CZ20013894A3

CZ20013894A3 - Polypeptidové kompozice toxické pro hmyz z řádu Coleoptera a transgenní rostliny rezistentní proti hmyzu

Info

Publication number: CZ20013894A3
Application number: CZ20013894A
Authority: CZ
Inventors: Mark J. Rupar; William P. Donovan; Chih-Rei Chu; Elizabeth Pease; Yuping Tan; Annette C. Slaney; Thomas M. Malvar; James A. Baum
Original assignee: Monsanto Technology Llc
Priority date: 1999-05-04
Filing date: 2000-05-03
Publication date: 2002-04-17
Also published as: EP1173578A2; US20090094714A1; PL353437A1; US20030232757A1; US7078592B2; US7320958B2; BR0010303A; BG106076A; AU769939B2; AR026120A1; US20060253925A1; CA2371442A1; WO2000066742A2; ZA200108918B; CN1360632A; AU4698700A; US7772369B2; US6555655B1; WO2000066742A3; US7442540B2

Description

Oblast techniky

Vynález se obecně týká molekulární biologie. Určité příklady provedení vynálezu zahrnují způsoby a kompozice, obsahující úseky DNA a proteiny odvozené od bakteriálních kmenů. Konkrétněji se vynález týká nových genů, pocházejících zBacillus thuringiensis, které kódují coleopteran - krystalové proteiny toxické pro hmyz. Vynález zahrnuje různé způsoby výroby a použití těchto úseků DNA, jako je například použití úseků DNA jako diagnostických látek a matric pro výrobu proteinů, úseky DNA kódující uměle modifikované δ-endotoxin polypeptidy a přírodní i umělé krystalové proteiny a použití proteinů, íuzních proteinových nosičů a peptidů v různých imunologických a diagnostických aplikacích. Vynález dále zahrnuje způsoby výroby a použití úseků nukleových kyselin při vývoji transgenních rostlinných buněk, které obsahují polynukleotidy podle vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Protože hmyz způsobuje značné hospodářské škody na úrodě, jsou dnes velmi zapotřebí ekologické způsoby hubení hmyzu. Zejména drobní zemědělci a pěstitelé hledají ekologické způsoby jak ošetřit zemědělské plochy. Nej rozšířenější ekologické insekticidy, které byly vyvinuty v posledních letech jsou mikrobiální pesticidy, odvozené od bakterie Bacillus thuringiensis. Bacillus thuringiensis je Gram-pozitivní bakterie, která produkuje krystalové proteiny nebo inkluze, které jsou specificky toxické pro určité řády a kmeny hmyzu. Ukázalo se, že mnoho různých kmenů Bacillus thuringiensis vyrábí insekticidní krystalové proteiny. Kompozice zahrnující kmeny Bacillus thuringiensis, které vyrábějí insekticidní proteiny, jsou komerčně dostupné a používají se jako ekologické insekticidy, protože jsou poměrně značně toxické pro konkrétní cílový hmyz, ale jsou neškodné pro rostliny a další necílové organizmy.

δ-Endotoxiny δ-Endotoxiny se používají pro regulaci populací širokého spektra listožravých kmenů housenek a brouků, stejně jako komárů. Tyto bílkovinné parasporální krystaly, známé také jako krystalové proteiny s funkcí insekticidu, krystalové proteiny Bt inkluze, krystalické inkluze, inkluzní tělíska a Bt toxiny tvoří velkou skupinu insekticidních proteinů insekticidů produkovaných Bacillus ·» ·· t ·· • · · · · ··«« • · · · · · · · Λ thuringiensis, které přijímány v potravě jsou toxické pro vnímavého hmyzího hostitele. V průběhu posledních deseti let byl proveden výzkum struktury a funkce všech hlavních kategorií toxinů Bacillus thuringiensis a přestože se tyto toxiny od sebe liší svojí specifickou strukturou a funkcí, v základních rysech jsou si podobné. Na základě předchozího výzkumu toxinů Bacillus thuringiensis byl vytvořen obecný mod jejich působení, který zahrnuje: požití hmyzem, rozpuštění toxinů v zažívacím traktu hmyzu (v žaludku a ve střevech), rezistenci proti trávicím enzymům, někdy dokonce s částečnou aktivací toxinů „natrávením“, vazbu na buňky trávicího traktu, vytvoření otvoru ve hmyzích buňkách a porušení buněčné homeostáze (English a Slatin, 1992).

Jedním ze zvláštních rysů Bacillus thuringiensis je jeho schopnost vyrábět v průběhu sporulace krystalové proteiny, které jsou specificky toxické pro určité řády a kmeny hmyzu. Ukázalo se, že mnoho různých kmenů Bacillus thuringiensis produkuje krystalové proteiny s funkcí insekticidů. Kompozice zahrnující různé kmeny Bacillus thuringiensis, které produkují proteiny s insektícidní aktivitou proti hmyzu z řádů Lepidoptera a Diptera, jsou komerčně dostupné a používají se jako ekologické insekticidy, protože jsou poměrně značně toxické pro specifický cílový hmyz, ale jsou neškodné pro rostliny a další necílové organismy.

V posledních deseti letech byl prováděn rozsáhlý výzkum týkající se mechanismu insektícidní účinnosti krystalových proteinů Bacillus thuringiensis. Ukázalo se, že krystalové proteiny jsou pro hmyz toxické pouze po požití proteinu hmyzem. Alkalické pH a proteolytické enzymy v hmyzím zažívacím traktu rozpouští proteiny a umožňují tak uvolnění složek, které jsou pro hmyz toxické. Toxické složky roztrhají buňky zažívacího traktu, hmyz se tedy nemůže živit a nakonec umírá. Z tohoto důvodu je Bacillus thuringiensis považován za účinný ekologický insekticid proti různým kmenům hmyzích škůdců.

Jak uvádí Hofte a kol., (1989), většina insekticidních kmenů Bacillus thuringiensis je účinná proti hmyzu z řádu Lepidoptera, tedy proti housenkám. Další kmeny Bacillus thuringiensis mají insektícidní účinek proti hmyzu z řádu Diptera, tedy proti mouchám a komárům nebo proti hmyzu z obou jmenovaných řádů. V posledních letech bylo objeveno několik kmenů Bacillus thuringiensis, které produkují krystalové proteiny toxické proti hmyzu z řádu Coleoptera, tedy proti broukům (Krieg a kol., 1983; Sick a kol., 1990; Donovan a kol., 1992; Lambert a kol., 1992a; 1992b).

Geny kódující krystalové proteiny

Mnohé delta-endotoxiny jsou příbuzné z hlediska stupně podobnosti jejich aminokyselinových sekvencí. Historicky byly proteiny a geny, které je kódují, klasifikovány na základě šíře spektra jejich insekticidní účinnosti. Práce, kterou publikovali Hofte a Whiteley (1989) pojednávala o genech a proteinech, které byly určeny v Bacillus thuringiensis před rokem 1990 a pokračuje dále v nomenklaturním a klasifikačním schématu, které bylo tradičně aplikováno na geny a proteiny Bacillus thuringiensis. cryl geny kódují Cryl proteiny toxické pro Lepidoptera a cryll geny kódují Cryll proteiny, které jsou toxické pro oba řády: Lepidoptera i Diptera. crylll geny kódují Crylll proteiny toxické pro Coleoptera, zatímco crylV geny kódují Cryl V proteiny toxické pro Diptera.

Na základě stupně sekvenční podobnosti byly proteiny dále klasifikovány a rozděleny do podrodin; příbuznější proteiny z každé rodiny byly pro odlišení označeny písmeny, jako například: Cryl A, CrylB, CrylC, atd.. Proteiny s ještě vyšším stupněm příbuznosti z každé podrodiny dostaly ještě označení jako například: CrylCl, CryC2, atd..

V poslední době byl vytvořen nový způsob nomenklatury, který systematicky klasifikuje Cry proteiny na základě homologie aminokyselinových sekvencí a ne podle specifika toxicity proti cílovému hmyzu (Crickmore a kol., 1998). Klasifikační schéma pro mnoho známých toxinů, nezahrnující ovšem alelické varianty jednotlivých proteinů, je uvedeno dále.

Krystalové proteiny toxické pro hmyz z řádu Coleoptera.

Bylo popsáno klonování a exprese genu cryI3Bb (Donovan a kol., 1992). Tento gen kóduje 74-kDa protein, který má insekticidní účinek proti hmyzu z řádu Coleoptera, jako je například mandelinka bramborová (Colorado potato beetle - CPB) a Diabrotica undecimpunctata (southern corn root worm -SCRW).

Kmen PS201T6 Bacillus thuringiensis účinný proti Diabrotica virgifera virgifera (western corn rootworm, WCRW,) byl popsán v U. S. patentu 5436002 (který je zde zahrnut tímto odkazem). Tento kmen vykazuje účinnost také proti Musea domestica, Aedes aegypti a Liriomyza trifoli.

Klonování a exprese genu cryET29 bylo také popsáno (mezinárodní patentová přihláška č. WO 97/17507/1997). Tento gen kóduje 25-kDa protein, který je účinný proti hmyzu zrádu Coleoptera, zejména proti CPB, SCRW, WCRW a Ctenocephalides felis (cat flea).

Dále bylo popsáno klonování a exprese genů cryET33 a cryET34 (mezinárodní patentová přihláška č. WO 97/17600/1997). Tyto geny kódují proteiny ~30 a ~50 kDa v tomto pořadí a jsou účinné proti hmyzu z řádu Coleoptera, zejména proti larválnímu stádiu CPB a proti Popillia japonica (Japanese beetle).

·· 9« 9 · · 99 • · · 9 W **·«

999 99 9 * · Λ

Také byl klonován a sekvenován gen viplA, který kóduje vegetativní rozpustný insekticidní protein (Intl. Pat. Appl. Publ. Ser. No. WO 96/10083, 1996). Tento gen kóduje protein o přibližně 80 kDa, kteiý je účinný proti WCRW i proti Diabrotica barberi (northem corn rootworm (NCRW).

Dalším endotoxinem účinným proti hmyzu z řádu Coleoptera včetně WCRW je Crylla (Intl. Pat. Appl. Publ. Ser. No. WO 90/13651, 1990). Gen kódující tento 81-kDa polypeptid byl klonován a sekvenován.

Byly popsány také další krystalové proteiny toxické proti WCRW (Intl. Pat. Appl. Publ. Ser. No. WO 97/40162, 1997). Ukázalo se, že tyto proteiny fungují jako binární toxiny a jejich sekvence vykazují podobnost se sekvencemi proteinů izolovaných zB. sphaericus, které jsou toxické pro komáry.

Určité kmeny B. sphaericus jsou vysoce účinné proti larválnímu stadiu komárů, protože v průběhu sporulace vyrábí velké množství krystalických inkluzí, které jsou složeny ze dvou proteinových toxinů. Analýza genů kódujících tyto proteiny byla popsána Baumannem a kol., (1988). Tyto toxiny jsou označeny jako P51 a P42 na základě jejich molekulové hmotnosti 51,4kDa a 41,9- kDa, v tomto pořadí. Samotný protein P42 účinkuje proti larválnímu stádiu komárů jen slabě. Samotný protein P51 nemá proti komárům žádnou účinnost. Pro plnou insekticidní účinnost je zapotřebí obou proteinů P51 i P42. Není známo, že by měly krystalové proteiny B. sphaericus účinnost na jakýkoli jiný hmyz kromě komárů (součaný přehled viz Charles a kol., 1996a; 1996b).

Proteinové toxiny kmené třídy působící proti komárům jsou produkovány některými kmeny B. sphaericusXyto proteiny, známé jako Mtx toxiny, jsou vyráběny během vegetativní fáze růstu a netvoří krystalické inkluze. Dva Mtx toxiny, které byly identifikovány byly označeny jako Mtx a Mtx2 a mají molekulární hmotnost 100 a 30,8 kDa, v tomto pořadí. Klonování a sekvenování genů pro tyto toxiny, označených m/X a mtx2,bylo již popsáno (Thanabalu a kol., 1991, Thanabalu a Porter, 1995). Mtx a Mtx2 proteiny nemají sekvenční podobnost s žádnými jinými známými insekticidními proteiny ani s krystalovými proteiny B. sphaericus a B. Ihurlngiensis.

Podstata vynálezu

Vynález poskytuje insekticidní polypeptidy a DNA sekvence, které je kódují. Odlišnost pěti z těchto polypeptidů od známých krystalových proteinů ukazuje na existenci nové třídy nebo podtřídy krystalových proteinů B. thuringiensis, jelikož mají méně než 65% shodu aminokyselinové sekvence sjakýmikoli v současnosti známými insekticidními polypeptidy. Vynález dále poskytuje polypeptidy, které v kombinaci vytváří krystalové proteiny s insekticidním účinkem. Vynález také zahrnuje transformované hostitelské buňky, transgenní rostliny, vektory a způsoby výroby a použití nových polypeptidů a polynukleotidů.

V prvním příkladu provedení poskytuje vynález izolovaný polypeptid CryET69, který obsahuje alespoň 7 po sobě jdoucích arnikyselin z SEQ ID č .: 14. S výhodou obsahuje alespoň 9 nebo alespoň 11 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 14. Ještě výhodněji obsahuje polypeptid alespoň 13 nebo alespoň 15 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 14 a výhoději obsahuje alespoň 17 nebo alespoň 19 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 14. V typickém příkladu provedení obsahuje polypeptid sekvenci SEQ ID č.: 14. Takový polypeptid je s výhodou kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 45 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 13 a výhodněji je kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 90 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 13. Výhodněji je takový polypeptid kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 150 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 13. Typické polynukleotidy kódující insekticidní polypeptidy obsahují alespoň 300 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 13 a v jednom příkladu provedení obsahuje polynukleotid nukleotidovou sekvenci SEQ ID č.: 13.

Dále je popsán a nárokován izolovaný CryET84 polypeptid obsahující alespoň 15 po sobě jdoucích aminokyselin SEQ ID č.: 19. Výhodněji polypeptid obsahující alespoň 30 až 45 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 19. Nejlépe polypeptid obsahující alespoň 45 až 90 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 19 a výhodněji obsahující alespoň 90 až 150 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 19. V typickém příkladu provedení obsahuje polypeptid sekvenci SEQ ID č.: 19. Takový polypeptid je s výhodou kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 45 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 18 a výhodněji je kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 90 párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ID ě.: 18. Nejlépe je takový polypeptid kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 150-párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ID č.:18. Typické polynukleotidy kódující insekticidní polypeptidy obsahují alespoň 300 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID ě.: 18 a v jednom příkladu provedení obsahuje polynukleotid nukleotidovou sekvenci SEQ IDě.: 18.

Dále je zde popsán a nárokován izolovaný CryET75 polypeptid obsahující alespoň 15 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 16. Výhodněji polypeptid obsahující alespoň 30 až 45 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 16. Nejlépe polypeptid obsahující alespoň 45 až 90 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 16 a výhodněji obsahující alespoň 90 až 150 po sobě • ·* *· * ·♦ ·· ·· * 4··· ··««

44·· 4 4 4 » » « ··· ·· ·· ♦·· <»· ···· jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 16. V typickém příkladu provedení polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID č.: 16. Takový polypeptid je s výhodou kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 45 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 15 a výhodněji je kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 90 párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ID č.: 15. Nejlépe je takový polypeptid kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 150 párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ID č.: 15. Typické polynukleotidy kódující insekticidní polypeptid obsahují alespoň 300 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.:15 a v jednom příkladu provedení obsahuje polynukleotid nukleotidovou sekvenci SEQ ID č.: 15.

V jiném příkladu provedení vynález popisuje a nárokuje izolovaný CryET80 polypeptid obsahující alespoň 17 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.:4. Výhodněji polypeptid obsahující alespoň 20 nebo alespoň 23 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 4. Ještě výhodněji polypeptid obsahující alespoň 26 nebo alespoň 29 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 4 a výhodněji obsahující alespoň 32 nebo alespoň 35 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 4. V typickém příkladu provedení polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID č.: 4. Takový polypeptid je s výhodou kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 51 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 3 a výhodněji je kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 60 párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ID ě.: 3. Nejlépe je takový polypeptid kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 78 párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ID č.: 3. Typický polynukleotid kódující insekticidní polypeptid obsahuje alespoň 96-párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 3 a v jednom příkladu provedení obsahuje polynukleotid nukleotidovou sekvenci SEQ ID č.: 3.

V jiném příkladu provedení představuje vynález izolovaný CryET76 polypeptid obsahující alespoň 55 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 2. Výhodněji polypeptid obsahující alespoň 60 nebo alespoň 70 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 2. Nejlépe polypeptid obsahující alespoň 75 nebo alespoň 80 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 2 a výhodněji obsahující alespoň 85 nebo alespoň 90 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 2. V typickém příkladu provedení polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID č.: 2. Takový polypeptid je s výhodou kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 165 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 1 a výhodněji je kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 180 párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ID č.: 1. Nejlépe je takový polypeptid kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 225 párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ♦ · 4 4« 4 4 44« · · 444

ID č.. 1. Typické polynukleotidy kódující insekticidní polypeptid obsahují alespoň 270 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 1 a v jednom příkladu provedení obsahuje polynukleotid nukleotidovou sekvenci SEQ ID č.:l.

V následujícím příkladu provedení vynález popisuje a nárokuje izolovaný CryET71 polypeptid obsahující alespoň 146 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 12. Výhodněji polypeptid obsahující alespoň 150 nebo alespoň 154 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 12. Ještě výhodněji polypeptid obsahující alespoň 158 nebo alespoň 162 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 12 a výhodněji obsahující alespoň 166 nebo alespoň 170 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 12. V typickém příkladu provedení polypeptid obsahující sekvenci SEQ ID č.: 12. Takový polypeptid je s výhodou kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 438 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 11 a výhodněji je kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 450 párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ID č.: 11. Ještě výhodněji je takový polypeptid kódován úsekem nukleové kyseliny, která obsahuje alespoň 462 párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ID č.: 11. Typické polynukleotidy kódující insekticidní polypeptid obsahují alespoň 510 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 11 a v jednom příkladu provedení obsahující nukleotidovou sekvenci SEQ ID č.: 11.

Vynález dále poskytuje izolovaný CryET74 polypeptid, který obsahuje sekvenci SEQ ID č.: 6. Takový polypeptid je s výhodou kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 45 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 5 a výhodněji je kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 90 párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ID č.: 5. Ještě výhodněji je takový polypeptid kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 150 párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ID ě.: 5. Typické polynukleotidy kódující insekticidní polypeptid obsahují alespoň 300 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 5 a v jednom příkladu provedení obsahuje polynukleotid nukleotidovou sekvenci SEQ IDč.: 5.

Kromě toho poskytuje vynález izolovaný CryET39 polypeptid, který obsahuje sekvenci SEQ ID ě.: 8. Takový polypeptid je s výhodou kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 45 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 7 a výhodněji je kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 90 párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ID č.: 7. Ještě výhodněji je takový polypeptid kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 150 párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ID č..: 7. Typické polynukleotidy

kódující insekticidní polypeptid obsahují alespoň 300 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 7 a v jednom příkladu provedení obsahuje polynukleotid nukleotidovou sekvenci SEQ ID č .: 7.

Dále vynález poskytuje izolovaný CryET79 polypeptid, který obsahuje sekvenci SEQ ID č.: 10. Takový polypeptid je s výhodou kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 45 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 9 a výhodněji je kódován úsekem nukleové kyseliny, který obsahuje alespoň 90 párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ID č.: 9. Ještě výhodněji je takový polypeptid kódován úsekem nukleové kyseliny který obsahuje alespoň 150 párů bází po sobě jdoucích sekvence z SEQ ID č.: 9. Typické polynukleotidy kódující insekticidní polypeptid obsahují alespoň 300 párů bází po sobě jdoucích nukleotidové sekvence z SEQ ID č.: 9 a v jednom příkladu provedení obsahuje polynukleotid nukleotidovou sekvenci SEQ IDč.: 9.

Vynález také popisuje kompozice a insekticidní formulace, které obsahují jeden nebo více zde uvedených polypeptidů. Taková kompozice může být buněčný extrakt, buněčná suspenze, buněčný homogenát, buněčný lyzát, buněčný supernatant, buněčný filtrát nebo buněčné pelety bakteriální buňky, které obsahují polynukleotidy kódující takové polypeptidy. Typické bakteriální buňky, které produkují takové polypeptidy zahrnují B. thuringiensis EG4550 (uloženo s NRRL, 30. května 1997 jako NRRL B-21784); EG5899 (uloženo s NRRL 30. května 1997 jako NRRL B21783); EG11529 (uloženo s NRRL 12. února 1998 jako NRRL B-21917); EG4100 (uloženo s NRRL 30. května 1997 jako NRRL B-21786); EG11647 (uloženo s NRRL 30. května 1997 jako NRRL B-21787); EG9444 (uloženo s NRRL 30. května 1997 jako NRRL B-21785); EG 11648 (uloženo s NRRL 30. května 1997 jako NRRL B-21788); EG4851 (uloženo s NRRL 12. února 1998 jako NRRL B-21915); a EG11658 (uloženo s NRRL 12. února 1998 jako NRRL B-21916).

Kompozice, jak bude detailně popsáno dále, může být formulována jako prášek, moučka, dražé, granule, sprej, emulze, koloid, roztok nebo podobně a může být připravena takovými obvyklými postupy jako je například vysoušení, lyofilizace, homogenizace, extrakce, filtrace, centrifugace, sedimentce nebo koncentrace takových kultur buněk, které obsahují polypeptid. Takové kompozice lze s výhodou získat z jedné nebo více buněčných kultur B. thuringiensis, které jsou zde popsány. Ve všech takových kompozicích, které obsahují alespoň jeden takový insekticidní polypeptid, může být polypeptid přítomen v koncentraci asi od 1 hmotn. % do 99.%.

Typická insekticidní polypeptidová formulce může být připravena způsobem, který zahrnuje kroky kultivace vhodné buňky B. thuringiensis v podmínkách vhodných pro tvorbu insekticidního polypeptidu (polypeptidu); a získání insekticidního polypeptidu (polypeptidu) takto vytvořeného.

Vynález například popisuje a nárokuje způsob přípravy polypeptidu delta-endotoxinu, který má insekticidní účinek proti hmyzu z řádu Coleoptera nebo Lepidopíera. Způsob obecně zahrnuje izolaci jednoho nebo více polypeptidů δ-toxinů vyráběných buňkami z vhodné buněčné kultury B. thuringiensis, která byla pěstována za vhodných podmínek. Takové polypeptidy mohou být izolovány z buněčné kultury nebo supernatantu nebo ze spórové suspenze získané z buněčné kultury a použity v živé formě nebo mohou být přečištěny nebo koncentrovány, podle potřeb konkrétního použití.

Vynález také poskytuje způsob regulace populace hmyzu. Způsob obecně zahrnuje kontakt populace s insekticidně účinným množstvím polypeptidu, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 nebo 19. Takové způsoby mohou být použity k vyhubení nebo výraznému snížení velikosti populace mnoha cílových kmenů hmyzu na určité ploše nebo mohou být aplikovány preventivně, aby se zabránilo zamoření oblasti škůdci. S výhodou hmyz konzumuje nebo je alespoň kontaktován s insekticidně účinným množstvím polypeptidů. Kromě toho vynález poskytuje přečištěnou protilátku, která se specificky váže na insekticidní polypeptidy zde popsané. Dále poskytuje způsoby přípravy takové protilátky a způsoby použití protilátky k izolaci, určení, charakterizování a/nebo přečištění polypeptidů, ke kteiým se tato protilátka specificky váže. Dálším důležitým aspektem vynálezu je detailní popis imunologického vybavení a imunodetekčních způsobů vhodných pro určení takových polypeptidů a peptidových fragmentů a/nebo jejich epitopů.

Takové protilátky mohou být použity k určení přítomnosti takových polypeptidů ve vzorku nebo mohou být použity, jak bude popsáno dále, v různých imunologických způsobech. Typický způsob určení polypeptidu delta-endotoxinu v biologickém vzorku obecně zahmje získání biologického vzorku, o kterém se domníváme, že obsahuje polypeptid δ-endotoxin; kontakt vzorku s protilátkou, která se specificky váže k polypeptidu za podmínek, které umožňují tvorbu komplexu a zjištění, zda se komplex vytvořil.

Pro takové způsoby vynález také poskytuje imunodetekční vybavení. Takové vybavení obecně zahrnuje, ve vhodných konteinerech, protilátku, která se váže na polypeptid δ-endotoxin a alespoň první imunodetekční činidlo. Obvykle může vybavení poskytovat další činidla nebo návod k použití protilátky k určení polypeptidů δ-endotoxinů ve vzorku.

• · · ft

Takové protilátky mohou být připraveny pomocí popsaného polypeptidu jako antigenu ve zvířeti, jak je popsáno dále. Z celé polypeptídové sekvence, která je zde popsána nebo z její části mohou být také připraveny antigenní epitopy, kratší peptidy, směsi peptidů, fagmenty peptidů vázané na nosiče a podobně.

Vynález se dále týká biologicky čisté kultury bakterie B. thuringiensis, jak ukazuje tabulka 9, uložené v Agricultural Research Culture Collection, Northern Regional Research Laboratory (NRRL).

Další příklad provedení vynálezu se týká vektoru, který obsahuje sekvenční oblast, která kóduje polypeptid obsahující jednu nebo více zde popsaných aminokyselinových sekvencí, rekombinantní hostitelské buňky transformované takovým rekombinantním vektorem a biologicky čistých kultur rekombinantní bakterie transformované polynukleotidovou sekvencí, která kóduje zde popsaný polypeptid. Všechny kmeny uložené v NRRL byly uloženy ve sbírce mikroorganismů, která splňuje podmínky Budapešťské smlouvy a údaje o životaschopnosti byly uvedeny ve mezinárodím formuláři o příjmu BP/4, kde je možno je získat. Typické vektory, rekombinantní hostitelské buňky, transgenní buněčné linie, pluripotentní rostlinné buňky a transgenní rostliny obsahující alespoň první sekvenci oblasti, která kóduje polypeptid obsahující jednu nebo více zde popsaných sekvencí, jsou zde detailně popsány dále.

V dalším příkladu provedení poskytuje vynález způsob přípravy insekticidní polypeptídové kompozice. V typických příkladech provedení vynálezu mohou být takové polypeptidy formulovány pro použití jako insekticidní činidla a mohou být použity k regulaci populace hmyzu v přírodních podmínkách včetně zemědských ploch a podobně. Formulace mohu být použity k likvidaci hmyzu buď lokální aplikací nebo tak, že hmyz požije polypeptidovou kompozici. U určitých kmenů hmyzu může být zapotřebí formulovat polypeptidy podle vynálezu pro aplikaci na půdu, na rostliny nebo v blízkosti rostlin, na stromy a keře nebo v jejich blízkosti a podobně, v blízkosti živých rostlin, dobytka, lidských obydlí, hospodářské techniky, budov a podobně.

Vynález také poskytuje transformované hostitelské buňky, pluripotentní rostlinné buněčné populace, embryonální rostlinnou tkáň, rostlině buňky, sazenice a transgenní rostliny, které obsahují vybrané sekvenční oblasti kódující insekticidní polypeptid. Takové buňky jsou s výhodou prokaryotické nebo eukaryotické buňky, například bakteriální, houbové nebo rostlinné buňky, přičemž typické bakteriální buňky zahrnují: B. thuringiensis, B. subtilis, B.megaterium, B. cereus, Escherichia, Salmonella, Agrobacterium nebo Pseudomonas buňky.

Rostliny a rostlinné hostitelské buňky jsou s výhodou buňky jednoděložných nebo dvouděložných rostlin, jako jsou například: kukuřice, pšenice, sója, oves, bavlník, rýže, žito, proso, cukrová třtina, rajče, tabák, kapok, len, lilek brambor, ječmen, drnová tráva, krmná tráva, plody, ovoce, luštěniny, zelenina, okrasné rostliny, keře, kaktusy, sukulenty a stromy.

Illustrativní transgenní rostliny podle vynálezu mají s výhodou v genomu vložen vybraný polynukleotid (nebo transgen), který obsahuje alespoň první sekvenční oblast kódující jeden nebo více zde popsaných insekticidních polypeptidů.

Stejně tak i potomstvo jakékoli generace takové transgenní rostliny představuje důležitý aspekt vynálezu. S výhodou obsahuje takové potomstvo vybraný transgen a dědí fenotypový znak insekticidní rezistence, která se prokázala u mateřské rostliny. Semena každé generace všech takových transgenních, proti napadení hmyzem rezistentních, rostlin jsou také důležitým aspektem vynálezu. Semena budou s výhodou také obsahovat vybraný transgen a rostliny, které z nich vyrostou, ponesou také fenotypový znak insekticidní rezistence.

Insekticidně rezistentní, křížené fertilní transgenní rostliny obsahující jeden nebo více transgenů, které kódují jeden nebo více zde popsaných polypeptidů, mohou být získány způsobem, který obecně zahrnuje fertilní transgenní rostlinu, která obsahuje chromozomálně včleněný transgen kódující takový insekticidní polypeptid; funkčně připojený k promotoru, který je aktivní v rostlině; křížení fertilní transgenní rostliny s kmenou rostlinou bez transgenu za účelem získání třetí rostliny, obsahující transgen; zpětné křížení třetí rostliny za účelem získání zpětně křížené fertilní rostliny. V takových případech může být transgen zděděn po samčím nebo samičím rodiči. Kmená rostlina může být inbred (výsledek příbuzenského křížení) a třetí rostlina může být hybrid.

Stejně tak může být insekticidně rezistentní hybrid získán postupem, který obecně zahrnuje křížení první a kmené rodově zatížené rostliny, kde jedna nebo obě rodově zatížené rostliny obsahují chromosomálně vložený transgen, který kóduje vybraný polypeptid funkčně připojený k rostlinnému expresibilnímu promotoru, který exprimuje transgen. V illustrativních příkladech provedení, mohou být první a kmená rodově zatížená rostlina jednoděložné rostliny vybrané ze skupiny sestávající z: kukuřice, pšenice, rýže, ječmen, oves, žito, čirok, drnová tráva a cukrová třtina.

V souvisejícím příkladu provedení poskytuje vynález také způsob získání insekticidně rezistentní rostliny. Způsob obecně zahrnuje kontakt rostlinné recipientní buňky s DNA kompozicí, která obsahuje alespoň první transgen, který kóduje insekticidní polypeptid za podmínek, které umožňují funkci DNA kompozice; výběr recipientní buňky obsahující chromozomálně vložený transgen, který kóduje polypeptid; regeneraci rostliny z vybrané buňky a určení fertilní transgenní rostliny, která má zvýšenou rezistenci ve srovnání s netransformovanou rostlinou.

Způsob získání transgenních semen obecně zahrnuje získání fertilní transgenní rostliny obsahující chromozomálně vložený transgen, který kóduje polypeptid obsahující jednu nebo více zde popsaných aminokyselinových sekvencí, funkčně připojených k promotoru, který exprimuje transgen v rostlině a růst rostliny za podmínek vhodných pro tvorbu transgenních semen.

Dále vynález poskytuje způsob získání potomstva jakékoli generace z fertilní transgenní rostliny se zvýšenou insecticidní rezistencí. Způsob obecně zahrnuje shromáždění transgenních semen z transgenní rostliny, která obsahuje chromozomálně vložený transgen kódující takový polypeptid, funkčně připojený k promotoru, který exprimuje transgen v rostlině; pěstování shromážděných transgenních semen a růst potomstva transgenních rostlin ze semen.

Tyto způsoby získávání transgenních rostlin, potomstva a semen mohou zahrnovat obsah rostlinné buňky sDNA kompozicí užívající jeden z postupů dobře známých pro transformaci rostlinné buňky jako je například ostřelování mikroprojektilem, elektroporace nebo transformace při které slouží jako přenosné médium Agrobacterium. Tyto a další příklady provedení vynálezu budou zřejmé odborníkům v dané oblasti z následujících příkladů a patentových nároků s přihlédnutím k uvedeným odkazům.

Úseky polynukleotidů

Vynález poskytuje úseky nukleové kyseliny, které mohou být izolovány prakticky z jakéhokoliv zdroje, z kompletní genomové DNA, a které kódují nové insekticidní polypeptidy a jejich peptidové fragmenty, které jsou zde popsány. Polynukleotidy kódující tyto peptidy a polypeptidy mohou kódovat účinné insekticidní proteiny nebo peptidové fragmenty, polypeptidové podjednotky, funkční domény nebo krystalové proteiny CryET84, CryET80, CryET76, CryET71, CryET69, CryET75, CryET39, CryET79, CryET74 a jim podobné krystalové proteiny jako zde popsané polypeptidy. Dále vynález zahrnuje úseky nukleové kyseliny, které mohou být syntetizovány celé in vitro s použitím postupů, které jsou velmi dobře známé odborníkům v dané oblasti a které kódují zde popsané nové polypeptidy, peptidové fragmenty, podjednotky nebo funkční domény.

Ve vynálezu používaný pojem „úsek nukleové kyseliny“ nebo „polynukleotid“ znamená molekulu nukleové kyseliny, která byla izolována z kompletních genomových DNA jednotlivých kmenů. Úsek nukleové kyseliny nebo polynukleotid kódující polypeptid endotoxin tedy znamená • 44 44 4 ·4 ·4

4 4 4 44 4 4 4 4

4444 444 44 ·

4 4 4 4 4 4«4 4 β

444 44 44 4·4 44 4444 molekulu nukleové kyseliny, která obsahuje alespoň první sekvenci kódující krystalový protein, která je ovšem izolována nebo přečištěna z kompletní genomové DNA kmene, ze kterého byl získán úsek nukleové kyseliny, což je v tomto případě genom skupiny Gram-pozitivních bakterií, Bacillus a především kmeny Bacillus známé jako B. thuringiensis. Pojem „úsek nukleové kyseliny zahrnuje úseky polynukleotidů a menší fragmenty takových úseků a také rekombinantní vektory které zahrnují například plazmidy, kosmidy, fagemidy, fágy, viriony, bakuloviry, umělé chromozomy, viry a podobně. Polynukleotidové sekvence, které mají asi mezi 70% a 80% shodu nebo výhodněji asi mezi 81% a 90% shodu nebo dokonce nejlépe asi mezi 91% a 99% shodu nukleové kyseliny nebo funkční ekvivalenci s polynukleotidovou sekvencí SEQ ID č.: 1, SEQ ID č.: 3, SEQ ID č.: 5, SEQ ID č.: 7, SEQ ID č : 9, SEQ ID č : 11, SEQ ID č.: 13, SEQ ID č : 15 nebo SEQ ID č : 18 budou tedy sekvence, které jsou v podstatě uvedeny v SEQ ID č.: 1, SEQ ID č.: 3, SEQ ID Č.: 5, SEQ ID č.: 7, SEQ ID č.: 9, SEQ ID ě.: 11, SEQ ID č.: 13, SEQ ID č.: 15, or SEQ IDNO: 18. Velmi výhodné sekvence jsou takové, které mají s výhodou asi 91%, asi 92%, asi 93%, asi 94%, asi 95%, asi 96%, asi 97%, asi 98%, asi 99% nebo asi 100% shodu nebo funkční ekvivalenci s nukleotidovou sekvencí SEQ ID č.: 1, SEQ ID č.: 3, SEQ ID č.: 13, SEQ ID ě.: 15, or SEQ ID č.: 18. Další sekvence, které kódují související polypeptidové sekvence jsou s výhodou ty, které jsou asi z 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% nebo 90% identické nebo funkčně ekvivalentní s polynukleotidovou sekvencí uvedenou v jedné nebo více z těchto sekvenčních identifikací. Podobně jsou sekvence, které mají asi 71 %, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% nebo 80% shodu nebo funkční ekvivalenci s polynukleotidovou sekvencí uvedenou v jedné nebo více z těchto sekvenčních identifikací také považovány za vhodné v praktickém použití vynálezu.

Podobně polynukleotid, obsahující izolovaný, přečištěný nebo vybraný gen nebo sekvenční oblast odpovídající polynukleotidu, který může obsahovat navíc k sekvencím kódujícím peptid také určité další elementy, například regulátorové sekvence, izolované z dalších přirozeně se vyskytujících genů nebo protein-kódujících sekvencí. S ohledem na to je, pro jednoduchost, pojmem gen označována jednotka kódující funkční protein nebo polypeptid. Jak je zřejmé odborníkům vdané oblasti, tento pojem zahrnuje jak genovou sekvenci, operátorovou sekvenci a menší konstrukční úseky genu, které se exprimují nebo mohou být upraveny pro expresi proteinů, polypeptidů nebo peptidů. V určité příkladu provedení obsahuje úsek nukleové kyseliny alespoň první gen, který kóduje jeden nebo více zde popsaných polypeptidů.

Pro umožnění exprese genu a translace mRNA na zralý polypeptide obsahuje úsek nukleové kyseliny s výhodou také alespoň první promotor funkčně spojený s genem pro expresi genového • ·

999

produktu v hostitelské buňce transformované tímto úsekem nukleové kyseliny. Promotor může být endogenní promotor nebo alternativní, heterologní promotor vybraný pro jeho schopnost podporovat expresi genu v jednom nebo více určitých typech buněk. Například při tvorbě transgenních rostlin a pluripotentních rostlinných buněk obsahujících vybraný gen je vybraný heterologní promotor takový, který je schopen exprimovat v rostlině a v mnoha příkladech může být s výhodou v rostlině exprimující promotor, který je specifický pro tkáň nebo buněčný cyklus. Výběr promotoru exprimujícího v rostlině je dobře znám odborníkům v oblasti transformace rostlin a příklady vhodných promotorů jsou uvedeny ve vynálezu. V určitém příkladu provedení může být v rostlině exprimující promotor vybrán ze skupiny sestávající z promotorů: kukuřičné sacharózové syntetázy 1, kukuřičné alkoholové dehydrogenázy 1, kukuřičného lehce vytěžitelného komplexu, kukuřičného proteinu tepelného šoku, malé podjednotky RuBP karboxylázy hrachu, Ti plazmidu mannopin syntázy, Ti plazmidu nopalin syntázy, chalkon izomerázy petúnie, fazolového proteinu 1 bohatého na glycin, bramborového patatinu, lectinu, CaMV 358 a 8-E9 malé podjednotky RuBP karboxylázy.

„Izolovat od ostatních kódujících sekvencí znamená, že gen, který je předmětem zájmu, v tomto případě gen kódující bakteriální krystalický protein, tvoří významnou část kódující oblasti úseku DNA, a že úsek DNA neobsahuje velké části přirozeně se vyskytující kódující DNA jako jsou například velké úseky chromozomů nebo jiné funkční geny nebo oblasti kódující operóny. Je samozřejmě míněn úsek DNA tak jak byl původně izolován a nejsou vyloučeny umělé geny, rekombinantní geny, syntetické spojovací články nebo kódující oblasti později přidané k úseku. Příklady provedení vynálezu se především týkají izolovaných polynukleotidů (například DNA RNA, antimediátorová DNA antimediátorová RNA ribozymy a PNA) a rekombinantních vektorů obsahujících polynukleotidové sekvence, které kódují jeden nebo více zde popsaných polynukleotidů.

Pojem sekvence uvedená v SEQ ID č. . 2, SEQ ID č : 4, SEQ ID č. . 6, SEQ ID č. . 8, SEQ ID č.: 10, SEQ ID č.: 12, SEQ ID ě.: 14, SEQ ED č.: 16, nebo SEQ ID č.: 19 znamená, že sekvence v podstatě odpovídá části sekvence SEQ ID č.: 2, SEQ ID ě.: 4, SEQ ID č.: 6, SEQ ID ě.: 8, SEQ ID č.: 10, SEQ ID ě.: 12, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.: 16 nebo SEQ ID č.: 19 a obsahuje poměrně málo aminokyselin, které nejsou identické nebo obsahuje biologicky funkční ekvivalenty aminokyselin jakékoli z těchto sekvencí. Pojem biologicky funkční ekvivalent je velmi dobře znám odborníkům v dané oblasti a bude zde dále detailně definován (např. viz ilustrativní příklady provedení). Podle toho sekvence, které mají asi mezi 70% a 80% shodou nebo výhodněji asi mezi 81% a 90% shodou nebo dokonce nejlépe asi mezi 91% a 99% shodou v aminokyselinových sekvencích nebo funkční

shodu s aminokyselinovou sekvencí SEQ ID č.:2, SEQ ID č.:4, SEQ ID č.:6, SEQ ID č.:8, SEQ ID č.: 10, SEQ ID č.: 12, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.: 16 nebo SEQ ID č.: 19 budou tedy sekvence, které jsou zapsány v SEQ ID č.: 2, SEQ ID č .: 4, SEQ ID č.: 6, SEQ ID ě .: 8, SEQ ID ě .: 10, SEQ ID č.; 12, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.: 16 nebo SEQ ID č.: 19. Velmi výhodné sekvence jsou ty, které mají s výhodou asi 91 %, asi 92%, asi 93%, asi 94%, asi 95%, asi 96%, asi 97%, asi 98%, asi 99% nebo asi 100% shodu nebo jsou funkčními ekvivalenty aminokyselinových sekvencí SEQ ID č.: 2, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.: 16, or SEQ ID č.: 19. Další výhodné sekvence jsou ty, které mají asi 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89% nebo 90% shodu nebo jsou funkčními ekvivalenty aminokyselinových sekvencí SEQ ID č : 2, SEQ Π) č.: 4, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č .: 16 nebo SEQ ID č.: 19. Stejně tak sekvence, které mají asi 71%,72%,73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79% nebo 80% shodu nebo jsou funkčními ekvivalenty polypeptidové sekvence uvedené v SEQ ID č.: 2, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.: 16 nebo SEQ ID č.. 19 jsou také považovány za vhodné pro praktické provedení vynálezu.

Je také zřejmé, že aminokyselinové a nukleotidové sekvence mohou obsahovat další přídavné zbytky, například: přídavný N- nebo C- konec aminokyselin nebo 5' nebo 3' sekvence a přesto jsou považovány za sekvence zde popsané dokud sekvence splňuje dříve popsaná kriteria, včetně udržování biologické aktivity proteinů, kde je zahrnuta proteinová exprese. Přidání terminální sekvence se zejména používá pro sekvence nukleových kyselin, které mohou například obsahovat různé nekódující sekvence bočně připojené buď k 5' nebo 3' konci kódující oblasti nebo mohou obsahovat různé vnitřní sekvence, tj. introny, které se, jak známo, vyskytují v genech. Úseky nukleových kyselin podle vynálezu, nehledě na délku kódující sekvence samotné, mohou být kombinovány s jinými sekvencemi nukleových kyselin, například promotory, signální místa polyadenylace, místa přídavných restrikčních enzymů, místa mnohonásobného klonování, jiné kódující úseky a podobně, takže jejich celková délka může být značně proměnlivá. Může být tedy použit fragment nukleové kyseliny téměř jakékoli délky, přičemž celková délka je s výhodou omezena snadností přípravy a použití v zamýšleném rekombinantním protokolu nukleové kyseliny. Například fragmenty nukleové kyseliny mohou být připraveny tak, že obsahují krátkou přilehlou oblast kódující peptidovou sekvenci popsanou v SEQ ID ě.: 2, SEQ ID ě.: 4, SEQ ID Č.: 6, SEQ ID ě.: 8, SEQ Π) č.: 10, SEQ ID č.: 12, SEQ ID č.: 14, SEQ ID ě.: 16 nebo SEQ ID č.: 19 nebo jsou identické nebo komplementární k nukleotidovým sekvencím, které kódují peptidy popsané v SEQ ID ě.: 2, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 6, SEQ ID č.: 8, SEQ ID ě.: 10, SEQ ID ě.: 12, SEQ ID ě.: 14, SEQ ID č.: 16 nebo SEQ ID č.: 19 a zejména ty nukleotidové úseky zapsané v SEQ ID č. 1, 3, 13, • · • ··

15, nebo 18. Například nukleotidové sekvence, které mají asi 23 nukleotidů a které mají až asi 10000, asi 5000, asi 3000, asi 2000, asi 1000, asi 500, asi 200, asi 100, asi 50 a asi 23 nebo podobně párů bází (včetně všech vložených sekvencí), které obsahují přilehlou nukleotidovou sekvenci z SEQ ID č. 1, SEQ ID ě. 3, SEQ ID č.: 5, SEQ ID č.. 7, SEQ ID ě.: 9, SEQ ID č.: 11, SEQ ID č.: 13, SEQ ID č.: 15 nebo SEQ ID č. 18 nebo ty, které kódují po sobě jdoucí aminokyselinové sekvence z SEQ ID č.: 2, SEQ ID č.. 4, SEQ ID č.: 6, SEQ ID č.: 8, SEQ ID č.: 10, SEQ ID č.: 12, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.. 16 nebo SEQ ID č.: 19 jsou považovány za zvláště výhodné. Bude jistě zřejmé, že „střední délka, v kontextu polynukleotidových sekvencí nebo úseků nukleových kyselin nebo primer nebo sondy specifické pro určení genu, znamená jakoukoli délku mezi vymezenými hranicemi, jako například z asi 24, 25, 26, 27,28,29 atd.; 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, atd.; 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, atd.; 100, 101, 102, 103, 104, atd.; 110, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 180, 190, atd.; včetně všech vložených sekvencí v rozsahu od asi 200 až 500; 500 až 1000; 1000 až 2000; 2000 až 3000; 3000 až 5000; a až do a včetně sekvencí o asi 10 000 nebo 12 000 nebo podobně nukleotidech a podobně.

Stejně tak bude zřejmé, že „střední délky“, v kontextu polypeptidů nebo peptidů, znamená jakoukoli délku mezi vymezenými hranicemi po sobě jdoucích aminokyselin. Například, když uvažujeme popsané insekticidní polypeptidy, všechny délky mezi asi 7 a asi 300 po sobě jdoucími aminokyselinovými sekvencemi, jsou považovány za vhodné, zejména pro zde popsané příklady provedení. Například peptidy obsahující po sobě jdoucí aminokyselinové sekvence mající asi 7, asi 8, asi 9, asi 10, asi 11, asi 12, asi 13, asi 14, asi 15, asi 16, asi 17, asi 18, asi. 19, asi 20, asi 21, asi 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 65, atd., 70, 75, atd., 80, 85, atd., 90, 95, atd., a dokonce peptidy obsahující alespoň asi 96, 97, 98, 99, 100, 101, 102, 103 a 104, nebo více po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.. 2, SEQ ID ě.: 4, SEQ ID č.. 6, SEQ ID č.; 8, SEQ ID č.. 10, SEQ ID ě.: 12, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.: 16 nebo SEQ ID č.: 19 explicitně spadají do skupiny peptidů, které vyhovují myšlence vynálezu.

Kromě toho pojem „střední délky“ znamená, v Širším kontextu insekticidně účinných polypeptidů, jakoukoli délku mezi vymezenými rozsahy po sobě jdoucích aminokyselin, která zahrnuje takový polypeptid, což bude okamžitě zřejmé odborníkům v dané oblasti. Například uvažuj eme-li polypeptidy podle vynálezu, všechny délky mezi asi 100 a asi 1000 po sobě jdoucích aminokyselinových sekvencí jsou považovány za vhodné, zejména příklady provedení zde popsané.

• ·· • ··

Například, polypeptidy obsahující po sobě jdoucí aminokyselinové sekvence mající alespoň asi 100, asi 101, asi 102, 103, 104, 105, 106, 107, 108, 109, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145, 150, 155, 160, 165, 170, 175, 180, 185, 190, 195, atd., 200, 201, 202, 203, 204, 205, 206, 207, 208, 209, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 270, 280, 290, atd., 300, 310, 320, 330, 340, 350, 360, 370, 380, 390, 400, atd., 410, 430, 450, 470, 490, atd., 500, 525, 550, 575, 600, 650, 675, 700, atd., 750, atd., a dokonce ty polypeptidy, které obsahují alespoň asi 775 nebo více aminokyselin spadají do oblasti vynálezu. Zvláště v případě luze proteinů obsahujících celou nebo část aminokyselinové sekvence SEQ ID č.: 2, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 6, SEQ ID č.: 8, SEQ ID č.: 10, SEQ ID č.: 12, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.: 16 nebo SEQ ID č.: 19 polypeptidové sekvence mohou být s výhodou delší včetně sekvence, která zahrnuje asi 760, 770, 780, 790 nebo dokonce asi 800 nebo 900 nebo více aminokyselin.

Bude také zřejmé, že vynález není omezen na určité sekvence nukleových kyselin, které kódují peptidy podle vynálezu nebo které kódují aminokyselinové sekvence SEQ ID č.: 2, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 6, SEQ ID č.: 8, SEQ ID č.: 10, SEQ ID č.: 12, SEQ ID Č.: 14, SEQ ID č.: 16 nebo SEQ ID č.. 19 včetně DNA sekvence která je zvláště popsána SEQ ID č.: 1, SEQ ID č.: 3, SEQ ID č.: 5, SEQ ID č.: 7, SEQ ID č.: 9, SEQ ID č.: 11, SEQ ID č.: 13, SEQ ID č.: 15 nebo SEQ ID č.; 18. Rekombinantní vektory a izolované DNA úseky mohou tedy variabilně obsahovat polypeptid kódující oblasti samotné, kódující oblasti nesoucí vybrané úpravy nebo modifikace v základní kódující oblasti nebo mohou kódovat větší polypeptidy, které nicméně obsahují tyto peptid kódující oblasti nebo mohou kódovat biologicky funkční ekvivalenty proteinů nebo peptidů, které mají různé aminokyselinové sekvence.

