ES2353966T3 - Plantas que tienen características de crecimiento mejoradas y un método para su elaboración. - Google Patents
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Abstract
Método para mejorar las características de crecimiento de una planta con relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre, que comprende la introducción en una planta y expresión específicamente en un tejido de brote, de un ácido nucleico que codifica un Compañero de Dimerización (DP) E2F.
Description
Plantas que tienen características de
crecimiento mejoradas y un método para su elaboración.
La presente invención se relaciona con un método
para mejorar las características de crecimiento de una planta. Más
específicamente, la presente invención se relaciona con un método
para mejorar las características de crecimiento de una planta
incrementando la expresión en el tejido del brote de una planta de
un gen que codifica al Compañero de Dimerización (DP) E2F, en el
tejido del brote de una planta, de una proteína DP. La presente
invención también se relaciona con plantas transformadas con un gen
que codifica DP, bajo el control de un elemento de control
preferido del brote, cuyas plantas tienen características de
crecimiento mejoradas con relación a las correspondientes plantas de
tipo silvestre.
Ya que la población mundial siempre está en
crecimiento, sigue siendo un objetivo importante de la investigación
mejorar la eficiencia de la agricultura. Los medios convencionales
para mejoras hortícolas y de los cultivos utilizan técnicas
selectivas de fitomejoramiento para identificar las plantas que
tienen características deseables. Sin embargo, tales técnicas
selectivas de fitomejoramiento tienen varios inconvenientes,
especialmente que esas técnicas son típicamente de mano de obra
intensiva y resultan en plantas que contienen a menudo componentes
genéticos heterogéneos que no siempre resultan en el rasgo deseable
que está siendo transmitido por las plantas madre. En contraste,
los avances en biología molecular le han permitido al género humano
modificar en forma más precisa el germoplasma de las plantas. La
modificación por ingeniería genética de las plantas implica el
aislamiento y la manipulación de material genético (típicamente en
la forma de ADN o ARN) y la posterior introducción de ese material
genético en una planta. Tal tecnología ha conducido al desarrollo de
plantas que tienen diferentes rasgos hortícolas, agronómicos o
económicos mejorados. Las características de interés económico
particular incluyen alto rendimiento y
biomasa.
biomasa.
La habilidad para mejorar una o más
características de crecimiento de una planta tendría muchas
aplicaciones en áreas tales como la mejora de los cultivos,
fitomejoramiento de las plantas, producción de plantas ornamentales,
arboricultura, horticultura, silvicultura, y en la producción de
algas o de plantas (por ejemplo para uso como biorreactores, para
la producción de sustancias tales como compuestos farmacéuticos, tal
como anticuerpos, o vacunas, o para la bioconversión de residuos
orgánicos, o para uso como combustibles, en el caso de algas y
plantas de alta productividad).
Se ha encontrado ahora que incrementando la
expresión de un gen que codifica DP de una proteína DP en tejido de
brotes de una planta, produce plantas que tienen características
mejoradas de crecimiento con relación a las correspondientes plantas
de tipo silvestre.
Las proteínas DP son proteínas altamente
conservadas y están involucradas en el control del ciclo celular
(Gutierrez et al. (2002) Current Opinion in Plant Biology 5:
480-486). Los factores DP actúan junto con los
factores E2F para formar un heterodímero, capaz de iniciar la
transcripción de genes específicos de la fase S. La identificación
de factores E2F, factores DP y factores de tipo
E2F-DP (DEL) fue reportada por Magyar et
al., 2000 (FEBS letters, 486: 79-97). Con base
en la comparación de la secuencia, se agruparon los genes de
Arabidopsis que codifican estas proteínas en distintas
categorías como se describe en Vandepoele et al., 2002 (Plant
Cell 14(4): 903-16). Además, las
características estructurales de las proteínas DP típicas fueron
reportadas por Magyar et al. Por ejemplo, las Figuras 3A y B
de Magyar et al. muestran la ubicación de un dominio
característico de enlazamiento de ADN y un dominio de dimerización
en proteínas DP de Arabidopsis. La Figura 5 de Vandepoele
et al. ilustra muy bien que las proteínas DP son distintas de
proteínas relacionadas tales como los factores E2F y los DEL debido
a la presencia de un dominio de enlazamiento de ADN y un domino de
dimerización.
La solicitud de patente internacional publicada
WO 00/47614 a favor de Pioneer Hi-Bred sugiere que
el control de la expresión de DP utilizando promotores específicos
de la célula o específicos del tejido proporciona una
característica diferencial de crecimiento. En particular, sugiere
que (i) el uso de un promotor específico de la semilla estimulará
la tasa de división celular y dará como resultado una mayor biomasa
de semilla; (ii) el uso de un promotor específico de la borla
fuertemente expresado en forma temprana reforzará el desarrollo de
esta estructura reproductiva completa; y (iii) que el uso de un
promotor específico de la raíz dará como resultado raíces más
grandes y un crecimiento más rápido (es decir, más acumulación de
biomasa). Sin embargo, no se generaron plantas que tengan tales
características diferenciales de crecimiento o que se hubieran
presentado como ejemplo en la solicitud.
La última solicitud de patente internacional
presentada WO 01/21644, a favor del Consejo Superior de
Investigaciones Científicas, simplemente sugiere, sin ejemplos, que
el crecimiento de la planta puede ser controlado por medio de la
expresión de un DP recombinante. A pesar de la declaración de que
"son particularmente útiles los ácidos nucleicos a partir de los
cuales se controla la expresión utilizando un promotor específico
del tejido o un promotor químicamente inducible", no se hace
mención o se presentan ejemplos en la solicitud de plantas
transformadas con tales ácidos nucleicos y que tengan
características mejoradas de crecimiento.
A pesar de las sugerencias anteriores, no se han
generado plantas transgénicas mejoradas utilizando las enseñanzas
del estado del arte, lo cual indica que el uso de DP como se sugiere
en el estado del arte es ineficiente para mejorar las
características de crecimiento de una planta.
\newpage
Inesperadamente, se ha encontrado ahora que se
pueden mejorar las características de crecimiento de una planta
incrementando la actividad de una proteína DP en el tejido de los
brotes de una planta y/o incrementando la expresión en el tejido de
los brotes de una planta de un gen que codifica un DP.
La presente descripción proporciona un método
para mejorar las características de crecimiento de una planta con
relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre, que
comprende incrementar la actividad de una proteína DP o un homólogo
de la misma específicamente en un tejido del brote de una planta y/o
incrementando la expresión de un gen que codifica un DP o una
variante funcional del mismo en el tejido del brote de una
planta.
Una primera modalidad de la invención se
relaciona con un método para mejorar las características de
crecimiento de una planta con relación a las correspondientes
plantas de tipo silvestre, que comprende la introducción en una
planta, y la expresión específicamente en el tejido de un brote, de
un ácido nucleico que codifica al Compañero de Dimerización (DP)
E2F.
Convenientemente, el desempeño del método de
acuerdo con la presente invención produce plantas que tienen una
variedad de características de crecimiento mejoradas con relación a
las correspondientes plantas de tipo silvestre, especialmente mayor
biomasa. Las características de crecimiento mejoradas pueden ser
estables y heredables por las futuras generaciones.
El término "característica de crecimiento"
abarca mayor biomasa, entre otras características relacionadas con
el crecimiento como se detalla aquí más adelante.
El término "biomasa" se refiere a la
cantidad de material biológico producido. Un incremento en biomasa
puede estar en una o más partes de una planta con relación a la
biomasa de las plantas de referencia correspondientes, por ejemplo
con relación a la biomasa de las correspondientes plantas de tipo
silvestre. Las plantas de acuerdo con la invención se caracterizan
por una mayor biomasa por encima del suelo, lo cual es
particularmente importante para las plantas de cultivo que
crecieron por sus tejidos vegetativos. Para el maíz ensilado, por
ejemplo, los parámetros típicos de valor económico son la biomasa
por encima del suelo y el contenido de energía de las hojas; para
los árboles y la caña de azúcar, un parámetro típico de valor
económico es la biomasa por encima del suelo de los tallos.
El término "mayor biomasa" como se lo
utiliza aquí puede abarcar también mayor rendimiento,
particularmente mayor rendimiento de semilla.
El término "mayor rendimiento" como se
define aquí pretende significar un incremento en uno o más de los
siguientes, cada uno con relación a las correspondientes plantas de
tipos silvestre: (i) mayor biomasa (peso) de una o más partes de
una planta, particularmente las partes que están por encima del
suelo (cosechables), mayor biomasa de raíces o mayor biomasa de
cualquier otra parte cosechable; (ii) mayor rendimiento total de
semillas, que puede resultar de un incremento en la biomasa de las
semillas (peso de las semillas) y que puede ser un incremento en el
peso de las semillas por planta o con base en una semilla
individual; y cuyo incremento en peso de la semilla puede ser
debido a dimensiones alteradas de la semilla, tales como largo de la
semilla y/o ancho de la semilla y/o área de la semilla; (iii) mayor
número de semillas (llenas); (iv) mayor tamaño de las semilla, que
puede influenciar también la composición de las semillas; (v) mayor
volumen de las semillas, que puede influenciar también la
composición de las semillas; (vi) mayor índice de cosecha, que se
expresa como la relación del rendimiento de las partes cosechables,
tal como semillas, sobre la biomasa total; y (vii) mayor peso de
mil granos (TKW), que se extrapola a partir del número de semillas
llenas contabilizadas y su peso total. Un mayor TKW puede resultar
de un mayor tamaño de la semilla y/o mayor peso de la semilla.
La presente invención también proporciona un
método para mejorar las características de crecimiento de una
planta en donde dicha característica mejorada de crecimiento de una
planta es mayor rendimiento, particularmente mayor rendimiento de
semilla con relación a las correspondientes plantas de tipo
silvestre.
Tomando al maíz como ejemplo, un mayor
rendimiento puede manifestarse como uno o más de lo siguiente: un
incremento en el número de plantas por hectárea o por acre, un
incremento en el número de espigas por planta, un incremento en el
número de hileras, en el número de granos por hilera, en el peso del
grano, en el peso de mil granos, en la longitud/diámetro de las
espigas, entre otros. Tomando al arroz como ejemplo, un mayor
rendimiento puede manifestarse como un incremento en uno o más de
los siguiente: en número de plantas por hectárea o por acre, en el
número de panículas por planta, en el número de espiguillas por
panícula, en el número de flores por panícula, en un incremento en
la tasa de llenado de la semillas, en un incremento en el peso de
mil granos, entre otros. Un incremento en el rendimiento puede
resultar también en una arquitectura modificada, o puede ocurrir
como resultado de una arquitectura modificada.
Ya que las plantas transgénicas de acuerdo con
la presente invención tienen mayor biomasa con relación a las
correspondientes plantas de tipo silvestre, es probable que estás
plantas exhiban una mayor tasa de crecimiento (al menos durante
parte de su ciclo de vida), con relación a la tasa de crecimiento de
las correspondientes plantas de tipo silvestre en una etapa
correspondiente en su ciclo de vida. La mayor tasa de crecimiento
puede ser específica para una o más partes de una planta (incluidas
las semillas), o puede ser sustancialmente a través de la planta
completa. Una planta que tiene una mayor tasa de crecimiento puede
exhibir incluso floración temprana. El incremento en la tasa de
crecimiento puede tener lugar en una o más etapas en el ciclo de
vida de una planta o sustancialmente durante el ciclo de vida
completo de la planta. Una mayor tasa de crecimiento durante las
etapas tempranas en el ciclo de vida de una planta puede reflejar un
mayor vigor. El incremento en la tasa de crecimiento puede alterar
el ciclo de cosecha de una planta permitiendo que las plantas sean
sembradas más tarde y/o cosechadas más pronto de lo que sería
posible de otra manera. Si se incrementa suficientemente la tasa de
crecimiento, se posibilitaría la siembra de más semillas de la misma
especie de planta (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de
arroz seguido por la siembra y cosecha de más plantas de arroz todo
dentro de un período de crecimiento convencional). En forma
similar, si se incrementa suficientemente la tasa de crecimiento,
se posibilitaría la siembra adicional de semillas de diferentes
especies de plantas (por ejemplo la siembra y cosecha de plantas de
arroz seguido, por ejemplo, por la siembra y cosecha opcional de
soja, patatas o de cualquier otra planta adecuada). Puede ser
posible entonces realizar varias cosechas del mismo rizoma en el
caso de algunas plantas. La alteración del ciclo de cosecha de una
planta puede conducir a un incremento en la producción anual de
biomasa por acre (debido a un incremento en el número de veces
(digamos en un año) que puede ser cultivada y cosechada una planta
particular). Un incremento en la tasa de crecimiento puede permitir
también el cultivo de plantas transgénicas en áreas geográficas más
amplias que sus contrapartes de tipo silvestre, ya que las
limitaciones territoriales para el desarrollo de un cultivo a menudo
están determinadas por condiciones ambientales adversas ya sea en
el momento de la siembra (comienzo de la temporada) o al momento de
la cosecha (fin de la temporada). Tales condiciones adversas pueden
ser evitadas si se acorta el ciclo de la cosecha. La tasa de
crecimiento puede estar determinada por diferentes parámetros que se
derivan de las gráficas de las curvas de crecimiento de
experimentos de crecimiento; tales parámetros pueden ser: T Medio
(el tiempo que le toma a las plantas alcanzar el 50% de su tamaño
máximo) y T-90 (el tiempo que le toma a las plantas
alcanzar el 90% de su tamaño máximo), entre otros.
La presente invención también proporciona un
método para mejorar las características de crecimiento de una planta
en donde dicha característica mejorada de crecimiento de la planta
es un incremento en la tasa de crecimiento con relación a las
correspondientes plantas de tipo silvestre.
