JP2008500808A - 収量が向上した植物及び該植物を作出する方法 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(i)サイクリンD3をコードする核酸の一部、好ましくは配列番号1で表されるサイクリンD3をコードする核酸の一部、
(ii)サイクリンD3をコードする核酸の選択的スプライス変異体、好ましくは配列番号1で表されるサイクリンD3をコードする核酸の選択的スプライス変異体、
(iii)サイクリンD3をコードする核酸の対立遺伝子変異体、好ましくは配列番号1で表されるサイクリンD3をコードする核酸の対立遺伝子変異体、及び
サイクリンD3アミノ酸配列のホモログ、誘導体及び活性フラグメント、好ましくは配列番号2の配列で表されるサイクリンD3、が含まれる。
(i)サイクリンD3をコードする核酸又はその機能的変異体、好ましくは配列番号1で表されるサイクリンD3をコードする核酸またはその機能的変異体(上に定義される)(ここで、核酸は、サイクリンD3ポリペプチド又はその機能的変異体、好ましくは配列番号2で表されるサイクリンD3ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードする。)、
(ii)シュートで、好ましくは栄養(地上)シュートの細胞増殖域で、(i)の核酸を選択的に発現させることができるプロモーター、及び任意に、
(iii)転写終結配列、
を含む遺伝子構築物が提供される。
(i)サイクリンD3をコードする核酸またはその機能的変異体、好ましくは配列番号1で表されるサイクリンD3をコードする核酸またはその機能的変異体を、植物または植物細胞に導入すること(ここで、前記核酸またはその機能的変異体は、サイクリンD3ポリペプチドまたはその機能的変異体をコードし、前記ポリペプチドは好ましくは配列番号2で表されるか又はその変異体であり、前記核酸またはその機能的変異体は、シュートで、好ましくは栄養(地上)シュートの細胞増殖域で、前記核酸を選択的に発現させることができるプロモーターの制御下にある。)、
(ii)再生及び成熟した植物の成長を促進する条件下で植物細胞を培養すること、
を含む。
本発明を添付の図を参照して説明する(後述の図面の簡単な説明を参照のこと)。
シロイヌナズナのサイクリンD3;3(内部参照CDS0018)を、シロイヌナズナシードリングcDNAライブラリー(Invitrogen,Paisley,英国)をテンプレートとして用いてPCRで増幅した。苗(seedling)から抽出したRNAを逆転写後、cDNAをpCMV Sport 6.0にクローニングした。バンクの平均挿入サイズは1.5kbであり、クローンの最初の数は1.59×107cfuであった。最初の力価は9.6×105cfu/mlと測定され、最初の増幅後は6×1011cfu/mlと測定された。プラスミド抽出後、テンプレート200ngを50μlのPCRミックスに使用した。プライマーは、prm0360(センス、開始コドンは太字、AttB1部位はイタリックで示す。)
続いて、エントリークローンp0433を、p3169(イネ形質転換に使用されるディスティネーションベクター)とのLR反応に使用した。このベクターは、T−DNAボーダー内に機能的エレメントとして、植物選択マーカーと、植物スクリーナブルマーカーと、及びエントリークローンにすでにクローニングされた目的の配列を有するLR in vivo組換え用のGatewayカセットとを含む。栄養(地上)シュートの増殖域での発現のためのβ−エクスパンシンプロモーターをGatewayカセットの上流に配置する。
約15〜20の独立したT0イネ形質転換体を作出した。初代の形質転換体を成長させてT1種子を収穫するため、組織培養チャンバーから温室に移した。T1後代が3:1で導入遺伝子の存在/不存在に分離した、5つの事象が保持された。これらの各事象について、導入遺伝子(ヘテロ−及びホモ−接合体)を含む約10本のT1苗、及び導入遺伝子を欠く(無接合体(nullizygote))約10本のT1苗を、可視マーカーの発現をモニタリングすることにより選択した。更に、最も良好なT1の事象について、T1世代と同じ方法でT2世代で評価したが、1事象あたりもっと多くの個体を用いた。
2つのファクターANOVA(変異体の分析)を、植物の表現型の特性を全体的に評価するため、統計学的モデルとして使用した。F−テストを、本発明の遺伝子で形質転換した全ての事象の全ての植物を測定する全てのパラメーターについて行った。F−テストは、全ての形質転換事象にわたって遺伝子の効果をチェックするため、及びグローバルな遺伝子効果としても知られる遺伝子の全体的な効果を証明するために行った。真のグローバルな遺伝子効果についての有意性の閾値は、F−テストについて5%確率レベルにセットした。有意なF−テスト値は遺伝子の効果を示し、表現型の違いを起こしている遺伝子の存在または位置のみだけではないことを意味する。