DNA úseky podle vynálezu kódují biologicky-funkční, ekvivalentní peptidy. Takové sekvence se mohou vyskytovat jako konsekvence kodonové degenerace a funkční ekvivalence, které se, jak je známo, vyskytují přirozeně v sekvenci nukleové kyseliny a proteinech takto kódovaných. Případně mohou být vytvořeny funkčně-ekvivalentní proteiny nebo peptidy aplikací rekombinantní DNA technologie, díky níž mohou být provedeny změny v proteinové struktuře založené na znalosti vlastností aminokyselin, které jsou zaměňovány. Umělé změny mohou být zavedeny pomocí aplikace technik cílené mutageneze, například zavedení zvýšení antigenicity proteinu nebo testování mutantů za účelem zjistit aktivitu na molekulární úrovni. Případně mohou spadat do rozsahu vynálezu některé přirozené, dosud neznámé nebo dosud neurčené polynukleotidy a/nebo polypeptidy strukturně a/nebo funkčně odpovídanící sekvenci zde popsané. Takové polynukleotidy jsou ty polynukleotidy, které kódují polypeptid strukturně a/nebo funkčně podobný nebo identický s ♦ ♦ • ·· polypeptidem zde charakterizovaným jako polynukleotid kódující krystalový protein. Vzhledem ktomu, že označení CryET39, CryET69, CryET71, CryET74, CryET76, CryET79, CryET80, CryET84 a CryET7S jsou označení libovolně vybraná pro jednodušší identifikaci polypeptidu obsahujících zde popsané aminokyselinové sekvence, je zřejmé, že může být určeno mnoho jiných polypeptidu, které jsou vysoce homologní (nebo dokonce identické) s touto sekvencí, které však mohly být izolovány z různých organizmů nebo zdrojů nebo, případně, mohly být dokonce celé syntetizovány uměle nebo částečně de novo. Jako takové, všechny polypeptidové sekvence, ať už přirozeně se vyskytující nebo vytvořené člověkem, které jsou strukturně homologní s primární aminokyselinovou sekvencí, jak je zde popsáno, a které mají podobnou insekticidní účinnost proti cílovému hmyzu zde popsanému, spadají do myšlenky vynálezu. Podobně všechny polynukleotidové sekvence, ať už přirozeně se vyskytující nebo vyrobené člověkem, které jsou strukturně homologní s nukleotidovou sekvencí zde popsanou nebo které kódují polypeptid, který je homologní a biologicky-funkčně ekvivalentní s aminokyselinovou sekvencí zde popsanou spadají také do myšlenky vynálezu.

Je-li to zapotřebí, můžeme také připravit fuzní proteiny a peptidy, napříkad takové, kde jsou peptid kódující oblasti uspořádány ve stené expresní jednotce s jinými proteiny nebo peptidy, které mají požadovanou funkci, jako napříkald pro purifikační nebo imunodetekční účely (napříkad proteiny, které mohou být purifikovány pomocí afinitní chromatografie a označené kódující oblasti enzymu, v tomto pořadí).

Rekombinantní vektory tvoří další aspekry vynálezu. Za obzváště vhodné vektory jsou považovány ty vektory, ve kterých je kódující část úseku DNA, ať už kóduje celý insekticidní protein nebo menší peptid, umístěna pod kontrolou promotoru. Promotor může být ve formě promotoru, který je přirozeně spojen s genem kódujícím peptidy podle vynálezu, což můžeme získat izolací 5' nekódující sekvence lokalizované proti směru kódujícího úseku nebo exonu, například s použitím rekombinantní technologie klonování a/nebo PCRTM ve spojení se zde popsanou kompozicí. V mnoha případech může být promotor přirozený promotor nebo, případně, heterologní promotor, například promotory z bakteriálních zdrojů (včetně promotorů z jiných krystalových proteinů), z hub, virů, fágů nebo fagemidů (včetně promotorů jako jsou CaMV35 a jeho deriváty, T3, T7, λ a φ promotory a podobně) nebo z rostlinného zdroje (včetně konstruktivních, inducibilních a/nebo tkáňově specifických promotorů a podobně).

• 4· 99 9 ΦΦ «φ

ΦΦ· ΦΦΦΦ Φ φ · «

Φ ΦΦΦ 9 9 9 9 9 9 • ΦΦ · Φ Φ φ φ ·

ΦΦ· ΦΦ ·· ·»· ΦΦ ··*·

Charakteristiky CryET76, CryET80 a CryET84 polypeptidů izolovaných z EG4851

Vynález poskytuje nové polypeptidy, které vymezují celé nebo části B. thuringiensis CryET76, CryET84 nebo a CryET80 krystalických proteinů.

Ve výhodném příkladu provedení vynález uvádí a nárokuje izolovaný a přečištěný CryET76 protein. CryET76 protein izolovaný z EG4851 obsahuje 387- aminokyselinovou sekvenci a má vypočítanou molekulovou hmotnost přibližně 43 800 Da. CryET76 má vypočítanou izoelectrickou konstantu (pí) 5,39.

Ve výhodném příkladu provedení vynález popisuje a nárokuje izolovaný a přečištěný CryET80 protein. CryET80 protein izolovaný z EG4851 obsahuje 132- aminokyselinovou sekvenci a má vypočítanou molekulovou hmotnost přibližně 14 800 Da. CryET80 má vypočítanou izoelectrickou konstantu (pí) 6,03.

Ve výhodném příkadu provedení vynález popisuje a nárokuje izolovaný a přečištěný CryET84 protein. CryET84 protein izolovaný z EG4851 obsahuje 341- aminokyselinovou sekvenci a má vypočítanou molekulovou hmotnost přibližně 37 884 Da. CryET84 má vypočítanou izoelectrickou konstantu (pí) 5,5.

V řetězci EG4851, cryET80 a cryET76 genů jsou s výhodou lokalizovány jednotlivé DNA úseky a jsou oddědeny asi 95 nukleotidy. Gen pro CryET76 prodlužuje z nukleotidu 514 na nukleotid 1674 SEQ ID č.: 5 a gen kódující CryET80 prodlužuje z nukleotidu 23 na nukleotid 418 SEQ ID č.: 5. Podle vynálezu mohou být geny cryET80 a cryET76 s výhodou lokalizovány na jednotlivém úseku DNA.

Na řetězci EG4851 je gen cryET84 lokalizován hned na 5' u cryET80 a cryET76 genů. Nukleotidová sekvence cryET84 genu je uvedena v SEQ ID č.: 18 a odvozená aminokyselinová sekvence Cry ET84 proteinu je uvedena v SEQ ID č.: 19. Podle vynálezu mohou být geny cryET80, cryET84 a cryET76 s výhodou lokalizovány na jednotlivém úseku DNA (například SEQ ID č.: 17).

Úseky nukleotidové kyseliny jako hybridizační sondy a primery.

Kromě použití v řízení exprese krystalových proteinů nebo peptidů podle vynálezu, mají zde popsané sekvence nukleové kyseliny také mnoho jiných použití. Například jsou vhodné jako sondy nebo primery v příkladech provedení hybridizace nukleové kyseliny. Vynález poskytuje způsob určení sekvence nukleové kyseliny kódující polypeptid δ-endotoxinu. Způsob obecně zahrnuje získání vzorku nukleových kyselin, o kterých se předpokládá, že kódují polypeptid δ-endotoxinu; dále pak kontakt vzorku nukleových kyselin s izolovaným úsekem nukleové kyseliny, který

> 4*	4* 4	*4	*4
• 4 4	4 4	4 4	•	4	4 4
4 ··»	• 4	4	4	4	4
					4
♦ 4 »	4 ·	•	4	•	4
• 44 ·>	»»	4*4	44		♦ **·

obsahuje jednu ze zde popsaných sekvencí za podmínek vhodných pro hybridizaci zejména komplementárních nukleových kyselin a určení komplementárně hybridizovaných nukleových kyselin, které se takto tvoří.

Dále vynález poskytuje sadu k detekci nukleových kyselin, která obsahuje ve vhodných kontejnerech alespoň první úsek nukleové kyseliny obsahující alespoň 23 souvisejících nukleotidů z SEQ ID č.. 1, SEQ ID č.: 3, SEQ ID č.: 5, SEQ ID č.. 7, SEQ ID Č.: 9, SEQ ID č.: 11, SEQ ID č.: 13, SEQ ID č.: 15 nebo SEQ ID č.: 18 a alespoň první detekční činidlo. Schopnost takových sond nukleových kyselin specificky hybridizovat na sekvence kódující krystalový protein zabraňuje jejich použití pro určení přítomnosti komplementárních sekvencí v daném vzorku. Avšak můžeme předpokládat jiná použití včetně použití informace uložené v sekvenci pro přípravu mutantních kmenů primerů nebo primerů pro použití v přípravě dalších genetických konstrukcí.

Molekuly nukleové kyseliny, které mají sekvenční oblasti sestávající ze souvisejících nukleotidových prodloužení asi 23 až asi 50 nebo dokonce obsahují sekvence až asi 100 až 200 nukleotidů nebo podobně, identické nebo komplementární ke zde uvedené DNA sekvenci, jsou zvláště považovány za hybridizační sondy pro použití například, Souther a Norther blotingu. Fragmenty střední velikosti mohou také být obecně považovány za použitelné v příkladech provedení hybridizace, kde se délka souvisejících komplementárních oblastí může měnit, jako například asi mezi 25 až 30 nebo asi mezi 30 a 40 nebo podobně nukleotidy, ale větší související komplementární prodloužení může být také použito, jako například asi od 200 do 300 nebo od asi 300 do 400 nebo 500 nebo podobně nukleotidů, podle délky komplementárních sekvencí může probíhat detekce. Je dokonce možné, že delší související sekvenční oblasti mohou být vhodné včetně těch sekvencí obsahujících alespoň asi 600, 700, 800, 900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, nebo více souvisejících nukleotidů z jedné ze sekvencí zde popsaných.

Fragmenty mohou samozřejmě také být získány jinými technikami jako například mechanickým stříháním nebo digescí restrikčními enzymy. Malé úseky nebo fragmenty nukleové kyseliny mohou být mohou být jednoduše připraveny pomocí, například, přímé syntézy fragmentu chemickou cestou, což se běžně provádí s použitím automatického oligonukleotidového syntetizéru. Fragmenty mohou být také získány aplikací reprodukční technologie nukleové kyseliny, jako je například PCRTM technologie podle U. S. patentů 4683195 a 4683202 (které jsou zde zahrnuty tímto odkazem), vložením vybraných sekvenci do rekombinantních vektorů za účelem tvorby rekombinantů a pomocí dalších technik rekombinace DNA, které jsou obecně známy odborníkům v oblasti molekulární biologie.

• · 4

Nukleotidové sekvence podle vynálezu mohou být tedy použity díky jejich schopnosti selektivně vytvářet duplex molekul s komplementárními prodlouženími DNA fragmentů.

V závislosti na předpokládané aplikaci mohou být použity různé podmínky hybridizace, čímž získáme různé stupně selektivity sondy k cílové sekvenci. Pro aplikace vyžadující vysokou selektivitu se běžně používají poměrně přísné podmínky pro tvorbu hybridů. „Přísné podmínky hybridizace“, například poměrně nízká koncentrace soli a/nebo vysoká teplota, což splňuje například asi 0,02 M až asi 0,15 MNaCl při teplotě asi 50 °C až asi 70 °C. Takto vybrané podmínky umožňují málo, pokud vůbec nějaké nevhodné spojení mezi sondami a předlohou nebo círovým řetězcem a jsou obzvláště vhodné pro izolaci úseků DNA, které kódují krystalové proteiny. Detekci úseků DNA pomocí hybridizace je dobře známa odborníkům v dané oblasti a techniky U. S. patentů 4965188 a 5176995 (které jsou zde zahrnuty tímto odkazem) jsou typickým příkladem metod hybridizační analýzy. Postupy, jako například ty, které můžeme najít v textech Maloy a kol., 1990; Maloy 1994; Segal, 1976; Prokop a Bajpai, 1991 a Kuby, 1994, jsou zvláště relevantní.

Samozřejmě, že pro některé aplikace, například přípravu mutantů užívající mutantní primerové vlákno hybridizované na základní prvek předlohy nebo izolaci sekvence kódující krystalový protein z příbuzného kmenu, funkční ekvivalenty nebo podobně, jsou obacně zapotřebí méně přísné podmínky hybridizace, aby bylo dosaženo tvorby heteroduplexu. Za těchto podmínek může být přísnost podmínek hybridizace „nízká“ nebo „snížená“, například: od asi 0,15 M do asi 0,9 M solný roztok při teplotě v rozmezí asi od 20 °C do 55 °C. Křížem hybridizující kmeny mohou tak být jednoduše identifikovány jako pozitivně hybridizující signály s ohledem na řízené hybridizace.

V každém případě je obecně ceněno, že podmínky mohou být zpřísněny přidáním vzrůstajícího množství formamidu, který slouží k destabilizaci hybridního duplexu stejným způsobem jako zvýšená teplota. Tak můžeme s hybridizačními podmínkami jednoduše manipulovat a způsob výběru bude tedy obecně záviset na požadovaných výsledcích. Podle toho která konkrétní kombinace soli ( například NaCl nebo NaCitrát a podobně), organického pufiru (včetně například formamidu a podobně) a inkubačních nebo promývacích teplot bude použita budou odborníci v dané oblasti moci jednoduše určit podmínky hytridizace, které jsou „vysoce“, “středně“ nebo „málo“ přísné a budou schopni interpretovat výsledky hybridizačnícb analýz za takových podmínek k určení relativní homologie cílové sekvence nukleové kyseliny s určitou novou polynukleotidovou sondážní sekvencí vybranou z SEQ ID č.: 1, SEQ ID č.: 3, SEQ ID č.: 5, SEQ ID č.: 7, SEQ ID č.: 9, SEQ ID č.. 11, SEQ ID č.: 13, SEQ ID č.: 15 nebo SEQ ID č.: 18.

V určitých příkladech provedení bude výhodné použít sekvence nukleových kyselin podle vynálezu v kombinaci s vhodnými prostředky, například označení pro určení hybridizace. V dané oblasti je známo mnoho různých vhodných indikátorů včetně fluorescenčních, radioaktivních, enzymatických nebo jiných ligandů, například avidin/biotin, které jsou schopné dát detekční signál. Ve výhodných příkladech provedení může být použito fluorescenční označení nebo enzymová značka, například ureáza, alkalinfofatáza nebo peroxidáza, namísto radioaktivních nebo jiných, pro životní prostředí nevyhovujících, činidel. V případě enzymové značky jsou známy kolorimetrické indikátorové substráty, které mohou být použity pro zviditelnění lidskému oku nebo spektrofotometricky, pro identifikaci určité hybridizce s komplementárními vzorky, které obsahují nukleové kyseliny.

Obecně se předpokládá, že hybridizační sondy popsané ve vynálezu budou vhodné k obojímu: jako reagenty v hybridizačních roztocích a v příkladech provedení, které používají pevnou fázi. V příkladech provedení zahrnujících pevnou fázi je testovací DNA (nebo RNA) adsorbovaná nebo jinak připevněná k selekční matrix nebo povrchu. Tato upevněná, jednořetězcová nukleová kyselina je pak podrobena specifické hybridizací s vybranými sondami za požadovaných podmínek. Vybrané podmínky budou záviset na určitých okolnostech založených na určitých požadovaných kriteriích (závisí například na obsahu G+C, typu cílové nukleové kyseliny, zdroji nukleové kyseliny, velikosti hybridizační sondy, atd.) Následuje promytí hybridizačního povrchu, aby byly odstraněny nespecificky vázané sondážní molekuly, specifická hybridizace je určena nebo dokonce kvantifikována pomocí označení.

Vektory a způsoby rekombinantní exprese polypeptidů souvusejících s Cry

V dalších příkladech provedení se uvažuje, že určité výhody budou získány umístěním kódujícího úseku DNA pod kontrolu rekombinantního nebo heterologního promotoru. Podle použití ve vynálezu považujeme rekombinantní nebo heterologní promotor za odpovídající promotoru, který není normálně spojen s úsekem DNA kódujícím krystalový protein nebo peptid v jeho přirozeném prostředí. Takové promotory mohou zahrnovat promotory normálně spojené sjinými geny a/nebo promotory izolované z jakýchkoliv bakteriálních, virových, eukaryotických nebo rostlinných buněk. Bude samozřejmě důležité použít promotor, který účinně řídí expresi úseku DNA v typu buňky, organismu nebo dokonce zvířeti, které bylo vybráno pro expresi. Použití kombinací promotoru a typu buňky pro expresi proteinu je obecně známo odborníkům v oblasti molekulární biologie, napříkad viz Sambrook a kol., (1989). Použité promotory mohou být konstitutivní nebo inducibilní a • · · · φ φ φφφ · φφφ

ΦΦΦΦ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φ φ φ φ mohou být použity za vhodných podmínek k řízení exprese vysoké úrovně úvodního úseku DNA, což je výhodné pro výrobu rekombinantních proteinů nebo polypeptidů ve velkém měřítku. Vhodné systémy promotorů uvažované pro použití v expresi vysoké úrovně zahrnují, ale nejsou omezeny na: Pichia expresní vektorový systém (Pharmacia LKB Biotechnology).

Ve spojení s expresí se v příkladech provedení pro přípravu rekombinantních proteinů a peptidů předpokládá, že delší DNA úseky bydou používány častěji, přičemž DNA úseky kódující celou peptidovou sekvenci jsou nej výhodnější. Použití kratších úseků DNA křížení exprese krystalových peptidů nebo epitopů jaderných oblastí, například použití pro výrobu protilátek proti krystalickým proteinům, také spadá do myšlenky vynálezu. DNA úseky, které kódují peptidové antigeny asi od 8 do 50 aminokyselin nebo výhodněji asi od 8 do 30 aminokyselin nebo dokonce výhodněji asi od 8 do 20 aminokyselin jsou považovány za zvláště vhodné. Takové peptidové epitopy mohou být aminokyselinové sekvence, které obsahují související aminokyselinové sekvence, jak je popsáno ve vynálezu.

Transgenní rostliny exprimující cryET polypeptidy

Vynález dále poskytuje způsoby výroby transgenních rostlin, které exprimují vybraný úsek nukleové kyseliny obsahující sekvenční oblast, která kóduje nové endotoxin polypeptidy podle vynálezu. Postup výroby transgenních rostlin je velmi dobře znám v dané oblasti. Obecně metoda zahrnuje transformaci vhodné rostlinné hostitelské buňky pomocí úseku DNA, který obsahuje promotor funkčně spojený škodující oblastí, která kóduje jeden nebo více ze zde popsaných polypeptidů. Taková kódující oblast je obecně funkčně připojena k alespoň první transkripčněterminační oblasti, kde je promotor schopný řídit transkripci kódující oblasti v buňce a tak poskytuje buňce schopnost tvorby polypeptidu in vitro. Nebo v případě, že je zapotřebí řídit, regulovat nebo snížit množství jednotlivých rekombinantních krystalických proteinů exprimováných v určitých transgenních buňkách, poskytuje vynález také antimediátorový mRNA řetězec pro expresi krystalových proteinů. Použití antimediátorového mRNA řetězce jako prostředku pro řízení snížení množství daného proteinu v buňce je dobře známo v dané oblasti.

Vynález dále zahrnuje transgenní rostliny, které exprimují gen, úsek genu nebo sekvenční oblast, která kóduje alespoň jednu nebo více nových polypeptidových kompozic popsaných ve vynálezu. Zde používaný termín „transgenní rostlina“ znamená rostlinu, která má včleněné sekvence DNA včetně, ale není omezeno na geny, které nejsou pravděpodobně v rostlině přirozeně přítomny, DNA sekvence, které nejsou přirozeně transkribovány do RNA nebo nepodléhají translaci do

proteinů nebo jakékoli jiné geny nebo sekvence DNA, které mohou být zapotřebí pro introdukci do netransformované rostliny, například geny, které mohou být přítomny v netransformovaných roslinách, ale které je třeba buď geneticky upravit, nebo mít se změněnou expresí.

Uvažuje se, že v některých případech genom transgenní rostliny podle vynálezu bude mít/bude zvětšen stálým vložením jednoho nebo více transgenů, ať už přirozených, synteticky modifikovaných nebo mutovaných, které kódují insekticidní polypeptid identický se zde popsaným polypeptidem nebo s ním vysoce homologní. V některých případech bude do genomu transformované hostitelské rostlinné buňky včleněn více než jeden transgen. To je takový případ, kdy je do genomu takové rostliny včleněn více než jeden úsek DNA kódující krystalový protein. V určitých situacích může být zapotřebí mít jeden, dva, tři, čtyři nebo dokonce více B. thurigiensis krystalových proteinů (ať už přirozené nebo vyrobené rekombinací) včleněné a trvale exprimované v transformované transgenní rostlině. Nebo může být kmený transgen včleněn do rostlinné buňky aby jí propůjčil další fenotypové znaky. Takové transgeny mohou způsobovat rezistenci k jednomu nebo více kmenům hmyzu, bakterií, hub, virů, hlístů nebo dalších patogenů.

Výhodný gen, který může být včleněn zahrnuje například DNA sekvenci kódující krystalový protein z bakteriálního zdroje a zejména jednu nebo více sekvencí popsaných ve vynálezu, které jsou získány z Bacillus spp. Velmi výhodné sekvence nukleové kyseliny jsou ty, které jsou získány z B. thurigiensis nebo kterékoli z těch sekvencí, které byly geneticky pozměněny, aby se zvýšila nebo snížila insekticidní aktivita krystalového proteinu v takové hostitelské buňce.

Prostředky pro transformaci rostlinné buňky a přípravu pluripotentních rostlinných buněk a regeneraci transgenní buněčné linie z transgenní rostliny, buněčná kultura, embryo nebo kalusové pletivo jsou dobře známy odborníkům v dané oblasti a jsou zde popsány. Vektory, (včetně plazmidů, kosmidů, fágů, fagemidů, bakulovirů, virionů, BACs (umělé bakteriální chromozomy), YACs (umělé kvasinkové chromozomy) obsahující alespoň první úsek nukleové kyseliny kódující insekticidní polypeptid pro použití v transformaci takových buněk budou samozřejmě obecně obsahovat buď operóny, geny, nebo z genů odvozené sekvence podle vynálezu, ať už přirozené nebo uměle vyrobené a částečně ty, které kódují popsané krystalové proteiny. Tyto konstrukty nukleové kyseliny mohou dále obsahovat struktury jako jsou například promotory, zesilovače transkripce, mnohočetné spojovníky, introny, terminátory nebo dokonce sekvence genů, které mají pozitivní nebo negativní regulační účinek na klonovaný gen δ-endotoxinu, jak je požadováno.Úsek DNA nebo gen může kódovat buď přirozený nebo modifikovaný krystalový protein, který bude exprimován ve výsledných rekombinantních buňkách a/nebo, který dá transgenní rostlině, která

takový úsek obsahuje, zlepšený fenotyp (v tomto případě, zvýšenou rezistenci proti napadení hmyzem, zamoření škůdci nebo osídlení škůdci.).

Výroba transgenní rostliny, která obsahuje alespoň jednu polynukleotidovou sekvenci kódující insekticidní polypeptid za účelem zvýšení nebo rozšíření rezistence takové rostliny proti napadení cílovým hmyzem, představuje důležitý aspekt vynálezu. Především vynález popisuje přípravu jednoděložných a dvouděložných rostlin rezistentních proti hmyzu, včleněním transgenního úseku DNA, který kóduje jeden nebo více insekticidních polypeptidů, které jsou toxické pro hmyz z řádu Coleoptera nebo Lepidoptara, do takové rostliny.

S tím souvisí aspekt vynálezu, který zahrnuje semena produkovaná transformovanými rostlinami, potomky z takových semen a semena produkovaná těmito potomky původní transgenní rostliny, vytvořené podle dříve popsaného způsobu. Takové potomstvo a semena budou mít transgen kódující krystalový protein trvale včleněný do jejich genomu a rostliny takového potomstva zdědí znaky získané vložením trvalého transgenu podle Mendelových pravidel dědičnosti. Všechny takové transgenní rostliny, které mají transgenní úsek DNA kódující jeden nebo více krystalových proteinů nebo polypeptidů včleněný do svého genomu, jsou předmětem vynálezu. Jak bude zřejmé odborníkům v dané oblasti, potomstvo rostlin znamená jakékoli potomky vzniklé z takové rosliny.

Třídění krystalových proteinů a detekční sady

Vynález poskytuje způsoby a sady pro třídění vzorků, u kterých se předpokládá, že obsahují krystalové proteiny, polypeptidy nebo polypeptidy příbuzné s krystalovými proteiny nebo buňky tvořící takové polypeptidy. Sada může obsahovat jednu nebo více protilátek specifických pro popsané aminokyselinové sekvence nebo jednu nebo více protilátek specifických pro peptid odvozený od jedné z popsaných sekvencí a může také obsahovat činidlo (činidla) pro detekci interakce mezi vzorkem a protilátkou podle vynálezu. Předpokládané činidlo (činidla) může být radioaktivně, fluorescenčně nebo enzymaticky označené. Sada může obsahovat známé radioaktivní značkovací činidlo, které se váže nebo reaguje s nukleovou kyselinou nebo protilátkou podle vynálezu.

Činidlo (činidla) sady může být poskytováno jako kapalný roztok, připojené k pevnému nosiči nebo jako vysušený prášek. Je-li činidlo(a) poskytováno ve formě kapalného roztoku, kapalný roztok je s výhodou vodný roztok. Je-li poskytované činidlo(a) připojeno na pevný nosič, je pevný nosič s výhodou chromatografické médium, testovací deska s mnoha jamkami nebo mikroskopovací

··· *· ·· ··· ·· ···· krycí sklíčko. Je-li činidlo(a) poskytováno jako suchý prášek, prášek může být použit s přidáním vhodného ředidla, které může být také obsaženo v sadě.

V dalších příkladech provedení zahrnuje vynález imunodetekční způsoby a s nimi související sady. Krystalové proteiny nebo peptidy podle vynálezu mohou být použity k detekci protilátek, které snimi reagují nebo naopak protilátky připravené podle vynálezu mohou být použity k určení krystalových proteinů nebo epitopy obsahujících peptidů příbuzných s krystalovými proteiny. Obecně budou tyto způsoby zahrnovat za prvé získání vzorku, o kterém se předpokládá, že obsahuje takový protein, peptid nebo protilátku, kontakt vzorku s protilátkou nebo peptidem podle vynálezu, pokud je to zapotřebí, za podmínek vhodných pro tvorbu imunokomplexu a poté určení přítomnosti imunokomplexu.

Obecně je určení tvorby imunokomplexu dobře známo odborníkům v dané oblasti a může být dosaženo použitím četných přístupů. Ve vynálezu se uvažuje například použití ELISA, RIA, imunopřenosu (například bodový přenos na membránu), nepřímých imunofluorescečních technik a podobně. Obecně bude tvorba imunokomplexu určena pomocí značení, například radioaktivní značkování nebo enzymová značka. (Například alkalinfosfatáza, křenová peroxidáza nebo podobně). Samozřejmě, že v průběhu používání mohou být nalezeny další výhody kmenotně vázaných ligandů, jako je kmená protilátka nebo biotin/avidin vazebná soustava ligandů, jak je známo odborníkům v dané oblasti.

Za účelem testování může být použit prakticky každý vzorek s předpokládaným obsahem buď krystalového proteinu, nebo peptidu příbuzného s krystalovým proteinem nebo protilátky hledané pro určení. Takové příklady provedení mohou být aplikovány vtitraci vzorků antigenu nebo protilátky, ve výběru hybridomů a podobně. V souvisejících příkladech provedení poskytuje vynález sady, které mohou být použity k určení přítomnosti krystalových proteinů nebo příbuzných peptidů a/nebo protilátek ve vzorku. Vzorky mohou obsahovat buňky, buněčné supernatanty, buněčné suspenze, buněčné extrakry, enzymové frakce, proteinové extrakry nebo další kompozice bez buněk s předpokládaným obsahem krystalových proteinů nebo peptidů. Obecně řečeno, sady podle vynálezu budou obsahovat vhodný krystalový protein, peptid nebo protilátku cílenou proti takovému proteinu nebo peptidu spolu s imunodetekčním činidlem a prostředek pro uchování protilátky nebo antigenu a činidla. Imunodetekční činidlo bude typicky obsahovat značku spojenou s protilátkou nebo antigenem nebo spojenou s kmenotně se vážícím ligandem. Typické ligandy by mohly obsahovat kmenotnou protilátku cílenou proti první protilátce nebo antigenu nebo biotin nebo avidin (nebo streptavidin) ligandů majícímu připojené značky. Jak již bylo zmíněno, v dané oblasti

je samozřejmě známo mnoho typických značek a všechny takové značky mohou být použity ve spojení s vynálezem.

Kontejner bude typicky obsahovat ampulku, do které může být umístěna protilátka, antigen nebo detekční činidlo a s výhodou ve vhodném množství. Sady podle vynálezu budou také typicky obsahovat prostředek pro uložení konteinerů s protilátkami, antigeny a činidly v uzavřeném balení pro komerční prodej. Takové konteinery mohou obsahovat injekci nebo plastové konteinery s rozprašovačem, do kterých se požadované ampulky vloží.

Insekticidní kompozice a způsoby použití

Polypeptidové kompozice uvedené ve vynálezu mají být specielně vhodné jako insekticidy pro místní a/nebo systémovou aplikaci na zemědělské plochy, trávy, ovoce a zeleninu, trávníky, stromy a/nebo okrasné rostliny. Případně mohou být zde popsané polypeptidy formulovány ve formě spreje, prachu, prášku nebo rozpuštěné ve vodě, atomizované nebo v aerosolu pro hubení hmyzu nebo regulaci populace hmyzu. Polypeptidové kompozice podle vynálezu mohou být použity profylakticky nebo mohou být dodány do prostředí proti cílovému hmyzu, například WCRW, který byl rozpoznán v určité oblasti. Polypeptidové kompozice mohou obsahovat jednotlivý Cry polypeptid nebo mohou obsahovat různé kombinace zde popsaných polypeptidů.

Bez ohledu na způsob aplikace je množství složky (složek) aktivního polypeptidů aplikováno v insekticidně účinném množství, které se bude měnit v závislosti na takových faktorech, jako je například určitý kmen cílového hmyzu, určité prostředí, poloha, rostlina, úroda nebo zemědělská plocha, která má být ošetřena, podmínky prostředí a způsob, rychlost, koncentrace, stabilita a množství aplikované insekticidně účinné polypeptidové kompozice. Formulace se také může měnit s ohledem na klimatické podmínky a/nebo na frekvenci aplikace a/nebo závažnost zamoření škůdci.

Popsaná insekticidní kompozice může být vyrobena formulováním buď bakteriální buňky, krystalové a/nebo sporové suspenze nebo izolované proteinové složky s požadovaným zemědělsky přijatelným nosičem. Kompozice může být formulována před podáváním ve vhodném prostředku jako například lyofilizovaná, vysušená a zmražená, sušená nebo ve vodném nosiči, mediu nebo vhodném ředidle, jako je napříkad solný roztok nebo jiný pufr. Formulovaná kompozice může být ve formě prášku nebo granulí nebo suspenze v oleji (rostlinném nebo minerálním) nebo vodě nebo emulzi olej/voda nebo jako smáčivý prášek nebo v kombinaci s jakýmkoli jiným nosičem vhodným pro aplikaci v zemědělství. Nosiče vhodné pro zemědělství mohou být pevné nebo kapalné a jsou dobře známé odborníkům v dané oblasti. Pojem „zemědělsky přijatelné nosiče“ pokrývá všechny • 9 pomocné látky, inertní komponenty, dispergovadla, povrchově aktivní činidla, prostředky pro zlepšení konfekční lepivosti, pojivá, atd., které jsou obyčejně používány v technologii insekticidních formulací; tyto jsou dobře známy odborníkům v oblasti insekticidních formulací. Formulace mohou být smíchány s jednou nebo více pevnými pomocnými látkami a připraveny různými způsoby, například homogenním míšením, smícháním a/nebo mletím insekticidní kompozice s vhodnou pomocnou látkou s použitím konvenčních technik formulace.

Tekuté olejové suspenze

Ve výhodném příkladu provedení vynálezu obsahuje insekticidní kompozice tekutou olejovou suspenzi bakteriálních buněk, které exprimují nový, zde popsaný, krystalový protein. Typické bakteriální kmeny zahrnují takové jako například B. thuringiensis, B. megaterium, B. subtilis, B. cereus, E. coli, Salmonella spp., Agrobacterium spp. nebo Pseudomonas spp.

Ve vodě dispergovatelné granule

V dalším důležitém příkladu provedení obsahuje bioinsekticidní kompozice ve vodě dispergovatelné granule. Tyto granule obsahují bakteriální buňky, které exprimují nový, zde popsaný, krystalový protein. Bakteriální buňky zahrnují s výhodou takové bakterie jako jsou například B. megaterium, B. subtilis, B. cereus, E. coli, Salmonella spp., Agrobacterium spp. nebo Pseudomonas spp. Transformované buňky s úsekem DNA podle vynálezu, které exprimují krystalový protein jsou také považovány za vyhovující.

Prášky a formulace spor

Ve třetím důležitém příkladu provedení obsahuje bioinsekticidní kompozice smáčivý prášek, krystalickou formulaci spor, kuličky obsahující spory nebo koloidní koncentrát. Takový prášek obsahuje bakteriální buňky, které exprimují zde popsaný nový krystalový protein. Bakteriální buňky, které s výhodou zahrnují B. thuringiensis buňky nebo buňky bakteriálních kmenů jako jsou například: B. megaterium, B. subtilis, B. cereus, E. coli, Salmonella spp., Agrobacterium spp. nebo Pseudomonas spp. a podobně, mohou být také transformovány jedním nebo více úseky nukleové kyseliny jak zde bylo uvedeno. Takové vysušené formy insekticidních kompozic mohou být formulovány pro rozpuštění okamžitě po namočení nebo rozpuštění řízeným uvolňováním, postupným uvolňováním nebo jiným na čase závislým způsobem. Takové kompozice mohou být • · 4 «4 4 4

4·· 4 44 4

4 4 4 4 4

444 44 4444 aplikovány na cílový hmyz nebo je může cílový hmyz přijímat v potravě a jako takové mohou být používány k řízení množství hmyzu nebo rozšíření takového hmyzu v daném biotopu.

Vodné suspenze a filtráty nebo lyzáty bakteriálních buněk

Ve čtvrtém důležitém příkladu provedení vynálezu obsahují bioinsekticidní kompozice vodné suspenze bakteriálních buněk nebo vodné suspenze parasporálních krystalů nebo vodné suspenze filtrátů nebo lyzátů bakteriálních buněk, atd., jako jsou například ty dříve popsané, které exprimují krystalický protein. Takové vodné suspenze mohou být poskytovány ve formě koncentrovaného roztoku určeného ke skladování, který se zředí před aplikací nebo ve formě zředěného roztoku, který je připraven k použití.

Pro tyto metody zahrnující aplikaci bakteriálních buněk, může být buněčný hostitel obsahující gen (geny) pro krystalový protein pěstován v jakémkoli vhodném živném médiu, kde DNA konstrukt poskytuje selektivní výhodu poskytovanou selektivnímu médiu za tím účelem, aby si podstatné množství buněk, případně všechny buňky, udržely gen B. thuringiensis. Tyto buňky pak mohou být vytěženy konvenčními způsoby. Nebo mohou být buňky před vytěžením ošetřeny.

Ob sáhuj e-li insekticidní kompozice intaktní buňky B. thuringiensis exprimují cí žádaný protein, mohou být takové bakterie formulovány různými způsoby. Mohou být použity ve formě smáěivých prášků, granulí nebo prachů mícháním s různými inertními materiály, jako jsou například anorganické minerály (fylosilikáty, karbonáty, sulfáty, fosfáty a podobně) nebo rostlinné materiály (rozemletá vřetena kukuřičných klasů, rýžové slupky, skořápky vlašských ořechů a podobně). Formulace může obsahovat rozprašovací a lepicí pomocné látky, stabilizující činidla, jiná pesticidní aditiva nebo povrchově aktivní činidla. Kapalné formulace mohou být vodné nebo nevodné a mohou být použity jako pěny, suspenze, emulgovatelné koncentráty nebo podobně. Složky mohou obsahovat reologická činidla, povrchově aktivní činidla, emulgátory, dispergovadla nebo polymery.

Případně mohou být nové insekticidní polypeptidy připraveny přirozenými nebo rekombinovánými bekteriálními expresními systémy in vitro a izolovány pro následnou aplikaci. Takový protein může být buď v surových buněčných lyzátech, suspenzích, koloidech, atd. nebo může být purifikován, rafinován, rozpuštěn vpufru a/nebo podroben dalším postupům před formulováním do aktivní biocidní formulace. Podobně může být za určitých podmínek vyžadováno izolovat krystaly a/nebo spory z bakteriálních kultur exprimujících krystalový protein a aplikovat roztoky, suspenze nebo koloidní přípravky takových krystalů a/nebo spor jako aktivní bioinsekticidní kompozici.

·· • ·» • 4 · 99 99 * «·· · · · · • · · · · · • · ··· · · ····

Multifunkční formulace

V určitém příkladu provedení, kde je požadován účinek na více kmenů hmyzu, může také insekticidní formulace podle vynálezu dále obsahovat jeden nebo více chemických pesticidů (jako jsou například chemické pesticidy hubící hlísty, houby, viry, mikroby, měňavky, hmyz, atd.) a/nebo jeden nebo více polypeptidů δ-endotoxinu, které mají stejný nebo jiný insekticidní účinek nebo jiné insekticidní určení než insekticidní polypeptid popsaný ve vynálezu. Insekticidní polypeptidy mohou také být použity v kombinaci s jinými způsoby ošetření jako jsou například hnojivá, prostředky proti pleveli, ochranné prostředky proti mrazu, povrchově aktivní činidla, detergenty, insekticidní mýdla, dormantní oleje, polymery a/nebo časem se uvolňující nebo biodegradabilní nosné formulace, které umožňují dlouhodobé dávkování látky na cílovou plochu po jedné aplikaci formulace. Podobně může být formulace připravena ve formě návnad určených k požití nebo upravena jako „past“ na hmyz, která umožňuje konzumaci insekticidní formulace cílovým hmyzem. Insekticidní kompozice podle vynálezu mohou také být použity postupně nebo současně s aplikováním do prostředí jednotlivě nebo v kombinaci jednoho nebo více dalších insekticidů, pesticidů, chemikálií hnojiv nebo dalších složek.

Způsoby aplikace a účinné poměry.

Insekticidní kompozice podle vynálezu jsou aplikovány do prostředí cílového hmyzu, obvykle na listy rostliny nebo plodiny, která má být chráněna, konvenčními metodami, s výhodou rozprašováním. Síla a trvání insekticidní aplikace budou určeny s ohledem na podmínky specifické pro určité(ho) škůdce, plodinu(y), která má být ošetřena a částečně podmínky prostředí. Poměrné zastoupení účinné složky a nosiče bude samozřejmě záviset na chemické podstatě, rozpustnosti a stabilitě insekticidní kompozice, stejně jako na konkrétní používané kompozici.

Jiné aplikační techniky, včetně práškování, kropení, namáčení zeminy, injikování zeminy, potahování semen, pokrývání sazenic, postřiku listů, rozprášení do vzduchu, prášení, rozprašování, plynování, ošetření aerosolem a podobně jsou také proveditelné a mohou být požadovány za určitých podmínek, jako jsou například hmyz, který způsobuje zamoření kořenů nebo stonku nebo pro aplikaci na jemnou vegetaci nebo okrasné rostliny. Tyto aplikační postupy jsou také dobře známé odborníkům v dané oblasti.

Insekticidní kompozice podle vynálezu mohou také být formulovány pro preventivní nebo profylaktickou aplikaci na určitou plochu a mohou být za určitých podmínek aplikovány na domácí

zvířata, hospodářská zvířata, stání pro zvířata nebo v okolí hospodářského vybavení, stodol, chlévů nebo zemědělských nebo průmyslových potřeb a podobně.

Koncentrace insekticidní kompozice, která je použita do prostředí, systémově, místně nebo na listy se bude velmi měnit v závislosti na podstatě konkrétní formulace, prostředcích aplikace, podmínkách prostředí a stupni biocidní aktivity. Obecně lze říci, že insekticidní kompozice bude přítomna v aplikované formulaci v koncentraci alespoň asi 1 hmotn.% a může být až asi 99 hmotn.% včetně. Suché formulace polypeptidových kompozic mohou obsahovat asi od 1 hmotn.% až do asi 99 hmotn.% nebo i více proteinové kompozice, zatímco kapalné formulace mohou obecně obsahovat asi od 1 hmotn.% až do 99 hmotn.% nebo více aktivní složky. Jako takové jsou mnohé formulace upravitelné, včetně těch formulací, které obsahují asi od 5 hmotn.% až 95 hmotn.% nebo více insekticidního polypeptidu, včetně těch formulací, které obsahují asi od 10 hmotn.% až do asi 90 hmotn.% nebo více insekticidního polypeptidu. Samozřejmě, že kompozice obsahující asi od 15 hmotn.% až do 85 hmotn.% nebo více insekticidního polypeptidu a formulace obsahující asi od 20 hmotn.% až do 80 hmotn.% nebo více insekticidního polypeptidu také spadají do myšlenky vynálezu.

V případě kompozic, ve kterých jsou obsaženy intaktní bakteriální buňky s insekticidním polypeptidem, obsahují přípravky obecně asi od 10⁴ až 10⁸ buněk/mg, ačkoli v určitých příkladech provedení vynálezu může být požadováno použít formulace obsahující asi od 10² do 10⁴buněk/mg nebo jsou-li požadovány koncentrovanější formulace, může být také formulována kompozice obsahující asi od 10⁸ do 10^Ιθ nebo 10¹¹ buněk/mg. Nebo mohou být připraveny buněčné pasty, spórové koncentráty nebo koncentráty suspenze krystalových proteinů, které obsahují ekvivalent od asi 1013 buněk/mg aktivního polypeptidu a takové koncentráty mohou být zředěny před aplikací.

Drive popsaná insekticidní formulace může být podávána na určitou rostlinu nebo cílovou plochu v jedné nebo více aplikací, podle potřeby, přičemž obvyklé množství aplikované na pole je v rozmezí asi od 50 g/ha do 500 g/ha aktivní složky nebo může být použito asi od 500 g/ha do 1000 g/ha. V určitém případě může být dokonce zapotřebí aplikovat insekticidní formulaci na cílovou plochu v množství asi od 1000 g/ha do 5000 g/ha nebo více aktivní složky. Ve skutečnosti, všechna aplikovaná množství v rozsahu asi od 50 g aktivního polypeptidu na hektar do asi 10 000 g/hektar jsou vhodná pro hubení cílových hmyzích škůdců s použitím takových insekticidních formulací. Jako taková, mohou být použitelná v určitých zemědělských, průmyslových a domácích aplikacích zde popsaných pesticidních formulací tato množství: asi 100 g/ha, asi 200 g/ha, asi 300 g/ha, asi 400 g/ha, asi 500 g/ha, asi 600 g/ha, asi 700 g/ha, asi 800 g/ha, asi 900 g/ha, asi 1 kg/ha, asi

1,1 kg/ha, asi 1,2 kg/ha, asi 1,3 kg/ha, asi 1,4 kg/ha, asi 1,5 kg/ha, asi 1,6 kg/ha, asi 1,7 kg/ha, asi 1,8 kg/ha, asi 1,9 kg/ha, asi 2,0 kg/ha, asi 2,5 kg/ha, asi 3,0 kg/ha, asi 3,5 kg/ha, asi 4,0 kg/ha, asi 4,5 kg/ha, asi 6,0 kg/ha, asi 7,0 kg/ha, asi 8,0 kg/ha, asi 8,5 kg/ha, asi 9,0 kg/ha a dokonce až včetně asi 10,0 kg/ha nebo více aktivního polypeptidů.

Epitopické středové sekvence

Vynález se také týká proteinových nebo peptidových kompozic, které jsou zbaveny celých buněk a dalších peptidů, a které obsahují přečištěný peptid s včleněným epitopem, který imunologicky křížově reaguje s jednou nebo více protilátkami, které jsou specifické pro popsané polypeptidové sekvence. Zde používaný pojem „včlenění epitopu(ů), který imunologicky křížově reaguje s jednou nebo více protilátkami, které jsou specifické pro popsané polypeptidové sekvence“ znamená peptidový nebo proteinový antigen, který obsahuje primární, sekundární nebo terciální strukturu podobnou epitopu lokalizovanému v popsaném polypeptidů. Stupeň podobnosti bude obecně takový, že monoklonální nebo polyklonální arotilátky proti krystalovému proteinu nebo polypeptidů se budou také vázat, reagovat nebo podobně rozpoznávat křížově reagující peptidový nebo proteinový antigen. V souvislosti s takovými protilátkami mohou být použity různé metody imunitních testů, jako jsou například: Western blotting, ELISA, RIA a podobně, z nichž všechny jsou známy odborníkům v dané oblasti.

Určení imunodominantních epitopů a/nebo jejich funkčních ekvivalentů vhodných pro použití ve vakcínách je poměrně jednoduché. Například mohou být použity metody Hoppa uvedené v US patentu 4554101, který je zde zahrnut tímto odkazem, kde je popsáno určení a příprava epitopů z aminokyselinových sekvencí na bázi hydrofilie. Postupy popsané v několika dalších patentech a počítačové programy na nich založené mohou být také použity pro určení epitopických středových sekvencí, (viz například Jameson a Wolf, 1988; Wolf a kol., 1988; US patent 4,554,101). Aminokyselinová sekvence těchto epitopických středových sekvencí může tedy být přímo včleněna do peptidů, buď pomocí aplikace peptidové syntézy nebo rekombinantní technologie.

Peptidy pro použití podle vynálezu budou s výhodou obecně dlouhé 8 až 20 aminokyselin a s výhodou asi 8 až asi 15 aminokyselin. Kratší antigenní peptidy odvozené od krystalických proteinů budou za určitých podmínek výhodnější, napříkad při výrobě imunodetekčních testů. Typické výhody zahrnují jednoduchost výroby a přečištění, poměrně nízkou cenu a zvýšenou reprodukovatelnost výroby a výhodnou biodistribuci.

Některé výhody vynálezu mohou být realizovány pomocí výroby syntetických peptidů, které obsahují modifikované a/nebo prodloužené epitopické/imunogenní středové sekvence, čímž se získá „univerzální“ epitopický peptid zaměřený na krystalové proteiny a související sekvence. Tyto epitopické středové sekvence jsou zde určeny v konkrétních polohách jako hydrofilní oblasti určitého polypeptidového antigenu. Tyto oblasti představují ty oblasti, které nejčastěji stimulují T-buňky nebo B-buňky a tak způsobují tvorbu specifických protilátek.

Epitopickou středovou sekvencí se zde myslí poměrně krátká sekvence aminokyselin, která je „komplementární“ s vazebnými místy antigenu na protilátkách krystalických proteinů podle vynálezu, na než se tudíž váže. Mimoto nebo kromě toho je epitopická středová sekvence taková, že vyvolává tvorbu protilátek, které křížově reagují s protilátkami cílenými proti peptidovým kompozicím podle vynálezu. Je zřejmé, že v tomto kontextu znamená pojem „komplementární“ aminokyseliny nebo peptidy, které se vzájemně přitahují. Takže určité epitopické středové sekvence podle vynálezu mohou být pracovně označeny v pojmech, které se týkají jejich schopnosti soutěžit s požadovaným proteinovým antigenem ve vazbě nebo dokonce znemožnit vazbu požadovaného proteinového antigenu s odpovídajícím antisérem cíleným proti proteinu.

Obecně lze říci, že velikost polypeptidového antigenu není rozhodující, pokud je polypeptid alespoň tak dlouhý, aby mohl nést určenou středovou sekvenci nebo sekvence. Předpokládá se, že nejmenší použitelná středová sekvence bude obecně v pořadí asi 8 aminokyselin, s výhodou 10 až 20 aminokyselin. Tato velikost bude tedy obecně odpovídat nejmenším peptidovým antigenům vyrobeným podle vynálezu. Velikost antigenu však může být větší, je-li to zapotřebí, tak dlouhá, aby mohla obsahovat zálkadní epitopickou středovou sekvenci.

Určení epitopické středové sekvence je známo odborníkům vdané oblasti, je popsáno například v US patentu 4554101, který je zde zahrnut tímto odkazem, a kde je uvedeno určení a výroba epitopů z aminokyselinových sekvencí na bázi hydrofílie. Mimoto exestuje mnoho počítačových programů, které jsou vhodné pro prognózu antigenní části proteinů (viz například Jameson a Wolf, 1988; Wolf a kol., 1988). Počítačové programy pro analýzu peptidové sekvence (například DNAStar® software, DNAStar, lne., Madison, WI) mohou být také užitečné pro navržení syntetických peptidů podle vynálezu.

Syntéza epitopických sekvencí nebo peptidů, které obsahují ve své sekvenci antigenní epitopy může být prováděna pomocí konvenčních metod syntézy jako je například metoda pevné fáze (například s využitím komerčně dostupného syntetizéru peptidů jako je například Applied Biosystems Model 430A syntetizér peptidů). Peptidové antigeny syntetizované tímto způsobem

·· · ·· ·· • φ Φ · φ φ· · • · · · · · mohou pak být odměřeny v předem určených množstvích a uskladněny k pozdějšímu použití obvyklým způsobem, jako například ve vodných roztocích nebo dokonce s výhodou ve formě prášku nebo v lyofilizovaném stavu.

Obecně lze říci, že díky poměrné stabilitě peptidů mohou být přímo uskladněny ve vodných roztocích po dosti dlouhou dobu, pokud je to zapotřebí, například až 6 měsíců nebo déle, přičemž jsou prakticky jakékoli vodné roztoky bez patrných známek degradace nebo ztráty antigenní účinnosti. Avšak při delším skladování vodného roztoku je většinou zapotřebí přidat činidla obsahující pufry jako je například Tris nebo fosfátové pufřy, aby bylo zachováno pH asi 7,0 až asi 7,5. Kromě toho může být zapotřebí přidat činidla, která inhibují růst mikroorganismů, jako je například azid sodný nebo Merthiolat. Pro delší skladování ve formě vodného roztoku může být zapotřebí uskladnit roztok při teplotě asi 4°C nebo jej s výhodou zmazit. Peptidy v lyofilizovaném stavu nebo ve formě prášku mohou být samozřejmě skladovány prakticky neomezeně, například v odměřených množstvích, která budou před použitím rozpuštěna v určeném množství vody (s výhodou destilované) nebo pufru.

Následující pojmy mají tyto uvedené významy:

Exsprese: proces zahrnující vnitrobuněčné děje včetně transkripce a translace, které umožňují vytvoření polypeptidů podle kódující molekuly DNA jako je například strukturní gen.

Pluripotentní: pojem označující rozvinutou přizpůsobivost. Pluripotentní buňka je schopna diferenciace na mnoho různých typů a kmenů buněk. Například kmenová buňka kostní dřeně může dát vznik mnoha různým kmenům krevních buněk cirkulujících v krevním řečišti. Opakem pluripotentní buňky je buňka diferencovaná, která má jednoznačně určený směr vývoje.

Promotor: Rozpoznávací místo na DNA sekvenci nebo skupina DNA sekvencí, která poskytuje expresní řídící element pro strukturní gen a k níž se specificky váže RNA polymeráza a spouští RNA syntézu (transkripci) takového genu.

Regenerace: Proces růstu rostliny z rostlinné buňky (například rostlinného protoplastu nebo explantátu).

Strukturní gen: Gen jehož expresí vzniká polypeptid.

Transformace: Proces vložení exogenní DNA sekvence (napříkad vektoru, rekombinantní DNA molekuly) do buňky nebo protoplastu, ve kterém je taková exogenní DNA včleněna do chromozomu nebo je schopna autonomní replikace.