El término "característica de crecimiento"
como se lo utiliza aquí, también abarca la arquitectura de la
planta. Las plantas de acuerdo con la invención exhiben una
arquitectura alterada, que se manifiesta en una forma y tamaño
alterados de las partes por encima del suelo debido a una mayor
biomasa. Esta característica puede ser ventajosa para muchas
plantas ornamentales. El término "arquitectura" como se lo
utiliza aquí abarca la apariencia o la morfología de una planta,
incluida una cualquiera o más de las características estructurales
o combinación de características estructurales, tales como forma,
tamaño, número, posición, textura, disposición y patrón de las
células, tejidos, órganos o grupos de células, tejidos u órganos de
una planta. Se prefieren particularmente las plantas que tienen una
cualquiera o más de: mayor número, tamaño, forma de los vástagos (o
parte correspondiente de la planta); mayor número de ramas y/o de
hojas.
Por lo tanto, de acuerdo a la presente invención
se proporciona un método para mejorar las características de
crecimiento de la planta en done dicha característica mejorada de
crecimiento de la planta es una arquitectura alterada,
particularmente de una o más entre el mayor número, tamaño, forma de
los vástagos, o de la correspondiente parte de la planta; mayor
número de ramas y/o de hojas.
Una mejora en cualquiera de las características
de crecimiento anteriormente mencionadas se presenta si la planta
está bajo condiciones no estresadas o si la planta está expuesta a
diferentes estreses comparada con las plantas de control. Las
plantas típicamente responden a la exposición al estrés creciendo
más lentamente. En condiciones de estrés severo, la planta puede
incluso detener su crecimiento completamente. Un estrés leve por
otro lado se define aquí como cualquier estrés al cual está expuesta
una planta que no resulta en que una planta cesa de crecer
completamente. Debido a los avances en las prácticas agrícolas
(irrigación, fertilización, tratamientos con pesticidas) no se
encuentra a menudo estreses severos en las plantas de cultivo
cultivadas. En consecuencia, el crecimiento comprometido inducido
por estrés leve es a menudo una característica indeseable para la
agricultura. Los estreses leves son los estreses típicos a los
cuales se puede exponer una planta. Estos estreses pueden ser los
estreses bióticos y/o abióticos diarios (ambientales) a los cuales
se ve expuesta una planta. Los estreses abióticos o ambientales
típicos incluyen estreses por temperatura causados por temperaturas
frías/de congelación o calientes atípicas; estrés por salinidad;
estrés por agua (sequía o exceso de agua). Los estreses abióticos
pueden ser provocados también por compuestos químicos. Los estreses
bióticos son típicamente aquellos estreses provocados por
patógenos, tales como bacterias, virus, hongos e insectos.
Las características de crecimiento anteriormente
mencionadas pueden ser modificadas convenientemente en una variedad
de especies de plantas.
El término "planta" como se lo utiliza aquí
abarca a plantas enteras, ancestros y progenie de las plantas y
partes de las plantas, incluyendo semillas, brotes, tallos, raíces
(incluidos tubérculos), y células vegetales, tejidos y órganos. El
término "planta" también abarca por lo tanto cultivos en
suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso,
hojas, semillas, raíces, brotes, gametofitos, esporofitos, polen, y
microesporas. Las plantas que son particularmente útiles en los
métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a
la súper familia de Viridiplantae, en particular plantas
monocotiledóneas y dicotiledóneas, incluyendo forraje o leguminosas
forrajeras, plantas ornamentales, cultivos alimenticios, árboles, o
arbustos seleccionados de la lista que comprende Acacia spp.,
Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizia
amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca
catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga,
Betula spp., Brassica spp., Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana,
Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis,
Canna indica, Capsicum spp., Cassia spp., Centroema pubescens,
Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arabica, Colophospermum
mopane, Coronillia varia, Cotoneaster serotina, Crataegus spp.,
Cucumis spp., Cupressus spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga,
Cryptomeria japonica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia
oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp.,
Dicksonia squarosa, Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos
spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis, Ehrarlia spp.,
Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp.,
Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa
sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii,
Geranium thunbergii, Ginkgo biloba, Glycine javanica, Gliricidia
spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtia coleosperma,
Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum
vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta,
Indigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyrolifolia, Lespediza spp.,
Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus
bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot
esculenta, Medicago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa
sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Omithopus spp., Oryza
spp., Peltophorum africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima,
Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium
cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum,
Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa,
Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium
stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata,
Rhopalostylis sapida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes
spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp.,
Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata, Sequoia
sempervirens, Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia
spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos
humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra,
Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla, Vaccinium spp.,
Vicia spp., Vitis vinifera, Watsonia pyramidata, Zantedeschia
aethiopica, Zea mays, amaranto, alcachofas, espárragos, brócoli,
coles de Bruselas, col, canola, zanahoria, coliflor, apio, hojas de
col, lino, col rizada, lenteja, colza, ocra, cebolla, patata, arroz,
soja, paja, remolacha azucarera, caña de azúcar, girasol, tomate, té
de chayote, árboles, hierbas (incluyendo pastos forrajeros) y algas,
entre otros.
De acuerdo a una característica preferida de la
presente invención, la planta es una planta de cultivo tal como
fitoplancton, soja, girasol, canola, colza, algodón, alfalfa,
tomate, patata, lechuga, tabaco, papaya, chayote, álamo, eucalipto,
pino, leguminosas, lino, lupinos y sorgo. De acuerdo a una modalidad
preferida adicional de la presente invención, la planta es una
planta monocotiledónea tal como caña de azúcar, cebolla o bambú.
Preferiblemente además la planta es un cereal, tal como arroz, maíz
(incluido forraje de maíz), trigo, cebada, mijo, avena y
centeno.
El término "DP" significa Compañero de
Dimerización E2F. Como lo sugiere el nombre, una proteína DP es
capaz de dimerizar con un factor de transcripción E2F/DEL. Esto
puede ser analizado, por ejemplo, por medio de un ensayo Híbrido
Doble como se describe en Magyar et al., 2000 (FEBS letters,
486: 79-97) o por medio de inmunoprecipitación
conjunta. Las características estructurales de las proteínas DP
típicas fueron reportadas por Magyar et al. Por ejemplo,
las Figuras 3A y B de Magyar et al. muestran la ubicación de
un dominio característico de enlazamiento de ADN y un dominio de
dimerización en proteínas DP de Arabidopsis. La Figura 5 de
Vandepoele et al., 2002 (Plant Cell 14(4):
903-16), ilustra muy bien que las proteínas DP son
diferentes de proteínas relacionadas tales como los factores E2F y
los DEL a causa de la presencia de un dominio de enlazamiento de ADN
y un dominio de dimerización. La Figura 3 muestra la ubicación de
estos dominios en la secuencia DPb de Arabidopsis thaliana.
Con base en los conocimientos disponibles, una persona capacitada en
el arte sería capaz de identificar fácilmente una proteína DP.
De acuerdo con una característica preferida de
la invención, la proteína DP es como la representada por medio de
la SEQ ID NO: 2. La descripción también proporciona homólogos de la
SEQ ID NO: 2 y ejemplos específicos de tales homólogos incluyen
proteínas DP de Arabidopsis thaliana como lo describen Magyar
et al., 2000 (FEBS, 486(1): 79-87),
proteínas DP de Triticum aestivum como se describe en
Ramirez-Parra & Gutierrrez, 2000 (FEBS,
86(1): 73-8) y proteínas DP de
Impatiens, soja y maíz como se describe en la solicitud
publicada de patente internacional WO99/53075 a favor de Du
Pont.
Preferiblemente, la proteína DP o un homólogo de
la misma como se describe aquí se refiere a un polipéptidos que
tienen orden creciente de preferencia al menos 40%, 41%, 42%, 43%,
44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%, 56%,
57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%,
70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%,
83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%,
96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia con una proteína DP,
por ejemplo, con cualquiera de las SEQ ID NOs: 2, 4, 13, 15, 17, 19,
21 y 23.
Las proteínas DP de Arabidopsis thaliana
pueden ser subdivididas en dos clases diferentes, como se muestra
en Vandepoele et al., 2002 (Plant Cell.,14(4):
903-16), DPa y DPb. Los miembros de ambas clases son
también abarcados por el término "homólogo" como se lo utiliza
aquí. Convenientemente, estas diferentes clases de proteínas DP, o
sus ácidos nucleicos que las codifican, pueden ser utilizados en los
métodos de la presente invención.
El ácido nucleico para DP o la proteína DP
útiles en los métodos de la invención se obtienen preferiblemente a
partir de una planta, preferiblemente de una planta dicotiledónea,
preferiblemente adicionalmente de la familia Brassicaceae,
más preferiblemente de Arabidopsis thaliana. De acuerdo con
una modalidad adicional, el polipéptido DP es un polipéptido DPb.
Un "DPb" se refiere a una proteína que está más cercanamente
relacionada con AtDPb que con AtDPa. Si una secuencia pregunta
puede ser clasificada como una DPa o como una DPb se puede
determinar calculando el porcentaje de identidad de secuencia o
estableciendo la presencia de motivos conservados como se describe
aquí más adelante. Otro método para identificar una secuencia
pregunta como una DPa o como una DPb es introduciendo la secuencia
pregunta en un árbol filogenético, tal como el mostrado en la Figura
5. Una proteína DPb debe agruparse más cerca a AtDPb que a
AtDPa.
Los polipéptidos DP preferidos o los homólogos,
útiles en los métodos divulgados en esta descripción, son aquellos
que tienen, en orden creciente de preferencia, al menos 40%, 41%,
42%, 43%, 44%, 45%, 46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%,
55%, 56%, 57%, 58%, 59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%,
68%, 69%, 70%, 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%,
81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%,
94%, 95%, 96%, 97%, 98% ó 99% de identidad de secuencia con una
proteína DP, por ejemplo, una proteína DP como la representada por
cualquiera de las SEQ ID NOs: 2, 4, 13, 15, 17, 19, 21 y 23. El
porcentaje de identidad se puede calcular sobre una región
conservada típicamente presente en todas las proteínas DP. Esta
región arranca aproximadamente desde los residuos CEKVES (por
ejemplo, desde la posición 111 de la SEQ ID NO: 2) hasta
aproximadamente FVLKTM (por ejemplo, hasta la posición 290 de la
SEQ ID NO: 2); ver la Figura 3.
Tres motivos están particularmente conservados
en una subclase de proteínas DP, la cual comprende DPb de
Arabidopsis thaliana. Las secuencias de consenso para estos
motivos "DPb" están representadas aquí por la SEQ ID NO: 9
(motivo 1, LDIXXDDA), SEQ ID NO: 10 (motivo 2, KKKK/RR) y SEQ ID NO:
11 (motivo 3, AXGXDK) (ver la Figura 3).
Preferiblemente, estos motivos están presentes
en el polipéptido o en los homólogos de DP utilizados en los
métodos divulgados en esta descripción. La Figura 3 muestra una
alineación de proteínas DP con la ubicación de los motivos
"DPb". Como puede observarse a partir de la alineación, es
posible refinar las secuencias de consenso. Por ejemplo, en la
posición 4 en el motivo 1existe una alta probabilidad para un
residuo Q o un residuo H y en la posición 5 existe una alta
probabilidad para un residuo G o para un residuo A. También en el
motivo 3, en la posición 2 existe un alta probabilidad para un
residuo V, T o A y en la posición 4 existe una alta probabilidad
para un residuo P o para un residuo A. Una persona capacitada en el
arte se dará cuenta que un motivo DPb puede desviarse por ejemplo
por una o dos faltas de correspondencia a partir de los motivos de
consenso DPb como los representados por las SEQ ID NOs: 9, 10 u 11
sin perder ninguna funcionalidad.
Loa motivos "DPb" recientemente
identificados anteriormente mencionados pueden ser utilizados
también para buscar bases de datos y para identificar polipéptidos u
homólogos de DPb y secuencias de codificación.
La identificación de dominios de proteína,
motivos y cajas, estaría también dentro de los conocimientos
de una persona capacitada en el arte. La información del dominio de una proteína puede estar disponible a través
de las bases de datos PRODOM (hftp://www. biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/jj/prodomsrchjj.html), PIR
(http://pir.georgetown.edu/). PROSITE (http://au.expasy.org/PROSITE/) o pFAM (http://pFAM.wustl.edu/). Los programas diseñados para dicha búsqueda de dominios incluyen, pero no se limitan a, MotifScan, MEME, SIGNALSCAN, y GENESCAN. MotifScan es un programa preferido y se encuentra disponible en (http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN, el cual utiliza la información del dominio de la proteína de PROSITE y pFAM. Puede encontrarse un algoritmo MEME (Versión 3.0) en el paquete GCG o en http://www.sdsc.edu/MEME/meme. SIGNALSCAN versión 4.0 se encuentra disponible en http://biosci.cbs.umn.edu/software/sigscan.html. GENESCAN se puede encontrar en http://gnomic. stanford.edu/GENESCANW.html.
de una persona capacitada en el arte. La información del dominio de una proteína puede estar disponible a través
de las bases de datos PRODOM (hftp://www. biochem.ucl.ac.uk/bsm/dbbrowser/jj/prodomsrchjj.html), PIR
(http://pir.georgetown.edu/). PROSITE (http://au.expasy.org/PROSITE/) o pFAM (http://pFAM.wustl.edu/). Los programas diseñados para dicha búsqueda de dominios incluyen, pero no se limitan a, MotifScan, MEME, SIGNALSCAN, y GENESCAN. MotifScan es un programa preferido y se encuentra disponible en (http://hits.isb-sib.ch/cgi-bin/PFSCAN, el cual utiliza la información del dominio de la proteína de PROSITE y pFAM. Puede encontrarse un algoritmo MEME (Versión 3.0) en el paquete GCG o en http://www.sdsc.edu/MEME/meme. SIGNALSCAN versión 4.0 se encuentra disponible en http://biosci.cbs.umn.edu/software/sigscan.html. GENESCAN se puede encontrar en http://gnomic. stanford.edu/GENESCANW.html.
