ES2627863B1 - Composiciones y métodos para determinar la alimentación por psílidos - Google Patents

Abstract

Composiciones y métodos para determinar la alimentación por psílidos.#La invención se relaciona con una planta que incluye un transgén que codifica un polipéptido heterólogo que confiere en la expresión de planta dicha resistencia de polipéptidos a un insecto hemipteroide que succionan la savia. El transgén también se expresa en un componente vegetal (tal como una hoja). Típicamente, la expresión de tales polipéptidos disuade la alimentación por insectos tales como psílidos (tales como psílidos cítricos asiáticos, psílidos cítricos africanos o psílidos cítricos americanos). Los ejemplos de plantas útiles en la invención son plantas cítricas o solanáceas.

Description

5 Referencia cruzada con los documentos relacionados

Esta solicitud reivindica beneficio del documento EEUU No. 62/008,934, archivado el 6 de junio de 2014, que se incorpora aquí por referencia en su totalidad.

CAMPO DE LA INVENCiÓN

La presente invención se relaciona generalmente con el campo de plantas que expresan

10 proteínas inhibitorias de insectos. En particular, la presente invención se relaciona con proteínas que exhiben actividad inhibitoria de insectos contra pestes relevantes en la agricultura de plantas de cultivo tales como plantas solanáceas y cítricas particularmente las plagas de insectos hemipteroides que succionan la savia, tales como el psílido cítrico asiático, el psílido cítrico africano, el psílido cítrico americano y el psílido de patata/tomate,

15 Bactericera cockerelli.

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

Los psílidos son pequeños insectos que se alimentan de f10ema que típicamente se alimentan de una sola planta, o de unas pocas plantas relacionadas. Pueden servir como vectores para diferentes especies microbianas que pueden actuar como plagas de plantas.

20 También se sospecha que entregan toxinas a las especies vegetales a medida que se alimentan, que causan patogénesis.

Los psílidos cítricos de Asia, África, y América son pequeñas plagas de insectos que se alimentan de las hojas y tallos de los árboles cítricos. Estos psílidos trasmiten una enfermedad bacteriana llamada Huanglongbing (HLB), también conocida como enfermedad 25 de los cítricos. Todos los cítricos y especies cercanamente relacionadas son anfitriones susceptibles para tanto insectos psílidos cítricos como la enfermedad HLB. Esta enfermedad bacteriana es trasmitida a árboles saludables mediante el psílido después de que se alimentan de tejido vegetal infectado. Una vez se infecta un árbol cítrico con HLB, no hay cura y la planta eventualmente morirá. La mejor forma actualmente para prevenir que la

30 enfermedad mate árboles cítricos es detener estos psílidos cítricos.

El psílido de patata/tomate, Bactericera cockerelli, ha sido una antigua plaga de cultivos solanáceos, que incluyen patatas, tomates, pimientos y berenjenas. Puede dañar plantas a través de alimentación directa, se sospecha que entrega una toxina de planta, y también transmite los patógenos bacterianos Uberibacter psyllaurous y Liberibacter solanacearum. 35 En patatas, se cree que causa una enfermedad sistémica denominada amarillos psílidos que incluye una reducción en el crecimiento, amarillamiento de las hojas, erección de nuevo follaje, anomalías foliares, entrenudos acortados y engrosados, nódulos agrandados, tubérculos aéreos, senescencia prematura y muerte temprana de las plantas. En tomates, los síntomas de follajes son similares a los de las patatas, y se puede disminuir el conjunto 40 de frutas, tamaño, textura y rendimiento. El B. cockerelli y la transmisión de L. solanacearum también han sido vinculadas con la enfermedad de la viruela cebra en las patatas, lo que provoca el retraso del crecimiento, clorosis, entrenudos hinchados del crecimiento superior, proliferación de los brotes axilares, tubérculos aéreos, pardeamiento del sistema vascular, chamuscamiento de las hojas y muerte prematura de las plantas. Se 45 han usado diferentes insecticidas contra B. cockerelli, sin embargo, recientemente se ha

detectado algo de resistencia a tratamientos comunes en poblaciones de psílidos en Calilornia (Butler y Trumble, TerrestriaJ Arthropod Reviews, 5, 87-111 , 2012).

No hay disponible actualmente ningún método de control que elimine psílidos y el riesgo de trasmisión de patógenos dentro de una plantación de cítricos o campos de cultivos solanáceos. Los métodos para suprimir la infestación de psílidos probablemente disminuirán la propagación de la enfermedad y mantendrá la viabilidad económica de la producción agrícola.

Es en vista de estas cuestiones que se desarrolló la invención descrita aquí.

Resumen de la invención

Se ha descubierto que son útiles diferentes genes de los hongos de HirsuteJla que colonizan insectos y de Allium (la familia de la cebolla) y otros genes que es aquí, cuando se expresan en plantas transgénicas, para inhibir la alimentación por insectos psílidos. Por consiguiente, la invención proporciona moléculas de ácido nucleico purificadas, vectores (tales como vectores de expresión), células, plantas y componentes vegetales, productos y métodos útiles para proteger las plantas de enfermedades, por ejemplo, el verdeado de los cítricos y la enfermedad de las virutas de cebra causada por psílidos.

En un aspecto, la invención presenta una planta que incluye un transgén que codifica un polipéptido heterólogo, el polipéptido que confiere, en una planta que expresa el polipéptido, resistencia (como se describió aquí) a una plaga de insectos hemipteroides que succionan la savia. En realizaciones preferidas, el insecto es un psilido tal como los psílidos cítricos asiáticos. En otras realizaciones preferidas, la planta es resistente a la infestación por psílidos. En aún otras realizaciones preferidas, la planta resistente a la alimentación por psílidos. La invención por consiguiente presenta plantas que no son atractivas a insectos que succionan la savia. En realizaciones particularmente preferidas, la planta es una planta cítrica. Las plantas a manera de ejemplo por consiguiente incluyen cualquier miembro de la familia ruda que incluyen, pero no están limitados a, naranja, limón, lima, y plantas de pomelo. Preferiblemente, el transgén está vinculado operativamente a secuencias regulatorias (tales como secuencias regulatorias heterólogas) para expresión del polipéptido, y en el que las secuencias regulatorias incluyen un promotor (por ejemplo, un promotor constitutivo o un promotor específico celular tal como un promotor activo en las células del Iloema o en el Iloema de una planta). Los polipéptidos a manera de ejemplo son sustancialmente idénticos a HtA (nativo), HtA (corto), ASAL (nativo), ASALR (nativo), ASALR (corto), ACA (nativo), ACA (corto), ACT (nativo), o ACT (corto), MpNPR1 o CsNPR1 como se describen aquí. En otras realizaciones preferidas, los polinucleótidos que codifican las pOlipéptidos se apilan según técnicas convencionales (como se describió aquí). También se contemplan las combinaciones de uno o más polinucleótidos en una planta transgénica o componente vegetal. Las plantas que expresan tales polinucleótidos típicamente evidencian un aumento del rendimiento comparado con una planta de control.

En otro aspecto, la invención presenta un producto derivado de una planta transgénica que expresa cualquier polinucleótido descrito aquí, en la que el producto incluye una cantidad detectable del transgén o un polipéptido expresado a partir del polinucleótido. Preferiblemente, el producto es un producto cítrico, o un producto de plantas solanáceo.

En aún otro aspecto, la invención presenta una planta progenie o semilla, en la que la planta progenie o semilla incluye un transgén que expresa uno o más de los polinucleótidos descritos aquí. En algunas realizaciones, la planta progenie o semilla incluye un gen resistente al herbicida que confiere resistencia al herbicida.

En otro aspecto, la invención presenta un polinucleótido que tiene identidad sustancial con HIA (nativo), HIA (corto), ASAL (nativo), ASALR (nativo), ASALR (corto), ACA (nativo), ACA (corto), ACT (nativo), o ACT (corto), MpNPR1 o CsNPR1 (cada uno descrito aqui), opcionalmente en el que el polinucleótido está vinculado operativamente con secuencia

5 regulatorias para expresión del polipéptido, y en la que las secuencias regulatorias incluyen un promotor.

En otro aspecto, la invención presenta un constructo de expresión que incluye un polinucleótido que expresa uno o más polipéptidos que confieren en una planta resistencia a un insecto hemipteroide que succionan la savia. Los polinucleótidos a manera de ejemplo son aquellos que tienen identidad sustancial con HtA (nativo), HtA (corto), ASAL (nativo), ASALR (nativo), ASALR (corto), ACA (nativo), ACA (corto), ACT (nativo), ACT (corto), MpNPR1 , o CsNPR1. En otras realizaciones preferidas, el polinucleótido es complementario con al menos 20 nucleótidos continuos de una secuencia seleccionada del grupo de HtA

15 (nativo), HIA (corto), ASAL (nativo), ASALR (nativo), ASALR (corto), ACA (nativo), ACA (corto), ACT (nativo), ACT (corto), MpNPR1 , o CsNPR1. En otras realizaciones preferidas, el polinucleótido está vinculado operativamente con una secuencia regulatoria heteróloga tal como un promotor CaMV 358, un promotor tándem CaMV 35S, un promotor Shpx6b, un promotor SUS1 , o un promotor CsSU81. En aún otras realizaciones preferidas, el polinucleótido está vinculado operativamente con un terminador. En aún otras realizaciones preferidas, se expresa el polinucleótido en tejido de floema de una planta.

En otro aspecto la invención presenta una célula vegetal, una planta, o componente vegetal que incluye uno o más de los polinucleótidos o constructos de expresión descritos aquí. En 25 particular, la invención presenta plantas que son miembros del género cítrico tal como Citrus sinensis, Citrus sinensis L. Osbeck 'Hamlin', o Citrus sinensis L. Osbeck 'Valencia'.

En aún otro aspecto, la invención presenta la propagación de cualquiera de las plantas transgénicas (tal como cítricas y de patata) como se describió aquí por propagación vegetativa.

En aún otro aspecto, la invención presenta un producto derivado de la célula vegetal, planta,

o componente vegetal que incluye uno o más de los polinucleótidos descritos aquí, en la que el producto incluye una cantidad detectable del polinucleótido recombinante. En

35 realizaciones preferidas, el producto es un producto cítrico o un producto solanáceo, que puede incluir, pero no está limitado a, cítricos, zumo de cítricos y concentrado de jugo de cítricos.

En otros aspectos, la invención presenta un método para controlar un insecto hemipteroide que succionan la savia, el método que incluye exponer el insecto a la célula vegetal, planta,

o componente vegetal que incluye uno o más de los polinucleótidos descritos aquí, en la que la planta vegetal, planta, o componente vegetal expresa un polipéptido que inhibe alimentación, por ejemplo, directamente o indirectamente, por el insecto. En general, el método, por ejemplo, implica hacer que una planta sea menos atractiva para alimentación o

4S infestación por psílidos.

