CN111172176B - 一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpMADS2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpMADS2及其应用，所述转录因子PpMADS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。所述转录因子PpMADS2能够结合萜类合成酶PpTPS1基因启动子区的CArG(CCAAATTTGTA)结合位点，激活PpTPS1基因的表达，进而促进桃芳樟醇含量的积累。经过验证，桃果实的PpMADS2基因表达与芳樟醇的含量呈正相关关系，采用遗传转化技术过量表达PpMADS2基因可以增加果实的芳樟醇含量。所述PpMADS2可显著促进芳樟醇生物合成，促进基因PpTPS1表达，以及作为桃果实开展基因工程与改良育种的重要候选基因，改善果实的芳香品质。

Description

一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpMADS2及其应用

技术领域

本发明涉及植物分子生物技术和基因工程技术领域，涉及一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpMADS2及其应用，是一个参与桃果实挥发性萜烯类物质芳樟醇合成调控的转录因子PpMADS2及其应用。

背景技术

桃(Prunus Persica)属于蔷薇科、桃属植物，原产于中国，在世界各地均有栽植。桃作为重要的大众经济水果，其基因组较小，可以作为蔷薇科植物研究的模式材料。芳香是影响桃果实消费的重要品质，芳樟醇作为一种单萜醇，具花香、甜香和醇香，是桃果实香味形成的重要物质基础。此外，芳樟醇在植物防御反应及植物间信号转导中发挥重要作用。芳樟醇是重要的化学信息素，可吸引植物取食害虫的天敌或直接作为一些蚜虫的驱虫剂，也具有一定抗菌作用。因此，鉴别参与芳樟醇合成调控的转录因子具有重要生物学和产业意义。

挥发性芳樟醇的合成由萜类合成酶TPS催化，TPS基因目前已经在番茄，苹果，葡萄，猕猴桃，小苍兰等多个物种上有研究，而TPS基因表达水平受转录因子调控。转录因子是一类反式作用因子，通常能够与靶标基因启动子上的顺式作用元件结合，调控靶标基因的表达水平。目前，鉴别出的参与转录调控萜类物质代谢的多个转录因子家族成员主要来自于AP2/ERF，bHLH，MYB，NAC，WRKY和bZIP家族。针对转录调控芳樟醇代谢的研究较少。主要集中在模式植物番茄中，SlMYC1和SlWRKY73可激活番茄芳樟醇合成酶SlTPS5，且SlMYC1在反式激活SlTPS5启动子中表现出与锌指类转录因子萜类化合物SlEOT1有协同调控作用。桃果实中与SlMYC1，SlWRKY73和SlEOT1同源的转录因子均不能激活PpTPS1启动子。桃果实芳樟醇生物合成的上游调控因子尚不明确，比如还未鉴定出调控芳樟醇合成的转录因子。

发明内容

本发明的目的在于提供一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpMADS2，是一个参与桃果实芳樟醇合成调控的转录因子PpMADS2，转录因子PpMADS2能够促进芳樟醇的生物合成。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpMADS2及其应用，所述转录因子PpMADS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述转录因子PpMADS2的PCR扩增的上游引物核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；所述转录因子PpMADS2的PCR扩增的下游引物核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明提供了上述方案所述转录因子PpMADS2编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明还提供了一种包含上述方案所述转录因子PpMADS2的重组载体，所述重组载体为PpMADS2-pGreen II 002962-SK。

本发明还提供了一种包含重组载体的重组微生物，所述微生物是农杆菌GV3101::pSoup菌株，所述重组载体为PpMADS2-pGreen II 002962-SK。

本发明还提供了上述方案所述的转录因子PpMADS2在促进挥发性萜烯类物质芳樟醇的合成中的应用。

本发明还提供了上述方案所述的转录因子PpMADS2在促进基因PpTPS1表达中的应用。

本发明还提供了上述方案所述的转录因子PpMADS2在果实芳香品质改善的基因工程育种中的应用。

本发明的有益效果：本发明提供了一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpMADS2，属于植物分子生物技术和基因工程技术领域，所述PpMADS2具有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明中，所述转录因子PpMADS2能够结合萜类合成酶PpTPS1基因启动子区的CArG(CCAAATTTGTA)结合位点，激活PpTPS1基因的表达，进而促进桃芳樟醇含量的积累。经过验证，在桃果实的成熟阶段、不同组织及采后的紫外线B处理中，PpMADS2基因表达都与PpTPS1基因及芳樟醇的含量呈正相关关系。采用遗传转化技术过量表达PpMADS2基因可以增加果实的芳樟醇含量。由此表明，所述PpMADS2可显著促进芳樟醇生物合成，改善果实的芳香品质。