Un polipéptido o un homólogo de DP pueden
encontrarse en las bases de datos de secuencias (públicas). Los
métodos para la alineación e identificación de los homólogos de
proteína DP en las bases de datos de secuencias son bien conocidos
en el arte. Tales métodos, involucran la selección de bases de datos
de secuencia con las secuencias suministradas por la presente
descripción, por ejemplo las SEQ ID NOs: 2, 4, 13, 15, 17, 19, 21 y
23 (o la SEQ ID NO: 1). Se conocen en el arte diferentes algoritmos
de búsqueda y programas para la alineación y comparación de
secuencias, e incluyen por ejemplo GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA Y
TFASTA. Preferiblemente se utiliza el programa BLAST, que calcula
el porcentaje de identidad de secuencia y realiza un análisis
estadístico de la similitud entre las secuencias. El conjunto de
programas denominados como programas BLAST tiene 5 implementaciones
diferentes: tres diseñadas para consultas de secuencias de
nucleótidos (BLASTN, BLASTX, y TBLASTX) y dos diseñadas para
consultas de secuencias de proteínas (BLASTP y TBLASTN) (Coulson,
Trends in Biotechnology: 76-80, 1994; Birren et
al., GenomeAnalysis, 1: 543, 1997). El programa para la
realización del análisis BLAST se encuentra públicamente disponible
a través del National Centre for Biotechnology Information. Las
bases de datos de secuencias útiles incluyen, pero no se limitan al
Genbank (http:l/www.ncbi.nlm.nih.gov/web/Genbank), a la European
Molecular Biology Laboratory Nucleic Acid Database (EMBL)
(http:/w.ebi.ac.uk/ebi-docs/embl-db.html)
o versiones de la misma o la base de datos MIPS
(http://mips.gsf.de/).
Los polipéptidos DP preferidos útiles en los
métodos de la presente descripción tienen al menos 40% de identidad
de secuencia con cualquiera de las SEQ ID NOs: 2, 4, 13, 15, 17, 19,
21 y 23. El porcentaje de identidad de secuencia, se puede calcular
utilizando un programa de alineación global por parejas
implementando el algoritmo de Needleman-Wunsch (J.
Mol. Biol. 48: 443-453, 1970), que maximiza el
número de coincidencias y minimiza el número de huecos. Para el
calculus de los porcentajes anteriormente mencionados, puede
utilizarse el programa needle (paquete EMBOSS) con una penalización
por abertura de huecos de 10 y una penalización por extensión de
huecos de 0.1. Para proteínas, se utiliza la matriz blosum62 con una
longitud de palabra de 3. Para ácidos nucleicos, el programa needle
utiliza la matriz "DNA-full", con una longitud
de palabra de 11, como el suministrado por el paquete EMBOSS. El
algoritmo de Needleman-Wunsch es más adecuado para
analizar secuencias de proteína relacionadas en toda su longitud.
Alternativamente, el análisis de proteínas relacionadas y la
determinación del porcentaje de identidad de secuencia como se
mencionó anteriormente, se pueden calcular en la región conservada,
los dominios o motivos como se mencionó anteriormente.
Los ejemplos de polipéptidos que caen bajo la
definición de "un polipéptido DP u homólogo del mismo" son DPb
de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 2) y la correspondiente
secuencia de codificación SEQ ID NO: 1). Otros ejemplos de
proteínas DP se dan en la Figura 3, junto con su número de acceso en
el Genebank, su secuencia de codificación, y su secuencia de
proteína, representadas por las SEQ ID NOs: 12 a 23. Las secuencias
del genoma de Arabidopsis thaliana y Oryza sativa se
encuentran ahora disponibles en bases de datos públicas tales como
el Genebank y otros genomas están siendo actualmente secuenciados.
Por lo tanto, se espera que serán identificados fácilmente otros
homólogos por medio de alineación de secuencia con cualquiera de las
SEQ ID NOs: 1 a 4 ó 12 a 23 utilizando los programas BLASTX o BLASTP
u otros programas.
A pesar de que puede parecer que es una
homología de secuencia relativamente baja de "al menos 40% de
identidad", las proteínas DP están altamente conservadas
teniendo todas ellas un dominio de enlazamiento de ADN y un dominio
de dimerización. Debe entenderse que el término polipéptido DP u
homólogo del mismo no está limitado a las secuencias representadas
por las SEQ ID NOs: 2, 4, 13, 15, 17, 19, 21 y 23, sino que
cualquier polipéptido que tenga los rasgos característicos de las
DP, a saber (i) actividad de dimerización (que puede ser atribuida
a un dominio de dimerización parcial o preferiblemente completo) y
(ii) un dominio de enlazamiento de ADN para enlazamiento de ADN,
puede ser útil en los métodos de esta descripción. Un polipéptido DP
que tiene tales características retiene una actividad biológica y/o
funcional similar o al menos parte de la actividad biológica y/o
funcional de una proteína DP. La actividad biológica es la actividad
de la proteína cuando está en su ambiente natural. La actividad de
dimerización (es decir la capacidad de DP para dimerizar con un
factor de transcripción E2F) puede ser analizado, por ejemplo, por
medio de un ensayo Hibrido Doble tal como se describe en Magyar
et al., 2000 (FEBS letters, 486: 79-97) o
utilizando inmunoprecipitación conjunta.
Un polipéptido/proteína DP o un homólogo de los
mismos es codificado por un "ácido nucleico que codifica para
DP" o por un "gen que codifica para DP"; los términos se
utilizan aquí en forma intercambiable y significan un ácido
nucleico que codifica un polipéptido DP o un homólogo del mismo como
se describe aquí más arriba. Los ejemplos de ácidos nucleicos que
codifican para DP incluyen aquellos representados por cualquiera de
las SEQ ID NOs: 1, 3, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22. También se provee el
uso de ácidos nucleicos que codifican para DP en la realización de
los métodos de la presente invención. Las variantes funcionales de
ácidos nucleicos que codifican para DP incluyen porciones de tales
ácidos nucleicos y/o ácidos nucleicos capaces de hibridar con un
ácido nucleico que codifica para DP. Las variantes funcionales
(porciones o secuencias de hibridación) útiles en los métodos de la
invención son aquellas que codifican polipéptidos que tienen los
rasgos característicos de las DP, a saber (i) actividad de
dimerización (que puede ser atribuida a un dominio de dimerización
parcial o preferiblemente completo) y (ii) un dominio de
enlazamiento de ADN para enlazamiento de ADN. Estas variantes
funcionales pueden ser útiles en los métodos divulgados en esta
descripción.
El termino porción como se lo utiliza aquí se
refiere a un pedazo de ADN que contiene al menos 80 nucleótidos y
que codifica un polipéptido que tiene los rasgos característicos de
las DP, a saber (i) actividad de dimerización (que puede ser
atribuida a un dominio de dimerización parcial o preferiblemente
completo) y (ii) un dominio de enlazamiento de ADN para
enlazamiento de ADN. Dichas porciones pueden prepararse, por
ejemplo, haciendo una o más supresiones a un ácido nucleico que
codifica para DP. La porción es preferiblemente una porción de un
ácido nucleico como el representado por cualquiera de las SEQ ID
NOs: 1, 3, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22, y la cual reúne los
requerimientos anteriormente mencionados.
Una variante funcional de un ácido nucleico que
codifica para DP es un ácido nucleico capaz de hibridar,
preferiblemente bajo condiciones rigurosas, con un ácido nucleico
que codifica para DP. Tal secuencia de hibridación como la definida
aquí tiene una longitud de al menos 80 nucleótidos y codifica un
polipéptido que tiene los rasgos característicos de las DP, a saber
(i) actividad de dimerización (que puede ser atribuida a un dominio
de dimerización parcial o preferiblemente completo) y (ii) un
dominio de enlazamiento de ADN para enlazamiento de ADN. Tales
secuencias de hibridación pueden ser útiles en los métodos de esta
descripción. La secuencia de hibridación es preferiblemente capaz
de hibridar ácido nucleico como el representado por cualquiera de
las SEQ ID NOs: 1, 3, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22, y la cual reúne los
requerimientos anteriormente mencionados.
El término "hibridación" como se lo utiliza
aquí significa apareamiento con secuencias de nucleótidos
complementarias sustancialmente homólogas en un proceso de
hibridación. El proceso de hibridación puede ocurrir completamente
en solución, es decir ambos ácidos nucleicos complementarios están
en solución. El proceso de hibridación puede presentarse también
con uno de los ácidos nucleicos complementarios y movilizados a una
matriz tal como partículas magnéticas, partículas de Sefarosa o
cualquier otra resina. El proceso de hibridación puede presentarse
además con uno de los ácidos nucleicos complementarios inmovilizados
a un soporte sólido tal como una membrana de nitrocelulosa o de
nylon o inmovilizada, por ejemplo, por medio de fotolitografía, por
ejemplo, a un soporte de vidrio silíceo (este último conocido como
arreglos o microarreglos de ácido nucleico o como chips de ácido
nucleico). Con el propósito de permitir que ocurra la hibridación,
generalmente se desnaturalizan térmica o químicamente las moléculas
de ácido nucleico para fundir una cadena doble en dos cadenas
sencillas y/o para remover horquillas u otras estructuras
secundarias de los ácidos nucleicos monocatenarios. La rigurosidad
de la hibridación está influenciada por condiciones tales como la
temperatura, la concentración de sal/sodio, y la composición del
amortiguador de
hibridación.
hibridación.
La hibridación se presenta bajo condiciones de
rigurosidad reducida, preferiblemente bajo condiciones rigurosas.
La rigurosidad de la hibridación está influenciada por condiciones
tales como temperatura, concentración salina, fuerza iónica y
composición del amortiguador de hibridación. La hibridación se
presenta bajo condiciones de rigurosidad reducida, preferiblemente
bajo condiciones rigurosas. Los ejemplos de condiciones rigurosas se
muestran en la Tabla 1 a continuación: condiciones rigurosas con
aquellas que son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las
condiciones A-L; y condiciones de rigurosidad
reducida son al menos tan rigurosas como, por ejemplo, las
condiciones M-R.
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Otras variantes funcionales de los ácidos
nucleicos que codifican para DP divulgadas en la presente
descripción incluyen variantes alélicas de un ácido nucleico que
codifica para DP, variantes de empalme, variantes debidas a la
degeneración del código genético, miembros de la familia de un ácido
nucleico que codifica para DP y variantes interrumpidas por una o
más secuencias intervinientes, tales como intrones, secuencias
espaciadoras o transposones. Cada una de las variantes funcionales
anteriormente mencionadas es capaz de codificar un polipéptido que
tiene los rasgos característicos de las DP, a saber (i) actividad de
dimerización (que puede ser atribuida a un dominio de dimerización
parcial o preferiblemente completo) y (ii) un dominio de
enlazamiento de ADN para enlazamiento de ADN. Los ácidos nucleicos
que codifican para DP o variantes funcionales de los mismos pueden
estar en la forma de ADN o un complemento del mismo, ARN, ADNc, ADN
genómico, ADN sintético completo o una parte, ácido nucleico
monocatenario o bicatenario.
La secuencia dada en la SEQ ID NO: 3 es un
ejemplo de una variante de empalme de la SEQ ID NO: 1. Otros
ejemplos de variantes de empalme se encuentran en Oryza
sativa donde dos proteínas DPb tienen cada una dos diferentes
formas de empalme: AAO72709.1 y AY224589, que son variantes de
empalme del mismo ADN genómico, y AAO72671.1 y AY224551 que son
variantes de empalme del mismo ADN genómico y que codifican a la
otra proteína DPb. El término "variante de empalme" como se lo
utiliza aquí incluye variantes de un ácido nucleico en las cuales
se han cortado, reemplazado o añadido intrones y/o exones
seleccionados. Las variantes de empalme adecuadas para uso en los
métodos de esta descripción son aquellos que codifican polipéptidos
que tienen los rasgos característicos de las DP, a saber (i)
actividad de dimerización (que puede ser atribuida a un dominio de
dimerización parcial o preferiblemente completo) y (ii) un dominio
de enlazamiento de ADN para enlazamiento de ADN. Tales variantes de
empalme pueden encontrarse en la naturaleza o pueden prepararse
reteniendo selectivamente esos segmentos funcionales de la
proteína. Los métodos para elaborar variantes de empalme son
conocidos en el arte.
Otra variante funcional de ácido nucleico que
codifica para DP es una variante alélica de un gen que codifica
para DP. Existen variantes alélicas en la naturaleza y dentro de los
métodos de la presente descripción está incluido el uso de estos
alelos naturales. Las variantes alélicas también incluyen
Polimorfismos de Nucleótidos Individuales (SNP) así como
Polimorfismos Pequeños de Inserción/Supresión (INDEL). El tamaño de
los INDEL es usualmente menor a 100 pb. Los SNP y los INDEL forman
el conjunto mayor de variantes de secuencia en cepas polimórficas
de ocurrencia natural de la mayoría de los organismos. Las variantes
alélicas adecuadas para uso en los métodos de esta descripción son
aquellas que codifican polipéptidos que tienen los rasgos
característicos de las DP, a saber (i) actividad de dimerización
(que puede ser atribuida a un dominio de dimerización parcial o
preferiblemente completo) y (ii) un dominio de enlazamiento de ADN
para enlazamiento de ADN.
El ácido nucleico que codifica para DP o una
variante funcional del mismo puede derivarse de cualquier fuente
natural o artificial. La fuente puede ser una fuente microbiana, tal
como bacterias, levaduras u hongos, o una fuente vegetal, de algas
o animales (incluida la humana). El ácido nucleico puede ser
modificado a partir de su forma nativa en composición y/o en
ambiente genómico a través de manipulación humana deliberada. El
ácido nucleico es preferiblemente de origen vegetal, ya sea de la
misma especie de planta (por ejemplo de aquella en la cual va a ser
insertado) o de una especie diferente de planta. El ácido nucleico
puede ser aislado de una especie dicotiledónea, preferiblemente de
la familia Brassicaceae, preferiblemente adicionalmente de
Arabidopsis thaliana. Más preferiblemente, el gen que
codifica para DP es aislado de Arabidopsis thaliana y es
como el representado por la SEQ ID NO: 1 ó 3, y la secuencia
codificada de aminoácidos de DP es como la representada por la SEQ
ID NO: 2 ó 4. Otras secuencias preferidas son como las representadas
por las SEQ ID NOs: 12, 14, 16, 18, 20 y 22 y la correspondiente
secuencia de aminoácidos como la representada por las SEQ ID NOs:
13, 15, 17, 19, 21 ó 23.