En otro aspecto preferido, la invención presenta un método para hacer una planta resistente a verdeado cítrico, el método que incluye los pasos de introducción en una célula vegetal, uno o más de los polinucleótidos descritos aquí; y que regenera a partir de la célula vegetal una planta transgénica que expresa una cantidad inhibitoria de insectos de un polipéptido codificado por el polinucleótido; y opcionalmente, que muestra resistencia a psílidos cítricos asiáticos como una propiedad de la planta cítrica transgénica o del componente vegetal cítrica transgénica. Nuevamente el método, en general, implica hacer una planta menos atractiva para alimentación o infestación por psílidos.

En aún otro aspecto preferido, la invención presenta un método para hacer una planta resistente a enfermedad de la viruela cebra y psílidos amarillos, el método que incluye los pasos de introducir en una célula vegetal, uno o más de los polinucleótidos descritos aquí; y que regenera a partir de la célula vegetal una planta transgénica que expresa una cantidad inhibitoria de insecto de un polinucleótido codificado por el polinucleótido; y, opcionalmente, que muestra resistencia a B. cockereJ/i como una propiedad de la planta solanácea transgénica o el componente vegetal solanácea transgénica.

En otro aspecto, la invención presenta un método para obtener jugo cítrico, el método, en general, implica proveer fruta cosechada de una planta que expresa un polipéptido que confiere resistencia a una plaga de insectos hemipteroides que succionan la savia y extraen jugo cítrico de la planta tal como una fruta proporcionada de tal planta. En realizaciones preferidas, el jugo se extrae de una fruta de una planta cítrica tal como naranja, limón, lima,

o pomelo. En otras realizaciones preferidas, el método adicionalmente implica concentrar el jugo cítrico. En aún otras realizaciones preferidas, el método implica adicionalmente fortificar el jugo cítrico (por ejemplo, vitaminas y nutrientes tiamina y potasio, vitamina D y calcio). Adicionalmente, si se desea, el método implica además fortificar el concentrado de jugo cítrico.

En aún otros aspectos, la invención presentó método para obtener frutas cíclicas tales como naranjas, limones, limas, y pomelo, el método que implica cosechar fruta de una planta que expresa un polipéptido que confiere resistencia a un insecto hemipteroide que succionan la savia.

Por "molécula de ácido nucleico" o "polinucleótido" se indica una molécula, por ejemplo, ARN o ADN , que tiene una secuencia de dos o más enlaces covalentes, nucleótidos que ocurren naturalmente o modificados. La molécula de ácido nucleico puede ser, por ejemplo, individual o de cadena doble, y puede incluir nucleótidos modificados o no modificados, o mezclas o combinaciones de los mismos. También se incluyen diferentes sales, sales mezcladas, y formas de ácido libre.

Por "fragmento de ácido nucleico" o "fragmento polinucleótido~ se indica un segmento contagioso de una molécula de ácido nucleico. La longitud de un segmento de ácido nucleico puede variar desde al menos una base par (por ejemplo, al menos 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, lOO, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, 410, 420, 430, 440, o 450 pares de base) hasta la longitud completa de la molécula de ácido nucleico. Cuando una molécula de ácido nucleico se indica aquí como que tiene más de un fragmento de ácido nucleico, se entiende que estos fragmentos de ácido nucleico pueden ocupar porciones que no se superponen de la molécula de ácido nucleico.

Por "identidad de secuencia" se indica (en el contexto de comparar la secuencia de una molécula de ácido nucleico o un fragmento de ácido nucleico con una secuencia referencia o comparar la secuencia de aminoácido de un polipéptido con una secuencia referencia) que la molécula de ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico tiene la misma secuencia como la secuencia referencia o tiene un porcentaje especificado de nucleótidos que son los mismos en las locaciones correspondientes dentro de la secuencia referencia, cuando la secuencia de longitud completa de la molécula de ácido nucleico o fragmento de ácido nucleico está alineada óptimamente con la longitud completa de la secuencia referencia. Dentro de este contexto, se computa el porcentaje de nucleótidos que son los mismos entre dos secuencias con referencia a la longitud de la secuencia más larga. Se puede computar la identidad de secuencia entre ADN y ADN, ARN Y ARN, o ADN y ARN. Cuando se computa una identidad de secuencia entre ADN y ARN, es bien apreciado en la técnica que residuos de timidina sean equivalentes a residuos de uracilo para propósitos de este cálculo. Adicionalmente, es bien apreciado en la técnica que si el porcentaje de identidad de secuencia de la secuencia complemento inversa a la secuencia referencia es mayor que aquella de la secuencia directa, enlonces el porcentaje de identidad de secuencia es la primera cantidad. El algoritmo Needleman-Wunsch, por ejemplo, se puede usar para determinar la identidad de secuencia basada en alineamientos globales óptimos. Se puede computar la identidad de secuencia entre pOlipéptidos así como de acuerdo con métodos estándar. Están disponibles públicamente los programas de ordenador para determinar secuencias de ácido nucleico o identidad de polipéptido (por ejemplo, explosión de proteína) en, por ejemplo, la página web del European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI) o usando BLAS~que se encuentre la página web de la National Library of Medicine.

Por "sustancialmente idéntico" se indica (en el contexto de comparar la secuencia de una molécula de ácido nucleico un fragmento de ácido nucleico con una secuencia referencia de una molécula de ácido nucleico o comparar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido con una secuencia referencia) que las secuencias tienen una identidad de secuencia, como se calculó mediante el uso de métodos descritos anteriormente, de al menos 85% (por ejemplo, al menos 85%, 87%, 90%, 92%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o incluso 100%).

Por "resistencia a una plaga vegetal" se indica un nivel de resistencia a una plaga (por ejemplo, un insecto hemipteroide que succiona la savia tal como un psílido tal como los psílidos cítricos asiáticos) en una planta transgénica (o componente vegetal o célula) mayor que el nivel de resistencia en relación con una planta control (por ejemplo, una planta no transgénica). En una realización, el nivel de resistencia a una plaga en una planta transgénica es al menos 5 a 10% (y preferiblemente 20%, 30%, o 40%) mayor que la resistencia de una planta control. En otras realizaciones, el nivel de resistencia a la plaga es 50% mayor, 60% mayor, y más preferiblemente incluso 75% o 90% mayor que una planta control; con hasta 100% de resistencia comparada con una planta control que es más preferida. Se mide el nivel de resistencia usando métodos convencionales. Por ejemplo, se ensaya el nivel de resistencia a un psílido comparando la no capacidad de atracción de una hoja transgénica para los psílidos versus una hoja control. En otro ejemplo, se ensaya el nivel de resistencia a infestación de psílidos. Y en aún otro ejemplo, se ensaya el nivel de resistencia a alimentación de psílidos en plantas transgénicas versus planta de control como una medida para determinar la efectividad de expresión de un polipéptido heterólogo para conferir resistencia a la planta como es descrito aquí.

Por "operativamente vinculado" se indica que un gen y una secuencia regulatoria están conectados de tal manera que permiten expresión del gen cuando las moléculas apropiadas (por ejemplo, proteínas activadoras de la trascripción) están unidas a las secuencias regulatorias.

Por "polipéptido" o "proteína" se indica cualquier cadena de aminoácidos, independientemente de la longitud o modificación post-traduccional (por ejemplo, glicosilación fosforilación).

°

Por "célula vegetal" se indica cualquier célula de auto-propagación unida por una membrana semipermeable que contiene un plástido. Tal célula también requiere una pared celular si se desea propagación adicional. La célula vegetal, como es usada aquí incluye, sin limitación, cualquier célula obtenida de cultivos de suspensión de semillas, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, hojas, raíces, brotes, polen y microsporas.

Por "componente vegetal" se indica una parte, segmento, corte, líquidos, fibras, o un órgano obtenido de una planta intacta. Los componentes vegetales a manera de ejemplo incluyen, sin limitación, semillas, embriones somáticos, corteza, hojas, tallos, polen, raíces, brotes,

flores, zarcillos, frutos, troncos y portainjertos, jugos y concentrados de zumos, así como cualquier parte vegetal usada para la propagación vegetativa.

Por "transgén" se indica cualquier pieza de una molécula de ácido nucleico (por ejemplo, DNA) que se inserta por artificio en una célula , y se vuelve parte del genoma del organismo que se desarrolla a partir de aquella célula. Tal transgén puede incluir un gen que es parcialmente o enteramente heterólogo (es decir, foráneo) para el organismo transgénico, o puede representar un gen que tiene identidad de secuencia con un gen endógeno del organismo.

Por "transgénico~ se indica cualquier célula que incluye una molécula de ácido nucleico aislada (por ejemplo, una secuencia de ADN) que se inserta por artificio en una célula y se vuelven parte del genoma del organismo que se desarrolla a partir de aquella célula. Como es usado aquí, los organismos transgénicos son generalmente plantas transgénicas y el ADN (por ejemplo, un transgén) se inserta por artificio en el genoma nuclear o plastídico. Una planta transgénica puede contener una o más de las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas aquí.

Como se discutió aquí, se han identificado varios polinucleótidos, aislados o diseñados, y caracterizados, que son útiles en proporcionar resistencia contra psílidos. Por consiguiente, la invención proporciona un número de importantes avances y ventajas para la protección de plantas contra plagas. Por ejemplo, la invención facilita un método efectivo y económico para protección en la planta contra plagas de planta mediante disuasión de alimentación de plagas de insectos. Tal protección contra plagas reduce o minimiza la necesidad de prácticas químicas tradicionales (por ejemplo, aplicación de bactericidas o insecticidas o ambos) que son usados típicamente por granjeros para controlar el esparcimiento de plagas de planta y proporcionar protección contra plagas que causan enfermedades tal como los psílidos cítricos asiáticos y los psílidos de patata/tomate. Adicionalmente, debido a plantas con uno o más de los polinucleótidos descritos aquí son menos vulnerables a plagas y sus enfermedades, la invención proporciona adicionalmente mayor eficiencia de producción, así como para mejorar la calidad y rendimiento de una planta de cultivo agrícola tal como plantas de cultivos cítricos y plantas solanáceas. De esta forma, la invención contribuye a la producción de productos agrícolas cítricos de alta calidad y alto rendimiento, por ejemplo, frutas, jugos, así como cultivos que tienen puntos, defectos, y manchas reducidas que son causados por plagas que incluyen verdeado reducido debido a HLB; los productos agrícolas con mayor vida útil y menores costos de manipulación; y alta calidad y producción de cultivos para fines agrícolas, industriales y comerciales. Adicionalmente, porque la invención reduce la necesidad de protección química contra plagas de planta, la invención beneficia el ambiente donde los cultivos crecen.