附图说明

图1为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中芳樟醇含量。

图2为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中PpTPS1的表达量。

图3为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中PpMADS2的表达量。

图4为湖景蜜露不同组织中芳樟醇含量。

图5为湖景蜜露不同组织中PpTPS1的表达量。

图6为湖景蜜露不同组织中PpMADS2的表达量。

图7为紫外线B处理下湖景蜜露中芳樟醇含量(**P<0.01)。

图8为紫外线B处理下湖景蜜露中PpTPS1的表达量(**P<0.01)。

图9为紫外线B处理下湖景蜜露中PpMADS2的表达量(**P<0.01)。

图10表示PpMADS2对PpTPS1启动子的转录激活效应(**P<0.01)。

图11表示SDS-PAGE电泳检测PpMADS2重组蛋白。

图12表示EMSA检测PpMADS2与PpTPS1启动子结合。

图13表示PpMADS2编码蛋白定位在细胞核。

图14表示转基因番茄果实的PpMADS2表达量(*P<0.05)。

图15表示过量表达PpMADS2的转基因番茄芳樟醇含量(**P<0.01)。

具体实施方式

本发明结合附图和实施例作进一步的说明。

本发明提供了一种参与挥发性萜烯类物质芳樟醇合成调控的转录因子PpMADS2，所述PpMADS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述转录因子PpMADS2属于MADS家族。

本发明中，所述PpMADS2的PCR扩增模板优选为桃果实cDNA；所述桃果实cDNA优选的采用桃果实总RNA逆转录合成；本发明对桃果实cDNA的合成方法没有特殊要求，采用本领域常规的植物cDNA合成方法即可，在本发明具体实施过程中，采用TAKARA试剂盒进行合成；本发明对桃果实总RNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规的植物细胞总RNA提取方法即可。

本发明提供了上述方案所述转录因子PpMADS2编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述蛋白质含有251个氨基酸；所述蛋白质的N端含有核定位信号NLS和保守的MADS结构域。

本发明还提供了一种包含上述方案所述转录因子PpMADS2的重组载体；所述重组载体优选的以pGreen II 002962-SK为原始载体，在pGreen II 002962-SK的多克隆位点插入转录因子PpMADS2；优选的，所述PpMADS2插入在原始载体pGreen II 002962-SK上的BamHI和Sal I酶切位点之间。

本发明中，所述重组载体优选的采用以下方法制备获得：以cDNA为模板，结合引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3获得PpMADS2的PCR产物；pGreen II 002962-SK通过BamH I(NEB)和Sal I(NEB)进行双酶切，回收后连接，得到PpMADS2-pGreen II 002962-SK。

本发明中，所述双酶切体系优选为：Cutsmart buffer 5μL、载体1μg，内切酶各1μL，水补足50μL；所述双酶切程序优选为：37℃酶切3h。

本发明中，所述回收优选的采用TAKARA的凝胶回收试剂盒进行；所述连接的试剂盒优选的采用Vazyme的一步克隆试剂盒进行。

本发明还提供了一种包含上述方案所述重组载体的重组微生物；所述重组微生物优选的以农杆菌为原始微生物，在农杆菌中转入重组载体PpMADS2-pGreen II 002962-SK；本发明对所述转入的方法没有特殊限制，采用本领域常规转化方法即可，本发明的具体实施过程中，采用电击转化法进行转化。

本发明的具体实施过程中，优选的转化步骤为：50μL农杆菌感受态加入5μL重组载体，冰上放置30min，转入Bio-Rad的2mm电击杯，通过Bio-Rad GenePulser Xcell在2.5Kv条件电击转入。

本发明还提供了上述方案所述的转录因子PpMADS2在促进基因PpTPS1表达中的应用。

本发明中，所述转录因子PpMADS2能够结合参与桃芳樟醇合成的萜类合成酶PpTPS1基因启动子区的CArG(CCAAATTTGTA)结合位点，进而激活PpTPS1基因的表达。

本发明还提供了上述方案所述的转录因子PpMADS2在果实芳香品质改善的基因工程育种中的应用。

下面结合实施例对本发明提供的一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpMADS2及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1桃的PpMADS2表达与PpTPS1转录本及芳樟醇含量正相关

(一)实验方法

1.桃果实材料

以水蜜桃品种‘湖景蜜露’(Prunus persica L.Batsch cv.Hujingmilu)为材料，其果实、花和叶均采自浙江省奉化市水蜜桃研究所。样品当天采收，并运达实验室，挑选大小、成熟度一致，且未受病虫害和机械伤的果实或花、叶为材料。桃果实分别在四个发育阶段(S1，S2，S3和S4)进行采收，S1表示第一个快速生长期(即为花后34天(34DAB))，S2表示硬核期(即为花后7l天(71DAB))，S3表示第二次快速生长期(即为花后94天(94DAB))，S4表示成熟期(即为花后108天(108DAB))。S4成熟阶段的桃果实采收后，在20℃和90-96％相对湿度的条件下转货架3天(S4+3d，S5)进行取样。花，叶和果每个取样时间点设置3个生物学重复，果实每个重复5个，样品经液氮冷冻后于-80℃保存待用。