Las secuencias de ácido nucleico que codifican
para DP útiles en los métodos de la presente descripción pueden
tener en orden creciente de preferencia, al menos 30%, 31%, 32%,
33%, 34%, 35%, 36%, 37%, 38%, 39%, 40%, 41%, 42%, 43%, 44%, 45%,
46%, 47%, 48%, 49%, 50%, 51%, 52%, 53%, 54%, 55%. 56%, 57%, 58%,
59%, 60%, 61%, 62%, 63%, 64%, 65%, 66%, 67%, 68%, 69%, 70%, 71%,
72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%,
85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,
98% ó 99% de identidad de secuencia con un ácido nucleico que
codifica para DP, por ejemplo, con cualquiera de las SEQ ID NO 1, 3,
12, 14, 16, 18, 20 ó 22.
En una modalidad particular de la presente
invención, se proporciona un método para mejorar las características
de crecimiento de una planta con relación a las correspondientes
plantas de tipo silvestre en donde dicho ácido nucleico que codifica
para DP es:
- (i)
- un ácido nucleico que contiene las SEQ ID NOs: 1, 3, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22; o
- (ii)
- un ácido nucleico que codifica una proteína como la representada por medio de las SEQ ID NOs: 2, 4, 13, 15, 17, 19, 21 ó 23.
\vskip1.000000\baselineskip
Los "homólogos" de una proteína abarcan
péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que
tienen una sustitución, supresión y/o inserción de aminoácidos con
relación a la proteína no modificada en cuestión y que tienen
actividad biológica y funcional similar a la proteína no modificada
de la cual se derivan. Para producir tales homólogos, se pueden
remplazar aminoácido de la proteína por otros aminoácidos que tengan
propiedades similares (tal como hidrofobicidad, hidrofilicidad,
antigenicidad similares, propensión a formar o a romper estructuras
\alpha helicoidales o estructuras de láminas \beta). Las tablas
de sustitución conservadora son conocidas en el arte (ver por
ejemplo Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company). Los
homólogos útiles en los métodos de la descripción son aquellos
polipéptidos que tienen los rasgos característicos de las DP, a
saber (i) actividad de dimerización (que puede ser atribuida a un
dominio de dimerización parcial o preferiblemente completo) y (ii)
un dominio de enlazamiento de ADN para enlazamiento de ADN. Un
polipéptido DP que tiene tales características retiene una
actividad biológica y/o funcional similar o al menos parte de la
actividad biológica y/o funcional de una proteína DP.
Dos formas especiales de homólogos, a saber
ortólogos y parálogos, son conceptos evolucionarios utilizados para
describir relaciones ancestrales de genes. El término
"ortólogos" se relaciona con genes en diferentes organismos
que son homólogos debido a una relación ancestral. El término
"parálogos" se relaciona con duplicaciones de genes dentro del
genoma de una especie que conduce a genes parálogos. El término
"homólogos" como se lo utiliza aquí también abarca parálogos y
ortólogos de una proteína DP, que son también útiles en la práctica
de los métodos de la descripción.
Se pueden encontrar fácilmente ortólogos de una
proteína DP en otra especie de planta llevando a cabo una búsqueda
por Blast, que involucra la búsqueda de una o más bases de datos de
secuencia con un gen de consulta o una proteína (por ejemplo,
cualquiera de las SEQ ID NOs: 1 a 4 ó 12 a 23), utilizando por
ejemplo, un programa BLAST. Los genes objetivo de más alto rango
que resultan de esta búsqueda son utilizados luego como una
secuencia de consulta en una búsqueda similar con BLAST. Aquellos
genes que tienen una correspondencia más alta contra la secuencia
original de consulta se considera que con genes ortólogos. Por
ejemplo, para encontrar un ortólogo del arroz de un gen de
Arabidopsis thaliana se puede realizar un análisis BLASTN o
TBLASTX sobre una base de datos de arroz tal como la base de datos
de Oryza sativa Nipponbare disponible en el sitio web de
NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). En una siguiente etapa, se
utilizan las secuencias de arroz de más alto rango en una búsqueda
inversa por BLAST sobre una base de datos de secuencia de
Arabidopsis thaliana. Se puede utilizar el método para
identificar ortólogos de muchas especies diferentes, por ejemplo, de
maíz.
Pueden encontrase fácilmente parálogos de una
proteína DP llevando a cabo una búsqueda Blast sobre secuencias de
la misma especie a partir de las cuales se deriva la proteína DP de
"consulta". A partir de las secuencias que son seleccionadas
por medio de la búsqueda por Blast, se pueden identificar parálogos
verdaderos como aquellos que tienen la identidad de secuencia más
alta.
Los ortólogos y parálogos útiles en los métodos
de la descripción son aquellos polipéptidos que tienen los rasgos
característicos de las DP, a saber (i) actividad de dimerización
(que puede ser atribuida a un dominio de dimerización parcial o
preferiblemente completo) y (ii) un dominio de enlazamiento de ADN
para enlazamiento de ADN. Preferiblemente, un parálogo de DP incluye
además los motivos DPb como se describe aquí más adelante.
Las variantes funcionales de los ácido nucleicos
que codifican para DP y los homólogos de proteínas DP como se
definió aquí anteriormente pueden presentarse en la naturaleza y
pueden ser aislados de la naturaleza. Una vez se conoce la
secuencia de un homólogo, y su correspondiente secuencia de
codificación, la persona capacitada en el arte será capaz de aislar
el correspondiente ácido nucleico para DP a partir de material
biológico tal como bibliotecas genómicas, por ejemplo, por medio de
la técnica de PCR. Un ejemplo de tal experimento está indicado en
el Ejemplo 1. Alternativamente, cuando no se conoce la secuencia, se
pueden aislar nuevas proteínas DP a partir de material biológico a
través de técnicas de hibridación con base en sondas de proteínas
DP conocidas. Alternativamente y/o adicionalmente, pueden elaborarse
variantes funcionales de ácidos nucleicos que codifican para DP u
homólogos de proteínas DP a través de técnicas que involucran, por
ejemplo, mutación (sustitución, inserción o supresión) o
derivación. Estas variantes funcionales son denominadas aquí
"derivadas", que son también útiles en los métodos de la
presente descripción siempre y cuando el derivado sea un polipéptido
que tenga los rasgos característicos de las DP, a saber (i)
actividad de dimerización (que puede ser atribuida a un dominio de
dimerización parcial o preferiblemente completo) y (ii) un dominio
de enlazamiento de ADN para enlazamiento de ADN, o en el caso de un
ácido nucleico, el derivado codifica a dicho polipéptido.
Se pueden elaborar fácilmente derivados de una
proteína utilizando técnicas para síntesis de péptidos bien
conocidas en el arte, tales como las síntesis de péptidos en fase
sólida y similares, o por medio de manipulaciones de ADN
recombinante. La manipulación de secuencias de ADN para producir
variantes de sustitución, inserción o supresión de una proteína son
bien conocidos en el arte. Por ejemplo, las técnicas para
elaboración de mutaciones por sustitución en sitios predeterminados
en el ADN son bien conocidas por aquellos capacitados en el arte e
incluyen mutagénesis M13, mutagénesis in vitro
T7-Gen (USB, Cleveland, OH), mutagénesis Dirigida al
Sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA), mutagénesis dirigida
al sitio mediada por PCR u otros protocolos de mutagénesis dirigida
al sitio.
Un homólogo puede estar también en el formato de
una variante por sustitución. El término "variantes por
sustitución" de una proteína DP se refiere a aquellas variantes
en donde al menos un residuo en una secuencia de aminoácidos ha
sido removido y se ha insertado un aminoácido diferente en su lugar.
Las sustituciones de aminoácidos son típicamente de residuos
individuales, pero pueden agruparse dependiendo de las restricciones
funcionales colocadas sobre el polipéptido; las inserciones
usualmente son del orden de aproximadamente 1 a 10 aminoácidos, y
las supresiones pueden estar en el rango de aproximadamente
1-20 aminoácidos. Preferiblemente, las sustituciones
de aminoácidos incluyen sustituciones conservadoras de
aminoácidos.
Los homólogos pueden estar también en la forma
de una "variante de inserción" de una proteína en la cual se
introducen uno o más aminoácidos en un sitio predeterminado en la
proteína DP. Las inserciones pueden incluir fusión en el terminal
amino o en el terminal carboxilo así como una inserción dentro de la
secuencia de un solo aminoácido o de múltiples aminoácidos.
Generalmente, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos
son del orden de aproximadamente 1 a 10 aminoácidos. Los ejemplos de
fusiones en el terminal amino o en el terminal carboxilo incluyen
la fusión del dominio de enlazamiento o del dominio de activación de
un activador transcripcional como el utilizado en el sistema
híbrido doble de levadura, proteínas de recubrimiento de fago,
etiqueta de (histidina)6, etiqueta de glutationa
S-transferasa, proteína A, proteína para
enlazamiento de maltosa, dihidrofolato reductasa, epítopo de Tag
100, epítopo de c-myc, epítopo de FLAG, lacZ, CMP
(péptido para enlazamiento de calmodulina), epítopo de HA, epítopo
de proteína C y epítopo de VSV.
Los homólogos en la forma de "variantes de
supresión" se caracterizan por la remoción de uno o más
aminoácidos de la proteína.
El polipéptido DP o un homólogo del mismo puede
ser un derivado en la forma de un péptido, oligopéptido,
polipéptido, proteína o enzima, caracterizado por sustituciones,
y/o supresiones y/o adiciones de aminoácidos de ocurrencia natural
y no natural comparado con los aminoácidos de una proteína DP de
ocurrencia natural. Un derivado puede incluir también uno o más
sustituyentes no aminoácidos, comparado con la secuencia de
aminoácidos de la cual se deriva. Tales sustituyentes no
aminoácidos incluyen, por ejemplo, aminoácidos de ocurrencia no
natural, una molécula reportera u otro ligando, enlazados en forma
covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos. Tal
molécula reportera puede estar enlazada para facilitar la detección
de la proteína DP.
Otro tipo de polipéptido DP suministrado en esta
descripción es un fragmento activo de una proteína DP. Tales
"fragmentos activos" de una proteína DP incluyen al menos 80
residuos aminoácidos contiguos de una proteína DP, los cuales
retienen actividad biológica y/o funcional similar a una proteína de
ocurrencia natural o una parte de la misma. Los fragmentos activos
incluyen polipéptidos que tienen los rasgos característicos de las
DP, a saber (i) actividad de dimerización (que puede ser atribuida a
un dominio de dimerización parcial o preferiblemente completo) y
(ii) un dominio de enlazamiento de ADN para enlazamiento de ADN.
Además, los fragmentos activos incluyen fragmentos de una proteína
DP que parten en el segundo o tercer o posteriores residuos internos
de metionina; estos fragmentos se originan a partir de la
traducción de la proteína, partiendo de los codones internos
ATG.
La actividad de un polipéptido DP o de un
homólogo del mismo o la expresión de un gen que codifica DP o de
una variante funcional del mismo se pueden incrementar por medio de
la introducción de una modificación genética (preferiblemente en el
locus de un gen que codifica DP o un homólogo del mismo). El locus
de un gen como se define aquí se entiende cómo una región genómica,
que incluye al gen de interés y 10 KB secuencia arriba o secuencia a
bajo de la región de codificación.
Se puede introducir la modificación genética,
por ejemplo, por uno cualquiera (o más) de los métodos siguientes:
activación de TADN, TILLING, mutagénesis dirigida al sitio,
evolución dirigida, recombinación homóloga o por medio de la
introducción en una planta de un ácido nucleico que codifica DP o
una variante funcional del mismo que codifica un polipéptido DP o
un homólogo del mismo. Después de la introducción de la modificación
genética, sigue una etapa opcional de selección para mayor
actividad de un polipéptido DP, cuya mayor actividad produce plantas
que tienen características de crecimiento mejoradas.
La activación del T-ADN
etiquetando (Hayashi et al. Science (1992)
1350-1353) involucra la inserción de
T-ADN que usualmente contiene un promotor (puede ser
también un reforzador de la traducción o un intrón), en la región
genómica del gen de interés o 10 KB secuencia arriba o secuencia
debajo de la región de codificación de un gen en una configuración
tal que el promotor dirija la expresión del gen objetivo.
Típicamente, la regulación de la expresión del gen objetivo por su
promotor natural se rompe, y el gen cae bajo el control del promotor
recientemente introducido. El promotor está típicamente embebido en
un T-ADN. Este T-ADN es insertado en
el genoma de la planta, por ejemplo, a través de inserción de
Agrobacterium y conduce a la sobreexpresión de genes cerca
al T-ADN insertado. La planta transgénica resultante
muestra fenotipos dominantes debido a la sobreexpresión de genes
cerca al promotor introducido. El promotor que es introducido puede
ser cualquier promotor capaz de dirigir la expresión de un gen en
el organismo deseado, en este caso una planta. Por ejemplo,
promotores constitutivos, preferidos del tejido, preferidos por el
tipo de célula y promotores inducibles son todos adecuados para uso
en la activación de T-ADN.
Se puede introducir también una modificación
genética en el locus de un gen que codifica DP utilizando la
técnica de TILLING (Targeted Induced Local
Lesions IN Genomes: Lesiones Locales Inducidas
Dirigidas en Genomas). Esta es una tecnología de mutagénesis útil
para generar y/o identificar, y para aislar variantes de mutagénesis
de un ácido nucleico que codifica DP capaz de exhibir actividad de
DP. TILLING también permite la selección de plantas que portan
tales variantes mutantes. Estas variantes mutantes pueden exhibir
incluso mayor actividad de DP que aquella exhibida por el gen en su
forma natural. TILLING combina mutagénesis de alta densidad con
métodos de selección de alto rendimiento. Las etapas típicamente
seguidas en TILLING son: (a) mutagénesis EMS (Redei y Koncz, 1992;
Feldmann et al., 1994; Lightner y Caspar 1998); (b)
preparación y reunión del ADN de individuos; (c) amplificación por
PCR de una región de interés; (d) desnaturalización e hibridación
para permitir la formación de heterodúplex; (e) DHPLC, donde la
presencia de un heterodúplex en un fondo común se detectada como un
pico extra en el cromatograma; (f) identificación del mutante
individual; y (g) secuenciación del producto PCR mutante. Los
métodos para TILLING son bien conocidos en el arte (McCallum Nat.