Transformovaná buňka: Buňka jejíž DNA byla upravena vložením exogenní DNA molekuly do této buňky.

Transgenní buňka: Jakákoli buňka odvozená od nebo regenerovaná z transformované buňky nebo odvozená od transgenní buňky. Typické transgenní buňky zahrnují rostlinné buňky odvozené od transformované rostlinné buňky a takových buněk jako jsou buňky lisů, kořenů stonku, například somatické buňky nebo reprodukční (zárodečné) buňky získané z transgenních rostlin.

Transgenní rostlina: Rostlina nebo potomstvo jakékoli generace rostliny, která byla odvozena od transformované rostlinné buňky nebo protoplastů, kde roslinné nukleové kyseliny obsahují vybrané exogenní sekvenční oblasti nukleové kyseliny, které nejsou původně přítomny v přirozené, netransgenní rostlině stejného kmenu. Pojem „transgenní rostlina“ a „transformovaná rostlina“ byly několikrát použity v dané oblasti jako synonymní pojmy označující rostlinu, jejíž DNA obsahuje exogenní DNA molekulu. Je však přesnější označovat regenerovanou rostlinu nebo kalus získané z transformované rostlinné buňky nebo protoplastů nebo z transformovaných pluripotentních roslinných buněk jako transgenní rostliny. Transgenní rostliny podle vynálezu zahrnují s výhodou ty rostliny, které obsahují alespoň první vybraný polynukleotid, který kóduje insekticidní polypeptid. Tento výbraný polynukleotid je s výhodou δ-endotoxin kódující oblast (nebo gen) funkčně připojená k alespoň prvnímu promotoru, který exprimuje kódující oblast, čímž vzniká insekticidní polypeptid v transgenní rostlině. Transgenní rostliny podle vynálezu, které tvoří kódovaný polypeptid vykazují s výhodou fenotyp zvýšené rezistence k cílovým hmyzím škůdcům. Takové transgenní rostliny, jejich potomstvo a semena z jakékoli takové generace jsou s výhodou rostliny rezistentní proti hmyzu.

Vektor: Molekula nukleové kyseliny schopná replikace v hostitelské buňce a/nebo k níž může být funkčně připojen jiný úsek nukleové kyseliny tak, aby došlo k replikaci připojeného úseku. Plazmidy, fágy, fágemidy a kosmidy jsou typické vektory. V mnoha příkladech provedení vynálezu jsou vektory používány jako prostředky pro vložení jednoho nebo více vybraných polynukleotidů do hostitelské buňky, čímž vzniká „transformovaná“ nebo „rekombinantní“ hostitelská buňka.

Popis obrázků

Obrázky jsou součástí přihlášky vynálezu a jsou zde uvedeny pro lepší demonstraci určitých aspektů vynálezu. Vynálezu může být lépe rozuměno s pomocí jednoho nebo více těchto obrázků v souvislosti s detailním popisem konkrétních příkladů provedení vynálezu, které jsou zde uvedeny. Obr. 1 Restrikční mapa pEG1337

Obr. 2 Restrikční mapa pEGl 921.

• 44 ·*» 4 44 44

444 4444 4·4 4

444 444 44 4

444 44 4 444

444 44 >4 4^· 44 4444

Obr. 3 SDS-PAGE analýza spórové krystalové suspenze zC2 kultur EG11658, EG12156 a EG12158. Dvacet pět mikrolitrů (μΐ) suspenze bylo zředěno s 75 μΐ sterilní vody a připraveno pro elektroforézu jak je popsáno v příkladu 11. Deset mikrolitrů bylo naneseno v pruzích na 15% akrylamidový gel. Pravidelné ředění albuminu hovězího séra (BSA) bylo zařazeno jako standard. Pruhy 1 až 3, EG11658; pruhy 4 až 6, EG12156; pruhy 7 až 8, EG12158. M = standardy molekulární hmotnosti (Sigma M-0671) v kilodaltonech. Pruhy odpovídající CryET76, CryET80 a CryET84 jsou označeny šipkami.

Příklady provedení vynálezu

Některé výhody vynálezu

Vynález poskytuje nové δ-endotoxiny, které jsou vysoce toxické pro hmyz, jako je například WCRW, SCRW, a CPB. Tyto proteiny mají aminokyselinové sekvence, které pouze vzdáleně souvisí s těmi δ-endotoxiny, které jsou toxické pro hmyz z řádu Diptera nebo Coleoptera. Podle směrnic nomenklatury krystalových proteinů stanovených pro B. thuringiensis (Crickrnore a kol., 1998), dva z těchto polypeptidů, označené CryET76 a CryET80 reprezentují nové podtřídy insekticidních krystalových proteinů účinných proti hmyzu z řádu Coleoptera.

Hmyzí škůdci

Téměř všechny plodiny, rostliny a zemědělské plochy jsou citlivé pro napadení jedním nebo více hmyzími škůdci. Zejména problematický je hmyz z řádu Lepidoptera a Coleoptera uvedený v tabulce 1. Například zelenina jako jsou: artyčoky, brukev, Eruca vesicaria ssp. sativa (arugula), pór, chřest, čočka, fazole, hlávkový salát (například hlava, list, romaine), řepy, hořčice bílá, C. purpuro-variegatus (malanga), brokolice, meloun (například Cucumis melo, vodní meloun, cukrový meloun, Cucumis melo, variety inodorus, Cucumis melo, variety reticulatus), růžičková kapusta, zelí, cardoni, mrkev, napa, květák, Hibiscus esculentus (okra), cibule, celer, petržel, hrách ptačí, pastinák, cikorka, hrách, čínské zelí, paprika, okrasná kapusta Brassica oleracea (collards), brambor, okurka, dýně, ředkvička, cibule, Brassica napus, variety napobrassica (rutabaga), baklažán, Tragopogon porrifolius (salsify), locika lesní, cibule šalotka (Allium ascalonicum Z.), čekanka, sója, česnek, špenát, zelená cibule, tykve, zelené fazole, cukrová řepa, sladké brambory, tuřín, řepa Beto vulgaris, variety cicla (swiss chard), křen selský, rajče, kapusta, tuřín a různé kmeny koření jsou vnímavé k zamoření jedním nebo více z následujících hmyzích škůdců: Autographa californica (alfalfa looper), Pseudaletia unipuncta, Spodoptera exigua (beet armyworm), Gortyna xanthenes (artichoke chochol moth), některé kmeny Choristoneura (cabbage budworm),

• ·· e · * • 999	• 4 9 9 9 »	• 4	• 9	9 9 9 9
9 •	♦ ♦
9 9 9	• »		♦	•	•
·· · · ·	·«	* 9 ·		» 9

Trichoplusia ni, Crocidolomia binotalis( cabbage webworm), eliothis zea, kmeny napadající listy celeru (celery leafeater),Cotesia orobenae (cross-striped cabbageworm), Ostrinia nubilalis, předivka polní, Plathypena scabra (green cloverworm), Pieris rapae, Diaphania hyalinata (mellonworm), Sparganothis stultana (omnivorous leafroller), Diaphania nitidalis (pickleworm), larvy Noctuidae (rindworm komplex), Estigmene acrea (saltmarsh Caterpillar), Pseudoplusia includens ( soybean looper), Heliothis virescens (tobacco budworm), Heliothis zea (tomato fruitworm), Manduca quinquemaculata (tomato hornworm), Keiferia lycopersicella (tomato pinworm), Anticarsia gemmatalis (velvetbean Caterpillar) a Spodoptera ornithogalli.

Podobně krmné a užitkové plodiny, jako je například vojtěška, krmná tráva a siláže jsou často napadány takovými kmeny škůdců jako je například: Pseudaletia unipuncta, spodoptera exiqua (beet armyworm), colias eurytheme, Thymelicus lineola (European skipper) a různými kmeny z čeledí Geometridae, Noctuidae, Mythimna spp.(loopers), larvy motýlů, vytvářející pavučinové zámotky (webworms) a Spodoptera ornithogalli (yellow striped armyworm).

Ovoce a víno, jako například jablka, meruňky, třešně, nektarinky, broskve, hrušky, slívy, švestky, kdoule, kaštany, lískové ořechy, Carya illinoensis (pecans), pistácie, vlašské ořechy, citróny, ostružiny, borůvky, Rubus ursinus (boysenberries), brusinky, rybíz, Rubus loganobaccus (loganberries), maliny, jahody, hrozny, avokádo, banány, kiwi, tomely, granátová jablka, ananasy, tropické ovoce, jsou často napadány Eumorpha achemon (achema sphinx moth), Amorbia spp. (amorbia), Pseudaletia unipuncta, Xylomyges curialis (citrus cutworm), Erionota thrax (banana skipper), Rhopobota naevana (blackheaded fireworm), Sparganothis sulfureana (blueberry leafroller), Alsophila pometaria, Grapholitha packardii (cherry fruitworm), Xylomyges curialis (citrus cutworm), Chrysoteuchia topiaria (cranberry girdler), Malacosoma americanum (eastern tent Caterpillar), Hyphantria cunea (fall webworm), Archips rosanus (filbert leafroller), některé kmeny z Noctuidae (rough skinned cutworm), Archips argyrospila (fruit tree leafroller), Endopiza viteana (grape berry moth), Sparganothis pilleriana (grape leaffolder), Harrisina americana (grape leaf skeletonizer), Lithophane antennata (green fruitworm), kmeny rodu batrachedra (gummososbatrachedra commosae), Lymantria dispar (gypsy moth), Cydia caryana (hickory shuckworm), Manduca spp. (hornworms), kmeny z čeledí Geometridae, Noctuidae a Mythimna spp. (loopers), Paramyelois transitella (navel orangeworm), Choristoneura rosaceana (obliquebanded leafroller), Sparganothis stultana (omnivorous leafroller), Sabulodes caberata (omnivorous looper), Argyrotaenia citrana (orange tortrix), Papilio cresphonates (orange dog), Grapholitha molesta (oriental fruit moth), Pandemis pyrusana (pandemis leafroller), Anarsia lineatella (peach twig borer), Acrobasis nuxvorella (pecan nut casebearer), Argyrotaenia velutinana (redbanded leafroller), Schizura concinna (redhumped Caterpillar), některé druhy z Noctuidae (rough skinned cutworm), Estigmene acrea (saltmarsh Caterpillar), Operophtera bruceata (spanworm), Malacosoma spp. (tent Caterpillar ), kmeny rodu Thecla (thecla-thecla basillides), Heliothis virescens (tobacco budworm), Tortricidae (tortrix moth), Platynota idaeusalis (tufted apple budmoth), Platynota flavendana (variegated leafroller), Citheronia regalis (walnut Caterpillar), Malacosoma californicum (western tent Caterpillar) a Spodoptera omithogalli.

Plodiny pěstované na polích, například řepka olejka, prvosenky, Limnanthes douglasii (meadow -foam), kukuřice (krmná, sladká, popkorn), bavlna, chmel, jojoba, podzemnice, rýže, Carthamus tinctorius (safflower), obilniny (ječmen, oves, žito, pšenice, atd.), proso, sója, slunečnice a tabák jsou často cílem hmyzu jako je například: Pseudaletia unipuncta, Ostrinia fumacalis a jiné kmeny Pyralidae (asian and other corn borers), Cochylis hospes (banded sunťlower moth), spodoptera exiqua, Heliothis spp. (bollworm), Trichoplusia ni, Diabrotica spp. (včetně Diabrotica virgifera a Diabrotica undecimpunctata ) (corn rootworm), Bucculatrix thurberiella (cotton leaf perforator), Plutella xylostella (diamondback moth), Ostrinia nubilalis, Plathypena scabra, larvy můr napadající obilniny (headmoth, headworm), Pieris rapae, kmeny z čeledí Geometridae, Noctuidae a Mythimna spp. včetně Anacamptodes spp., Choristoneura rosaceana (obliquebanded leafroller), Cnephasia longana (omnivorous leaftier), Helicoverpa zea (podworm), Estigmene acrea (saltmarsh Caterpillar), Diatraea grandiosella, Pseudoplusia includens ( soybean looper), Xestia spp. (spotted cutworm), Homoeosoma electellum (sunflower moth), Heliothis virescens (tobacco budworm), Manduca sexta (tobacco hornworm), Anticarsia gemmatalis (velvetbean Caterpillar).

Záhonové rostliny, květiny, ozdobné rostliny, zelenina a zásobárny jsou často hostiteli hmyzu jako je Pseudaletia unipuncta, Datana major (azalea moth), Spodoptera exigua (beet armyworm), předivka polní, Agrius spp. (ello moth,hornworm), Callopistriafloridensis (Florida fern Caterpillar), Automeris io (Io moth), kmeny z čeledí Geometridae, Noctuidae a Mythimna spp. (loopers), Syntomeida epilais (oleander moth), Sparganothis stultana (omnivorous leafroller), Sabulodes caberata (omnivorous looper) a Heliothis virescens (tobacco budworm).

Lesy, ovocné a ořechy plodící stromy, stejně jako keře a jiné rostliny jsou často napadány hmyzem jako je: Thyridopteryx ephemeraeformis (bagworm), Rhopobota naevana (blackheaded fíreworm), Euproctis chrysorrhoea (browntail moth), Phryganidia californica (California oakworm), Orgyia pseudotsugata (douglas fir tussock moth), Ennomos subsignarius (elm spanworm), Hyphantria

4 4 4 • «4 4 cunea (fall webworm), Archips argyrospila (fřuittree leafroller), Dryocampa rubicunda (greenstriped maplewoml), Lymantria dispar (gypsy moth), Choristoneura pinus pinus (jack pine budworm), Homadaula anisocentra (mimosa webworm), Panolisflammea (pine butterfly), Schizura concina (redhumped Caterpillar), Sibine stimulea (saddleback Caterpillar), Disphragis guttivitta (saddle prominent Caterpillar), Paleacrita vernata, Alsophila pometria (spring and fall cankerworm), Choristoneura spp. (spruce budworm), Malacosoma spp. (tent Caterpillar), Argyrotaenia citrana (tortrix) a Orgyia vetusta (western tussock moth). Podobně, traviny jsou často napadány škůdci, jako jsou Pseudaletia unipuncía, Parapediasia teterrella a Herpetogramma phaeopteralis (tropical sod webworm).

o τιTabulka 1

Taxonomie hmyzích škůdců rodu Coleoptera podle druhů

ί.

B

O

i.

»3

B o

>M ce '3.

co

B >u

B

O a

B

9i >o

B

CS es

B •es >kss .i.

g co

5S i?

a co

Q •r*.

5F t>€ ^3 β

s t>0

B >u

			<L>
<D Ctí TÚ • vH	<u ctí tú 4- ΖΛ	> o Tú <u	ctí TÚ '3 rO
B <U a	cd 2 u<	'SP >N	s Ctí 3-1
3	<X>	o	CD
O	Q	44	U

>

>Š

ΙΛ <u ctí <2

L2 o

•c

O ctí s

£

O

CD

CO ss

P.

(Λ δ

£

Ci, o

δ a

a.

5Γ o

<D ccS

C a

ω _3

Ph <zj f

-r »

§>

«3 r

<5 δ

a>

bo

I §eg

S bo

R

R sSž

Co

3S <5

O

Q <u ctí '2 o

•c a

Co !

£

Chrysomelinae Chrysomelini Chrysomela C. tremula, Chrysomela

Q	4-» • í“H
Ctí	>
TJ	O	'a?
	44	ctí
O	g	.s
2		tZ>
S	2 TÚ	e
	p ctí	ctí
43	p	2
ω		O

CM tJ*8

TS

O o

>u >«

C3 fi ββ ¢3

Timarchini Timarcha Timarcha sp.

(Z) §

R á

g o

R eu

S

R

OJ

R <2 δ

R c3

R 'f-Μ δ

<2 •t** o

►S a o R o

R	I·»»
S	§	δ
	s	-R
r O		£

ctf ,s

O <22 o

‘C

Q c

»

O

Já

O oj c

<g

O

O š

S§ &<

R *8

O <2 £

ca

O, >3 <2 šš <2

R <22

R

R <2

R

Q &

S υ

R

a.

<22 ,02

RS

R

R δ

r~.

>

neklasifikováno Lachnaia Lachnaia sp.

I

CO £

s tO

R

1O •Ne &

tO

O

k.

Λ S	X §	8 s		§ x
b Ό

to

S

O o

o

-s bo

X! to S

3Ne

X

k.

R to »

X o

•Ne

J cx co to

S

-R x

Ss, o

•2 x

k.

<3

-R <3

CX co to

S •Ne

-o

Co •Ne

Co

K &

SX

Jr

N*«i

δ) d

Ό

O

i.

š §

co

S δ

O §

R to co £

ns:

ς>

£ o

		<>3 £
Co	Co	§
so S2, K.	-2	£p <3
S- 2Γ •Ne 0	e

0-3 β

O

J.

etí e

a s

O ctf cu §

£

-O o

£

PX a

>u a

>«

Ό stí

S ^kťS >k.

eí .>* c*« e

Chrysomelidae tu ctí .S ’3 o

Uh

O <D ctf

Γ2 *S o

k,

O >

o o

ítí oa

O a

<u ctí a

Hylobiinae Hypera H. brunneipennis, H.

poslica, H. punclala

Infrařád nadčeleď čeleď podčeleď skupina rodů rod druh tenui-punctatus. H. transversus,

H 9 · · 9 1 9 9

111 1111 9 111

1191 19 1 11 1

O

1	.<3
	g

	0^

Tenebrio T. molitor (p. moučný), (potemník) T. obscurus

1^•sf °a •o o

Λ a

• RR a

s cn

Ό aj >0

O

O a

e <u >u

JU >u a

es a

Ό >b es .!»

Tentyria T. schaumi &í ··»·«» u

r*» ší <5 o

<5 •N* &

s	B-h
as	_Λ
to í	Έ >S • tH	to R ►3» 7s
CJ	Ό	R
E<	ctí 32	δ			ct
	tZl	E-5			co
i $>	d a	•f*r R	Co a	Co	Co ^3
S 0	R δ		O S
	15	<a ta	«	ik.	42 U
3	&		Nj	N	O

<0 £

j <s š

ΐ i

co £

Λ) •**«4

I co £

a o

<3 r

r &

R <o as

R as s

<5 o

-r

N £

cj

O ctí <υ

-o o

w ctí a

<2 •c <U ctí tí to as i

CO

5S §

Cl to as §

o a

<1

B

I =§

R

-R εμ o

ctí .S '2 o

o

O o

>

-ctí o

'ctí

Co ς>

i

O ctí .s oŽ ctí

C

Q

		O
	/—s	ctí
1>	\-»
ctí	’>	*s
	Q	ctí
’2 ctí 0	>O -ctí JC	-§ ctí
J-J	O	0
	Í-H	CZI

>

o a

a o

^3 >

ctí <2 ’5 ctí ctí

O

CZ)

Geotrupinae Geotrupes G. stercorosus

	•f-4	s:	<3 •fl»
-2Ž	í§	£ Λ>	h St	j

co

Rutelinae Popillia P. japonica (Japanese beetle)

Nomenklatura známých δ-endotoxinů B. THURINGIENSIS

Tabulka 2 obsahuje výpis původní a v současné době používané nomenklatury známých δ -endotoxinů. Je zde také uvedeno přístupové číslo pro sekvencované polypeptidy a polynukleotidy.

Tabulka 2

Nomenklatura známých δ-endotoxinů B. THURINGIENSIS^a

Nový	Starý	Přístupové číslo GenBank
CrylAal	CryIA(a)	Ml 1250
CrylAa2	CryIA(a)	M10917
CrylAa3	CrylA(a)	D00348
CrylAa4	CrylA(a)	X13535
CrylAa5	CrylA(a)	D175182
Cryl Aa6	CryIA(a)	U43605
CrylAa7		AF081790
CrylAa8		126149
CrylAa9		AB026261
CrylAbl	CryIA(b)	M13898
CrylAb2	CryIA(b)	M12661
CrylAb3	CryIA(b)	M15271
CrylAb4	CryIA(b)	D00117
CrylAb5	CryIA(b)	X04698
CrylAbó	CryIA(b)	M37263
CrylAb7	CryIA(b)	X13233
CrylAb8	CryIA(b)	Ml 6463
CrylAb9	CryIA(b)	X54939
Cryl Ab 10	CryIA(b)	A29125
CrylAbl 1		112419
CrylAbl2		AF057670
CrylAcl	CryIA(c)	Ml 1068
CrylAc2	CryIA(c)	M35524

CrylAc3	CryIA(c)	X54159
CrylAc4	CrylA(c)	M73249
CrylAc5	CryIA(c)	M73248
CrylAcó	CrylA(c)	U43606
CrylAc7	CryIA(c)	U87793
CrylAc8	CryIA(c)	U87397
CrylAc9	CryIA(c)	U89872
CrylAclO	CryIA(c)	AJ002514
CrylAcll		AJ130970
Cryl Acl2		112418
CrylAdl	CryIA(d)	M73250
CrylAd2		A27531
CrylAel	CryIA(e)	M65252
CrylAfl		U82003
CrylAgl		AF081248
CrylBal	CrylB	X06711
CrylBa2		X95704
CrylBbl	ET5	L32020
CrylBcl	Crylb(c)	Z46442
CrylBdl	CryEI	U70726
CrylCal	CrylC	X07518
CrylCa2	CrylC	X13620
CrylCa3	CrylC	M73251
CrylCa4	CrylC	A27642
CrylCa5	CrylC	X96682
CrylCaó	CrylC	X96683
CrylCa7	CrylC	X96684
CrylCbl	CryIC(b)	M97880
CrylDal	CrylD	X54160
CrylDa2		176415
CrylDbl	PrtB	Z22511
CrylEal	CrylE	X53985

·· ·» » ·· ·· • · · ·· · · · · ··· · · · · · ♦ ····* · · · · · «· ··· · · ·<···

CrylEa2	CrylE	X56144
CrylEa3	CrylE	M73252
CrylEa4		U94323
CrylEa5		A15535
CrylEbl	CryIE(b)	M73253
CrylFal	CrylF	M63897
CrylFa2	CrylF	M63897
CrylFbl	PrtD	Z22512
CrylFb2		Z22512
CrylFb3		AF062350
CrylFb4		173895
CrylGal	PrtA	Z22510
CrylGa2	CrylM	Y09326
CrylGbl	CryH2	U70725
CrylHal	PrtC	Z22513
CrylHbl		U35780
Cryllal	CryV	X62821
Crylla2	CryV	M98544
Crylla3	CryV	L36338
Crylla4	CryV	L49391
Crylla5	CryV	Y08920
Cryllaó		AF076953
Cryllbl	CryV	U07642
Cryllcl		AF056933
CrylJal	ET4	L32019
CrylJbl	ET1	U31527
CrylJcl		AF056933
CrylKal		U28801
Cry2Aal	CrylIA	M31738
Cry2Aa2	CrylIA	M23723
Cry2Aa3		D86084
Cry2Aa4		AF047038

# 4*	4 ·	*		• 4	4 a
• · «	• 4	* 4	*	•	« 4
• »»·	• *	»	4	4	4
• 44 4« 4 44	« * 44	• * 44	•	• » 4	• 4444

Cry2Aa5	AJ132464
Cry2Aa6		AJ1324635
Cry2Aa7		AJ132463
Cry2Abl	CrylIB	M23724
Cry2Ab2	CrylIB	X55416
Cry2Acl	CrylIC	X57252
Cry3Aal	CrylIIA	M22472
Cry3Aa2	CrylIIA	J02978
Cry3Aa3	CrylIIA	Y00420
Cry3Aa4	CrylIIA	M30503
Cry3Aa5	CrylIIA	M37207
Cry3Aa6	CrylIIA	U10985
Cry3Aa7		AJ237900
Cry3Bal	CrylIIB	X17123
Cry3Ba2	CrylIIB	A07234
Cry3Bbl	CryIlIB2	M89794
Cry3Bb2	CryIIIC(b)	U31633
Cry3Bb3		115475
Cry3Cal	CrylIID	X59797
Cry4Aal	CrylVA	Y00423
Cry4Aa2	CrylVA	D00248
Cry4Bal	CrylVB	X07423
Cry4Ba2	CrylVB	X07082
Cry4Ba3	CrylVB	M20242
Cry4Ba4	CrylVB	D00247
CrySAal	CryVA(a)	L07025
Cry5Abl	CryVA(b)	L07026
Cry5Acl		134543
Cry5Bal	PS86Q3	U19725
CryóAal	CryVIA	L07022
CryóBal	CryVIB	L07024
Cry7Aal	CrylIIC	M64478

* » · · · 9 · * * · • · « · · · · ····

Cry7Abl	CrylIICb	U04367
Cry7Ab2		U04368
Cry8Aal	CrylIIE	U04364
Cry8Bal		U04365
Cry8Cal		U04366
Cry8Bal	CrylIIG	U04365
Cry8Cal	CrylIIF	U04366
Cry9Aal	CrylG	X5812O
Cry9Aa2	CrylG	X58534
Cry9Bal	CrylX	X75019
Cry9Cal	CrylH	Z37527
Cry9Dal	N141	D85560
Cry9Da2		AF042733
Cry9Eal
CrylOAal	CrylVC	M12662
CrylOAa2		E00614
CryllAal	CryIVD	M31737
CryllAa2	CryIVD	M22860
CryllBal	Jeg8O	X86902
CryllBbl		AF017416
Cryl2Aal	CryVB	L07027
Cryl3Aal	CryVC	L07023
Cryl4Aal	CryVD	U13955
Cryl5Aal	34Kda	M76442
CrylóAal	cbm71	X94146
Cryl7Aal	cbm71	X99478
Cryl8Aal	CryBPl	X99049
Cryl9Aal	Jeg65	Y08920
Cry20Aal		U82518
Cry21Aal		132932
Cry22Aal		134547
Cry23Aal		AF03048

Cry24Aal	U88188
Cry25Aal		U88189
Cry26Aal		AF122897
Cry27Aal		AB023293
Cry28Aal		AF132928
CytlAal	CytA	X03182
CytlAa2	CytA	X04338
CytlAa3	CytA	YOO135
CytlAa4	CytA	M35968
CytlAbl	CytM	X98793
CytlBal		U37196
Cyt2Aal	CytB	Z14147
Cyt2Bal	CytB	U52043
Cyt2Ba2	CytB	AF020789
Cyt2Ba3	CytB	AF022884
Cyt2Ba4	CytB	AF022885
Cyt2Ba5	CytB	AF022886
Cyt2Ba6		AF034926
Cyt2Bbl		U82519
Cyt2Bbl		U82519

^a Převzato z http://epunix.biols.susx.ac.uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/toxins.html (z 27.dubna 1999)

Sondy a primery

Z dalšího hlediska, informace sekvence DNA poskytovaná vynálezem umožňuje výrobu poměrně krátkých DNA (nebo RNA) sekvencí, které mají schopnost specificky hybridizovat na genové sekvence vybraných polynukleotidů zde popsaných. Z tohoto hlediska jsou sondy nukleových kyselin vhodné délky vyráběny na základě uvažované vybrané protein kódující genové sekvence, jako je například zde popsaná sekvence. Schopnost takových molekul DNA a sond nukleových kyselin specificky hybridizovat na krystalový protein kódující genovou sekvenci je činí zvláště výhodnými pro mnoho příkladů provedení. Zejména mohou být sondy použity v mnoha testech na určení přítomnosti komplementárních sekvencí v daném vzorku.

• · · • · 1 • · · · • · · * « • · · ·♦ «· » · · · · · · » · · · · • · · · · ♦ · ····

V určitých příkladech provedení je výhodné použít oligonukleotidové primery. Sekvence takových primerů je označena s použitím polynukleotidu podle vynálezu pro použití při určování, amplifikaci nebo mutování definovaných úseků genu pro krystalový protein z B. thuringiensis s využitím PCR™ technologie. Úseky příbuzných genů pro krystalové proteiny z jiných kmenů mohou být také amplifikovány pomocí PCR™ s použitím těchto primerů.

Kvůli určitým výhodám podle vynálezu obsahuje sekvence nukleové kyseliny používaná pro hybridizační studie nebo testy s výhodou sekvence, které jsou komplementární s alespoň asi 23 až asi 40 nebo podobně dlouhými nukleotidovými sekvencemi krystalový protein kódující sekvence, jako je například ta zde uvedená. Velikost alespoň asi 14 neo 15 nebo podobně nukleotidů zajišťuje, že úsek bude mít dostatečnou délku pro tvorbu duplexní molekuly, která je jak stabilní tak selektivní. Nicméně molekuly, mající komplementární sekvence delší než asi 23 nebo podobně bází, jsou obecně výhodnější kvůli zvýšení stability a selektivity hybridu a tedy zvýšení kvality a stupně získaných specifických hybridních molekul. Obecně je výhodné navrhovat molekuly nukleových kyselin mající s genem komplementární sekvence asi 14 až asi 20 nukleotidů nebo dokonce delší, pokud je to zapotřebí. Takové fragmenty mohou být přímo vyrobeny pomocí, například, přímé syntézy fragmentu chemickou cestou, aplikací technologie reprodukce nukleových kyselin, jako je například PCR™ technologie podle US patentů 4683195, a 4683202, které jsou zde v tomto pořadí zahrnuty tímto odkazem nebo pomocí vystřihnutí vybraných fragmentů DNA z rekombinantních plazmidů obsahuj cích vhodné inzerty a vhodná restrikční místa.

Expresní vektory

Ve vynálezu se předpokládá, že polynukleotidy podle vynálezu jsou obsaženy v jednom nebo více expresních vektorech. V jednom příkladu provedení obsahuje tedy expresní vektor úsek nukleové kyseliny obsahující gen, který kóduje krystalový protein funkčně spojený s promotorem, který exprimuje gen. Nadto může být kódující oblast funkčně spojena s transkripčně-terminační oblastí, kde promotor řídí transkripci kódující oblasti a transkripčně-terminační oblast zastavuje transkripci v nějakém bodě 3' kódující oblasti.

Zde používaný pojem „funkčně spojený“ znamená, že promotor je spojen škodující oblastí takovým způsobem, že je transkripce této kódující oblasti řízena a usměrňována tímto promotorem. Prostředky pro funkční spojení promotoru s kódující oblastí jsou dobře známé v daném oboru.

Ve výhodném příkladu provedení probíhá rekombinantní exprese molekul DNA kódujících krystalové proteiny podle vynálezu s výhodou v hostitelské buňce Bacillus. Hostitelské buňky

s výhodou zahrnují: B. thuringiensis, B. megaterium, B. subtilis a příbuzné bacily, přičemž velmi výhodné je použití B. thuringiensis hostitelských buňěk. Promotory funkční v bakteriích jsou v oboru dobře známé. Typické promotory pro krystalové proteiny tvořené v buňkách Bacihus zahrnují s výhodou jakékoli ze známých promotorů genů pro krystalové proteiny včetně promotorů cry genů samotných. Nebo mohou být vyrobeny mutagenizované nebo rekombinantní promotory uměle a použity k řízeni exprese nových úseků genů podle vynálezu.

V jiném příkadu provedení je rekombinantní exprese molekul DNA kódujících krystalové proteiny podle vynálezu prováděna s pomocí transformované Gram-negativní bakterie, jako je například E.coli nebo Pseudomonas spp. hostitelská buňka. Promotory účinné v expresi vysoké úrovně cílových polypeptidů v A’. coli a jiných Gram-negativních hostitelských buňkách jsou také dobře známé v daném oboru.

Tam, kde má být použit expresní vektor podle vynálezu pro transformaci rostlin, je vybrán promotor, který má schopnost řídit expresi v rostlinách. Promotory funkční v rostlinách jsou vdaném oboru také dobře známé. Pro expresi polypeptidu v rostlinách jsou vhodné promotory, které jsou inducibilní, virové, syntetické, konstitutivní jak bylo publikováno (Poszkowski a kol., 1989; Oděli a kol., 11985) a časově omezené, prostorově omezené a prostorově i časově omezené (Chau a kol., 1989). Promotor je také vybírán podle schopnosti zaměřit transkripční aktivitu transformovaných rostlinných buněk nebo transgenních rostlin na kódující oblast. Strukturní geny mohou být řízeny různými promotory v rostlinných tkáních. Promotory mohou být blízce konstitutivní, jako je například CaMV 35S promotor nebo tkáňově specifické nebo vývojově specifické promotory působící v jednoděložných nebo dvouděložných rostlinách.

Je-li promotor blízce konstitutivní, jako například CaMV 35S, vzrůst exprese polypeptidu je pozorovatelný v různých tkáních transformovaných rostlin (například kalus, listy, semena a kořeny). Nebo mohou být účinky transformace zaměřeny na určité rostlinné tkáně s použitím rostlinných intergrujících vektorů, které obsahují promotor specifický pro danou tkáň.

Typickým tkáňově specifickým promotorem je lectin promotor, který je specifický pro tkáň semen. Lectin protein v sojových bobech je kódován jedním genem (Lei), který je exprimován pouze v průběhu zrání semene a zabírá asi 2 % až asi 5 % celkové mRNA semene. Lectinový gen a pro semena specifický promotor byly přesně charakterizovány a použity pro řízení exprese specifické pro semena v transgenních tabákových rostlinách (Vodkin a kol., 1983; Lindstrom a kol., 1990.)

Expresní vektor obsahující kódující oblast, která kóduje polypeptid, který je předmětem zájmu je konstruován tak, aby byl řízen lectinovým promotorem a je vložen do rostliny s použitím, například protoplastové transformační metody (Dhir a kol., 1991a). Exprese polypeptidu je specificky zaměřena na semena transgenní rostliny.

Transgenní rostlina podle vynálezu vzniklá z rostlinné buňky transformované tkáňově specifickým promotorem může být křížena s kmenou transgenní rostlinou, která vznikla z rostlinné buňky transformované jiným tkáňově specifickým promotorem, přičemž vzniká hybridní transgenní rostlina, která vykazuje účinky transformace ve více než jedné určité tkáni.

Typické tkáňově specifické promotory jsou: kukuřičná sacharózová syntáza 1 (Yang a kol., 1990), kukuřičná alkoholová dehydrogenáza 1 (Vogel a kol., 1989), kukuřičný snadno vytěžitelný komplex (Simpson, 1986), kukuřičný protein tepelného šoku (Oděli a kol., 1985), malá podjednotka RuBP hrachové karboxylázy (Poulsen a kol., 1986; Cashmore a kol., 1983), Ti plazmid mannopin syntáza (Langridge a kol., 1989), Ti plazmid nopalin syntáza (Langridge a kol., 1989), chalcon izomeráza petúnie (Van Tunen a kol., 1988), fazolový glycinem bohatý protein 1 (Keller a kol,. 1989), CaMV 35S transkript (Oděli a kol., 1985) a bramborový patatin (Wenzler a kol., 1989). Promotory jsou s výhodou virus květákové mozaiky (CaMV 35S) promotor a S-E9 malá podjednotka RuBP karboxylázy promotor.

Výběr expresního vektoru a výběr promotoru a kódující oblasti polypeptidu, ke kterým je funkčně připojen, závisí přímo na požadovaných funkčních vlastnostech, například umístění a načasování proteinové exprese a hostitelské buňce, která má být transformována. To jsou dobře známá podstatná omezení v oboru konstruování rekombinantních DNA molekul. Vektor vhodný pro použití ve vynálezu je však schopen řídit expresi oblasti kódující polypeptid, na kterou je funkčně připojen.

Typické vektory vhodné pro expresi genů ve vyšších rostlinách jsou dobře známé v daném oboru a zahrnují vektory odvozené od nádory způsobujícího (Ti) plazmidu Agrobacterium tumefaciens, který je popsán (Rogers a kol., 1987). Je však známo několik dalších rostlinných integračních vektorových systémů, které fungují v rostlinách včetně pCaMVCN přesun řídícího vectoru, který je popsán (Fromm a kol., 1985). pCaMVCN (dostupný od Pharmacia, Piscataway, NJ) obsahuje promotor viru květákové mozaiky CaMV 35S.

Ve výhodných příkladech provedení obsahuje vektor používaný pro expresi polypeptidu selekční signální znak, který je účinný v rostlinné buňce, s výhodou signální znak selekční rezistence kjedu. Jeden signální znak rezistence vůči jedu je s výhodou gen, jehož exprese

9 9999 způsobuje rezistenci ke kanamicinu; tj. chimérický gen obsahující promotor nopalin synázy, Tn5 neomycin fosfotmsferáza II (nptll) a nopalin syntáza 3' oblast nepodléhající translaci, která je popsána (Rogers a kol., 1988).

RNA polymeráza transkribuje kódující DNA sekvence od místa, kde se vyskytuje polyadenylace. Typické je, že DNA sekvence umístěné několik set párů bází po směru polyadenylaěního místa slouží k terminaci transkripce. Tyto DNA sekvence jsou zde označovány jako transkripčně-terminační oblasti. Tyto oblasti jsou nutné pro dobrý průběh polyadenulace transkrybované messenger RNA (mRNA).

Prostředky pro výrobu expresních vektorů jsou v daném oboru dobře známé. Exprese (transformačních vektorů) používaná pro transformaci rostlin a postupy výroby takových vektorů jsou popsány v US patentech č. 4971908, 4940835, 4769061 a 4757011, které jsou zde zahrnuty tímto odkazem. Tyto vektory mohou být modifikovány tak, aby obsahovaly kódující sekvenci podle vynálezu.

Bylo vyvinuto mnoho metod pro funkční vložení úseku DNA do vektoru pomocí komplementárního kohezního mezníku nebo zarovnaných konců. K úseku DNA mohou být například přidány komplementární homopolymerní úseky, aby byl inzertován do vektorové DNA. Vektor a úsek DNA jsou pak spojeny vodíkovými vazbami mezi komplementárními homopolymerními konci a tvoří rekombinantní molekuly DNA.

Kódující oblast, která kóduje polypeptid mající schopnost poskytnout insekticidní účinek buňce, je s výhodou gen kódující B. thuringiensis krystalový protein. Ve výhodných příkladech provedení má takový polypeptid aminokyselinovou zbytkovou sekvenci jedné ze zde popsaných sekvencí nebo jejich funkční ekvivalent. Podle těchto příkladů provedení vynálezu je kódující oblast také s výhodou taková, která obsahuje sekvenci DNA takové sekvence.

Názvosloví nových proteinů

Ve vynálezu je uvedeno vlastní pracovní označení nových proteinů podle vynálezu. Podobně byly označeny geny nových sekvencí nukleové kyseliny, které kódují tyto polypeptidy. Formální označení genů a proteinů založené na revidovaném názvosloví krystalových proteinů endotoxinů bude označeno nomenklaturní komisí B. thuringiensis a bude tvořit systematickou klasifikaci B. thuringiensis krystalových proteinů. Předpokládá se, že ve vynálezu uvedené pracovní názvosloví bude nahrazeno oficiálními nomenklaturními označeními pro tyto sekvence.

• ·« · · · 9 9 9 9

9 9 9 99 9 9 9 9

9999 9· 9 9 9 9

Transformované hostitelské buňky a transgenní rostliny

Dalším aspektem vynálezu jsou způsoby a kompozice pro transformaci bakterií, kvasinek a rostlinných buněk nebo celých rostlin jedním nebo více expresními vektory, které obsahují úsek genu kódující krystalový protein. Transgenní bakterie, kvasineky a rostlinné buňky nebo celé rostliny získané takovým transformačním procesem nebo potomstvo a semena takových transenních rostlin jsou dalšími příklady provedení vynálezu.

Prostředky pro transformaci bakterií a kvasinek jsou v daném oboru dobře známé. Obvyklé prostředky transformace jsou podobné těm, které jsou v oboru dobře známé pro transformaci jiných bakterií nebo kvasinek, jako je například E. coli nebo Saccharomyces cerevisiae. Způsoby pro transformaci DNA rostlinných buněk zahrnují transformaci rostlin zprostředkovanou Agrobacterium, transformaci protoplastů, genový přenos do pylu, injekce do reprodukčních orgánů, injekce do nezralých imbrií a ostřelování částicemi. Každý z těchto postupů má rozdílné výhody a nevýhody. Jeden určitý postup vložení genů do určitého rostlinného kmenu nemusí být nezbytně nejúčinější pro jiný rostlinný kmen, aleje známo, které postupy jsou vhodné pro konkrétní rostlinný kmen.

Existuje mnoho metod, jak vložit tansformované úseky DNA do buněk, ale ne všechny jsou vhodné pro vložení DNA do rostlinných buněk. Vhodné postupy zahrnují praktický jakýkoli postup, kterým může být DNA vložena do buňky, jako je například infikování buněk bakterií Agrobacterium, přímé vložení DNA, jako je například PEG- zprostředkovaná transformace protoplastů (Omirulleh a kol., 1993), vysušením/inhibicí zprostředkovaný přenos DNA elektroporace, míchání s vlákny karbidu křemičitého, ostřelování urychlenými částicemi, které jsou pokryty DNA a podobně. V určitých příkladech provedení jsou výhodné metody ostřelování ostřelování urychlenými částicemi, například ostřelování mikroprojektilem a podobně.

Technologie vložení DNA do buněk je dobře známa odborníkům v oboru. Byly popsány čtyři hlavní postupy vložení genu do buněk: (1) chemické postupy (Graham a van der Eb, 1973; Zatloukal a kol., 1992); (2) fyzikální postupy, jako například mikroinjekce (Capecchi, 1980), elektroporace (Wong a Neumann, 1982; Fromm a kol., 1985; U. S. patent č. 5,384,253) a genová pistole (Johnston a Tang, 1994; Fynan a kol., 1993); (3) virové vektory (Clapp, 1993; Lu a kol., 1993; Eglitis a Anderson, 1988a; Eglitis a kol., 1988); a (4) receptorem zprostředkované mechanizmy (Curiel a kol., 1991; 1992; Wagner a kol., 1992).

· ♦ ··

Elektroporace

Aplikace krátkých vysokonapěťových electrických pulzů na různé živočišné a roslinné buňky vede k tvorbě pórů o velikosti nanometrů v plazmatické membráně. DNA je vložena přímo do buněčné cytoplazmy a uď těmito póry nebo jako následek přerozdělení membránových komponent, které provází uzavírání pórů. Elektroporace může být velmi účinná a může být použita jak pro přechodnou expresi genových klonů tak pro ustanovení buněčných linií, které nesou integrované kopie požadovaného genu. Elektroporace je na rozdíl od kalcium fosfátem zprostředkovaného přenosu a fuze protoplastů často dává růst buněčným liniím, které nesou jeden nebo nanejvýš několik málo integrovaných kopií cizorodé DNA.

Vložení DNA pomocí elektroporace je dobře známo odborníkům v dané oblasti. Tato metoda využívá určité enzymy, které způsobují degradaci buněčné stěny, jako jsou například pektin degradující enzymy k tomu, aby se cílové recipientní buňky staly vnímavější k transformaci pomocí elektroporace než jsou buňky, na které enzymy nepůsobily. Vnímavost buněk k transformaci může být také zvýšena mechanickým porušením. Pro účinnou transformaci elektroporací mohou být použity buď drobivé tkáně, jako například suspenze kultur buněk nebo embryogenický kalus nebo mohou být přímo trasformována nezralá embrya nebo jiné organizované tkáně. Stěna vybraných buněk může být narušena pektin degradujícími enzymy (pektolyázami) nebo mechanicky poškozena řízeným způsobem. Takové buňky jsou pak vnímavé k přenosu DNA elektroporací, která může být provedena v tomto stavu a transformované buňky pak určeny vhodným selekčním nebo prověřovacím protokolem, který závisí na podstatě nově vložené DNA.

Ostřelování mikroprojektilem

Další výhodou metodou pro vložení úseků transformované DNA do rostlinných buněk je ostřelování mikroprojektilem. Tato metoda využívá částic, které jsou pokryty nukleovými kyselinami, a které se dostávají do buňky spirálovým vstřelením. Typické částice jsou takové, které obsahují wolfram, zlato, platinu a podobně.

Kromě toho, že jde o účinný prostředek, jak opakovaně trvale transformovat jednoděložné rostliny, je výhodou ostřelování mikroprojektilem to, že nevyžaduje ani izolaci protoplastů (Cristou a kol., 1988) ani vnímavost k infekci bakterií Agrobacterium. Ilustrativním příkladem provedení metody pro vložení DNA do kukuřičných buněk urychlenými částicemi je Biolistics Particle Delivery Systém, který může být použit k protlačení částic pokrytých DNA nebo buněk přes síto, jako je například síto z nerezoceli nebo Nytexu na povrch filtru, který je pokryt kukuřičnými buňkami kultivovanými v suspenzi. Síto disperguje částice, takže nejsou přeneseny do recipientních buněk ve velkých agregátech. Síto vložené mezi projektilovou aparaturu a buňky, které mají být vystaveny ostřelování zmenšuje velikost projektilových agregátů a může přispět vyšší frekvenci transformace snížením poškození, které způsobené na recipientních buňkách projektily, které jsou příliš velké.

Buňky v suspenzi pro ostřelování jsou s výhodou koncentrovány na filtrech nebo pevném kultivačním médiu. Případně mohou být na pevném médiu umístěna nezralá imbrya nebo jiné cílové buňky. Buňky, které mají být ostřelovány jsou umístěny ve vhodné vzdálenosti pod makroprojektilovou zastavující deskou. Pokud je to zapotřebí, je mezi urychlovacím zařízením a ostřelovanými buňkami umístěno jedno nebo více sít. Při použití zde uvedených postupů je možno získat až 1000 nebo více ohnisek nebo buněk přechodně exprimujících markrový gen. Množství buněk v ohnisku, které exprimují exogenní genový produkt 48 hodin po ostřelování často kolísá mezi 1 až 10 a průměrně je to asi 1 až 3.

Při transformaci ostřelováním mohou být optimalizovány kultivační podmínky před ostřelováním a parametry ostřelování pro získání maximálního množství trvalých transformantů. V této technologii jsou důležité jak fyzikální, tak biologické parametry. Fyzikální faktory jsou ty, které zahrnují manipulaci s DNA/mikroprojektil částicemi nebo ty, které ovlivňují let a rychlost buď makro- nebo mikroprojektilů. Biologické faktory zahrnují všechny kroky manipulace s buňkami před a okamžitě po ostřelování, osmotické vyrovnání cílových buněk, které má pomoci zmírnit šok způsobený ostřelováním a také podstata transformující DNA, jako je linearizovaná DNA nebo intaktní supersvinuté plazmidy. Předpokládá se, že manipulace před ostřelováním jsou obzvláště důležité pro úspěšnou transformaci nezralých embryí.

Při jednotlivých menších výzkumech je tedy možné upravit různé parametry ostřelování tak, aby byly podmínky optimální. Mohou být upraveny například fyzikální parametry jako například vzdálenost mezer, vzdálenost letu, vzdálenost tkáně a tlak hélia. Mohou být také minimalizovány šokové redukční faktory (TRF) modifikací podmínek, které ovlivňují fyziologický stav recipientních buněk, a které tedy mohou ovlivnit účinnost transformace a integrace. Pro optimální transformaci může být upraven například osmotický stav, tkáňová hybridizace a stupeň subkultury nebo buněčný cyklus recipientních buněk. Odborníkům v dané oblasti budou také známy další úpravy v souladu s vynálezem.

1« · · · · • 4 · · · · · • · · · ·

Přenos zprostředkovaný Agrobacterium

Přenos zprostředkovaný Agrobacterium je široce aplikovatelný systém pro vkládání genů do rostlinných buněk, protože DNA může být vložena do celé rostlinné tkáně a není tedy zapotřebí regenerovat intaktní rostlinu z protoplastů. Použití Agrobacterium zprostředkovaných rostlinných integračních vektorů pro vložení DNA do rostlinných buněk je v oboru velmi dobře známé. Viz, například, metody popsané v (Fraley a kol., 1985; Rogers a kol., 1987). Kromě toho je integrace TiDNA poměrně přesný proces, jehož výsledkem je několik přemístění. Oblast DNA která má být transformována, je určena hraniční sekvencí a vkládaná DNA je obvykle vložena do rostlinného genomu jak bylo popsáno (Spielmann a kol., 1986; Jorgensen a kol., 1987).

Moderní Agrobacterium transformační vektory jsou schopné replikace v E. coli i v Agrobacterium, což umožňuje vhodné manipulace jak bylo popsáno (Klee a kol., 1985). Kromě toho současné technologické postupy, týkající se vektorů pro genový transfer zprostředkovaný Agrobacterium, zlepšily uspořádání genů a restrikčních míst ve vektorech, čímž byla umožněna snadnější konstrukce vektorů schopných exprimovat různé geny kódující polypeptidy. Popsané vektory (Rogers a kol., 1987) obsahují vhodné oblasti multi-spojovníků spojené s promotorem a polyadenylační místa pro přímou expresi vložených genů kódujících polypeptidy a jsou vhodné pro současné výzkumy. Mimoto může být pro transformaci použito Agrobacterium obsahující jak „armed“, tak „disarmed“ (neobsahuje hormonální geny) Ti geny. V těch rostlinných druzích, kde je transformace zprostředkovaná Agrobacterium účinná, se jedná o metodu výběru kvůli snadné a definované podstatě genového přenosu.

Agrobacterium zprostředkovaná transformace listových disků a jiných tkání, jako jsou například dělohy a hypokotyly, se zdá být omezená na rostliny, které Agrobacterium přirozeně infikuje. Agrobacterium zprostředkovaná transformace je účinnější u dvouděložných rostlin. Zdá se, že málo jednoděložných rostlin je přirozenými hostiteli Agrobacterium, ačkoli transgenní rostliny byly vyrobeny u chřestu s použitím Agrobacterium vektorů, jak bylo popsáno (Bytebier a kol., 1987). Komerčně důležitá obilná zrna, jako je například rýže, kukuřice a pšenice musí být většinou transformována pomocí alternativních postupů. Avšak, jak bylo uvedeno dříve, u chřestu může být dosaženo transformace i pomocí Agrobacterium. (viz například, Bytebier a kol., 1987).

Transgenní rostlina vytvořená pomocí Agrobacterium transformačních metod obvykle obsahuje jeden gen na jednom chromozomu. Takové transgenní rostliny mohou být označeny jako heterozygotní pro daný gen. Ovšem protože použití slova „heterozygotní“ obvykle předpokládá přítomnost komplementárního genu ve stejném lokusu na kmeném párovém chromozomu a zde žádný takový komplementární gen v rostlině obsahující jeden vložený gen není, je pravděpodobně přesnější označit takovou rostlinu termínem nezávislý segregant, protože přidaný, exogenní gen segreguje nezávisle během mitózy a meiózy.

Transgenní rostliny jsou s výhodou ty, které jsou homozygotní pro přidaný strukturní gen; to je transgenní rostliny, které obsahují dva přidané geny, oba na stejném lokusu obou homologních chromozomů. Homozygotní transgenní rostliny mohou být získány sexuálním rozmnožováním (samosprášení) nezávislých segregantů transgenních rostlin, které obsahují jeden přidaný gen, klíčením některých produkovaných semen a analýzou vzniklých rostlin na rozšíření karboxylázové aktivity vzhledem ke kontrole (přirozené, netransformované rostliny) nebo nezávislých segregantů transgenní rostliny.