另外，将S4成熟阶段桃果实随机分成两组，并贮藏在没有任何自然光的气候室(20℃，相对湿度90-96％)中。将处理组的桃果实平行摆放在紫外线B灯(波长为280-315nm)下照射6h和48h。紫外线B灯管(Luzchem Research，Gloucester，ON，加拿大)距离果实高度约50cm，光强为1.5w/m²。对照果实用锡箔纸覆盖以避免暴露于紫外光下，并置于被紫外线B辐射的样旁。实验设置三个生物学重复，每个重复包含5个桃果实，取样时，切下约1mm厚度的果皮组织，并迅速用液氮冷冻后放置于-80℃保存待用。

2.RNA提取及转录组测序

经液氮充分研磨后的果实样品1g，叶片、花和果皮样品0.1g，加入到有4mL 65℃预热的CTAB/β-巯基乙醇提取缓冲液的离心管中，涡旋混合，65℃水浴5min；加入4mL氯仿：异戊醇(24：1)抽提液，充分涡旋混合；15℃10000rpm离心10min，吸取上清液到新的离心管，重新抽提一次；上清液吸取到新的离心管中，加入1/4体积的10mol/L的LiCl，4℃放置过夜；次日，4℃10000rpm离心20min，倒掉上清液，将离心管倒置于纸巾上以去除多余的溶液；加入400μL 65℃预热的SSTE，溶解沉淀；再加入400μL氯仿：异戊醇(24：1)抽提液，涡旋混合；转移至1.5mL离心管中4℃10000rpm离心10min，吸上清液到新的离心管中加入2倍体积的-20℃预冷的无水乙醇，上下颠倒混匀，-80℃放置30min；4℃10000rpm离心25min，去上清液，短暂离心后吸出残余液体，将沉淀在通风橱晾干(约10min)；加入20μL DEPC水溶解沉淀，得到总RNA样品后，送由百迈克生物科技有限公司进行转录组测序分析。

3.桃果实挥发性芳樟醇含量分析

取样后的桃果肉样品经液氮研磨后称取5g，桃叶片、花和果皮样品各1g，加入3mL200mM EDTA溶液、3mL 20％CaCl₂溶液及30μL的内标2-辛醇(0.8mg/mL)密封后混合均匀，恒温平衡30min后，使用65μm聚二甲基硅氧烷和二乙烯苯(PDMS-DVB)萃取头(Supelco Co.)进行30min固相微萃取。萃取头在GC-MS(Agilent 7890-5975)进样口解吸附5min后用DB-WAX毛细管色谱柱(0.25mm，30m，0.25μm，J&W Scientific)进行分离。升温程序为从40℃以3℃·min^-1速率升至100℃，然后再以5℃·min^-1速率升至245℃。以1.0mL·min^-1氦气为载气，MS离子源温度230℃，采用电子轰击电离方式，电子能量为70eV，质谱扫描范围为35到350m/z。采用质谱库NIST-8(NIST/EPA/NIH，美国)和保留指数(Retention index，RI)进行物质鉴别，内标面积归一化方法进行物质的浓度计算。实验结果参见图1、图2、图3、图4、图5、图6、图7、图8和图9，图1为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中芳樟醇含量；图2为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中PpTPS1的表达量；图3为不同生长发育阶段的湖景蜜露果实中PpMADS2的表达量；图4为湖景蜜露不同组织中芳樟醇含量；图5为湖景蜜露不同组织中PpTPS1的表达量；图6为湖景蜜露不同组织中PpMADS2的表达量；图7为紫外线B处理下湖景蜜露中芳樟醇含量；图8为紫外线B处理下湖景蜜露中PpTPS1的表达量；图9为紫外线B处理下湖景蜜露中PpMADS2的表达量。

(二)实验结果

挥发性芳樟醇含量随着果实的生长发育逐渐积累，在S5时最高；PpTPS1的表达量整体呈现先上升至花后94d(94DAB)最高后逐渐下降的趋势；PpMADS2的表达量整体趋势与PpTPS1的表达量相同，呈正相关关系，且PpMADS2和PpTPS1表达量的大幅度增加都先于芳樟醇含量的大幅度积累。在桃不同组织中，挥发性芳樟醇含量、PpTPS1的表达量和PpMADS2的表达量都在果实中最高，其次为叶片和花，呈正相关关系。采后紫外线B处理桃果实48h后，挥发性芳樟醇含量、PpTPS1的表达量和PpMADS2的表达量均受到显著抑制，呈正相关关系。由此表明，桃的PpMADS2表达与PpTPS1转录本及芳樟醇含量正相关。推测PpMADS2是调控PpTPS1表达进而影响了芳樟醇合成的转录因子。