Biotechnol.; 2000 Apr, 18 (4), 455-5, revisado por
Stemple 2004 (TILLING- a high-throughput harvest for
functional genomics. Nat. Rev. Genet. 2004 5(2);
145-50)).
145-50)).
Se puede utilizar mutagénesis dirigida al sitio
para generar variantes de ácidos nucleicos que codifican DP o
variantes funcionales de los mismos que codifican proteínas activas.
Varios métodos se encuentran disponibles para lograr la mutagénesis
dirigida al sitio; siendo los más comunes los métodos con base en
PCR (Current Protocols in Molecular Biology,
(http://www.4ulr.com/products/currentprotocols/index.html).
También se puede utilizar evolución dirigida
para generar variantes de ácidos nucleicos que codifican DP. Esto
consiste de iteraciones de arrastre de ADN seguido por detección y/o
selección apropiadas para generar variantes de ácidos nucleicos que
codifican DP o porciones de los mismos que codifican polipéptidos DP
o porciones de los mismos que tienen una actividad biológica
modificada (Castle et al., (2004) Science 304(5674):
1151-4; patentes estadounidenses Nos. 5.811.238 y
6.395.547).
La activación de T-ADN, TILLING
y mutagénesis dirigida al sitio son ejemplos de tecnologías que
permiten la generación de nuevos alelos y variantes de DP que
retienen la función de DP y que son por lo tanto útiles en los
métodos de la presente descripción.
La recombinación homóloga permite la
introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una
posición definida. La recombinación homóloga es una tecnología
estándar usada rutinariamente en ciencias biológicas para
organismos inferiores tales como levadura o musgo
Physcomitrella. Los métodos para llevar a cabo la
recombinación homóloga en plantas han sido descritos no solamente
para plantas modelo (Offringa et al. Extrachromosomal
homologous recombination and gene targeting in plant cells after
Agrobacterium-mediated transformation. 1990 EMBO J. 1990
Oct; 9 (10): 3077-84) sino también para plantas de
cultivo, por ejemplo arroz (Terada R, et al. Nat Biotechnol.
2002. Efficient gene targeting by homologous recombination in rice;
Lida and Terada. Curr Opin Biotechnol. 2004 Apr; 15 (2):
132-8: A tale of two integrations, transgene and
T-DNA: gene targeting by homologous recombination in
rice). El ácido nucleico que será dirigido (que puede ser un ácido
nucleico que codifica DP o una variante del mismo como se definió
aquí anteriormente) no requiere ser dirigido al locus de un gen que
codifica DP, sino que puede ser introducido, por ejemplo, en
regiones de alta expresión. El ácido nucleico que va a ser dirigido
puede ser un alelo mejorado utilizado para reemplazar el gen
endógeno o puede ser introducido además o el gen endógeno.
De acuerdo a una modalidad preferida de la
invención, se pueden mejorar las características de crecimiento de
una planta por medio de la introducción y expresión en una planta de
un ácido nucleico o una variante funcional del mismo que codifica un
polipéptido DP o un homólogo del mismo, en donde el ácido nucleico
se expresa específicamente en tejido de brote de una planta.
De acuerdo con un aspecto preferido de la
presente invención, se prevé una expresión mejorada o reforzada de
la molécula de ácido nucleico que codifica DP. Los métodos para
obtener una expresión reforzada o mejorada de genes o de productos
génicos están bien documentados en el arte e incluyen, por ejemplo,
sobreexpresión dirigida por promotores apropiados, el uso de
reforzadores de transcripción o reforzadores de traducción. Se
pueden introducir ácidos nucleicos aislados que sirvan como
elementos promotores o reforzadores en una posición apropiada
(típicamente secuencia arriba) de una forma no heteróloga de un
polinucleótido para favorecer la expresión de un ácido nucleico que
codifica DP o una variante funcional del mismo. Por ejemplo, se
pueden alterar in vivo promotores endógenos por medio de
mutación, supresión, y/o sustitución (ver Kmiec, patente
estadounidense No. 5.565.350; Zarling et al.,
PCT/US93/03868), o se pueden introducir promotores aislados en una
célula vegetal en la orientación y distancia apropiados del gen de
la presente invención para controlar la expresión del gen.
De acuerdo con los métodos de la presente
invención, la actividad de un polipéptido DP se incrementa
específicamente en tejido de brotes, y preferiblemente esto es
mediado por una mayor expresión de un ácido nucleico que codifica
DP específicamente en tejido de brotes. El término "brote" como
se lo utiliza aquí abarca todas las partes aéreas de las plantas.
Los tejidos típicos de brote incluyen, pero no se limitan a, tejidos
de tallos, ramas, hojas, yemas, flores, órganos reproductivos,
semillas, y estructuras derivadas de brotes tales como estolones,
cormos, bulbos o tubérculos. Preferiblemente, en los métodos de la
presente invención, el gen que codifica DP se expresa
preferencialmente en tejidos de brote joven.
Preferiblemente, la expresión específica en
brotes de un gen que codifica DP se logra por medio de un promotor
específico para brotes que está operativamente enlazado a un gen que
codifica DP. Por lo tanto, de acuerdo con una modalidad preferida
de la invención se provee un método para mejorar las características
de crecimiento de una planta con relación a las correspondientes
plantas de tipo silvestre, que comprende la introducción en una
planta de un ácido nucleico que codifica una proteína DP, en donde
el ácido nucleico es específicamente expresado en tejido de brotes.
En particular, la presente invención proporciona un método en donde
dicho ácido nucleico que codifica DP está bajo el control de un
promotor capaz de expresar específicamente dicho ácido nucleico que
codifica DP en tejido de brotes; preferiblemente dicho promotor
tiene un perfil de expresión comparable con un promotor de expansina
beta.
El término "promotor específico para
brotes" como se define aquí se refiere a un promotor que es al
menos 5 veces más fuerte en los brotes que en otros órganos de la
planta, tal como las raíces y es preferencialmente, pero no
exclusivamente expresado en partes aéreas de una planta. El término
promotor "específico del tejido" es utilizado aquí en forma
intercambiable con un promotor "preferido para el tejido".
Alternativamente, la expresión específica del brote de un gen que
codifica DP puede ser mediada por técnicas selectivas de
transformación, tales como el uso de balística para la
transformación de tejidos aéreos. Alternativamente, se puede lograr
expresión específica del brote por medio de etiquetado de
T-ADN, una técnica bien conocida por aquellos
capacitados en el arte y que involucra la introducción de un
promotor en forma aleatoria en una planta y la selección de aquellas
plantas en las cuales se incrementa específicamente la expresión de
DP en tejido de brotes.
Si se desea la expresión del polipéptido,
generalmente es deseable incluir una región de poliadenilación en
el extremo 3' de una región para codificación de polinucleótidos. La
región de poliadenilación se puede derivar del gen natural, a
partir de una variedad de otros genes de la planta, o a partir
T-ADN. La secuencia del extremo 3' que va a ser
añadida se puede derivarse, por ejemplo, de los genes para nopalina
sintasa u octopina sintasa, o alternativamente a partir de otro gen
de la planta, o a partir de cualquier otro gen eucariota.
Se puede añadir también una secuencia de un
intrón a la región 5' no traducida o la secuencia de codificación
de la secuencia parcial de codificación para incrementar la cantidad
del mensaje de madurez que se acumula en el citosol. La inclusión
de un intrón empalmable en la unidad de transcripción tanto en
construcciones para expresión en plantas como en animales ha
demostrado que incrementa la expresión génica tanto en ARNm como en
los niveles de proteína hasta en 1000 veces, Buchman y Berg, Mol.
Cell Biol. 8, 4395-4405 (1988); Callis et
al., Genes Dev. 1: 1183-1200 (1987). Tal mejora
en el intrón de la expresión génica es típicamente mayor cuando se
coloca cerca del extremo 5' de la unidad de transcripción. El uso de
los intrones del maíz 1, 2, y 6 de Adh1-S, el
intrón de Bronze-1 son conocidos en el arte; ver,
The Maize Handbook, Capítulo 116, Freeling y Walbot, Eds., Springer,
N.Y. (1994).
La invención también suministra construcciones
genéticas y vectores para facilitar la introducción y/o expresión de
las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de acuerdo con
la invención.
Por lo tanto, de acuerdo con una modalidad
adicional de la presente invención, se proporciona una construcción
genética que comprende:
- (a)
- un ácido nucleico que codifica DP;
- (b)
- una o más secuencias de control de la transcripción capaces de dirigir la expresión del ácido nucleico de (a) en tejido de brotes; y opcionalmente
- (c)
- una secuencia de terminación de la transcripción.
\vskip1.000000\baselineskip
Se pueden construir construcciones útiles en los
métodos de acuerdo con la presente invención utilizando tecnología
de ADN recombinante bien conocida por las personas capacitadas en el
arte. Se pueden insertar las construcciones génicas en vectores,
que pueden encontrarse comercialmente disponibles, adecuadas para
mantenimiento y expresión del gen de interés en las células
transformadas. Preferiblemente, la construcción genética de acuerdo
con la presente invención es un vector de expresión de una planta,
adecuado para la introducción y/o el mantenimiento y/o la expresión
de un ácido nucleico en una célula, tejido u órgano de una planta o
en la planta completa.
Un ejemplo de una construcción genética de
acuerdo con la presente invención está representado por la SEQ ID
NO: 8 y describe un gen para DP bajo el control de un promotor de
expansina beta de arroz, seguido por una secuencia doble de
terminación de la transcripción (ver la Figura 2).
La presente invención proporciona construcciones
genéticas como se describió anteriormente en donde la secuencia de
control de (b) es un promotor preferido del tejido de brote, tal
como un promotor de expansina beta o un promotor que tiene un perfil
de expresión comparable a la del promotor de expansina beta.
El ácido nucleico de acuerdo con (a) es
convenientemente cualquier ácido nucleico que codifica DP, tal como
cualquiera de los ácidos nucleicos descritos aquí anteriormente. Un
ácido nucleico preferido es un ácido nucleico representado por las
SEQ ID NOs: 1, 2, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22 o una variante funcional
de las mismas como se describe aquí más arriba, o es un ácido
nucleico que codifica una proteína como la representada por medio de
las SEQ ID NOs: 2, 4, 13, 15, 17, 19, 21 ó 23 o un homólogo de las
mismas como se describe aquí más arriba.
También se prevé el uso de las construcciones
anteriormente mencionadas en los métodos de la invención.
Se transforman las plantas con un vector que
contiene la secuencia de interés (es decir, un ácido nucleico que
codifica DP o una variante funcional del mismo). La secuencia de
interés está operativamente enlazada a una o más secuencias de
control, preferiblemente a un promotor. El término "promotor"
se refiere a una secuencia de control de la transcripción. El
promotor (b) es operable en una planta y preferiblemente se deriva
de la planta. Los términos "secuencia de control de la
transcripción" y "promotor" se utilizan aquí en forma
intercambiable y se refieren a ácidos nucleicos reguladores capaces
de efectuar la expresión de las secuencias con las cuales están
operativamente enlazados. Abarcadas por los términos anteriormente
mencionados están las secuencias reguladoras de la transcripción
derivadas de un gen genómico eucariota clásico (incluida la caja
TATA que es requerida para la iniciación precisa de la
transcripción, con o sin una secuencia de la caja CCAAT) y elementos
reguladores adicionales (es decir, secuencias, reforzadores y
silenciadores activadores secuencia arriba) que alteran la
expresión génica en respuesta a estímulos externos y/o de
desarrollo, o en una forma específica del tejido. También está
incluida dentro del término una secuencia reguladora de
transcripción de un gen procariota clásico, en cuyo caso puede
incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras de la
transcripción de caja -10. El término "elemento regulador"
también abarca una molécula sintética de fusión o un derivado que
confiere, activa o refuerza la expresión de una molécula de ácido
nucleico en una célula, tejido u órgano.
El término "operativamente enlazado" como
se lo utiliza aquí se refiere a un enlace funcional entre la
secuencia promotora y el gen de interés, de tal manera que la
secuencia promotora sea capaz de iniciar la transcripción del gen de
interés. Preferiblemente, el gen de interés está operativamente
enlazado en la orientación sentido con el promotor.
Convenientemente, se puede utilizar cualquier
promotor para los métodos de la invención, siempre y cuando tenga un
patrón de expresión específico del tejido del brote. Estos
promotores tienen, cuando se los compara con un promotor
constitutivo fuerte (tal como el promotor constitutivo/ubicuo fuerte
CaMV35S), un nivel de expresión menor en las raíces.
Un ejemplo de tal promotor es el promotor de
expansina beta del arroz EXPB9, representado aquí por la SEQ ID NO:
7. Este promotor se puede aislar del cromosoma 10 de Oryza
sativa (grupo de la variedad japonesa cultivada),
BACOSJNBa0082M15, que está localizado secuencia arriba del gen EXPB9
que codifica al ARNm como el representado por el número de acceso
del Genbank AF261277. El término "promotor específico del
tejido" como se lo utiliza aquí también significa por lo tanto
un promotor que tiene actividad igual o similar, que el promotor de
expansina beta del arroz EXPB9 en Oryza sativa. Una actividad
similar en este contexto significa una actividad que es al menos 20
veces superior o inferior que la del promotor de expansina beta
EXPB9, preferiblemente a lo sumo 10 veces superior o inferior o 5
veces superior o inferior o 3 veces superior o inferior.
Un método para medir la fuerza del promotor es a
través del uso de fusiones promotor-glucuronidasa
beta. El promotor puede fusionarse con el gen UidA de Escherichia
coli que codifica glucuronidasa beta y transformarse en una
planta. Se extraen proteínas del material de la planta y se mide la
actividad de GUS (Jefferson et al., 1987, EMBO J. 20;
6(13): 3901-7). Se calcula luego la actividad
del promotor como la densidad óptica en unidades por mg de proteína
extraída.