DESCRIPCiÓN DETALLADA

Esta solicitud describe la producción de plantas transgénicas o componentes vegetales transgénicos que tienen resistencia a plagas de psílidos, en , por ejemplo, deteriorar la alimentación o infestación por psilidos en plantas cítricas transgénicas o componentes vegetales tales como, pero no limitados a, 'Hamlin' o naranjas dulces 'Valenicia', tomate, y patata.

Polinucleótidos y polipéptidos inhibidores de plagas de insectos

Los polinucleótidos sustancialmente idénticos a las siguientes secuencias son útiles para generar plantas transgénicas que tienen resistencia al insecto hemipteroide que succionan la savias (tal como para hacer una planta o componente vegetal no atractivo a, por ejemplo, psílidos). Las secuencias de polinucleótidos sintéticas pueden ser diseñadas de manera que serán expresadas en plantas. Son conocidas en la técnica una variedad de métodos

estándar para sintetizar genes de planta para mejorar el nivel de expresión de la proteína codificada por el gen sintetizado. Tales métodos, en general, se relacionan con la modificación de las secuencias de genes estructurales del transgén exógeno, para causarles a estos ser transcritos más eficientemente, procesados, traducidos y expresados por la planta. Las características de los genes que son bien expresados en plantas incluyen eliminación de secuencias que pueden causar empalme de ¡ntrones indeseados o poliadenilación en la región que codifica de un transcripto de gen mientras retiene sustancialmente la secuencia de aminoácidos del polipéptido expresado.

1. Hirsutellin A ("HtA"): un gen de ribotoxina del hongo, Hirsutella

a. "Nativo"

ATGAAGGCCTTTACTGCCATTCTCGCCAGCGCGGCCTTGTTCGCCACCGGCCTCGCGG CTCCCGCCTCAGAAGCCACCTCGGTGAACAGCCTGGAAGAGCGCGCTCCCATCGTCAC CTGCCGGCCCAAGCTCGACGGGCGGGAGAAGCCGTTCAAGGTAGACGTGGCGACGGC GCAGGCACAGGCGCGCAAGGCGGGCCTGACGACGGGCAAGAGCGGCGACCCTCACC GGTACTTCGCCGGCGACCACATCCGCTGGGGCGTCAACAACTGCGACAAGGCGGACG CGATCCTGTGGGAGTACCCGATCTACTGGGTCGGCAAGAACGCCGAGTGGGCCAAGG ACGTCAAGACGTCGCAGCAAAAGGGAGGGCCGACGCCGATCCGCGTCGTCTACGCCA ACAGCAGGGGCGCCGTGCAGTACTGCGGCGTCATGACGCACAGCAAGGTCGACAAGA ATAACCAGGGCAAGGAGTTCTTTGAGAAGTGCGATTAG (SEQ ID NO: 1)

b. Polipéptido:

Mel K A F TAl L A S A A L F A T G L AA P A S E A T S V N S L E E R A P I V T C R P K L DGREKPFKVDVATAQAQARKAGLTTGKSGDPHRYFAGDHIRW G V N N C D KADAI LW EY P I YWVG K NA EWAK DV KT SQ Q KG G PT P I R V V Y A N S R G A V Q y C G V Mel T H S K V D K N N Q G K E F F E K C D (SEQ ID NO: 2)

c. "Corto"

ATGGCTCCCATCGTCACCTGCCGGCCCAAGCTCGACGGGCGGGAGAAGCCGTTCAAG GTAGACGTGGCGACGGCGCAGGCACAGGCGCGCAAGGCGGGCCTGACGACGGGCAA GAGCGGCGACCCTCACCGGTACTTCGCCGGCGACCACATCCGCTGGGGCGTCAACAA CTGCGACAAGGCGGACGCGATCCTGTGGGAGTACCCGATCTACTGGGTCGGCAAGAA CGCCGAGTGGGCCAAGGACGTCAAGACGTCGCAGCAAAAGGGAGGGCCGACGCCGAT CCGCGTCGTCTACGCCAACAGCAGGGGCGCCGTGCAGTACTGCGGCGTCATGACGCA CAGCAAGGTCGACAAGAATAACCAGGGCAAGGAGTTCTTTGAGAAGTGCGATTAG(SEQ ID NO: 3)

d. Polipéplido:

Mel A P I V T C R P K L D G R E K P F K V D V A T A Q A Q A R K A G L T T G K S G D P H R YF AG D H I RWGV N N C D KA DA 1LW EY P I YW VG KN AEWA KDV KT S Q Q K G G P T PI R V V Y A N S R G A V Q Y C G V Mel T H S K V D K N N Q G K E F F E K C D (SEQ ID NO: 4)

2. ASAL: un gen de lectina de Allium ampeloprasum

a. Nativo:

ATGAGCGTGGCCACTGTAGCCACCATCCTAACCATTTTGGCATCTACATGCATGGCCAG AAACGTATTGGTGAACAACGAAGGACTGTACGCAGGCCAATCCCTAGTCGAGGAACAG TACACTTTTATAATGCAGGATGACTGCAACCTTGTACTGTATGAATACAGCACCCCCATC TGGGCCTCAAACACAGGCATCACCGGTAAAAATGGGTGCAGGGCCGTGATGCAGCCTG ATGGCAACTTTGTCGTCTACGATGTTAAGGGGCGTGCCGTCTGGGCCAGTAACAGCAG AAGAGGGAACGGGAACTATATCCTGGTGCTTCAGAAGGACAGAAACGTTGTTATTTACG GATCTGATATTTGGTCTACTGGCACATACCGGAAAAAAGTGGGTGGAACTGTTGTTATG GCTATGAGTGGTACGGTCGATGGAGGCTCCGCGATTGGACCGGTAACAGTGAATCAGA ATGTCACTGCCGTCCGAAAGGTTGCAGCAGCTGCTGCTGCTTGA (SEO ID NO: 5)

b. Polipéptido:

Met S V A T V A TI L TI L A S T C Met A R N V L V N N E G L Y A G O S L V E E O y T F I Met O D D C N LV L Y E Y S T P I W A S N T G I T G K N G C R A V Met O P D G N F V V YD VKG RAVWAS N S R RG N G N Y I L V LO K D R N VV IYG S D IW STGTY R K K V G G T V V Met AMet S G T V D G G S A I G P V T V N O N V T A V R K V A A AA A A (SEO ID NO: 6)

3. ASALR: un gen de lectina de Allium roseum

a. Nativo:

ATGAGCGTGGCCACTGTAGCCACCATCCTAACCATTTTGGCATCTACATGCATGGCCAG AAACGTATTGGTGAACAACGAAGGACTGTACGCAGGCCAATCCCTAGTCGAGGAACAG TACACTTTTATAATGCAGGATGACTGCAACCTTGTACTGTATGAATACAGCACCCCCATC TGGGCCTCAAACACGGGCATCACCGGTAAAAATGGGTGCAGGGCCGTGATGCAGCCTG ATGGCAACTTTGTCGTCTACGATGTTAAGGGGCGTGCCGTCTGGGCCAGTAACAGCAG AAGAGGGAACGGGAACTATATCCTGGTGCTTCAGAAGGACAGAAACGTTGTTATTTACG GATCTGATATTTGGTCTACTGGCACATACCGGAAAAAAGTGGGTGGAACTGTTGTTATG GCTATGAATGGTACGGTCGATGGAGGCTCCGCGATTGGACCGGTAACAGTGAATCAGA ATGTCACTGCCGTCCGAAAGGTTGCAGCAGCTGCTGCTGCTTGA (SEO ID NO: 7)

b. Polipéptido:

Met S V A T V A TI L TI L A S T C Met A R N V L V N N E G L Y A G O S L V E E O Y T F I Met O D D C N LV L Y E Y S T P I W A S N T G I T G K N G C R A V Met O P D G N F V V Y D V K G R A VW A S N S R R G N G N Y I LV L O K D R N V V I Y G S D I W S T G T Y R K K V G G T V V Met AMet N G T VD G G S A I G P V T V N O N V T A V R K V A AA A A A (SEO ID NO: 8)

c. Corto:

ATGAGGAACCTACTGACGAACGGCGAAGGACTGTATGCAGGGCAATCCCTAGATGTAG AACAGTACAAGTTTATAATGCAGGATGACTGCAACCTCGTATTGTACGAATACAGCACCC CCATCTGGGCCTCAAACACCGGTGTCACTGGCAAAAACGGGTGCAGGGCTGTCATGCA AAAGGACGGCAACTTTGTGGTCTACGATGTTAACGGGCGTCCCGTCTGGGCCAGTAAC AGTGTAAGAGGGAATGGGAACTATATCCTGGTGCTTCAGGAGGACAGGAACGTTGTCAT TTACGGCTCTGATATTTGGTCTACTGGTACCTACAGAAGATGA (SEO ID NO: 9)

d. Polipéptido:

Met L R N L L T N G E G L Y A G O S L D V E O Y K F I Met O D D C N LV L Y E Y S T P I WASNTGVTGKNGCRAVM.OKDGNFVVYDVNGRPVWASNSVRG N G N Y I LV L O E D R N V V I Y G S D I W S T G T Y R R (SEO ID NO: 10)

4. ACA: un gen de lectina de Allium cepa varoaggregatum

B. Nativo:

ATGAGCGTGGCCACTGTAGCCACCATCCTAACCATTTTGGCATCTACATGCATGGCCAG AAACGTATTGGTGAACAACGAAGGACTGTACGCAGGCCAATCCCTAGTCGAGGAACAG TACACTTTTATAATGCAGGATGACTGCAACCTTGTACTGTATGAATACAGCACCCCCATC TGGGCCTCAAACACGGGCATCACCGGTAAAAATGGGTGCAGGGCCGTGATGCAGCCTG ATGGCAACTTTGTCGTCTACGATGTTAAGGGGCGTGCCGTCTGGGCCAGTAACAGCAG AAGAGGGAACGGGAACTATATCCTGGTGCTTCAGAAGGACAGAAACGTTGTTATTTACG GATCTGATATTTGGTCTACTGGCACATACCGGAAAAAAGTGGGTGGAACTGTTGTTATG GCTATGAATGGTACGGTCGATGGAGGCTCCGCGATTGGACCGGTAACAGTGAATCAGA ATGTCACTGCCGTCCGAAAGGTTGCAGCAGCTGCTGCTGCTTGA (SEO ID NO: 11)

b. POlipéptido:

Met S V A T V A TI L TI L A S T C Met A R N V L V N N E G L Y A G O S L V E E O Y T F I Met O D D C N LV L Y E Y S T P I W A S N T G I T G K N G C R A V Met O P D G N F V V Y D V K G R A VW A S N S R R G N G N Y I LV L O K D R N V V I Y G S D I W S T G T Y R K K VG GTVV MetA MetN GTV D G G SA I G PVT V N O N VT AV R KVAAAA A A (SEO ID NO: 12)

c. Corto:

ATGAGAAACGTATTGGTGAACAACGAAGGACTGTACGCAGGCCAATCCCTAGTCGAGG AACAGTACACTTTTATAATGCAGGATGACTGCAACCTTGTACTGTATGAATACAGCACCC CCATCTGGGCCTCAAACACGGGCATCACCGGTAAAAATGGGTGCAGGGCCGTGATGCA GCCTGATGGCAACTTTGTCGTCTACGATGTTAAGGGGCGTGCCGTCTGGGCCAGTAAC AGCAGAAGAGGGAACGGGAACTATATCCTGGTGCTTCAGAAGGACAGAAACGTTGTTAT TTACGGATCTGATATTTGGTCTACTGGTACGTACAGGAAATGA (SEO ID NO: 13)

d. Polipéptido:

Met R N V L V N N E G L Y A G O S L V E E O Y T F I Met O D D C N LV L Y E Y S T P I W A S N T G I T G K N G C R A V Met O P D G N F V V Y D V K G R A V W A S N S R R G N G N Y I LV L O K D R N V V I Y G S D I W S T G T Y R K (SEO ID NO: 14)

5. ACT, un gen de lectina de Allium tuberosum

a. Nativo:

ATGAGCGTGGCCACTGTAGCCACCATCCTAACCATTTTGGCATCTACATGCATGGCCAG AAACGTATTGGTGAACAACGAAGGACTGTACGCAGGCCAATCCCTAGTCGAGGAACAG TACACTTTTATAATGCAGGATGACTGCAACCTTGTACTGTATGAATACAGCACCCCCATC TGGGCCTCAAACACAGGCATCACCGGTAAAAATGGGTGCAGGGCCGTGATGCAGCCTG ATGGCAACTTTGTCGTCTACGATGTTAAGGGGCGTGCCGTCTGGGCCAGTAACAGCAG AAGAGGGAACGGGAACTATATCCTGGTGCTTCAGAAGGACAGAAACGTTGTTATTTACG GATCTGATATTTGGTCTACTGGCACATACCGGAAAAAAGTGGGTGGAACTGTTGTTATG GCTATGAGTGGTACGGTCGATGGAGGCTCCGCGATTGGACCGGTAACAGTGAATCAGA ATGTCACTGCCGTCCGAAAGGTTGCAGCAGCTGCTGCTGCTTGA (SEO ID NO: 15)

b. POlipéptido:

MetS VATVAT I L TI LAST C MetAR N VLVN N EG L YAGO S LVE EOYT F I Met O D D C N LV L Y E Y S T P I W A S N T G I T G K N G C R A V Met O P D G N F V V Y D V KG RAVWAS N S R R G N G N Y I L V LO K D R N VV IYG S D IW STGTY R K K VG GTVV MetA Met S GTV DGG SA I G PVTV N O N VT AVR KVAAAA A A (SEO ID NO: 16)

c. Corto:

ATGAGAAACGTATTGGTGAACAACGAAGGACTGTACGCAGGCCAATCCCTAGTCGAGG AACAGTACACTTTTATAATGCAGGATGACTGCAACCTTGTACTGTATGAATACAGCACCC CCATCTGGGCCTCAAACACAGGCATCACCGGTAAAAATGGGTGCAGGGCCGTGATGCA GCCTGATGGCAACTTTGTCGTCTACGATGTTAAGGGGCGTGCCGTCTGGGCCAGTAAC AGCAGAAGAGGGAACGGGAACTATATCCTGGTGCTTCAGAAGGACAGAAACGTTGTTAT TTACGGATCTGATATTTGGTCTACTGGTACGTACAGGAAATGA (SEQ ID NO: 17)

d. Polipéptido:

Mel R N V L V N N E G L Y A G O S L V E E O Y T F I MelaD D C N LV L Y E Y S T P I W A S N T G I T G K N G C R A V Mel Q P D G N F V V Y D V K G R A V W A S N S R R G N G N Y I LV L O K D R N V V I Y G S D I W S T G T Y R K (SEQ ID NO: 18)

6. MpNPR1: un gen regulatorio implicado en la resistencia basal de la planta en manzana

a. Secuencia de nucleótidos:

ATGGCTCATTCAGCCGAACCATCATCCTCTCTGAGCTTTACTTCATCACCCCATTTATCA AATGGTTCAATAAGCCACAACTTATCGTGTTCTGGCTCCGAATCGGTGCCAAGTCTTGA AGTCATCAGTTTGTCCAAGCTTAGCTCTAGTTTGGAGCAGTTGTTGATTGATCCTGGCTG TGACTATAGTGATGCTGATATCGTAGTTGAGGGGATTCCTGTTGGTGTACACCGATGTA TATTGGCTTCTAGGAGTGGAI I IIIICGCGAGCTATTCAAGCGAGAAAAGGGGTCTTCT GGAAAGGAAGACAGGCCAAAGTACTGTATGAGTGATTTTCTGCCTTATGGCGATGTTGG ATATGAAGCCTTCTTGGTTTTCTTAAGCTATGTGTATACTGGAAAGCTTAAGCCTTCTCC CGTGGAGGTGTCAACCTGCGTTCACAATGTATGTGCCCATGACGCATGTAGACCTGCTA TCAATTTCGTTGTGGAATTGATGTACGCCGCTTCCATTTTCCAAATGCCCGATCTGGTTT CGATATTCGAGCGGCGCCTTCTTAATTTTGTTGGGAAAGCTCTGTCAGACAATGTTGTC CCAATTCTCTTGGTTGCCTTCCATTGTCAGTTGAATCAGCTCATCGATCAGTGTGTAGAT AGAGTGGCACGATCAGATATTGATGACATCTCTCTTGAGAAGGGACTTCCTGATGAGGT TGTGAAGAAAATCAAAATTCTTCGCCGCAATTATCAGCAGGATTCTGACCCAAACTTGCC ACCTGCCGATCCCTTGCATGAAAAGAGAATCCGAAGAATACATAAGGCTTTGGACTCGG ATGATGTCGAGCTTGTGAAACTTCTTTTAACGGAGTCTAATATAACCTTAGATGAAGCCA ATGCTCTCCATTATGCTGCAGCTTACTGCGATCCTAAGGTTGTGACCGAAGTGCTTGCT CTGGGCCTCGCTGATGTTAACCTCCGGAATTCTAGGGGTTATACAGTGCTTCACATTGC TGTGATGCGCAAAGAGCCATCAATTATTGTATTGCTACTGACTAAAGGAGCTCGTGCAT CGGAGCTGACATCAGATGGTCAGAGTGCTGTTAGTATTTGCAGGAGGTTGACGAGACC AAAGGATTACCATTCAAAAACAGAGCAGGGGCAAGAAGCAAACAAAGACCGAATATGCA TCGATGTTCTAGAGAGGGAAATGCGGCGGAATCCAATGGCTGGAGATGCATCTATATCT TCCCAAATAATGCCCGATGATCTGCACATGGAGTTGCTGAACCTGGAGAACAGAGTGGC ATTGGCCCGATTG I I I I I CCCTGCGGAAGCCAAGCTAGCCATGGTCATTGCCCATGCGG AGACATCTGAGTTTGCTGCGCCATCATCATCGAAAGGATCAAGTGGGAATCTGATGGAG GTAGATTTAAACGAGACCCCCACCGTGCAGAACAAAAGACTTCATTCCAGGTTGGAAGC CCTTATGAAAACAGTCCGTTTGGGTAGATGCTACTTCCCTCATTGCTCAGAAGTCCTGG ATAAGTTCATCGATGACGACCTCCCTCATTTGTTTTACCTCGAGCCTGGCTCCTCCGAC GAGCAGAAGGTAAAGAGGAGGCGTTTCATGGAGCTCAAGGAGGAAGTACAAAAAGCAT TTGACAAGGACAAGGCCGAGTGTAACCTCTCCGGATTGTCTTCATCGTCCTCCACGACA TCTCCGGAAAAAATTGGTGCAAATCAGAAGGTTAGGGAACCGTGA (SEO ID NO: 19)

b. Secuencia de polipéptidos:

MetAHSAEPSSSLSFTSSPHLSNGSISHNLSCSGSESVPSLEVISLSKLSSSLEQLLlDPGCDY SDADIWEGIPVGVHRCILASRSGFFRELFKREKGSSGKEDRPKYCMSDFLPYGDVGYEAFL VFLSYVYTGKLKPSPVEVSTCVHNVCAHDACRPAINFVVELMYAASIFQMPDLVSIFERRLLN

FVGKALSDNWPILLVAFHCQLNQLlDQCVDRVARSDIDDISLEKGLPDEVVKKIKILRRNYQQ DSDPNLPPADPLHEKRI RRIH KALDSDDVEL VKLLL TESN ITLDEANALHY AAA YCDPKVVTE VLALGLADVNLRNSRGYTVLHIAVMRKEPSI IVLLLTKGARASELTSDGQSAVSICRRL TRPK DYHSKTEQGQEANKDRICIDVLEREMRRNPMAGDASISSQIMPDDLHMELLNLENRVALARL FFPAEAKLAMVIAHAETSEFAAPSSSKGSSGNLMEVDLNETPTVQNKRLHSRLEALMKTVRL GRCYFPHCSEVLDKFIDDDLPHLFYLEPGSSDEQKVKRRRFMELKEEVQKAFDKDKAECNL SGLSSSSSnSPEKIGANQKVREP (SEQ ID NO: 20)

7. CsNPR1: un gen regulatorio implicado en la resistencia basal de las plantas en cítricos

Las secuencias de CsNPR1 útiles son aisladas e identificadas de acuerdo con métodos estándares. Por ejemplo, se extrae ADN genómico de C. sinensis cv. valencia (Four W inds Growers, Winters, CA) que usa un kit de extracción de ADN de planta E.Z.N.A. de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Omega Bio-Tek, Norcross, GA). Ya que no se ha publicado previamente ninguna secuencia de CsNPR1 de C. sinensis, se clona inicialmente una región genómica que incluye un fragmento 5' de la secuencia que codifica usando cebadores degenerados designados basados en alineamientos CLUSTAL hechos con secuencias mARN de MpNPR1 de Malus x domestica (acceso GenBank EU624123.1). Se amplificará un fragmento de 1800-pb aproximadamente a partir de ADN genómico de C. sinensis que usa cebadores CsNPR1degF1 (tggctgtgactatagtgatgct) (SEQ ID NO: 21) Y CsNPR1degR1 (ccctaaccttctgatttgcacc) (SEQ ID NO: 22) en una concentración final de 1 ¡..1M Y GoTaq Hot Start Mastermix (Promega, Madison, WI). Los parámetros de ciclo serán 95°C por 2 minutos, 35 ciclos de 95°C por 30s, 50°C por 30s, 72°C por 1 minuto, y una elongación final de 72°C por 5 minutos.