Mohou být, samozřejmě, také kříženy dvě různé transgenní rostliny, čímž vzniká potomstvo, které obsahuje dva nezávisle segregující přidané exogenní geny. Samosprášenim vhodných potomků mohou vzniknout rostliny, které jsou homozygotní pro oba přidané exogenní geny, které kódují žádaný polypeptid. Zpětné křížení rodičovské rostliny a křížení s netransgenní rostlinou je také možné.

Jiné transformační metody.

Transformace rostlinných protoplastů může být dosaženo s použitím metod založených na přijímání fosfátu vápenatého, ošetření polyetylenglykolem, elektroporaci a kombinaci těchto metod (viz například Potrykus a kol., 1985; Lorz a kol., 1985; Fromm a kol., 1986; Uchimiya a kol., 1986; Callis a kol., 1987; Marcotte a kol., 1988).

Aplikace těchto systémů na různé rostlinné kmeny závisí na schopnosti konkrétního rostlinného kmenu regenerovat z protoplastů. Ilustrativní metody pro regeneraci obilnin z protoplastů jsou popsány (Fujimura a kol., 1985; Toriyama a kol., 1986; Yamada a kol., 1986; Abdullah a kol., 1986).

Transformace rostlinných kmenů, které nemohou úspěšně regenerovat z protoplastů, může být provedena jinými postupy vkládání DNA do intaktních buněk nebo tkání. Například regenerace obilnin z nezralých embryí nebo explantátů může být vhodné, jak je popsáno (Vasil, 1988). Kromě toho může být využita částicová pistole nebo technologie urychlených mikročástic (Vasil a kol., 1992).

S použitím posledně jmenovaných technologií je DNA přenášena přes buněčnou stěnu a do cytoplazmy na povrchu malých částic kovů, jak je popsáno (Klein a kol., 1987; Klein a kol., 1988;

McCabe a kol., 1988). Kovové částice penetrují přes několik vrstev buněk a tak umožňují transformaci buněk z tkáňových explantátů.

Genová exprese v rostlinách

Ačkoli metody výroby transgenních rostlin exprimujících bakteriální proteiny, jako například B. thuringiensis krystalické proteiny, prošly v posledních letech velkým vývojem, výsledky exprese přirozených bakteriálních genů v rostlinách často zklamou. Na rozdíl od mikrobiální genetiky, bylo zpočátku v genetice rostlin známo málo o faktorech, které mají vliv na heterologní expresi cizích genů v rostlinách. Avšak v posledních letech bylo určeno několik faktorů, které pravděpodobně odpovídají za měnící se hladiny exprese proteinů, z určité kódující sekvence. Například je nyní známo, že udržování podstatné hladiny určité mRNA v buňce je jistě rozhodující faktor. Příčin trvale nízkých množství mRNA kódující cizí proteiny je bohužel mnoho. Například syntéza celé RNA nemusí vykazovat vysokou frekvenci. To by mohlo být například způsobeno předčasným ukončením RNA během transkripce nebo neočekávanými úpravami mRNA během transkripce. Za kmené, RNA plné délky může být vytvořena v rostlinné buňce, ale poté upravována (adiční sestřih póly A) v jádře způsobem, který tvoří nefunkční mRNA. Jestliže RNA syntetáza, terminace a polyadenylace neprobíhá správně, nemůže se RNA přemístit do cytopazmy kvůli translaci. Jednoduše řečeno, jestliže mají molekuly mRNA v cytopazmě snížený poločas přežití (který závisí na jejich primární a sekundární struktuře) produkce proteinu je nedostatečná. Kromě toho je zde účinek výkonnosti translace na mRNA poločas přežití, jehož velikost je neurčitá. A dále, každá molekula RNA tvoří určitou strukturu nebo rodinu struktur, která závisí na sekvenci. Konkrétní struktura jakékoli RNA může vést k větší nebo menší stabilitě v cytoplazmě. Struktura per se pravděpodobně také podmiňuje mRNA úpravy v jádře. Bohužel je nemožné předpovídat a téměř nemožné určit strukturu jakékoli RNA (s výjimkou tRNA) in vitro nebo in vivo. Je však pravděpodobné, že podstatné změny sekvence RNA budou mít velký dopad na její sekundární strukturu. Je pravděpodobné, že struktura per se nebo určité strukturní znaky hrají také roli ve stabilitě RNA.

Aby se předešlo těmto omezením v expresi cizího genu, byly určeny některé sekvence a signály v molekulách RNA, které by mohly mít specifický účinek na stabilitu RNA. V určitých příkladech provedení je tedy požadována optimalizovaná exprese popsaných úseků nukleové kyseliny in planta. Konkrétní takový postup je proveden úpravami bakteriálního genu tak, aby se odstranily sekvence nebo motivy, které snižují expresi v transformované rostlinné buňce. Tyto

postupy konstruování kódující sekvence pro optimální expresi in planta se často nazývá „plantizing“ sekvence DN A.

Obzvláště problematické sekvence jsou ty, které jsou bohaté na A+T páry. B. thuringiensis má bohužel na A+T páry bohatý genom a tudíž musí být přirozené genové sekvence krystalových proteinů často modifikovány pro optimální expresi v rostlině. Sekvenční motiv ATTTA (nebo AUUUA jak se objevuje v RNA) byl určen jako destabilizující sekvence v mRNA savčích buněk (Shaw a Kamen, 1986). Mnoho krátce žijících molekul mRNA má A+T páry bohaté 3' translaci nepodléhající oblasti a tyto oblasti často mají ATTTA sekvenci, někdy v mnoha kopiích nebo ve formě multimerů (například ATTTATTTA...). Shaw a Kamen ukázali, že přenos 3' konce nestabilní mRNA do stabilní RNA (globin nebo VA1 ) významně snižuje poločas přežití stabilních molekul RNA. Dále ukázali, že pentamer ATTTA měl silný destabilizující účinek na stabilní informaci a že tento signál mohl uplatnit svůj účinek ať už byl lokalizován na 3' konci, nebo s kódující sekvencí. Avšak množství ATTTA sekvencí a/nebo sekvence, v jejímž kontextu se vyskytují, se také jeví důležité pro určení zda fungují jako destabilizující sekvence. Shaw a Kamen ukázali, že trimer ATTTA má mnohem menší účinek než pentamer na mRNA stabilitu a dimer nebo monomer nemají na stabilitu žádný účinek (Shaw a Kamen, 1987). Je třeba poznamenat, že multimery ATTTA, jako je například pentamer automaticky tvoří A + T bohatou oblast. Ukázalo se, že jde o cytoplazmatický účinek, nikoli jaderný. V jiných nestabilních molekulách mRNA mohou být přítomny ATTTA sekvence v pouze jedné kopii, ale často pokračují A+T bohatou oblastí. Podle informací shromážděných ze zvířecích buněk se zdá, že ATTTA je alespoň v některých kontextech důležitá sekvence pro stabilitu, ale není dosud možné určit, které výskyty ATTTA jsou destabilizujícími elementy nebo zda budou kterékoli z těchto účinků podobně pozorovány u rostlin.

Některé studie degradace mRNA v živočišných buňkách také ukazují, že degradace RNA může v některých případech začít nukleolytickým napadením A+T bohatých oblastí. Není jasné, zda se toto štěpení týká ATTTA sekvencí. Existují také příklady molekul mRNA které mají různou stabilitu v závislosti na typu buňky, ve které exprimují nebo na fázi buněčného cyklu, ve které exprimují. Například histonové mRNA molekuly jsou stabilní v průběhu syntézy DNA ale nestabilní v případě, že je syntéza DNA přerušena. Zdá se, že 3' konec některých histonových molekul mRNA ma takový účinek (Pandey a Marzluff, 1987). Nezdá se vsak, ze by byl zprostředkován ATTTA ani není jasné, co řídí různou stabilitu těcho molekul mRNA. Jiným příkladem je rozdílná stabilita IgG mRNA v B lymfocytech v průběhu zrání B buněk (Genovese a Milcarek, 1988). Všechny tyto příklady poskytují důkaz, že mRNA stabilita může být • ·« ·* · ·· ·· ·· · · · ·· · * · · • ··· · · · · ♦ · ······ ···· · ··· ··· ··· ··« ·· ·» ··· ·· ··♦· zprostředkována specifickými faktory typu buňky nebo buněčného cyklu. Kromě toho není tento typ nestability dosud spojován s určitou sekvencí. Vzhledem k těmto neurčitým informacím není možné předem určit, které molekuly RNA budou nestabilní v dané buňce. Navíc, dokonce i motiv ATTTA může mít různý účinek v závislosti na podstatě buňky, ve které je RNA obsažena. Shaw a Kamen ( 1987) uvedli, že aktivizace proteinkinázy C může blokovat degradaci zprostředkovanou ATTTA.

Adice polyadenylačního vlákna k 3' konci je obvyklá pro většinu molekul mRNA eukaryotických buněk, ať už rostlinných nebo živočišných. Současný pohled na polyA adici je takový, že se vznikající transkript prodlužuje za hotový 3' konec. V tomto transkriptu jsou obsaženy signály pro polyadenylaci a přesnou tvorbu 3' konce. Tyto úpravy na 3' konci zahrnují štěpení mRNA a adici polyA k hotovému 3' konci. Díky pátrání po konsenzuálních sekvencích blízko polyA úseku v rostlinných i živočišných molekulách mRNA bylo možno určit konsenzuální sekvence, které jsou zjevně zahrnuty v polyA adici a štěpení 3' konce. Zdá se, že pro oba procesy jsou důležité stejné konsenzuální sekvence. Tyto signály jsou obvykle variací na sekvenci AATAAA. V živočišných buňkách byly určeny některé varianty této sekvence, které jsou funkční; v rostlinných buňkách se vyskytují funkční sekvence v širokém rozsahu. (Wickens a Stephenson, 1984; Dean a kol., 1986). Protože všechny tyto konsenzuální sekvence jsou variacemi na AATAAA, jedná se o A+T bohaté sekvence. Tyto sekvence se obvykle nacházejí 15 až 20 párů bází před polyA úsekem ve zralé mRNA. Studie živočišných buněk ukazují, že tato sekvence je obsažena jak v polyA adici, tak v 3 ’ maturaci. Bodově cílené mutace v této sekvenci mohou narušit tyto funkce (Conway a Wickens, 1988; Wickens a kol., 1987). Bylo však také pozorováno, že sekvence od 50 až 100 párů bází 3' kdomělému polyA signálu jsou také požadovány; tj. gen, který má normální AATAAA ^al^e byl přemístěn nebo přerušen po směru nedosáhl přesné polyadenylace. (Gil a Proudfoot, 1984; Sadofsky a Alwine, 1984; McDevitt a kol., 1984). To znamená, že polyA signál samotný nestačí pro kompletní a přesnou úpravu. Dosud není známo, které konkrétní sekvence po směru jsou zapotřebí v adici pro polyA signál nebo zda existuje specifická sekvence, která má takovou funkci. Sekvenční analýza může tedy pouze zjistit potenciální polyA signály.

V přirozeně se vyskytujících molekulách mRNA které jsou normálně polyadenylovány, bylo pozorováno, že přerušení tohoto procesu, ať už střídáním polyA signálu nebo jiných sekvencí v mRNA, lze výrazně ovlivnit na úrovni funkční mRNA. Bylo to pozorováno v několika přirozeně se vyskytujících molekulách mRNA, s tím výsledkem, že jsou geny velmi specifické.

Bylo ukázáno, že v přirozeně se vyskytujících molekulách mRNA je důležitá přesná polyadenylace pro akumulaci mRNA a že přerušení tohoto procesu může významně ovlivnit hladiny • ·

mRNA. Máme však dosud nedostatečné znalosti pro předběžné určení účinku změn v normálním genu. V heterologním genu je dokonce ještě složitější určit konsekvenci. Je však možné, že domělá místa, která byla identifikována, nejsou funkční. To znamená, že tako místa nemusí fungovat jako pravá póly A místa, ale místo toho fungují jako odlišná místa, která dávaní vznik nestabilním molekulám mRNA.

V systémech živočišné buňky je signál AATAAA určený v mRNA sekvenci proti směru exprese genu póly A mnohem obvyklejší, ale alespoň čtyři varianty byly také nalezeny (Wickens a Stephenson, 1984). V rostlinách nebylo provedeno zdaleka tolik analýz, ale je zřejmé, že mnohonásobné sekvence podobné AATAAA mohou být použity. Místa v rostlinách uvedená v tabulce 3 se nazývají majoritní nebo minoritní podle studie Dean a kol.(1986), která analyzuje pouze tři typy rostlinného genu. Označení polyadenylačních míst jako majoritní a minoritní odpovídá pouze frekvenci jejich výskytu jako funkčních míst v přirozeně se vyskytujících genech, které byly analyzovány. V případě rostlin je to velmi omezená databáze. Je těžké s jistotou předem určit, že místo označené jako majoritní nebo minoritní je více nebo méně podobné funkcí částečně nebo úplně, nachází-li se v heterologním genu, jako jsou například geny kódující krystalové proteiny podle vynálezu.

Tabulka 3

Polyadenylační místa v rostlinných genech

PA	AATAAA	Majoritní konsenzuální místo
PIA	AATAAT	Majoritní rostlinné místo
P2A	AACCAA	Minoritní rostlinné místo
P3A	ATATAA	tl
P4A	AATCAA	II
PSA	ATACTA	tl
P6A	ATAAAA	II
P7A	ATGAAA	tt
P8A	AAGCAT	tt
P9A	ATTAAT	tt
P10A	ATACAT	tt
P11A	AAAATA	tt

P12A	ATTAAA	Minoritní živočišné místo
P13A	AATTAA	11
P14A	AATACA	11
P15A	CATAAA	11

Vynález poskytuje způsoby přípravy syntetických rostlinných genů, které exprimují svůj proteinový produkt v hladině podstatně vyšší než přirozený typ genu, který byl dosud obvykle používán v transformaci rostlin. Vynález dále poskytuje nové syntetické rostlinné geny, které kódují nerostlinné proteiny.

Jak bylo uvedeno dříve, exprese přirozených B. thuringiensis genů v rostlinách je často problematická. Podstata kódujících sekvencí genů B. thuringiensis se liší od rostlinných genů stejně jako mnoho jiných heterologních genů exprimovaných v rostlinách. Obzvláště B. thuringiensis geny jsou velmi bohaté (asi 62 %) na adenin (A) a thymin (T), zatímco rostlinné geny a většina jiných bakteriálních genů, které byly exprimovány v rostlinách obsahují 45 % až 55 % A+T.

Díky degeneraci genetického kódu a omezenému množství výběru kodonů pro jakoukoli aminokyselinu se většina „přírůstku“ A+T v strukturních kódujících sekvencích některých kmenů Bacillus nachází na třetí pozici kodonů. To znamená, že geny některých kmenů Bacillus mají A nebo T jako třetí nukleotid v mnoha kodonech. Tak obsah A+T může částečně ovlivnit použití kodonů. Kromě toho je zřejmé, že geny mají maximální funkci v organismu, ve kterém se vyvinuly. To znamená, že jednotlivé nukleotidové sekvence nacházející se v genu z jednoho organismu, kde nemusejí hrát žádnou důležitou roli kromě toho, že kódují určitou sekvenci aminokyselin, mohou být v jiném organismu rozpoznávány jako genové kontrolní elementy (jako například transkripční promotory nebo terminátory, polyA adiční místa, místa sestřihu intronů nebo specifické mRNA degradační signály). Je poněkud překvapivé, že takové chybně čtené signály nejsou běžnějším znakem heterologní genové exprese, ale může to být částečně vysvětleno poměrně stejným obsahem A+T (asi 50 %) v mnoha organismech. Tento obsah A+T a podstata genetického kódu kladou jasné požadavky na pravděpodobnost výskytu jakékoli jednotlivé oligonukleotidové sekvence. Takže gen zE. coli s obsahem 50 % A+T obsahuje jakékoli jednotlivé A+T bohaté úseky s daleko menší pravděpodobností než gen z B. thuringiensis.

Pro získání vysokohladinové exprese genů endotoxinů v rostlinách jsou typicky existující strukturní kódující sekvence („strukturní geny“), které kódují endotoxin modifikovány odstraněním ATTTA sekvencí a domělých polyadenylačních signálů, bodovou mutací DNA obsahující strukturní

4* • 4 4

444

4 4 ·

·· ·· 44

4 4 ·

4 ·

4 4

4 4 ·· 44«· gen. S výhodou jsou odstraněny v podstatě všechny polyadenylační signály a ATTTA sekvence, ačkoli zvýšená hladina exprese může být pozorována i při částečném odstranění jedné ze dvou dříve zmíněných sekvencí. Nebo, je-li vyroben syntetický gen, který kóduje exprimovaný protein, jsou vybrány takové kodony, které neobsahují ATTTA sekvence a předpokládané polyadenylační signály. Pro potřeby vynálezu předpokládané polyadenylační signály zahrnují, ale nejsou nezbytně omezeny na AATAAA, AATAAT , AACCAA, ATATAA, AATCAA, ATACTA, ATAAAA, ATGAAA, AAGCAT, ATTAAT, ATACAT, AAAATA, ATTAAA, AATTAA, AATACA a CATAAA. Pro přemístění ATTTA sekvencí a polyadenylačních signálů, jsou s výhodou použity kodony, které se vyhýbají kodonům, které se zřídka nacházejí v rostlinných genomech. Vybraná DNA sekvence je skenována kvůli určení oblastí s více než čtyřmi po sobě následujícími adenin (A) nebo thymin (T) nukleotidy. A+T oblasti jsou skenovány kvůli potencionálním rostlinným polyadenylačním signálům. Ačkoli nepřítomnost pěti nebo více za sebou následujících A nebo T nukleotidů eliminuje většinu rostlinných polyadenylačních signálů, vyskytne-li se více než jeden z minoritních polyadenylačních signálů v deseti nukleotidech každého z nich, pak nukleotidová sekvence této oblasti je s výhodou zaměněná k odstranění těchto signálů, ale udržení původní kódované aminokyselinové sekvence.

Kmeným krokem je uvážit asi 15 až asi 30 nebo podobně nukleotidových zbytků obklopujících A+T bohatou oblast, která byla určena v kroku 1. Pokud je obsah A+T obklopující oblasti menší než 80 %, oblast má být testována na polyadenylační signály. Změna oblasti založená na polyadenylačních signálech závisí na (1) množství přítomných polyadenylačních signálů a (2) přítomnosti majoritního rostlinného polyadenylačního signálu.

Prodloužená oblast je testována na přítomnost rostlinných polyadenylačních signálů. Polyadenylační signály jsou odstraněny pomocí místně cílené mutageneze DNA sekvence. Prodloužená oblast je také testována na mnohonásobné kopie ATTTA sekvence, které jsou také odstraněny mutegenezí. Oblasti obsahující mnoho po sobě jdoucích A+T bází nebo G+C bází jsou s výhodou přerušené protože tyto oblasti jsou předem určeny ktomu, že s vyšší pravděpodobností tvoří vlásenku díky komplementaritě vlastních bází. Inzerce heterogenních párů bází by tedy snížila pravděpodobnost tvorby sekundární struktury díky komplementaritě vlastních bází, která je známa tím, že inhibuje transkripci a/nebo translaci v některých organismech. Ve většině případů může být nepříznivý účinek minimalizován pomocí sekvencí, které neobsahují více než pět po sobe jdoucích A+T nebo G+C.

··· <·» · · · «·« ·· ·· ··· ·· ····

Syntetické oligonukleotidy pro mutagenezi

Jsou-li při mutagenezi používány oligonukleotidy je zapotřebí udržovat přesnou aminokyselinovou sekvenci a čtecí rámec, bez vložení obvyklých restrikčních míst, jako je například BgUI, Hindlll, Sací, KpnI, EcóRl, Ncol, Pstl a Sall do modifikovaného genu. Tato restrikční místa se nacházejí v inzerčních místech mnohočetného spojovníku mnoha klonovacích vektorů. Samozřejmě, že vložení nových polyadenylačních signálů, ATTTA sekvencí nebo po sobě jdoucích sekvencí více než pěti A+T nebo G+C, by mělo být také vyloučeno. Velikost oligonukleotidů je s výhodou asi 40 až asi 50 bází, ale fragmenty, jejichž velikost se pohybuje v rozmezí 18 až 100 bází jsou také vhodné. Ve většině případů bylo udržováno minimálně asi 5 až asi 8 párů bází homologních s DNA matricí na obou koncích syntetizovaného fragmentu pro jistotu přesné hybridizace primerů k matrici. Oligonukleotidy by neměly obsahovat sekvence delší než pět párů bází A+T nebo G+C. Kodony použité při přemístění divokého typu kodonů by s výhodou neměly obsahovat TA nebo GC páry, pokud je to možné. Kodony jsou vybrány z tabulky výhodných rostlinných kodonů (jako je například tabulka 4 uvedená dále), aby bylo možno vyhnout se kodonům, které se zřídka nacházejí v rostlinných genomech a je vhodné vybrat kodony, které mají s výhodou obsah G+C asi 50 %.

Tabulka 4

Výhodné kodony užívané v rostlinách

Aminokyselina	Kodon	Procento použití v rostlinách
ARG	CGA	7
	CGC	11
	CGG	5
	CGU	25
	AGA	29
	AGG	23
LEU	CUA	8
	CUC	20
	CUG	10
	CUU	28
	UUA	5
	UUG	30

·« · · · -.·· ·· • ♦ · · · ♦ · ♦ ··· · · · · ·

SER	UCA	14
	UCC	26
	UCG	3
	UCU	21
	AGC	21
	AGU	15
THR	ACA	21
	ACC	41
	ACG	7
	ACU	31
PRO	CCA	45
	CCC	19
	CCG	9
	CCU	26
ALA	GCA	23
	GCC	32
	GCG	3
	GCU	41
GLY	GGA	32
	GGC	20
	GGG	11
	GGU	37
ILE	AUA	12
	AUC	45
	AUU	43
VAL	GUA	9
	GUC	20
	GUG	28
	GUU	43
LYS	AAA	36
	AAG	64
ASN	AAC	72

	AAU	28
GLN	CAA	64
	CAG	36
HIS	CAC	65
	CAU	35
GLU	GAA	48
	GAG	52
ASP	GAC	48
	GAU	52
TYR	UAC	68
	UAU	32
CYS	UGC	78
	UGU	22
PHE	UUC	56
	UUU	44
MET	AUG	100
TRP	UGG	100

Předpokládá se, že oblasti s mnoha po sobě jdoucími A+T bázemi nebo G+C bázemi tvoří s větší pravděpodobností vlásenku kvůli komplementaritě vlastních bází. Přerušení těchto oblastí inzercí heterogenních párů bází je výhodné a mělo by snížit pravděpodobnost tvorby sekundárních struktur vznikajících díky komplementaritě vlastních bází, jako jsou například vlásenky, které jsou známé tím, že v některých organismech inhibují transkripci (transkripční terminátory) a translaci (atenuátory).

Nebo může být připraven komplementární syntetický gen pro danou aminokyselinovou sekvenci, který neobsahuje oblasti pěti nebo více po sobě jdoucích A+T nebo G+C nukleotidů. Kodony jsou vybírány mezi kodony, které neobsahují TA a GC pokud je to možné. Použití kodonů může být normalizováno proti použití výhodných rostlinných kodonů tabulky (tako je například tabulka 4) a G+C obsah s výhodou upraven na asi 50 %. Výsledná sekvence by měla být testována, aby se vyloučila přítomnost rostlinných polyadenylačních signálů a ATTTA sekvencí. Je také vhodné se vyhnout restrikčním místům, která se vyskytují v obvykle používaných klonovacích • · · · · ·

vektorech. Avšak umístění několika jednotlivých restrikčních míst do genu je vhodné pro analýzu genové exprese nebo konstrukci variant genu.

Způsoby výroby transgenních rostlin rezistentních proti hmyzu

Po transformaci vhodné hostitelské buňky, jako je například rostlinná buňka, rekombinantním úsekem, který obsahuje cry gen, může expresí kódovaného krystalového proteinu (například bakteriálního krystalového proteinu nebo polypeptidů, který má insekticidní účinek proti broukům) vzniknout rostlina rezistentní proti hmyzu.

Způsobem uvedeným v příkladu může být použit expresní vektor obsahující kódující oblast pro B. thuringiensis krystalický protein a vhodný volitelný signální znak pro transformaci suspenze embryonálních rostlinných buněk, jako jsou například pšeničné nebo kukuřičné buňky, s použitím takových metod, jako je například ostřelování částicemi (Maddock a kol., 1991; Vasil a kol., 1992) pro vložení DNA pokrývající mikročástice do recipientních buněk. Transgenní rostliny pak regenerují z transformovaných embryonálních buněk, které exprimují insekticidní proteiny.

Vzniku transgenních rostlin může také být dosaženo použitím jiných metod buněčné transformace, které jsou v oboru známé, jako je například přenos DNA zprostředkovaný Agrobacterium (Fraley a kol., 1983). Případně může být DNA vložena do rostin přímým vložením DNA pylu (Zhou a kol., 1983; Hess, 1987; Luo a kol., 1988), injekcí DNA do reprodukčních orgánů rostliny (Pěna a kol., 1987), nebo přímou injekcí DNA do buněk nezralých embryí a následnou rehydratací vysušených embrií (Neuhaus a kol., 1987; Benbrook a kol., 1986).

Regenerace, vývoj a kultivace roslin z jedotlivých rostlinných protoplastových transfonnantů nebo z různých transformovaných explantátů je dobře známo v oboru (Weissbach a Weissbach, 1988). Takový regenerační a růstový proces typicky zahrnuje kroky selekce transformovaných buněk, kultivace těchto individualizovaných buněk přes obvyklé stupně embryonálního vývoje přes stupeň zakořenění sazenic. Transgenní embrya a semena se regenerují podobně. Výsledné transgenní zakořeněné výhonky se pak přemístí do vhodného růstového média, jako je například půda.

Vývoj nebo regenerace rostlin obsahujících cizí, exogenní gen, který kóduje žádaný polypeptid vnesený Agrobacterium z listových explantátů může být dosaženo postupy dobře známými v oboru, jak bylo popsáno (Horsch a kol., 1985). V tomto postupu jsou transformanti kultivováni v přítomnosti selekčního činidla a v médiu, které zahrnuje regeneraci výhonků v rostliném kmenu, který byl transformován, jak bylo popsáno (Fraley a kol., 1983).

• »

Tímto postupem typicky vznikají výhonky do dvou až 4 měsíců a tyto výhonky jsou poté přeneseny do vhodného kořeny obsahujícího média, které obsahuje selektivní činidlo a antibiotika zabraňující růstu bakterií. Výhonky, které v přítomnosti selekčního média zakoření a vytvoří tak sazenice, jsou poté přemístěny do půdy nebo jiného média, které umožňuje rozvoj kořenů. Tyto metody se mění v závislosti na konkrétním rostlinném kmenu, přičemž potřebné změny jsou v oboru dobře známé.

Regenerované rostliny jsou s výhodou samosprašné, čímž mohou poskytovat homozygotní transgenní rostliny, jak bylo uvedeno dříve. Pyl získaný z regenerovaných rostlin je použit ke křížení s rostlinami, které byly vypěstovány ze semen zemědělsky významných, s výhodou dědičných linií. A naopak pyl z rostlin těchto významných linií může být použit k opylování regenerovaných roslin. Transgenní rostlina podle vynálezu obsahující žádaný polypeptid, je kultivována s využitím metod dobře známých odborníkům v oboru.

Transgenní rostlina podle vynálezu má tedy zvýšené množství kódujících oblastí (například gen), které kódují polypeptid, jak zde bylo popsáno. Transgenní rostlina je s výhodou nezávislý segregant a může přenést tento gen a jeho účinek na svoje potomstvo. Transgenní rostlina je výhodněji homozygotní pro tento gen a přenáší tento gen na veškeré své potomstvo získané pohlavním rozmnožováním. Semena transgenní rostliny mohou být pěstována na poli nebo ve skleníku a výsledné pohlavně dospělé transgenní rostliny jsou samosprášené pro vytvoření pravých pěstovaných rostlin. Potomstvo těchto rostlin tvoří pravé pěstované linie, které jsou hodnoceny postupem uvedeným v příkladu, zvýšení insekticidní kapacity proti broukům, s výhodou na poli, v podmínkách prostředí. Má se za to, že vynález nalezne uplatnění při výrobě transgenních rostlin komerčního zájmu včetně různých drnové a krmné trávy, žita, pšenice, kukuřice, kapoku, lnu, rýže, ječmene, ovsa, cukrové třtiny, bavlny, rajčat, brambor, sojových bobů a jiných, jako jsou například luštěniny, tabák, proso, stejně jako různých ozdobných rostlin, jako jsou například kaktusy a sukulenty, ovoce, bobule, zelenina a také různé stromy a rostliny, které nesou ovoce a ořechy.

Transgenní rostliny obsahující jeden nebo více transgenů, které kódují polypeptid, jak zde bylo popsáno, budou s výhodou vykazovat fenotyp zvýšené nebo rozšířené rezistence proti hmyzu z řádu Coleoptera a Lepidoptera, jak zde bylo popsáno. Tyto rostliny budou s výhodou poskytovat transgenní semena, která budou použita pro vypěstování linií transgenních rostlin (tj. potomstva nebo vyvinutých generací původní transgenní rostliny), které mohou být použity k tvorbě semen nebo jako potrava pro zvířata či člověka, nebo k výrobě vláken, oleje, produkci plodů a semen nebo z nich bude získán jiný komerční užitek. V takových případech, potomstvo a semena získaná • ·

z jakékoli generace transformovaných rostlin bude obsahovat vybraný chromozomálně integrovaný transgen, který kóduje δ-endotoxin podle vynálezu. Transgenní rostliny podle vynálezu mohou být kříženy pro vznik hybridů nebo dědičných linií s jednou nebo více rostlinami, které mají požadované vlastnosti. Za určitých podmínek může být také zapotřebí vytvořit transgenní rostliny, semena a potomstvo, které obsahuje jeden nebo více přidaných transgenů včleněných do jejich genomu navíc k transgenu kódujícímu polypeptid podle vynálezu. Například mohou transgenní rostliny obsahovat kmený gen kódující stejný nebo jiný polypeptid rezistence proti hmyzu nebo případně rostliny mohou obsahovat jeden nebo více přidaných transgenů, například ty, které způsobují rezistenci proti herbicidům, houbám, bakteriím, stresu, soli nebo suchu, vyšší stonek nebo rozvoj kořenů, zvýšenou tvorby škrobu, zrn, oleje, uhlovodíků, aminokyselin, proteinů a podobně.

Izolace homogního genu a genových fragmentů

Geny a δ-endotoxiny, které jsou předmětem vynálezu neobsahují pouze zde popsané sekvence plné délky, ale také fragmenty těchto sekvencí nebo fuzní proteiny, které si podržely charakteristický insekticidní účinek sekvencí, které jsou zde konkrétně uvedeny.

Odborníkům v daném oboru je známo, že insekticidní δ-endotoxiny mohou být určeny a získány pomocí několika prostředků. Specifické geny nebo jejich části mohou být získány ze skladu kultur nebo konstruovány synteticky, například s použitím genového počítače. Variace těchto genů mohou být přímo konstruovány s použitím běžných postupů pro vytvoření bodových mutací. Mohou být také vyrobeny fragmenty těchto genů s použitím komerčně dostupných exonukleáz podle běžných postupů. Například enzymy, jako je Ba/31 nebo místně cílené mutageneze mohou být použity pro systematické odstřižení nukleotidů z konce těchto genů. Také geny kódující aktivní fragmenty mohou být získány s použitím různých jiných restrikčních enzymů. Proteázy mohou být použity k přímému získání aktivních fragmentů těchto δ-endotoxinů.

Ekvivalentní δ-endotoxiny a/nebo geny kódující tyto ekvivalentní δ-endotoxiny mohou být také izolovány z kmenu Bacillus a/nebo DNA knihoven s použitím zde poskytovaných postupů. Například protilátky proti δ-endotoxinům, které jsou zde popsány a nárokovány, mohou být použity pro určení a izolování jiných δ-endotoxinů ze směsi proteinů. Přesněji řečeno, protilátky mohou být vedené na části δ-endotoxinů, které jsou nejvíce konstantní a nejvíce oddělené od jiných B. thuringiensis δ-endotoxinů. Tyto protilátky pak mohou být použity pro specifické určení • 4 ekvivalentních δ-endotoxinů s charakteristickým insekticidním účinkem pomocí imunoprecipitace, enzymatickými imunotesty (ELISA) nebo Western blootingu.

Dalším způsobem určení δ-endotoxinů a genů, které jsou předmětem vynálezu je použití oligonukleotidových sond. Tyto sondy jsou nukleotidové sekvence s detekovatelným označením. Jak je známo v daném oboru, jestliže sondážní molekula a vzorek nukleové kyseliny hybridizují za vzniku silné vazby mezi dvěma molekulami, můžeme předpokládat, že sonda a vzorek jsou v podstatě identické. Detekovatelné označení sond umožňuje známým způsobem určit zda k hybridizaci došlo. Taková sondážní analýza poskytuje rychlý způsob určení formicidních genů δ-endotoxinu, které jsou předmětem vynálezu.

Nukleotidové úseky, které jsou využívány jako sondy podle vynálezu mohou být syntetizovány s použitím DNA syntetizérů standardními metodami. Při použití nukleotidového úseku jako sondy je jednotlivá sonda označena jakýmkoli vhodným označením známým odborníkům v daném oboru, včetně radioaktivních a neradioaktivních označení. Typické radioaktivní značky zahrnují: ³²P, ¹²⁵I, ³⁵S nebo podobně. Sonda označená radioaktivním izotopem může být konstuována z nukleotidové sekvence komplementární k DNA vzorku běžnou translační reakcí s použitím DNáz a DNA polymeráz. Sonda a vzorek mohou pak být spojeny v roztoku hybridizačního pufru a uchovány za vhodné teploty až do teplotní hybridizace. Poté je membrána promyta, čímž se odstraní cizí materiály a molekuly vzorku a vázané sondy mohou být určeny a kvantifikovány pomocí autoradiografie a/nebo kapalné scintilace.

Neradioaktivní označení zahrnuje například ligandy, jako je biotin nebo tyroxin a také enzymy, jako jsou například hydrolázy nebo peroxidázy nebo různé chemoluminiscenty, jako je například luciferin nebo fluorescenční složky jako fluorescein a jeho deriváty. Sonda může být také označena na obou koncích různými typy značek pro usnadnění separace, jako je například použití dříve zmíněných izotopů na jednom konci a biotinové značky na kmeném konci.

Duplexní formace a stabilita závisí na skutečné komplementaritě mezi dvěma vlákny hybridu, jak bylo zmíněno dříve, určitém stupni chybného párování, který může být tolerován. Sondy, které jsou předmětem vynálezu tedy zahrnují mutace (jednotlivé i mnohonásobné), delece, inzerce popsaných sekvencí a jejich kombinace, v nichž tyto mutace, inzerce a delece dovolují tvorbu stabilních hybridů s cílovými polynukleotidy, které jsou předmětem zájmu. Mutace, inzerce a delece mohou být vytvořeny v dané polynukleotidové sekvenci mnoha způsoby, postupy, které jsou v současné době odborníkům obvykle známé a pravděpodobně i dalšími metodami, které vejdou ve známost v budoucnosti.

• ·

Možné variace v uvedených sondách mohou vzniknout částečně díky redundanci genetického kódu. Redundance genetického kódu znamená, že většina aminokyselin potřebných k tvorbě proteinů je kódována více než jedním kódujícím nukleotidovým tripletem (kodonem). Určitou aminokyselinu mohou tedy kódovat různé nukleotidové sekvence. Aminokyselinové sekvence B. thuringiensis δ-endotoxinů a peptidů mohou tedy být připraveny z ekvivalentních nukleotidových sekvencí kódujících stejnou aminokyselinovou sekvenci proteinu nebo peptidu. Předmětem vynálezu jsou tedy také takové ekvivalentní nukleotidové sekvence. Předmětem vynálezu jsou také inverzní nebo komplementární sekvence a mohou být přímo použity odborníky v daném oboru. Kromě toho bylo ukázáno, že proteiny stejné struktury a funkce mohou být konstruovány pomocí změny aminokyselinové sekvence, pokud takové změny neovlivní sekundární strukturu proteinu (Kaiser a Kezdy, 1984). Předmětem vynálezu jsou tedy mutanti aminokyselinové sekvence zde popsané, které nemají změněnou sekundární strukturu proteinu nebo, pokud je tato struktura změněna, je jejich biologická účinnost v podstatě zachvána. Předmětem vynálezu jsou také mutanti celých hostitelských organismů, které nesou celý nebo část kódujícího genu δ-endotoxinu podle vynálezu. Takoví mutanti mohou být získáni postupy, které jsou dobře známé odborníkům v daném oboru. Pro přípravu mutantů hostitelských organismů může být použito například UV záření. Stejně tak mohou takový mutanti obsahovat asporogenní hostitelské buňky, které mohou také být připraveny metodami známými v oboru.

Rekombinantní hostitelské buňky

Nukleotidové sekvence, které jsou předmětem vynálezu mohou být vloženy do mnoha mikrobiálních a eukaryotických hostitelů. Hostiteli pro rekombinantní expresi Cry polypeptidů, které jsou zvláštním předmětem zájmu, jsou prokaryota a nižší eukaryota, jako jsou například houby. Příklady prokaryot, jak Gram-negativních tak Gram-pozitivních, zahrnují Enterobacteriaceae, jako například Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella a Próteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, jako například Rhizobium; Spirillaceae, jako je Photobacterium, Zymomonas, Serratia, Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, jako například Pseudomonas a Acetobacter; Azotobacteraceae, Actinomycetales a Nitrobacteraceae. Mezi eukaryoty jsou houby, jako například Phycomycetes a Ascomycetes, které zahrnují kvasinky, jako například Saccharomyces a Schizosaccharomyces a Basidiomycetes kvasinky, jako například Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces, a podobně.

* ·

Důležité charakteristiky pro výběr hostitelské buňky za účelem tvorby polypetidů zahrnují: snadné vložení genetického konstruktu podle vynálezu do hostitelské buňky, použitelnost expresního systému, účinnost exprese, stabilita žádaného genu v hostitelské buňce a přítomnost pomocných genetických vybavení.

Velké množství mikroorganismů, které obývají povrch rostlin (povrch listů) a/nebo rhizosféru (půda obklopující kořeny) mnoha důležitých plodin mohou být také žádanými hostitelskými buňkami pro manipulaci, rozmnožování, uskladnění, ochranu a/nebo mutagenezi popsaných genetických konstrukcí. Tyto mikroorganismy zahrnují bakterie, řasy a houby. Předmětem zvláštního zájmu jsou mikroorganismy, jako jsou například bakterie, například rody Bacillus (včetně kmenů a pokmenů B. thuringiensis kurstaki HD-1, B. thuringiensis kurstaki HD-73, B. thuringiensis solto, B. thuringiensis berliner, B. thuringiensis thuringiensis, B. thuringiensis tohvorthi, B. thuringiensis dendrolimus, B. thuringiensis alesti, B. thuringiensis galleriae, B. thuringiensis aizawai, B. thuringiensis subtoxicus, B. thuringiensis entomocidus, B. thuringiensis tenebrionis a B. thuringiensis san diego; Pseudomonas, Erwinia. Serratia, Klebsiella, Zanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylophilius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc, a Alcaligenes; houby, zvláště kvasinky, jako například rody Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula a Aureobasidium. Předmětem zvláštního zájmu jsou takové fytosféry bakteriálních kmenů jako je Pseudomonas syringae, Pseudomonas jluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, Agrobacterium tumefaciens, Rhodobacter sphaeroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes eutrophus a Azotobacter vinlandii; a fytosféry kmenů kvasinek, jako například Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces roseus, S. odorus, Kluyveromyces veronae, a Aureobasidium pollulans.

Důležité charakteristiky pro výběr hostitelské buňky za účelem tvorby polypetidů zahrnují: snadné vložení genegických konstruktů do hostitele, použitelnost expresního systému, účinnost exprese, stabilita polynukleotidu v hostiteli a přítomnost pomocných genetických vybavení. Dále se přihlíží kjednoduchosti formulace a manipulace, ekonomické stránce, skladovací stabilitě a podobně.

• ·

Polynukleotidové sekvence

DNA kompozice kódující insekticidně účinné polypeptidy podle vynálezu jsou zvláště výhodné pro ochranu recipientních rostlinných buněk v generaci pluripotentních rostlinných buněk a především ve výrobě transgenních rostlin rezistentních proti hmyzu. Mohou být například použity DNA úseky ve formě vektorů a plazmidů nebo lineárních DNA fragmentů v některých případech obsahující pouze DNA element, který má být exprimován v rostlinné buňce a podobně.

Vektory, plazmidy, fagemidy, kosmidy, virové vektory, kyvadlové vektory, bakulovirové vektory, BAC (bakteriální umělé chromozomy), YAC (kvasinkové umělé chromozomy) a úseky DNA, používané pro transformaci buněk δ-endotoxin kódujícími polypeptidy, budou samozřejmě obsahovat alespoň první gen, který kóduje polypeptid, který odpovídá SEQ ID č.: 2, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 6, SEQ ID č.: 8, SEQ ID č.: 10, SEQ ID č.: 12, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.: 16 nebo SEQ ID č.: 19 nebo gen, který kóduje polypeptid, který má alespoň asi 80% nebo 85% nebo 90% nebo 95% sekvenční shodnost s aminokyselinovou sekvencí popsanou v SEQ ID č : 2, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 6, SEQ ID č.: 8, SEQ ID č.: 10, SEQ ID č.: 12, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.: 16 nebo SEQ ID č.: 19. Tyto konstrukty nukleové kyseliny mohou obsahovat jeden nebo více genů, které je zapotřebí vložit do recipientní buňky. Tyto DNA konstrukty mohou podle potřeby obsahovat struktury jako jsou promotory, zesilovače transkripce (enhancery), mnohočetné spojovníky nebo regulační geny. Úseky DNA nebo geny vybrané pro vložení do buněk často kódují polypeptidy, které jsou exprimovány ve výsledných rekombinantních buňkách, což bude mít za následek třídění nebo výběr a/nebo vylepšený fenotyp transformované buňky. Nebo mohou konstrukty nukleové kyseliny zahrnovat antimediátorové konstrukty nebo ribozómy kódující oblasti, je-li doručení nebo vložení takových konstruktů zapotřebí.

Způsoby přípravy mutagenizovaných polynukleotidů

Za určitých podmínek může být zapotřebí upravit nebo změnit jeden nebo více nukleotidů v jedné nebo více polynukleotidových sekvencích podle vynálezu za účelem výměny nebo změny insekticidní aktivity nebo insekticidní specifičnosti kódovaného polypeptidu. Mutantní sekvence je pak postupně amplifikována. Postupy mutageneze a amplifikace úseku DNA jsou velmi dobře známé v daném oboru. Mutegeneze úseků DNA může probíhat pomocí náhodných nebo místně specifických procesů mutageneze. Polynukleotidy mohou být modifikovány adicí, delecí nebo substitucí jednoho nebo více nukleotidů z kódující sekvence insekticidně účinných polypeptidů.

··

Přesné postupy mutageneze a amplifíkace, které mohou být vhodné pro provedení vynálezu jsou popsány v Tomic a kol., Michael a kol., Upender a kol., Kwoh a kol., Frohrnan, a kol., Ohara a kol., Wu a kol., Walker a kol.; U. S. Patenty č. 4,683,195, 4,683,202, 4,800,159, 4,883,750 a

EP320,308 EP329,822; GB 2202328; PCT/US87/00880; PCT/US89/01025; WO 88/10315, WO 89/06700, z nichž každý je zde zařazen tímto odkazem.

Posttranskripční úpravy mající vliv na expresi transgenů v rostlinách

Hladina transkripce určitého transgenů vdané hostitelské buňce v mnoha případech neodpovídá množství produkovaného proteinu v transformované hostitelské buňce. Schopnost transkriptu produkovat protein je často ovlivněna posttranskripčními úpravami, jako je například sestřih, polyadenylace, příslušná translační iniciace a stabilita RNA.Takové faktory mohou také ovlivnit stabilitu a množství mRNA vyráběné podle daného transgenů. Z toho důvodu je často zapotřebí změnit posttranskripční úpravy pomocí určitých postupů molekulární biologie. Předpokládá se, že v určitých případech může být zapotřebí změnit transkripci a/nebo expresi polypeptid kódujícího konstruktu nukleové kyseliny podle vynálezu, aby bylo možno zvýšit, snížit nebo jinak upravit nebo řídit tyto konstukry v konkrétních hostitelských buňkách a/nebo transgenních rostlinách.

Účinná iniciace proteinové translace

Hlavním faktorem, který ovlivňuje účinnost translace eukaryotické mRNA je 5' nepřekládaná vedoucí sekvence (5' -UTL). Zpočátku se u chimérických transgenů s virovým promotorem používalo libovolné délky virové sekvence za transkripčnim iniciačním místem, která fúzovala na AUG kódující oblasti. Pozdější studie ukázaly, že 5' -UTL sekvence a sekvence přímo obklopující AUG mohou velmi významně ovlivnit účinnost translace v hostitelských buňkách a zejména v některých rostlinných druzích a že tento účinek se může lišit v závislosti na konkrétních buňkách nebo tkáních, ve kterých je zpráva exprimována.

Ve většině eukaryotických molekul mRNA je bod iniciace translace na AUG kodonu poblíž 5' čepičky transkriptu. Srovnání rostlinných mRNA sekvencí a experimenty s místně cílenou mutagenezí prokázaly existenci konsenzuální sekvence obklopující iniciační kodon v rostlinách, 5'-UAAACAAUGGCU-3¹ (Joshi, 1987; Lutcke a kol., 1987). Konsenzuální sekvence budou zřejmé mezi jednotlivými rostlinnými kmeny. Například složení sekvencí obklopujících iniciační kodon z 85 kukuřičných genů dává konsenzus 5' -(C/G)AUGGCG-3' (Luehrsen a kol., 1994). V tabákových • · • · 9

99 ·· ·· • 9 ’ • <

protoplastech vykazují transgeny kódující glukuronidázu (GUS) a bakteriální chitinázu čtyřnásobný a osminásobný vzrůst exprese, v tomto pořadí, poté, co byly přirozené sekvence těchto genů změměny na 5'- ACCAUGG-3' (Gallie a kol., 1987b; Jones a kol., 1988).

Při výrobě chimérických transgenů (tj. transgenů, které obsahují funkčně spojené DNA úseky z rozdílných zdrojů) jsou často používány 5' -UTL rostlinných virů. Ukázalo se, že 5'UTL proteinu kapsidu alfalfa viru tabákové mozaiky (AMV) a proteinu kapsidu viru bromové mozaiky (BMV) osminásobně zvětšuje mRNA translaci v tabákových protoplastech vystavených elektroporaci (Gallie a kol., 1987a; 1987b). 67-nukleotid odvozený (Ω) od 5-UTL viru tabákové mozaiky RNA (TMV) fúzoval na chloramfenikolacetyltransferázový (CAT) gen a ukázalo se, že GUS gen zvětšuje translaci refernčních genů in vitro (Gallie a kol., 1987a; 1987b; Sleat a kol., 1987; Sleat a kol., 1988). Elektroporace protoplastů tabákového mezofylu s transkripty obsahujícími TMV vedoucí sekvenci fúzovanou na referenční geny CAT, GUS a LUC, dala 33- 21- a 36- násobnou hladinu vzestupu, v tomto pořadí (Gallie a kol., 1987a; 1987b; Gallie a kol., 1991). Ukázalo se také, že 83-nt 5-UTL bramborového viru X RNA zvyšuje čtyřikrát expresi neomycinfosfotransferázy II f7\ý?ZlIý v tabáku (Poogin a Skryabin, 1992).

Účinek 5'UTL může být různý v závislosti na rostlině, bude se lišit obzvláště mezi jednoděložnými a dvouděložnými rostlinami. Ukázalo se, že TMV 5'-UTL je účinnější v tabákových protoplastech (Gallie a kol., 1989) než v kukuřičných protoplastech (Gallie and Young, 1994). Také 5-UTL z TMV-0 (Gallie a kol., 1988), AMV-kapsidu (Gehrke a kol., 1983; Jobling a Gehrke, 1987), TMV-kapsidu (Goelet a kol., 1982) a BMV-kapsidu (French a kol., 1986) špatně fungují v kukuřici a inhibují expresi luciferázového genu v kukuřici vzhledem kjeho přirozené vedoucí sekvenci (Koziel a kol., 1996). Avšak 5-UTL z viru květákové mozaiky (CaMV) 35S transkript a kukuřičný genový glutelin (Boronat a kol., 1986), PEP-karboxyláza (Hudspeth a Grula, 1989) a ribulózobifosfátkarboxyláza vykazují významné zvýšení exprese luciferázového genu v kukuřici oproti jeho přirozené vedoucí sekvenci. (Koziel a kol., 1996).

Tyto 5 '-UTL mají v tabáku různé účinky. Na rozdíl od kukuřice, TMV (Ω) 5'-UTL a AMV kapsidového proteinu 5 -UTL zvětšuje expresi v tabáku, zatímco glutelin, kukuřičná PEP-karboxyláza a kukuřičná ribulózo-l,5-bifosfátkarboxyláza 5'-UTL nevykazuje zesílení vzhledem kpřirozené luciferáze 5'-UTL (Koziel a kol., 1996). Pouze CaMY 35S 5-UTL zvětšuje expresi luciferázy v tabáku i v kukuřici (Koziel a kol., 1996). Kromě toho TMV a BMV kapsidový protein 5 -UTL jsou inhibitory jak v kukuřičných tak v tabákových protoplastech (Koziel a kol., 1996).