Preferiblemente, el promotor preferido del brote
se expresa durante el desarrollo vegetativo de una planta o en
tejido joven de brote. Por lo tanto, se mide preferiblemente la
actividad de GUS de tejidos después de la germinación. Estas
mediciones se realizan preferiblemente durante el desarrollo
vegetativo de una planta, por ejemplo después de 2, preferiblemente
después de 4 semanas después de la germinación.
Otro ejemplo de un promotor preferido del tejido
de brote es un promotor de protoclorofila reductasa.
Opcionalmente, la construcción genética puede
incluir también una o más secuencias terminadoras. El término
"secuencia de terminación de la transcripción" abarca una
secuencia de control en el extremo de una unidad transcripcional,
cuyas señales de procesamiento y poliadenilación 3' de un
transcripto primario y terminación de la transcripción. Elementos
reguladores adicionales, tales como reforzadores de transcripción o
de traducción, pueden ser incorporados en la construcción genética.
Aquellos capacitados en el arte estarán al corriente de las
secuencias terminadoras y reforzadoras adecuadas.
Las construcciones genéticas de la invención
pueden incluir además un origen de la secuencia de replicación, que
es requerido para el mantenimiento y/o la replicación en un tipo
específico de célula. Un ejemplo es cuando se requiere mantener una
construcción genética en una célula bacteriana como un elemento
genético episomal (por ejemplo un plásmido o un cósmido). Los
orígenes preferidos de replicación incluyen, pero no se limitan al
f1-ori y colE1.
La construcción genética puede incluir
opcionalmente un gen marcador seleccionable. Como se lo utiliza
aquí, el término "gen marcador seleccionable" incluye a
cualquier gen que confiera un fenotipo sobre una célula en la cual
se exprese para facilitar la identificación y/o selección de las
células que son transfectadas o transformadas con una construcción
de ácido nucleico de la invención. Los marcadores adecuados pueden
seleccionarse entre los marcadores que confieren resistencia
antibiótica o herbicida, que introducen una nuevo rasgo metabólico
o que permiten selección visual. Los ejemplo de genes marcadores
seleccionables incluyen a los genes que confieren resistencia a los
antibióticos (tal como nptll que fosforila neomicina y kanamicina, o
hpt, que fosforila higromicina), a herbicidas (por ejemplo bar que
proporciona resistencia a Basta; aroA o gox que proporcionan
resistencia contra el glifosato), o genes que proporcionan una
característica metabólica (tal como manA que permite que las
plantas utilicen manosa como fuente única de carbono). Los genes
marcadores visuales resultan en la formación de color (por ejemplo
\beta-glucuronidasa, GUS), luminiscencia (tal como
luciferasa) o fluorescencia (Proteína Fluorescente Verde, GFP, y
derivados de la misma).
La presente invención también abarca plantas que
pueden ser obtenidas por medio de los métodos de acuerdo con la
presente invención. La presente invención suministra por lo tanto
plantas que pueden ser obtenidas por medio del método de acuerdo con
la presente invención, en donde las plantas tienen dentro de ellas
un ácido nucleico que codifica DP como se definió aquí
anteriormente.
La invención también proporciona un método para
la producción de plantas transgénicas que tienen características
mejoradas de crecimiento, que comprende la introducción y expresión
en una planta de un ácido nucleico que codifica DP.
Se proporciona por lo tanto un método para la
producción de una planta transgénica que comprende:
- (a)
- la introducción en una célula vegetal de un ácido nucleico que codifica DP, preferiblemente la introducción de una construcción genética como se describió anteriormente;
- (b)
- el cultivo de dicha célula vegetal bajo condiciones que promueven el crecimiento y desarrollo de la planta.
\vskip1.000000\baselineskip
El ácido nucleico que codifica DP o una variante
funcional del mismo o construcción genética es como se definió
anteriormente. Las plantas transgénicas producidas por medio del
método anteriormente mencionado tienen características mejoradas de
crecimiento de la planta con relación a las correspondientes plantas
de tipo silvestre, siendo tales características cualquiera de las
anteriormente mencionadas.
En una modalidad preferida de la presente
invención, dicha característica mejorada de crecimiento de la planta
es mayor biomasa con relación a las correspondientes plantas de
tipo silvestre. En otra modalidad preferida de la presente
invención dicha característica mejorada de crecimiento de la planta
es mayor rendimiento, particularmente rendimiento de semilla con
relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre. En una
modalidad preferida adicional de la presente invención, dicha
característica mejorada de crecimiento de la planta es una mayor
tasa de crecimiento con relación a las correspondientes platas de
tipo silvestre. En otra modalidad preferida adicional, dicha
característica mejorada de crecimiento de la planta es una
arquitectura alterada, particularmente una o más entre mayor
número, tamaño, forma de vástagos, o de la parte correspondiente de
la planta; mayor número de ramas y/o de hojas.
La "introducción" del ácido nucleico que
codifica DP o de la construcción genética dentro de una célula
vegetal se logra preferiblemente por medio de transformación. El
término "transformación" como se lo utiliza aquí abarca la
transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula huésped,
independientemente del método utilizado para la transferencia. El
tejido de la planta capaz de una propagación clónica subsiguiente,
ya sea por organogénesis o por embriogénesis, puede ser
transformado con una construcción genética de la presente
invención. La escogencia del tejido depende de la especie particular
de planta que está siendo transformada. Los ejemplos de tejidos
objetivo incluyen discos de hojas, polen, embriones, cotiledones,
hipocotiledones, mega gametofitos, tejido calloso, tejido
meristemático existente (por ejemplo, meristema apical, yemas
axilares, y meristemas de la raíz), y tejido de meristema inducido
(por ejemplo, meristema de cotiledón y meristema de hipocotiledón).
El polinucleótido puede ser introducido en forma transitoria o
estable en una célula huésped y puede ser mantenido en forma no
integrada, por ejemplo, como un plásmido. Alternativamente, puede
estar integrado en el genoma huésped. Preferiblemente, el ácido
nucleico que codifica DP se integra en forma estable en el genoma
de la célula vegetal, lo cual puede lograrse, por ejemplo,
utilizando un vector de transformación de la planta o un vector de
expresión de la planta que tenga bordes de T-ADN,
que flanquean el ácido nucleico que va a ser introducido en el
genoma.
La transformación de una especie vegetal es
ahora una técnica bastante rutinaria. De acuerdo con la presente
invención, las plantas transformadas son preferiblemente plantas
monocotiledóneas, tales como caña de azúcar, o un cereal, tal como
arroz, trigo, cebada, maíz, mijo, centeno, avena o sorgo, lo más
preferible, plantas de arroz. Convenientemente, se puede utilizar
cualquiera de los diferentes métodos de transformación para
introducir el gen de interés en un ancestro adecuado de la célula.
Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas,
electroporación, productos químicos que incrementan la captación de
ADN libre, inyección del ADN directamente dentro de la planta,
bombardeo con pistola de partículas, transformación utilizando virus
o polen y microinyección. Se pueden seleccionar los métodos a
partir del método con calcio/polietilén glicol para protoplastos
(Krens, F. A. et al., 1882, Nature 296,
72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant
Mol. Biol. 8, 363-373); electroporación de
protoplastos (Shillito R. D. et al., 1985 Bio/Technol 3,
1099-1102); microinyección dentro del material de
la planta (Crossway A. et al., 1986 Mol. Gen. Genet. 202,
179-185); bombardeo de partículas recubiertas con
ADN o ARN (Klein T. M. et al., 1987 Nature 327, 70);
Infección con virus (no integradores) y similares. Un método
preferido para la producción de plantas transgénicas de acuerdo con
la invención es un método de transformación mediado por
Agrobacterium.
Las plantas de arroz transgénico son producidas
preferiblemente a través de transformación mediada por
Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos bien
conocidos para la transformación de arroz, tal como se describe en
cualquiera de los siguientes documentos: solicitud publicada de
patente europea EP 1198985, Aldemita y Hodges (Planta, 1996, 199:
612-617); Chan et al. (Plant Mol. Biol. 1993,
22(3): 491-506); Hiei et al. (Plant
J., 1994, 6(2): 271-282). En el caso de la
transformación del maíz, el método preferido es como el descrito ya
sea por Ishida et al. (Nat. Biotechnol., 1996, 14(6):
745-50) o Frame et al. (Plant Physiol., 2002,
129(1): 13-22).
Generalmente después de la transformación, se
seleccionan células vegetales o las agrupaciones celulares por la
presencia de uno o más marcadores que son cotransformados con el gen
que codifica DP.
La célula vegetal transformada resultante, el
grupo de células o el tejido vegetal, pueden ser utilizados luego
para regenerar una planta completa transformada a través de técnicas
de regeneración bien conocidas por las personas capacitadas en el
arte. Por lo tanto, el cultivo de la célula vegetal bajo condiciones
que promuevan el crecimiento de la planta puede abarcar las etapas
de selección y/o regeneración y/o crecimiento hasta la madurez.
Después de la transferencia y regeneración del
ADN, se pueden evaluar las plantas putativamente transformadas,
utilizando análisis tipo Southern, por ejemplo para monitorear la
presencia del gen de interés, para determinar el número de copia y/o
la organización genómica. Alternativamente o adicionalmente, se
pueden monitorear los niveles de expresión del ADN recientemente
introducido utilizando análisis tipo Northern y/o tipo Western
siendo ambas técnicas bien conocidas por las personas ordinariamente
capacitas en el arte.
\newpage
Las plantas transformadas generadas se pueden
propagar por medio de una variedad de medios, tales como por medio
de propagación clónica o por medio de técnicas clásicas de
fitomejoramiento. Por ejemplo, una primera generación de plantas
transformadas (o T1) puede ser autofecundadas para producir una
segunda generación de transformantes homocigotos (o T2), y se pueden
propagar adicionalmente las plantas T2 a través de técnicas clásicas
de fitomejoramiento.
Los organismos transformados generados pueden
tomar una variedad de formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras de
células transformadas y de células no transformadas; los
transformantes clónicos (por ejemplo, todas las células
transformadas para contener el casete de expresión); injertos de
tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas,
un rizoma transformado injertado a un vástago no transformado).
La presente invención también proporciona
células huésped que contienen una molécula aislada de ácido nucleico
que codifica una DP o una construcción genética como se mencionó
aquí anteriormente. Las células huésped preferidas son células
vegetales. También se proporcionan células vegetales, tejido,
órganos y plantas completas y partes de plantas y propágulos de las
mismas que han sido transformados con y que incluyen un gen que
codifica DP o una construcción genética de la invención. La
presente invención se extiende claramente a plantas que pueden ser
obtenidas por medio de cualquiera de los métodos descritos aquí
anteriormente. La presente invención se extiende a planta que
tienen mayores niveles de expresión de un ácido nucleico que
codifica DP y/o mayores niveles y/o actividad de una proteína DP
específicamente en tejidos de brotes. En particular, la presente
invención se extiende a plantas transgénicas que tienen
características mejoradas de crecimiento con relación a las
correspondientes plantas de tipo silvestre resultantes de un ácido
nucleico que codifica DP bajo el control de un promotor específico
del brote introducido dentro de dicha planta.
La presente invención abarca también la progenie
de una célula primaria transformada, tejido, órgano o planta
completa o parte de una planta, siendo el único requerimiento el que
la progenie exhiba la(s) misma(s)
característica(s)
genotípica(s) que las plantas originales de las cuales se derivan y que incluyen una construcción genética como se definió previamente.
genotípica(s) que las plantas originales de las cuales se derivan y que incluyen una construcción genética como se definió previamente.
Las plantas de acuerdo con la presente invención
tienen características mejoradas de crecimiento con relación a las
correspondientes plantas de tipo silvestre. La invención también se
extiende a cualquier parte de la planta de acuerdo con la invención,
preferiblemente una parte cosechable, tal como, pero sin limitarse
a, semilla, hoja, fruto, flor, cultivos de tallo, tallo, rizoma,
raíz, tubérculo, bulbo y fibra de algodón. La invención también
proporciona productos directamente derivados de una planta o
progenie como se definió anteriormente que comprende una
construcción genética como se definió previamente.
La presente invención también se relaciona con
el uso de un ácido nucleico que codifica una proteína DP o un
homólogo de la misma bajo el control de un promotor preferido del
brote para mejorar una o más de las características de crecimiento
anteriormente mencionadas.
Los ácidos nucleicos que codifican DP o
variantes funcionales de los mismos, o polipéptidos DP u homólogos
de los mismos, pueden encontrar uso en programas de fitomejoramiento
en los cuales se identifica un marcador de ADN que puede estar
genéticamente enlazado con un gen que codifica DP o una variante
funcional del mismo. Los genes que codifican DP o variantes
funcionales de los mismos, o una proteína DP u homólogos de la
misma, pueden ser utilizados para definir un marcador molecular.
Este ADN o marcador de proteína pueden ser utilizados luego en
programas de fitomejoramiento para seleccionar plantas que tengan
características alteradas de crecimiento. El gen que codifica DP es
preferiblemente un ácido nucleico como el representado por una
cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22.
Las variantes alélicas de un gen que codifica DP
o una variante funcional del mismo pueden encontrar también uso en
programas de fitomejoramiento asistido por marcadores. Tales
programas de fitomejoramiento requieren algunas veces de la
introducción de una variación alélica por medio de tratamiento
mutagénico de las plantas, utilizando por ejemplo mutagénesis EMS;
alternativamente, el programa puede iniciar con una colección de
variantes alélicas de origen natural. La identificación de
variantes alélicas tiene lugar entonces, por ejemplo, por medio de
PCR. Esto es seguido por una etapa de selección para la selección de
variantes alélicas superiores de la secuencia en cuestión y la cual
produce características de crecimiento mejoradas en una planta con
relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre. La
selección se lleva a cabo típicamente por medio del monitoreo del
desempeño del crecimiento de las plantas que contienen diferentes
variantes alélicas de la secuencia en cuestión, por ejemplo,
diferentes variantes alélicas de cualquiera de las SEQ ID NOs: 1, 3,
12, 14, 16, 18, 20 ó 22. El desempeño de crecimiento puede ser
monitoreado en un invernadero o en el campo. Otras etapas opcionales
incluyen el cruzamiento de plantas, en las cuales se identificó la
variante alélica superior, con otra planta. Esto podría ser
utilizado, por ejemplo, para hacer una combinación de rasgos
fenotípicos interesantes.