Se lleva a cabo entonces la amplificación rápida de 5' de extremos genómicos (RAGE) de acuerdo con Uu et al. (Plant Mol Biol Rep 19:261-267, 2001) para clonar la región corriente arriba de la secuencia que codifica CsNPR1. Brevemente, se extrae el ADN genómico de hojas de C. sinensis cv. valencia que usa el kit midi de ADN de planta OMEGA SP de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Omega Bio-Tek) y se realizan PCR usando cebadores designados inicialmente para templar cerca del extremo 5' en la secuencia que codifica CsNPR1. Progresivamente se obtienen fragmentos 5' corriente arriba que usan una estrategia del caminar del gen. Se clonan entonces todos los productos de PCR en un vector para secuenciación tal como pGEM-T fácil (Promega).

Constructos de expresión de planta

Se establece bien la construcción de casetes de expresión para uso en plantas tales como plantas solanáceas y cítricas. Los casetes de expresión son constructos de ADN donde varios promotores, que codifican, y secuencias de poliadenilación son vinculadas operativamente. En general, los casetes de expresión típicamente comprenden un promotor que está vinculado operativamente a una secuencia de interés que está vinculada operativamente con una región de poliadenilación o terminadora. En ciertas instancias que incluye, pero no está limitado a, la expresión de genes en una planta, también puede ser útil incluir una secuencia de intrón. Cuando se incluye una secuencia de intrón, está ubicada típicamente en la región líder 5' no traducida del transgén. En ciertas instancias, también puede ser útil incorporar secuencias no traducidas 5' específicas en un transgén para mejorar la estabilidad de la transcripción o para promover traducción eficiente de la transcripción .

Se puede usar una variedad de promotores en la práctica de esta invención. Se indica a una amplia clase de promotores útiles como "promotores" constitutivos que son activos en la mayoría de órganos de plantas a lo largo del desarrollo de la planta. Por ejemplo, el promotor puede ser un promotor viral tal como un promotor CaMV35S. Los promotores CaMV35S son activos en una variedad de tejidos de planta transformados y la mayoría de

órganos de plantas (por ejemplo, callo, hoja, semilla y raíz). Son particularmente útiles versiones mejoradas o duplicadas de los promotores CaMV35S. Otros promotores útiles son conocidos en la técnica.

También se pueden usar los promotores que están activos en ciertos tejidos de plantas (es decir, promotores específicos de tejido) para dirigir la expresión de proteínas inhibitorias de insectos divulgadas aquí. Ya que ciertas plagas de insectos tales como psílidos son insectos que succionan la savia que típicamente se alimentan mediante la inserción de sus probóscides en el tejido vascular de las plantas anfitrionas, los promotores que dirigen expresión de las proteínas inhibitorias de insectos o fragmentos de los mismos en el tejido vascular de las plantas transgénicas son particularmente útiles en la práctica de este invención. Los promotores específicos de floema a manera de ejemplo incluyen, sin limitación, el promotor de gen de peroxidasa Shpx6b. Otros promotores preferidos de floema útiles incluyen aquellos aislados de un gen de sintasa 1 de sacarosa (SUS1 ) tal como maíz, tabaco, cítricos, tabaco, o caña de azúcar. Una región promotora a manera de ejemplo de ciruela (Prunus domestica L. cv. Francesa Mejorada).

TCCAATGATTGCTCCCATTAGCTAATCAAATTAATAGTACATTATAGTATGATAAGATTCA GCATATTCTTCAAACTATCCTCTCATCTTTTTTTATTATAATGTGTGTACATAGTAATTAAA AACATTAATCCAAAACCCAAGTTGGATTACATTAAACCCGTGAACCCAATGGGCTAGAAT TGTAGGGTTTCATAGGGAACAACAACTGCAAAGTCTAAAAAGTAAGAGAAACTCTCGTG AAACGGGGATAGCATTTTTTGGTCTCCGGGGCAGTAACAACATGATACATAGGATAACT TTTCCGATACATATGACAACTTCTCCACATGTCATGTTGTTATTGGCCGGGGATAGCAAA ACAGTGCTATCCGCGGTATAGGTGAGTTTTTTTCCTAAAAAGCGGCCAAAAGTCCGACT TCTGAATCATCACCCAACCAGCACCTTCGCCGATTAGACCCATGCATGCCCCTCTTTCT CTGCACTTTCCCTGACCGCCACATATTTAI I I I I IATTTCACACCTTAATTCCATGAATTT GGTGCCTICAATGGG CCAGAAAATCCCAATGGATTTTTCTT GTTGCCCAAGCCCGACAAAAAAAGGCAAATGCTTGAATATCAAGGCTTAAAATTAAACA GCACAAAATTGATTAATCCTCTAATTTCTTTCCAAAAATCCTATCATATCCCATTTTCAATT TGTGAATTTACGAAATTACCCCTGTTTTTTTGATGACTTCTTCGGTCTTCGGGTAAGGAA ATGAGACTGATAAAATGGATATAATAGATTTCCGACCACCCTGCTGGAIIIIIIIIII GC CACTGCCCTTATTATCGTACGCTCCAAGII I IIIIIIIACTTGCCTATTTTGGTTCGCGGT

TCCACGCTATAAAGCGAGCTCACACCATCCACCAACCACCTCACTTCTCTTCTTCTCGT

TTCCATAGGCTTTCTCTCTCTCTCTGTGTTCTTTGTCTAGGTACACCTCATTTTCTCTTCC CATTTTTAIIIIICCTTGTGTTCTTGTTCTTCTTGTTGGGTTATTTCTTTAGGCTATATGGT CTTTGCTCIIII I IICTTTTGGTTCATCTCCCAAATCACATAGATCAATGCCTTCTGAATG TAGGGTTGAGTTTATTTGAGGGTATATACTCTGIIIIIGCTTTTCTGCACCAGTATTTTGT GCGGATCTCTGI I I I IAATTTTTTTCCGTCTGCTTTTGTTIGTTGAAAGTGAAAAAGCTGT

TTATCIIIIIGACTGGTTGGTCTGTTTCACTTCAACAAGCAACCAGTAGAAGAAGTGTT TTTC TTTA TCTTGA TGGTC I I I IICAGCTTCTCTTTTGGAGAAAAGATTGATTCTTGTCAA CATTCGCCAAATGCACCAIIIIIAIIIIICTTCTTCTTTGATAAAAAGCGTTTTCTCTGCTT TTGCTAAGCACCCTTAATTATTAATATTATAAGCCTGGATTTTTATGATGGGCTTGAAGCT TTTTATCTGTCCGCCACTCTGCAAATCCTTTATGGGTGCATCTAATTATTACATAATTAAA ACCTGGATCIIIIIIICATTATTCTTAACCACTATCTAAGGTTGCATCTTTGTTCAACCGC ACTGCTCTAATTAACGTTTGTATGAGGTGGTTGGTGGATGGTGTGTTTGGTTTTGAAAAA CTAAAGAAATTAGTCTTCTAGAATAATAAATAATATTAATAATAATAATATTATTATTATTGT AAAGTCTTCCTGTTAATGTTGGAATTATTGACTTGGTGGTGATTATCCATCTCIIIIIATT GCGAAGCTTCTGGATACCTTGTTATACTCACGGCTTGCTTTGTACTTGCAGIIIIIGAAG GTTCTCTGATTTACCAATCTGCTATCAATG (SEO ID NO 23)

ATG (en negrilla) muestra el codón de inicio del gen SUS1. Las secuencias subrayadas corresponden a los cebadores usados para estudio corriente abajo para realizar supresiones de constructos (en secuencias de 1379, 978 Y 672 nucleótidos). Las secuencias en negrilla cursiva en SEa ID NO:23 corresponden a elementos que confieren especificidad de xi lema en Phaseolus vulgaris descrito por la página web de Plant Care ( http://bioinformatics.psb . uge nt.be/webtools/plantca re/htm l/).

Aún otro promotor específico de floema útil es el promotor sintasa-I de sacarosa de Citrus sinensis (CsSUS1 p) (Singer et al., Planta 234:623-637 (201 1 ).)

También se pueden usar los elementos potenciadores de la transcripción en conjunción con cualquier promotor que está activo en la célula vegetal o con cualquier elemento promotor basal que requiere un potenciador para actividad en una célula vegetal. Los elementos potenciadores de la transcripción pueden activar la transcripción en diferentes células vegetales y son usualmente 100-200 pares de bases largos. Los elementos potenciadores pueden ser obtenidos mediante síntesis química o por aislamiento de elementos regulatorios que incluyen tales elementos, y pueden comprender nucleótidos de flanqueo adicionales que contienen sitios de enzimas de restricción útiles para facilitar manipulación subsecuente. Los elementos potenciadores pueden ser ubicados típicamente dentro de la región 5' hacia el sitio tapa de ARNm asociado con un promotor, pero también puede estar localizado en regiones que están 3' hacia el sitio tapa (es decir, dentro de una región 5' no traducida, un intrón, o 3' hacia el sitio de poliadenilación) para proporcionar niveles aumentados de expresión de genes vinculados operativamente. Tales potenciadores son bien conocidos en la técnica.

Adicionalmente secuencias líder 5' no traducidas pueden estar vinculadas operativamente a una secuencia que codifica de interés en un casete de expresión de planta. De este modo el casete de expresión de planta puede contener una o más secuencias líder 5' no traducidas que sirven para aumentar la expresión del ácido nucleico vinculado operativamente que codifica cualquiera de los polipéptido descritos anteriormente aquí.

Las secuencias que codifican péptidos que proporcionan la localización de cualquiera de los polipéptidos descritos aquí en orgánulos subcelulares pueden estar vinculadas operativamente a las secuencias que codifican el pOlipéptido particular. De esta forma se espera que polipéptidos que están vinculados operativamente a un péptido señal entren a la vía de secreción y puedan ser retenidos por orgánulos tales como el retículo endoplásmico o dirigido al vacuolo vinculando operativamente la retención apropiada o dirigiendo péptidos al terminal en C del polipéptido. Los ejemplos de péptidos de dirección vacuolar así como péptidos para dirigir los plástidos vegetales son bien conocidos en la técnica.

Como se notó anteriormente, la secuencia de polinucleótidos de interés también puede estar vinculada operativamente a una región 3' no traducida que contiene una señal de poliadenilación. Esta señal de poliadenilación proporciona la adición de una secuencia de poliadenilato hacia el extremo 3' del ARN. El gen 3' de sintasa de nopalina de plásmido (NOS) que induce tumores (Ti) de Agrobacterium y las regiones no traducidas del gen 3' ssRUBISCO ES de arveja contienen señales de poliadenilato y representan ejemplos no limitantes de tales regiones 3' no traducidas que pueden ser usadas en la práctica de está invención. Se entiende que este grupo de regiones de poliadenilación a manera de ejemplo no son limitantes y que alguien experto en la técnica puede emplear otras regiones de poliadenilación que están citadas explícitamente aquí.

