SI23835A - Uporaba makrocipinov kot pesticidnih učinkovin - Google Patents

Abstract

Predmet izuma je uporaba makrocipinov kot pesticidnih učinkovin za zaščito rastlin. Makrocipini so skupina proteinov, ki so naravno prisotni v glivi Macrolepiota procera. Uporaba teh proteinov za zaščito rastlin je možna na dva načina. Prvi je z uporabo gensko spremenjenih rastlin, katerim v genom stabilno vključimo polinukleotidno zaporedje, ki kodira vsaj enega izmed proteinov navedenih v tem izumu. Drugi način pa je neposredna aplikacija proteinov na rastline. V tem primeru je polinukleotidno zaporedje, ki kodira vsaj enega izmed proteinov navedenih v tem izumu, vstavljeno v vektor za heterologno izražanje za produkcijo rekombinantnega proteina v bioreaktorju. Te proteine po procesu čiščenja lahko nanesemo neposredno na rastline, ki jih želimo zaščititi. Polipeptidi tega izuma so še posebej uporabni za zaščito pred škodljivci kmetijskih rastlin, kot na primer skupin žuželk iz redov Lepidoptera, Hemiptera, Diptera in Coleoptera, prednostno pred koloradskim hroščem (Leptinotarsa decemlineata).

Description

NAZIV IZUMA: UPORABA MAKROCIPINOV KOT PESTICIDNIH UČINKOVIN

OPIS IZUMA

Predmet izuma je uporaba makrocipinov kot pesticidnih učinkovin za zaščito rastlin. Pesticidna učinkovitost je dokazana z zmanjšano rastjo in stopnjo preživetja organizmov, ki povzročajo škodo pri rasti in/ali pridelku rastlin.

V prihajajočih desetletjih se bo človeška družba soočala z velikimi izzivi. Z večanjem števila prebivalcev in višanjem življenjskega standarda v državah v razvoju se potrebe po surovinah in konkurenca zanje že povečuje. Povečane potrebe po hrani so že povzročile zvišanje cen. Sočasno z večanjem števila prebivalstva pa se povečuje tudi ekološka ozaveščenost, posledica česar so povečane potrebe po organsko pridelanih živilih. Za pridelavo organske hrane je značilno, da prepoveduje uporabo sintetičnih insekticidov za zaščito rasti in pridelka rastlin. Kljub temu pa je za zadostno oskrbo z organsko pridelanimi živili rastline potrebno zaščititi pred škodljivci, na primer pred žuželkami, ki zmanjšujejo rast in pridelek rastlin. Eden od sprejemljivih načinov zaščite rastlin v organskem kmetijstvu je uporaba naravnih pesticidov.

Eden izmed načinov, ki omogočajo zaščito rastlin pred škodljivci, je gensko spreminjanje rastlin. Metode genskega inženiringa omogočajo vnos specifičnih odsekov DNA, ki kodirajo faktorje za odpornost rastlin pred škodljivci, v genom rastlin. Ta način omogoča zaščito rastlin brez uporabe sintetičnih pesticidov. Prednost uporabe te tehnologije je, da zmanjša ceno pridelave rastlin in zmanjša izpostavljenost ljudi potencialno škodljivim učinkom pesticidov. Toda, še vedno ostaja potreba po iskanju primernih faktorjev za zaščito rastlin.

Vendar pa v številnih delih sveta gensko spremenjeni organizmi niso sprejeti kot vir organske hrane. Dodatno, njihovo pojavljanje na tržišču omejujejo dolgi in zapleteni pravni postopki. Kljub temu so biotehnološke rešitve, ki omogočajo zaščito rastlin pred škodljivci, že široko uporabljane. Najuspešnejši in najpogosteje uporabljen način zaščite pred škodljivci uporablja skupino genov, ki kodirajo različne toksine bakterije Bacillus thuringiensis (Bt-toksini). Gensko spremenjene poljščine, na primer koruza in bombaž, v katere so bili vnešeni različni geni Cry, ki kodirajo Bt-toksine, gojijo na obsežnih območjih mnogih držav. Primeri patentov in patentnih prijav, ki ščitijo uporabo različnih Bttoksinov so: US006100456A, US005731194A, US 20030232757A1.

Zanimanje za iskanje novih insekticidnih učinkovin je kljub dosedanji uspešni zaščiti poljščin pred škodljivci z uporabo Bt-toksinov vedno večje. Bt-toksini namreč ne nudijo zaščite proti vsem rastlinskim škodljivcem, poleg tega pa se pojavlja tudi odpornost proti tem toksinom. Zato je potreba po iskanju novih, predvsem naravnih, pesticidnih učinkovin za zaščito rastlin vedno večja.

Glivni proteini predstavljajo bogat vir raznolikih naravnih snovi. Ena od njih je skupina glivnih proteinov poimenovana makrocipini. Gre za skupino cisteinskih proteaznih inhibitorjev, izoliranih iz užitne gobe Macrolepiota procera (Renko et al. 2010; Sabotic et al. 2007; Sabotic et al. 2009).

Za makrocipine je bilo ugotovljeno, da in vitro inhibirajo delovanje mnogih ne-žuželčjih cisteinskih proteaz (Renko et al. 2010), iz česar smo sklepali, da lahko morda inhibirajo tudi delovanje žuželčjih cisteinskih proteaz in vivo in bi jih torej lahko uporabili za inhibicijo njihove rasti. Da bi ugotovili pravilnost te hipoteze, smo preverili ali imajo makrocipini inhibitorno delovanje na proteaze iz prebavnega trakta žuželk. Ugotovljeno je bilo, da je inhibitorna aktivnost makrocipinov zelo šibka, saj so inhibirali le eno izmed testiranih proteaz, s čimer smo zavrnili hipotezo o uporabi teh proteinov za zaščito rastlin. Pristop zaščite rastlin z makrocipini kot inhibitorji cisteinskih proteaz se je torej izkazal za neučinkovitega.

Namen izuma je priskrbeti polipeptide uporabne kot pesticidne učinkovine za zaščito rastlin pred škodljivci. Poleg tega je namen izuma priskrbeti naravne sestavine za zaščito rastlin pred škodljivci. Nadalje je namen izuma priskrbeti gensko spremenjene rastline s povečano odpornostjo proti škodljivcem. Prav tako pa je namen izuma tudi zagotovitev sestavin z biocidno aktivnostjo za neposredno aplikacijo na gensko nespremenjene rastline.

Zgoraj opisani namen je bil dosežen z vnosom polinukleotidov, ki kodirajo polipeptide, navedene v patentnem zahtevku 1, in so definirana kot pesticidna sredstva, ki imajo inhibitorno delovanje na rast in preživetje škodljivcev. Presenetljiva je ugotovitev izumiteljev, da polipeptidi, ki jih kodirajo polinukleotidi omenjeni v tem izumu, povečajo odpornost rastlin proti škodljivcem. Na teh rastlinah so posledice napada škodljivcev manjše, pridelek pa je večji, kar je še posebej uporabno za zaščito kmetijskih rastlin in zaradi njihove narave manj škodljivo za okolje.

Polipeptidi, navedeni v tem izumu, so lahko pridobljeni na dva načina. Prvi način je z izražanjem polipeptidov navedenih v patentnem zahtevku 1 neposredno v rastlini, drugi pa, da jih na rastline, oziroma na dele rastlin, ki jih želimo zaščititi, nanesemo v rekombinantni obliki.

V enem delu izuma je polinukleotidno zaporedje, ki kodira vsaj enega izmed proteinov navedenih v tem izumu, ki ima pesticidno delovanje, stabilno vključeno v genom rastline, ki jo želimo zaščititi pred škodljivci.

V drugem delu izuma pa je polinukleotidno zaporedje, ki kodira vsaj enega izmed proteinov navedenih v tem izumu, ki ima pesticidno delovanje, vstavljeno v vektor za heterologno izražanje za produkcijo rekombinantnega proteina v bioreaktorju.

Proteine pridobljene v bioreaktorju po procesu čiščenja lahko nanesemo neposredno na rastline, ki jih želimo zaščititi. Presenetljiva je ugotovitev izumiteljev, da ostanejo rekombinantni proteini po nanosu na rastlino še dalj časa aktivni.

Definicije

V kontekstu izuma imajo naslednji izrazi sledeče pomene:

Makrocipini (Macrolepiota procera cjsteinski jaroteazni inhibitorji), kratko imenovani Mcp, so cisteinski proteazni inhibitorji izolirani iz gobe Macrolepiota procera. Termin makrocipin obsega naravne in rekombinantne makrocipine.

Škodljivec je organizem, ki škodljivo vpliva na rast ali pridelek kmetijskih rastlin.

Donos je definiran kot merljiva količina ekonomske vrednosti poljščine. Lahko je opredeljen v smislu količine in/ali kakovosti.

Pesticidna učinkovina je v kontekstu izuma definirana kot učinkovina, zlasti kot polipeptid, ki z inhibicijo rasti in preživetja škodljivcev ščiti rastline pred škodo.

Izraz heterologen se v kontekstu izuma nanaša na kakršenkoli genetski material, ki je vnesen v celico ali celice organizma, kjer ta genski material prej ni bil prisoten.

V tej prijavi se izrazi različice, homologi in derivati lahko uporabljajo izmenično. Ti izrazi označujejo polipeptide s podobnimi zaporedji in podobnimi biološkimi in funkcionalnimi lastnostmi.

Različice, homologi in derivati polinukleotidov, ki kodirajo makrocipine, so tipično tisti, ki imajo enako funkcijo kot naravni polinukleotidi, ki kodirajo makrocipine.