• · ·· ··· ·· ·· • * · ·· ····

Použití intronů pro zvýšení exprese

Ukázalo se, že přítomnost jednoho nebo více intronů v transkribované části genu zvyšuje expresi heterologního genu v různých rostlinných systémech (Callis a kol., 1987; Maas a kol., 1991; Mascerenhas a kol., 1990; McElroy a kol., 1990; Vasil a kol., 1989), ne všechny introny však mají stimulační účinek a stupeň stimulace se mění. Stimulační účinek intronů se zdá být zjevnější u jednoděložných než u dvouděložných rostlin. Tanaka a kol., (1990) ukázal, že použití katalázového intronů 1 izolovaného z ricinových bobů zvyšuje genovou expresi v rýži. Podobně se ukázalo, že intron alkoholdehydrogenázy 1 (AdhX) zvyšuje expresi genomického klonu AdhX obsahující endogenní promotor v transformovaných kukuřičných buňkách (Callis a kol., 1987; Dennis a kol., 1984). Jiné introny, které jsou také schopny zvýšit expresi transgenů, ve kterých jsou obsaženy, zahrnují introny 2 a 6 Md7zl (Luehrsen a Walbot, 1991 ), katalázový intron (Tanaka kol., 1990), intron 1 kukuřičného bronzu I gen (Callis a kol., 1987), intron 1 synázy kukuřičné sacharózy (Vasil a kol., 1989), intron 3 rýžového aktinového genu (Luehrsen a Walbot, 1991), rýžový aktinový intron 1 (McElroy a kol., 1990) a kukuřičný ubichitinový exon 1 (Christensen a kol., 1992).

Obecně lze říci, že pro dosažení optimální exprese by měly být přítomny vybrané introny (intron) v 5' transkripční jednotce ve správné orientaci s ohledem na spojem sekvence podrobené sestřihu (Callis a kol., 1987; Maas a kol., 1991; Mascerenhas a kol., 1990; Oard a kol., 1989; Tanaka a kol., 1990; Vasil a kol., 1989). Ukázalo se, že intron 9 Adhl zvyšuje expresi heterologního genu, pokud když je umístěn 3' (nebo po směru) genu, který je předmětem zájmu (Callis a kol., 1987).

Použití syntetických genů pro zvýšení exprese heterologních genů v rostlinách

V případě, že je vkládán prokaryotický gen do eukaryotického hostitele, nebo když exprimuje eukaryotický gen v nepřirozeném hostiteli, sekvence genu musí být často pozměněna nebo modifikována, aby bylo dosaženo účinné translace transkriptu(ů) tohoto genu. Z tohoto hlediska jsou významné zkušenosti s použitím syntetických genů pro zvýšení exprese požadovaného proteinu B. thuringiensis v rostlinách. Přirozené B. thuringiensis geny jsou často exprimovány pouze v nízkých hladinách v dvouděložných rostlinách a někdy vůbec v mnoha druzích jednoděložných rostlin (Koziel a kol., 1996). Použití kodonů v přirozených genech je významně odlišné od těch, které se běžně nacházejí v rostlinných genech, které mají vyšší obsah G+C. Strategie zvýšení exprese těchto genů v rostlinách obecně mění celkový obsah G+C v genech. Například syntetické B. thuringiensis krystalový protein kódující geny mají významně vyšší expresi těchto endotoxinů • · ·· • ·· v různých plodinách včetně bavlny (Perlak a kol., 1990; Wilson a kol.. 1992), rajčat (Perlak a kol.. 1991), brambor (Perlak a kol., 1993), rýže (Cheng a kol., 1998) a kukuřice (Koziel a kol., 1993).

Předpokládá se, že genetické konstrukty podle vynálezu, protože obsahují jeden nebo více genů z bakteriálního zdroje, mohou být za určitých podmínek podobně upraveny pro zvýšení exprese těchto prokaryotických genů vdaných hostitelských eukaryotických buňkách a/nebo transgenních rostlinách, které obsahují takové konstrukty. S použitím postupů molekulární biologie, které jsou dobře známé odborníkům v daném oboru, mohou být kódující nebo nekódující sekvence konkrétního Cry- kódujícího genu pozměněny, aby bylo dosaženo jeho optimální nebo snadnější exprese v transformovaných rostlinných buňkách na hladiny vhodné pro prevenci nebo snížení napadení hmyzem v takových transgenních rostlinách.

Izolace a cílení chloroplastů

Další cesta ke zvýšení exprese A+T bohatých genů v rostlinách byla nalezena v transformaci chloroplastů tabáku. Vysoké hladiny exprese neupravených B. thuringiensis krystalové proteiny kódujících genů v tabáku byly publikovány McBridem a kol., (1995).

Postupy cílení proteinů do chloroplastů byly zdokonaleny. Tato technika, využívající hrachové chloroplastové tranzitní peptidy, byla využita pro cílení enzymů dráhy syntézy polyhydroxybutyrátu do chloroplastu (Nawrath a kol., 1994). Tato technika také popírá nutnost upravovat kódující oblast jinak než přidáním vhodné cílené sekvence.

U. S. patent 5576198, (který je zde zařazen tímto odkazem) popisuje kompozice a metody vhodné pro genetické úpravy rostlinných buněk, které poskytují postupy řízení časového nebo tkáňového vzoru exprese cizích DNA sekvencí vložených do genomu rostlinného plastidu. Konstrukty zahrnují ty pro jadernou transformaci, které umožňují expresi virové samostatné podnednotky RNA polymerázy v rostlinných pletivech a cílení exprimovaného polymerázového proteinu do plastidů rostlinných buněk. Dále jsou zde zahrnuty plastidové expresní konstrukty obsahující promotorovou oblast, která je specifická pro RNA polymerázu exprimovanou z jaderných expresních konstruktů, které byly dříve popsány a heterologní gen, který má být exprimován v transformovaných plastidech buněk. Případně může být gen transformován/lokalizován do chloraplast/plastid genomu a exprimován odtud pomocí promotorů dobře známých v oboru (viz Maliga, a kol.).

·· ·· ····

Účinky 3' oblastí na expresi transgenu

Ukázalo se, že oblasti 3' konce transgenů mají velký vliv na expresi transgenů v rostlinách (Ingelbrecht a kol., 1989), V této studii byly různé 3' konce funkčně připojeny k neomycin fosfotransferáza II (NpíTÍ) referenčnímu genu a exprimovány v transgenním tabáku. Různé 3' konce byly získány z oktopinsyntázového genu, 2S semenného proteinu z Arabidopsis, malé podjednotky rbcS z Arabidopsis, prodloužení z mrkve a chalkonsyntáza zAntirrhinum. Ve stabilních tabákových transformantech je asi šedesátinásobný rozdíl mezi nejvíce exprimovaným konstruktem (malá podjednotka rbcS 3' konce) a nejméně exprimovaným konstruktem (shalconsyntáza 3' konce).

Tabulka 5

Rostlinné promotory

Promotor Odkaz³

Virový

Virus krtičníkové mozaiky (FMV) Virus květákové mozaiky (CaMV)

Rostlinný

Elongační faktor Polygalakturonáza rajčat Histor Arabidopsis H4 Faseolin

Skupina 2

Ubichitin

P119 a-amyláza

U.S. patent č. 5378619 U.S. patent č. 5530196 U.S. patent č. 5097025 U.S. patent č. 5110732

U.S. patent č. 5177011 U.S. patent č. 5442052 U.S. patent č. 5491288 U.S. patent č. 5504200 U.S. patent č. 5608144 U.S. patente. 5614399 U.S. patent č. 5633440 U.S. patent č. 5712112 • · • 9 ·· « · · · • · ·

Virový zesilovač transkribce/Rostlinný promotor

CaMV ³⁵S zesilovač transkribce/manopin U.S. patent č. 5106739 syntázový promotor “Každý z odkazů je zde zařazen ve své úplnosti

Tabulka 6

Rostlinné promotory specifické pro tkáně

Promotor specifický pro tkáň	Tkáň	Odkaz“
Blec	pokožka	U.S. patent č. 5646333
malátová syntetáza	semena; sadba	U.S. patent č. 5689040
izocitrát lyáza	semena; sadba	U.S. patent č. 5689040
patatin	hlíza	U.S. patent ě. 5436393
ZRP2	kořen	U.S. patent č. 5633363
ZRP2(2.0)	kořen	U.S. patent č. 5633363
ZRP2(1.0)	kořen	U.S. patent č. 5633363
RB7	kořen	U.S. patent č. 5459252
	kořen	U.S. patent č. 5401836
	plod	U.S. patent č. 4943674
	meristém	U.S. patent č. 5589583
	buňky-strážci	U.S. patent č. 5538879
	tyčinka	U.S. patent č. 5589610
SodAl	pyl; střední vrstva; stomium prašníku	Van Camp a kol., 1996
SodA2	cévní svazky; průduchy; postraní pupeny; pericykl; stomium; pyl	Van Camp a kol., 1996
CHS 15	květy; kořenové špičky	Faktor a kol., 1996
Psam-1	lýko; kůra; kořenové špičky	Vanderakol., 1996
ACT11	prodlužovací tkáně a orgány;pyl;vajíčka	Huang a kol., 1997
zmGBS	pyl; endosperm	Russell and Fromm, 1997

zmZ27	endosperm	Russell and Fromm, 1997
osAGP	endosperm	Russell and Fromm, 1997
osGTl	endosperm	Russell and Fromm, 1997
RolC	lýko; poševní svazky; vaskulární parenchym	Graham a kol., 1997
Sh	lýko	Graham a kol., 1997
Cmd	endosperm	Grosset a kol., 1997
Bnml	pyl	Treacy el al., 1997
tungro bacilliformní virus rýže	lýko	Yinakol., 1997a; 1997b
S2-Rnase	pyl	Ficker a kol., 1998
LeB4	semena	Baumlein a kol., 1991
gf-2.8	semena; sadba	Berná and Bernier, 1997

“Každý z odkazů je zde zařazen ve své úplnosti.

Schopnost exprimovat geny v rostlinách způsobem specifickým pro danou tkáň vedla k vytvoření samčích a samičích sterilních rostlin. Obecně řečeno, vytváření samčích sterilních rostlin zahrnuje použití promotorů specifických pro prašníky, které jsou operativně připojeny na heterologní geny, které narušují informaci v pylu (U.S. patent č. 5689051; 5689049; 5659124, (který je zde zařazeným tímto odkazem). U.S. patent č. 5633441 (který je zde zařazen tímto odkazem) poskytuje metodu vytváření rostlin se samičí genetickou sterilitou. Metoda sestává z použití promotorů specifických pro buňky blizny, buňky čnělky nebo pro buňky blizny a čnělky, které exprimují polypeptidy, které, jsou li vytvářeny v buňkách rostliny, zabíjí nebo významně narušují metabolizmus, funkci nebo vývoj buněk

Tabulka 7

Odvozené rostlinné promotory

Promotor Odkaz“ promotor teplotního šoku

Em

Adhl

U. S. Patent No. 5447858 U. S. Patent No. 5139954 Kyozoka et al., 1991

HMG2	U. S. Patent No. 5689056
cinnamyl alkohol dehydrogenáza	U. S. Patent No. 5633439
asparaginsyntáza	U. S. Patent No. 5595896
GST-n-27	U. S. Patent No. 5589614

“Každý z odkazů je zde zařazen ve své úplnosti.

Kompozice protilátek a způsoby přípravy

Konkrétní příklady provedení používají protilátky, ať už monoklonální nebo polyklonální, které se vážou na jeden nebo více polypeptidů podle vynálezu. Prostředky přípravy a charakteristika protilátek jsou dobře známy v daném oboru (viz například Harlow a Lané, 1988; zde zařazeno tímto odkazem). Způsoby vytváření monoklonálních protilátek (mAbs) se obecně podobají postupům pro přípravu polyklonálních protilátek. Polyklonální protilátka se získává imunizací zvířete imunogenickou kompozicí podle vynálezu a shromážděním antiséra z imunizovaného zvířete. Pro přípravu antiséra může být použito velké množství živočišných kmenů. Běžnými kmeny používanými pro výrobu antiséra je králík, myš, krysa, křeček, morče nebo koza. Díky poměrně velkému množství krve jsou králíci považováni za výhodný kmen pro výrobu polyklonálních protilátek.

mAbs mohou být přímo připraveny použitím dobře známých postupů, například ty uvedené v US patentu 4196265, který je zde zařazen tímto odkazem. Obecně tyto postupy zahrnují imunizaci vhodného zvířete vybranou imunogenickou kompozicí, například přečištěný, nebo částečně přečištěný krystalový protein, polypeptid nebo peptid. Imunizační kompozice je podávána způsobem, který je účinný pro stimulování buněk produkujících protilátky. Hlodavci, například myši a krysy jsou výhodná zvířata, avšak použití králíků, ovcí nebo žabích buněk je také možné. Použití krys může poskytovat určité výhody (Goding, 1986, strany 60 až 61), ale myši jsou výhodné, přičemž BALB/c myši jsou nej výhodnější, jelikož jsou nejčastěji používané a obecně dávají vyšší procento stabilních fúzí.

Testy ELIS A a imunoprecipitace

Ve spojení s vynálezem mohou být použity testy ELISA. Výroba a použití testů ELISA nebo sad, které jsou používány jako testy ELISA je odborníkům v daném oboru dobře známa.

Westernové přenosy (Western bloty)

Kompozice podle vynálezu naleznou široké využití v analýzách imunopřenosu nebo westernového přenosu. Protilátky proti peptidům mohou být použity jako vysoce afinitní primární činidla pro určení proteinů imobilizováných na pevnou podpůrnou matrici jako je například nitrocelulóza, nylon nebo jejich kombinace. V souvislosti s imunoprecipitací, po které následuje gelová elektoforéza mohou být tyto použity jako jednokrokové činidlo pro určení antigenů, proti kterým nemohou být použita sekundární činidla, protože způsobují nepříznivé prostředí. To je obzvláště vhodné, jsou li sledované antigeny imunoglobuliny (mimo použití imunoglobulinů vázajících komponenty buněčné stěny), antigeny křížově reagující s detekčním činidlem nebo migrují na stejné relativní molekulární váze jako křížově reagující signál.

Imunologické detekční metody, používané v souvislosti s westernovým přenosem, zahrnující enzymaticky, radioaktivně nebo fluorescenčně označené sekundární protilátky proti toxické části, jsou považovány za obzvláště použitelné v tomto ohledu.

Biologické funkční ekvivalenty

Úpravy a změny mohou být provedeny ve struktuře peptidů podle vynálezu a v úsecích DNA, které je kódují a dosud obsahují funkční molekulu, která kóduje protein nebo peptid s požadovanými vlastnostmi. Mohou být provedeny změny aminokyselin proteinu, díky nimž vznikne ekvivalentní nebo dokonce vylepšená molekula kmené generace. V určitých příkladech provedení vynálezu jsou mutované krystalové proteiny vhodné pro zvýšení insekticidní účinnosti proteinu a tím zvýšení insekticidní účinnosti a/nebo exprese rekombinantního transgenu v rostlinné buňce. Změny aminokyselin mohou být dosaženy změnou kodonů DNA sekvence, podle kodonů v tabulce 8.

Tabulka 8

Aminokyselina	kodony
Alanin	Ala A	GCA GCC GCG GCU
Cystein	CysC	UGCUGU
Aspagová kys.	AspD	GAC GAU
Glutamová kys.	GluE	GAA GAG
Fenylalanin	PheF	uucuuu

·

Glycin	Gly G	GGA GGC GGG GGU
Histidin	His H	CAC CAU
Isoleucin	Ile I	AUA AUC AUU
Lysin	Lys K	AAA AAG
Leucin	LeuL	UUA UUG CUA CUC CUG CUU
Metionin	MetM	AUG
Asparagin	AsnN	AAC AAU
Prolin	Pro P	CCA CCC CCG CCU
Glutamin	GlnQ	CAA CAG
Arginin	Arg R	AGA AGG CGA CGC CGG CQU
Serin	Ser S	AGC AGU UC A UCC UCG UCU
Treonin	Thr T	ACA ACC ACGACU
Valin	Val V	QUAGUCGUGGUU
Tryptofan	Trp W	UGG
Tyrozin	Tyr Y	UAC UAU

Určité aminokyseliny mohou být například substituovány za jiné aminokyseliny ve struktuře proteinu, bez patrné ztráty interaktivní vazebné kapacity se strukturami, například antigen vázající oblasti protilátek nebo vazebná místa na molekulách substrátu. Protože je to interaktivní kapacita a podstata proteinu, která určuje biologickou funkční aktivitu proteinu, mohou být provedeny určité substituce aminokyselinových sekvencí v sekvenci proteinu a samozřejmě vjeho základní DNA kódující sekvenci a přesto získáme protein s podobnými vlastnostmi. Předpokládá se tedy, že mohou být provedeny různé změny v sekvencích peptidu kompozic podle vynálezu nebo odpovídajících DNA sekvencích, které kódují uvedené peptidy, bez znatelné ztráty jejich biologických funkcí nebo účinnosti.

Při provádění takových změn je zapotřebí brát v úvahu hydropatický index aminokyselin. Důležitost hydropatického indexu aminokyseliny v souvislosti s interaktivní biologickou funkcí proteinu je v daném oboru obecně známa. (Kyte a Koolittle, 1982, zařazený zde tímto odkazem). Je známo, že relativní hydropatický charakter aminokyseliny přispívá k sekundární struktuře výsledného proteinu, která střídavě určuje interakce proteinu s jinými molekulami, jako jsou například enzymy, substráty, receptory, DNA, protilátky, antigeny a podobně.

Každá aminokyselina byla označena hydropatickým indexem na základě její hydrofobicity a nábojových charakteristik (Kyte a Doolittle, 1982), jsou to: isoleucin (+4,5); valin (+4,2); leucin • · • ·· ·· • · • · et·· (+3,8); fenylalanin (+2,8); cystein/cystin (+2,5); methionin (+1,9); alanin (1,8); glycin (-0,4); threonin (-0,7); serin (-0,8); tryprofan (-0,9); tyrozin (-1,3); prolin (-1,6); histidin (-3,2); glutamát (3,5); glutamin (-3,5); asparát (-3,5); asparagin (-3,5); lyzin (-3,9) a arginin (-4,5).

V oboru je známo, že určité aminokyseliny mohou být substituovány jinými aminokyselinami, které mají podobný hydropatický index nebo skóre a tvoří tedy protein s podobnou biologickou aktivitou, tj. získáme biologicky funkční ekvivalenty proteinů. Při provádění takových změn jsou s výhodou takové substituce, kde se hydropatické indexy liší o ±2, substituce s rozdílem indexů ±1 jsou výhodné a nejvýhodnější jsou substituce, kde se indexy liší o ±0,5.

V oboru je také známo, že substituce podobných aminokyselin mohou být provedeny účinně na základě hydrofilicity. U. S. patent 4554101, který je zde zařazen tímto odkazem, uvádí, že největší lokální průměrná hydrofilicita proteinu, řízená hydrofilicitou jeho přilehlých aminokyselin, odpovídá biologickým vlastnostem proteinu.

Podle U. S. patentu 4554101 byly následující hodnoty hydrofilicity přiděleny aminokyselinovým zbytkům: arginin (+3,0); lyzin (+3,0); aspartát (+3,0 ± 1); glutamát (+3,0 ± 1); serin (+3,0); asparagin (+2,0); glutamin (+0,2); glycin (0); threonin (-0,4); prolin (-0,5 ± 1); alanin (0,5); histidin (-0,5); cystein (-1,0); methionin (-1,3); valin (-1,5); leucin (-1,8); izoleucin (-1,8); tyrozin (-2,3); fenylalanin (-2,5); tryptofan (-3,4).

Je známo, že aminokyselina může být substituována za jinou, která má podobnou hodnotu hydrofilicity, a tak může být získán biologicky ekvivalentní a zejména imunologicky ekvivalentní protein. Při provádění takových změn jsou s výhodou takové substituce aminokyselin, kde se hodnoty hydrofilicity liší o ±2, substituce s rozdílem ±1 jsou obzvláště výhodné a nej výhodnější jsou substituce s rozdílem ±0,5.

Jak bylo uvedeno, substituce aminokyselin jsou tedy obecně založeny na vzájemné podobnosti aminokyselinových postranních řetězců substituentů, například jejich hydrofobnosti, hydrofilnosti, náboji, velikosti a podobně. Typické substituce, které mají různé z těchto uvedených charakteristik jsou velmi dobře známé odborníkům v daném oboru a zahrnují: arginin a lyzin; glutamát a aspartát; serin a threonin; glutamin a asparagin a valin, leucin a izoleucin.

• · • ··

Následující příklady jsou zde zahrnuty pro ilustraci výhodných příkladů provedení vynálezu. Odborníci ocení, že v následujících příkladech jsou popsané způsoby, které představují postupy, u nichž se ověřilo praktické použití vynálezu a mohou tedy být považovány za ustanovené výhodné způsoby jeho použití. Odborníci však také ocení, že může být provedeno mnoho změn v konkrétních příkladech provedení, které jsou popsány, a tak získat podobný výsledek bez odchýlení od myšlenky vynálezu.

Příklad 1

Izolace B. thuringiensis kmenů EG4550 a EG5899

Práškové vzorky plodiny byly získány z různých zdrojů ze Spojených států a z ciziny, obecně ze skladů obilovin. Práškové vzorky plodin byly ošetřeny a rozprášeny na agarové plotny pro izolaci jednotlivých typů kolonií Bacillus, například B. thuringiensis, jak bylo popsáno v U. S. patentu 5187091, který je zde zařazen tímto odkazem. Pro vizuální určení buněk s krystalickými inkuzemi v koloniích, které vyrostly po ošetření, byla použita fázová kontrastní mikroskopie. Kmeny vytvářející krystaly pak byly charakterizovány pomocí upravené elektroforézy na Eckhardt agarózovém gelu, jak popisuje Gonzalez a kol., (1982). Tento postup umožňuje elektroforézu pole přirozených plazmidů kmene B. thuringiensis. Plazmidová pole mohou být porovnána s těmi, která jsou známa pro B. thuringiensis pro snadnější určení divokých kmenů (Carlton a Gonzalez, 1985).

Kmen EG4550 je krystaly produkující B. thuringiensis kmen izolovaný z New Yorkského prachového vzorku plodiny. Krystalické inkluze sporulovaných EG4550 měly odlišnou morfologii a podobaly se drobným tyčinkám. Plazmidové pole EG4550 se nepodobalo žádnému známému poli B. thuringiensis.

Kmen EG5899 je krystaly produkující B. thuringiensis kmen izolovaný z Kalifornského prachového vzorku plodiny. Krystalické inkluze sporulovaných EG5899 jsou zde neobvyklé, jeví se jako mnohonásobně spojené krystaly s nepravidelnou morfologií. Plazmidové pole EG5899 se nepodobalo žádnému známému poli B. thuringiensis.

Zkouška B. thuringiensis kmenů EG4550 a EG5899 na hmyzu ukázala, že jsou tyto kmeny toxické pro larvální stádium brouků, včetně SCRW, což naznačuje, že krystaly v těchto druzích obsahují nové insekticidní proteiny. EG4550 a EG5899 byly uloženy s ARS Patent Culture Collection a byly označeny NRRL čísla B21784 a B-21783, v tomto pořadí. Tyto kmeny a další kmeny podle vynálezu jsou uvedeny v tabulce 9:

Divoké typy a rekombinantní druhy bakterií

_o

3

o

Ό B s

3 Ί

<D

ex

CU ε

ε

CX

-G £

λ £

B

Ή

1

<!

<

υ

W

ω

ř?

ττ

o

r>

r-

Γ-

r-

Γ-

<D

oC

σΓ

σΤ

σ\

σ-Γ

ΙΖΊ

G

cn

σΊ

CC

CO

co

Γ

Γ-

s

H

Η

o

W

ω

W

j£

§

ř?

m

ř?

ε?

ΜΊ

ε?

ΙΤί

ε?

ιτ>

k**V U

ε?

Ph

00

o

Ο

ι>

ο

r-

ο

Γ~~

ο

Γ-

ο

r-

Ο

ο

Ί-»

_ο.

Γ-

r-

Ο

Ι/Ί

ΙΓ>

u

00

σ>

σ\

CO

Γ“*<

ΗΗ

o

ί-Η

ΙΤΊ

1/Ί

Ο

co

Γ*Ί

Ο

3

Η

<L>

φ

W

PQ

Κ

Φ

>

1

ο.

Λ

Ο,

ο.

Ο.

>>

es

ctí

t—1

ΗΗ

Η-1

t—Η

ΗΗ

o es

ctí

kb

Ι-Η

kb

ΗΗ

-kb

Η-<

-kb

1—1

-kb

1—1

-kb

o

S

'tí

Ηίη

’χί·

.£

<Γ>

Ηίκ

π

.s:

li

W

00

$

00

οο

ΓΠ*

C

ί—Η

σ\

00

σ>

ΠΊ

π

OS

ι-Η

r-H

τ-Η

CC

co

CO

σ\

tí

ϊ-Η

1-Η

,—Η

ί—«

τ—5

N

Ο

Φ

φ

cg

ω

W

CL

£Χ

ο,

ο.

Λ

<<

εο

<Λ §

ΖΛ G

1

§

B

O

¢)

_N

’5c

δ®

Το

δό

§>

£P

urin

ο «0

ο υ

urin

ο υ

urin

κ ·|>» L. 5S

o

ffl

Λ 4-í

α$

Μ

«5

Μ

«5

•S

r-

00

η

o

<Λ

y

O\

σ>

B

S

2

’—ϊ

,-Μ

3

>N

E“<

οί

ctí

jo

o

ο

OS

’Ό

3

>

m

τ—1

Q

>

Γτ

cn

Ο-

00

«—<

CL

Xh

r-

σ>

Q

T-H

Τ-Η

r—(

<Z5

1 <

n

<Ν

OS

>U CL

>o

ffl

ώ

.

ώ

.

<Ν

ΟΊ

σ>

ν/Ί

o

σ\

00

<Ν

C4

OS

CO

ΓΛ

ι/Ί

σ>

*η

0Ί

00

σ\

ΟΊ

in

00

Τ—Η

τ—Η

τ—I

Γ—<

τ-Η

1—Η

Tj

m

Τ-Η

ι-Η

Τ“Η

Τ-Η

τ-Μ

τ—<

2

o

ο

Ο

Φ

φ

0

w

W

ω

W

ω

W

• · • ·· ► · · • · ·· • · ’ • · « » · · · ·

O\


Eryth	Eryth		Eryth		Eryth		Eryth
cryET39, 74	cryET39	cryET69	cryET69	cryET71, 79	cryET71, 79	cryET76, 80, 84	o oo VO r- H £ & 3
T—1 m Ě 34	pEG1915		ΟΊ CO H ffi 34	1	pHT315	1	Γ*Ί Ě 34
H-< x> B 44 cn	HH x a 44 *3 4 κ ί£· ,-T tcj		Mbol část	1	Mbol část	1	Mbol část
pEG1920	pEG1921 i	1	pEG1820	1	pEG1821	1	Γ*Ί CM 00 δ w P.
B. thuringiensis	B. thuringiensis	B. thuringiensis	B. thuringiensis	B. thuringjensis	B. thuringiensis	B. thuringiensis	B. thuringiensis
1	1	30.5.1997	30.5.1997	30.5.1997	30.5.1997 i	12.2.1998	12.2.1998
1	1	B-21786	B-21787	B-21785	B-21788	B-21915	B-21916 '
EGU 936	EG11937	EG4100	EGU 647	EG9444	EG11648	EG4851	EG11658 ^!

><z>

>c <4>

es

Cú

I o

Ό

O >2

4-* X 00

X

O '5?

·’“·) o

•g a

><Λ

C/5

O es /5

23« <D

X ><u

X u

eS

CM

CM c<X>

d

ΪΖ1 d

ΟΊ

C^i

Ctí

Tř

p.

^K<L>

es >S ’Ό o

>U(

P.

<υ 'Sb

O

Ί3 a

cú

Q

CL es p<

CCC

VÍ

G

Ó t

C<>

Ό

O — Jž >§ >N O >c o

JŽ tí

C?

<D ’Ρ <D es o

tz>

Λ

O t?

Ό >

°š <υ ><D

O

Ό

O ε

^02 <3 ε

T3

O

N

Ž >N

O r <

^^2

Ό

O ε

t* >02

O

O ε

N £-*->

ε

-a2

N «2 o

c3 >2 £

>

Jž >>

>

>8 ε

Ό >4h

O <3 £

Č?

£ á

O ε

ε o

§ £

+->

>02

O

Jž ^2 >

-g ε

N >

o

7Š

N

-^2 >

O &, >02 '3 «2

I

N

J02 •3 o

o

-§ >

o

T3 «2 >N

O <D

7Š οι

Os

>

O

N

O >05

O

p.

>c

P, §

JU c

Ό

O

P.

p

Γ2 š

P.

p o

P.

>1-1

P.

P >P

P >N

O a

p

T3 ca

-p

P

P.

o

O

IX

Ctí

O ►

• 1M >N i

>

o s

O

Ό £

ca o

to >P o

P, cn

P ”3

O

T3

O

P.

>P

T3 ca >d

p.

S

P

Ό ’S >

o

P, ca

T3 ca §

j3 ca

N &

Um ><D	P		ctí	O
<ctí > O Um	Um • ^M P 44	>3 -o Om	<υ o Um 3	-&
Gh			CZ)	43
	«Λ o	o	<U >	3
*3	P •p* >tl	Um 0)	1	O 43 O
<D .2	P >	<D >	o N	a
	ca	co	>	s
<ctí §	£	£	>·^Μ P P	P fe
§	O >N	o >N	>N O
ctí		o
a	3	3	3	>

N

P

I o

N >

O

P

P p

>N

O

T3

X5 o

N >

o

P

P >N

O

Ctí §

>N

O

P,

X

O

O.

I

O ”0

1) >N a

co ctí «1—1 &

^5 >>

N >

P

P p

>N

O

T3

X>

p >N

-ca* p

P

I

P

N

P

CD >O

P

CD oa p, °3 i

Ό ca >N o

P.

o

O >p a

>P

P

S o

P

P >fe

S

Ό p

>u

Pd a

P

O

JD

Ό £

SP o

o

P

Ό

P oi

O

P.

O

P.

-§ +->

ε

O rS *3 <u ·'—1 £

CD ti

O

N >

o

P

K <z>

O

P, ca

P

P, o

O ca >>

ID

P ca £

>>

Ό §

P<

JD >P

Ό

O

PE?

>P §

T3

O ><D

P £

ta

P

CD

P

O

Ό •JO tJ

Ž a

§ a

CD >N a

>3 a

Ό

P >tl

P, ca p

o • mM

Q a

P o

£ of .2 ’ο

U

CD li

O

CD

O

Έ

P τΛ §

<υ

CO <2 ^3 o

O

Ό

P >3

P a

Ό ffl

T3

JD

I o

ca p<

P ^ctí

Ό <ctí >P

P, >P o

P,

P o P, o

CD P ca >>

Ό

O

Ό

P <z>

%>

>05 p

£

Ό pq

O

Ό

O

P.

P §

>

O

P a

ctí p

p p

(D >N

O >s a

N >

<D

P

CD >N

O

P '5?

>tl p

>

o a

i o

c <L>

O

Um

-1-M rO

P p

>

Ě?

P >N

3, m

p _u •a a

CZ) <υ >

Tt

O

Ό

1—4

KO d

‘C o

o

Ph o

<D

Um in ca

Ό o

P.

CD

O >C <D >u

P,

O

P

P >

o

P.

d>

T3 a

P

N

CD a

o £

X5

O <u >co >

<u

I ctí

CO

X>

O

O <u i

-S

O x

P fe

Č?

£ o

ΙΓ)

• 44 • · • · ·«	44 4 4	4 4	4 4 4 •	44 4 4 4 4
4 4 4	4	•	•	4 4
44 44	4 4		4 4 4	44

Příklad 2

Vyhodnocení krystalových proteinů EG4550 a EG5899

Kmeny EG4550 a EG5899 byly pěstovány v sporulačním médiu C2 (Donovan a kol., J. Biol. Chem., 263:561-567, 1988) po dobu tří dnů při teplotě 30 °C, během které kultury rostly do stacionární fáze, sporulovaly a lyžovaly, přičemž uvolňovaly do média proteinové inkluze. Kultury byly centrifugovány pro vytěžení buněčných peletů, obsahujících spory a krystaly. Pelety byly promyty suspenzí vrostoku 0,005% triton X-100® a centrifugovány. Promyté pelety byly resuspendovány na jednu desetinu původního objemu v 0,005% triton X-100®.

Krystalové proteiny byly rozpuštěny ze sporokrystalových suspenzí inkubací v solubilizačním pufru [0,14 M Tris-HCl pH 8,0, 2 % (hmotnost/objem) sodiumdodecylsulfát (SDS), 5 % (objem/objem) 2-merkaptoetanol, 10 % (objem/objem) glycerol a 1% blue bromfenolu] při teplotě 100 °C po dobu 5 minul. Rozpuštěné krystalové proteiny byly rozděleny na frakce SDSPAGE na akrylamidovém gelu v koncentraci 12,5 %.

Po rozdělení na frakce podle velikostí byly proteiny vizualizovány barvením Coomassie Brilliant Blue R-250. Vizualizované proteiny kmenu EG4550 s přibližnou molekulární hmotností 45 kDa a 15 kDa. Vizualizované proteiny kmenu EG5899 s přibližnou molekulární hmotností 160 kDa, 45 kDa, 35 kDa a 15 kDa.

Příklad 3

Charakterizace CryET39 krystalového proteinu kmenu EG4550

Byla určena sekvence NH₂-konce přibližně 45 -kDa proteinu EG4550, navrženého CryET39. Sporulovaná kultura EG4550 byla promyta a resuspendována. Krystalové proteiny v suspenzi byly rozpuštěny a umístěny na 10% akrylamidový gel pro provedení SDS-PAGE analýzy. Po elektroforéze proteinů byly přeneseny na BioRad PVDF membránu s použitím standardních postupů westernového přenosu. Poté byla membrána propláchnuta 3x destilovanou vodou a barvena po dobu 1 minuty Amido Black 1013 (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Filtr byl odbarvován po dobu jedné minuty v 5% kyselině octové a pak promyt 3x destilovanou vodou. Část filtru obsahující přibližně 45-kDa CryET39 řetězec byla odstraněna žiletkou. Tímto postupem byla získána čistá forma CryET 39, která byla získána jako proteinový řetězec nanesený na PVDF membráně (BioRed, Hercules, CA)

Určení aminokyselinové sekvence NH₂-konce přečištěného CryET39 proteinu imobilizovaného na membráně bylo provedeno v oddělení fyziologie na Tufts Medical School, • 9 ·· ·· 9

9 ·* • · ·

9 · ·«· ··

9

9 9

9999

9Ί

Boston, MA s použitím standardních postupů Edmanovy degradace. Sekvence NH₂-konce Byla určena takto:

2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Met Leu Asp Thr Asn Lzs Val Tyr Llu Ile Ser Asn His Ala Asn (SEQ ID č. . 20)

Počítačový algoritmus (Korn a Qeen, 1984) byl použit pro srovnání sekvence NH₂-konce CryET39 proteinu s aminokyselinovou sekvencí všech známých B. thuringiensis krystalových proteinů včetně sekvencí všech B. thuringiensis krystalových proteinů, které byly publikovány v odborné literatuře, mezinárodních patentových přihláškách nebo vydaných patentech. Seznam krystalových proteinů, jejichž sekvence byly publikovány a označeny genovou/proteinovou značkou je uveden v tabulce 2.

Příklad 4

Izolace DNA fragmentu obsahujícího CryET39 gen

K určení genu kódujícího CryET39 byla vyvinuta oligonukleotidová sonda specifická pro aminokyselinovou sekvenci NH₂- konce proteinu. Pomocí kodonů, které se typicky nacházejí v B. thuringiensis toxinových genech byl pomocí Integrated DNA Technologies, lne. (Coralville. IA) syntetizován oligonukleotid složený z 41 nukleotidů a označen wd271. Sekvence wd271 je:

5'-ATGTTAGATACAAATAAAGTATATGAAATTTCAAATCATGC-3' (SEQ ID č.: 21)

Radioaktivně označený wd271 byl použit jako sonda v Southemových hybridizačních pokusech, jak bude dále popsáno, k určení restrikčního fragmentu obsahujícího gen cryET39. Kompletní DNA byla extrahována z kmenů EG4550 a EG5899 pomocí následujícího postupu. Vegetativní buňky byly resuspendovány v lyzátovém pufru, který obsahoval 50 mM glukózy, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM EDTA a 4 mg/ml lysozymu. Suspenze byla inkubována při teplotě 37°C po dobu čtyř hodin. Po inkubaci byla suspenze extrahována jednou pomocí stejného objemu fenolu, dále pak pomocí stejného objemu fenol: chloroform : izoamylalkohol (25 : 24 : 1), a jednou pomocí stejného objemu chloroform : izoamylalkohol (24 : 1). DNA byla vysrážena z kapalné fáze přidáním jedné desetiny objemu 3M octanu sodného a potom dvou objemů 100% etanolu. Vysrážená DNA byla shromážděna centrifuováním, promyta 70% etanolem a resuspendována v dH₂O .

Extrahovaná DNA byla poté digerována, v oddělených reakcích, různými restrikčními endonukleázami, včetně EcóRl a HindBl, za podmínek doporučených výrobcem (Promega Corp.. Madison, WI). Digerovaná DNA byla rozdělena na fragmenty podle velikosti elektroforézou na 0,8% agarózovém gelu v IX TBE (0,089 M Tris-borát, 0,089 M kyselina boritá, 0,002 M EDTA) přes noc při napětí 2 volty/cm délky gelu. DNA fragmenty rozdělené na frakce byly poté přeneseny do Millipore Immobilon-NC@ nitrocelulózového filtru (Millipore Corp., Bedford, MA) podle metody Southern (1975). Fragmenty DNA byly fixovány na nitrocelulózu zapečením filtru při teplotě 80°C ve vakuové troubě. Určení fragmentů DNA obsahujících sekvenci kódující NH2konec proteinu CryET39 (viz Příklad 3) bylo dokončena pomocí oligonukleotidu wd271 jakožto hybridizační sondy. Aby byla sonda označena radioaktivně bylo přidáno 1 až 5 pmolů wd271 do reakce, obsahující [γ-³²Ρ]ΑΤΡ (3 μΕ 3000 Ci/mmol na 10 mCi/ml v 20-μ1 objemu reakce), 10X reakční pufr (700 mM Tris-HCl (pH 7,8), 100 mM MgC12, 50 mM DTT), a 10 jednotek polynukleotid kinázy T4 (Promega Corp.). Reakce byla inkubována po dobu 20 minut při teplotě 37°C, aby byl umožněn přenos radioaktivního fosfátu na 5'-konec oligonukleotidu, a tak jej bylo možno využít jako hybridizační sondu.

Označená sonda byla inkubována spolu s nitrocelulózovým filtrem přes noc při teplotě 45 °C v 3X SSC, 0,1% SDS, 10X Denhardtovo činidlo(0,2% BSA, 0,2% polyvinylpyrrolidonu, 0,2% Ficoll®}, 0,2 mg/ml heparin. Po inkubaci byl filtr několikrát promyt v 3X SSC, 0,1% SDS při teplotě 45 °C. Filtr byl vysušen a exponován na Kodak X-OMA TAR film citlivý na radioaktivitu (Eastman Kodak Company, Rochester, NY) přes noc při teplotě -70 °C s DuPont Cronex Lightning Plus filtrem, aby byl získán autoradiogram.

Zkoumáním autoradiogramu bylo identifikováno přibližně 2,5-kb EcoRl fragmentu hybridizujícího na wd271 v DNA z kmenu EG4550. Kmen EG5899 měl přibližně 8,4 kb Hindlíl restrikční fragment, který specificky hybridizuje na označený wd271. Výsledek ukazuje, že jak EG4550 tak EG5899 obsahují příbuzné nebo snad identické, kopie genu cryET39.

Příklad 5- klonování genu CRYET39

První pokusy o klonování zahrnovaly izolaci 2,5-kb EcoRl fragmentu EG4550, kvůli vyjádření a charakteristice EG4550 proteinu CryET39. Když byl tento fragment klonován a vyjádřen v rekombinantním kmenu B. thuringiensism bylo získáno pouze 15 kDa proteinu, což ukázalo, že 2,5-kb EcoRl fragment neobsahuje kompletní a funkční gen cryET39. Tento výsledek také ukazoval, že gen pro 15-kDa krystalový protein a pro CryET39 však jsou velmi podobné.

Rekombinantní kmen B. thuringiensis exprimující 15-kDa protein, určený EG11467, nebyl pro larvy SCR W toxický.

Přibližně 8,4 kb restrikční fragment Hindill obsahující gen cr>ET39 z EG5899 by izolován z kompletní genové DNA, jak bylo popsáno v části 5.4. DNA byla digerována Hindlíl a podrobena elektoforéze přes 0,8% agarózní, IX TBE gel, přes noc, při napětí 2 volty/cm délky gelu. Gel byl barven etidium bromidem, takže digerovaná DNA mohla být vizualizována při expozici dlouhovlným UV světlem. Části gelu obsahující fragmenty DNA velké přibližně 8,0 až 9,0 kb byly odstraněny z gelu pomocí žiletky. Fragmenty DNA byly přečištěny od částí gelu pomocí postupu Geneclean® (Bio 101, Vista, CA).

Izolované fragmenty DNA byly vloženy do fagemidu pBluescript® II SK+ (Stratagene, LaJolla, CA), aby byla vytvořena série v E. coli restrikčních fragmentů Hindlíl vybraných podle velikosti. Fagemidový vektor DNA pBluescript® II SK+ může replikovat velké množství kopií v E. coli a nese gen pro rezistenci proti antibiotiku aplicilin, které lze použít jako kmenotný markér. Fragmenty byly smíchány s digerovaným pBluescript® II SK+, který byl ošetřen bakteriální alkalinfosfátázou (GibcoBRL, Gaithersburg, MD), aby byly odstraněny 5' fosfáty z digerovaného plazmidu a zabránilo se znovu vložení vektoru do sebe sama. T4 ligáza a ligační pufr (Promega Corp.) byly přidány do reakce, která obsahovala digerovaný fagemid a framgenty Hindlíl vybrané dle velikosti. Tyto byly inkubovány při pokojové teplotě podobu 1 hodiny, aby bylo umožněno vložení a připojení fragmentů Hindlíl k vektoru pBluescript® II SK+.

Ligační směs byla vložena do buněk E. coli DH5a™ (GibcoBRL) odpovědných za transformaci, podle postupů popsaných výrobcem. Transformované buňky E. coli byly pěstovány na LB agarových plotnách obsahujících 50 pg/ml aplicilinu a byly přes noc inkubovány při teplotě 37 °C. Růst několika stovek kolonií rezistentních na aplicilinu na každé plotně indikoval přítomnost rekombinantních plazmidů v buňkách každé z těchto kolonií.

Aby bylo možno izolovat kolonie, ve kterých se nalézaly klony 8,4-kb fragmentu T/zfrtňlI obsahující gen cryET39, byly kolonie nejprve přeneseny do nitrocelulózních filtrů.Toho bylo dosaženo umístěním kruhového filtru (Millipore HATF 085 25, Millipore Corp., Bedford, MA) přímo na povrch LB-aplicilinových agarových ploten, které obsahovaly transformované kolonie. Když byl filtr pomalu sloupnut z ploten, kolonie ulpěly na filtru a vytvořiti přesnou repliku vzorů kolonií na originální plotně. Na plotnách bylo ponecháno dostatek buněk v každé kolonii, které během 5 až 6 hodin růstu při teplotě 37 °C kolonie obnovily. Plotny byly poté uloženy při teplotě 4°C. Nitrocelulózní filtry s přenesenými koloniemi byly umístěny, stranou s koloniemi nahoře, na • »· 4 4 » ·· • · 4 4 4 4 4 ····

4 4 4 44 · 4· ·

444444 · · 4 4 4

444 44 4 444

444 44 44 444 ·· 4444

100 čerstvé LB-aplicilinové agarové plotny a byl jim umožněn růst při teplotě 37°C, dokud kolonie nedosáhly přibližně průměru 1 mm.

K uvolnění DNA z rekombinantních buněk E. coli byly nitrocelulózové titry umístěny (stranou s koloniemi vzhůru) na 2 listy chromatografického papíru Whatman 3MM (Whatman International Ltd., Maidstone, England) nasycené 0,5 M NaOH, 1,5 M NaCl po dobu 15 min. Toto ošetření lyžovalo buňky, denaturovalo uvolněnou DNA a ta ulpěla na nitrocelulózovém filtru. Filtry byly poté neutralizovány umístěním filtrů, stranou s koloniemi nahoru) na 2 listy Whatmanova papíru nasyceného 1 M acetátem amonným, 0,02 M NaOH po dobu 10 min. Filtry byly poté promyty v 3X SSC, vzduchem vysušeny u zahřívány po dobu 1 hodiny při teplotě 80°C ve vakuové troubě, aby byly připraveny na hybridizaci.

NH2- konec oligonukleotidu specifický pro gen czyET39, wd271, byl označen na 5' konci pomocí γ-32Ρ a T4 polynukleotidkinázy, jak bylo popsáno dříve. Označená sonda byla přidána k filtrům v 3X SSC, 0,1% SDS, 10X Oenhardtovo činidlo(0,2% BSA, 0,2% polyvinylpyrrolidon, 0,2% Ficoll®), 0,2 mg/ml heparinu a inkubována přes noc při teplotě 40°C. Tyto podmínky byly zvoleny, aby byla umožněna hybridizace označeného oligonukleotidu na příbuzné sekvence přítomné na nitrocelulózových přenosech kolonií transformované E. coli. Po inkubaci byly filtry několikrát promyty v 3X SSC, 0,1% SDS při teplotě 45°C. Filtry byly vysušeny a exponovány na film Kodak X-OMA TAR citlivý na radioaktivitu (Eastman Kodak) přes noc při teplotě -70 °C s DuPont Cronex Lightning Plus filtrem.

Několik kolonií z této transformace hybridizovalo na wd271. Tyto kolonie byly identifikovány vyrovnáním signálů na autoradiogramu s koloniemi na původních transformačních plotnách. Izolované kolonie byly poté pěstovány v LB aplicilinovém kapalném médium, ze kterého mohly být získány buňky a připraven rekombinantní plazmid standardním postupem alkaline-lysis miniprep proceduře (Maniatis a kol., 1982). Izolované plazmidy byly digerovány pomocí restrikčního enzymu HindOl, který indikoval, že klonované fragmenty DNA EG5899 mají očekávanou velikost, tj. 8,4-kb. Plazmid DNA digerovaný pomocí Hindlll ze šesti hybridizujících kolonií byl podroben elektroforéze přes agarózní gel a přenesen na nitrocelulózu, jak je bylo popsáno dříve. Poté byl hyhridizován pomocí oligonukleotidu wd271, který byl dříve radioaktivně označen na 5' konci pomocí γ-³²Ρ a T4 polynukleotid kinázy. Přibližná velikost 8,4-kb inzertovaných fragmentů ze všech šesti digerovaných plazmidů hybridizovaných pomocí wd271 potvrdilo přítomnost genu cryET39. Jeden z těchto plazmidů s 8,4 kb vloženou částí obsahující cryET39 gen byl označen pEG1319. KmenE. coli obsahující pEG1319 byl označen EG11521.

101

Příklad 6 - exprese rekombinantního proteinu z EG11529

Pro charakterizování vlastností proteinu CryET39 bylo nutné exprimovat klon genu cryET39 v buňkách B. thuringiensis, který nevytváří krystalové proteiny (Cry). Abychom toho dosáhli, byl klonovaný 8,4-kb fragment Hindlll fragment z pEG1319 vložen do plazmidu schopného replikace v B. thuringiensis, a tak byla umožněna exprese genu cryET39 a vytvoření vněm kódovaného proteinu.

pEG1319 byl digerován pomocí Hindlll a byl vydělen klonovaný 8,4 kb fragment. Digerovaný plazmid byl rozpuštěn na agarózním gelu a kus gelu obsahující 8,4 kb fragment byl oddělen. 8,4-kb fragment Hindlll byl vyčištěn od gelu pomocí postupu GeneClean proceduře (BiolOl). Fragment byl vložen do B. thuringiensis/E. coli kyvadlového vektoru, který byl digerován pomocí Hindlll a ošetřen pomocí bakteriální alkalinové fosfátázy.. Tento kyvadlový vektor, označený jako pEG597, popsal Baum a kol.., (1990). pEG597 je schopen replikace jak v E. coli tak v B. thuringiensis, propůjčujíc to E. coli resistenci aplicilin a B. thuringiensis rezistenci na chloramfenikol. Ligační roztok byl vpraven do buněk E. coli DH5a™ pomocí transformačního postupu popsaného výrobcem (GibcoBRL). Plazmidová DNA byla připravena z Apm^Rtransformantlů a byla provedena analýza restrikčních enzymů pro ověření správné konstrukce. Plazmid obsahující 8,4-kb fragment Hindlll byl vložen do vektoru pEG597 a označen pEGl321. Kmen A. coli přechovávající pEG1321 byl označen EG11525.

pEG1321 byl vpraven do Cry kmenu B. thuringiensis EG10368 pomocí elektroforézy(Macaluso a Menus, 1991). Buňky transformované na odolnost na chloramfenikol byly vybrány pomocí inkubace přes noc na LB agarových plotnách, které obsahovaly 3 pg/ml chloramfenikol. Plazmidová DNA byla izolována z několika transformantů B. thuringiensis. Izolované plazmidy byly digerovány pomocí Hindlll a podrobeny elektroforéze pře agarózní gel. Všechny transformanty měly restrikční fragmenty odpovídající 8,4 kb fragmentu cryET39 a vektoru pEG597. Pro ověření správné konstrukce plazmidu byly restrikční fragmenty přeneseny na nitrocelulózní filtr, který byl poté hybridizován pomocí oligo wd271 specifického pro cryET39, jak bylo uvedeno dříve. Sonda wd271 hybridizovala skloňovanými 8,4 kb fragmenty Hindlll a potvrdila, že pEG1321 obsahuje gen cryET39 a že tento byl úspěšně vpraven do B. thuringiensis. Rekombinantní kmen B. thuringiensis obsahující pEG1321 byl označen EG11529. EG11529 byl uložen do NRRL a bylo mu přiděleno pořadové číslo 8-21917.

102

EG 11529 byl pěstován v DSM + glukózu obsahujícím sporulačním médiu, obsahujícím 5 pg/ml chloramfenikolu [0,8% (hmotnost/objem) živném médiu, 0,5% (hmotnost./objem.) glukózy, 10 mM K2HPO4, 10 mM KH2PO4, 1 mM CafNChK 0,5 mM MgSO₄, 10 μΜ MnCl₂, 10 μΜ FeSO₄) po dobu tři dní při teplotě 30 °C, během které kultura rostla dostacionární fáze, sporulovala, lyžovala, a tak uvolnila proteinové inkluze do média. Kultury byly získány centrifugováním. Pelet tvořený sporami a proteinovými krystaly byl promyt v roztoku 0,005% Triton X-100®, 2 mM EDTA a centrifugován. Promytý pelet byl suspendován při jedné desetině původního objemu v 0,005% Triton X-100®, 2 mM EDTA.