選択したT1植物(導入遺伝子を有する約10本、及び導入遺伝子を有しない約10本)を温室に移した。各植物に固有のバーコードラベルを貼り、表現型のデータを対応する植物と明確にリンクさせた。選択したT1植物を、直径10cmのポットに入った土で以下の環境設定で育てた。明期=11.5時間、日光の強さ=30,000lux以上、日中の温度=28℃以上、夜間の温度=22℃、相対湿度=60−70℃。トランスジェニック植物及び対応する無接合体をランダムな位置で隣接させて育てた。播種期から成熟期まで、各植物を、何度かデジタル画像キャビネットに通過させて画像化した。各タイムポイントで、デジタル画像(2048x1536ピクセル、1600万色)を少なくとも6つの異なる角度から各植物を撮影した。以下に説明するパラメーターを、画像分析ソフトウエアを使って、自動化された方法で全ての植物の全てのデジタル画像から得た。
植物の地上面積を、バックグラウンドと区別される地上の植物部分からピクセルの全数を数えることにより決定した。この値を、同じ時点で異なる角度から撮った写真を平均化し、検量により平方mmで表した物理的表面値に変換した。実験は、この方法で測定した地上の植物面積は地上の植物部分のバイオマスと相関することを示す。T1及びT2の評価の結果を以下の表1に示す。トランスジェニック植物及び対応する無接合体(nullizygote)間の差のパーセンテージを示す。FテストのP値は、T1及びT2の評価の両方において有意であり、地上面積の導入遺伝子の存在の全体的な影響を示した。
成熟した最初の穂(panicle)を収穫し、袋に詰め、バーコードを貼付し、それから37℃のオーブンで3日間乾燥した。次に、穂を脱穀し、全ての種子を集めて数えた。充実した殻を、送風機を使って空の殻と分けた。空の殻を捨て、残った画分を再び数えた。充実した殻を化学天秤で重量測定した。この手順により、以下に説明する種子関連パラメーターのセットが得られた。
植物当たりの全種子数を、植物から収穫した殻の数を数えて計測した。T1及びT2の評価の結果を以下の表2に示す。トランスジェニック植物及び対応する無接合体間の差のパーセンテージを示す。FテストのP値は、T1及びT2の評価の両方において有意であり、導入遺伝子の存在が生産された種子の全数に有意な影響を与えることを示した。
充実した種子の数を、分離ステップ後に残った充実した殻の数を数えて測定した。T1及びT2の評価の結果を以下の表4に示す。トランスジェニック植物及び対応する無接合体間の差のパーセンテージを示す。FテストのP値は、T1及びT2の評価の両方において有意であり、導入遺伝子の存在が生産された充実した種子の数を有意に増加させることを示した。
種子の全収量を、植物から収穫した充実した殻の全てを重量測定することにより計測した。T1及びT2の評価の結果を、以下の表5に示す。トランスジェニック植物及び対応する無接合体間の差のパーセンテージを示す。FテストのP値は、T1及びT2の評価の両方において有意であり、導入遺伝子の存在は種子重量を有意に増加させることを示した。
本発明における収穫指数は、全種子収量と地上面積(mm2)間の比率として定義され、ファクター106を乗じる。T1及びT2の評価の結果を以下の表6に示す。トランスジェニック植物及び対応する無接合体の差のパーセンテージを示す。FテストのP値は、T1及びT2の評価の両方において有意であり、導入遺伝子の存在は収穫指数を有意に増加させることを示した。
上記構築物を含む植物を作製し、pβ−エクスパンシン::サイクリンD3;3について上記に説明した同じ手順を使って評価した。T1の評価の結果を以下の表7〜9に示す。トランスジェニック植物及び対応する無接合体間の差のパーセンテージを各テーブルに示す。FテストのP値も示す。
β−エクスパンシンプロモーターを、「BP組換え反応」を用いるGatewayTMシステム(Life Technologies)のpDONR201エントリープラスミドにクローニングした。クローニングされた挿入物の同一性及び塩基対組成を、配列決定により確認し、更に、得られたプラスミドを、制限酵素で消化して試験を行った。
Claims (23)
- サイクリンD3をコードする核酸をシュートで選択的に発現させることができるプロモーターの制御下にある該核酸を、植物に導入することを含む、植物の収量を向上させる方法。
- 収量の向上が、種子の収量の増加である、請求項1に記載の方法。
- 収量の向上が、植物の地上面積の増加である、請求項1に記載の方法。
- 種子の収量の増加が、(i)種子のバイオマスの増加、(ii)(充実した)種子の数の増加、(iii)種子の大きさの増加、(iv)種子の体積の増加、(v)収穫指数の増加、及び(vi)千粒重の増加、からなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- サイクリンD3をコードする核酸が植物から得られる、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