Različice, homologi in derivati polipeptidov obsegajo peptide, oligopeptide, polipeptide, proteine in encime z aminokislinskimi zamenjavami, delecijami in/ali vključitvami v primerjavi z nespremenjenim proteinom ter imajo podobno biološko in funkcionalno aktivnost kot nespremenjeni proteini iz katerih izhajajo. Za pridobitev takšnih homologov je potrebno nekatere aminokislinske ostanke v proteinu zamenjati z drugimi aminokislinskimi ostanki, ki pa imajo podobne lastnosti (na primer hidrofobnost, hidrofilnost, antigenost, nagnjenost k oblikovanju ali preprečevanju tvorbe alfa vijačnic in beta ploskev). Tabele konservativnih zamenjav so dobro poznane in z njihovo pomočjo lahko izučene osebe poiščejo uporabne zamenjave. Prav tako so homologi lahko pridobljeni z rutinskimi eksperimetalnimi tehnikami.

Primeri različic, homologov in derivatov so polipeptidi s podobnim zaporedjem kot ga ima makrocipin. Lahko imajo eno ali več konservativnih aminokislinskih zamenjav. Število aminokislinskih zamenjav, ki je še uporabno, je odvisno od mesta v polipeptidu, ki ga spreminjamo. Mesta primerna za zamenjavo lahko najdemo z rutinskimi eksperimenti. Za izboljšanje lastnosti polipeptidov so najprimernejše zamenjave do desetih aminokislin, prednostno tri do pet konservativne aminokislinske zamenjave.. Primeri konservativnih zamenjav so tisti, kjer se aminokislino ki je uvrščena v isto skupino, nadomesti z drugo aminokislino, kot na primer zamenjava aminokisline z drugo aminokislino, ki ima podobno stransko verigo, na primer podobne alifatske stranske verige, pozitivno ali negativno nabite stranske verige, aromatske skupine na stranskih verigah ali pa zamenjava za aminokislino, ki prav tako tvori vodikove vezi. Primer slednje zamenjave so zamenjave aminokislin, ki imajo stranske verige s hidroksilno skupino. Vstavitve, delecije in zamenjave so mogoče v kolikor bistveno ne spremenijo funkcije polipeptida kot pesticidnega dejavnika. Pesticidno aktivnost različic, homologov in derivatov lahko določimo s standardnimi tehnikami. Aktivnost le teh mora biti vsaj 95 %, prednostno pa 99%, v primerjavi z aktivnostjo naravnega makrocipina.

Poleg tega so prednostne tiste aminokislinske zamenjave, delecije in vstavitve, ki ne povzročijo sprememb tridimenzionalne strukture ali zvitja proteina, ki je pomembno za aktivnost različic, homologov in derivatov. Spremembe tridimenzionalne strukture zaradi aminokislinskih zamenjav, delecij in vstavitev se lahko določi z dobro poznanimi tehnikami, kot so uporaba cirkularnega dikroizma (CD spektri), kristalografije z X žarki ali NMR (jedrska magnetna resonanca).

Prednostno imajo različice, homologi in derivati, ki so definirani zgoraj, vsaj 63 %, še bolje vsaj 70% ali 80%, še bolje 90 % ali celo 95 %, ali pa v najboljšem primeru več kot 99 % identičnost z zaporedjem makrocipina, ki je definirano v tem dokumentu.

Različice, homologi in derivati polipeptidov obsegajo peptide, oligopeptide, polipeptide, proteine in encime ki izhajajo iz naravnih polipeptidnih zaporedij, ki pa imajo nekatere izmed naslednjih sprememb: spremenjene naravne, glikozilirane, acilirane, prenilirane ali umetne aminokislinske ostanke, ki se ne pojavljajo v naravi. Obojim pa je skupna podobna ali identična funkcionalnost in/ali aktivnost. Funkcionalnost in/ali aktivnost lahko določimo s poznanimi metodami, kot na primer za encime obstaja metoda za določanje encimatske aktivnosti polipeptida z delovanjem na substrat. Derivati imajo lahko prisotno tudi eno ali več ne-aminokislinskih zamenjav ali prisotne dodatne skupine na aminokislinskem zaporedju. Primer dodatne skupine je reporterska molekula ali kak drug ligand, ki je kovalentno ali nekovalentno povezan z aminokislinskim zaporedjem. V delu tega izuma je lahko ligand ali reporterska molekula povezana z makrocipinom, kar omogoča enostavnejšo detekcijo. V drugem delu tega izuma pa so lahko nenaravni aminokislinski ostanki dodani ali pa nadomestijo aminokislinske ostanke prisotne v naravnem zaporedju.

Izraz rastlina se nanaša tudi na posamezne dele rastlin ali rastlinska tkiva.

Transgena rastlina” je rastlina, v katero je bil vnesen vsaj en heterologen polinukleotid, ki se je stabilno integriral v genom.

Izraz vektor se v tem dokumentu nanaša na polinukleotid, ki se ga uporablja za vnos gena v tarčno celico. V vektorju so ponavadi nukleotidna zaporedja, ki pomagajo pri izražanju želenega produkta ali pa so za izražanje celo nujna. Ko pride vektor v gostiteljsko celico, le ta začne proizvajati protein, ki ga kodira vneseni gen. Vektor tipično vsebuje tudi zaporedja pomembna za uravnavanje izražanja gena, kot so ojačevalna zaporedja in promotorji, ki vodijo v uspešno transkripcijo gena, ki ga nosi vektor.

Opis slik

Slika 1. Inhibicijska aktivnost makrocipinov proti glavnim prebavnim cisteinskim proteazam prisotnim v prebavilu ličink koloradskega hrošča. Neaktivnost makrocipinov do prevladujočih prebavnih cisteinskih proteaz kaže na to, da je način delovanja teh proteaznih inhibitorjev drugačen kot pri proteaznih inhibitorjih, ki so bili do sedaj uporabljeni za nadzor koloradskega hrošča. Gel filtration fraction - frakcija proteinov po gelski filtraciji.

Slika 2a. Plazmidna mapa vektorja pMDC32, ki smo ga uporabili za izražanje makrocipina 4A v krompirju (Solanum tuberosum cv. Desiree).

Slika 2b. Shematski prikaz regije T-DNA iz vektorja pMDC32; RB/LB - desno/levo robno zaporedje, Hyg^r - gen, ki kodira odpornost proti higromicinu, 2x35S - dvojni promotor CaMV 35S; nosT terminator; regija med attRl in attR2 je z rekombinacijo zamenjana z genom, ki kodira Mcp4A.

Slika 3. Izražanje makrocipina v različnih transgenih linijah krompirja (Solanum tuberosum cv. Desiree). Za nadaljne analize so bile izbrane linije Mcp32 Al, Mcp32 A2 in Mcp32 E2 (okrajšana imena linij so Al, A2 in E2).

Slika 4. Rezultati prenosa po vvesternu. Uporabljen je bil grobi proteinski ekstrakt tansformiranih rastlin. Za prisotnost makrocipina so bile testirane linije Al, A2, E2, D3, E3 in E4. Al, A2 , E2, D3, E3 in E4, nanosi proteinskega izvlečka transgenih linij krompirja; -K, negativna kontrola (netransformirana rastlina); +K, pozitivna kontrola (rekombinanten makrocipin); M, lestvica standardnih molekulskih mas (velikost v kDa).

* ·

Slika 5. Rezultati prvega prehranjevalnega testa ličink koloradskega hrošča hranjenih s transgenim krompirjem, ki izraža Mcp4; pridobivanje teže ličink. Pridobivanje teže ličink koloradskih hroščev hranjenih z gensko nespremenjenim krompirjem (WT, ang. wild type) ter gensko spremenjenima linijama Al in A2, ki izražata makrocipin. Velikost začetnega vzorca je 20 ličink na posamezno linijo. Na sliki je z ročkami prikazana standardna napaka. DPI - dnevi po izleganju.

Slika 6. Rezultati prvega prehranjevalnega testa ličink koloradskega hrošča hranjenih s transgenim krompirjem, ki izraža Mcp4; stopnja preživetja ličink. Stopnja preživetja ličink koloradskega hrošča po hranjenju z gensko nespremenjenim krompirjem (WT, ang. wild type) ter gensko spremenjenima linijama Al in A2, ki izražata makrocipin. Velikost začetnega vzorca je 20 ličink na posamezno linijo. DPI - dnevi po izleganju.

Slika 7. Rezultati drugega prehranjevalnega testa ličink koloradskega hrošča hranjenih s transgenim krompirjem, ki izraža Mcp4; pridobivanje teže ličink. Pridobivanje teže ličink koloradskih hroščev hranjenih z gensko nespremenjenim krompirjem (WT, ang. wild type) ter gensko spremenjenimi linijami Al, A2 in E2 ki izražajo makrocipin. Velikost začetnega vzorca je 20 ličink za liniji WT in A2 ter 17 za Al in 14 za E2. Na sliki je z ročkami prikazana standardna napaka. DPI - dnevi po izleganju.

Slika 8. Rezultati drugega prehranjevalnega testa ličink koloradskega hrošča hranjenih s transgenim krompirjem, ki izraža Mcp4; stopnja preživetja ličink. Stopnja preživetja ličink koloradskega hrošča po hranjenju z gensko nespremenjenim krompirjem (WT, ang. wild type) ter gensko spremenjenimi linijami Al, A2 in E2, ki izražajo makrocipin. Velikost začetnega vzorca je 20 ličink za liniji WT in A2 ter 17 za Al in 14 za E2. DPI - dnevi po izleganju.

