MXPA06009986A - Plantas con mejor rendimiento y metodo para prepararlas. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se refiere a un metodo para mejorar el rendimiento de las plantas introduciendo en una planta un acido nucleico que codifica una proteina ciclina D3 bajo el control de un promotor que puede expresar preferentemente el acido nucleico en descargas. La invencion tambien se refiere a las plantas transgenicas que contienen un acido nucleico que codifica una proteina ciclina D3 bajo el control de un promotor que puede expresar preferentemente el acido nucleico en descargas, cuyas plantas tienen mejor rendimiento en relacion con las plantas nativas correspondientes. La invencion tambien se refiere a las construcciones utiles en los metodos de la invencion.

Description

PLANTAS CON MEJOR RENDIMIENTO Y MÉTODO PARA PREPARARLAS La presente invención se refiere, en general, al campo de la biología molecular y se refiere a un método para mejorar el rendimiento de las plantas en relación al correspondiente de las plantas de tipo nativas. Más específicamente, la presente invención se refiere a un método para mejorar el rendimiento, introduciendo en una planta un ácido nucleico que codifique una ciclina D3, cuyo ácido nucleido está bajo el control de un promotor que se expresa preferentemente en los brotes. La invención también se refiere a las plantas que contienen un ácido nucleico de ciclina D3 aislado bajo el control del promotor preferentemente expresado en los* brotes, cuyas plantas tienen mejor rendimiento en relación con las plantas tipo nativas correspondientes. La invención también se refiere a las construcciones útiles en los métodos de la invención.

La población mundial cada vez más creciente y la disposición disminuida de tierra cultivable disponible para la agricultura fomentan la investigación hacia el mejoramiento de la eficiencia de la agricultura. Los medios de cultivos tradicionales y los mejoramientos hortícolas utilizan técnicas de reproducción selectivas para identificar las plantas que tienen características deseables. No obstante, estas técnicas de reproducción selectiva tienen algunas desventajas, a saber, que estas técnicas normalmente requieren de intensa mano de obra y dan como resultado plantas que muchas veces contienen componentes genéticos heterogéneos que no siempre pueden producir el rasgo deseable que se quiere pasar de las plantas precursoras. Los avances en la biología molecular han permitido al hombre modificar el germen plasma de animales y plantas. La ingeniería genética de plantas supone la separación y manipulación del material genético (normalmente en forma de DNA ó RNA) y la introducción posterior de ese material genético en una planta. Esta tecnología tiene la capacidad de proporcionar cultivos o plantas que tienen diferentes rasgos económicos, agronómicos y hortícolas mejorados. Un rasgo de interés económico específico es el rendimiento. El rendimiento normalmente se define como el producto medible de valor económico de un cultivo. Esto se puede definir en términos de cantidad y/o calidad. El rendimiento depende directamente de diversos factores, por ejemplo, la cantidad y tamaño de los órganos, la arquitectura de la planta (por ejemplo, la cantidad de ramas), la producción de las semillas y más. El desarrollo de la raíz, la captación de nutrientes y la tolerancia a la agresión son también factores importantes para determinar el rendimiento. Es posible aumentar el rendimiento de los cultivos haciendo óptimos los factores antes mencionados, lo cual se puede hacer modificando los mecanismos de crecimiento propios de una planta.

Los mecanismos de crecimiento propios de una planta residen en una secuencia altamente ordenada de sucesos que se conocen en forma colectiva como el "ciclo celular". El avance a lo largo del ciclo celular es fundamental para el crecimiento y desarrollo de todos los organismos multicelulares y es crucial para la proliferación celular. Los principales componentes del ciclo celular están altamente conservados en levaduras, mamíferos y plantas. El ciclo celular normalmente se divide en las siguientes fases sucesivas: G0-G1-S-G2-M. La replicación o síntesis del DNA generalmente toma lugar durante la fase S ("S" es para la síntesis del DNA) y la segregación mitótica de los cromosomas sucede durante la fase M (la "M" es para la mitosis), con fases de "espacios intervinentes, Gl (durante las cuales las células crecen antes de la replicación del DNA) y G2 (un periodo después de la replicación del DNA durante la cual la célula se prepara para la división) . La división celular se completa después de la citocinesis, el último paso de la fase M. Las células que han salido del ciclo celular y que se han vuelto inactivas se dice que están en la fase GO. En esta fase las células pueden ser estimuladas para volver a entrar en el ciclo celular en la fase Gl. La "G" en las fases Gl, G2 y GO representa "gap". La terminación del proceso del ciclo celular permite que cada célula hija durante la división celular reciba una copia completa del genoma precursor.