Se puede usar cualquiera de los elementos de expresión de planta mencionados anteriormente con un polinucleótido diseñado para expresar uno o más de los polipéptidos codificados por cualquiera de los polinucleótidos descritos aquí (tal como un polipéptido que tienen identidad sustancial con HtA (nativo), HtA (corto), ASAL (nativo), ASALR (nativo), ASALR (corto), ACA (nativo), ACA (corto), ACT (nativo), o ACT (corto), MpNPR1 o CsNPR1 ) en una planta o componente vegetal. Se proporciona aquí los casetes de expresión de planta que incluye uno o más de los polinucleótidos descritos aquí que codifican uno o más de sus respectivos polipéptidos, o proteínas inhibitorias de insectos que codifican fragmentos de los mismos que proporcionarán la expresión de uno o más polipéptidos en una planta. Se puede evaluar una secuencia de polinucleótidos expresable de planta preferida para expresión óptima en células de protoplastos derivados de las especies de plantas de interés o una especie de planta relacionada, o de acuerdo con cualquiera de los métodos descritos aquí. Después de la selección de aquellas secuencias de polinucleótidos designadas que dan la mejor expresión , las secuencias seleccionadas son entonces transformadas en plantas estables para selección continúa.

Los constructos de ADN que incluyen los casetes de expresión de planta descritos anteriormente son típicamente mantenidos en varios vectores. Los vectores contienen secuencias que proporcionan la replicación del vector y las secuencias vinculadas covalentemente en una célula anfitriona. Por ejemplo, los vectores bacterianos contendrán orígenes de replicación que permiten replicación del vector en uno o más anfitriones bacterianos. Los vectores de transformación de planta mediados por Agrobacterium típicamente comprende secuencias que permiten replicación en tanto E. coN como Agrobacterium así como una o más secuencias "frontera" posicionadas de manera que permiten la integración del casete de expresión en el cromosoma de la planta. Los genes que codifican marcadores seleccionables que confiere resistencia a antibióticos son también incluidos típicamente en los vectores para proporcionar su mantenimiento en huéspedes bacterianos.

Plantas transgénicas y métodos para obtener plantas transgénicas inhibitorias de insectos

También son proporcionados por este invención los métodos de obtención de una planta transgénica (o un componente vegetal transgénico) capaz de inhibir plagas de insectos. Primero, se introducen los vectores de expresión adecuados para expresión de cualquiera de los polipéptidos divulgados aquí en una planta, una célula vegetal o un tejido de planta que usa técnicas de transformación de acuerdo con métodos estándar bien conocidos en la técnica. Después se obtiene una planta transgénica en contiene el vector de expresión de planta mediante regeneración de aquella planta transgénica de la planta, célula vegetal o tejido de planta que recibió el vector de expresión. El paso final es obtener una planta transgénica que expresa una cantidad inhibitoria de insectos del polipéptido. Las plantas transgénicas expresan cantidades inhibitorias de insectos o más polipéptidos (tal como sustancialmente idénticos a HtA (nativo), HtA (corto), ASAL (nativo), ASALR (nativo), ASALR (corto), ACA (nativo), ACA (corto), ACT (nativo), o ACT (corto), MpNPR1 o CsNPR1

o cualquier combinación de los mismos) contemplados aquí incluyen, pero no están limitados a, plantas solanáceas tales como tomate y patata y plantas cítricas tales como naranjas, limones, limas, y pomelo.

Se pueden introducir los vectores de expresión de planta en los cromosomas de una planta anfitriona a través de métodos tales como transformación mediada por Agrobacterium, transformación mediada de partícula, transfección de ADN, o electroporación de AON, o mediante la llamada transformación mediada por bigotes. Los métodos a manera de ejemplo de introducción de transgenes son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, métodos para producción de cítricos transgénicos a través de la transformación mediada de Agrobacterium de tejido juvenil o adulto se describen en Orbovié y Grosser, "Chapter 17: Citrus" in Agrobacterium Protoco/s, Segunda Edición, Volumen 2, Kan Wang, editor, Humana Press, Totowa, Nueva Jersey (2006).

Aquellos expertos en la técnica apreciarán adicionalmente que se puede usar cualquiera de estas técnicas de transferencia de genes para introducir el vector de expresión en el cromosoma de una célula vegetal, un tejido vegetal, una planta, o un componente vegetal.

Después de que se introduce el vector de expresión de planta en una célula vegetal o tejido vegetal, las células o tejidos transformadas o tejidos son regenerados típicamente en plantas completas cultivando estas células o tejidos bajo condiciones que promueven la formación de una planta completa (es decir, el procedimiento de regeneración de hojas, tallos, raíces y, en ciertas plantas, tejido reproductivo). El desarrollo o regeneración de plantas transgénicas a partir de protoplastos de una sola planta o de diversos explantes es bien conocido en la técnica. Este procedimiento de regeneración y crecimiento típicamente que incluye los pasos de selección de células transformadas y cultivo de células seleccionadas bajo condiciones que producirán plántulas enraizadas. Los brotes enraizados transgénicos resultantes se plantan posteriormente en un medio de crecimiento de planta apropiado tal como el suelo. Las plantas transgénicas que tienen incorporados en sus genomas segmentos de ADN transgénico que codifican uno o más de los polipéptidos descritos aquí están dentro del alcance de esta invención. Se reconoce adicionalmente que plantas transgénicas que contienen los constructos de DNA descritos aquí, y materiales derivados de los mismos, se pueden identificar a través del uso de PCR u otros métodos que pueden detectar específicamente las secuencias en los constructos de ADN.

Una vez se regenera o recupera una planta transgénica, se puede usar una variedad de métodos para identificar u obtener una planta transgénica que expresa una cantidad inhibitoria de uno o más de los polipéptidos descritos aquí. Una configuración general de métodos es realizar ensayos que miden la cantidad del pOlipéptido que se produce. Alternativamente, se puede determinar la cantidad de ARNm producido por la planta transgénica para identificar plantas que expresan cantidades inhibitorias de insectos del polipéptido.

También se pueden identificar las plantas transgénicas que expresan cantidades inhibitorias de insectos del polipéptido mediante el ensayo directo de tales plantas para inhibición de insectos, por ejemplo como se describió aquí.

Control de plagas de insectos que succionan la savia

Se pueden usar las plantas transgénicas que incluyen polinucleótidos que codifican uno o más de los polipéptidos descritos aquí o fragmentos inhibitorios de insectos de los mismos en métodos de control de infestaciones de insectos.

Las plantas transgénicas a manera de ejemplo incluyen, sin limitación, plantas cítricas tales como, pero no limitadas a, naranjas dulces 'Hamlin' o 'Valencia' (Citrus sinensis L.), y plantas solanáceas tal como la patata (So/anum tuberosum L.).

Las plantas transgénicas de cítricos tales como una naranja transgénica (tal como 'naranja dulce Hamlin') y la patata o tomate que son atacadas por plagas de insectos succionadoras de savia inhibidas por uno o más de los polipéptidos descritos aquí son útiles en la agricultura.

Las plantas transgénicas preferidas (o componentes vegetales transgénicos) incluyen polinucleótidos que codifican uno o más polipéptidos descritos aquí o fragmentos inhibitorios de insectos de los mismos que están protegidos contra la alimentación o infestación de insectos que succionan la savia. Tales plantas transgénicas son particularmente efectivas para controlar especies de insectos hemipteroides que succionan la savia tales como psílidos que perforan y/o succionan los fluidos de las células y tejidos de plantas.

Se identifican primero las plantas transgénicas que expresan cantidades inhibitorias de insectos del polipéptidos inhibitorios de insectos o fragmentos inhibitorios de insectos de los mismos por uno de los métodos descritos aquí. Se puede conducir la inhibición de insectos inicial en condiciones ambientales controladas (es decir, en cámaras de crecimiento cerradas o invernaderos) que evalúan alimentación de insectos (por ejemplo, psílidos). También se pueden someter a las plantas transgénicas a infestación de insectos en pruebas

de campo y comparadas contra plantas de control no transgénicas. Si se desea, las plantas de control transgénicas incluirán tanto plantas tratadas con insecticidas como plantas no tratadas. Las líneas de plantas transgénicas (es decir, plantas transgénicas derivadas de eventos de transformación distintos que incluyen inserciones de transgenes en locaciones 5 genéricas diferentes) que muestran la actividad inhibitoria de insectos (tal como hacer una planta menos atractiva a la infestación o alimentación de psílidos), son seleccionadas para desarrollo potencial para uso en una variedad de diferentes antecedentes genéticos (es decir, variedades genéticamente distintas, variedades y/o germoplasmas híbridos). Son bien conocídos por aquellos expertos en la técníca los métodos de introgresíón de transgenes en 10 germoplasmas distintos y producir lotes de semilla que incluyen primariamente semillas transgénicas. Por ejemplo, se puede fijar el transgén en un estado homocigótico en un antecedente genético deseado. Una vez se fija el transgén en aquel antecedente, se puede usar la planta transgénica homocigótica para producir semillas transgénicas de cultivos no híbridos. Alternativamente, se puede usar la planta transgénica homocigótica como un

15 donante de polen o recipiente para producir semillas transgénicas de cultivos híbridos.

En esta invención se contemplan tipos específiCOS de plantas transgénicas que expresan polipéptidos inhibitorios de insectos que inhiben plagas de insectos específicas. Se contemplan específicamente plantas cítricas transgénicas tales como, pero no limitadas, a plantas de naranjas 'Hamlin' o 'Valencia' que expresan polipéptidos inhibitorios de insectos

20 que inhiben los psílidos cítricos asiáticos.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos son representativos de la invención. Los detalles específicos divulgados aquí na se deben interpretar como limitantes.

Ejemplo 1 -Constructos de expresión de plantas

25 Las representaciones esquemáticas de los constructos transformantes descritos aquí se muestran en las Tablas 1 y 2. Todos los vectores se produjeron usando protocolos estándar e incluyen pBINplus (van Engelen et aL, Transgenic Res 4: 288-290, 1995) con un múltiplo PZP-RSC1 insertado (Hajdukiewicz et al., Plant Mol Biol. 25: 989-994, 1994) como antecedente, y se verificaron por secuenciación antes de la transformación. Todos los

30 constructos contenían un promotor 35S parcialmente duplicado (indicado aquí como 35S, Kay el al., Science 236: 1299-1302, 1987), el promotor del gen de la peroxidasa Shpx6b de la leguminosa Stylosanthes humilis (Curtis et aL, MPMI 10: 326-338, 1997), el promotor de sacarosa sintasa 1 (SUS1) de ciruela (Prunus domestica L cv. Francés mejorada) clonado como se describió aquí, y el promotor de sacarosa sintasa-I de Citrus sinensis (CsSUS1)

35 (Singer et al., Planta 234: 623-637, 2011) fusionado con el terminador transcripcional de la nopalina sintasa (nos-t). Se insertaron entonces todos los casetes de fusión nos-t de promotor en el sitio de clonación múltiple en un vector pBINplus y se clonaron en la cepa OH-50 de Escherichia coli, que usa el kit pGEMTeasy (Promega, Madison, EE.UU.) según las instrucciones del fabricante .