Slika 9. Rezultati prehranjevalnih testov ličink koloradskega hrošča hranjenih z listi krompirja prevlečenimi z rekombinantnimi proteini (pridobljenimi v bakteriji E. coli). Ličinke so bile hranjene z listi namočenimi v rekombinantne proteine (Mcpl, Mcp3, Mcp4) pri kontrolnem poskusu pa v BSA (ang. bovine serum albumin). Vsi poskusi so bili ponovljeni dvakrat. Začetno število ličink v obeh poskusih skupaj je bilo 16.

Slika 10. Rezultati prehranjevalnih testov ličink koloradskega hrošča hranjenih z listi krompirja prevlečenimi z rekombinantnim proteinom Mcpl (pridobljenimi v bakteriji E. coli). Prikazani so isti rezultati kot na sliki 9, le da zajemajo le podatke za protein Mcpl. V tabelo je vključena tudi statistična obdelava s Študentovim T-testom(*** p<0,001, **p<0,01, *p<0,05).

Podroben opis izuma

Izum obravnava pesticidna sredstva, ki so zelo učinkovita proti škodljivcem, predvsem proti škodljivcem poljščin. Presenetljivo je bilo ugotovljeno, da so nekateri izmed proteinov makrocipinske družine učinkoviti kot pesticidne učinkovine za zaščito rastlin. Pričujoči izumitelji so z in vivo prehranjevalnimi testi ugotovili, da imata inhibitoren učinek na rast in preživetje ličink koloradskega hrošča predvsem predstavnika Mcpl in Mcp4 (glej slike 5-10).

Takšen učinek makrocipinov je bil presenetljiv in nepričakovan in njegovo delovanje nepoznano. Na podlagi do sedaj objavljenih podatkov in začetnih poskusov prikazanih na sliki 1 je bilo ugotovljeno, da makrocipini ne inhibirajo delovanja glavnih cisteinskih proteaz iz prebavila koloradskega hrošča v tolikšni meri, da bi lahko inhibirali rast in zmanjšali preživetje ličink.

Izumitelji so ugotovili, da je pesticidna aktivnost makrocipinov posledica tega, da imajo makrocipini inhibitorno delovanje na nekatere proteaze, na primer prebavne cisteinske proteaze »intestaine, ki jih najdemo v prebavilu ličink koloradskega hrošča.. Z inhibicijo teh encimov po do sedaj znanih podatkih razlagamo delovanje makrocipinov, predvsem makrocipinov navedenih v tej prijavi. Domneva se, ne da bi se vezali na teorijo, da imajo makrocipini, kot definirani v tej prijavi, ki so specifično aktivni proti glikozid hidrolazam, na primer celulazam (glikozid hidrolazne družine 48), še posebno pesticidno aktivnost. Zdi se torej, da imajo ti makrocipini vsaj dvojno inhibitorno delovanje proti izbranim proteazam in proti glikozid hidrolazam. Poleg nekaterih prebavnih proteaz so tarče makrocipina (glej tabelo 3 pri primeru 2) tudi glikozid hidrolaze, kar je bilo pokazano z afinitetno kromatografijo z vezanim makrocipinom, in je podrobneje razloženo v primeru 2. Na podlagi teh rezultatov lahko s premislekom ugotovimo, da imajo makrocipini zaradi svojega dvojnega delovanja z inhibicijo celulaz in proteaz pri prebavi močnejši celokupni efekt. Domnevamo, da prav ta multitarčna inhibicija omogoča presenetljivo povečanje učinkovitosti pesticidnega delovanja polinukleotidov in polipeptidov razkritih v tej prijavi.

Zgoraj omenjena teorija, ne da bi bili vezani nanjo, je torej za enkrat najbolj verjetna razlaga za superiorni učinek polipeptidov navedenih v tem izumu kljub temu, da so eksperimentalni podatki prikazani v primeru 1 nakazovali ne inhibitorno neaktivnost makrocipinov in vivo. Proteini iz družine makrocipinov so kljub temu, da tega nismo pričakovali, vseeno pokazali aktivnost proti škodljivcem in so bili nepričakovano stabilni, kar omogoča njihovo uporabo na ali v rastlinah. Superiorni učinek je bil še posebej pokazan za Mcpl in Mcp4, ki sta se izkazala kot učinkovita pri inhibiciji rasti in preživetju ličink koloradskega hrošča (glej slike 5-10) v in vivo prehranjevalnih testih.

Makrocipini (Macrolepiota procera cisteinski proteazni inhibitorji) so cisteinski proteazni inhibitorji izolirani iz gobe Macrolepiota procera. Te makrocipine kodira družina genov, ki jo na podlagi • · zaporedij razdelimo v pet skupin. Znotraj posamezne skupine je podobnost zaporedja aminokislinskih ostankov večja kot 90 %, med skupinami pa je podobnost med 75 in 86 %. Na aminokislinsko zaporedje makrocipinov lahko sklepamo iz podatkov genomskih zaporedij ali pa iz zaporedij cDNA. Podatki o razlikah v promotorskih in nekodirajočih zaporedjih predlagajo, da je uravnavanje izražanja makrocipinov uravnano na različnih stopnjah (glej Sabotič et al, 2009). Makrocipini so učinkoviti inhibitorji proteaz iz papainske družine (družina Cl po Merops klasifikaciji), kot so na primer papain in cisteinske katepsinske endopeptidaze, prav tako pa inhibirajo katepsine B in H, ki imajo tako endopeptidazno kot eksopeptidazno aktivnost. Raznolikost v zaporedjih vpliva na inhibicijsko aktivnost makrocipinov ter vpliva na različnost inhibicijskih profilov. Vsi makrocipini imajo podobne osnovne biokemijske lastnosti in so stabilni pri visokih temperaturah in ekstremnih pH-ji.

Makrocipini niso podobni drugimim družinam proteaznih inhibitorjev, zato domnevamo, da je mehanizem inhibicije tarčnih cisteinskih proteaz pri makrocipinih edinstven. Kristalna struktura makrocipina je razkrila motiv vezave na papainu podobne cisteinske proteaze, ki na zaenkrat še nepoznan način ovira dostop do katalitičnih aminokislinskih preostankov proteaze (glej Renko et al, 2010). Makrocipini imajo β-triperesno zvitje, ki je v obliki drevesaste strukture z dvema zankama v koreninski regiji, deblom sestavljenim iz 6-verižnega beta sodčka in dvema plastema zank (6+3) v regiji krošnje. Z usmerjenimi mutacijami je bilo pokazano, da dve zanki, ki vežeta cisteinske katepsine spadata v spodnjo plast krošnje, medtem ko je en sama zanka iz regije krošnje odgovorna za inhibicijo tripsina ali asparagrnske endopeptidaze. Te zanke predstavljajo mnogostransko površino, ki bi potencialno lahko vezala tudi druge razrede proteaz.

Ugotovljeno je bilo, da imajo nekateri člani makrocipinske družine izrazito visoko aktivnost in je njihova uporaba še posebej prednostna. To so Mcpl, Mcp3 in Mcp4, ki so v nadaljevanju natančneje opisani.

Prednostno so inhibirane cisteinske proteaze papainske družine. Endopeptidaze iz te družine močno inhibirajo vsi testirani makrocipini. Katepsin B, ki je ekso- in endopeptidaza, je šibko inhibiran z Mcpl in Mcp4. Mcp3 in Mcp4 učinkovito inhibirata tudi katepsin H, ki ima prav tako ekso- in endopeptidazno aktivnost. Poleg cisteinskih proteaz iz družine Cl pa Mcpl in Mcp3 prav tako inhibirata tudi cisteinske proteaze iz družine C13, to je asparaginske endopeptidaze. Cisteinsko proteazo legumain inhibirajo vsi makrocipini razen enega predstavnika (Mcp4), ki namesto tega šibko inhibira serinsko proteazo tripsin.

Primeri makrocipinskih polinukleotidov, ki so se izkazali za uporabne v skladu s tem izumom, vključujejo, a niso omejeni na polinukleotide ID. ŠT. ZAP. 1-13 (glej tabelo 1 spodaj). Makrocipinski polinukleotidi in njihove različice so primerni za uporabo v skladu s tem izumom. Različice makrocipinskih polinukleotidov so tipično tiste, ki imajo isto funkcijo kot v naravi pojavljajoči se makrocipinski polinukleotidi.

Različice makrocipinskih polinukleotidov lahko pripravimo z metodami, ki so na področju dodobra poznane. Na primer z usmerjeno mutagenezo pridobimo različne makrocipinske polinukleinske kisline. Za usmerjeno mutagenezo je poznanih precej metod in so na voljo izkušenemu strokovnjaku, najobičajnejše so na osnovi metode pomnoževanja z verižno reakcijo s polimerazo.

Zaporedja, ki jih zaobjema definicija besed makrocipin ali homologi makrocipina niso omejena zgolj na zaporedja razkrita v tej prijavi (ID. ŠT. ZAP. 14-22, glej tabelo 1 spodaj), temveč vključujejo tudi vsa njim podobna polipeptidna zaporedja s podobnim zvitjem in podobno funkcionalnostjo ter aktivnostjo in se lahko uporabljajo v skladu s tem izumom. Metode za določanje tridimenzionalne strukture proteinov in določanje zvitja proteina so dobro poznane strokovnjakom iz tega področja in vključujejo kristalografijo z X žarki in NMR (ang. nuclear magnetic resonance, jedrska magnetna resonanca).

Kjer so navedene pristopne številke GenBank-a (GenBank Accession Numbers) se le te nanašajo na GenBank verzijo 183.0 (dostopen: 14. april, 2011), ki ga lahko najdemo na http://www.ncbi.nlm.nih.ROv/sites/gquerv.