实施例2烟草双荧光素酶验证PpMADS2转录激活PpTPS1启动子

(一)实验方法

1.cDNA合成及DNA提取

取1.0μg果实总RNA，用TAKARA试剂盒去除基因组DNA后，按说明书操作逆转录合成cDNA。利用CTAB法提取桃果实基因组DNA。经液氮研磨后的桃果实材料1g，加入4ml65℃预热的CTAB/β-巯基乙醇提取液，涡旋混匀，65℃水浴1h；加入4ml氯仿/异戊醇(24:1)，涡旋混匀；10000rpm，15℃离心10min，取上清，加入2ml 5mol/L醋酸钠，4ml经-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀后于-20℃放置1h；12000rpm离心15min，弃上清；沉淀经1ml 75％乙醇洗2次，去上清后晾干乙醇，加100μL水溶解沉淀，即为桃果实DNA。

2.重组载体构建及农杆菌转化

根据PpMADS2在桃基因组数据库

(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html#！info？alias＝Org_Ppersica)中的参考序列，利用PCR技术，以桃果实cDNA为模板，结合引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3扩增获得PpMADS2全长SEQ ID NO.1。PCR反应体系为50μL，成分分别为：25μLPrimeSTAR Max Premix(2x)酶(TAKARA)，上下游引物(10μM)各1μL，1μL桃果实cDNA，22μLH₂O。PCR反应程序为：98℃10s；55℃15s，72℃10s，35个循环。利用Vazyme一步克隆试剂盒将PCR产物与经限制性内切酶BamH I和Sal I在37℃水浴条件下酶切3h后的pGreen II002962-SK载体5μL连接产物加入20μL DH5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化DH5α，挑取阳性菌落后测序验证。结合引物对SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6，以桃果实DNA为模板通过PCR扩增获得ATG上游2000bp长度的PpTPS1启动子序列(SEQ ID NO.7，PpTPS1-promoter-2000)，利用上述方法构建于Hind III和Nco I酶切后的pGreen II 0800-LUC载体。将序列确认正确的PpMADS2-pGreen II 002962-SK载体及PpTPS1-pro-pGreen II0800-LUC载体利用电击转化法，分别转入农杆菌GV3101::pSoup中，并分别挑取阳性克隆保存。

3.农杆菌侵染烟草叶片及LUC/REN荧光检测

含有PpMADS2-pGreen II 002962-SK及PpTPS1-pro-pGreen II 0800-LUC载体的农杆菌用渗透液(10mM MgCl₂、10mM MES、150μM乙酰丁香酮、pH为5.6)悬浮后调整OD₆₀₀＝0.75，以10:1(v/v)混合均匀后用注射器注入本氏烟叶片，每棵烟草注射3片叶片，空的pGreen II 002962-SK载体代替PpMADS2-pGreen II 002962-SK作为对照。注射后的烟草于25℃，16h/8h(光照/黑暗)培养3d后检测LUC及REN荧光值。用直径4mm的打孔器在叶片注射口附近取样，每株烟草取6个样品，放置于100μL的l x PBS溶液中研磨，吸取上清50μL，用Dual-Luciferase Reporter Assay System(Promega，美国)和Modulus Luminometer(Promega，美国)检测叶片中两种荧光素酶(LUC和REN)的比值，每个结果至少有3次独立试验重复。结果参见图10，显示PpMADS2对PpTPS1启动子的转录激活效应。

(二)实验结果

烟草双荧光素酶结果显示，PpMADS2能够显著激活PpTPS1启动子活性，与空载相比，激活倍数超过8倍。

实施例3 EMSA验证PpMADS2与PpTPS1-promoter结合

(一)实验方法

1.重组载体构建及大肠杆菌转化

结合引物对SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9，利用PCR技术扩增获得去除终止密码子的PpMADS2，PCR体系及反应程序同实施例2。利用Vazyme一步克隆试剂盒将PCR产物与经限制性内切酶Sac I和Sal I在37℃水浴条件下酶切3h后的pET-32a载体5μL连接产物加入20μL DH5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化DH5α，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的PpMADS2-pET-32a载体利用热激转化法转入BL21(DE3)中，挑取阳性克隆保存。