40 Posteriormente, se obtuvieron versiones nativas y maduras (corto) de constructos de AONC mediante amplificación por PCR de preparaciones de AONc a partir de tejidos de Hirsutella thompsonii, Malus x domestica, Allium cepa assagi (ACA), Al. Roseum (ASALros) y Al. Ampeloprasum (ASAL). Los cebadores para la amplificación de las secuencias de AONc nativo y maduro de HtA se obtuvieron de Boucias et aL, J. de invert PathoL 72: 258 -261 ,

45 1998, pero modificado para contener los sitios de restricción BamHI y Sacl para facilitar la clonación, en el extremo 5 'y 3', respectivamente. Los cebadores para la amplificación del AONc de MpNPR1 se obtuvieron secuencias de ARNm de Malus x domestica (acceso GenBank EU624123.1), pero se modificaron para contener sitios de restricción BamHI y Sacl para facilitar la clonación, en el extremo 5 'y 3', respectivamente. Los cebadores para

los genes Allium nativos y maduros (corto) también se modificaron para contener los sitios de restricción BamHI y Sacl para facilitar la clonación, y se diseñaron a partir de secuencias conocidas (acceso GenBank no. U58947 para ASAL y número de acceso L 12172 para ACA). Estos cebadores son los siguientes:

5

ASAL nativo: cebador F 5'-GGCGGATCCATGGGTCCTACTACTTCATCTCCT-3' (SEO ID NO: 24),

ASAL nativo: cebador R 5'-GGCGAGCTCTCAAGCAGCACCGGTGCCAACCTT-3' (SEO ID NO: 25),

10

ACA nativo: cebador F 5'-GGCGGATCCATGAGAAACGTATTGGTGAACAA-3' (SEO ID NO: 26),

ACA nativo: cebador NO: 27),

R 5'-GGCGAGCTCTCATTTCCTGTACGTACCAGTAGA-3' (SEO ID

ASAL maduro: cebador F 5'-GGCGGATCCATGAGGAACCTACTGACGAAC-3' NO: 28),

(SEO ID

15

ASAL maduro: cebador R 5'-GGCGAGCTCTCATCTTCTGTAGGTACCAGTAGA-3' (SEO ID NO: 29),

ACA maduro: cebador F 5'-GGCGGATCCATGAGCGTGGCCACTGTAG-3' (SEO ID NO: 30), y

ACA maduro: cebador R 5'-GGCGAGCTCTCAAGCAGCAGCAGCTGC-3' (SEO ID NO: 31),

20

Todas las amplificaciones por PCR se realizaron utilizando Platinum PCR SuperMix High Fidelity de acuerdo con las instrucciones del fabricante (lnvitrogen, San Diego, CA) con el siguiente perfil térmico: 94°C durante 2 minutos, seguido de 30 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 55°C o e durante 30 segundos y68 o e durante 2 minutos.

2S

Adicionalmente a los genes individuales, se prepararon dos casetes de fusión de gen. La primera fue una fusión entre las secuencias maduras de HtA, ACA (de Al. Cepa assag/) y ASAL (Al. Ampe/oprasum) denominada HtA::ACAas::ASALam. El segundo contenia la secuencia madura de la ACA y el gen ASAL de Al. Roseum y designado como ACAros::ASALros. El casete de fusión HtA::ACAas: :ASALam se realizó por PCR con los siguientes cebadores:

30

HTA delantero 5'-GGATCCGAATTCGGCTTCATATGGCTCC-3' (SEO ID NO: 32),

HTA cebador reverso 5'-CCCCGGGATCGCACTTCTCAAAGAACTCCT-3' (SEO ID NO: 33),

ACAassagi cebador delantero 5'-CCCGGGAGAAACGTATTGGTGAACAACGA-3', (SEO ID NO: 34),

35

ACAassagi cebador reverso 5'-GGTACCTTTCCGGTATGTGCCAGTAGAC-3' (SEO ID NO: 35),

ASALampeloprasum (SEO ID NO: 36),

cebador delantero 5'-GGTACCAGGAACCTACTGACCAACGGC-3'

y

40

ASALampeloprasum cebador reverso 5'-GAGCTCTCACCTTCTGTAGGTACCAGTAGACC3'.(SEO ID NO: 37).

Similarmente, el casete de fusión ACAros::ASALros se hizo por PCR usando los siguientes cebadores:

ACAros cebador delantero 5'-CCCGGGATGAGAAACGTATTGGTGAACAACG-3' (SEO ID NO: 38),

5 ACAros cebador delantero 5"-GGTACCTTTCCGGTATGTGCCAGTAGAC-3' (SEO ID NO:

39),

ASALros cebador delantero 5'-GGTACCAGGAACCTACTGACCAACGGC-3' (SEO ID NO: 40), y

ASALros cebador delantero 5'-GAGCTCTCACCTTCTGTAGGTACCAGTAGACC-3' (SEO ID 10 NO:41).

Para la creación de ambos casetes de fusión, se usó el kit Platinum PCR SuperMix High Fidelity PCR Mix (Invitrogen, San Diego, CA) según las instrucciones del fabricante con el siguiente perfil térmico: 94°C durante 2 minutos, seguido de 30 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 6Soe durante 2 minutos.

15 Después de la preparación de los ADNc, se purificaron los vectores pBINplus de la fusión nos-t del promotor descritos anteriormente de la cepa DH-50 de Escherichia coJi, y diversas combinaciones de los ADNc de genes individuales (por ejemplo, HtA nativo, ACA corto, MpNPR1, etc.) y se insertaron los casetes de fusión de genes maduros (es decir, HtA :. ACAas :: ASALam y ACAros :: ASALros) entre el terminador y promotor de nopalina sintasa

20 (nos-t) usando digestión con enzimas de restricción y ligación de acuerdo con la práctica habitual. Después de la ligación, los vectores se transformaron de nuevo en la cepa OH-50 de Escherichia coN, usando el kit pGEMTeasy (Promega, Madison, EE.UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante para esperar la transformación en la cepa EHA105 de Agrobacterium para la transformación de plantas.

25 Tabla 1. Constructos

Nombre de Constructo

Promotor Contenidos de casetes Fuente de origen de genes expresados

JM202

CaMV35S 35S :35S::nos-t

JM220

CaMV35S 35S::35S :HtA nativo :nos-t Hirsutella

JM204

CaMV35S 35S::35S :HtA corto::nos-t Hirsutella

JM275

CaMV35S 35S::35S::ACA nativo::nos-t Allium cepa varo aggregatum

JM276

CaMV35S 35S :35S::ACA nativo::nos-t Allium tuberosum

JM277

CaMV35S 35S::35S::ACA corto::nos-t Allium cepa varo aggregatum

JM278

CaMV35S 35S :35S::ACA corto::nos-t Allium tuberosum

JM273

CaMV35S 35S::35S::ASAL nativo :nos-t Allium roseum

JM272

CaMV35S 35S::35S::ASAL nativo :nos-t Allium ampeloprasum

JM274

CaMV35S 35S::35S::ASAL corto :nos-t Allium roseum

JM282

CaMV35S 35S::35S::HIA corto::ACA corto::ASAL corto::nos-t HirsuteJJa, Allium cepa varo aggregatum, Allium tuberosum

JM283

CaMV35S 35S::35S::ACA corto::ASAL corto::nos-t Allium tuberosum, Allium roseum

JM210

CaMV35S 35S::35S::GUS::nos-1

JM206

Shpx6b Shpx6b :nos-t

JM221

Shpx6b Shpx6b :HIA corto :nos-t Hirsutella

JM264

Shpx6b Shpx6b::HIA corto::ACA corto::ASAL corto::nos-t Hirsutella, Allium cepa varo aggregatum, Allium tuberosum

JM285

Shpx6b Shpx6b::ACA corto::ASAL corto::nos-t Allium luberosum, Allium roseum

Tabla 2. Constructos adicionales

Nombre de Constructo

Promotor Contenidos de casetes Fuente de origen de genes expresados

EK101

Sus1 Susl::HIA corto::ACA corto::ASAL corto::nos-t Prunus domestica, HirsuteJJa, Allium cepa varo aggregatum, Allium tuberosum

EK102

Sus1 Susl :MpNPR1::nos-1 Prunus domestica, Malus x domestica

EK103

Su51 Sus 1::CsNPR1 ::nos-t Prunus domestica, Citrus sinensis

EK104

CsSUS1 CsSUS1::HIA corto::ACA corto::ASAL corto :nos-t Citrus sinensis, HirsuteJla, Allium cepa varo aggregatum, AJlium tuberosum

EK105

CsSUS1 CsSUSl :MpNPRl ::nos-I Citrus sinensis, MaJus x domestica

EK106

CsSUS1 CsSUSl ::CsNPRl ::nos-I Citrus sinensis

Ejemplo 2

5 Las plantas de tomate transgénicas se obtuvieron por transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens de acuerdo con métodos estándar que usan los constructos de expresión de plantas descritos en el Ejemplo 1.

Se bio-ensayaron las plantas transgénicas por el atractivo a los psílidos de tomate, B. cockerelli, ubicándolos en pequeñas cámaras que contienen hojas transgénicas y no transformadas de control. Aquellas plantas en cuyas hojas los psílidos no permanecieron se identificaron como menos atractivas para los psílidos, y por lo tanto menos probables ser 5 probadas por las probóscides de alimentación de los psílidos. Un ensayo típico implica la preparación de una cámara que contiene hojas de control y de tomate transgénico e introducción de aproximadamente 5 psílidos en la cámara. De dieciocho a veinticuatro horas después de configurar el ensayo, la localización de los psílidos se controla contando el número de psílidos en una hoja transgénica en comparación con el número en las hojas de

10 control. Las líneas de plantas transgénicas se toman como útiles cuando se encuentran O o 1 psílidos en hojas transgénicas, con un mayor número de psílidos encontrados en las hojas de control.

En algunos experimentos, pero no en todos, las hojas transgénicas eran menos atractivas para los psílidos que las hojas de control. La Tabla 3 a continuación muestra resultados 15 seleccionados de líneas transgénicas identificadas como menos atractivas para psílidos.