Krystalové proteiny byly rozpuštěny z sporo-krystalové suspenze inkubováním suspenze v solubilizačním pufru. [0,14 M Tris-HCl pH 8,0, 2% (hmotnost/objem) sodium dodecyl sulfát (SDS), 5% (objem/objem) 2-merkaptoetanol, 10% (objem/objem) glycerol a 0,1% bromfenol blue] při teplotě 100°C po dobu 5 min. Rozpuštěné krystalové proteiny byby rozděleny na frakce podle velikosti pomocí SDS-PAGE. Po rozdělení na frakce podle velikosti byly proteiny vizualizovány obarvením pomocí Coomassie Brilliant Blue R-250. Tato analýza ukázala, že kmen EG11529 produkoval tři různé krystalové proteiny. Mimo 44-kDa CryET39 toxinu byly vytvořeny i polypeptidy o přibližně 15- a 35-kDa.

35-kDa krystalický protein exprimovaný v B. thuringiensis EG11529 mohl být separován z 44-kDa (CryET39) and 15-kDa proteinů pomocí centrifugo vání přes sacharózový gradientový krok (kroky: 55%, 68%, 72%, 79% ) jak je popsáno v sekci 5.12.Určení sekvence aminokyselin NH2konce izolovaného 35-kDa proteinu bylo dosaženo pomocí postupů popsaných v sekci 5.3. Sekvence aminokyselin NH2- konce 35-kDa proteinu byla určena následovně:

SILNLQDLSQKYMTAALNKI (SEQ ID č.: 22)

Srovnání NH2- konce 35-kDa proteinu s předpokládanou sekvencí aminokyselin CryET39 potvrdilo, že nejde o formu proteinu CryET39. Přibližně 35 kDa protein byl označen CryET75 a gen, který ho kóduje (který je v 8,4-kb fragmentu z EG5899) byl označen cryET75.

Sacharózní gradientová frakce obsahující CryET39 obsahuje také přibližně 15-kDa protein, označený jako CryET74. Sekvence aminokyselin NH2- konce proteinu CryET74 byla určena podobně jak je popsáno pro for CryET39 v sekci 5.3. . Sekvence aminokyselin NH2- konce izolovaného proteinu CryET74 byla určena následovně:

SARQVHIQINNKTRH (SEQ ID č.:23) • ftft · · · ·· · · ftft· ··· ft··· • ftftft ftft · ftft ♦

103

Srovnání této sekvence se sekvencemi proteinů CryET39 a CryET75 ukázalo, že CryET74 je unikátní pretein kódovaný třetím genem, označeným cryET74, který byl obsažen v 8,4-kb ve fragmentu HiruAll klonovaném z EG5899.

Příklad 7- sekvencování CRY genů a určování sekvencí aminokyselin jimi kódovaných polypeptidů.

K usnadnění sekvencování genů cryET39, cryET74 a cryET75 byl 8,4-kb fragment HincRll pEG1319 subklonován do 77/>z<71II-digerovaného pUCl8 (Yanisch-Perron a kol., 1985). Tento plazmid byl označen jako pEG1337, a je zobrazen na obrázku 1.

Přípravy pEG1337 dvouřetězcové plazmidové matrice DNA bylo docíleno pomocí buď standardní alkalické lyže nebo a použitím Qiagen Plazmid Kitu (Qiagen lne., Chatworth, CA) podle postupů výrobce. Sekvencovací reakce byly provedeny s využitím Sequenase™ Version 2.0 DNA Sequencing Kitu (United States Biochemical/Amersham Life Science lne., Cleveland, OH) podle postupů výrobců a pomocí ³⁵S-[dATP] jako značkovacího isotopu (DuPont NEN Research Products, Boston, MA). Denaturování gelové elektroforézy reakcí bylo provedeno na 6% (hmotnost/objem) akrylamidu, 42% (hmotnost/objem) močovinový gel pro sekvencování. Vysušený gel byl exponován na film Kodak X-OMA TAR citlivý na radioaktivitu(Eastman Kodak) přes noc při pokojové teplotě.

Oligonukleotid specifický pro NH2- konec, wd271, byl použit jako iniciační sekvencovací primer. Úplná sekvence pro gen cryET39 byla určena pomocí postupů popsaných dříve. Následné oligonukleotidy, které byly použity pro začátek sekvencovacích reakcí byly určeny na základě dat z předchozích skupin reakcí. Tímto způsobem pokračovalo sekvencování DNA podél horního i spodního řetězce genu cryET39 v rozumných krocích.

Oligonukleotidový primer, založený na sekvenci aminokyselin NH2- konce proteinu CryET75 byl protein určený pro použití při sekvencování genu cryET75. Oligonukleotid byl označen MR51 měl následující sekvenci:

5-TCACAAAAATATATGAACAGC-3' (SEQID č.:24)

Pomocí dříve uvedený postupů pro sekvencování DNA byla určena částečná sekvence nukleotidů genu cryET75, zbytek byl určen pomocí automatizovaného sekvencování. Vzorky DNA byly sekvencovány pomocí ABI PRISM® DyeDeoxy sequencing chemistry (Applied Biosystems, lne., CA) podle protokolu výrobce.

Úplné reakce byly prováděny na automatickém sekvenceru DNA ABI 377. Data sekvencí DNA byly analyzovány pomocí Sequencher v3.0 DNA analysis software (Gene Codes Corporation,

104

Ann Arbor, MI). Sekvence aminokyselin proteinu CryET75 byla pak odvozena přepisem otevřeného čtecího rámce cryET75. Určená sekvence NH2- konce CryET75 byla identifikována pomocí sekvence aminokyseliny NH2- konce odovozené ze sekvence nukleotidu. Studie, ve kterých 8,4-kb fragment HindOA z EG11529 byl dále digerován a fragmenty subklonovány pro exprimaci genů krystalových proteinů, individuálně nebo v kombinaci jsou popsány v sekci 5.11. Exprese proteinu CryET39 byla závislá na klonování genu cryET74 ve stejném restrikčním fragmentu. To by se dalo vysvětlit tak, že gen cryET74 je umístěn proti směru transkripce genu cryET39 a že promotor pro cryET74 také určuje směry exprese cryET39. Oligonukleotidy specifické pro sekvence DNA 5' konce k začátku genu cryET39 byly určeny jako primery pro automatické sekvencování. Následné primery byly určeny v závislosti na datech odvozených z každé ze sad sekvencovaních reakcí. Tímto způsobem pokračovalo sekvencování DNA proti směru transkripce genu cryET39 v rozumných krocích.

Přepis sekvence DNA odkryl otevřený čtecí rámec kódující protein CryET74. Zkoumáním odvozené sekvence aminokyselin byla nalezena oblast identická k určené sekvenci aminokyselin NH2- konce CryET74, identifikující otevřený čtecí rámec jako gen cryET74.

CRYET39

Sekvence DNA genu CryET39 je prezentována SEQ ID č.:7 a kóduje sekvenci aminokyselin polypeptidů CryET39 polypeptidů, vyjádřeného SEQ ID č:8.

Charakteristiky polypeptidů CRYET39 izolovaného z EG5899

Polypeptid CryET39 obsahuje 385 sekvencí aminokyselin, má kalkulovanou molekulovou hmotnost 44246 Da a má kalkulovanou izoelektrickou konstantu (PI) rovnu 5,47. Aminokyselinová kompozice polypeptidů CryET39 je v tabulce 11.

Tabulka 11

Aminokyselinová kompozice CRYET39

Aminokyselina	# zbytků	% všech	aminokyselina	# zbytků	% všech
Ala	6	1,5	Leu	33	8,5
Arg	3	0,7	Lys	39	10,1
Asn	31	8,0	Met	8	2,0

• ·» · ·· ·· ·· · · · ·· ···· ···· ·· · · · ·

105

Asp	23	5,9	Phe	6	1,5
Cys	2	0,5	Pro	16	4,1
Gin	17	4,4	Ser	30	7,7
Glu	27	7,0	Thr	36	9,3
Gly	19	4,9	Trp	7	1,8
His	8	2,0	Tyr	24	6,2
Iie	32	8,3	Val	18	4,6

Kyselé (Asp + Glu) 50

Bazické Aromatické Hydrofobní	(Arg + Lys) 42 (Phe + Trp + Tyr) 37 (Aromatické + lle + Leu + Met + Val)	126
CRYET74

Sekvence DNA genu CryET74 je prezentována SEQ ID č.:5 a kóduje sekvenci aminokyselin polypeptidu CryET74 polypeptidu, vyjádřeného SEQ ID č:6.

Charakteristiky polypeptidu CRYET74

Polypeptid CryET74 obsahuje 119 sekvencí aminokyselin, má kalkulovanou molekulovou hmotnost 13221 Da a má kalkulovanou izoelektrickou konstantu (PI) rovnu 6,21. Aminokyselinová kompozice polypeptidu CryET74 je v tabulce 12.

Tabulka 12

Aminokyselinová kompozice CRYET74

Aminokyselina	# zbytků	% všech	Aminokyselina	# zbytků	% všech
Ala	4	3,3	Leu	6	5,0
Arg	6	5,0	Lys	7	5,8
Asn	6	5,0	Met	2	1,6
Asp	7	5,8	Phe	4	3,3
Cys	1	0,8	Pro	3	2,5
Gin	3	2,5	Ser	13	10,9

• ·· ·♦ r ·· »· tt · ···· · · · · • ··» · · · · * ·

	106	··· ··	·· »·»
Glu	8	6,7	Thr	12	10,0
Gly	10	8,4	Trp	1	0,8
His	5	4,2	Tyr	4	3,3
Ile	9	7,5	Val	8	6,7
Kyselé		(Asp + Glu)			15
Basic		(Arg + Lys)			13
Aromatické		(Phe + Trp + Tyr)			9
Hydrofobní		(Aromatické + Ile + Leu + Met + Val)	34

CryET75

Sekvenci DNA genu CryET75 vyjadřuje SEQ ID č.:15 a kóduje sekvenci aminokyselin polypeptidů CryET75 polypeptidů, vyjádřeného SEQ ID č: 16.

Charakteristiky polypeptidů CryET75

Polypeptid CryET75 obsahuje 310 sekvencí aminokyselin, má kalkulovanou molekulovou hmotnost 34259 Da a má kalkulovanou izoelektrickou konstantu (PI) rovnu 5,67. Aminokyselinová kompozice polypeptidů CryET75 je v tabulce 13.

Tabulka 13

Aminokyselinová kompozice CryET75

Aminokyselina	# zbytků	% všech	Aminokyselina	# zbytků	% všech
Ala	15	4,8	Leu	24	7,7
Arg	5	1,6	Lys	29	9,3
Asn	15	4,8	Met	7	2,2
Asp	17	5,4	Phe	11	3,5
Cys	2	0,6	Pro	9	2,9
Gin	11	3,5	Ser	34	10,9
Glu	22	7,0	Thr	33	10,6
Gly	17	5,4	Trp	1	0,3
His	6	1,9	Tyr	11	3,5

« ·« • · · • ··* • · · • · · «·· ··

9 9

9

9 9 • » »· · a·

9 9 · • 9 9

9 9

9999

107

Ile	22	7,0 Ví
Kyselé	(Asp + Glu) 39
Bazické	(Arg + Lys) 34
Aromatické	(Phe + Trp + Tyr)	23
Hydrofobní	(Aromatické + Ile + Leu + Met + Val)

Příklad 8 -analýza homologie pro CryET39

Odvozená sekvence aminokyselin proteinu CryET39 byla použita pro hledání příbuzných proteinů v elektronické databázi sekvencí. Byla prohlížena databáze The SWISS-PROT ALL (swan) pomocí FASTA verze 3.15 (Pearson and Lipman, 1988) na serveru FASTA v European Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk) s následujícími parametry (matrix = paml50, ktup =

2. gapcost = -12. gapxcost = -2). Výsledky hledání v databázi ukázaly, že CryET39 vykazuje ~25% shodnost sekvence aminokyselin v oblasti 322 aminokyselin s 42 kDa moschitocidalním krystalovým proteinem z B. sphaericus. CryET39 také vykazuje ~20% shodnost sekvence v oblasti 343 aminokyselin s 51 kDa krystalovým protein z B. sphaericus. Žádné jiné sekvence proteinů v databázi nevykazovaly žádnou významnou podobnost sekvencí se sekvencí CryET39. Sekvence aminokyselin CryET39 byla také použita pro vyhledávání v non- redundant (nr) databazi National Center Biotechnology Information (NCBI) pomocí BLASTP version 2,0 (Altschul a kol., 1997) s následujícími parametry: matrix = blosum62, gapped alignment. ostatní parametry = výchozí nastavení. Nr databáze obsahuje záznamy sekvencí z PDB, SWISS-PROT, PIR a CDS translations of GenBank. Výsledky hledání byly v souladu s výsledky získanými pomocí FASTA.

Příklad 9- hledání v databázích proteinů souvisejících s CryET74

Také odvozená sekvence aminokyselin CryET74 byla použita pro vyhledávání v databázích SWISS-PROT ALL a nr pomocí FASTA a BLASTP, jak je popsáno v sekci 5.8. Nebyly nalezeny žádné proteiny vykazující podstatnou podobnost sekvence s CryET74.

Příklad 10 - hledání v databázích proteinů souvisejících s CryET75

Také odvozená sekvence aminokyselin CryET75 byla použita pro vyhledávání v databázích SWISS-PROT ALL a nr pomocí FASTA a BLASTP, jak je popsáno v sekci 5.8. Hledání pomocí

• · • 4 • ·

108

FASTA odhalilo, že CryET75 vykazuje 28,1% podobnost sekvence s Cryl5Aa (Genbank, pořadové číslo M76442) v oblasti 121 aminokyselin. Analýza pomocí BLASTP odhalila 23% podobnost sekvence identity v oblasti 231 aminokyselin.

Příklad 11

Subklonování a exprese CryET39 a CryET74 genů Sacharózová gradientní frakce parasporálních krystalů získaná z lyžovaných kultur kmenu EG11529 obsahovala jak CryET39 tak CryET74 polypeptidy. Test vyhodnocující přípravek CryET39 a CryET74 ukázal, že tento přípravek je stejně toxický pro WCRW larvální stádium jako celý krystalový protein připravený z EG11529. Pro určení insekticidní účinnosti CryET39 proteinu samotného bylo nezbytné klonovat cryET39 gen po směru od jiného promotoru. Jak bude dále popsáno, bylo toho dosaženo použitím PCR™, amplifikací promotorové oblasti pro B. thuringiensis krystalický protein, Cry2Ac (Wu a kol., 1991) a jeho umístěním proti směru PCR™ amplifikovaného CryET39 genu v kyvadlovém vektoru, čímž byla umožněna exprese pouze CryET39 proteinu v rekombinantním kmenu B. thuringiensis.

Oligonucleotidy byly navrženy pro použití ve funkci primerů v PCR™ amplifikací a následném klonování řídící oblasti cry2Ac genu; včetně otevřených čtecích rámců ORF1 a ORF2, vazebného místa pro ribozom a startovacího kodonu pro cry2Ac. Oligo mr47 obsahuje AcoRI restrikční místo 2124 párů bází proti směru od startovacího kodonu cry2Ac kódující oblasti. Sekvence mr47 je:

5’-ATATCTATAGAATTCGCAATTCGTCCATGTG-3' (SEQ ID č.: 25)

AcoRI

Komplementární oligonukleotidový primer, mr43, sestává z obrácené komplementární sekvence pro ribozomové vazebné místo a startovací kodon (Met) pro cry2Ac gen. Hincfíll místo bylo vloženo mezi RBS a Met kodon pro umožnění inzerce sekvence cryET39 genu do rámce. Sekvence mr43 je:

5'-CAGTATT CAT AT AAGCTTCCTCCTTTAATA-3' (SEQ ID č.: 26)

Met Hincfíll RBS

PCR™ reakce pro amplifikací cryET39 genu zahrnuje následující: čtyři deoxynukleozidtrifofáty -dATP, dTTP, dCTP, dGTP- v konečné koncentraci 200 μΜ; 5 μΐ 10x Taq Extender™ pufru (Stratagene Cloning Systems) v konečné koncentraci lx; 10 ng pEG1273, který sestává zpUC18 do něhož byl klonován cry2Ac gen; oligonukleotidové primery mr47 a mr43

• ··

109 v konečné koncentraci 2,5 μΜ každý; 2,5 jednotky Taq ExtenderTM (Stratagene Cloning Systems); 2,5 jednotky Taq Polymerase (Promega Corp.); a dH₂O v konečném objemu reakce 50 μΐ. Reakce probíhala v PowerBlock™ EasyCycler™ Series teplotním cykleru (Ericomp, lne., San Diego, CA). Podmínky cyklování byly následující: dvouminutový denaturační krok při teplotě 94 °C, poté 30 cyklů teploty 94 °C po dobu 1 minuty, teplotní hybridizace při teplotě 50 °C po dobu 1 minuty a prodlužování při teplotě 72 °C po dobu 2 minut. Po cyklování bylo 5 μΐ reakční seměsi podrobeno elektroforéze na 0,8% agarózovém gelu, aby se ověřilo, že byl pomocí PCR™ vytvořen přibližně 2kb produkt. Zbytek produktu reakce byl přečištěn QIAquick™ rotačním sloupcem podle návodu výrobce (QIAGEN, lne.).

PCR™ amplifikovaný cry2Ac promotor byl pak klonován do E. coli/B. thuringiensis kyvadlového vektoru pHT315 (Arantes and Lereclus, 1991). Bylo toho dosaženo digescí obou pHT315 a PCR™ produktů v oddělených reakcích s restrikční mi enzymy AcoRI and Hindtíl. Tyto enzymy stříhaly v mnohonásobně klonované oblasti pHT315 a blízko konců PCR™ produktu, v sekvencích specifikovaných oligonukleotidy mr47 a mr43. Digerovaný PCR™ produkt byl izolován pomocí průběhu reakce na agarózovém gelu a přečištěním přibližně 2-kb fragmentu s použitím Geneclean© postupu (Bio 101). Digerovaný pHT315 byl přečištěn podobným způsobem. Fragment byl poté vložen do digerovaného pHT315 v reakci zahrnující T4 DNA ligázu a ligační pufr (Promega Corp.).

Ligační směs byla vložena do transformačně kompetentních E. coli DH5a™ buněk (GibcoBRL) Podle postupu uvedeného výrobcem. E. coli buňky byly rozprostřeny na LB agarové plotny kontaminované 50 μg/ml ampicilinu a inkubovány přes noc při teplotě 37°C. pHT315 obsahuje gen, který poskytuje rezistenci proti ampicilinu rekombinantním buňkám, do kterých byl úspěšně vpraven. Plazmid DNA byl připraven z několika k ampicilinu rezistentních klonů a digerován s AcoRI and HincRIl, aby byla potvrzena přítomnost 2-kb inzertu. Jeden z těchto plazmidů označený pEG 1915, byl použit pro klonování a expresi cryET39 genu.

PCR™ byla použita pro amplifikaci cryET39 z klonovaného 8,4-kb Hindlli fragmentu v pEG1337. Oligonukleotidové primery byly označeny pro usnadění inzerce cryET39 do pEG1915, takže gen nemohl být exprimován z cry2Ac promotoru. cryET39-specifický oligonukleotid, mr44, obsahuje startovací kodon (Met) pro cryET39 s Hindlli místem konstruovaným 5' ke startovacímu kodonu. Sekvence mr44 je:

5-AAGGTGAAGCTTTTATGTTAGATACTAATAAAGTTTATG-3¹ (SEQIDč.: 27)

Hind ΠΙ

Met • · · · ·

110

Kmený primer, označený mr45, byl určen jako komplementární k sekvenci 212 párů bází 3' do konce cryET39 kódující oblasti. Hindlll místo bylo včleněno do sekvence mr45. 5'-CCGGAATAGAAGCTTTGCATATGG-3' (SEQ ID č.: 28)

Hindlll cryET39 PCR™ produkt obecně používající mr44 a mr45 jako primery byl stříhán Hindlll a inzertován do Hindlll místa specifikovaného mr43 vplazmidu pEG 1915. To umisťuje Met kodon cryET39 genu 7 párů bází po směru od vazebného místa pro ribozom klonovaného cry2Ac promotoru. Očekávalo se, že taková konfigurace umožní významnou expresi rekombinantního CryET39 proteinu. Ligační reakce, která byla poté zahájena, aby byl inzertován cryET39 gen do pEG1915 byla použita pro transformaci E. coli DH5a™ na rezistenci proti ampicilinu. Byl připraven plazmid DNA a podroben analýze restrikčními enzymy pro určení klonu, ve kterém cryET39 gen byl inzertován do pEG1915 ve správné orientaci. Bylo nezbytné, aby byl pozitivní řetězec cryET39 orientován ve stejném směru jako řetězec cry2Ac regulační oblasti pro získání významné transkripce. Restrikční výběry používající enzymy uvedené v obrázku 2 určily plazmid obsahující cryET39 ve správné orientaci. Tento plazmid byl označen pEG1921.

Cry kmen B. thuringiensis byl transformován na rezistenci proti erytromycinu vložením pEG1921. Tento rekombinantní kmen, označený EG11937, byl pěstován v C2 sporulačním médiu až do té doby než začala sporulace a začaly se vytvářet krystaly. Fázová kontrastní mikroskopie v kultuře jasně určila krystalické inkluze ve tvaru podlouhlých pravoúhelníků nebo jehel. Spory, krystaly a nelyžovaná sporangia byly vyněženy centrifugací. Materiál ve formě peletu byl promyt dvakrát v roztoku 0,005 % Triton X- 100®, 10 mM Tris-HCl pH7,5 a suspendován na polovinu původního objemu v promývacím roztoku.

SDS-P AGE bylo použito pro vizualizaci proteinu v krystalu. 25 μΐ 0,5 N NaOH bylo přidáno do 100 μΐ vzorku pro inhibici proteolytické aktivity, která může zničit protein, protože krystal je rozpuštěn. Po 2,5 min při pokojové teplotě bylo přidáno 65 μΐ 3X Laemmli vzorkového pufru (30% glycerol, 15% 2-merkaptoetanol, 3% SDS, 0,1875 M Tris, 0,01% bromfenol blue) do vzorku. Vzorek byl zahřát na teplotu 100°C po dobu 5 minut, krátce centrifiigován pro odstranění nerozpustného materiálu a uložen na akrylamidový gel. Proteinové pásy byly vizualizovány barvením Coomassie Brilliant Blue R-250. Tato analýza ukázala, že EG 11937 exprimuje 44-kDa CryET39 protein a neexprimuje 13-kDa (CryET74) nebo 34-kDa (CryET75) proteiny produkované rekombinantním kmenem EG11529. Pomocí PCR™ vytvořená kopie cryET39 genu v pEG1921 byla sekvencována pro potvrzení doměnky, že byla identická s kopií divokého typu pEG1337.

111

Kmen EGI1937 byl pěstován a připraven pro testování na WCRW larvální stádium. Překvapivě neměl krystalový protein z EG11937 žádný účinek na hmyz. Tento výsledek ukazuje, že buď CryET39 protein vyžaduje přítomnost CryET74, aby byl toxický nebo že CryET74 je aktivní toxický protein.

pEG1337 byl digerován s restrikěními enzymy Hindlll aEcoRl, aby uvolnil přibližně 3,2-kb fragment obsahující cryET74 gen a pouze malou část cryET39 genu. Tento fragment byl izolován na agarózovém gelu, přečištěn a klonován do kyvadlového vektoru pHT315, digerovaného s Hindlll a AcoRI, s použitím postupů, které byly dříve popsány. Tento plazmid, označený pEG1919, byl vložen do Cry' B. thuringiensis kmenu, EG10650, elektroporací, transformací rekombinantních buněk na rezistenci k erytromycinu. Jeden transformant, označený EG11935, byl pěstován v C2 sporulačním médiu pro určení, zda klonovaný cryET74 gen může řídit expresi krystalového proteinu. Kultura byla vytěžena a krystalový protein analyzován pomocí SDS-PAGE jak bylo popsáno dříve. EG11935 produkoval pouze CryET74 a neměl žádný účinek na larvální stádium WCRW.

Pozorovaná skutečnost, že CryET39 a CryET74, v tomto pořadí, nemají žádný účinek na larvální stádium WCRW, ukazuje, že tyto dva proteiny spolu reagují, aby vytvořily toxickou proteinovou kompozici. PCR™ Byla použita pro získání DNA fragmentu obsahujícího geny pro CryET39 a CryET74, ale ne gen pro CryET75, který je také přítomen na 8,4-kb fragmentu EG1337 (viz mapa pEGI337). m 13/pUC dopředný sekvencovací primer, (GibcoBRL) a mr45 byly použity pro amplifikaci přibližně 3,7-kb produktu, který obsahoval cryET74 a cryET39. PCR™ byla provede za podmínek, které byly dříve popsány při použití pEG1337 jako matrice. PCR™ produkt byl přečištěn gelem, digerován s Hindlll a klonován do pHT315, který byl stříhán pomocí Hindlll a reagoval s bakteriálním alkalickým fosfátem. Výsledný plazmid, označený pEG1920, byl použit pro transformaci Cry' B. thuringiensis kmenu, EG 10650, na rezistenci proti erytromycinu. Jeden rekombinant, označený EG11936, byl pěstován pro zkoušku na produkci krystalového proteinu. EG11936 produkoval jak 44-kDa CryET39 tak přibližně 13-kDa CryET74 polypeptidy. krystalové proteiny tvořené EG11936 měly účinek na WCRW larvální stádium srovantelný s účinkem pozorovaným u rekombinantního kmenu EG11529.

Příklad 12

Toxicita krystalových proteinů pro hmyz

Toxicita EG11529 krystalových proteinů pro SCRW larvální stádium • ·

112

Toxicita pro SCRW larvální stádium (Diabrotica undecimpunctata howardí) byla určena pro rekombinantní kmen EGU 529, který exprimoval CryET39, CryET74 a CryET75 polypeptidy.

EG11529 byl pěstován v C2 médiu při teplotě 30 °C po dobu 3 dnů dokuk nezačala sporulace a lyže. Kultuty byly vytěženy centrifugací, promyty dvakrát v IX původní objem 0,005% Triton X-100® a suspendován v 1/10 objemu původní kultury 0,005% Triton X- 100®. Pro srovnání EG11535 a rekombinantní B. thuringiensis kmen exprimující protein toxický pro brouky Cry3B2 (Donovan a kol., 1992) byl pěstován a vytěžen stejným způsobem. SDS-PAGE bylo použito pro vizualizaci proteinů. Proteiny byly kvantifikovány srovnáním se standardním loadingem známých množství hovězího sérového albuminu (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) s použitím Computing Densitometer, Model 300A, (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA), podle návodu výtobce

SCRW larvální stádium bylo testováno pomocí povrchově kontaminované umělé potravy podobně jak popsal Marrone a kol., (1992), ale bez formalinu. Každý test sestával z osmi sérií vodného ředění s množstvími aplikovanými na povrch potravy. Po ředění (vodný 0,005% Triton X100® roztok) byl vysušen, první larvální stádium bylo umístěno na potravu a inkubováno při teplotě 28°C. Třicet dva larev bylo testováno na dávkování. Mortalita byla vyhodnocena po 7 dnech. Údaje z opakovaných testů byly uloženy pro možnost ověření anlýzy (Daum, 1970), přičemž mortalita byla upravena vzhledem k smrti kontrolních larev, kterým bylo podáno pouze rozpouštědlo (Abbot, 1925). Výsledky byly uvedeny jako množství krystalového proteinu na misku (175 mm² povrchu potravy), výsledky vLCso, koncentrace zabíjející 50 % testovaného hmyzu. 95 % ověřovací intervaly byly také uvedeny.

Tabulka 14.

Insekticidní účinnost EG11529 proteinů na SCRW larvální stádium

Vzorek	LC⁵⁰ (pg proteinu/misku)	95% C.I.
EGU 529	34,1	28-41
EG11535 (Cry3B2)	49,5	33-83

Výsledky uvedené ve výše uvedené tabulce ukazují, že krystalové proteiny EG11529, mají významný účinek na larvální stádium SCRW. LC50 hodnota pro EG11529 byla nižší než hodnota pro Cry3B2 kontrolní protein, ačkoli 95% ověřovací intervaly se překrývaly, což ukazuje, že rozdíl nemusí být podstatný.

• ·

113

Toxicita CryET39 A CryET74 pro WCRW larvální stádium

Toxicita pro WCRW larvální stádium {Diabrotica virgifera virgifera) byla určena pro

EG11529 a pro rekombinantní kmeny konstruované tak, aby vytvářely jednotlivé krystalové proteiny EG11529. Rekombinantní kmeny a krystalové proteiny, které vytvářejí jsou uvedeny v tabulce 15.

Tabulka 15

Bt Rekombinantní kmen	Exprimovaný krystalový protein	MW (kDa)’
EG11529	CryET39	44 kDa
	CryET74	13 kDa
	CryET75	34 kDa
EG11934	CryET75	34 kDa
EG11935	CryET74	13 kDa
EG11936	CryET39 + CryET74	44 kDa + 13 kDa
EG11937	CryET39	44 kDa

Molekulární hmotnosti byly odhadnuty podle migrace proteinu na SDS-PAGE gelu a srovnáním s standardy známých molekulárních hmotností.

Série zkoušek na určení účinku krystalových proteinů byly provedeny přesně tak, jak je popsáno pro SCRW zkoušku, s tou výjimkou, že byly použity ěerstě vylíhnuté larvy místo prvního larvárního stádia. Přečištěné krystalové proteiny byly připraveny pro první zkoušku s použitím sacharózového krokového gradientu EG11529 bylo pěstováno po dobu tří dnů při teplotě 30 °C v C2 sporulačním médiu. Sporulované a lyžované kultury byly vytěženy centrifugací a promyty dvakrát ve stejném objemu promývacího pufru (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,005% Triton X-100®) a suspendovány v 1/10 původního objemu vpromývacím roztoku. Sacharózové krokové gradienty byly připraveny umístěním roztoků se zvyšující se koncentrací sacharózy do promývacího roztoku v 25 x 89 mm Ultra- Clear centrifugových zkumavkách (Beckman Instruments, lne., Palo Alto, CA). Kroky sestávaly z 7,5 ml každé z následujících koncentrací sacharózy (ode dna k hladině): 79%72%-68%-55%. 5 ml spóry/krystaly suspenze bylo umístěno na nejvyšší gradient. Gradienty byly centrifugovány při 18,000 rpm při teplotě 4 °C v L8-70M ultracentrifuze (Beckman Instruments) přes noc. Krystalové proteiny EG11529 se rozdělily do dvou odlišných pásů. Jeden pás při 68% až • ·

114

72% rozhraní, obsahoval CryET75 protein. Kmený pás při 72% až 79% rozhraní obsahoval oba CryET39 a CryET74. Pásy byly odstraněny pipetou a dvakrát promyty vpromývacím pufru. Proteinový vzorek byl pak přenesen na kmený gradient, aby bylo zajištěno úplné oddělení CryET75 od CryET39 a CryET74. Proteinové vzorky byly umístěny na SDS-PAGE gel pro ověření úplnosti vzorku. Vzorky pak byly kvantifikovány s použitím standardní proteinové zkoušky (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA), podle návodu výrobce.

Zkouška byla provedena srovnáním toxicity CryET39 + CryET74 a CryET75 přečištěného vzorku krystalového proteinu pro WCRW larvální stádium s toxicitou EGU 529. EGU 529 byl připraven jako spóry/krystaly suspenze a množství proteinu bylo určeno pomocí SDS-PAGE a densitometrie. Údaje získané ze zkoušky byly uloženy pro možnost ověření analýzy (Daum, 1970), přičemž mortalita byla upravena vzhledem ke smrti kontroly, kontrole bylo podáno pouze rozpouštědlo (Abbot, 1925). Výsledky jsou uvedeny jako množství krystalového proteinu na misku (175 mm² povrchu potravy), výsledky v LCso, koncentrace zabíjející 50 % testovaného hmyzu. 95% ověřovací intervaly jsou také uvedeny v tabulce 16.

Tabulka 16

Insekticidní aktivita proteinů EG11529 na larvz WCRW

Vzorek	LC^5l) (pg proteinu/misku)	95% C.I.
CryET75	nemá vliv*
EG11529	8.,6	6,6-10,6
CryET39 + CryET74	9,7	7,2-12,7

*6% mortalita při dávce 45 pg/miska

Tato zkouška jasně ukazuje, že přečištěný CryET75 protein nebyl toxický pro larvální stádium WCRW. Vzorek obsahující směs CryET39 a CryET74 měl účinek podobný jako EG11529, což ukazuje, že CryET75 nehrál synergní roli v toxicitě EG11529 pro WCRW larvální stádium.

Pro určení zda je CryET74 toxickou složkou EG11529 kmenu, spóry/krystaly suspenze EG11935, která tvoří pouze CryET74, byla srovnána v testu s spóry/krystaly suspenzí EGU529 a EG11936, který tvoří oba CryET39 a CryET74. Údaje zopakovaných zkoušek byly uloženy pro ověření analýzy (Daum, 1970), přičemž mortalita byla upravena vzhledem ke smrti kontroly, kontrole bylo podáno pouze rozpouštědlo (Abbot, 1925). Výsledky jsou uvedeny jako množství

115

krystalového proteinu na misku (175 mm² povrchu potravy), vož vyústilo vLC₅₀, koncentrace zabíjející 50 % testovaného hmyzu. 95% ověřovací intervaly jsou také uvedeny v tabulce 17, která je uvedena dále.

Tabulka 17

Insekticidní aktivita proteinů B. thuringiensis na larvální stádium WCRW

Vzorek	LC⁵⁰ (pg proteinu/misku)	95% C.I.
EG11935	Nemá vliv při 80 pg/misku
EG11529	9,78	6,9-12,5
EG11936	14,5	9,7-19,5

CryET74 protein vytvářený EG11935 neměl žádný účinek na WCRW larvální stádium, což ukazuje, že CryET39 protein, ať už samotný nebo v kombinaci s CryET74, byl zodpovědný za insekticidní účinek pozorovaný u EG11529 a EG11936.

Byl proveden test srovnávající spóry/krystaly suspenzi EG11937, který tvoří popuze CryET39 krystalový protein, se suspenzemi EG11936 a EG11937. Do tohoto testu byla také zahrnuta 50 : 50 směs EG11935 + EG11937, pro zjištění zda směs CryET39 a CryET74 má podobný účinek jako EG11936. Údaje (tabulka 18) jsou uvedeny jako procento kontroly, což je mortalita na dané dávce upravená vzhledem k mortalitě kontroly, které bylo podáno pouze rozpouštědlo. Dva identické vzorky EG11937 byly připraveny pro repetici.

Tabulka 18

Vzorek	Dávka(pg/misku)	procentní kontrola
EG11935	80	0
EG11935	160	0
EG11936	80	100
EG11936	160	100
EG11937(1)	80	10,5
EG11937(1)	160	6,7

• ·

116

EG11937(2)	80	13,3
EG11937(2)	160	0
EG11935 +EG11937(1)	80	100
EG11935 +EG11937(1)	160	100
EG11935 +EG11937(2)	80	100
EG11935 +EG11937(2)	160	93,3

Výsledky toto testu jasně ukázaly, že CryET39 protein samotný, který je exprimován v EG11937 nezpůsobuje účinek pozorovaný u EGI1936 nebo EG11529. Avšak přidáním CryET74 k CryET39 proteinu vznikla kompozice toxická pro larvální stádium WCRW. Tyto údaje ukazují, že CryET39 a CryET74, které spolu reagují za vzniku toxické složky EG11529 a EG11936.

Toxicita krystalových proteinů EG11529 pro larvální stádium CPB

Sporulovaná kultura EG11529 byla vytěžena, pramyta a suspendována, jak bylo popsáno dříve, aby bylo možno určit zda krystalové proteiny tvořené EG 11529 jsou toxic pro larvální stádium mandelinky bramborové (Colorado potato beetle CPB). Test na CPB larvální stádium byl proveden s použitím postupů podobných postupům SCRW testu, s výjimkou výměny BioServe's #9380 krmivá pro hmyz (s přidanými bramborovými lupínky) za uměle vyrobené krmivo. Mortalita byla vyhodnocena po třech dech místo sedmi. Pro tuto zkoušku bylo použito 16 jedinců hmyzu pro jednu dávku 140 pg/miska. Při této dávce byo zabito 100% larev, čímž se ukázalo,že EGU 529 je toxický pro CPB larvální stádium.

Příklad 13

Určení genů kódujících příbuzné δ-endotoxin polypeptidy

Kmeny B. thuringiensis vytvářející krystalové proteiny 40-50 kDa byly určeny pomocí SDSPAGE analýzy parasporálních krystalů tvořených sporulujícími kulturami. Celková DNA byla extrahována z těchto kmenů podle postupů uvedených dříve, digerována s restrikční endonukleázou HindSS. a restrikční fragmenty byly rozlišeny elekroforézou na agarózovém gelu a přeneseny do nitrocelulózového filtru pro Southern přenosovou analýzu. PCR™ byla použita pro amplifilaci úseku cryET39 genu pro použití jako hybridizační sondy pro určení a klonování příbuzných toxinových genů z těcho kmenů B. thuringiensis. PCR™ fragment byl prodloužen z nukleotidu 176

117

6?jET39 kódující sekvence na přibližně 200-bp 3' ke konci genu a byl generován s použitím opačných primerů mr3 a mr24 a plazmidů pEG1337 jako matrice. mrl3: 5'- TACACAGCTATGGAGC -3' (SEQ ID č.: 33) mr24: 5' -ATGATTGCCGGAATAGAAGC -3' (SEQ ID č.: 34)

Amplifikovaný DNA fragment byl radioaktivně označen s použitím a-³²P-dATP a označovací sadou náhodného primeru (Prime-a-Gen@ Labeling System; Promega Corporation, Madison, WI). Následovala inkubace s cryET39-specifickou hybridizační sondou, filtry byly promyty za mírně přísných podmínek (například v O,1X-1,OX SSC při teplotě 55°C) a vystaveny na radiocitlivý film pro získání autoradiogramu, který určuje DNA fragmenty obsahující cryET39příbuzné sekvence. Několik kmenů poskytlo hybridizační vzory, které se lišily od vzorů EG5899. Tři kmeny, označené EG4100, EG4851 a EG9444 v tomto pořadí, byly vybrány pro další charakterizaci.

Klonování a exprese cry genů z kmenů EG4100, EG4851 a EG9444 bylo dokončena s použitím postupů popsaných v části 5.4, části 5.5 a části 5.6. DNA byla připravena z kmenů částečně digerovaných restrikčním enzymem Mbol, čímž bylo dosaženo rozdělení významných náhodných DNA fragmentů. Mbol fragmenty byly rozlišeny na agarózovém gelu a fragmenty o velikosti 6 až 10-kb byly přečištěny. Přečištěné Mbol fragmenty byly pak vloženy do B. thuringiensis/E. coli kyvadlového vektoru, pHT315, když byly předtím digerovány BamHI a reagovaly s alkalickým fosfátem. Ligační směs byla pak použita pro transformaci E. coli na rezistenci k ampicilinu, tvoříc tak sérii klonovaných fragmentů reprezentujících genom každého příslušného kmenu B. thuringiensis. E. coli série byly pak umístěny na LB agar obsahující 50 pg/ml ampicilinu a kolonie přemístěny do nitrocelulózového filtru. Pro určení cryET39- sekvencí byly filtry sondovány jak radioznačenými oligonukleotidy wd271 (EG9444 ), jak bylo popsáno v části 5.4 a části 5.5 tak cryET39-specifickou hybridizační sondou, která byla dříve popsána (EG4100 a EG4851 série). Plazmid DNA byl izolován z hybridizujících E. coli kolonií a použit pro transformaci akrystaliferního B. thuringiensis hostitelského kmenu na rezistenci proti erytromycinu. Rekombinantní B. thuringiensis klony byly pěstovány do sporulace v C2 médiu a krystalové proteiny byly analyzovány pomocí SDS- PAGE jak bylo popsáno v části 5.6.

Klonovaný fragment určený dříve uvedeným způsobem z EG4100 série kódující přibližně 60-kDa krystalový protein, označený CryET69 (SEQ ID č.: 14). DNA sekvenční analýza ukázala, že cryET69 gen (SEQ ID č.: 13) kódující protein 520 aminokyselinových zbytků. CryET69 protein vykazuje -23% sekvenční shodu s CryET39. Rekombinantní B. thuringiensis kmen exprimující

118

CryET69 byl označen EG1164 7 a rekombinantní plazmid obsahující crjET69 gen byl označen pEG1820. EG4100 a EG11647 byly uloženy s ARS Patent Culture Collection a byla jim přidělena NRRL pořadová čísla B-21786 a B-21787, v tomto pořadí.

Klonovaný fragment izolovaný z EG9444 série, jak bylo popsáno dříve, kódoval přibližně 45-kDa krystalový protein, označený CryET71, který byl příbuzný s CryET39 a přibližně 14-kDa krystalový protein, označený CryET79, který byl příbuzný s CryET74. DNA sekvenční analýza ukázala, že cryET71 gen (SEQ ID č.: 11) kóduje protein o 397 aminokyselinách a že cryET79 gen (SEQ ID č.: 9) kóduje protein o 123 aminokyselinách. CryET7 protein (SEQ ID č.: 12) vykazuje 78% sekvenční shodu s CryET39, zatímco CryET79 protein (SEQ ID č.: 10) vykazuje 80% sekvenční shodu s CryET74. Rekombinantní B. thuringiensis kmen exprimující CryET71 a CryET79 byl označen EG11648 a rekombinantní plazmid obsahující cryET71 a cryET79 geny byl označen pEG1821 (tabulka 9). EG11648 byl toxický pro larvální stádium WCRW. Podle analogie s příbuznými CryET39 a CryET74 proteiny se přepokládá, že oba CryET71 a CryET79 jsou zapotřebí pro plnou WCRW toxicitu. EG9444 a EG11648 byly uloženy s ARS Patent Culture Collection byla jim přidělena NRRL pořadová čísla B-21785 a B-21788, v tomto pořadí.

Klonovaný fragment izolovaný z EG4851 série, jak bylo popsáno dříve, kódoval přibližně 44-kDa krystalový protein, označený CryET76, který byl příbuzný s CryET39 a přibližně 15-kDa protein, označený CryET80, který byl příbuzný s CryET74. DNA sekvenční analýza ukázala, že cryET76 gen (SEQ ID č.: 1) kódoval protein o 387 aminokyselinách a že cryET80 gen (SEQ ID č.: 3) kódoval protein o 132 aminokyselinách. CryET76 protein (SEQ ID č: 2) vykazoval 61% sekvenční shodu s CryET39, zatímco CryET80 protein SEQ ID č.: 4) vykazoval 52% sekvenční shodu s CryET74. Rekombinantní B. thuringiensis kmen exprimující CryET76 a CryET80 byl označen EG 1658 a rekombinantní plazmid obsahující cryET76 a cryET80 geny byl označen pEGI823 (tabulka 9). EG11658 byl toxický pro larvální stádium WCRW. Podle analogie s příbuznými CryET39 a CryET74 proteiny, se předpokládá, že oba CryET76 a CryET80 jsou zapotřebí pro plnou WCRW toxicitu. EG4851 a EG11658 uloženy s ARS Patent Culture Collection a byla jim přidělena NRRL pořadová čísla B-21915 a B-21916, v tomto pořadí.

Na základě těchto výsledků lze říci, že použití postupů podobných těm, které jsou zde popsány, povede k izolování dalších B. thuringiensis toxinů krystalových proteinů. DNA sondy založené na zde popsaných nových sekvencích mohou být připraveny z oligonukleotidů, PCR™ produktů nebo restrikčních fragmentů a použity k určení dalších genů příbuzných sgeny zde popsanými. Tyto nové geny mohou být také klonovány, charakterizovány DNA sekvencováním a

119

jejich kódované proteiny vyhodnoceny ve zkouškách na různé insekticidy s použitím zde popsaných způsobů. Nové geny mohou tedy mít za následek určení nových rodin příbuzných genů, jak je vidět z dříve uvedených příkladů.

Příklad 14

Sekvencování příbuzných cry genů ct>ET71

Počáteční nukleotidová sekvence pro cryET71 gen byla získána s použitím oligonukleotidu wd271 jako sekvencovacího primeru a způsobů popsaných v části 5.7. Následné oligonukleotidy použité jako primery pro sekvencovací reakce byly navrženy na základě údajů získaných z předchozích sad sekvancovacích reakcí pro získání sekvence cryET71 genu.

DNA sekvence CryET71 genu je uvedena v SEQ ID č.: 11 a kóduje aminokyselinovou sekvenci CryET71 polypeptidu, uvedenou v SEQ ID č.: 12.

Charakteristiky CryET71 polypeptidu

CryET71 polypeptid obsahuje 397-aminoky setinovou sekvenci, má vypočítanou molekulární hmotnost 45,576 Da a má vypočítané pí 4,75. Aminokyselinová kompozice CryET71 polypeptidu je uvedena v tabulce 19.

Tabulka 19

Aminokyselinová kompozice CryET71

Aminokyselina	# zbytku	% celku	Aminokyselina	# zbytků	% celku
Ala	11	2,7	Leu	31	7,8
Arg	8	2,0	Lys	30	7,5
Asn	38	9,5	Met	8	2,0
Asp	28	7,0	Phe	6	1,5
Cys	2	0,5	Pro	16	4,0
Gin	25	6,2	Ser	29	7,3
Glu	22	5,5	Thr	33	8,3

120 ·· • · ·

Gly	19 4,7	Trp	7
His	5 1,2	Tyr	24
Ile	41 10,3	Val	14
Kyselé	(Asp + Glu)		50
Bazické	(Arg + Lys)		38
Aromatické	(Phe + Trp + Tyr)		37
Hydrofobní	(Aromatické + Ile + Leu + Met + Val)	131
CryET79

1,7

6,0

3,5

Počáteční sekvence pro protisměrný gen cryET79 byla získána pomocí oligonukleotidového primem navrženého z dokončené sekvence cryET7E Vzorky DNA byly sekvencovány pomocí ABI PRISM™ DyeDeoxy sequencing chemistry sady (Applied Biosystems) podle návodu výrobce. Dokončené reakce byly zpracovány na ABI 377 automatizovaném DNA sekvenceru. Data sekvencí DNA byla analyzována pomocí Sequencher v3.0 DNA analysis software (Gene Codes Corp.). Následné oligonukleotidy, které se měly použít jako primery pro sekvencovaní reakce byly navrženy z dat předchozí sady reakcí a tak byla získána kompletní sekvence genu cryET19 gen.

Charakteristiky polypeptidů CryET79

Polypeptid CryET79 obsahuje sekvenci 123 aminokyselin, má kalkulovanou molekulovou hmotnost 13609 Da a má vypočítané PI 6,32. Aminokyselinová kompozice polypeptidů CryET79 je v tabulce 20.

Tabulka 20

Aminokyselinová kompozice CryET79

Aminokyselina	# zbytku	% celku	Aminokyselina	# zbytků	% celku
Ala	5	4,0	Leu	4	3,2
Arg	4	3,2	Lys	6	4,8
Asn	12	9,7	Met	2	1,6
Asp	5	4,0	Phe	3	2,4
Cys'	.0	0	Pro	3	2,4
Gin	6	4,8	Ser	13	10,5
Glu	7	5,6	Thr	13	10,5

··· ·· · ··· ·»· ·· ·· ··· ·· ····

121

Gly	13	10,5	Trp	1	0,8
His	6	4,8	Tyr	8	6,5
Ile	6	4,8	Val	6	4,8

Kyselé	(Asp + Glu)	12
Bazické	(Arg + Lys)	10
Aromatické	(Phe + Trp + Tyr)	12
Hydrofobní	(Aromatické + Ile + Leu + Met + Val)	30

CryET69

Sekvence aminokyselin HN2- konce izolovaného proteinu CryET69 byla určená postupy uvedenými

v sekci 5.3. Sekvence HN2- konce izolovaného proteinu byla:
1 2 3 4 5 6 7 8	9	10	11
Met Asn Val Asn His Gly Met Ser (SEQ ID Č.:29)	Cys	Gly	Cys

Oligonukleotidový primer založený na sekvenci aminokyselin NH2- konce proteinu CryET69 byl navržen pro použití při sekvencování cryET69. Tento oligonukleotid, označený jako crcl2, má následující sekvenci:

5'- ATGAATGTAAATCATGGGATGWSNTGT -3’ (SEQ ID č.:30) kde W = A a T a S = C a G. Počáteční sekvence nukleotidu byla získána pomocí crcl2 jakožto sekvencovacího primerů a postupů popsaných v sekci 5.7. Následné oligonukleotidy, které byly použity jako primer v sekvencovacích reakcích byly navrženy na základě dat z předchozí sady reakcí. Sekvence byla dokončena pomocí automatického sekvencování. Vzorky DNA byly sekvencovány pomocí ABI PRISM DyeDeoxy sequencing chemistry kitu (Applied Biosystems) podle protokolu výrobce. Dokončené reakce byly zpravovány pomocí na automatickém sekvenceru DNA ABI377. Data sekvencí DNA byla analyzována pomocí Sequencher v3.0 DNA analysis software (Gene Codes Corp.).

Charakteristiky polypeptidu CRYET69

122 • ft • · · ·· ·· • ftft 4 • ·

Polypeptid CryET69 obsahuje sekvenci 520 aminokyselin, má kalkulovanou molekulovou hmotnost 58609 Da a má kalkulované PI 5,84. Aminokyselinová kompozice polypeptidu CryET69 je v tabulce 21.

Tabulka 21

Aminokyselinová kompozice CryET69

Aminokyselina	# zbytku	% celku	Aminokyselina # zbytků	% celku
Ala	24	4,6	Leu	31	5,9
Arg	30	5,7	Lys	15	2,8
Asn	60	11,5	Met	10	1,9
Asp	27	5,1	Phe	20	3,8
Cys	9	1,7	Pro	24	4,6
Gin	32	6,1	Ser	39	7,5
Glu	24	4,6	Thr	48	9,2
Gly	32	6,1	Trp	6	1,1
His	9	1,7	Tyr	22	4,2
Ile	24	4,6	Val	34	6,5

Kyselé	(Asp + Glu)	51
Bazické	(Arg + Lys)	45
Aromatické	(Phe + Trp + Tyr)	48
Hydrofobní	(Aromatické + Ile + Leu + Met + Val)	147
Příklad 16 - hledání	v databázích proteinů příbuzných s CRYET69

Sekvence aminokyselin odvozená pro CryET69 byla použita pro vyhledávání v databázích SWISS-PROT ALL a nr pomocí FASTA. a BLASTP jak je popsáno pro CryET39 v části 5.8, jen v hledáni pomocí FASTA byla použita srovnávací matice blosum50. Výsledky získané pomocí FASTA ukázaly, že CryET69 vykazuje ~32% shodnost sekvence v oblasti 338 aminokyselin s 42kDa moschitocidalním krystalovým proteinem B. sphaericus a ~30% shodnost sekvence v oblasti 440 aminokyselin s 51-kDa krystalovým proteinem B. sphaericus.