2.诱导表达及重组蛋白的纯化

转化后的BL21(DE3)菌于20mL含AMP(100mg/L)的LB中培养12h，然后以1:50转移至500mL含AMP(100mg/L)的LB中继续培养至OD600＝0.5-0.8，加入IPTG(终浓度0.5mmol/L)，16℃诱导表达24h，离心(5000g，15min，15℃)收集菌。用25mL 1x PBS缓冲液重悬。重悬后的菌经过超声破碎，10000rpm，4℃离心30min。上清液过

HV的除菌膜(0.45μm,diameter 33mm,Millipore，美国)，除菌后的上清液按照说明书过HisTALONTM(Clontech,Takara)的重力柱纯化得到粗蛋白并通过SDS-PAGE电泳检测。粗蛋白液用脱盐柱PD-10(GEHealthcare，英国)进行脱盐，并将蛋白置换到Tris-HCl缓冲液(100mmol/L Tris，2mmol/LDTT，pH 7.5)，加入10％甘油储存在超低温冰箱。

3.PpTPS1-promoter序列分析及EMSA验证

EMSA通过Lightshift Chemilunimescent EMSA kit(Thermo)根据说明书操作完成。根据PpTPS1-pro-2000上预测获得的CArG位点，合成双链探针SEQ ID NO.10和SEQ IDNO.11，探针经过DNA 3'End Biotinylation Kit(Thermo)完成生物素标记，未标记的探针作为竞争探针；将CArG序列突变为SEQ ID NO.12和SEQ ID NO.13，经过生物素标记作为突变探针。在25℃下，探针与重组蛋白在Binding buffer(10×concentration:100mM Tris，500mM KCl，10mM dithiothreitol，pH 7.5)中孵育25min，反应体系为20μL(0.2pmoL探针，2μg融合蛋白，1μg poly(Di-dC))。反应产物经过PAGE电泳后转移至带正电尼龙膜，380mA 4℃电泳30min。紫外交联30min后，通过化学发光检测仪检测。实验结果参见图11和图12，图11表示SDS-PAGE电泳检测PpMADS2重组蛋白；图12表示EMSA检测PpMADS2与PpTPS1启动子结合。

(二)实验结果

HIS-PpMADS2可以与生物素标记的CArG探针结合而发光，加入未标记的竞争探针后发光减弱，并且随竞争探针浓度增加，发光更弱；当生物素标记的探针序列突变后，不能与HIS-PpMADS2重组蛋白结合，无发光结合条带。结果表明，HIS-PpMADS2重组蛋白可与PpTPS1启动子上的CArG(CCAAATTTGTA)位点结合。

实施例4 PpMADS2定位在细胞核

(一)实验方法

1.载体构建及农杆菌转化

结合引物对SEQ ID NO.14和SEQ ID NO.15，利用PCR技术扩增获得去除终止密码子的PpMADS2，PCR体系及反应程序同实施例2。利用Vazyme一步克隆试剂盒将PCR产物与经限制性内切酶BamH I和Sal I在37℃水浴条件下酶切3h后的P2300-eGFP载体5μL连接产物加入20μL DH5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化DH5α，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的PpMADS2-P2300-eGFP载体利用电击转化法，分别转入农杆菌GV3101::pSoup中，并分别挑取阳性克隆保存。

2.烟草叶片侵染

含有PpMADS2-P2300-eGFP载体的农杆菌用渗透液(10mmol/L MgCl₂、10mmol/LMES、150μmol/L乙酰丁香酮、pH为5.6)悬浮后调整OD₆₀₀＝1.0，用无菌注射器选取生长4周的本氏烟草的第5-6片叶片进行注射。以空载体作为阴性对照。为了确定细胞内结构，选用细胞核表达红色荧光蛋白(Nucleus-RFP)的转基因烟草(Nicotiana benthamiana)进行注射。注射后2d，选取叶片注射部位做成载玻片，使用Zeiss LSM710NLO共聚焦激光扫描显微镜对烟草叶片的绿色荧光蛋白(GFP)进行荧光成像。实验结果参见图13，图13表示PpMADS2编码蛋白定位在细胞核。

(二)实验结果

烟草瞬时表达结果证明PpMADS2编码的蛋白定位在细胞核。

实施例5转基因技术过量表达PpMADS2提高了番茄果实芳樟醇含量

(一)实验方法

1.载体构建及农杆菌转化

结合引物对SEQ ID NO.16和SEQ ID NO.17，利用PCR技术扩增获得PpMADS2，PCR体系及反应程序同实施例2。利用invitrogen的BP CLonase酶连接到pDONR207中间载体，连接反应体系为10μL，成分分别为：PpMADS2 PCR产物2μL，pDONR207载体1μL，TE buffer 5μL，BPClonase^TMII enzyme mix 2μL。连接反应程序为：25℃1h后加入1μL Proteinase K终止反应，37℃10min。连接完成后5μL连接产物加入20μL DH5α感受态，冰上放置30min，42℃热激90s，转化DH5α，挑取阳性菌落后测序验证。将序列确认正确的PpMADS2-pDONR207载体用invitrogen的LR CLonase酶连接到pBIN19-E8终载体，连接反应体系为10μL，成分分别为：PpMADS2-pDONR207载体1μL，pBIN19-E8载体1μL，TE buffer 6μL，LR Clonase^TMII enzymemix 2μL。连接反应程序同上，转入DH5α感受态后挑取阳性菌落后测序验证。将测序正确的PpMADS2-pBIN19-E8载体利用电击转化法，转入农杆菌EHA105中，挑取阳性克隆保存。