- サイクリンD3をコードする核酸またはその機能的変異体を植物に導入することを含み、核酸またはその機能的変異体が、
(i)サイクリンD3をコードする核酸の一部、
(ii)サイクリンD3をコードする核酸の選択的スプライス変異体、
(iii)サイクリンD3をコードする核酸の対立遺伝子変異体、及び
(iv)サイクリンD3アミノ酸のホモログ、誘導体及び活性フラグメント、
から選択され、
(i)〜(iv)の機能的変異体は、植物のCDKと結合して活性化し得る、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。 - シュートで前記核酸を選択的に発現できるプロモーターが、β−エクスパンシンプロモーターと同等の発現プロフィールを有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の方法。
- 対応する野生型植物と比べて収量が向上したトランスジェニック植物を作出する方法であって、
(i)サイクリンD3をコードする核酸またはその変異体、好ましくは配列番号1で表されるサイクリンD3をコードする核酸又はその機能的変異体を、植物又は植物細胞に導入すること、ここで、前記核酸又はその機能的変異体は、サイクリンD3ポリペプチド又はその機能的変異体をコードし、前記ポリペプチドは、好ましくは配列番号2で表されるか又はその機能的変異体であり、前記核酸又はその機能的変異体は、シュート、特に栄養(地上)シュートの細胞増殖域で、前記核酸を選択的に発現させることができるプロモーターと機能的に結合されている、
(ii)植物細胞を、再生及び成熟した植物の成長を促進する条件下で培養すること、
を含む方法。 - 収量の向上が、種子の収量の増加である、請求項8に記載の方法。
- 収量の増加が、地上面積の増加を含み、及び種子の収量の増加が、(i)種子のバイオマスの増加、(ii)(充実した)種子の数の増加、(iii)種子の大きさの増加、(iv)種子の体積の増加、(v)収穫指数の増加、及び(iv)千粒重の増加、から選択される、請求項8または9に記載の方法。
- シュートで選択的に遺伝子を発現させることができるように、サイクリンD3ポリペプチド又はその機能的変異体をコードする遺伝子の遺伝子座において、遺伝子改変を植物に導入することを含む、植物の収量、特に種子の収量を向上させる方法。
- 遺伝子改変が、突然変異誘発、相同的組換え、ティリング及びT−DNA活性化の1つ以上により行われる、請求項11に記載の方法。
- 請求項1〜12のいずれか1項に記載の方法によって得られる植物。
- (i)サイクリンD3をコードする核酸又はその機能的変異体、好ましくは配列番号1で表されるサイクリンD3をコードする核酸またはその機能的変異体、ここで、前記核酸は、サイクリンD3ポリペプチド又はその機能的変異体、好ましくは配列番号2で表されるサイクリンD3ポリペプチド又はその機能的変異体をコードする、
(ii)シュートで、特に栄養(地上)シュートの細胞増殖域で、(i)の核酸を選択的に発現させることができるプロモーター、及び任意に、
(iii)転写終結配列、
を含む構築物。 - プロモーターが、β−エクスパンシンプロモーターと同等の発現プロフィールを有する、請求項14に記載の構築物。
- 請求項14または15に記載の構築物で形質転換された植物。
- サイクリンD3またはその機能的変異体をコードする核酸を、シュートで選択的に前記核酸を発現させることができるプロモーターの制御下に含むことを特徴とする、対応する野生型植物と比べて収量が向上したトランスジェニック植物。
- サトウキビなどの単子葉植物、又はイネ、トウモロコシ、コムギ、オオムギ、ミレット、ライムギ、オートムギまたはソルガムなどの穀類である、請求項13、16または16に記載のトランスジェニック植物。
- 請求項13、16〜18のいずれか1項に記載のトランスジェニック植物の収穫可能な部分。
- 種子である、請求項19に記載の収穫可能な部分。
- 収量の向上、特に種子の収量の増加におけるサイクリンD3をコードする単離された核酸の使用であって、該核酸は、シュートで該核酸を選択的に発現させることができるプロモーターと機能的に結合される、使用。
- 種子の収量が、(i)種子のバイオマスの増加、(ii)(充実した)種子の数の増加、(iii)種子の大きさの増加、及び(iv)種子の体積の増加、(v)収穫指数の増加、及び(vi)千粒重の増加、のいずれか1つ以上を含む、請求項21の使用。
- サイクリンD3をコードする核酸が、配列番号1で表される核酸またはその機能的変異体であり、またはサイクリンD3が、配列番号2で表されるアミノ酸またはその機能的変異体である、請求項21または22に記載の使用。
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