• ·

Tabela 1: Zaporedja razkrita v tej prijavi

ID. ŠT. ZAP./ Identifikacijska številka zaporedja	opis	pristopne številke GenBank-a	DNA/ protein
1	Mcp4a (optimizirano zaporedje za izražanje v krompirju)		DNA
2	makrocipin la gen, celotno kodirajoče zaporedje	FJ495240.1	DNA
3	makrocipin la mRNA, celotno kodirajoče zaporedje	FJ495239.1	DNA
4	makrocipin lb gen, celotno kodirajoče zaporedje	FJ495241.1	DNA
5	makrocipin lc mRNA, celotno kodirajoče zaporedje	FJ495242.1	DNA
6	makrocipin 2a gen, celotno kodirajoče zaporedje	FJ495243.1	DNA
7	makrocipin 2b gen, celotno kodirajoče zaporedje	FJ495244.1	DNA
8	makrocipin 3a mRNA, celotno kodirajoče zaporedje	FJ495245.1	DNA
9	makrocipin 3b gen, promoter in celotno kodirajoče zaporedje	FJ495246.1	DNA
10	makrocipin 3c mRNA, celotno kodirajoče zaporedje	FJ49 5247.1	DNA
11	makrocipin 4a mRNA, celotno kodirajoče zaporedje	FJ495248.1	DNA
12	makrocipin 4b gen, celotno kodirajoče zaporedje	FJ495249.1	DNA
13	makrocipin 5a gen, celotno kodirajoče zaporedje	FJ495250.1	DNA
14	makrocipin 1	ACL99724	protein
15	makrocipin 1	ACL99725	protein
16	makrocipin 1	ACL99726	protein
17	makrocipin 3	ACL99729	protein
18	makrocipin 3	ACL99731	protein
19	makrocipin 4	ACL99727	protein
20	makrocipin 4	ACL99732	protein
21	makrocipin 4	ACL99733	protein
22	makrocipin 4	ACL99734	protein

Zaporedja, ki se uporabijo v skladu s tem izumom, so vsa zaporedja, ki imajo vsaj 63 % identičnost z razkritimi zaporedji pridobljenimi iz glive Macrolepiota procera. Manj kot 63 % podobnost z geni oziroma zaporedjem cDNAje prenizka, da bi lahko bila uporabna. Prednostno je identičnost vsaj 68 % ali celo vsaj 73 %.

Makrocipine ali njihove homologe lahko brez težav identificiramo z rutinskimi metodami, ki so dobro poznane strokovnjakom s področja. Primer identifikacije homologov je s poravnavo zaporedij. Poravnave zaporedij in njihovo primerjavo so dobro poznane strokovnjakom in jih omogočajo metode kot so GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, TFASTA in tblastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=tblastn&BLAST PROGRAMS=tblastn&PAGE ΤΥΡΕ =BlastSearch&SHOW DEFAULTS=on&LINK LOC=blasthome).

Dobro poznan je algoritem tblastn 2.2.25+, ki je na voljo na spletni strani NCBI. Ta algoritem omogoča primerjavo proteinskega zaporedja z nukleotidnim zaporedjem, v katerem preverja 6 bralnih okvirjev. Uporaben je za iskanje regij, ki kodirajo homologne proteine v neobdelanih nukleotidnih zaporedjih. Prav tako je algoritem uporaben za preverjanje ali je neko proteinsko zaporedje homologno makrocipinom, kakršni so opisani v tej prijavi. Prav tako je uporaben za preverjanje ali je zaporedje gena ali cDNA homologno zaporedju gena ali cDNA, kakršno je opisano v tej prijavi, in sicer s primerjavo omenjenag predvidenega aminokislinskega zaporedja gena ali cDNA s tblastn.

Kadar primerjamo potencialni homolog makrocipina z uporabo algoritma tblastn, se proteinsko zaporedje lahko primerja z nukleotidno bazo podatkov imenovano nukleotidna zbirka (nr/nt) (ang. Nucleotide collection (nr/nt)). To je največja baza podatkov, ki je dostopna preko NCBI BLAST in vključuje vsa zaporedja iz zbirk zaporedij GenBank, RefSeq Nucleotides, EMBL (evropska nukleotidna baza podatkov), DDBJ (japonska nukleotidna baza podatkov) in proteinsko bazo podatkov PDB (ang. Protein Data Bank). Mejna vrednost (cut off) za pričakovano vrednost E (ang. expect value) mora biti nastavljena na 0,1. E je vrednost, ki opisuje verjetnost, da je podobnost zaporedij naključna.

V tabeli 2 je prikazan primer poravnave s proteinskim zaporedja Mcp4 (ID. ŠT. ZAP. 20; ACL99732.1). Prikazani so le rezultati primerjave z že objavljenimi polinukleotidi (ID. ŠT. ZAP. 2-13), ki kodirajo makrocipine z vsaj 73% podobnostjo z Mcp4.

Tabela 2: Primerjava zaporedja ACL99732.1 (Mcp4) z nukleotidno zbirko (nr/nt) (mejna vrednost E < 0.1) s pomočjo algoritma tblastn.

pristopne številke GenBank-a ID. ŠT. ZAP.	Opis	Maksimalna identičnost	vrednost E
FJ495248.1 SEQID NO 11	Macrolepiota procera makrocipin 4a mRNA, celotno kodirajoče zaporedje	100 %	3e-92
FJ495249.1 SEQIDNO 12	Macrolepiota procera makrocipin 4a gen, promotor in celotno kodirajoče zaporedje	89%	le-80
FJ495247.1 SEQ ID NO 10	Macrolepiota procera makrocipin 3c mRNA, celotno kodirajoče zaporedje	82%	3e-75
FJ495245.1 SEOIDNO8	Macrolepiota procera makrocipin 3a mRNA, celotno kodirajoče zaporedje	81%	le-73
FJ495242.1 SEOIDNO5	Macrolepiota procera makrocipin lc mRNA, celotno kodirajoče zaporedje	80%	4e-72
FJ495239.1 SEQIDNO3	Macrolepiota procera makrocipin la mRNA, celotno kodirajoče zaporedje	79%	9e-72
FJ495241.1 SEQIDNO4	Macrolepiota procera makrocipin lb mRNA, celotno kodirajoče zaporedje	79%	8e-71
FJ495244.1 SEQIDNO7	Macrolepiota procera makrocipin 2b gen, celotno kodirajoče zaporedje	78%	6e-66
FJ495243.1 SEOIDNO6	Macrolepiota procera makrocipin 2a gen, celotno kodirajoče zaporedje	74%	4e-65
FJ495246.1 SEQIDNO9	Mocrolepiota procera makrocipin 3b gen, celotno kodirajoče zaporedje	78%	9e-51

« ·

FJ495250.1 SEQIDNO 13	Macrolepiota procera makrocipin zaporedje	5a gen, celotno kodirajoče	81%	3e-47
FJ495240.1 SEQIDNO2	Macrolepiota procera makrocipin zaporedje	la gen, celotno kodirajoče	73%	2e-41

Makrocipinski polipeptidi in njihovi homologi, ki se lahko uporabljajo v skladu s tem izumom, so lahko tudi derivati le teh, kakor je prikazano zgoraj. Z izrazom derivati označujemo peptide, oligopeptide, polipeptide, proteine in encime, ki lahko v primerjavi z naravnimi proteini (nekateri navedeni v tabeli 1 kot ID. ŠT. ZAP. 14-22) obsegajo zamenjave, delecije ali vključitve naravnih ali sintetičnih aminokislinskih ostankov. Prednostno pa so s tem izumom zaščiteni še zlasti tisti homologi, različice in derivati kateregakoli izmed naravnih makrocipinov, ki imajo dvo-glavo inhibicijo.

Makrocipinske polipeptide in njihove homologe prav tako lahko kodirajo alternativne spojitvene variante makrocipinskih nukleinskih kislin ali genov. Izraz alternativne spojitvene variante v tem tekstu obsega različice zaporedij nukleinskih kislin v katerih so bili določeni introni in/ali eksoni izrezani, zamenjani, dodani, skrajšani ali podaljšani. Izmed takšnih različic so uporabne tiste, pri katerih bo ohranjena biološka aktivnost kodiranega proteina. Takšne različice lahko pridobimo s pomočjo selektivnega izbora funkcionalnih segmentov proteina. Različice makrocipinov pridobljene kot alternativne spojitvene variante lahko najdemo v naravi ali pa jih sintetiziramo. Metode sinteze alternativnih spojitvenih variant so dobro poznane strokovnjakom področja.

Polipeptidi navedeni v tem izumu so uporabni za zaščito rastlin, predvsem poljščin. Primeri rastlin, katere bi lahko z uporabo teh proteinov zaščitili pred škodljivci so lahko tako enokaličnice kot dvokaličnice, prednostno tiste iz družin Solanaceae, Poaceae, Fabaceae, Brassicaceae, Musaceae, Cucurbitaceae, Apiaceae, Rosaceae in Salicaceae, prednostno iz rodu Solanum, prednostno S. tuberosum, S. Iycopersicum in 5. melongena, ali iz rodu Nicotiana, prednostno N. tabacum ali N. benthamiana.

Najbolj prednostno so uporabljene rastline iz rodu Solanum in Nicotiana, na primer N. tabacum, N. benthamiana in S. tuberosum, saj so te vrste med najbolje raziskanimi in najpogosteje uporabljenimi za pridobivanje proteinov v rastlinah.

Polipeptidi tega izuma so uporabni za zaščito pred škodljivci kmetijskih rastlin. Škodljivci, proti katerim se lahko borimo s pomočjo teh proteinov so lahko, ni pa nujno, izbrani izmed skupin žuželk iz redov Lepidoptera, Hemiptera, Diptera in Coleoptera, prednostno pred škodljivcem vrste koloradski hrošč (Leptinotarsa decemlineata).