2.番茄子叶的侵染

挑选阳性单菌落于3ml含卡那霉素(50μg/mL)及利福平(10μg/mL)的LB液体培养基中，28℃培养过夜，吸取600μL菌液加入20ml LB中，28℃培养6-7h，以OD600＝0.5～0.6最佳，离心收集菌体，用无菌水稀释至OD600＝0.1～0.2作为侵染液。无菌条件下生长7-8d的番茄子叶，切去叶尖和叶基，将处理好的外植体背面朝上置于铺滤纸的预培养基T1上。预培养基T1组分：4.43g/L MS，30g/L蔗糖，7g/L琼脂，1mg/L 6-BA，0.1mg/L IAA。将预培养2d后的外植体浸泡于侵染液中，震荡5min后倒掉浸染液，将多余的浸染液用滤纸吸干后，将外植体重新置于预培养培养基。在暗室共培养2d后全部置于芽诱导培养基T21，在光下培养7d后转入新的T21培养基中进行继代培养。芽诱导培养基T21组分：4.43g/L MS，30g/L蔗糖，7g/L琼脂，75mg/L卡那霉素，200mg/L特美汀，1mg/L ZT，0.1mg/L IAA。第一次继代培养后，一般每隔2周进行下一次继代培养，直至外植体发芽完全。经过芽诱导期后，待外植体发芽芽长约为2-3cm时转入芽伸长培养基T22中。芽伸长培养基T22组分：4.43g/L MS，30g/L蔗糖，7g/L琼脂，75mg/L卡那霉素，200mg/L特美汀，0.5mg/L ZT，1mg/L GA。培养3-4周当芽伸长至4-5cm时，剪掉愈伤组织后将芽转入到生根培养Tr中，培养3-4周。生根培养Tr组分：2.22g/LMS，30g/L蔗糖，7g/L琼脂，37.5mg/L卡那霉素，150mg/L特美汀，2mg/L IBA。将生根旺盛，生长到一定高度的小苗即时转入土盆里。转入土盆后提取叶片DNA进行阳性植株检测。经过鉴定的T1代转基因番茄及野生型种植于人工气候室(25℃，16h/8h光周期)。采收红熟阶段(Br+7)的果实经液氮冷冻后保存于-80℃用于芳樟醇含量及基因表达分析。每个株系选取3株分别作为3个生物学重复，每个重复包含5个果实。

3.转基因番茄PpMADS2表达及香气物质检测

番茄果实样品用液氮研磨，利用CTAB法提取总RNA，取1.0μg RNA按(TAKARA)试剂说明书操作合成cDNA。qPCR以番茄SlACTIN(SEQ ID NO.18和SEQ ID NO.19)为内参基因，PpMADS2引物序列为SEQ ID NO.20和SEQ ID NO.21。qPCR反应体系包括10μL SsofastEvaGreen Supermix(Bio-Rad)，上下游引物(10μM)各1μL，2μL cDNA，6μL H₂O。PCR程序为：95℃3min；95℃10s，60℃30s，45个循环；95℃10s；从65℃到95℃，每上升0.5℃读取一次荧光信号值。所用仪器为Bio-Rad CFX96实时荧光定量PCR仪，所有qPCR引物特异性经熔点曲线分析、凝胶电泳分析和qPCR产物测序验证。经液氮研磨后的果实样品5g用GC-MS分析挥发性芳樟醇含量。方法参照实施例1。实验结果参见图14和图15，图14表示过量表达PpMADS2的番茄果实中PpMADS2的相对表达量；图15表示过量表达PpMADS2的番茄果实中芳樟醇的含量变化。

(二)实验结果

转基因技术稳定过量表达PpMADS2基因后，番茄果实中芳樟醇积累量增加到野生型对照的2-3倍。因此，采用遗传转化方法过量表达PpMADS2基因可提高果实芳樟醇的含量。

由以上实施例可知，本发明提供了一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpMADS2及其应用，PpMADS2可以通过转录激活PpTPS1的表达，促进挥发性芳樟醇含量的增加。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一个参与桃芳樟醇合成调控的转录因子PpMADS2及其应用