Tabla 3

Constructo

Promotor Gen Fuente # de Líneas transgénicas #de Líneas no atractivas % de Líneas no atractivas

204

35S Hta corto Hirsutella 12 4 33

221

Shpx6b Hta corto Hirsutella 8 4 50

Total

Hta corto Hirsutella 20 8 40

272

35S ASAL A larqo Allium ampelopra sum 27 3 11

274

35S ASAL R corto Allium roseum 20 3 15

277

35S ACA corto Allium cepa aggregatu m 86 14 16

278

35S ACT corto Allium tuberosum 49 7 14

282

35S Hta-ACAASAL R Hirsutella, AlJium cepa aggregatu m, y AlJium roseum 34 5 15

283

35S ACAASAL R AlJium cepa aggregatu m y AlJium roseum 35 9 26

1 NPR1

135S 1MR1PNP 1 . Manzana 122

El gen Hta del hongo de Hirsutefla fue más efectivo en el tomate en la disuasión psilidos de alimentación. La construcción apilada con dos genes de aglutinina de Allium (ACA-ASALR) fue efectivo para disuadir la alimentación de psílidos también.

S

Ejemplo 3 -Prevención de verdeado cítrico

10 15

Se causa el verdeado de los cítricos (Huanglongbing, HLB) por una bacteria con paredes limitadas de f1oema , Candidatus Liberibacter asiaticus. Se vectoriza HLB por los psílidos cítricos asiáticos (Diaphorina cito). Los bioensayos de plantas de tomate que se han transformado con varios genes del hongo de Hirsulella que coloniza insectos y de las especies Allium (la familia de la cebolla) evidenciaron que la incorporación de estos genes en líneas transgénicas inhibía la alimentación por insectos psílidos. Los constructos que representan las plantas de tomates "no atractivas" a los psílidos de tomate se prueban a continuación en plantas de naranjas para determinar si tales constructos hacen que las plantas de naranjas no sean atractivas para los psílidos de cítricos asiáticos, y por lo tanto, podrían interferir con la transmisión de la bacteria que causa HLB.

Las plantas de naranja dulce 'Hamlin' transgénica (Citrus sinensis (L.) Osbeck) se obtienen por transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens de acuerdo con métodos estándar que usan los constructos de expresión de plantas descritos en el Ejemplo 1. Las constructos JM204, JM277 Y JM282 son especialmente útiles en la in vención.

20

En particular, se han generado plantas de Hamlin transgénicas usando constructos JM277 (ACA corto) y JM282 (Hta-ACA-ASALR).

25

Las plantas transgénicas de Hamlin son identificadas y bio-ensayadas en la capacidad de atraer a los psílidos de cítricos asiáticos mediante la ubicación de psílidos en pequeñas cámaras que contienen hojas transgénicas y de control no transformadas (por ejemplo, hojas juveniles) como se describe en el Ejemplo 2. Aquellas plantas en cuyas hojas los psílidos no permanecen se identifican como menos atractivos para los psílidos como se describió en el Ejemplo 2, y por lo tanto menos probables de ser probadas por las probóscides de alimentación de psílidos. Tales plantas cítricas transgénicas no atractivas se toman como útiles en la invención.

30

Ejemplo 4 -Prevencíón de los psílídos amarillos y la enfermedad de la viruela cebra en patatas

35 40

La enfermedad de la viruela cebra en las patatas se piensa para ser causada por Liberibacter solanacearum, vectorizada por B. cockerelli, los psílidos de patata/tomate. Los psílidos amarillos es una enfermedad de patata que se cree que es causada por una toxina producida por la etapa de la ninfa de los psílidos de patata/tomate. Los bioensayos de plantas de tomate que se han transformado con varios genes del hongo de Hirsutella que coloniza insectos y de las especies Allium (la familia de la cebolla) evidenciaron que la incorporación de estos genes inhibía la alimentación por insectos psílidos. Se plantea la hipótesis de que la "no capacidad de atraer" de estas plantas de tomate transformadas a B. cockerelli sugieren que la transformación de los mismos genes en las plantas de patata reducirá la alimentación de los psílidos y por lo tanto, interferir con la transmisión de Liberibacter soJanacearum, a causa de la enfermedad de la vi ruela de la cebra, y la toxina que induce psílidos amarillos.

45

Se obtienen las plantas de patata transgénica (Solanum tuberosum L.) por transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens de acuerdo con métodos estándar que usan los

22

constructos de expresión de plantas descritas en el Ejemplo 1. Se prevé que los constructos JM204, JM277 Y JM282 son especialmente útiles en la invención.

Las plantas de patata transgénicas son identificadas y bio-ensayadas por no atraer a B. cockerelli que ubican los insectos en pequeñas cámaras que contienen hojas transgénicas y

5 no transformadas de control como se describió en el Ejemplo 2. Aquellas plantas en cuyas hojas los psílidos no permanecen, son identificadas como menos atractivas a los psílidos como se describió en el Ejemplo 2 y, por lo tanto es menos probable que sea probada por las probóscides de alimentación de los psílidos y para ser los receptores de bacterias y toxinas. Se toman tales plantas transgénicas no atractivas como útiles en la invención.

10 Puesto que pueden realizarse diversas modificaciones en las construcciones y métodos descritos e ilustrados aquí sin apartarse del alcance de la invención, se pretende que todo el componente contenido en la descripción anterior se debe interpretar como ilustrativo en vez de limitante. Por lo tanto, la amplitud y el alcance de la presente invención no deberían estar limitados por ninguna de las realizaciones a manera de ejemplo descritas anteriormente,

15 sino que deberían definirse únicamente de acuerdo con las siguientes reivindicaciones adjuntas y sus equivalentes.

TEXTO LIBRE DEL LISTADO DE SECUENCIAS

A continuación se aporta una traducción del texto libre en inglés que aparece en la lista de secuencias.

20 Artificial Sequence: Secuencia artificial.

Synthetic Primer: Cebador sintético.

Claims (22)

1. REIVINDICACIONES

   1. Una planta que comprende un transgén que codifica un pOlipéptido heterólogo que confiere en dicha planta la expresión de dicha resistencia de polipéptidos a un insecto hemipteroide que succionan la savia,

   en la que dicha planta comprende uno o más de un gen de ribotoxina, un gen de lectina, o un gen regulador implicado en la resistencia basal de la planta,

   en la que dicho gen de ribotoxina es sustancialmente idéntico a Hirsutellin A ("HtA") nativa (SEO ID NO: 1) o Hta "corto" (SEO ID NO: 3),

   en la que dicho gen de lectina es sustancialmente idéntico a ASAL "nativo" (SEO ID NO: 5), ASALR nativo (SEO ID NO: 7), ASALR corto (SEO ID NO: 9), ACA nativo (SEO ID NO: 11), ACA corto (SEO ID NO: 13), ACT nativo (SEO ID NO: 15), o ACT corto (SEO ID NO: 17),

   en la que dicho gen regulador es sustancialmente idéntico a MpNPR1 (SEO ID NO: 19) o CsNPR1.

2. 2.

   La planta de la reivindicación 1, en la que dicho transgén se expresa en un componente vegetal.

3. 3.

   La planta de la reivindicación 2, en la que dicho componente vegetal es una hoja.

4. 4.

   La planta de la reivindicación 1, en la que dicho insecto es un psílido.

5. 5.

   La planta de la reivindicación 4, en la que dicho psílido es el psílido cítrico asiático, el psílido cítrico asiático, el psílido cítrico asiático.

6. 6.

   La planta de la reivindicación 1, en la que dicha planta es una planta cítrica o una planta solanácea.

7. 7.

   La planta de la reivindicación 1, en la que dicho pOlipéptido es sustancialmente idéntico a HtA (nativo) (SEO ID NO: 2), HtA (corto) (SEO ID NO: 4), ASAL (nativo) (SEO ID NO: 6), ASALR (nativo) (SEO ID NO: 8), ASALR (corto) (SEO ID NO: 10), ACA (nativo) (SEO ID NO: 12), ACA (corto) (SEO ID NO: 14), ACT (nativo) (SEO ID NO: 16), ACT (corto) (SEO ID NO: 18), MpNPR1 (SEO ID NO: 20) o CsNPR1.

8. 8.

   La planta de la reivindicación 7, en la que los polinucleótidos que codifican los polipéptidos están apilados.

9. 9.

   Un producto derivado de la planta de la reivindicación 1, en la que dicho producto comprende una cantidad detectable de dicho transgén o dicho polipéptido o un gen de resistencia a herbicidas o ambos

10. 10.

    El producto de la reivindicación 9, en la que dicho producto es un producto cítrico, un producto de patata o un producto de tomate.

11. 11 . Una planta de la reivindicación 1, que comprende además un gen de resistencia a herbicidas que confiere resistencia a un herbicida.

12. 12.

    Un polinucleótido que tiene identidad sustancial con HtA (nativo), HtA (corto), ASAL (nativo), ASALR (nativo), ASALR (corto), ACA (nativo), ACA (corto), ACT (nativo), ACT (corto), MpNPR1 , o CsNPR1 opcionalmente en el que dicho polinucleótido está operativamente vinculado a una secuencia regulatoria heteróloga, y en el que dichas secuencias regulatorias comprenden un promotor.

13. 13.

    El polinucleótido de la reivindicación 12, en la que dicho polinucleótido es complementario de al menos 20 nucleótidos contiguos de una secuencia seleccionada del grupo de HIA (nativo), HIA (corto), ASAL (nativo), ASALR (nativo), ASALR (corto), ACA (nativo), ACA (corto), ACT (nativo), ACT (corto), MpNPR1, o CsNPR1 o

    sustancialmente idéntico a cualquiera de los polinucleótidos anteriormente mencionados.

14. 14.

    Un constructo de polinucleótido que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 12-13.

15. 15.

    El constructo de polinucleótido de la reivindicación 14, en el que dicho polinucleótido se expresa en el tejido de floema de una planta.

16. 16.

    Una célula vegetal o un componente vegetal que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 12 -15.

17. 17.

    Una célula bacteriana que comprende el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 12 -15.

18. 18.

    Una planta transformada de forma estable con el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 12 -15.

19. 19.

    Un componente vegetal o una semilla de la planta de la reivindicación 18, en el que dicho componente vegetal o semilla comprende dicho polinucleótido.

20. 20.

    Una progenie o un componente vegetal de la planta de la reivindicación 18, donde dicha progenie comprende dicho polinucléotido.

21. 21.

    la planta de la reivindicación 18, en la que dicha planta es una planta cítrica o solanácea.

22. 22.

    Un método para hacer una planta resistente al verdeado de los cítricos, que comprende introducir en una célula vegetal el polinucleótido de una cualquiera de las reivindicaciones 12 -15; regenerar a partir de dicha célula vegetal una planta transgénica que expresa una cantidad inhibidora de insecto de un polipéptido codificado por dicho polinucleótido; y demostrar la resistencia a psílidos cítricos asiáticos como una propiedad de dicha planta transgénica.