Ugotovljeno je bilo da so polipeptidi tega izuma še posebej uporabni za zaščito pred naslednjimi škodljivci: predstavniki reda Hemiptera vključujejo škodljivce iz družin Aphididae, Aleyrodidae, Delphacidae, Psyllidae, Jassidae in Coccidae. Iz družine Aphididae so predstavniki Aphis gossypii, Myzus persicae, Hyalopterus pruni, Lipaphis erysimi, Brevicoryne brassicae; iz družine Delphacidae so lahko škodljivci Nilaparvata lugens; iz družine Aleyrodidae vrste Bemisia tabaci gennadius; iz družine Jassidae vrsta Nephotettix bipunctatus; in iz družine Coccidae vrsta Unaspis yanonensis. Škodljivci iz reda Lepidoptera vključujejo škodljivce iz družin Noctuidae in Plutellidae. Škodljivci iz družine Noctuidae so iz rodu Asparagus, Spodoptera litura Fab ali Helicoverpa armigera; škodljivec iz družine Plutellidae pa vrsta Plutella xylostella.

Polipeptidi, navedeni v tem izumu, so lahko uporabljeni za zaščito rastlin na različne načine, ki so podrobneje opisani spodaj.

V vseh pristopih je za zaščito lahko uporabljen eden izmed makrocipinov in/ali njegova različica, homolog ali derivat, ali pa kombinacija enega ali več različnih makrocipinov in/ali njegovih različic, homologov ali derivatov prav tako pa se za zaščito lahko uporabi tudi dve ali več različic, homologov ali derivatov, ki izhajajo iz istega makrocipina. Kadarkoli se v tem dokumentu uporabi izraz polipeptid ali makrocipin, se le ta nanaša na makrocipin in/ali njegovo različico, homolog ali derivat ali pa na kombinacijo različnih makrocipinov in/ali enega ali več njegovih različic, homologov ali derivatov ali na dve ali več različic, derivatov in homologov, ki izhajajo iz istega makrocipina ali katerekoli kombinacije, razen v kontekstu, ki ne omogoča te interpretacije.

V delu tega izuma je uporabljena intrinzična učinkovina, to je vsaj en polipeptid, ki je aktiven kot pesticidno sredstvo, ki pa ni dodan kot polipeptid, temveč je kot tak proizveden v rastlini, kot sledi: v rastlinski genom rastline, ki jo želimo zaščititi, stabilno vstavimo polinukleotidno zaporedje, ki kodira vsaj en polipeptid ali pa kakršnokoli kombinacijo naravnih ali modificiranih makrocipinov, ki so navedeni v tem izumu. Za zaščito te rastline se mora vstavljen polinukleotid ali kombinacija polinukleotidov po stabilni integraciji v genom izražati, to izražanje je lahko, ni pa nujno, tudi inducirano (v primeru nadzora izražanja z inducibilnim promotorjem). Ali povedano drugače, rastlina sama proizvaja sredstvo za zaščito pred škodljivcem. V tem delu izuma je v rastlino ali rastlinski genom vstavljeno polinukleotidno zaporedje, ki kodira vsaj en polipeptid naveden v tem izumu. Na ta način je omogočeno, da rastlina sama proizvaja pesticidno sredstvo. Uporabljeno je lahko eno ali več polinukleotidnih zaporedij, ki lahko kodirajo enega ali več polipeptidov navedenih v tem izumu. Tako lahko en polinukleotid vsebuje informacijo za enega ali več polipeptidov istega ali različnih tipov ali pa sta uporabljena dva ali več polinukleotida, ki kodirata različne polipeptide ali različne kombinacije polipeptidov.

Metode za pridobivanje stabilno gensko spremenjenih rastlin so poznane strokovnjakom s področja. Gensko spremenjene rastline so tiste rastline, ki imajo v genom vneseno in stabilno vstavljeno vsaj eno heterologno polinukleotidno zaporedje.

Metode za vnos velikih heterolognih nukleotidnih zaporedij v rastlinske celice so dobro poznane. Strokovnjaki s področja lahko izberejo metodo vnosa, ki je primerna za rastlino, ki jo spreminjamo in vektor, ki ga uporabljamo za pomoč pri prenosu gena. Optimalne kombinacije rastline in vektorjev so torej poznane, ali pa jih določimo s pomočjo rutinskih poskusov.

Metoda vnosa genov v rastline so lahko kemične, kot sta transfekcija s kalcijevim fosfatom, ciklodekstrinom, liposomi (lipofekcija) ali pa transformacija plastidov s polietilenglikolom (PEG); ali nekemične metode kot je biolistično obstreljevanje z gensko puško, elektroporacija, magnifekcija in sonoporacija ali pa transdukcija s pomočjo virusov.

Za vnos polinukleotidov navedenih v tem izumu v rastline so primerne vse te metode ali kombinacije teh metod.

Ena metoda, ki omogoča vnos polinkleotidov v rastline je transformacija s pomočjo agrobakterije. Bakterije z virusnim ekspresijskim sistemom so lahko iz različnih skupin, nekateri primeri so Agrobacterium tumefaciens, A. rhizogenes, Sinorhizobium meliloti, Rhizobium sp. in Mesorhizobium loti, uporabi pa se lahko tudi druge bakterije.

Rastline lahko transformiramo s pomočjo vektorjev, ki vsebujejo ustrezno polinukleotidno zaporedje, ki kodira vsaj enega izmed makrocipinov, njegovo različico, homolog ali derivat. Polinukleotidno zaporedje, ki kodira vsaj enega izmed makrocipinov, je ustrezno povezan z enim ali več kontrolnimi zaporedji, vsaj s promotorjem. Izrazi regulatorni element, kontrolno zaporedje in promotor so v tem dokumentu med seboj zamenljivi in jih je potrebno razumeti kot regulatoma polinukleotidna zaporedja, ki lahko vplivajo na izražanje zaporedij s katerimi so ligirana. Zgoraj navedeni izrazi zaobjemajo tudi transkripcijska regulatoma zaporedja, ki so pridobljena iz klasičnih evkariontskih genomskih zaporedij in iz dodatnih regulatornih elementov kot so zgornja aktivacijska zaporedja, ojačevalna zaporedja, utiševalna zaporedja, ki spremenijo izražanje genov kot odgovor na razvojni ali zunanji dražljaj ali pa spremenijo izražanje glede na tkivno specifičnost. Izraz ustrezno povezan v tem besedilu se nanaša na funkcionalno povezavo med promotorskim zaporedjem in polinukleotidnim zaporedjem, ki kodira makrocipin, kar pomeni, da to promotorsko zaporedje lahko sproži transkripcijo tega polinukleotida. Za izražanje polinukleotidnega zaporedja je lahko uporabljen katerikoli promotor primeren za izražanje v rastlini in je primeren za izražanje vnesenega zaporedja. Izbor promotorja ni odločilen. Izbira optimalnega promotorja je za strokovnjaka s področja rutinsko opravilo, metode za izbor ustreznih promotorjev so objavljene. Primera ustreznih promotorjev sta p35s in Act2. Uporabljen promotor je lahko inducibilen, kar pomeni da se prepisovanje sproži ali poveča kot odgovor na razvojni, kemični, okoljski ali fizikalni dražljaj. Promotor je lahko tudi kemijsko uravnan, takšni so promotorji pri katerih je prepisovanje sproženo s prisotnostjo ali ob odsotnosti molekul kot so na primer alkohol, tetraciklin, steroidi ali kovine. Prav tako pa so lahko promotorji uravnani fizikalno. Primeri takšnih promotorjev so prepisovanje uravnano z prisotnostjo ali odsotnostjo svetlobe, oziroma z nizko ali visoko temperaturo. Primer inducibilnega promotorja je tudi stresno-inducibilen promotor, to je promotor, pri katerem je prepisovanje inducirano s pomočjo stresnih dejavnikov. Dodatno ali alternativno pa je lahko promotor tudi tkivno specifičen, kar pomeni da je sposoben prednostno sprožiti začetek prepisovanja v določenih tkivih, kot so na primer listi, korenine, semena, itd. Promotorji, ki so sposobni sprožiti prepisovanje pretežno v določenih tkivih, so v tem tekstu imenovani tkivno specifični. Za sprožitev prepisovanja makrocipina so lahko uporabljeni inducibilni promotorji. Z uporabo le teh je namreč mogoče izražanje makrocipina vključiti in izključiti, odvisno od prisotnosti ali odsotnosti zunanjih dražljajev in konfiguracije ekspresijskega sistema. Z uporabo inducibilnega promotorja je mogoče na ukaz vključiti izražanje pesticidne aktivnosti. Ob hkratni uporabi več kot enega polinukleotida, ki kodira makrocipin, je mogoče z uporabo inducibilnih promotorjev regulirati izražanje vsakega posebej, na primer v izražanje ob različnih časih ali pa postopno izražanje.

Z uporabo različnih inducibilnih promotorjev je torej mogoče nadzorovano izražanje enega ali več makrocipinov. Ob odsotnosti zunanjega dražljaja je izražanje nizko ali pa ga sploh ni, ob časovno nadzorovanem zunanjem dražljaju, to je ob približevanju ali prisotnosti škodljivca, pa se sproži ali poveča izražanje makrocipina. Izražanje se lahko vključi tudi na zgodnji stopnji razvoja gensko spremenjenih rastlin, to je v obdobju ko so rastline najbolj občutljive za napad škodljivcev. Z uporabo različnih promotorjev za različne polinukleotide, ki kodirajo makrocipine, lahko nadziramo moč pesticidne aktivnosti. Izražanje makrocipina v odrasli rastlini je nato lahko zmanjšano ali ustavljeno, s čimer je rastlini omogočeno da intenzivneje proizvaja rastlinsko biomaso ali pridelek.