<160> 21

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 756

<212> DNA

<213> 桃(Prunus persica)

<400> 1

atgggaagag gtagagttga gctgaagagg atagagaata aaattaacag gcaagtgact 60

tttgccaaga gaagaaatgg gctgctcaag aaagcttatg agctctcagt tctctgcgat 120

gctgaggttg ccctcataat tttctccagc cgtggcaaac tttatgaatt ctgcagcagt 180

atgagcatgc tgaaaacgct tgaaaagtac caaaggtgca gctatggctc cctggaagcc 240

aacagaccag tcaatgagac ccagaacagc tatcaggaat atctgaagct gaaagctaga 300

gtggaggtcc tccaacaatc tcaaagaaac cttcttgggg aagatttggc cccactgaac 360

acaaaggagc ttgagcagct tgagcatcaa ctggaggcat ccttgaacca aattaggtca 420

acaaagactc agtttatgct tgatcagctt tgtgatctcc agaacaagga acaaatgcta 480

gttgaagcta acaaagcctt gaggaggaag ctggaagaaa ctagtgggca agcgccacct 540

ctattggcat gggaagctgc tggccatggc aacaacaatg ttcagcatac tggccttcct 600

catcatcctc actcacaagg cttcttccat ccattgggaa acaactccac ttcccaaatt 660

ggatacaccc ccttgggttc agatcatcat gaacaaatga atgttggaaa tcatggccaa 720

catgtgaatg gattcattcc tgggtggatg ctttga 756

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 2

agaactagtg gatccatggg aagaggtaga gttga 35

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 3

cccctcgagg tcgactcaaa gcatccaccc aggaa 35

<210> 4

<211> 251

<212> PRT

<213> 桃(Prunus persica)

<400> 4

Met Gly Arg Gly Arg Val Glu Leu Lys Arg Ile Glu Asn Lys Ile Asn

1 5 10 15

Arg Gln Val Thr Phe Ala Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

20 25 30

Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Ile Phe

35 40 45

Ser Ser Arg Gly Lys Leu Tyr Glu Phe Cys Ser Ser Met Ser Met Leu

50 55 60

Lys Thr Leu Glu Lys Tyr Gln Arg Cys Ser Tyr Gly Ser Leu Glu Ala

65 70 75 80

Asn Arg Pro Val Asn Glu Thr Gln Asn Ser Tyr Gln Glu Tyr Leu Lys

85 90 95

Leu Lys Ala Arg Val Glu Val Leu Gln Gln Ser Gln Arg Asn Leu Leu

100 105 110

Gly Glu Asp Leu Ala Pro Leu Asn Thr Lys Glu Leu Glu Gln Leu Glu

115 120 125

His Gln Leu Glu Ala Ser Leu Asn Gln Ile Arg Ser Thr Lys Thr Gln

130 135 140

Phe Met Leu Asp Gln Leu Cys Asp Leu Gln Asn Lys Glu Gln Met Leu

145 150 155 160

Val Glu Ala Asn Lys Ala Leu Arg Arg Lys Leu Glu Glu Thr Ser Gly

165 170 175

Gln Ala Pro Pro Leu Leu Ala Trp Glu Ala Ala Gly His Gly Asn Asn

180 185 190

Asn Val Gln His Thr Gly Leu Pro His His Pro His Ser Gln Gly Phe

195 200 205

Phe His Pro Leu Gly Asn Asn Ser Thr Ser Gln Ile Gly Tyr Thr Pro

210 215 220

Leu Gly Ser Asp His His Glu Gln Met Asn Val Gly Asn His Gly Gln

225 230 235 240

His Val Asn Gly Phe Ile Pro Gly Trp Met Leu

245 250

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 5

cccctcgagg tcgactcaaa gcatccaccc aggaa 35

<210> 6

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 6

tggcgtcttc catggtttta ctagagcaat tgcag 35

<210> 7

<211> 2000

<212> DNA

<213> 桃(Prunus persica)