Příklad 17 - hledání v databázích proteinů příbuzných s CryET71 a CryET79

Sekvence aminokyselin odvozené pro CryET71 a CryET79 byly použity pro vyhledávání v databázích SWISS-PROT ALL a nr pomocí FASTA. a BLASTP jak je popsáno pro CryET39

123 ·· ·» ·· « · * 1 • · ·· ···· v části 5.8 Výsledky získané pomocí FASTA ukázaly, že CryET71 vykazuje -25% shodnost sekvence v oblasti 323 aminokyselin s 42-kDa moschitocidálním krystalovým proteinem B. sphaericus a -25% shodnost sekvence v oblasti 388-aminokyselin s 51-kDa krystalovým proteinem B. sphaericus. Vyhledávání pomocí FASTA ani BLASTP neidentifikovaly proteiny se shodnou sekvenci s CryET79.

Přikladl8 - Sekvencování genů CryET76 a CrvET80

Částečná sekvence DNA genu klonovaného v on pEG1823 byla určena pomocí stanovených postupů pro sekvencování DNA (dideoxy chain-termination DNA sequencing procedures, Sanger a kol., 1977). Dvouřetězcové DNA matrice plazmidů byla připravena pomocí Wizard® SV Miniprep Kitu (Promega Corp.) dle postupů výrobce nebo pomocí Qiagen Plasmid Kitu (Qiagen lne.) podle postupů výrobce, následovala extrakce v fenol:chloroform:izoamyl alkoholu (50:48:2) a poté extrakce v chlorform:isoamyl alkoholu (24:1). Sekvencovací reakce byly provedeny pomocí Sequenase™ Version 2,0 DNA Sequencing Kitu (United States Biochemical/Amersham Life Science lne.) dle postupů výrobce s využitím ³⁵S-[dATP] jako značkovacího izotopu (DuPont NEN® Research Products). Denaturační gelová elektroforéza reakcí byla provedena na 6% (hmotnost/objem) akrylamidu, 42% (hmotnost/objem) sekvencovacím gelu s močovinou nebo na CastAway™ Precast 6% akrylamidovém sekvencovacím gelu (Stratagene).Vysušený gel byl exponován na film Kodak X-OMAT AR citlivý na radioaktivitu (Eastman Kodak) přes noc při pokojové teplotě a tak byl získán autoradiogram.

Částečná sekvence DNA genů the cryET76 a cryET80 na pEG1823 byla získána pomocí postupů uvedených dříve. Oligonukleotid mrl8 specifický pro cryET39 byl použit jako počáteční sekvencovací primer. Sekvence mrl8je:

5'-GTACCAGAAGTAGGAGG-3' (SEQ ID č.31)

Následné oligonukleotidy použité jako primery pro sekvencovací reakce byly navrženy na základě údajů získaných z předchozích sad sekvencovacích reakcí. Sekvencování bylo dokončeno pomocí automatického sekvencování. Vzorky DNA byly sekvencovány pomocí ABI PRISM DyeDeoxy sequencing chemistry kitu (Applied Biosystems) podle protokolu doporučeného výrobcem.. Dokončené reakce byly zpracovány na automatickém sekvenceru DNA ABI 377. Data sekvencí DNA byly analyzovány pomocí Sequencher v3.0 DNA analysis software (Gene Codes Corp.). Sekvence DNA cryET76 (SEQ ID č.: 1) a cryET80 (SEQ ID č.:3) jsou uvedeny dále. Odvozené

124

• *4 • · 4 • · · ·	4 4 * 4 4 4 4 4 4 4	4f 44 4 4 4 ♦ 4 4 *
• · · «4	4 4 44 4	4 4 4 4 4 4

sekvence aminokyselin proteinu CryET76 (SEQ ID č.:2) a proteinu CryET80 (SEQ ID č.:4) jsou také uvedeny dále. Celá sekvencovaná oblast je v (SEQ ID č.: 17).

CryET76

Sekvence DNA pro gen CryET76 je představována SEQ ID č.:l a kóduje sekvenci aminokyselin polypeptidu CryET76, reprezentovaného SEQ ID č.:2.

Charakteristiky polypeptidu CryET76

Polypeptid CryET76 obsahuje sekvenci 387 aminokyselin, má kalkulovanou molekulovou hmotnost 43812 Da a má kalkulované PI 5,39. Aminokyselinová kompozice polypeptidu CryET76 jev tabulce 22.

Tabulka 22

Aminokyselinová kompozice CryET76

Aminokyselina	# zbytku	% celku	Aminokyselina	# zbytků	% celku
Ala	14	3,6	Leu	34	8,7
Arg	7	1,8	Lys	27	6,9
Asn	39	10,0	Met	5	1,2
Asp	17	4,3	Phe	8	2,0
Cys	1	0,2	Pro	10	2,5
Gin	17	4,3	Ser	30	7,7
Glu	22	5,6	Thr	47	12,1
Gly	22	5,6	Trp	8	2,0
His	4	1,0	Tyr	24	6,2
lle	31	8,0	Val	20	5,1
Kyselé	(Asp + Glu)			39
Bazické	(Arg + Lys)			34
Aromatické	(Phe + Trp +	Tyr)		40
Hydrofobní	(Aromatické + lle + Leu + Met + Val)	130

CryET80

Sekvence DNA pro gen CryET80 je vyjádřena SEQ ID č.:3 a kóduje sekvenci aminokyselin polypeptidu CryET80 vyjádřenou SEQ ID č.:4.

. · 4

125 · «9· 4

Charakteristiky polypeptidů CryET80

Polypeptid CryET80 obsahuje sekvenci 132 aminokyselin, má kalkulovanou molekulovou hmotnost 14839 Da a má kalkulované PI 6,03. Aminokyselinová kompozice polypeptidů CryET80 je v tabulce 23.

Tabulka 23

Aminokyselinová kompozice CryET80

Aminokyselina	# zbytků	% celku	Aminokyselina	# zbytků	% celku
Ala	7	5,3	Leu	6	4,5
Arg	8	6,0	Lys	4	3,0
Asn	13	9,8	Met	2	1,5
Asp	8	6,0	Phe	2	1,5
Cys	1	0,7	Pro	3	2,2
Gin	3	2,2	Ser	11	8,3
Glu	8	6,0	Thr	11	8,3
Gly	9	6,8	Trp	I	0,7
His	8	6,0	Tyr	6	4,5
Ile	13	9,8	Val	8	6,0
Kyselé	(Asp + Glu)		16
Bazické	(Arg + Lys)		12
Aromatické	(Phe + Trp + Tyr)		9
Hydrofobní	(Aromatické + Ile + Leu + Met + Val)	38

Charakteristiky genů CryET76, CryET80 a CryET84 izolovaných z EG4851 (SEQ ID č.: 17)

Sekvence DNA celého tří genového operonu obsahujícího kódovací oblasti CryET76,

CryET80 a CryET84 je vyjádřena SEQ ID č.: 17.

V kmenu EG4851, je gen cryET84 gen umístěn bezprostředně za 5' koncem genů cryET80 a cryET76. Gen cryET84 začíná na nukleotidu 656 a končí na nukleotidu 1678. Gen cryET80 začína na nukleotidu 1773 a končí na nukleotidu 2168. Gen cryET76 začíná na nukleotidu 2264 a končí na nukleotidu 3424.

Příklad 19 - analýza homologie sekvencí

Vyhledávání v databázích proteinů příbuzných s CryET76- A CryET80

e.· * ·* ·· • 4 4 · 4 · 4 4

4 · · · · • ·» · ·

126

Sekvence aminokyselin proteinů CryET76 a CryET80, odvozené translací nukleotidové sekvence, byly použity jako vzor pro vyhledávání příbuzných sekvencí proteinu v databázi sekvencí. . Byla prohlížena databáze The SWISS-PROT ALL (swan) pomocí FASTA verze 3.15 (Pearson and Lipman, 1988) na serveru FASTA v European Bioinformatics Institute (http://www.ebi.ac.uk) s následujícími parametry (matrix = paml50, ktup = 2. gapcost = -12. gapxcost = -2). Sekvence aminokyselin CryET76 a CryET80 byly také použity pro vyhledávání v non- redundant (nr) databazi National Center Biotechnology Information (NCBI) pomocí BLASTP version 2,0 (Altschul a kol., 1997) s následujícími parametry: matrix = blosum62, gapped alignment. ostatní parametry = výchozí nastavení.

Výsledky analýz pomocí FASTA odhalily, že CryET76 vykazuje -27% shodnost sekvence v oblasti 320 aminokyselin s 42-kDa moschitocidalním krystalovým proteinem z B. sphaericus, zatímco CryET80 nevykázal podobnost sekvence s žádnou sekvencí z SWISS-PROT ALL. Výsledky hledání pomocí BLASTP byly ve všeobecné shodě s hledáním pomocí FASTA. Nebyly identifikovány žádné proteiny se sekvencí podobnou s CryET80.

Dodatečné porovnávání sekvencí s CRY proteiny

Bylo provedeno zarovnání sekvence, aby bylo možné porovnat sekvence CryET39, CryET74, CryET75, CryET71, CryET79, CryET76, CryET80 a CryET69 se sekvencemi z dříve publikovaných patentových žádostí.Zarovnání bylo provedeno pomocí PALIGN ze sady PC/GENE verze 6.85 pro analýzu sekvencí (Intelligenetics Corp. Mountain View, CA). Bylo provedeno zarovnání podle párů bází s následujícími parametry: comparison matrix = unitary, open gap cost = 3, unit gap cost = 1.

CryET39

Srovnávání se zarovnanou sekvencí sekvence CryET39 se sekvencemi v dříve publikovaných patentových přihláškách odhalilo shodu sekvence mezi sekvencí CryET39 a sekvencemi s identifikátory 11, 38 a 43 z mezinárodní patentové přihlášky publikované pod číslem WQ 97/40162. CryET39 vykazoval 99,2% shodu sekvence se sekvencí číslo 11, 78,6% shodu sekvence se sekvencí číslo 38 a 79,9% shodu sekvence se sekvencí číslo 43 této přihlášky.

CryET74

Srovnávání se zarovnanou sekvencí sekvence CryET74 se sekvencemi v dříve publikovaných patentových přihláškách odhalilo shodu sekvence mezi sekvencí CryET74 a

127

sekvencemi s identifikátory 32, 36a41z mezinárodní patentové přihlášky publikované pod číslem WQ 97/40162. CryET74 vykazoval 100% shodu sekvence se sekvencí číslo 32, 80,7% shodu sekvence se sekvencí číslo 36 a 77,3% shodu sekvence se sekvencí číslo 41 této přihlášky.

5.19.2.3 CryET75

Srovnávání se zarovnanou sekvencí sekvence CryET75 a sekvencemi v dříve publikovaných patentových přihláškách odhalilo přibližně 26% shodu sekvence mezi CryET75 a CryET33, a proteinem toxickým pro brouky, popsaném v mezinárodní patentové přihlášce publikované pod ěíslem WQ 97/17600.

CryET71

Srovnávání se zarovnanou sekvencí sekvence CryET71 se sekvencemi v dříve publikovaných patentových přihláškách odhalilo shodu sekvence mezi sekvencí CryET71 a sekvencemi s identifikátory 11, 38 a 43 z mezinárodní patentové přihlášky publikované pod číslem WQ 97/40162. CryET71 vykazoval 78,4% shodu sekvence se sekvencí číslo 11, 91,9% shodu sekvence se sekvencí číslo 38 a 97,4% shodu sekvence se sekvencí číslo 43.

CryET79

Srovnávání se zarovnanou sekvencí sekvence CryET79 se sekvencemi v dříve publikovaných patentových přihláškách odhalilo shodu sekvence mezi sekvencí CryET79 a sekvencemi s identifikátory 32, 36 a 41 z mezinárodní patentové přihlášky publikované pod ěíslem WQ 97/40162. CryET79 vykazoval 79,8% shodu sekvence se sekvencí číslo 32, 95,9% shodu sekvence se sekvencí číslo 36 a 91% shodu sekvence se sekvencí číslo 41.

5.19.2.6 CryET76

Srovnávání se zarovnanou sekvencí sekvence CryET76 se sekvencemi v dříve publikovaných patentových přihláškách odhalilo shodu sekvence mezi sekvencí CryET76 a sekvencemi s identifikátory 11, 38 a 43 z mezinárodní patentové přihlášky publikované pod číslem WQ 97/40162. CryET76 vykazoval 60,8% shodu sekvence se sekvencí 11; 61,6% shodu sekvence se sekvencí číslo 38 a 61,9% shodu sekvence se sekvencí číslo 43.

5.19.2.7 CryET80

Srovnávání se zarovnanou sekvencí sekvence CryET80 se sekvencemi v dříve publikovaných patentových přihláškách odhalilo shodu sekvence mezi sekvencí CryET80 a sekvencemi s identifikátory 32, 36 a 41 z mezinárodní patentové přihlášky publikované pod ěíslem

128 • · ·

r* · ·

WQ 97/40162. CryET80 vykazoval 52,1% % shodu sekvence se sekvencí 32; 56,1% shodu sekvence se sekvencí číslo 36 a 54.5% shodu sekvence se sekvencí Číslo 41.

5.19.2.8 CryET69

Srovnávání se zarovnanou sekvencí sekvence CryET69 se sekvencemi v dříve publikovaných patentových přihláškách odhalilo pouze 23-25% shodu sekvence mezi sekvencí CryET69 a sekvencemi s identifikátory 11, 38 a 43 z mezinárodní patentové přihlášky publikované pod číslem WQ 97/40162. Tento krystalový protein vykazoval větší stupeň homologie moschitocidálními krystalovými B. sphaericus než k ke krystalovým proteinům B. thuringiensis.

Závěr

Analýzy ukázaly, že sekvence aminokyselin CryET69, CryET75, CryET76 a CryET80 jsou značně odlišné od dříve popsaných sekvencí insekticidních krystalových proteinů. S využitím nomenklatury pro krystalové proteiny B. thuringiensis (Crickmore a kol., 1998), by mohla být CryET76 a CryET80 přiřazena nová sekundární oblast a pro CryET69 a CryET75 by mohla být přiřazena nová primární oblast..

5.20 Příklad 20 - Exprese rekombinantních polypeptidů CryET76 A CryET80

Aby bylo možné charakterizovat vlastnosti proteinů CryET76 a CryET80, bylo nezbytné exprimovat klonované geny cryET76 a cryET80 v kmenu B. thuringiensis, který nevytváří jiné krystalové proteiny (t.j. Cry- kmen). Plasmid obsahující klonované geny cryET76 a cryET80, pEG1823, obsahuje počátek replikace B. thuringiensis a stejně tak i počátek, který řídí replikaci v E. coli, jak bylo popsáno drive. pEG1823 byl použit k transformování Cry- kmenu B. thuringiensis EG10650 k rezistenci na to erytromycin (Em^R) elektroforézou (Macaluso and Mettus, 1991). Buňky transformované na Em^R byly vybrané inkubací přes noc na LB agarových plotnách, obsahujících 25 pg/ml ery hromy činu. Jedna kolonie Em^R z každé transformace byla vybrána pro další analýzu. Jeden izolovaný vzorek byl označen EG1165 8.

EGI1658 byl pěstován v C2 sporulačním médiu, které obsahovalo 25 pg/ml eryhromycinu po dobu čtyřech dní při teplotě 25 °C, při kterých došlo k bodové sporulaci a nastala lyže buněk.. Mikroskopické zkoumání sporulovaných kultur demonstrovalo, že rekombinantní kmen vytvářel parasporální .inkluze. Sporulovaná kultura EG11658 byla získána centrifugováním, promyta a resuspendována při jedné desetině původního objemu v H₂O. Krystalový protein v suspenzi byl zkoumán pomocí analýzy SDS-PAGE, která odhalila vytvoření přibližně 44- and 15-kDa proteinů.

129

Příklad 21 - toxicita CryET76 a CryET80 vůči hmyzu.

Toxicita proteinů CryET76 and CryET80 na WCRW byla určena.

EG11658 byl pěstován v C2 médiu při teplotě 25°C po dobu čtyřech dní, dokud nedošlo k sporulaci a lyzy buděn.. Kultura byla získána centrifugováním, promyta přibližně v 2,5 násobku původního objemu destilovanou H₂O a resuspendována v 0,005% Triton X-IOO®při jedné desetině původního objemu. Pro srovnání s EG11658 byly pěstovány a získány stejným způsobem rekombinantní kmeny B. thuringiensis EGU 529, produkující proteiny toxické pro WCRW CryET39 a CryET74 a EGU 648, vytvářející proteiny toxické pro WCRW CryET7I a CryET79. Toxické proteiny ze vzorků byly kvantifikovány pomocí SDS-PAGE, jak je popsáno (Brussock and Currier, 1990. Postup by upraven tak, aby byl eliminován neutralizační krok pomocí 3M HEPES.

Larvy WCRW byly testovány kontaminací povrchu umělé výživy (20 g agar, 50 g pšeničných klíčků, 39 g sacharózy, 32 g kaseinu, 14 g vláken (fiber), 9 g směs Wessonových solí, 1 g metyl parabenu, 0,5 g kyselina sorbová, 0,06 g cholesterolu, 9 g vitaminové směsi Vanderzant, 0,5 ml lněného oleje, 2,5 ml kyseliny fosforečné/propionové na 1 litr). Každý test EGI1658 (CryET76 a CryET80), EG11529 (CryET39 a CryET74) a EGI1648 (CryET71 a CryET79) sestával z osmi postupných vodných ředění s poměrnými díly aplikovaných na povrch krmivá. Poté co ředidlo (vodný roztok 0,005% Triton X-100®) bylo vysušen, byly čerstvě vylíhlé larvy umístěny na krmivo a inkubovány při teplotě 28°C. V každé nádobě bylo testováno třicet dva.. Mortalita byla vyhodnocena po sedmi dnech. Data z replikovaných testů byla shromážděna a podrobena analýze (Daum, 1970) , přičemž mortalita byla upravena vzhledem ke smrti kontroly, kontrole bylo podáno pouze rozpouštědlo. (Abbott, 1925). Výsledky byly uvedeny jako množství krystalového proteinu na misku (175 mm² povrchu potravy), výsledky vLCso, koncentrace zabíjející 50% testovaného hmyzu. 95% ověřovací intervaly (confidence interval)jsou také uvedeny pro hodnoty LC50. (Tabulka 24).

Tabulka 24 Insekticidní aktivita CRY proteinů na larvy WCRW

Vzorek	krystalový protein	LC50 (pg proteinu/misku)	95% C.I.	LC95 (pg proteinu/misku)
EG11658	CryET76 CryET80	10,7	2,2-18,9	46
EG11648	CryET71 CryET79	5,3	0,9-10,1	27

130 ·· ·· • · · ·

9 «

EG11936 CryET39 CryET74

12,3

12,5-14,3

Výsledek uvedený v tabulce 24 ukazuje, že proteiny CryET76 a CryET80 významně působí na larvy WCRW.

Příklad 22

Toxicita CryET69 pro hmyz

Toxicita CryET69 pro WCRW byla určena s použitím způsobů popsaných v části 5.21. Výsledky jsou uvedeny jako množství krystalového proteinu na misku (175 mm² povrchu krmivá), s výsledkem v LC50, koncentrace zabíjející 50 % testovaného hmyzu. 95 % ověřovací intervaly byly také uvedeny pro LC50 hodnoty (tabulka 25).

Tabulka 25

Insekticidní aktivita CryET69 proteinů na larvy WCRW

Vzorek krystalový protein LC50 (pg proteinu/misku) 95% C.I.

EG11204 Cry3B2 13,8

EG11647 CryET69 147,3

LC95 (pg proteinu/misku) 502

6190

3,2-30,1

73-1292

Mortalita kontroly = 22%

Tyto výsledky ukazují, že CryET69 byl významně méně účinný než Cry3B2 proti WCRW. Nicméně tento krystalový protein podle všeho reprezentuje novou třídu δ-endotoxinů toxických pro brouky.

Příklad 23

Konstrukce kmenů EG12156 A EG12158

Rekombinantní B. thuringiensis kmeny byly konstruovány tak, že produkují buď CryET76 nebo CryET80. Posunová mutace byla vložena do cryET76 kódující sekvence na pEG1823, aby vytvořila rekombinantní plazmid schopný řídit tvorbu CryET80 samotného. Jednotlivá Agel restrikční místo v cryET76 kódující sekvenci bylo určeno počítačovou analýzou určené cryET76 nukleotidové sekvence. Následná digerace pEG1823 s Agel ověřila, že toto restrikční místo bylo

131 jediné na plazmidu. Pro vytvoření posunové mutace v tomto místě, byl pEG1823 digerován s Agel a DNA konce zarovnané pomocí T4 polymerázy v přítomnosti dNTP. Lineární DNA fragment byl následně rozčleněn elektroforézou na 1% agarózovém gelu, DNA pás byl odříznut žiletkou a DNA byla přečištěna s použitím Qiagen gel extrakční sady. Přečištěná DNA byla samovázána s použitím T4 ligázy a použita pro transformaci E. coli kmenu DH5a na rezistenci proti ampicilinu. Restrikční enzymová analýza DNA odhalila z několika ověřených klonů rezistentních k ampicilinu zlom Agel místa na pEG1823. Rekombinantní plazmid z jednoho takového klonu byl označený pEG2206. pEG2206 byl následně použit pro transformaci pomocí elektroporace, akrystaliferní B. thuringiensis kmen EG 10650 na rezistanci proti erytromycinu. Rekombinantní kmen obsahující pEG2206 byl označen EG 1215 6.

Deleční mutace byla vložena do cryET80 kódující sekvence na pEG1823, aby byl vytvořen rekombinantní plazmid schopný řídit tvorbu CryET76 samotného. Jedinečné DralII restrikční místo v cryET80 kódující sekvenci bylo určeno pomocí počítačové analýzy určené cryET80 nukleotidové sekvence. Následná digerace pEG1823 s Dralll ověřila, že toto restrikční místo bylo jediné na plazmidu. Pro vytvoření mutace v tomto místě, byl pEG1823 digerován sDralII a DNA konce zarovnané pomocí T4 polymerázy v přítomnosti dNTP. Lineární DNA fragment byl následně rozčleněn elektroforézou na 1% agarózovém gelu, DNA pás byl odříznut žiletkou a DNA byla přečištěna s použitím Qiagen gel extrakční sady. Přečištěná DNA byla samovázána s použitím T4 ligázy a použita pro transformaci E. coli kmenu DH5a na rezistenci proti ampicilinu. Restrikční enzymová analýza DNA odhalila z několika ověřených klonů rezistentních k ampicilinu zlom DralII místa na pEG1823. Rekombinantní plazmid z jednoho takového klonu byl označený pEG2207. pEG2207 byl následně použit pro transformaci pomocí elektroporace, akrystaliferní B. thuringiensis kmen EG 10650 na rezistanci proti erytromycinu. Rekombinantní kmen obsahující pEG2207 byl označen pEG12158.

Kmeny EG11658, EG12156 a EG12158 byly použity pro inokulaci 100 ml C2 vývarových kultur obsahujících 10 gg/ml erytromycinu. Vývarové kultury byly pěstovány při třepání v 500 ml přepažených baňkách při teplotě 28 až 30°C po dobu 3 dnů během nichž kultury plně sporulovaly a sporangia lyžovala. Ze spor a krystalů byl vytvořen pelet centrifugací při 8 000 otáčkách za minutu (~9800 x g) v JA 14 rotoru po dobu 20 minut při teplotě 4 °C. Pelet byl suspendován v 50 ml 10 mM Tris-HCL, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,005% Triton® X-100 (pH 7,0). Ze spor a krystalů byl opět vytvořen pelet centrifugací při 3,750 rpm (-3200 x g) v Beckrnan GPR centrifuze po dobu 1 • · « · » »· · » φ r ···· · · · ♦ * · φ φ · » · Φ · « · · 4 • Φ · ·· * ··· • » a · · · · ··· ·· »· ·*

132 hodiny při teplotě 4°C. Pelet byl resuspendován v 10 ml 10 mM Tris-HCI, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA 0,005% Triton® X-100 (pH 7,0) a skladován při teplotě 4 až 8 °C.

Krystalové proteiny tvořené těmito kulturami byly určeny pomocí SDS-PAGE a následovalo barvení SDS gelů Coomassie Brilliant Blue R-250, jak bylo popsáno v části 5.11. Výsledky této analýzy prokázaly, že kmen EG2156 vytvářel ET80, ale ne CryET76, zatímco kmen EG12158 vytvářel CryET76, ale ne CryET80 (obr. 3). Takže každý krystalový protein může být tvořen nezávisle na jiném krystalovém proteinu. Role každého krystalového proteinu v účinné toxicitě proti SCRW larválnímu stádiu může být nyní studována dokonce ještě detailněji.

SDS-PAGE analýza popsaná na obrázku 3 také ukázala přítomnost dalších proteinů přítomných v obou EG12156 a EG12158 krystalových přípravcích.Tento protein má zjevně molekulární hmotnost přibližně 35 kDa a byl označen CryET84.

Další DNA sekvenční analýza klonovaného inzertu vpEG1823 ukázala třetí otevřený čtecí rámec vhodný pro kódování ~38-kDa proteinu (SEQ ID č.: 19). Tato kódující oblast je lokalizována bezprostředně 5' kcryET80 genu. Takže cryET84 cryET80 a cryET76 mohou obsahovat operón. CryET84 protein izolovaný z EG4851 obsahuje 341 aminokyselinových sekvencí a má vypočítanou molekulovou hmotnost přibližně 37,884 Da. CryET84 má vypočítanou ezoelektrickou konstantu (pí) 5,5.

SDS PAGE analýza EG11658 krystalového proteinu použitá pro WCRW test popsaný v části 5.21 neuzjistila CryET84 proteinový pás. Zdá se, že malé rozdíly v kultivaci kmenu nebo ve způsobu vytěžení a promytí spóro-krystalové suspenze může mít za následek ztrátu CryET84.

Sekvenční srovnání používající Blast 2.0 a FASTA 3, jak bylo popsáno v příkladu 8, neukázalo žádnou významnou sekvenční shodu mezi CryET84 a kterýmkoli známým B. thuringiensis krystalovým proteinem.

Příklad 24

Příprava transgenních rostlin rezistentních proti hmyzu

Konstrukce rostlinného transgenu

Exprese rostlinného transgenu, který existuje ve formě dvouřetězcové DNA zahrnuje transkripci messenger RNA (mRNA) z jednoho vlákna DNA pomocí enzymu RNA polymerázy a následné procesování mRNA primárního transkriptu uvnitř jádra. Toto procesování zahrnuje 3' nepřekládanou oblast, která přidává polyadenylované nukleotidy k 3 'konci RNA. Transkripce DNA do mRNA je regulována oblastí DNA obvykle označovanou jako „promotor“. Promotorová oblast • «

133 obsahuje sekvence bází, které signalizují RNA polymeráze kde se připojit k DNA a začít transkripci mRNA s použitím jednoho z vláken DNA jako matrice pro vytvoření odpovídajícího vlákna RNA.

Množství pomótorů, které jsou účinné v rostlinných buňkách, bylo popsáno v literatuře. Takové promotory mohou být získány z rostlin nebo rostlinných virů a zahrnují, ale nejsou omezeny na, promotory nopalin syntázy (NOS) a oktopin syntázy (OCS) (které jsou neseny na nádory způsobujících plazmidech Agrobacterium tumefaciens), promotory viru květákové mozaiky (CaMV) 19S a 35S, light-inducibilní promotor z malé podjednotky ribulózy 1,5-bisfosfátkarboxylázy (ssRUBISCO, velmi hojný rostlinný polypeptid) a promotor viru krtičníkové mozaiky (FMV) 35S. Všechny tyto promotory byly použity pro vytvoření různých typů DNA konstruktů, které byly exprimovány vroslinách (viz například U.S. patent č. 5,463,175, který je zde zařazen tímto odkazem).

Konkrétní vybraný promotor by měl být schopen způsobit významnou expresi enzym kódující sekvence, čímž vzniká účinné množství proteinu. Jedna výhodná sada promotorů jsou promotory konstitutivní, jako jsou například CaMV35S nebo FMV35S promotory, které dávají vysoké hladiny exprese v mnoha rostlinných orgánech (U.S. patent č.: 5378619, které jsou zde zařazeny tímto odkazem). Jiná sada výhodných promotorů jsou kořenové prodlužovací nebo specifické promotory, jako je například CaMV odvozený 4 -1 promotor nebo pšeničný P0X1 promotor (U.S. patent č.: 5023179 který je zde zařazen tímto odkazem, Hertig a kol., 1991). Kořenové prodlužovací nebo specifické promotory by měly být obzvláště výhodné pro řízení kmenů Diabroticus (corn rootworm) v transgenních kukuřičných rostlinách.

Promotory používané v DNA konstruktech podle vynálezu mohou být modifikovány, pokud je to zapotřebí, pro zlepšení jejich řídících charakteristik. Například CaMV35S promotor může být připojen na část ssRUBISCO genu, který zastavuje expresi ssRUBISCO v nepřítomnosti světla, čímž vzniká promotor, který je účinný v listech, ale ne v kořenech. Výsledný chimérický promotor může být použit zde uvedeným způsobem. Pro účely tohoto popisu vyjádření „CaMV35S“ promotor tedy zahrnuje variace CaMV35S promotoru, například promotory odvozené prostředky ligace s řídící oblastí, náhodnou nebo řízenou mutací, atd. Kromě toho mohou být promotory upraveny tak, aby obsahovaly mnohonásobné „prodlužovací sekvence“, které pomáhají zvýšit genovou expresi.

RNA tvořená pomocí DNA konsruktu podle vynálezu také obsahuje 5' nepřekládanou vedoucí sekvenci. Tato sekvence může obýt odvozena od promotoru vybraného, aby exprimoval gen a může být specificky modifikována, aby se zvýšila translace mRNA. 5' nepřekládané oblasti mohou také být získány z virových RNA, z vhodných eukaryotických genů nebo z syntetické

134

• · · · genové sekvence. Vynález není omezen na konstrukty, v nichž nepřekládaná oblast je odvozena z 5' nepřekládané sekvence, která doprovází promotorovou sekvenci.

Pro optimalizaci exprese v jednoděložných rostlinách, jako je například kukuřice, může být také v DNA expresním konsruktu obsažen intron. Tento intron by měl být typicky umístěn blízko 5' konce mRNA v nepřekládané sekvenci. Tento intron může být získán z sady intronů sestávající z kukuřičného hsp70 intronu (U.S. patent č.: 5424412; který je zde zařazen tímto odkazem) nebo rýžového Actl intronu (McElroy a kol., 1990), ale není na ně omezen.

Jak bylo uvedeno dříve, 3' nepřekládaná oblast chimérických rostlinných genů podle vynálezu obsahuje polyadenylační signál, který způsobuje v rostlinách adici adenylováných nukleotidů k 3' konci RNA. Příklady 3' oblastí jsou s výhodou (1) 3' transkribované nepřekládané oblasti obsahující polyadenylační signál Agrobacterium nádory způsobujících (Ti) plazmidových genů, jako je například gen nopalin synázy (NOS) a (2) rostlinné geny, jako je například hrachový ssRUBISCO E9 gen (Wong a kol., 1992)

5.24.2 Rostlinná transformace a exprese

Transgen, který obsahuje δ-endotoxin kódující sekvenci podle vynálezu může být inzertován do genomu rostliny jakoukoli vhodnou metodou, jako jsou například ty zde uvedené. Vhodné rostlinné transformační vektory zahrnují ty vektory, které jsou odvozené od Ti plazmidu A. tumefaciens, stejně jako ty, popsané v Herrera- Estrella (1983), Bevan a kol., (1983), Klee (1985) a Evropské patentové přihlášce publikované pod číslem EP0120516. Kromě rostlinných transformačních vektorů odvozených od Ti nebo kořeny- indukujících (Ri) plazmidů A. tumefaciens, mohou být použity alternativní metody pro inzertování DNA konstruktů podle vynálezu do rostlinných buněk. Takové metody mohou zahrnovat, napříkldad, použití lipozómů, elektroporací, chemikálie, které zvyšují uptake volné DNA, uvolnění volné DNA pomocí ostřelování mikročásticemi a transformaci s použitím virů nebo pylu (Fromm a kol., 1986; Fromm a kol., 1990). Takové metody jsou popsány detailně v části 4.0.

Konstrukce rostlinných expresních vektorů

Pro dobře fungující expresi zde popsaných polynukleotidů v transgenní ch rostlinách musí mít vybraná sekvenční oblast (oblasti) kódující insektícidní polypeptid (polypeptidy) vhodnou sekvenční kompozici (Diehn a kol., 1996).

Například, za účelem umístění jednoho nebo více cry genů podle vynálezu ve vektoru, který je vhodný pro expresi v jednoděložných rostlinách (například pod kontrolou prodlužovacího

135

promotoru viru květákové mozaiky 35S a spojenou shsp70 intronem následujícím po nopalin syntáza polyadenylačním místě, jak je uvedno v U.S. patentu č.: 5424412, který je zde zařazen tímto odkazem), může být vektor digerován vhodnými enzymy, jako je například Ncol a EcoRI. Větší vektorový pás o přibližně 4,6 kb je pak podroben elektroforéze, přečištěn a spojen T4 DNA ligázou do vhodného restrikčního fragmentu, který obsahuje vložené geny. Ligační směs je poté transformována do E. coli, carbenicilin rezistentní kolonie získány a plazmid DNA získán pomocí DNA miniprep. postupů. DNA může pak být vystavena restrikční endonukleázové analýze enzymy, jako je například Ncol a EcoRI (společně), Notl a Pstl pro určení klonů obsahujcících cry gen kódující sekvenci, která fúzovala do hsp70 intronu (pod kontrolou prodlužovacího promotoru CaMV35S.)

Za účelem umístění δ-endotoxinového genu ve vektoru, který je vhodný pro získání stabilních transformovaných a proti hmyzu rezistentních rostlin, může být izolován restrikční fragment z pMON33708 obsahující lyzin oxidázu kódující sekvenci fúzovanou na hsp70 intron pod konrolou prodlužovacího CaMV35S promotoru pomocí gelové elektroforézy a přečištění. Tento fragment pak může být spojen s vektorem, jako je například pMON30460, který je ošetřen Notl a telecí střevní alkalickou fosfatázou (pMON30460 obsahuje neomycin fosfotransferázu kódující sekvenci pod kontrolou CaMV35S promotoru). Ke kanamycinu rezistentní kolonie mohou pak být získány tmsformací této ligační směsi do E. coli a kolonie obsahující výsledný plazmid mohou být určeny restrikční endonukleázovou digerací plazmidových miniprep DNA. Restrikční enzymy, jako je například Notl, EcóRN, Hindlll, Ncol, EcoRl a Bglll, mohou být použity pro určení vhodných klonů obsahujících restrikční fragment přesně inzertovaný do odpovídajícího místa pMON30460, v takové orientaci, že oba geny jsou v tandemu (tj. 3' konec cry genové expresní kazety je připojen k 5' konci nptll expresní kazety). Exprese Cry proteinů výsledným vektorem je pak ověřena v rostlinných protoplastech elektroporací vektoru do protoplastů, po níž následuje proteinový přenos a ELISA analýza. Tento vektor může být vložen do gonomové DNA rostlinných embryí, jako jsou například kukuřičná embrya, ostřelováním z mikročásticové pistole, a následuje paromycinová selekce pro získání kukuřičných rostlin exprimujících cry gen, což je popsáno v U. S. patentu č. 5,424,412, který je zde zařazen tímto odkazem. V tomto příkladu byl vektor vložen pomocí společného ostřelování splazmidem, který dává rezistenci k hygromycinu, do štítku nezralého embrya (IES) kukuřice, následovala hygromycinová selekce a regenerace. Transgenní rostlinné linie exprimující cry protein byly pak určeny ELISA analýzou. Potomstvo semen těchto výsledných rostlin může pak být následně testováno na rezistenci proti hmyzu.

136 • 4

Příklad 25

Modifikace bakteriálních genů pro expresi v rostlinách

Mnohé divoké typy genů kódujících bakteriální krystalové proteiny jsou známy tím, že špatně exprimují v rostlinách, ať už jako geny plné délky nebo jako ořezané geny. cry gen obsahuje obvykle málo G+C (37 %) a často obsahuje mnoho A+T bohatých oblastí, potenciálních polyadenylačních míst, a mnoho ATTTA sekvencí. Tabulka26 ukazuje seznam potenciálních pólyadenylačních sekvencí, kterým je zapotřebí se vyhnout při přípravě „plazmidového“ genového konstuktu.

Tabulka 26

Výpis sekvencí potenciálních polyadenylačních signálů

AATAAA*

AATAAT*

AACCAA

ATATAA

AATCAA

ATACTA

ATAAAA

ATGAAA

AAGCAT

ATTAAT

ATACAT

AAAATA

ATTAAA**

AATTAA**

AATACA**

CATAAA** * potenciální majoritní rostlinné polyadenylační místo ** potenciální minoritní živočišné polyadenylační místo

Všechna ostatní jsou potenciální minoritní rostlinná polyadenylační místa.

Oblasti pro mutagenezi mohou být vybrány následujícím způsobem. Byly určeny všechny oblasti DNA sekvence cry genu, které obsahují pět nebo více po sobě jdoucích párů bází, které byly A nebo T. Tyto byly rozděleny podle délky a podle procenta A+T v okolní sekvenční oblasti přes 20 až 30 párů bází. DNA byla analyzována na oblasti, které by mohly obsahovat polyadenylační místa nebo ATTTA sekvence. Oligonukleotidy byly pak označeny podle obsahu A+T po sobě jdoucích oblastí, které obsahují jedno nebo více polyadenylačních míst nebo ATTTA sekvencí. Dvě potenciální rostlinná polyadenylační místa se ukázala být více kritická na základě publikovaných výzkumů. Byly vybrány kodony, které mají zvýšený obsah G+C, ale netvoří restrikční místa pro

137

enzymy, a které jsou vhodné pro klonování a sestavení modifikovaných genů (například /tazwHI, Bgttl, Sací, Ncól, EcóRH atd.) Podobně je zapotřebí se vyhnout kodonům, které obsahují páry TA nebo GC, a které byly uvedeny jako kodony, které se zřídka vyskytují v rostlinách.

Ačkoli CaMV35S promotor je obecně konstitutivní promotor vyšší hladiny ve většině rostlinných tkání, hladina exprese genů řízených CaMV35S promotorem je nízká vtkáni květů ve srovnání s hladinami pozorovanými v listové tkáni. Protože jsou hmyzem často napadány květní části ekonomicky významných plodin nebo části rostlin od nich odvozené (nerozvité květy a paličky bavlníku, pupeny tabáku, pupeny rajčete a ovoce), je časo výhodné zvýšit expresi krystalových proteinů v těchto tkáních nad haldinu, kterou lze získat s použitím CaMV35 AS promotoru.

35S promotor viru krtičníkové mozaiky (FMV) je shodný s CaMV35S promotorem. Tento promotor byl izolován a vpraven do rosltinného trasformačního vektoru. Promotor FMV35S příbuzný CaMV promotoru je více exprimován v tkáni květů, přičemž poskytuje podobné hladiny genové exprese ve tkáních jako jsou například listy. Může být konstruován rostlinný transformační vektor, ve kterém je FMV promotorem řízen jeden nebo více δ-endotoxin kódujících genů plné délky přirozených nebo uměle získaných. Například tabákové rostliny mohou být transformovány takovým vektorem a je možno srovnat expresi krystalového proteinu(ů) pomocí westernového přenosu nebo ELISA testu v listech a /nebo v tkáni květů. FMV promotor byl použit pro tvorbu poměrně vysokých hladin krystalového proteinu v tkáni květů ve srovnání s CaMV promotorem.

Příklad 26

Exprese přirozených nebo získaných cry genů pomocí ssRUBISCO promotorů a chloroplastových tranzitních peptidů

Geny, které v rostlinách kódují malou podjednotku RUBISCO (SSU) jsou často silně exprimovány, snadno regulovány a někdy tkáňově specifické. Tyto expresní vlastnosti jsou způsobeny především sekvencí promotorů těchto genů. Bylo možné použít SSU promotory pro expresi heterologních genů v transformovaných rostlinách. Rostliny budou typicky obsahovat mnohonásobné SSU geny a hladiny exprese a tkáňová specificita různých SSU genů se bude lišit. SSU proteiny jsou kódovány v jádře a syntetizovány v cytoplazmě jako prekurzory, které obsahují NH₂- konec prodlužování, známé jako chloroplastové tranzitní peptidy (CTP). CTP řídí prekurzor do chloroplastu a začíná uptake SSU proteinu do chloroplastu. V tomto procesu je CTP vyštěpeno z SSU proteinu. Tyto CTP sekvence byly použity k řízení heterologních proteinů do chloroplastů transformovaných rostlin.

• ·

138

SSU promotory mohou mít několi výhod pro expresi heterologních genů v rostlinách. Některé SSU promotory jsou velmi silně exprimovány a mohou dávat zvýšené hladiny exprese, tak vysoké nebo vyšší než ty, které byly pozorovány u CaMV35S promotoru. Rozdělení exprese do tkání z SSU promotorů se liší od CaMV35S promotoru, takže pro hubení některých hmyzích škůdců může být výhodné řídit expresi krystalových proteinů těmito buňkami, ve kterých SSU je mnohem více exprimován. Například, ačkoli poměrně konstitutivní, v listech je CaMV35S promotor více exprimován ve tkáni cévních svazků než v některých jiných částech listu, zatímco většina SSU promotorů je více exprimována v buňkách mezofylu listu. Některé SSU promotory jsou také více tkáňově specifické, takže je možné použít specifický SSU promotor pro expresi proteinu podle vynálezu pouze v podskupině rostlinných tkání, pokud se například ukázalo, že exprese takového proteinu je pro určité buňky škodlivá. Napříkad, pro hubení mandelinky bramborové (Colorado potato beetle) v bramborách může být výhodné použít SSU promotory pro řízení exprese krystalového proteinu v listech, ale ne v jedlých hlízách.

Použití SSU CTP sekvencí pro lokalizaci krystalových proteinů do chloroplastů může být také výhodné. Lokalizace B. thuringiensis krystalových proteinů do chloroplastů je může ochránit před proteázami, které se nacházejí v cytoplazmě. To může stabilizovat proteiny a vést k většímu hromadění aktivního toxinů. cry geny obsahující CTP mohou být použity v kombinaci s SSU promotorem nebo s jinými promotory, jako je například CaMV35S.

Příklad 27

Cílení δ- endotoxin polypeptidů do extracelulárního prostoru nebo vakuoly používající signální peptidy

B. thuringiensis δ- endotoxin polypeptidů zde popsaných mohou být primárně lokalizovány do cytoplazmy transformovaných rostlinných buněk a výsledkem této lokalizace v cytoplazmě mohou být rostliny rezistentní proti hmyzu. Avšak v určitých příkladech provedení může být výhodné řídit lokalizaci nebo tvorbu B. thuringiensis polypeptidu(ů) do jedné nebo více organel rostliny nebo do specielních typů rostlinných buněk. Lokalizace B. thuringiensis proteinů v organelách raději než v cytoplazmě je výhodná v tom, že snižuje vystavení B. thuringiensis proteinů cytoplazmatickým proteázám, což vede k většímu hromadění proteinu, pterý poskytuje insekticidní účinek. Extracelulámí lokalizace může vést kúčinějšímu vystavení určitého hmyzu působení B. thuringiensis proteinů, což vede k větší účinnosti. V případech, kdy je B. thuringiensis ··*

·· ··*·

139 protein škodlivý pro funkci rostlinné buňky, může jeho lokalizace do organel ochránit tyto buňky před toxicitou proteinu.

V rostlinách, stejně jako v jiných eukaryotech, jsou proteiny, lokalizované buď v extracelulárních prostorách nebo v několika specifických organelách, obvykle syntetizovány s NH₂koncovým aminokyselinovým přečnívajícím koncem, který slouží jako signální peptid. Tento signální peptid řídí protein, aby vstoupil do dráhy začlenění do organely, a je obvykle vyštěpen ze zralého proteinu jako raný krok v procesu začlenění do organely. Skrytá dráha pro extracelulární protein obvykle zahrnuje kotranslační inzerci do edoplazmatického retikula, přičemž se objevuje štěpení signálního peptidu. Zralý protein pak prochází Golgiho systémem do váčků, které fúzují s plazmatickou membránou, uvolňujíce tak protein do extracelulárního prostoru. Proteiny cílené do jiných organel prochází podobnou dráhou. Napříkald proteiny, které jsou cíleny do endoplazmatického retikula nebo do Golgiho komplexu sledují tuto dráhu, ale jsou specificky ponechány vdané organele. U rostlin jsou některé proteiny cílené do vakuoly, což je další membránová organela, vyskytující se v mnoha rostlinných buňkách. Proteiny cílené do vakuol se rozcházejí svýše uvedenou dráhou v Golgiho systému, kde vstupují do váčků, které fúzují s vakuolou.

Běžným znakem tohoto cílení proteinů je signální peptid, který zahajuje proces začlenění do organely. Fuze signálního peptidu do proteinu povede v mnoha případech k cílení těchto proteinů do endoplazmatického retikula. Účinnost tohoto kroku může také záviset na sekvenci samotného zralého proteinu. Signály, které řídí protein do konkrétních organel spíše než do extracelulárního prostoru nejsou dosud přesně známy. Zdá se, že mnoho signálů, které řídí protein do konkrétních organel je obsaženo v aminokyselinové sekvenci zralého proteinu. To bylo ukázáno pro některé do vakuol cílené proteiny, ale není dosud možné definovat tyto sekvence přesně. Zdá se, že vylučování do extracelulárního prostoru je „chybná“ dráha pro protein, který kóduje signální sekvenci, ale nemá žádný další signál pro začlenění do organely. Strategie řízení B. thuringiensis proteinů mimo cytoplazmu je tedy fúze genů pro syntetické B. thuringiensis geny do DNA sekvencí kódujících známé rostlinné signální peptidy. Tyto fuzní geny budou dávat více B. thuringiensis proteinů, které projdou sekundární dráhu a povede k extracelulárnímu vylučování nebo cílení do vakuol nebo jiných organel.

Signální sekvence pro několik rostlinných genů byly popsány. Jedna taková sekvence je pro patogenní tabákový virus PRlb byla již dříve popsána (Comelissen a kol.,1986). PRlb protein je normálně lokalizován do extracelulárního prostoru. Jiný typ signálního peptidu je obsažen na

140 ·· ·· • 9 9 ·

9 ♦

9 9 9 · · • · · · · · zásobních proteinech semen luštěnin. Tyto proteiny jsou lokalizovány do proteinového těla semen, což je vakuole podobná organela nacházející se v semenech. DNA sekvence signálního peptidu pro β- podjednotku 7S zásobního proteinu běžné odrůdy fazolí (Phaseolus vulgaris), PvuB byla popsána (Doyle a kol., 1986). Na základě již publikovaného mohou být tyto publikované sekvence, geny syntetizovány chemicky s použitím oligonukleotidů, které kódují signální peptidy pro PRlb a PvuB. V některých případech může být pro dosažení sekrece heterologních proteinů nebo jejich začlenění do organely nezbytné, aby obsahovaly několik aminokyselinových sekvencí za normálním místem sestřihu signálního peptidu. Může to být nezbytné pro zajištění přesnosti sestřihu signálního peptidu.

Odkazy

Následující odkazy, které uvádí další příklady postupů a jiných detailů ke zde uvedeným, jsou zde zařazeny těmito odkazy:

U. S. Patent 4196265, ze dne 1. dubna 1980.

U. S. Patent 4237224, ze dne 2. prosince 1980.

U. S. Patent 4554101, ze dne 19. prosince 1985.

U. S. Patent 4683195, ze dne 28. července 1987.

U. S. Patent 4683202, ze dne 28. července 1987.

U. S. Patent 4757011, ze dne 12. července 1988.

U. S. Patent 4766203, ze dne 23. srpna 1988.

U. S. Patent 4769061, ze dne 6. září 1988.

U. S. Patent 4800159, ze dne 24. ledna 1989.

U. S. Patent 4883750, ze dne 28. prosince 1989.

U. S. Patent 4940835, ze dne 23. února 1990.

U. S. Patent 4943674, ze dne 24. července 1990.

U. S. Patent 4965188, ze dne 23. října 1990.

U. S. Patent 4971908, ze dne 20. listopadu 1990.

U. S. Patent 4987071, ze dne 22. ledna 1991.

U. S. Patent 5023179, ze dne 11 června 1991.

U. S. Patent 5097025, ze dne 17. března 1992.

U. S. Patent 5106739, ze dne 21. dubna 1992.

U. S. Patent 5110732, ze dne 5. května 1992.

U. S. Patent 5139954, ze dne 19. srpna 1992.

141 • ·« ·· ♦ · • · 9 • * ·

9 ·· ··«♦

U. S. Patent 5176995, ze dne 15. října 1991 U. S. Patent 5177011, ze dne 5. ledna 1993.

U. S. Patent 5187091, ze dne 15. října 1991.

U. S. Patent 5334711, ze dne 2. srpna 1994.

U. S. Patent 5378619, ze dne 3. ledna 1995.

U. S. Patent 5384253, ze dne 24. ledna 1995.

U. S. Patent 5401836, ze dne 28. března 1995.

U. S. Patent 5424412, ze dne 13. června 1995.

U. S. Patent 5436002, ze dne 25. července 1995. U. S. Patent 5436393, ze dne 25. června 1995.

U. S. Patent 5442052, ze dne 15. srpna 1995.

U. S. Patent 5447858, ze dne 5. září 1995.

U. S. Patent 5459252, ze dne 17. října 1995.

U. S. Patent 5463175, ze dne 31. října 1995.

U. S. Patent 5491288, ze dne 13. února 1996.

U. S. Patent 5504200, ze dne 2. dubna 1996.

U. S. Patent 5530196, ze dne 25. června 1996.

U. S. Patent 5538879, ze dne 23. července 1996. U. S. Patent 5576198, ze dne 19. listopadu 1996. U. S. Patent 5589583, ze dne 31. prosince 1996. U. S. Patent 5589610, ze dne 31. prosince 1996. U. S. Patent 5589614, ze dne 31. prosince 1996. U. S. Patent 5595896, ze dne 21. ledna 1997.