Prednostno je polinukleotid, ki kodira makrocipin ali njegovo različico, ustrezno povezan s konstitutivnim promotorjem. Konstitutivni promotor je transkripcijsko aktiven med večino, ne pa tudi nujno med vsemi, stopnjami rasti in razvoja in je izražen v vseh tkivih.

V konstruktu, ki ga vstavljamo v rastlino je možna tudi uporaba enega ali več terminatorskih zaporedij. Izraz terminator obsega kontrolno zaporedje DNA na koncu transkripcijske enote, ki signalizira procesiranje 3' konca in poliadenilacijo primarnega transkripta ter konec prepisovanja. Dodatni regulatorni elementi lahko vključujejo tudi transkripcijske in translacijske pospeševalce. Strokovnjaki s področja vedo, katera pospeševalna zaporedja so primerna za uporabo tega izuma. Ta zaporedja so objavljena in jih strokovnjaki s področja lahko redno pridobijo.

Prav tako lahko genski konstrukti prisotni v tem izumu vključujejo tudi zaporedja mest za začetek podvojevanja (ang. origin of replication, ORI), ki so potrebna za vzdrževanje in/ali podvojevanje v specifičnih celičnih linijah. Primer je, ko mora biti genetski konstrukt najprej vnesen in ohranjen v bakterijski celici kot episomalni genetski element (to je plazmid ali kozmid). Prednostno so mesta za začetek podvojevanja fl-ori in colEl, vendar pa se lahko uporabi tudi druga zaporedja.

Genetski konstrukt lahko, ni pa nujno, obsega tudi vsaj en gen za selekcijski marker. V tem besedilu se izraz selekcijski marker nanaša na katerikoli gen, ki doprinese k spremenjenemu fenotipu celice, v kateri je izražen. Na ta način je pospešena identifikacija in/ali selekcija celic, ki so s transfekcijo ali transformacijo prejele konstrukt z nukleotidnim zapisom opisanim v tem izumu. Primerni markerski geni so na področju dobro poznani. Izbiramo lahko med takimi, ki omogočajo odpornost proti antibiotikom ali herbicidom ali pa takimi, ki omogočijo sintezo novih metabolitov ali pa selekcijo s pomočjo vizualizacije. Primeri selekcijskih markerjev so geni, ki omogočijo odpornost proti antibiotikom, kot sta neomicin in kanamicin.

Prednostno je za pripravo gensko spremenjenih rastlin uporabljen vektor pMDC32 (glej Sliko 2a), ki vsebuje polinukleotid, ki kodira makrocipin. Zaporedje vektorja pMDC32 je leta 2003 v reviji Plant Physiol. (Oct;133(2):462-9) objavil Curtis. Ena izmed različic tega vektorja je objavljena v GenBank pod pristopno številko FJ172534.

Prednostno je za vnos v rastline polinukleotidno zaporedje prilagojeno glede na rastlinsko uporabo kodonov, saj se na ta način povečata nivo in učinkovitost izražanja. Optimizacijo lahko izvedemo z uporabo na spletu dostopnih programskih orodij, kot je na primer GenScript, ali pa z uporabo molekularno genetskih metod, ki jih poznajo strokovnjaki s področja.

Heterologne sekvence so lahko vstavljene v rastlinske celice tudi s pomočjo brizganja bakterijske kulture pod visokim pritiskom. Predhodno je v tem primeru potrebno pripraviti rastlinsko tkivo, na primer z mehanskimi abrazivnimi sredstvi (silicijev karbid ali karburund), da povečamo učinkovitost transfekcije.

Poleg zgoraj naštetih metod so lahko heterologna zaporedja vnesena v rastlinska tkiva z magnifekcijo (ang. magnifection).

Vnos genov za pridobitev gensko spremenjenih rastlin je lahko stabilen ali pa prehoden.

Rastlinske celice so lahko del cele rastline ali pa le del rastlinskega tkiva.

Tako pridobljene transformirane rastline lahko razmnožujemo na mnogo načinov, kot so na primer klonsko razmnoževanje ali pa klasične metode gojenja. Primer so rastline prve generacije (Tl), ki po samooprašitvi tvorijo rastline druge generacije (T2), ki so homozigotne. Te rastline lahko nadalje gojimo s klasičnimi metodami razmnoževanja.

Prednostna je vzgoja gensko spremenjenih rastlin, ki vsebujejo vsaj en polinukleotidni zapis, ki kodira Mcp4 (ID. ŠT. ZAP. 19-22) ali njegove različice, homologe ali derivate, saj ima Mcp4 sposobnost inhibicije cisteinskih in serinskih skupin proteaz ter glikozid hidrolaz, posledica česar je učinkovita zaščita gensko spremenjenih rastlin pred škodljivci.

V drugem delu tega izuma pa je polinukleotid opisan v tem izumu uporabljen za pridobivanje polipeptida s pesticidno učinkovitostjo. V tem delu izuma je polinukleotidno zaporedje, ki kodira vsaj en polipeptid s pesticidno učinkovitostjo, kot je to opredeljeno v patentnih zahtevkih, uporabljen za proizvodnjo polipeptidov v bioreaktorju. Polipeptid pridobljen v bioreaktorju je lahko po postopku čiščenja uporabljen kot pesticidno sredstvo. Prednostno je polinukleotidno zaporedje del vektorja in ta vektor je nato uporabljen za heterologno izražanje rekombinantnega proteina v bioreaktorju. V reaktorju je ta polipeptid izražen in procesiran, tako da pridobimo aktiven in hkrati stabilen protein, ki ga lahko uporabimo za zaščito pred škodljivci, predvsem škodljivci kmetijskih rastlin. Prav tako pa je mogoča uporaba drugih ekspresijskih sistemov za pridobivanje polipeptida opisanega v tem izumu. Te metode so strokovnjakom s področja poznane in jih lahko uporabijo na način, da je polipeptid opisan v tem izumu pridobljen v dostopni in stabilni obliki.

Če je za pridobivanje polipeptida uporabljen vektor, lahko le ta vsebuje polinukleotid, ki kodira vsaj en makrocipin ali njegovo različico, homolog ali derivat. Lahko pa vsebuje tudi kombinacijo različnih makrocipinov in/ali kombinacijo različnih različic, homologov ali derivatov makrocipina ali pa njihovo mešanico. Vektor ima lahko iste splošnih značilnosti, kot je opisano pri vektorjih uporabljenih za pridobivanje gensko spremenjenih rastlin. Te splošne značilnosti so na primer kontrolna in regulatorna zaporedja, markerski geni, multiplo mesto za kloniranje, promotor, ojačevalno zaporedje ali mesto za začetek podvojevanja.

• · · · ·· ..

• ····· · _ • · ·· · · · · · ·

Prednostno je za pridobivanje heterolognih rekombinantnih proteinov uporabljen gostiteljski organizem Escherichia coli, saj je le ta eden izmed najbolj uporabnih gostiteljskih organizmov za pridobivanje rekombinantnih proteinov hkrati pa je iz genetskega stališča eden najbolj poznanih mikroorganizmov.

»pET system« (Novagen, Madison, Wl, USA) je primeren vektorski sistem za heterologno izražanje v bakteriji E. coli.

Strokovnjak s področja lahko izbere najbolj učinkovito kombinacijo promotorja in polinukleotida za pridobivanje visokega donosa rekombinantnega proteina.

Makrocipini so lahko pridobljeni kot en polipeptid ali v kombinaciji različnih polipeptidov. Na primer z uporabo kombinacij pETlla:Mcpl, pET3a:Mcp3 in pET14b:Mcp4 so bili v bakterijskem ekspresijskem sistemu pridobljeni visoki donosi treh različnih rekombinantnih makrocipinov (glej Sabotič et al., 2009).

Uporabljena je lahko kakršnakoli modifikacija procesa čiščenja proteina, ki izboljša donos, procesiranje, očiščenje ali aktivnost proteinov. Primer modifikacije je uporaba dodatka lokalizacijskih signalnih zaporedij ali označevalcev, kot je na primer His-označevalec (ang. His-tag).

Končna faza čiščenja proteina je lahko narejena na načine opisane v literaturi. Metode čiščenja proteinov so dobro poznane strokovnjakom s področja, njihova uporaba pa je rutinska. Makrocipini ali njihove različice, homologi ali derivati so lahko uporabljeni za zaščito kot posamezen protein ali pa v kakršni koli mešanici proteinov.

Makrocipini ali njihove različice, homologi ali derivati so lahko pridobljeni v obliki netopnih inkluzijskih telesc, v topni obliki ali pa kot njuna mešanica. Če so pridobljeni v netopni obliki jih je priporočljivo pred nanosom na rastline spremeniti v topno obliko.

Za pridobivanje želenih proteinov je na voljo več načinov. Nekateri izmed načinov so ponavljajoče se zamrzovanje in odtajevanje, sonikacija, homogenizacija z visokim pritiskom, filtracija ali permeabilizacija z organskimi topili. Metoda, ki jo izberemo, je odvisna od občutljivosti proteina in čvrstosti celic iz katerih protein izoliramo. Makrocipini ostanejo stabilni ob kratkotrajni izpostavitvi ekstremnim pH, ki zavzema vrednosti med pH 2 in pH 12. Prav tako so makrocipini izjemno temperaturno stabilni, saj več mesecev ohranijo inhibicijsko aktivnost pri 4°C, nekaj tednov pri sobni temperaturi in celo po 15 minutah pri 100°C. Makrocipini imajo torej idealne lastnosti za procese izolacije, saj le ta ne vpliva na zmanjšanje njihove funkcionalnosti in donosa.