<400> 7

cccggccatg ccatgacccc aatgtatttc atatattttg tagagaatgt aaagaacaat 60

tgccatataa tgtggttcag gtcatggtcc cctcctaaat gcaataagaa cagcacaact 120

gctacaaaag aggggcccaa aatacaaata gtagcaattc ctgtggtacc gacaaaatat 180

tcaagttatt gagtttggat ggattatgga gcaccagcaa ggggaatcat ccacacacac 240

acagagcccg cgagggtctc tttatttctc caacagaata atgtatttca gaccccaaaa 300

actaataatg tatgcgggcg caaagtaaca acaggaggag tacctgtcat aatatcagta 360

tcaaatacta aaatattcat gatattatca gttttttgca tctagaatat tttaaaatat 420

atttatacac atatcgtata aatatcgata atatcaaaaa atatcgacgt cgataatttc 480

tctcacactt cagcaacatt tgaccaaaat atccctataa tattactgta atatcaataa 540

tatcgagata atgaagacaa tgaaaatttt gaaaagttat ttacgtgaac acaccatgag 600

gtttcagttt gttttcacaa aactcctttt cgttgattat ttgtccaaaa atttatgatt 660

tcattgaaat ttttttttaa tgcaaatgac aaaattaacc tcaatgaaat atatgcaatc 720

taatctcaaa ggccaactta gtcatttgga gaattttttt ttgtataaaa tcaatgaaaa 780

ttagttttgt gaaaacaatt taaaacatca gggggtgttc ttgtaatttc taaaacctca 840

aggagttttg tgaaaaagcc gaaaatctca tggggtgtta gtgtaaataa ctcaaatttg 900

aaccttacag gaagtctaag tggcactaaa tcactcatgt atattaccat gcaatgtata 960

aagtgtaaaa atattgtagt aaatcattat aaataaatga ttttggtgtg tttaatcttc 1020

tttcattaat tactacatat tttctacact cgtagtgttt gtcaactcac catataatca 1080

acttaaatta gttaaaccca ttatgcaatg catttccttc taattttttt ggtaataaag 1140

taatagataa ttgactaaat aaacatccta caaagtttca aaatttattt tttttaatcg 1200

atatcgataa ttttcctata tttccattga aatttatgtg tttttgaact accgatattt 1260

ccgaaaccgt cgatatttta gaccttggtc agtattttgc caaatttgta ttgtgtgcta 1320

tggtatcaac aagaggagat ttcagaatga cgttaccatt aggtgagctt caattttttg 1380

ttatttaaat tagttgttga cgtcacaatg atgttaccat taggtgagct tgcccaggta 1440

gtaattcaga caagtcttgc ctttggactt gcccactcct tgccctggtt ggcattcatt 1500

gctggacttc gtttttgggg ccttcaatac atgacatttt cttctccaca atatatgtat 1560

acagatggag acggagatgg agatggagat tggagcaatg gcttccatta taagtacaaa 1620

tttgattctt tcttggattc cttgtataaa tataccggtt gttgtgagcc tttcaaatcc 1680

atcgaattaa atacaacaca ctaaaaaaat gtgggagctg ctgttccaaa aatcgaacac 1740

tattcattaa tatggtgcat ttgaaagtgc cagcagcaca ccctctctca attattataa 1800

agtaaattta gtttttagtt tgacacgttt cttctgcttt tagtttgaca gatgatgtga 1860

agtgaagtat ttttcacaat tcgctcggtg caaatcttcc tctttataat gagaacccca 1920

gagtcactta cactctcaaa ttaagcaaca gaaacaaact gagaaaaaaa caagatcctg 1980

ctgcaattgc tctagtaaaa 2000

<210> 8

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 8

tccgaattcg agctcatggg aagaggtaga gttga 35

<210> 9

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 9

cgcaagcttg tcgacaagca tccacccagg aatga 35

<210> 10

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 10

tggtcagtat tttgccaaat ttgtattgtg tgctatggta 40

<210> 11

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 11

taccatagca cacaatacaa atttggcaaa atactgacca 40

<210> 12

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 12

tggtcagtat tttgatcgcg gcagcttgtg tgctatggta 40

<210> 13

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 13

taccatagca cacaagctgc cgcgatcaaa atactgacca 40

<210> 14

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 14

ggtacccggg gatccatggg aagaggtaga gttga 35

<210> 15

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 15

gctcaccatg tcgacaagca tccacccagg aatga 35

<210> 16

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 16

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggcta tgggaagagg tagagttga 49

<210> 17

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 17

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt caaagcatcc acccaggaa 49

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 18

tgtccctatt tacgagggtt atgc 24

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 19

cagttaaatc acgaccagca agat 24

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 20

gccacctcta ttggcatggg 20

<210> 21

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Unknown)

<400> 21

gtcaaagcat ccacccagga 20

Claims (3)

1. 一个参与桃萜类芳香物质芳樟醇生物合成的转录因子PpMADS2在促进桃果实中芳樟醇合成中的应用，所述PpMADS2的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述PpMADS2编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

2.权利要求1中所述的一个参与桃萜类芳香物质芳樟醇生物合成的转录因子PpMADS2在激活基因PpTPS1的启动子中的应用，所述PpTPS1的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示。

3.权利要求1中所述的一个参与桃萜类芳香物质芳樟醇生物合成的转录因子PpMADS2在改善桃果实芳香品质中的应用，其特征在于，作为重要基因在开展桃果实基因工程与改良育种中应用。

Images