U. S. Patent 5608144, ze dne 4. března 1997.

U. S. Patent 5614399, ze dne 25. března 1997.

U. S. Patent 5631359, ze dne 20. května 1997.

U. S. Patent 5633363, ze dne 27. května, 1997.

U. S. Patent 5633439, ze dne 27. května, 1997.

U. S. Patent 5633440, ze dne 27. května,1997.

U. S. Patent 5633441, ze dne 27. května,1997.

U. S. Patent 5646333, ze dne 8. července 1997.

• 4

142

44

4 4 •4 4444

U. S. Patent 5659124, ze dne 19. srpna 1997.

U. S. Patent 5689040, ze dne 18. listopadu 1997.

U. S. Patent 5689049, ze dne 18. listopadu 1997.

U. S. Patent 5689051, ze dne 18. listopadu 1997.

U. S. Patent 5689056, ze dne 18. listopadu 1997.

U. S. Patent 5700922, ze dne 23. prosince 1997.

U. S. Patent 5712112, ze dne 27. ledna 1998.

Mez. patent, přihláška č. PCT/US87/00880.

Mez. patent, přihláška č. PCT/US89/01025.

Mez. patent, přihláška č. WO 88/10315.

Mez. patent, přihláška č. WO 89/06700.

Mez. patent, přihláška č. WO 90/13651.

Mez. patent, přihláška č. WO 91/03162.

Mez. patent, přihláška č. WO 92/07065.

Mez. patent, přihláška č. WO 93/15187.

Mez. patent, přihláška č. WO 93/23569.

Mez. patent, přihláška č. WO 94/02595.

Mez. patent, přihláška č. WO 94/13688.

Mez. patent, přihláška č. WO 96/10083.

Mez. patent, přihláška č. WO 97/17507.

Mez. patent, přihláška č. WO 97/17600.

Mez. patent, přihláška č. WO 97/40162.

Evropská patent, přihláška č. EP0120516.

Evropská patent, přihláška č. EP0360257.

Evropská patent, přihláška č. EP 320308.

Evropská patent, přihláška č. EP 329822.

Evropská patent, přihláška č. 92110298.4

Patent, přihláška Velké Británie č. GB 2202328.

Abdullah a kol., Biotechnology, 4:1087, 1986.

Abbott, A method for computing the effectiveness of an insecticide, J Econ. Entomol., 18:265267.1925.

143

·· ····

Altschul, Stephen F. a kol., Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs, Nucl. AcidsRes. 25:3389-3402, 1997.

Arantes and Lereclus, Gene, 108:115-119 1991.

Armitage a kol., Proč. Nati. A cad. Sci. USA, 94(23):12320-12325,1997.

Baumlein, Boeijan, Nagy, Panitz, Inze, Wobus, Upstream sequences regulating legumin gene expression in heterologous transgenic plants, Mol. Gen. Genet., 225(1 ): 121-128, 1991.

Bawn, a kol., Appl. Envior. Biol. 56:3420-3428, 1990.

Baumann a kol., J. Bacteriol., 170:2045-2050, 1988.

Benbrook a kol., In: Proceedings Bio Expo 1986, Butterworth, Stoneham, MA str. 27-54, 1986. Berná and Bernier, Regulated expression of a wheat germin gene in tobacco: oxalate oxidase activity and apoplastic localization of the heterologous protein, Plant Mol. Biol., 33(3):417-429, 1997.

Bevan a kol., Nucleic Acids Res., 11(2):369-85, 1983.

Boffa, Carpaneto, Allfrey, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92:1901-1905, 1995.

Boffa, Morris, Carpaneto, Louissaint, Allfrey, J. Biol. Chem., 271: 13228-13233, 1996.

Boronat, Martinez, Reina, Puigdomenech, Palau, Isolation and sequencing of a 28 kd gluteline-2 gene from maize: Common elements in the 5' flanking regions among zein and glutelin genes, Plant Sci., 47:95-102, 1986.

Brussock and Currier, Use of sodium dodecyl sulfate-polacryamide gel electrophoresis to quantify Bacillus thuringiensis δ-endotoxins, In: Analytical Chemistry ofBacillus thuringiensis, L.A. Hickle and W.L. Fitch, (Eds), American Chemical Society, Washington DC, str. 78-87, 1990.

Bytebier a kol., Proč. Nati. Acad Sci. USA, 84:5345,1987.

Callis a kol., Genes andDevelopment, 1: 1183, 1987.

Callis, Fromm, Walbot, Introns increase gene expression in cultured maize cells, Genes Devel., 1:1183-1200, 1987.

Campbell, Monoclonal Antibody Technology, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 13, Burden and Von Knippenberg, Eds. str. 75-83, Elsevier, Amsterdam 1984.

Capecchi, High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells, Cell, 22(2):479-488, 1980.

Carlsson a kol., Nátuře, 380:207, 1996.

144 • ·

Carlton and Gonzalez, Molecular Biology of Microbial Differnetiation, Ninth International Spore Conference, Asilomar, Calif., USA Sept. 3-6, 1984. IX+280P. American Society for Microbiology, 246-252, 1985.

Cashmore a kol., Gen. Eng. of Plants, Plenům Press, New York, 29-38, 1983.

Charles a kol., Zeni. Bakteriol. Suppl., 28(0):99-100, 1996a.

Charles a kol., Annual Review of Entomology, 41 :451-472, 1996b.

Chau a kol., Science, 244:174-181,1989.

Chen a kol., Nucl. AcidsRes., 20:4581-9, 1992.

Cheng, Sardana, Kaplan, Altosaar, II Agrobacterium-transfonned rice plants expressing synthetic . Nati. Acad. Sci. USA, 95(6):2767-2772, 1998.

Chowrira and Burke, Nucl. AcidsRes., 20:2835-2840,1992.

Christensen a kol., J. Pept. Sci., 1(3):175-183, 1995.

Christensen, Sharrock, Quail, Maize polyubiquitin genes: Structure, thermal perturbation of expression and transcript splicing, and promotér activity following transfer to protoplasts by electroporation, Plant Mol. Biol., 18:675-689, 1992.

Clapp, Somatic gene therapy into hematopoietic cells. Current status and future implications, Clin. Perinatol., 20(1):155-168, 1993.

Collins and Olivě, Biochem., 32:2795-2799, 1993.

Conway and Wickens, In: RNA Processing, str. 40, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 1988.

Corey, Trends Biotechnol., 15(6):224-229, 1997.

Comelissenetal., Nátuře, 321(6069):531-2,1986.

Crickmore a kol., Revision of the nomenclature for the Bacillus thuringiensis pesticidal crystal proteins, Proč. Nati. Acad. Sci USA 62:807-813, 1998 Cri a kol., Plant Physiol., 87:671-674, 1988.

Curiel, Agarwal, Wagner, Cotten, II Adenovirus enhancement of transferrin-polylysine-mediated gene delivery , Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88( 19):8850-8854, 1991.

Curiel, Wagner, Cotten, Birnstiel, Agarwal, Li, Loechel, and Hu, High-efficiency gene transfer mediated by adenovirus coupled to DNA-polylysine complexes, Hum. Gen. Ther., 3(2):147-154, 1992.

Daum, Revision of two Computer programs for probit analysis, Bull. Entomol. Soc. Amer., 16:1015, 1970.

145 «4» ·· 4 44 ·4

444 «444 4444 • 4 £4 44 4 4« 4

444444 4444 4 • 44 44 4 444

444 44 44 444 44 44*4

Dean a kol., M/cZ. AcidsRes., 14(5):2229, 1986.

Dennis, Gerlach, Pryor, Bennetzen, Inglis, Llewellyn, Sachs, Ferl, Peackocock, Molecular analysis of the alcohol dehydrogenase (Adhl) gene of maize, Nucl. AcidsRes., 12:3983- 4000, 1984.

Diehn a kol., Genet. Eng. (N.Y.), 18:83-99, 1996.

Dhir, Dhir, Hepbum, Widholm, Factors affecting transient gene expression in electroporated Glydne-max protoplasts, Plant Cell Rep., 10(2): 106-110, 1991 a.

Donovan a kol., Appl. Environ. Microbiol, 58:3921-3927, 1992.

Doyle a kol., J. Biol. Chem., 261(20):9228-38, 1986.

Dropulic a kol., J. Virol., 66:1432-41, 1992.

Dueholm a kol., J. Org. Chem., 59:5767-5773, 1994.

Egholm a kol., Nátuře, 365:566-568,1993.

Eglitis and Anderson, Retroviral vectors for introduction of genes into mammalian cells, Biotechniques, 6(7):608-614, 1988.

Eglitis, Kantoff, Kohn, Karson, Moen, Lothrop, Blaese, Anderson, Retroviral-mediated gene transfer into hemopoietic cells, Avd. Exp. Med. Biol., 241 :19-27, 1988.

Elroy-Stein and Moss, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87:6743- 7, 1990.

English and Slatin, Insect Biochem. Mol Biol., 22: 1- 7,1992.

Faktor, Kooter, Dixon, Lamb, Functional dissection of a beán chalcone synthase gene promotér in transgenic tobacco plants reveals sequence motifs essential for floral expression, Plant Mol. Biol., 32(5):849-859, 1996.

Ficker, Kirch, Eijlander, Jacobsen, Thompson, Multiple elements of the S2-RNase promotér from potato (Solárium tuberosum L) are required for cell type-specific expression in transgenic potato and tobacco, Mol. Gen. Gene/., 257(2):132-142, 1998.

Footer, Engholm, Kron, Coull, Matsudaira, Biochemistry, 35:10673-10679, 1996. Fraley a kol., Biotechnology. 3:629, 1985.

Fraley a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 80:4803, 1983.

French, Janda, Ahlquist, Bacterial gene inserted in an engineered RNA virus: efficient expression in monocotyledonous plant cells, Science, 231: 1294-1297,1986.

Frohrnan, In: PCŘ¹^ Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academie Press, New York 1990.

Fromm a kol., Biotechnology (N.Y.), 8(9):833-9, 1990.

146

4 O >

• 4 · »4«

44

4 · 9

4 *

4 4

4444

Fromm, Taylor, Walbot, Expression of genes transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 82( 17):5824-5828, 1985.

Fromm a kol., Nátuře, 319:791-793,1986.

Fujimura a kol., Plant Tiss. Cult. Lett., 2.Ί4, 1985.

Fynan, Webster, Fuller, Haynes, Santoro, Robinson, DNA vaccines: protective immunizations by parenteral, mucosal, and gene gun inoculations, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90(24):11478-11482, 1993.

Gallie and Young, The regulation of expression in transformed maize aleurone and endosperm protoplasts, Plant Physiol., 106:929-939, 1994.

Gallie, Feder, Schimke, Walbot, Post-transcriptional regulation in higher eukaryotes: the role of the reportér gene in controlling expression, Mol. Gen. Genet., 228:258-264,1991.

Gallie, Lucas, Walbot, Visualizing mRNA expression in plant protoplasts: factors influencing efficient mRNA uptake and translation, Plant Cell, 1 :301-311, 1989.

Gallie, Sleat, Turner, Wilson, Mutational analysis of the tobacco mosaic virus 5'-leader for altered ability to enhance translation, Nucl. AcidsRes., 16:883-893,1988.

Gallie, Sleat, Watts, Turner, Wilson, A comparison of eukaryotic viral 5'-leader sequences as enhancers of mRNA expression in vivo, Nucl. AcidsRes., 15:8693-8711, 1987b.

Gallie, Sleat, Watts, Turner, Wilson, The 5'-leader sequence of tobacco mosaic virus RNA enhances the expression of foreign gene transcripts in vitro and in vivo, Nucl. Acids Res., 15:32573273, 1987a.

Gambacorti-Passerini a kol., Blood, 88: 1411-1417,1996.

Gao and Huang, Nucl. AcidsRes., 21 :2867-72,1993.

Gefter a kol., Sómat. Cell Genet., 3:231-236, 1977.

Gehrke, Auron, Quigley, Rich, Sonenberg, 5'-Conformation of capped alfalfa mosaic virus ribonucleic acid 4 may reflect its independence of the cap structure or of cap-binding protein for efficient translation, Biochemistry, 22:5157-5164, 1983.

Genovese and Milcarek, In: RNA Processing, str. 62, Cold Spring Harbor Laboratoiy , Cold Spring Harbor, NY 1988.

Gil and Proudfoot, Nátuře, 312:473,1984.

Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, str. 60- 74. kmené vydání, Academie Press, Orlando, FL 1986.

147 • »

Goelet, Lomonossoff, Butler, Akam, Gait, Karn, Nucleotide sequence of tobacco mosaic virus RNA, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 79:5818-5822, 1982.

Gonzalez Jr. a kol., Proč. Nati. Acad. Sci USA, 79:6951-6955, 1982.

Good and Nielsen, Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 7(4):431-437,1997.

Graham, Craig, Waterhouse, Expression patterns of vascular-specific promoters ROIC and Sh in transgenic potatoes and their use in engineering PLRV-resistant plants, Plant Mol. Biol., 33(4):729735, 1997.

Graham, F. L., and van der Eb, A. I., Transformation of rat cells by DNA of human adenovirus 5, Virology, 54(2):536-539, 1973.

Griffithakol., J. Am. Chem. Soc., 117:831-832, 1995.

Grosset, Alary, Gautier, Menossi, Martinez-Izquierdo, Joudrier, Characterization of a barley gene coding for an alpha-amylase inhibitor subunit (Cmd protein) and analysis of its promotér in transgenic tobacco plants and in maize kernels by microprojectile bombardment, Plant Mol. Biol., 34(2):331-338, 1997.

Guerrier- Takada a kol., Cell, 35:849,1983.

Haaima, Lohse, Buchardt, Nielsen, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 35:1939-1942,1996.

Hampel and Tritz, Biochem., 28:4929, 1989.

Hampel a kol., Nucl. AcidsRes., 18:299,1990.

Hanvey a kol., Science, 258:1481-1485, 1992.

Harlow and Lané, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor, NY 1988.

Herrera-Estrella a kol., Embo. J, 2(6):987-996, 1983.

Hertig a kol., Plant Mol. Biol., 16(1):171-4, 1991.

Hess, Intern Rev. Cytol., 107:367, 1987.

Hófte and Whiteley, Microbiol. Rev., 53:242-255, 1989.

Horsch, Fry, Hoffmann, Eichholtz, Rogers, Fraley, A simple and generál method for transferring genes into plants, Science, 227(4691):1229-1231, 1985.

Huang, An, McDowell, McKinney, Meagher, The Arabidopsis ACT11 action gene is strongly expressed in tissues of the emerging inflorescence, pollen and developing ovules, Plant Mol. Biol., 33(1):125-139, 1997.

148

Hudspeth and Grula, Structure and expression of the maize gene encoding the phosphoenolpyruvate carboxylase isozyme involved in C4 photosynthesis.¹', Plant Mol. Biol., 12:579-589,1989.

Hyrup and Nielsen, Bioorg. Med. Chem., 1996.

Ingelbrecht, Herman, Dekeyser, Van Montagu, Depicker, Different 3' end regions strongly influence the level of gene expression in plant cells, Plant Cell, 1 :671-680, 1989.

JafFieson and Wolf, The Antigenic Index: A Novel Algorithm for Predicting Antigenic Determinants, Compu. Appl. Biosci., 4(1):181-6, 1988.

Jensen a kol.., Biochemistry, 36(16):5072-5077, 1997.

Jobling and Gehrke, Enhanced translation of chimaeric messenger RNAs containing a plant viral untranslated leader sequence, Nátuře, 325 :622-625, 1987.

Johnston and Tang, Gene gun transfection of animal cells and genetic immunization, Methods Cell. Biol., 43(A):353-365, 1994.

Jones, Dean, Gidoni, Gilbert, Bond-Nutter, Lee, Bedbrook, Dunsmuir, Expression of bacterial chitinase protein in tobacco leaves using two photosynthetic gene promoters, Mol. Gen. Genet., 212:536-542, 1988.

Jorgensen a kol., A/o/. Gen. Genet., 20ΤΑΊΙ, 1987.

Joshi, An inspection of the domain between putative TATA box and translation start site in 79 plant genes, Nucl. AcidsRes., 15:6643-6653, 1987.

Kaiser and Kezdy, Science, 223:249-255, 1984.

Kashani-Sabet a kol., Antisense Res. Dev., 2:3-15, 1992.

Keller ukol, EMBO J., 8:1309-14, 1989.

Klee, Yanofsky, Nester, Vectors for transformation of higher plants, Bio-Technology, 3(7):637642, 1985.

Klein a kol., Nátuře, 327:70,1987.

Klein a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85:8502-8505, 1988.

Koch a kol., Tetrahedron Lett., 36:6933-6936, 1995.

Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511-519, 1976.

Kohler and Milstein, Nátuře, 256:495-497, 1975.

Koppelhus, Nucleic AcidsRes., 25(11 ):2167-2173, 1997.

Kom and Queen, DNA, 3:421-436, 1984.

149

·· ·· • · · · • · · » · · * • · · • · · · · ·

Koziel, Beland, Bowman, Carozzi, Crenshaw, Crossland, Dawson, Desai, Hill, Kadwell, Launis, Lewis, Maddox, McPherson, Meghji, Merlin, Rhodes, Warren, Wright, Evola, Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from Bacillus thuringiensis, Bio/technology, 11: 194-200, 1993.

Koziel, Carozzi, Desai, Optimizing expression of transgenes with an emphasis on posttranscriptional events, Plant Mol. Biol., 32(102):393-405, 1996.

Kremsky a kol., TetrahedronLett., 37:4313-4316,1996.

Krieg a kol., In: Zangew. Ent., 96:500-508, 1983.

Kuby, Immunology kmene vydání. W. H. Freeman & Company, New York 1994.

Kunkel, Roberts, Zakour, Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection, Methods Enzymol., 154:367-382, 1987.

Kwoh, Davis, Whitfield, Chappelle, DiMichele, Gingeras, Transcription-based amplification systém and detection of amplified human immunodeficiency virus type 1 with a bead-based sandwich hybridization formát, Proč. Nati. Acad. Sci. £7X4,86(4): 1173-1177, 1989.

Kyozuka, Fujimoto, lzawa, Shimamoto, Anaerobic induction and tissue-specific expression of maize Adhl promotér in transgenic rice plants and their progeny , Mol. Gen. Genet., 228(1-2):4048, 1991.

Kyte and Doolittle, A simple method for displaying the hydropathic character of a protein, J. Mol. Biol., 157(1):105-132, 1982.

LHuillier a kol., EMBOJ., 11 :4411-8, 1992.

Lambert a kol., Appl. Environ. Microhiol., 58:2536-2642, 1992b.

Lambert a kol., Gene, 110:131-132, 1992a.

Landsdorp a kol., Hum. Mol. Genet., 5 :685-691, 1996.

Langridge a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 86:3219-3223, 1989.

Lieber Methods Enzymol., 217:47-66, 1993.

Lindstrom a kol., Developmental Genetics, 11:160, 1990.

Lisziewicz a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA.,90:8000-4,1993.

Lorz a kol., A/o/. Gen. Genet., 199:178, 1985.

Lu, Xiao, Clapp, Li, Broxmeyer, High efficiency retroviral mediated gene transduction into single isolated immature and replatable CD34(3+) hematopoietic stem/progenitor cells from human umbilical cord blood, J. Exp. Med., 178(6):2089-2096, 1993.

Luehrsen a kol., Prog. Nucleic AcidRes. Mol. Biol., 47:149-93, 1994.

150

Luehrsen and Walbot, Intron enhancement of gene expression and the splicing efficiency of introns in maize cells,Mol. Gen. Genet., 225:81-93, 1991.

Luo a kol., Plant Mol. Riol. Reportér, 6: 165, 1988.

Lutcke, Chow, Mickel, Moss, Kern, Scheele, Selection of AUG initiation codons differs in plants and animals, EMBOJ., 6:43-48, 1987.

Maas, Laufs, Grant, Korfiiage, Werr, The combination of a novel stimulatory element in the first exon of the maize shrunken-l gene with the following intron enhances reportér gene expression 1000-fold, Plant Mol. Biol., 16:199-207, 1991.

Macaluso and Mettus, J. Bacteriol., 173:1353-1356, 1991.

Maddock a kol., Third International Congress of Plant Molecular Biology, Abstract 372, 1991. Maloy, Experimental Techniques in Bacterial Genetics Jones and Bartlett Publishers, Boston, MA 1990.

Maloy a kol., Microbial Genetics kmene vydání. Jones and Barlett Publishers, Boston, MA 1994. Maniatis a kol., Molecular Cloning: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor, NY. 1982.

Marcotte a kol., Nátuře, 335:454, 1988.

Mamme, Influence of artificial diet on Southern corn rootworm life history and susceptibility to insecticidal compounds, Westview Studies in Insect Biology; Advances in insect rearing for research and pěst management, 229-235, 1992.

Mascerenhas, Mettler, Pierce, Lowe, Intron mediated enhancement of heterologous gene expression in maize, Plant Mol. Biol., 15:913-920, 1990.

McBride, Svab, Schaaf, Hogan, Stalker, Maliga, Amplification of a chimeric Bacillus gene in chloroplaste leads to an extraordinary level of an insecticidal protein in tobacco, Bio/technology, 13:362-365, 1995.

McCabe a kol., Biotechnology, 6:923, 1988.

McDevitt a kol., Cell, 37:993-999,1984.

McElroy, Zhang, Wu, Isolation of an efficient promotér for use in rice transformation, Plant Cell, 2:163-171, 1990.

Michael, Biotechniques, 16:410-412,1994.

Mollegaard, Buchardt, Egholm, Nielsen, Proč. Nati. Acad.. Sci. USA, 91:3892-3895, 1994.

151

Nawrath, Poirier, Somerville, Targeting of the polyhydroxybutyrate biosynthetic pathway to the plastids of Arabidopsis thaliana results in high levels of polymer accumulation, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 91:12760-12764, 1994.

Neilsen, In: Perspectives in Drug Discovery and Design 4, Escom Science Publishers, str. 76-84, 1996.

Nielsen nko\., Anticancer Drug Des., 8(1):53-63,1993b.

Nielsen, Egholm, Berg, Buchardt, Science, 254:1497-1500,1991.

Norton, Piatyszek, Wright, Shay, Corey, Nat. Biotechnol., 14:615-620, 1996.

Norton, Waggenspack, Vamum, Corey, Bioorg. Med. Chem., 3:437-445,1995.

Oard, Paige, Dvorak, Chimeric gene expression using maize intron in cultured cells of breadwheat, Plant Cell. Rep., 8:156-160, 1989.

Oděli a kol., Nátuře, 313:810, 1985.

Ohara a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA., 86(15):5673-7, 1989.,

Ohkawa, Yuyama, Taira, Activities ofHIV-RNAtargeted ribozymes transcribed from a 'shotgun' type ribozyme-trimming plasmid, Nucl. Acids Symp. Ser., 27: 15-6, 1992.

Ojwang a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 10802-6, 1992.

Omirulleh a kol., Plant Mol. Biol., 21 :415-428,1993.

Orum, Nielsen, Egholm, Berg, Buchardt, Stanley, Nucl. Acids Res., 21 :5332-5336, 1993.

Orum, Nieisen, Jorgensen, Larsson, Stanley, Koch, Biotechniques, 19:472-480,1995.

Pandey and Marzluff, In RNA Processing, str. 133, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1987.

Pardridge, Boado, Kang, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 92:5592-5596,1995.

Pearson and Lipman, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 85(8):2444-8, 1988.

Pěna a kol., Nátuře, 325:274, 1987.

Perlak, Deaton, Armstrong, Fuchs, Sims, Greenplate, Fischhoff, Insect resistant cotton plants, Bio/Technology, 8:939-943, 1990.

Perlak, Fuchs, Dean, McPherson, Fischhoff, Modification of the coding sequence enhances plant expression of insect control protein genes, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88:3324-3328, 1991.

Perlak, Stone, Muskopf, Peterson, Parker, McPherson, Wyman, Love, Reed, Biever, Fischhoff, Genetically improved potatoes: protection from damage by Colorado potato beetles, Plant Mol. Biol.,22:313-321, 1993.

Perrault a kol., Nátuře, 344:565, 1990.

152

Perrotta and Been, Biochem., 31:16, 1992.

Perry-O'Keefe, Yao, Coull, Fuchs, Egholm, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 93:14670-14675, 1996. Petersen, Jensen, Egholm, Nielsen, Buchardt, Bioorg. Med. Chem. Letí., 5:1119-1124, 1995. Piekenakol., Science, 253:314, 1991.

Poogin and Skryabin, The 5' untranslated leader sequence of potato virus X RNA enhances the expression of the heterologous gene in vivó',Mol. Gen. Genet., 234:329-331, 1992.

Poszkowski a kol., EMROJ, 3:2719, 1989.

Potrykus a kol., Mol. Gen. Genet., 199:183, 1985.

Poulsen a kol., Afo/. Gen. Genet., 205:193-200,1986.

Prokop and Bajpai, Ann. N.Y. Acad. Sci., 646, 1991.

Rogers a kol., In: Methods For Plant Molecular Biology, Weissbach and Weissbach, eds., Academie Press lne., San Diego, CA 1988.

Rogers a kol., MethodsEnzymol., 153:253-277,1987.

Rose, Anal. Chem., 65(24):3545-3549,1993.

Rossi a kol., AidsRes. Hum. Retrovir., 8:183, 1992.

Ruskowski a kol.., Cancer, 80(12 Suppl):2699-2705, 1997.

Russell and Fromm, Tissue-specific expression in transgenic maize for four endosperm promoters from maize and rice, Transgenic Res., 6(2):157-168,1997.

Sadofsky and Alwine, Mol. Cell. Biol., 4(8):1460-1468, 1984.

Sambrook a kol., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold spring Harbor, NY, 1989a.

Samlcok a kol., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor, NY, 1989b.

Sanger a kol., DNA sequencing with chain-terminating inhibitors, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 74(12):5463-5467, 1977.

Sarverakol., Science, 247(4947):1222-5, 1990.

Saville and Collins, Cell, 61:685-696, 1990.

Saville and Collins, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88:8826-8830, 1991.

Scanlon a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 88:10591-5, 1991.

Scaringe a kol.., Nucl. AcidsRes., 18:5433-5441, 1990.

Seeger a kol., Biotechniques, 23(3 ):512-517, 1997.

Segal, Bioche:mical Calculations kmene vydání. John Wiley & Sons, New York 1976.

153 • · · · · ·· · ♦ • ···· · » * * ··· * · · · · * • · · · · » · · * · «·* «« ·· <·· ·· ····

Shaw and Kamen, Cell, 46:659-667, 1986.

Shaw and Kamen, In: RNA Processing, str. 220, Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor, NY 1987.

Simpson, Science, 233:34, 1986.

Sleat, Gallie, Jefferson Bevan, Turner, Wilson, Characterization of the 5'-leader sequence of tobacco mosaic virus RNA as a generál enhancer of translation in vitro, Gene,2\T.2Yl- 225, 1987. Sleat, Hulí, Turner, Wilson, Studies on the mechanism of translational enhancement by the 5'leader sequence of tobacco mosaic virus RNA, Eur. J. Biochem., 175:75-86, 1988.

Southern, J. Mol. Biol., 98:503-517, 1975.

Spielmann a kol., Afo/. Gen. Genet., 205:34, 1986.

Stetsenko, Lubyako, Potapov, Azhikina, Sverdlov, Tetrahedron Lett., 37:3571-3574, 1996.

Taira a kol., Nucl. AcidsRes., 19:5125-30, 1991.

Tanaka, Mita, Ohta, Kyozuka, Shimamoto, Nakamura, Enhancement of foreign gene expression by a dicot intron in rice but not in tobacco is correlated with an increased level of mRNA and an efficient splicing ofthe intron, Nucl. AcidsRes., 18:6767-6770, 1990.

Thanabalu a kol., Appl. Environ. Microbiol., 61(11):4031-6, 1995.

Thanabalu a kol., J. Bacteriol., 173(9):2776-85, 1991.

Thiede, Bayerdorffer, Blasczyk, Wittig, Neubauer, Nucleic Acids Res., 24:983-984,1996.

Thisted, Just, Petersen, Hyldig-Nielsen, Godtfředsen, Cell Vision, 3:358-363, 1996.

Thomson a kol.., Tetrahedron, 51:6179-6194, 1995.

Tomic, Sunjevaric, Savtchenko, Blurnenberg, A rapid and simple method for introducing specific mutations into any position of DNA leaving all other positions unaltered, Nucl. Acids Res., 18(6):1656, 1990.

Toriyama a kol., TheorAppl. Genet., 73:16, 1986.

Treacy, Hat tori, Pruďhomme, Harbour, Houtilier, Baszczynski, Huang, Johnson, Miki, Bnml, a Brassica pollen-specifíc gene, Planí Mol. Biol., 34(4):603-611, 1997.

Uchimiya a kol., Mol. Gen. Genet., 204:204,1986.

Ulmann, Will, Breipohl, Langner, Ryte, Angew. Chem., Int. Ed. Engl., 35:2632-2635, 1996.

Upender, Raj, Weir, Megaprimer method for in vitro mutagenesis using parallel templates, Biotechniques, 18:29-31, 1995.

Usmán a kol., J. Am. Chem. Soc., 109:7845-7854, 1987.

Usmán and Cedergren, TIBS, 17:34, 1992.

154

Van Camp, Herouart, Willekens, Takahashi, Saito, Van Montagu, Inze, Tissue-specific activity of two manganese superoxide dismutase promoters in transgenic tobacco, Plant Physiol., 112(2):525535, 1996.

Van Tunen a kol., EMBOJ., 7:1257, 1988.

Vander, Van Montagu, Inze, Boerjan, Tissue-specific expression conferred by the S-adenosyl-Lmethionine synthetase promotér of Arabidopsis thahana in transgenic poplar, Plant Cell Physiol., 37(8):1108-1115, 1996.

Vasil a kol., Herbicide-resistant fertile transgenic wheat plants obtained by microprojectile bombardment of regenerable embryogenic callus, Biotechnology, 10:667-674, 1992.

Vasil, Biotechnology, 6:397,1988.

Vasil, Clancy, ferl, Vasil, Hannah, Increased gene expression by the first intron of maize shrunkenl locus in grass species, Plant Physiol., 91:1575-1579, 1989.

Ventura a kol., Nucl. Acids Res., 21 :3249-55, 1993.

Veselkov, Demidov, Nielsen, Frank-Kamenetskii, Nucl. Acids Res., 24:2483-2487,1996.

Vickers, Griffith, Ramasamy, Risen, Freier, Nucl. Acids Res., 23:3003-3008, 1995.

Vodkin a kol., Cell, 34:1023, 1983.

Vogel, Dawe, Freeling, Regulation of the cell type-specific expression of maize Adhl and Shl electroporation-directed gene transfer into protoplasts of several maize tissues, J. Cell. Biochem., (Suppl. 0) 13:PartD 1989.

Wagner a kol., Coupling of adenovirus to transferrin-polylysine/DNA complexes greatly enhances receptor-mediated gene delivery and expression of transfected genes, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89(13):6099-6103, 1992.

Walker, Little, Nadeau, Shank, Isothermal in vitro amplification of DNA by a restriction enzyme/DNA polymerase systém, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 89(1):392-396, 1992.

Wangakol., J. Am. Chem. Soc., 118:7667-7670, 1996.

Watson, Fluid and electrolyte disorders in cardiovascular patients, Nurs. Clin. North Am., 22(4):797-803, 1987.

Webb and Hurskainen, J. Biomol. Screen., 1: 119-121,1996.

Weerasinghe a kol., J. Virol., 65:5531-4, 1991.

Weissbach and Weissbach, Methods for Plant Molecular Biology, (eds.), Academie Press, lne., San Diego, CA 1988.

Wenzler a kol., Plant Mol. Biol., 12:41-50, 1989.

·····* ·· • · · · * ·· ··· ··

155

Wickens and Stephenson, Science, 226:1045, 1984.

Wickens a kol., In: RNA Processing, str. 9, Cold Spring Harbor Laboratory , Cold Spring Harbor, NY 1987.

Wilson, Flint, Deaton, Fischhoff, Perlak, Armstrong, Fuchs, Berberich, Parks, Stapp, Resistance of cotton lineš containing a Bacillus thuringiensis toxin to pink bollworm (Lepidopteran: Gelechiidae) and other insects, J. Econ. Entomol., 4: 1516-1521, 1992.

Wolf a kol., Compu. Appl. Biosci.,4(1): 187-91, 1988.

Wong a kol., Plant Mol. Biol. 20(1 ):81-93, 1992.

Wong and Neumann, Electric field mediated gene transfer, Biochim. Biophys. Res. Commun., 107(2):584-587, 1982.

Woolfa kol., Proč. Nati. Acad Sci. USA, 89:7305-7309, 1992.

Wu a kol., FEMS Microbiol. Lett., 81,31-36, 1991.

Wu and Dean, Functional significance of loops in the receptor binding domain of Bacillus thuringiensis CrylIIA delta-endotoxin, J. Mol. Biol., 255(4):628-640, 1996.

Yamada a kol., Plant CellRep., 4:85, 1986.

Yang a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87:4144-48, 1990.

Yanisch-Perron a kol., Gene, 33(1):103-19, 1985.

Yin, Chen, Beachy, Promotér elements required for phloem-specific gene expression from the RTBV promotér in rice, Plant J., 12(5):1179-1188, 1997b.

Yin, Zhu, Dai, Lamb, Beachy, RF2a, a bZIP transcriptional activator of the phloem-specific rice tungro bacilliform virus promotér, functions in vascular development, EMBO J, 16(17):52475259,1997a.

Yu a kol., Proč. Nati. Acad Sci. USA, 90:6340-4, 1993.

Zatloukal, Wagner, Cotten, Phillips, Plank, Steinlein, Curiel, Birnstiel, Transferrinfection: a highly efficient way to express gene constructs in eukaryotic cells, Ann. N.Y. Acad. Sci., 660:136-153, 1992.

Zhou a kol., ΛΤβ/ΛοίΖνEnzymol., 101:433, 1983.

Zhou a kol., Afo/. Cell Biol., 10:4529-37, 1990.

Všechny sloučeniny a způsoby zde uvedené a nárokované, mohou být vytvořeny a provedeny bez nezbytného experimentování v duchu tohoto vynálezu. Ačkoli sloučeniny a způsoby podle vynálezu byly popsány ve výhodných příkladech provedení, odborníkům v oboru je zjevné, že

156

sloučeny, způsoby, jednotlivé kroky nebo pořadí kroků zde popsaných způsobů lze pozměnit, aniž by došlo k odchýlení od konceptu, ducha a rozsahu vynálezu. Přesněji, je zřejmé, že místo činidel zde popsaných, lze použít činidla chemicky nebo fyziologicky podobná, a že by bylo dosaženo stejných nebo podobných výsledků. Všechny tyto náhrady a modifikace, zřejmé odborníkům v oboru, jsou také zahrnuty mezi ty, které patří do ducha, rozsahu a konceptu vynálezu, jak je definováno v připojených nárocích. V tomto duchu jsou také patentována výhradní práva, tak jak je popsáno v dále uvedených nárocích.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaný polypeptid obsahující alespoň 15 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č .: 2, alespoň 15 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 4, alespoň 15 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 14, alespoň 15 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 16 nebo alespoň 15 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 19.
2. Polypeptid podle nároku 1, obsahující alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 2, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 4, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 14, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 16 nebo alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 19.
3. Polypeptid podle nároku 1, obsahující alespoň 50 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 2, alespoň 50 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 4, alespoň 50 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 14, alespoň 50 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 16, nebo alespoň 50 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 19.
4. Polypeptid podle nároku 1, obsahující alespoň 100 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 2, alespoň 100 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 4, alespoň 100 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 14, alespoň 100 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 16 nebo alespoň 100 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 19.
5. Polypeptid podle nároku 1, obsahující aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z SEQ ID č.: 2, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.: 16, SEQ ID č.: 19.
6. Polypeptid podle nároku 1, kde je polypeptid kódován alespoň 45 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 1, alespoň 45 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 3, alespoň 45 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 13, alespoň 45 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 15, alespoň 45 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 17 nebo alespoň 45 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 18.

• 4 4

4 4

44 4444

158
7. Polypeptid podle nároku 1, kde je polypeptid kódován alespoň 90 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 1, alespoň 90 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č : 3, alespoň 90 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 13, alespoň 90 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 15, alespoň 90 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 17 nebo alespoň 90 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 18.
8. Polypeptid podle nároku 1, kde je polypeptid kódován alespoň 150 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 1, alespoň 150 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 3, alespoň 150 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č .: 13, alespoň 150 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 15, alespoň 150 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 17 nebo alespoň 150 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 18.
9. Polypeptid podle nároku 1, kde je polypeptid kódován alespoň 300 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 1, alespoň 300 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 3, alespoň 300 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 13, alespoň 300 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 15, alespoň 300 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 17 nebo alespoň 300 po sobě jdoucími nukleotidy z SEQ ID č.: 18.
10. Polypeptid podle nároku 1, kde je polypeptid kódován SEQ ID č.: 1, SEQ ID č .: 3, SEQ IDč.: 13, SEQ IDč: 15 nebo SEQ IDč.: 18.
11. Kompozice, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jeden polypeptid, kde polypeptid obsahuje alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 2, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 4, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 14, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 16, nebo alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 19.
12. Kompozice podle nároku 11, vyznačující se tím, že polypeptid obsahuje aminokyselinovou sekvenci vybranou ze skupiny sestávající z SEQ ID č : 2, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 14, SEQ IDč.: 16, SEQ IDč: 19.

159
13. Kompozice podle nároku 11, vyznačující se tím, že obsahuje tři nebo více polypeptidů a tři z polypeptidů jsou SEQ ID č.: 2, SEQ ID č : 4 a SEQ D č.: 19.
14. Kompozice podle nároku 11, vyznačující se tím, že obsahuje dva nebo více polypeptidů a dva z polypeptidů jsou SEQ ID č.: 2 a SEQ ID č.: 4.
15. Kompozice podle nároku 11, vyznačující se tím, že obsahuje buněčný extrakt, buněčnou suspenzi, buněčný homogenát, buněčný lyzát, buněčný supernatant, buněčný filtrát nebo buněčný pelet Bacillus thuringiensis EG4550, EG5899, EG11529, NRRL B-21784, NRRL B-21783, NRRL B-21917, NRRL B-21786, NRRL B-21787, NRRL B-21785, NRRL B21788, NRRL B-21915 nebo NRRL B-21916 buněk.
16. Kompozice podle nároku 15, vyznačující se tím, že je ve formě prášku, posypu, pelet, granulí, sprejů, emulzí, koloidů nebo roztoků.
17. Kompozice podle nároku 15, vyznačující se tím, že se připraví vysušením, lyofilizací, homogenizací, extrakcí, filtrací, centrifugací, sedimentací nebo koncentrací kultury Bacillus thuringiensis buněk.
18. Kompozice podle nároku 15, vyznačující se tím, že obsahuje asi od 1 % do 99 hmotn.% polypeptidu.
19. Insekticidní polypeptid připravený způsobem zahrnujícím kroky: (a) kultivace Bacillus thuringiensis EG4550, EG5899, EG11529, NRRL B-21784, NRRL B-21783, NRRL B21917, NRRL B-21786, NRRL B-21787, NRRL B-21785, NRRL B-21788, NRRL B-21915 nebo NRRL B-21916 buněk za podmínek vhodných pro tvorbu insekticidního polypeptidu a (b) získání takto připraveného insekticidního polypeptidu z buněk.
20. Polypeptid podle nároku 19, kde polypeptid obsahuje alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 2, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 4, • ·· ··

99 ft · · · • ftftft ftftft ftft*· • ftft ·· · ··· ··· ·« ·· ··· *· ····

160 alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID c.: 14, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 16, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 19.
21. Bacillus thuringiensis buňka mající NRRL pořadové číslo NRRL B-21784, NRRL B-21783, NRRL B-21917, NRRL B-21786, NRRL B-21787, NRRL B-21785, NRRL B-21788, NRRL B-21915 nebo NRRL B-21916.
22. Izolovaný polynukleotid, který kóduje alespoň 15 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 2, alespoň 15 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 4, alespoň 15 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 14, alespoň 15 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 16, nebo alespoň 15 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 19.
23. Polynukleotid podle nároku 22, kde polynukleotid kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 2, SEQ ID ě : 4, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.: 16, nebo SEQ ID č : 19.
24. Polynukleotid podle nároku 22, kde polynukleotid kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 2, SEQ ID č.: 4 a SEQ ID č.: 19.
25. Polynukleotid podle nároku 22, kde polynukleotid kóduje polypeptid obsahující aminokyselinovou sekvenci SEQ ID č.: 2, SEQ ID č.: 4.
26. Polynukleotid podle nároku 22, obsahující alespoň 45 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID

č.: 1, alespoň 45 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 3, alespoň 45 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 13, alespoň 45 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 15, alespoň 45 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 17, nebo alespoň 45 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 18.
27. Polynukleotid podle nároku 22, obsahující alespoň 90 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 1, alespoň 90 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.:3, alespoň 90 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 13, alespoň 90 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 15, alespoň • ·

161

90 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 17, nebo alespoň 90 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 18.
28. Polynukleotid podle nároku 22, obsahující alespoň 150 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 1, alespoň 150 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 3, alespoň 150 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 13, alespoň 150 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 15, alespoň 150 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 17, nebo alespoň 150 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 18.
29. Polynukleotid podle nároku 22, obsahující alespoň 300 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 1, alespoň 300 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 3, alespoň 300 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 13, alespoň 300 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 15, alespoň 300 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 17, nebo alespoň 300 po sobě jdoucích nucleotidesfrom SEQ ID č.: 18.
30. Polynukleotid podle nároku 22, obsahující sekvenci nukleové kyseliny SEQ ID č.: 1, SEQ ID č.: 3, SEQ ID č.: 13, SEQ IDČ.: 15, nebo SEQ ID č.: 18.
31. Polynukleotid podle nároku 22, obsahující sekvenci nukleové kyseliny SEQ ID č.: 1, SEQ ID č.:3 a SEQ IDČ.: 18.
32. Polynukleotid podle nároku 22, obsahující sekvenci nukleové kyseliny SEQ ID č.: 1 a SEQ IDČ.: 3.
33. Polynukleotid podle nároku 22, dále charakterizovaný jako RNA nebo DNA.
34. Polynukleotid podle nároku 22, kde izolovaný polynukleotid je funkčně připojen k prvnímu promotoru.
35. Polynukleotid podle nároku 34, kde promotor je heterologní promotor.
36. Polynukleotid podle nároku 34, kde heterologní promotor je v rostlinách expresibilní promotor.

9·9

162
37. Polynukleotid podle nároku 36, kde promotor expresibilní v rostlinách je vybrán ze skupiny sestávající z kukuřičná syntáza sačharózy 1, kukuřičná alkohol dehydrogenáza 1, kukuřičný snadno vytěžitelný komplex, kukuřičný protein tepelného šoku, hrachová malá podjednotka RuBP karboxylázy, Ti plazmid mannopinsyntázy, Ti plazmid nopalin syntázy, petuniová chalcon izomeráza, fazolový glycinem bohatý protein 1, bramborový patatin, lektin, CaMV 35S a S-E9 malá podjednotka RuBP karboxyláza promotor.
38. Způsob určení sekvence nukleové kyseliny kódující δ-endotoxin polypeptid, vyznačující se tím, že se získá vzorek nukleových kyselin, o kterých se předpokládá, že kódují δ-endotoxin polypeptid, načež se vzorek nukleových kyselin kontaktuje s polynukleotidém podle nároku 35 za podmínek umožňujících hybridizaci podstatně komplementáních nukleových kyselin; a určí se takto vytvořené hybridizované komplementární nukleové kyseliny.
39. Detekční sada nukleových kyselin, vyznačující se tím, že obsahuje ve vhodných konterinerech alespoň první úsek nukleové kyseliny podle nároku 22 a alespoň první detekční činidlo.
40. A vektor nukleové kyseliny obsahující alespoň první sekvenční oblast kódující polypeptid obsahující alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 2, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 4, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 14, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 16 nebo alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 19.
41. Vektor podle nároku 40, kde první sekvenční oblast kóduje 8EQ ID č.: 2, SEQ Π) č : 4 nebo SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.: 16 nebo SEQ ID č.: 19.
42. Vektor podle nároku 40, kde první sekvenční oblast kóduje SEQ ID č.: 2, SEQ ID č.: 4 a SEQ ID č.: 19.
43. Vektor podle nároku 40, kde první sekvenční oblast kóduje SEQ ID č : 2 a SEQ ID č.: 4.
44. Vektor podle nároku 40, dále definovaný jako plazmid, baculovirus, umělý chromozom, virion, kosmid, fagemid, fág nebo virový vektor.

• · 4

163
45. Transformovaná hostitelská buňka obsahující nukleovou kyselinu kódující alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č : 2, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 4, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 14, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 16, nebo alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 19.
46. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 45, kde nukleová kyselina kóduje SEQ ID č.: 2, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.: 16 nebo SEQ ID č.: 19.
47. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 45, kde nukleová kyselina kóduje SEQ ID č.: 2, SEQ ID č : 4 a SEQ ID č.: 19.
48. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 45, kde nukleová kyselina kóduje SEQ ID ě.: 2 a SEQ ID č.. 4.
49. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 45, dále definovaná jako prokaryotická nebo eukaryotická hostitelská buňka.
50. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 45, dále definovaná jako bakteriální buňka nebo rostlinná buňka.
51. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 50, kde bakteriální buňka je Bacillus thuringiensis, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium, Bacillus cereus, Escherichia, Salmonella, Agrobacterium nebo Pseudomonas buňka.
52. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 50, kde bakteriální buňka je Bacillus thuringiensis EG4550, EG5899, EG11529, NRRL B-21784, NRRL B-21783, NRRL B-21917, NRRL B-21786, NRRL B-21787, NRRL B-21785, NRRL B-21788, NRRL B-21915 nebo NRRL B-21916 buňka.
53. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku50, kde bakteriální buňka je buňka Agrobacterium tumefaciens.

• 4

164
54. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 50, dále definovaná jako rostlinná buňka jednoděložných nebo dvouděložných rostlin.
55. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 54, kde rostlinná buňka je vybrána ze skupiny sestávající z buněk těchto rostin: kukuřice, pšenice sója, oves, bavlna, rýže, žito, proso, cukrová třtina, rajče, tabák, kapok, len, brambora, ječmen, drnová tráva, krmná tráva, bobule, ovoce, luštěniny, zelenina, okrasné rostliny, keře, kaktusy, sukulenty a stromy.
56. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 54, kde rostlinná buňka je buňka kukuřice, pšenice, rýže nebo cukrové třtiny.
57. Transformovaná hostitelská buňka podle nároku 54, kde rostlinná buňka je buňka sóji, bavlny, bramboru, rajčete nebo tabáku.
58. Rostlinný kalus nebo embryo obsahující polynukleotid kódující alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 2, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 4, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 14, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 16, nebo alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 19.
59. Rostlinný kalus nebo embryo podle nároku 58, kde polynukleotid kóduje SEQ ID č.: 2, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.: 16, nebo SEQ ID č.: 19.
60. Rostlinný kalus nebo embryo podle nároku 58, kde polynukleotid kóduje SEQ ID č : 2, SEQ ID č. . 4 a SEQ ID č. . 19.
61. Rostlinný kalus nebo embryo podle nároku 58, kde uvedený polynukleotid kóduje SEQ ID ě.: 2 a SEQ ID č.: 4.
62. Transgenní rostlina mající ve svém genomu včeněný vybraný polynukleotid obsahující první sekvenční oblast, která kóduje alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 2, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 4, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID

165 * *· ·* <

» <··

9 9 9 • 9 · «· · ·· ·· • · · » *

Φ 9 9 « » ·· » • · ·· t 9 9 9

9 9 9

9 9 9

9··

99 ·*Φ·

č.: 14, alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 16, nebo alespoň 30 po sobě jdoucích aminokyselin z SEQ ID č.: 19.
63. Transgenní rostlina podle nároku 62, kde první sekvenční oblast kóduje SEQ ID č.: 2, SEQ ID č.: 4, SEQ ID č.: 14, SEQ ID č.: 16 nebo SEQ ID č.: 19.
64. Transgenní rostlina podle nároku 62, kde první sekvenční oblast kóduje SEQ ID č.: 2, .SEQ ID č: 4 a SEQ IDČ.: 19.
65. Transgenní rostlina podle nároku 62, kde první sekvenční oblast kóduje SEQ ID č.: 2 a SEQ ID č.: 4.
66. Transgenní rostlina podle nároku 62, kde první sekvenční oblast obsahuje alespoň 90 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 1, alespoň 90 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 3, alespoň 90 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 13, alespoň 90 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 15, alespoň 90 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 17 nebo alespoň 90 po sobě jdoucích nukleotidů z SEQ ID č.: 18.
67. Transgenní rostlina podle nároku 62, kde první sekvenční oblast obsahuje SEQ ID č.: 1, SEQ ID č.:3, SEQ IDČ.: 13, SEQ IDČ.. 15 nebo SEQ IDČ.: 18.
68. Transgenní rostlina podle nároku 62, kde první sekvenční oblast obsahuje SEQ ID č.: 1, SEQ IDč.:3 a SEQ IDČ.: 18.
69. Transgenní rostlina podle nároku 62, kde první sekvenční oblast obsahuje SEQ ID č.: 1 a SEQ ID č.: 3.
70. Transgenní rostlina podle nároku 62, dále definovaná jako jednoděložná rostlina.
71. Transgenní rostlina podle nároku 62, dále definovaná jako rostlina kukuřice, pšenice, sóji, ovsa, bavlny, rýže, žita, drnové trávy nebo krmné trávy.

166

« ♦ · • · « • · · · • · » • · · * • · · • · « · • · · · • · · • · · · 0 • · · · · β» 9 · · · ·
72. Transgenní rostlina podle nároku 62, dále definovaná jako dvouděložná rostlina.
73. Transgenní rostlina podle nároku 62, dále definovaná jako luštěnina, sója, tabák, rajče, brambora, bavlna, ovoce, bobule, zelenina nebo strom.
74. Potomstvo jakékoli generace transgenní rostliny podle nároku 62, kde potomstvo obsahuje první vybranou sekvenční oblast.
75. Semena jakékoli generace rostliny podle nároku 62, kde semena obsahují uvedenou první sekvenční oblast.
76. Semena jakékoli generace potomstva podle nároku 74, kde semena obsahují první sekvenční oblast.
77. Rostlina jakékoli generace semen podle nároku 75 nebo 76, kde uvedená rostlina obsahuje první sekvenční oblast.
78. Způsob výroby rostliny rezistentní proti hmyzu, vyznačující se tím, že se kontaktuje recipientní rostlinná buňka s polynukleotidovou kompozicí obsahující alespoň první sekvenci nukleové kyseliny kódující polypeptid podle nároku 1; načež se vyberou recipientní rostlinné buňky obsahující první sekvenci nukleové kyseliny, které se regenarují za vzniku rostliny, přičemž rostlina má má zvýšnou rezistenci proti hmyzu ve srovnání s odpovídající netransformovanou rostlinou.