Ker so makrocipini zelo stabilni, je njihovo raztapljanje mogoče z dodatkom 3M uree. Nadaljnji procesi čiščenja pa so potem lahko taki kot je to poznano strokovnjakom s področja.

Metode za čiščenje makrocipinov lahko vključujejo obarjanje, diferencialno raztapljanje, ultracentrifugiranje in kromatografske metode, kot so kromatografija z ločevanjem po velikosti, (imuno)afinitetna kromatografija, ionsko-izmenjevalna kromatografija, vezava kovin preko Hisoznačevalcev ali HPLC. Primer je izolacija rekombinantnih Mcpl in Mcp4 s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti.

Očiščen makrocipin, njegova različica, homolog, derivat ali kakršnakoli kombinacija le teh je lahko skoncentrirana z uporabo liofilizacije ali ultrafiltracije.

Očiščen in koncentriran makrocipin ali njegovi homologi so lahko dostopni v obliki kakršno se običajno uporablja za nanos na rastline. Eden ali več makrocipinov, navedenih v tem izumu, je lahko zmešan s pomožnimi snovmi ali pa raztopljen in dostopen v obliki primerni za nanos na rastline. Prav tako pa je za nanos pesticidne učinkovine mogoča tudi oblika, ki omogoča prilagojeno dostavo.

Prednostna je sestava pesticidnega sredstva, ki vsebuje makrocipin, v raztopljeni obliki s pH vrednostjo med 6 in 9, saj so makrocipini v tem območju pH najbolj stabilni.

V nadaljevanju je izum pojasnjen z nekaterimi primeri. Ti primeri ne omejujejo uporabe izuma temveč ga le razlagajo.

Primeri

Primer 1

S testom inhibicije prebavnih proteaz izoliranih iz prebavila ličink koloradskega hrošča je bilo proučeno delovanje makrocipina. Na ta način smo želeli izvedeti kakšen je način delovanja makrocipina, ki omogoča pesticidno aktivnost. Gruden in sod. (1998) so pokazali, da predstavljajo cisteinske proteaze prevladujoč delež prebavne proteolitične aktivnosti v prebavilu ličink koloradskega hrošča. Najprej je bil z uporabo različnih substratov in različnimi koncentracijami inhibitorja narejen test inhibicije na grobem izvlečku prebavila ličink koloradskega hrošča. V tem testu ni bilo zaznati inhibicije. Nato so bili pred testom inhibicije proteini izvlečka prebavila ličink koloradskega hrošča delno očiščeni z obarjanjem z acetonom. Tudi v tem primeru ni bilo zaznati inhibitornega delovanje makrocipina na prebavne proteaze. V tretjem testu pa je bil proteinski ekstrakt iz prebavila ličink koloradskega hrošča po obarjanju z acetonom frakcioniran z gelsko filtracijo. Po frakcioniranju je bila v posamezni frakciji merjena proteolitična aktivnost na substrate Z21

Phe-Arg-pNa, Z-Arg-Arg-pNA in pGlu-Phe-Leu-pNA z in brez dodatka posameznih rekombinantnih makrocipinov (Mcpl, Mcp3, Mcp4).

Rezultati tega poskusa so prikazani na sliki 1. Nobeden izmed makrocipinov ni inhibiral aktivnosti prebavnih proteaz na substrata Z-Phe-Arg-pNa in Z-Arg-Arg-pNA. Vsi makrocipini so imeli le šibko inhibitorno delovanje za razgradnjo substrata pGlu-Phe-Leu-pNA, pa še to le pri najvišjih koncentracijah inhibitorja.

Primer 2

Z namenom da bi v prebavilu ličink koloradskega hrošča poiskali tarče na katere deluje makrocipin, je bila narejena afinitetna kromatografija, kjer je bil na monolitni nosilec vezan Mcpl. S homogenizacijo je bil pripravljen grob izvleček celotnih prebavil koloradskega hrošča, izoliranih iz ličink četrte stopnje, ki so bile nabrane na polju. Ekstrakt je bil nato očiščen s centrifugiranjem pri 4 °C, 15 min pri 16.000 g in ločen v frakcije s pomočjo kromatografije z ločevanjem po velikosti. Frakcije, ki so vsebovale protein (to je bilo določeno z merjenjem absorbance frakcije pri valovni dolžini 280 nm) so bile združene in nanešene na afinitetno kromatografijo z makrocipinom. Po spiranju kolone so bili vezani proteini izprani z znižanjem pH. Izprani proteini so bili nato analizirani z SDS-PAGE gelsko elektroforezo, posamezne proteinske lise pa nato izrezane iz gela. Posamezne lise so bile nato v gelu razgrajene s tripsinom in analizirane z masno spektrometrijo (ESI-MS-MS). Uporabljen je bil masni spektrometer MSDTrap XCT Ultra (Agilent, ZDA).

Rezultati

Z uporabo makrocipinske afinitetne kromatografije je bilo razkritih več potencialnih tarčnih molekul iz prebavil ličink koloradskega hrošča, na katere se veže makrocipin. Te molekule so intestaini, glikozid hidrolaze iz družine 48 in diapavzni protein 1 (glej tabelo 3 spodaj).

• ·

Tabela 3. Potencialne tarče makrocipina v prebavilu ličink koloradskega hrošča. Tarčne molekule so bile določene z uporabo masne spektrometrije posameznih lis, analiziranih po gelski elektroforezi proteinov pridobljenih z afinitetno kromatografijo z Mcpl.

Identificiran protein	Pristopne številke GenBank-a	Molekulska masa
glikozid hidrolaze iz družine 48	ADU33353	73 kDa
diapavzni protein 1 (Leptinotarsa decemlineata)	CAA53691	80 kDa
glikozid hidrolaze iz družine 48	ADU33352	73 kDa
prebavna cisteinska proteaza intestain (Leptinotarsa decemlineata}	AAS20589	36 kDa
prebavna cisteinska proteaza intestain	AAS20591	36 kDa

Primer 3

Priprava binarnega vektorja

Ker je uporaba kodonov pri krompirju drugačna kot pri glivah, je bilo zaporedje gena, ki kodira Mcp4A (GenBank pristopna številka FJ495248.1, ID. ŠT. ZAP. 11) prilagojena s pomočjo programske opreme na spletni strani GenScript. Nato je bilo prilagojeno zaporedje (ID. ŠT. ZAP.l v tabeli 1), ki kodira zapis za Mcp4A, naročeno v GeneScript-u. Ta sintetičen gen je bil že vstavljen v vektor pDONR.

V rekombinacijski reakciji z uporabo klonaze LR je bil nato po navodilih proizvajalca (Invitrogen) DNA fragment iz vektorja pDONR prenesen v destinacijski vektor pMDC32 (Curtis and Grossniklaus 2003). Plazmidna mapa destinacijskega vektorja pMDC32 je prikazana na sliki 2. Produkt rekombinacije je bil uporabljen za transformacijo kompetentnih celic bakterije E. coli seva OmniMAX™ s temperaturnim šokom. Plazmidi so bili preneseni v bakterijo ElectroMAX™ Agrobacterium tumefaciens sev LBA4404 z elektroporacijo (Invitrogen, ZDA).

Primer 4

Rastlinski material, pogoji rasti in transformacija

Krompir (Solanum tuberosum L. cv. Desiree) je bil vegetativno namnožen iz stebelnih izsečkov in gojen v modificiranem Murashige-Skoog gojišču s 3 % saharozo. Rastline so bile gojene pri 24°C in svetlobi 5000 luxov z dnevno nočnim ciklom 16 ur/8ur.

Za pridobitev gensko spremenjenega krompirja je bil uporabljen binarni vektor pMDC32. Vektor je bil vnesen v krompir s pomočjo transformacije z bakterijo Agrobacterium tumefaciens seva LBA4404. Transformacija je potekala z uporabo izsečkov krompirja, ki so bili okuženi z A. tumefaciens po že opisani metodi (Visser, Jacobsen, Hesselingmeinders, Schans, Witholt, and Feenstra 1989). Transformirane rastline so bile zbrane in regenerirane na selekcijskih gojiščih, ki so vsebovala higromicin.

Izbor gensko spremenjenih linij krompirja (qPCR)

Pri linijah, ki so zrastle na selekcijskih gojiščih je bila z metodo PCR v realnem času s predhodno reverzno transkripcijo analizirana stopnja izražanje transgena. Rezultati izražanja transgena so prikazani na sliki 3. Pri linijah krompirja, ki so najbolj izražale gen, kodirajoč Mcp4A, je bila nadalje s pomočjo prenosa po vvesternu določena prisotnost rekombinantnega proteina.

Prenos po vvesternu

Za detekcijo rekombinantnega Mcp v gensko spremenjenih rastlinah je bil uporabljena metoda prenosa po vvesternu. Za izolacijo proteinov je bilo uporabljenega 200 mg rastlinskega materiala posamezne linije. Rastlinski material je bil homogeniziran z uporabo homogenizatorja Qiagen Tissuelyser in resuspendiran v 500 μΙ pufra (50 mM Tris-HCI, pH 6.8, 15 mM DTT). Po 30 minutah inkubacije pri 0°C so bili vzorci centrifugiranj in po 30 μΙ supernatanta nanesenega v posamezno jamico poliakrilamidnega gela. Proteini so bili ločeni z gelsko elektroforezo v prisotnosti NaDS (NaDSPAGE, 12 % ločevalni gel). Po elektroforezi so bili proteini preneseni na PVDF membrano (Imobillon transfer membrane). Membrana je bila nato blokirana s pufrom TBS (10 mM Tris-HCI pH 7.4,150 mM NaCI) z dodanim 5 % mlekom v prahu brez maščob. Inkubacija s primarnimi protitelesi redčenimi 1:10.000 je potekala preko noči pri 4°C, nato je sledilo 7 spiranj s pufrom TBST pri 25°C in inkubacija s sekundarnimi protitelesi redčenimi 1:20.000. Kot primarna protitelesa je bil uporabljen zajčji antiserum proti makrocipinu, kot sekundarna protitelesa pa kozji imunoglobulin proti zajčjim protitelesom konjugiran s hrenovo peroksidazo. Detekcija je potekala s kemiluminiscentnim detekcijskim testom (Lumilight, Roche). Rezultati prenosa po westernu so prikazani na sliki 4.