Se pueden utilizar también ácido nucleico que
codifica DP o una variante funcional del mismo como una sonda para
mapear genética y físicamente los genes de los cuales hacen parte, y
como marcadores para rasgos enlazados con esos genes. Tal
información puede ser útil en fitomejoramiento de plantas con el
propósito de desarrollar líneas con fenotipos deseados. Tal uso de
ácidos nucleicos que codifican DP o de variantes funcionales de los
mismos requieren únicamente de una secuencia de ácido nucleico de al
menos 15 nucleótidos de longitud. Los ácidos nucleicos que
codifican DP o las variantes funcionales de los mismos pueden ser
utilizados como marcadores de polimorfismo con longitud de
fragmento de restricción (RFLP). Las transferencias tipo Southern
(Maniatis) de ADN genómico de la planta digerido con enzimas de
restricción pueden ser sondadas con los ácidos nucleicos que
codifican DP o variantes funcionales de los mismos. Los patrones de
las bandas resultantes pueden ser luego sometidos a análisis
genético utilizando programas de computador tales como MapMaker
(Lander et al., 1987, Genomics 1: 174-181)
con el propósito de construir un mapa genético. Además, se pueden
utilizar ácidos nucleicos para sondar transferencias tipo Southern
que contienen los ADN genómicos tratados con endonucleasa de
restricción de un grupo de individuos que representan a los padres y
a la progenie de un cruce genético definido. La segregación de los
polimorfismos de ADN es anotado y utilizado para calcular la
posición de los ácidos nucleicos que codifican DP o variantes
funcionales de los mismos en el mapa
genético previamente obtenido utilizando esta población (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32, 314-331).
genético previamente obtenido utilizando esta población (Botstein et al. (1980) Am. J. Hum. Genet. 32, 314-331).
La producción y el uso de sondas derivadas de
genes de plantas para uso en cartografía genética están descritos
en Bematzky y Tanksley (1986) Plant Mol. Biol. Reporter 4:
37-41. Numerosas publicaciones describen la
cartografía genética de clones específicos de ADNc utilizando la
metodología esbozada anteriormente o variaciones de la misma. Por
ejemplo, las poblaciones con entrecruzamiento F2, las poblaciones
con retrocruzamiento, las poblaciones apareadas en forma aleatoria,
las líneas casi isogénicas, y otros grupos de individuos pueden ser
utilizados para cartografía. Tales metodologías son bien conocidas
por aquellos capacitados en el arte.
Se pueden utilizar también sondas de ácido
nucleico para cartografía física (es decir, colocación de secuencias
sobre mapas físicos; ver Hoheisel et al. En: Nonmammalian
Genomic Analysis: A Practical Guide, Academic press 1996, páginas
319-346, y las referencias citadas allí).
En otra modalidad, se pueden utilizar sondas de
ácido nucleico en cartografía directa de hibridación in situ
con fluorescencia (FISH) (Trask (1991) Trends Genet. 7:
149-154). Aunque los métodos actuales de
cartografía por FISH favorecen el uso de clones grandes (desde unos
pocos hasta varios cientos de kb; ver Laan et al. (1995)
Genome Res. 5: 13-20), las mejoras en sensibilidad
pueden permitir la realización de cartografía por FISH utilizando
sondas más cortas.
Se pueden llevar a cabo una variedad de métodos
con base en la amplificación de ácido nucleico de cartografía
genética y física utilizando los ácidos nucleicos que codifican DP
anteriormente mencionados. Los ejemplos incluyen amplificación
específica de alelos (Kazazian (1989) J. Lab. Clin. Med. 11:
95-96), polimorfismo de fragmentos amplificados por
PCR (CAPS; Sheffield et al. (1993) Genomics 16:
325-332), ligación específica de alelos (Landegren
et al. (1988) Science 241: 1077-1080),
reacciones de extensión de nucleótidos (Sokolov (1990) Nucleic Acid
Res. 18: 3671), Radiation Hybrid Mapping (Walter et al.
(1997) Nat. Genet. 7: 22-28) y Happy Mapping (Dear
y Cook (1989) Nucleic Acid Res. 17: 6795-6807). Para
estos métodos, se utiliza la secuencia de un ácido nucleico para
diseñar y producir pares de iniciadores para uso en la reacción de
amplificación o en reacciones de extensión del iniciador. El diseño
de tales iniciadores es bien conocido por aquellos capacitados en
el arte. En métodos que emplean cartografía genética con base en
PCR, puede ser necesario identificar diferencias en la secuencia de
ADN entre los padres del mapeo cruzado en la región correspondiente
a la presente secuencia de ácido nucleico. Esto, sin embargo,
generalmente no es necesario para métodos de cartografía.
Los ácido nucleicos que codifican DP o variantes
funcionales de los mismos o polipéptidos DP u homólogos de los
mismos pueden encontrar uso también como reguladores de crecimiento.
Ya que se ha mostrado que estas moléculas son útiles en el
mejoramiento de las características de crecimiento de las plantas,
serían también reguladoras de crecimiento útiles, tal como
herbicidas o estimuladoras del crecimiento. La presente descripción
proporciona por lo tanto una composición que contiene un ácido
nucleico que codifica DP o una variante funcional del mismo o un
polipéptido DP u homólogo del mismo, junto con un portador,
diluyente o excipiente adecuado, para uso como regulador del
crecimiento.
Los métodos de acuerdo con la presente invención
resultan en plantas que tienen características de crecimiento
mejoradas, como se describió aquí anteriormente. Estas
características de crecimiento convenientes pueden ser combinadas
también con otras características económicamente ventajosas, tales
como características adicionales de mejoramiento de la
productividad, tolerancia a diferentes estreses, características que
modifican diferentes rasgos arquitectónicos y/o rasgos bioquímicos
y/o fisiológicos.
Se describirá ahora la presente invención con
referencia a las siguientes figuras en las cuales:
La Fig. 1 es un mapa del vector binario
pEXP::AtDPb para expresión en Oryza sativa del gen para DPb
de Arabidopsis thaliana (referencia interna CDS006) bajo el
control de un promotor de expansina beta del arroz (promotor
beta-EXPB9 con referencia interna PRO0061). El
casete de expresión AtDPb incluye además una secuencia doble de
terminación de la transcripción de T-zeina y
T-rbcS-deltaGA. Este casete de
expresión se localiza dentro del borde izquierdo (repetición LB, LB
Ti C58) y el borde derecho (repetición RB, RB Ti C58) del plásmido
Ti de nopalina. Dentro del T-ADN se suministra
además un marcador detectable y uno seleccionable, ambos bajo el
control de un promotor constitutivo y seguido por poliA o una
secuencia terminadora de la transcripción T-NOS.
Este vector incluye además un origen de replicación (pBR322 ori +
bom) para replicación bacteriana y un marcador bacteriano
seleccionable (Spe/SmeR) para selección bacteriana.
La Fig. 2 da algunos ejemplos de las secuencias
descritas en la presente solicitud. La SEQ ID NO: 2 también muestra
subrayada una región típicamente conservada en proteínas DP.
La Fig. 3 muestra una alineación de proteínas DP
con la localización de motivos conservados DPb de consenso
representados como SEQ ID NO: 9 (motivo 1), 10 (motivo 2) y 11
(motivo 3). El dominio de enlazamiento de ADN y el dominio de
dimerización de AtDPb están indicados. La localización de una región
altamente conservada con todas las proteínas DP está indicada con
paréntesis punteados. Se hizo una alineación múltiple de secuencias
a través de la secuencia completa utilizando CLUSTAL W (Higgins
et al., (1994) Nucleic Acids Res. 22:
4673-4680), con la matriz BLOSSUM 62 y con los
parámetros GAPOPEN 10, GAPEXT 0,05 y GAPDIST 8. También se
proporcionan los números de acceso del Genbank para las
secuencias.
La Fig. 4 muestra un cladograma correspondiente
a la alineación múltiple de la Figura 3. El cladograma fue generado
utilizando ClustalW. Se proporcionan los números de acceso del
Genbank para las secuencias.
La Fig. 5 muestra una vista en forma de
filograma de proteínas DP. El filograma proporciona la longitud de
las ramificaciones y la distancia entre los nodos en proporción a la
distancia evolucionaria entre las secuencias. La vista en forma de
cladograma fue generada por medio de ClustalW. Los dos grupos de
proteínas DP (Dpa y DPb) pueden distinguirse entre sí por medio de
la presencia o la ausencia de un motivo KKKK/RR que está únicamente
presente en DPb.
\vskip1.000000\baselineskip
Se describirá ahora la presente invención con
referencia a los siguientes ejemplos, que son únicamente para
propósitos de ilustración.
\vskip1.000000\baselineskip
A menos que se establezca otra cosa, se llevan a
cabo las técnicas de ADN recombinante de acuerdo a protocolos
estándar descritos en Sambrook (2001) Molecular Cloning: a
laboratory manual, 3rd Edition Cold Spring Harbor Laboratory Press,
CSH, New York o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al.
(1998), Current Protocols in Molecular Biology. Los materiales
estándar y los métodos para trabajo molecular en plantas están
descritos en Plant Molecular Biology Labfax (1993) por R. D. D.
Croy, publicado por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y
Blackwell Scientific Publications (RU).
\vskip1.000000\baselineskip
El gen de DPb de Arabidopsis (referencia
interna CDS006) fue amplificado por medio de PCR utilizando como
molde una biblioteca de ADNc de plántulas de Arabidopsis
thaliana (Invitrogen, Paisley, RU). Después de transcripción
inversa del ARN extraído de las plántulas se clonaron los fragmentos
de ADNc en pCMV Sport 6.0. El tamaño promedio del inserto de la
biblioteca de ADNc era de 1,5 kb, y el número original de clones era
aproximadamente de 1,59 x 10^{7} cfu. El título original de 9,6 x
10^{5} cfu/ml fue llevado hasta 6 x 10^{11} cfu/ml después de
amplificación de la biblioteca. Después de la extracción del
plásmido de los clones, se utilizaron 200 ng de molde de plásmido
en una mezcla PCR de 50 \mul. Los iniciadores utilizados para
amplificación por PCR, prm0319 con la secuencia 5'
GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACAATGACAA CTACTGGGTCTAATTCT 3' (SEQ
ID NO: 5) y prm0320 con la secuencia 5' GGGGACCACTTT
GTACAAGAAAGCTGGGTTCAATTCTCCGGCTTCAT 3' (SEQ ID NO: 6), incluye un
sitio AttB para clonación de recombinación Gateway (itálicas). Se
llevó a cabo la PCR utilizando Hifi Taq ADN polimerasa en
condiciones estándar. Se amplificó y purificó un fragmento de PCR de
la longitude esperada utilizando también métodos estándar. Se llevó
a cabo entonces la primera etapa del procedimiento Gateway, la
reacción BP, durante la cual el fragmento de PCR se recombina in
vivo con el plásmido pDONR201 para producir el "clon de
entrada", p0424. El plásmido pDONR201 fue adquirido a Invitrogen,
com parte de la tecnología Gateway®.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó posteriormente el clon de entrada
p0424 en una reacción LR con p3169, un vector de destinación
utilizado para transformación de Oryza sativa. Este vector
contiene como elementos funcionales dentro de los bordes del
T-ADN, un marcador seleccionable de planta, un
marcador detectable y un casete Gateway destinado a recombinación
in vivo de LR con la secuencia de interés ya clonada en el
clon de entrada. Secuencia arriba de este casete Gateway se
encuentra el promotor de expansina beta de arroz (referencia interna
PRO061) para expresión preferida en el tejido de brote del gen de
interés. Después de la etapa de recombinación LR, se transformó el
vector de expresión resultante pEXP::AtDPb (Fig. 1) en la cepa
LBA4044 de Agrobacterium y posteriormente en plantas de
Oryza sativa var. Nipponbare. Se cultivaron y
examinaron las plantas de arroz transformadas con relación a
diferentes características de crecimiento tal como se describe en el
Ejemplo 3.
\vskip1.000000\baselineskip
Aproximadamente se generaron 15 a 20
transformantes T0. Se transfirieron los transformantes primarios
desde las cámaras de cultivo de tejidos hasta un invernadero para
crecimiento y cosecha de semillas T1. Seis eventos de los cuales se
retuvo la progenie T1 segregada 3:1 por la presencia/ausencia del
transgén. "Plantas nulas" o "Segregantes nulos" o
"Nulicigotos" eran plantas tratadas en la misma forma que las
plantas transgénicas, pero a partir de las cuales se segregó el
transgén. Las plantas nulas pueden describirse también como
transformantes homocigotos negativos. Para cada uno de estos
eventos, se seleccionaron por medio de PCR aproximadamente 10
plántulas T1 que contenían al transgén (hetero y homocigotos), y
aproximadamente 10 plántulas T1 que carecían del transgén
(nulicigotos).
Con base en los resultados de la evaluación T1,
se escogieron tres eventos que mostraron características de
crecimiento mejoradas en el nivel T1 para caracterización adicional
en el T2 y generaciones adicionales. Se seleccionaron lotes de
semillas de las plantas T1 positivas (tanto hétero como homocigotas)
monitoreando la expresión del marcador. Para cada evento escogido,
se seleccionaron luego lotes de semilla homocigotas para evaluación
T2. Se trasplantaron un número igual de positivas y negativas dentro
de cada lote de semillas para evaluación en el invernadero (es
decir, para cada evento, se cultivaron 40 plantas de las cuales 20
eran positivas para el transgén y 20 negativas para el transgén).
Por lo tanto, para los tres eventos, se evaluaron un total de 120
plantas en la generación T2.