Priprava vektorjev za produkcijo rekombinantnih proteinov v bakteriji E.coli

Za produkcijo rekombinantnih makrocipinov so bili uporabljeni vektorji serije pET (Novagen). cDNA, ki kodira Mcpl je bila klonirana z ligacijo po restrikciji vektorja pETlla z encimoma Ndel in BamHI, Mcp3 po restrikciji vektorja pET3a z Ndel in BamHI in Mcp4 po restrikciji vektorja pET14b z encimoma Ncol in Ndel, tako da se izbrani proteini izražajo brez označevalcev.

Izražanje makrocipinov v obliki netopnih inkluzijskih telesc v bakteriji E.coli in njihova izolacija

Ekspresijski vektorji z vstavljenimi inserti so bili vneseni v bakterijo E. coli seva BL21(DE3). Bakterije so bile gojene v tekočem gojišču LB (Luria-Bertani) z dodatkom ampicilina v koncentraciji 100 pg/ml pri 37°C in 220 obratih na minuto. Ko je atenuacija (D) pri 600 nm dosegla vrednosti med 1 in 1,2 je bil sevom transformiranim z vektorjema pET3a in pET14b dodan induktor izopropil tio^-d-galaktozid v končni koncentraciji 0,4 mM, sevom transformiranim z vektorjem pETlla pa v končni koncentraciji 1 mM . Bakterije so nato rastle še 6 ur. Potem so bile celice izolirane s centrifugiranjem pri 6000 g 15 minut in resuspendirane v pufru A (50 mm Tris-HCI, pH 7.5, 0.1 % Triton Χ-100, 2 mM EDTA), nato pa enkrat zamrznejene in odtajane ter sonicirane pri 4°C. Netopna frakcija je bila ločena s 15 minutnim centrifugiranjem pri 10.000 g, ponovno raztopljena v istem pufru z dodano 3 M ureo in solubilizirana s štiri-urnim mešanjem pri 4°C. Preostali neraztopljen material je bil odstranjen s centrifugiranjem, supernatant pa je bil nanesen na kolono Sepharose S200 uravnoteženo s pufrom Tris-HCI, pH 7.5, z dodanim 0.3 M NaCI. Frakcije z inhibitornim delovanjem so bile združene in koncentrirane z ultrafiltracijo (Amicon UM-3).

Izražanje makrocipinov v topni obliki

Ekspresijski vektorji z inserti so bili vneseni v bakterijo E. coli BL21(DE3). Bakterije so bile gojene pri 37°C v tekočem gojišču LB (Luria-Bertani) z dodatkom ampicilina v koncentraciji 100 pg/ml. Ko je atenuacija (D) pri 600 nm dosegla vrednosti med 1 in 1,2 je bil sevom dodan induktor izopropil tio-βd-galaktozid v končni koncentraciji 1 mM. Izražanje rekombinantnih makrocipinov v topni obliki je bilo doseženo po 12 do 24 urni inkubaciji pri 23°C in 220 obratih na minuto.

Prehranjevalni testi

Prehranjevalni testi z gensko spremenjenimi rastlinami so bili izvedeni s celim nadzemnim delom rastline krompirja. Za ohranjanje vlage so bila stebla odrezanih rastlin potisnjena v mikrocentrifugirke, ki so vsebovale redek agar (0,5 %). Petrijevke v katerih so bile gojene ličinke so bile tekom poskusa hranjene v temi pri 28°C. Za vsak test je bilo uporabljenih 14 do 20 ličink. Ličinke so se že izlegle na testiranih linijah krompirja, ki smo jih vsakodnevno zamenjali s sveže pripravljeno rastlino. Za kontrolo smo uporabili netransformiran krompir (ang. wild type, WT). Vsak dan smo spremljali stopnjo preživetja in maso ličink. Rezultati so bili analizirani s študentovim T-testom.

Prehranjevalni testi z rekombinantnimi proteini so bili izvedeni z listi netransformiranega krompirja, ki so bili prevlečeni z rekombinantnimi proteini, listi s katerimi je bila hranjena kontrolna skupina pa so bili prevlečeni z govejim serumskim albuminom (ang. bovine serum albumin, BSA). Liste smo pripravili tako, da smo jih za nekaj časa iz vseh strani namočili v raztopine proteinov. Posode v katerih smo gojili ličinke smo imeli shranjene v temi pri 28°C. Za vsak test smo uporabili 16 ličink. Liste smo vsak dan nadomestili s svežimi. Vsak dan smo spremljali stopnjo preživetja in maso ličink. Rezultati so bili analizirani s študentovim T-testom.

Rezultati prehranjevalnih testov so prikazani na slikah 5-10.

Claims (14)

1. PATENTNI ZAHTEVKI

   1. Uporaba vsaj enega polinukleotidnega zaporedja, označena s tem, da kodira vsaj en makrocipin ali njegovo različico, za pridobivanje pesticidnega sredstva učinkovitega proti organizmom, ki škodljivo vplivajo na rast rastlin, katere želimo zaščititi pred tem organizmom.
2. 2. Uporaba v skladu z zahtevkom 1, označena s tem, daje polinukleotidno zaporedje stabilno vstavljeno v genom gensko spremenjene rastline.
3. 3. Uporaba v skladu z zahtevkom 1, označena s tem, da je polinukleotidno zaporedje del polinukleinske kisline za heterologno izražanje proteina v bioreaktorju.
4. 4. Uporaba v skladu z zahtevkoma 1 in 2, označena s tem, da je rastlinska vrsta izbrana med enokaličnicami ali dvokaličnicami, prednostno iz rastlinskih družin Solanaceae, Poaceae, Fabaceae, Brassi caceae, Musaceae, Cucurbitac eae, Apiaceae , R osaceae in Salicaceae, prednostno iz rodu Solanum, najbolje S. tuberosum, Solanum lycopersicum in Solanum melongena ali iz rodu Nicotiana, najbolje N. tabacum or N. benthamiana.
5. 5. Uporaba v skladu s katerimkoli od predhodnih zahtevkov,označena s tem, da pesticidno sredstvo zavira rast in/ali preživetje organizmov iz redov Lepidoptera, Hemiptera, Diptera in Coleoptera, prednostno kjer je ta organizem koloradski hrošč (Leptinotarsa decemlineata).
6. 6. Uporaba v skladu s katerimkoli od predhodnih zahtevkov, označena s tem, da polinukleotidno zaporedje kodira vsaj en makrocipin naveden z identifikacijsko številko (ID. ŠT. ZAP.) 1-13 ali pa njegovo različico, homolog ali derivat.
7. 7. Uporaba v skladu z zahtevkom 2, označena s tem, da polinukleotidno zaporedje kodira Mcp4 in prednostno obsega vsaj enega izmed zaporedij navedenih z identifikacijskimi številkami 1, 11 ali 12 ali njihove različice, ali pa kjer je polipeptid Mcp4, ki je izražen z uporabo polinukleotida, eden izmed polipeptidov navedenih z identifikacijskimi številkami 19, 20, 21 in/ali 22 ali pa je homolog le teh.
8. 8. Uporaba v skladu z zahtevkom 3, označena s tem, da polinukleotidno zaporedje kodira Mcpl in prednostno obsega vsaj enega izmed zaporedij navedenih z identifikacijskimi številkami 2, 3, 4 ali 5 ali njihove različice, ali pa kjer je polipeptid Mcpl, ki je izražen z uporabo polinukleotida, eden izmed polipeptidov navedenih z identifikacijskimi številkami 14, 15 ali 16 ali pa je homolog le teh.
9. 9. Uporaba v skladu z zahtevkom 3, označena s tem, da je polipeptid pridobljen v bioreaktorju očiščen in pipravljen v obliki primerni za nanos na rastline, kakršne so na primer kmetijske rastline, prednostno rastline navedene v zahtevku 4.
10. 10. Metoda za pripravo rastlin odpornih proti škodljivim organizmom, označena s tem, da obsega uporabo vsaj enega polinukleotidnega zaporedja v skladu z zahtevkom 1 ali njegovo različico, homolog ali derivat ali pa mešanico le teh za vnos v genom teh rastlin.
11. 11. Metoda, označena s tem, da za pripravo rastlin odpornih proti škodljivim organizmom nanesemo vsaj enega izmed polipeptidov v skladu z zahtevkom 1 ali njegovo različico, homolog ali derivat ali pa mešanico le teh na to rastlino.
12. 12. Vektor, označen s tem, da je sestavljen iz vsaj enega polinukleotidnega zaporedja, ki je določeno v zahtevku 1.
13. 13. Bakterija, označena s tem, da vključuje vektor iz zahtevka 12.
14. 14. Gensko spremenjena rastlina, označena s tem, da vsebuje vsaj eno v genom stabilno vstavljeno polinukleotidno zaporedje, ki je določeno v zahtevku 1.