Se transfirieron plantas T1 y T2 a un
invernadero y se las evaluó por parámetros de crecimiento vegetativo
como se describe a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizó un ANOVA de dos factores (análisis de
varianza) corregido por un diseño desequilibrado como modelo
estadístico de evaluación para los valore numéricos de las
características fenotípicas observadas de la planta. Los valores
numéricos fueron enviados a una prueba t y a una prueba F. Se obtuvo
el valor p comparando el valor t con la distribución t o
alternativamente comparando el valor F con la distribución F. El
valor p representa la probabilidad de que la hipótesis nula (donde
hipótesis nula significa que "no existe efecto del transgén")
sea correcta.
Se llevó a cabo una prueba t sobre todos los
valores de todas las plantas de un evento. Se repitió tal prueba t
para cada evento y para cada característica de crecimiento. Se llevó
a cabo la prueba t para revisar un efecto del gen dentro de un
evento de transformación, también llamado aquí un "efecto
específico de línea". En la prueba t, el umbral para un efecto
específico de línea significativo se establece en un nivel de
probabilidad del 10%. Por lo tanto, los datos con un valor p de la
prueba t por debajo del 10% significa que el fenotipo observado en
las plantas transgénicas de esa línea es causado por la presencia
del gen. Dentro de una población de eventos de transformación,
algunos eventos pueden ser bajos o estar por debajo de este umbral.
Esta diferencia puede ser debida a la diferencia en la posición del
transgén en el genoma. No es raro que el gen pueda tener únicamente
un efecto en ciertas posiciones del genoma. Por lo tanto, el
"efecto especifico de línea" anteriormente mencionado sea
también denominado como "efecto dependiente de la
posición".
Se llevó a cabo una prueba F sobre todos los
valores medidos para todas las plantas de todos los eventos. Se
repitió una prueba F para cada característica de crecimiento. Se
llevó a cabo la prueba F para revisar un efecto del gen sobre todos
los eventos de transformación y para verificar un efecto total del
gen, también llamado aquí "efecto génico". En la prueba F, el
umbral para un efecto génico global se establece en un nivel de
probabilidad del 5%. Por lo tanto, los datos con un valor p de la
prueba F por debajo del 5% significa que el fenotipo observado es
causado por más que solamente la presencia del gen y/o la posición
del transgén en el genoma. Un "efecto génico" es una indicación
de la gran aplicabilidad del gen en plantas transgénicas.
\vskip1.000000\baselineskip
Se cultivaron las plantas seleccionadas a un
invernadero. Cada planta recibió una etiqueta con un código de
barras único para relacionar sin ambigüedades los datos del fenotipo
con la planta correspondiente. Se cultivaron las plantas
seleccionadas sobre tierra en macetas de 10 cm de diámetro bajo las
siguientes características ambientales: período de luz = 11,5 h,
intensidad de luz día = 30.000 lux o más, temperatura durante el
día = 28ºC o superior, temperatura durante la noche = 22ºC, humedad
relativa = 60-70%. Se cultivaron las plantas
transgénicas y los correspondientes nulicigotos uno al lado del otro
en posiciones aleatorias. A partir de la etapa de cultivo hasta la
etapa de maduración (que es la etapa donde no se presenta más
incremento de biomasa) se transfirieron semanalmente las plantas a
través de una cámara digital para toma de imágenes. Se tomaron cada
vez imágenes digitales puntuales (2048 x 1536 pixeles, 16 millones
de colores) de cada planta al menos a partir de seis ángulos
diferentes. Se derivaron los parámetros descritos más abajo en una
forma automatizada a partir de las imágenes digitales utilizando un
software para análisis de imágenes.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó el área de la planta por encima del
suelo haciendo un recuento del número total de pixeles de las
partes de la planta por encima del suelo discriminadas de las que
están por debajo del suelo. Se promedió este valor para las
fotografías tomadas al mismo tiempo desde los diferentes ángulos y
se los convirtió a un valor físico de superficie expresado en mm
cuadrados por medio de calibración. Los experimentos muestran que
el área de la planta por encima del suelo, que corresponde al área
máxima total, medida de esta manera se correlaciona con la biomasa
de las partes de la planta por encima del suelo.
En promedio, las plantas transgénicas pEXP::DPb
en la generación T1 mostraron un incremento en el área por encima
del suelo del 8% con un valor p en la prueba F de 0,08. Una de las
tres líneas T1 más positivas mostró un incremento en el área por
encima del suelo del 30% con un valor p de la prueba T de 0,01. En
la generación T2, está línea mostró un incremento del 18% en el
área por encima del suelo con un valor p de la prueba t de 0,03.
\vskip1.000000\baselineskip
Se clonó el promotor de expansina beta en el
plásmido de entrada pDONR201 del sistema Gateway^{TM} (Life
Technologies) utilizando la "reacción de recombinación BP". La
identidad y la composición de pares de bases del inserto clonado se
confirmaron por medio de secuenciación y adicionalmente, se analizó
el plásmido resultante a través de digestiones de restricción.
Con el propósito de clonar al promotor en frente
de un gen reportero, se utilizó posteriormente cada clon de entrada
en una "reacción de recombinación LR" (Gateway^{TM}) con un
vector de destinación. Este vector de destinación fue diseñado para
enlazar operativamente al promotor con el gen
beta-glucuronidasa (GUS) de Escherichia coli
a través de la sustitución del casete de recombinación Gateway en
frente del gen GUS. Los vectores reporteros resultantes, que
incluyen al promotor operativamente enlazado con GUS son
posteriormente transformados en la cepa LBA4044 de
Agrobacterium y posteriormente en plantas de arroz utilizando
técnicas estándar de transformación.
Se generaron plantas transgénicas de arroz a
partir de células transformadas. El crecimiento de la planta se
llevó a cabo bajo condiciones normales.
Las plantas o partes de las plantas que iban a
ser analizadas fueron cubiertas con acetona fría sobre hielo al 90%
y se incubó durante 30 min a 4ºC. Después de 3 lavadas de 5 min con
amortiguador Tris [15,76 g de Trizma HCl (Sigma T3253) + 2.922 g de
NaCl en 1 litro de agua bidestilada, ajustado a pH 7,0 con NaOH], se
cubrió el material por medio de una solución de
Tris/ferricianato/X-Gluc [9,8 ml de amortiguador
Tris + 0,2 ml de patrón de ferricianato (0,33 g de ferricianato de
potasio (Sigma P3667) en 10 ml de amortiguador Tris) + 0,2 ml de
patrón de X-Gluc (26,1 mg de X-Gluc
(Europa Bioproducts ML 113A) en 500 \mul de DMSO)]. Se aplicó una
infiltración al vacío durante 15 a 30 minutos. Las plantas o partes
de las plantas fueron incubadas hasta por 16 horas a 37ºC hasta que
se hizo visible el desarrollo de color azul. Se lavaron las muestras
3 veces durante 5 minutos con amortiguador Tris. Se extrajo la
clorofila en series de etanol al 50%, 70% y 90% (cada vez durante 30
minutos).
\vskip1.000000\baselineskip
Este listado de referencias citado por el
solicitante es únicamente para conveniencia del lector. No forma
parte del documento europeo de la patente. Aunque se ha tenido gran
cuidado en la recopilación, no se pueden excluir los errores o las
omisiones y la OEP rechaza toda responsabilidad en este sentido.
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<160> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1158
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 385
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1442
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 413
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Arabidopsis thaliana
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 58
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador: iniciador hacia
adelante
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt cacaatgaca actactgggt ctaattct
\hfill58
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 47
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> iniciador: iniciador hacia atrás
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipggggaccact ttgtacaaga aagctgggtt caattctccg gcttcat
\hfill47
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1243
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 3077
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> casete de expresión
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> motivo Dpb 1
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> características diversas
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(5)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de ocurrencia natural
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> motivo Dpb 2
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CARACTERÍSTICA NUEVA
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser Arg o Lys
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia Artificial
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> motivo Dpb 3
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (2)..(2)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de ocurrencia natural
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (4)..(4)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de ocurrencia natural
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1550
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 386
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Zea mays
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (40)..(40)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de ocurrencia natural
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (102)..(102)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de ocurrencia natural
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1306
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (654)..(654)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n es a, c, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 344
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica nueva
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (193)..(193)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Xaa puede ser cualquier aminoácido
de ocurrencia natural
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 16
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1140
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 379
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1041
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 18
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 19
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 346
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 19
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 957
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 20
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 318
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Oryza sativa
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 21
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 1640
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Populus tremula x Populus
tremuloides
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 23
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 353
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Populus tremula x Populus
tremuloides
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 23
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (22)
1. Método para mejorar las características de
crecimiento de una planta con relación a las correspondientes
plantas de tipo silvestre, que comprende la introducción en una
planta y expresión específicamente en un tejido de brote, de un
ácido nucleico que codifica un Compañero de Dimerización (DP)
E2F.
2. Método de acuerdo a la reivindicación 1, en
donde dicho ácido nucleico que codifica DP es de origen vegetal,
preferiblemente de una planta dicotiledónea, preferiblemente además
de la familia Brassicaceae, más preferiblemente de
Arabidopsis thaliana.
3. Método de acuerdo a la reivindicación 1 ó 2,
en donde dicho ácido nucleico que codifica DP es:
- (i)
- un ácido nucleico que contiene las SEQ ID NOs: 1, 3, 12, 14, 16, 18, 20 ó 22; o
- (ii)
- un ácido nucleico que codifica una proteína como la representada por las SEQ ID NOs: 2, 4, 13, 15, 17, 19, 21 ó 23.
\vskip1.000000\baselineskip
4. Método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho ácido nucleico que codifica
DP está bajo el control de un promotor capaz de expresar
específicamente dicho ácido nucleico que codifica DP en tejido de
brote.
5. Método de acuerdo a la reivindicación 4, en
donde dicho promotor tiene un perfil de expresión comparable con un
promotor de expansina beta.
6. Método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en donde dicha característica mejorada de
crecimiento de la planta es mayor biomasa con relación a las
correspondientes plantas de tipo silvestre.
7. Método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en donde dicha característica mejorada de
crecimiento de la planta es mayor rendimiento, particularmente mayor
incremento de semilla con relación a las correspondientes plantas de
tipo silvestre.
8. Método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en donde dicha característica mejorada de
crecimiento de la planta es mayor tasa de crecimiento con relación a
las correspondientes plantas de tipo silvestre.
9. Método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 8, en donde dicha característica mejorada de
crecimiento de la planta es arquitectura alterada, particularmente
uno o más de mayor número, tamaño, forma de los vástagos, o parte
correspondiente de la planta; mayor número de ramas y/o de
hojas.
10. Método de acuerdo a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 9, en donde dicha planta es una planta
monocotiledónea.
11. Plantas obtenibles por medio de un método de
acuerdo a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.
12. Construcción genética que comprende:
- (a)
- un ácido nucleico que codifica un Compañero de Dimerización (DP) E2F;
- (b)
- una o más secuencias de control de la transcripción capaces de dirigir la expresión del ácido nucleico de (a) en tejido de brotes; y opcionalmente
- (c)
- una secuencia de terminación de la transcripción.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Una construcción genética de acuerdo a la
reivindicación 12, en donde dicha secuencia de control es capaz de
expresar específicamente dicho ácido nucleico que codifica DP en
tejido joven de brotes.
14. Una construcción genética de acuerdo a la
reivindicación 12 ó 13, en donde dicha secuencia de control es un
promotor que tiene un perfil de expresión comparable a un promotor
de expansina beta.
15. Una célula huésped transgénica que comprende
una construcción genética como la definida en cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14.
16. Planta o parte de una planta transgénica que
comprende una construcción genética como la definida en cualquiera
de las reivindicaciones 12 a 14.
\newpage
17. Método para la producción de una planta
transgénica que tiene características mejoradas de crecimiento con
relación a las correspondientes plantas de tipo silvestre, donde el
método comprende:
- a)
- la introducción en una célula vegetal de una construcción genética de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14;
- b)
- el cultivo de dicha célula vegetal en condiciones que promuevan el crecimiento y desarrollo de la planta.
\vskip1.000000\baselineskip
18. Una planta transgénica que tiene
características de crecimiento mejoradas con relación a las
correspondientes plantas de tipo silvestre resultante de un ácido
nucleico que codifica un Compañero de Dimerización (DP) E2F bajo el
control de un promotor específico de brotes introducido dentro de
dicha planta.
19. Una planta transgénica de acuerdo a las
reivindicaciones 11, 15, 16 ó 18, en donde dicha planta es una
planta monocotiledónea, tal como caña de azúcar, o un cereal, tal
como arroz, trigo, cebada, maíz, mijo, centeno, avena o sorgo.
20. Parte de una planta, preferiblemente una
parte cosechable, tal como una semilla, o un propágulo de una planta
como se define en cualquiera de las reivindicaciones 11, 15, 16, 18
y 19 y que contiene una construcción genética como la definida en
cualquiera de las reivindicaciones 12 a 14.
21. Progenie de una planta como la definida en
cualquiera de las reivindicaciones 11, 15, 16, 18, 19 y 20, en donde
dicha progenie exhibe la(s) misma(s)
característica(s) genotípica(s) que las plantas
originales a partir de las cuales se derivan y que contienen una
construcción genética como la definida en cualquiera de las
reivindicaciones 12 a 14.
22. El uso de un ácido nucleico que codifica DP
bajo el control de un promotor específico del brote para mejorar las
características de crecimiento de la planta seleccionadas de una o
más de: mayor biomasa de la planta, mayor rendimiento, mayor
rendimiento de semilla, arquitectura alterada de la planta y mayor
tasa de crecimiento.
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP04102392 | 2004-05-28 | ||
| US57625004P | 2004-06-02 | 2004-06-02 | |
| US576250P | 2004-06-02 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2353966T3 true ES2353966T3 (es) | 2011-03-08 |
Family
ID=43608349
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES05753886T Active ES2353966T3 (es) | 2004-05-28 | 2005-05-30 | Plantas que tienen características de crecimiento mejoradas y un método para su elaboración. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2353966T3 (es) |
-
2005
- 2005-05-30 ES ES05753886T patent/ES2353966T3/es active Active
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