La división celular es regulada por dos episodios principales del ciclo celular, a saber, la iniciación de la síntesis del DNA y la iniciación de la mitosis. Cada transición a cada uno de estos episodios clave es regulada por un punto de verificación representado por los complejos proteínicos específicos (involucrados en la replicación y división del DNA) . La expresión de los genes necesarios para la síntesis del DNA en el contorno Gl/S es regulada por la familia de factores de transcripción E2F en mamíferos y células vegetales (La Thangue, 1994; Muller y col., 2001; De Veylder y col., 2002) . La entrada en el ciclo celular es regulada/activada por un completo E2F/Rb que integra las señales y permite la activación de la transcripción de los genes del ciclo celular. La transición entre las diferentes fases del ciclo celular, y por tanto, el progreso hacia el ciclo celular, es impulsado por la formación y activación de diferentes serina/treonina proteína cinasas heterodiméricas, generalmente conocidas como cinasas dependientes de ciclina (las CDK) . Una condición previa de la actividad de estas cinasas es la asociación física con una ciclina específica, siendo la sincronización de la activación dependiente en gran medida de la expresión de la ciclina. La unión de la ciclina induce cambios de conformación en el lóbulo N-terminal de la CDK que se asocia y contribuye a la localización y especificidad del complejo para el sustrato. Las CDK monoméricas se activan cuando estas se asocian con las ciclinas y de este modo tienen una actividad cinasa. Los niveles de la proteína ciclina varían en el ciclo celular y por tanto representan un factor primordial en la determinación de la sincronización de la activación de la CDK. La activación periódica de estos complejos que contienen ciclinas y CDK durante el ciclo celular actúa como mediadora de la regulación temporal de las transiciones del ciclo celular (puntos de verificación) .

Se puede agrupar a las ciclinas en ciclinas mitóticas (denominadas ciclinas tipo A y B en eucariotas superiores y los CLB en levaduras en gemación) y en ciclinas específicas de Gl (denominadas ciclinas tipo D en mamíferos y CLN en levaduras en gemación) . Las ciclinas tipo H regulan la actividad de las CAK (cinasas activadoras de CDK) . Los cuatro tipos de ciclinas conocidas en las plantas fueron identificadas principalmente por analogía con sus contrapartes en humanos. En Arabidopsis, se han descrito diez ciclinas tipo A, nueve tipo B, diez D y una H (Vandepoele y col., 2002) .

Las diez ciclinas tipo D se subdividen en siete subclases, DI a D7, que muestran su ausencia de elevada similitud de secuencias entre sí, lo cual es contrario a las ciclinas tipo A y tipo B. Solo las subclases D3 y D4 tienen diferentes miembros, tres y dos respectivamente. Se ha propuesto anteriormente la redundancia de las ciclinas tipo D3 como explicación para la falta de fenotipos mutantes luego de un knocking out de una sola ciclina tipo D3 (S aminathan y col., 2000). Las dos ciclinas tipo D3 están vinculadas por una duplicación segmental reciente, lo cual sugiere que estas tienen funciones redundantes. Una hipótesis semejante se podría sostener para las ciclinas tipo D4, porque dos de tres están ubicadas en un bloque duplicado.

Una diferencia más grande observada para las ciclinas tipo D en comparación con las tipo A y B podría mostrar la función supuesta de las ciclinas tipo D en la integración de señales de desarrollo y claves del entorno en el ciclo celular. Por ejemplo, se ha demostrado que las ciclinas tipo D3 responden a las hormonas de las plantas, como las citocininas y brasinoesteroides, mientras que CYCD2 y CYCD4 se activan primero en Gl y reaccionan a la disponibilidad del azúcar (para una revisión ver Stals e Inzé, 2001) .

La sobreexpresión del gen CYCD2; 1 en el tabaco, según se documentó, aumenta la división celular y aumenta la velocidad de crecimiento total en las plantas sin alteraciones morfológicas (Cockroft y col., 2000).

La sobreexpresión en Arabidopsis del gen CYCD3; 1 bajo el control de un promotor de CaMV de 35S, según se documentó, proporciona plantas con cotiledones aumentados, un tamaño final de la planta drásticamente reducido y desarrollo deformado. A nivel celular, las células son empujadas desde Gl provocando la división de las células ectópicas en ambas regiones meristemáticas y en regiones en las que la división celular normalmente es ausente o limitada. El aumento del número de células se acopla con una disminución en el tamaño de las células (De itte y col., 2003).

La posibilidad de modificar con mayor exactitud el ciclo celular de una planta, y con ello modificar con mayor exactitud las diferentes características de crecimiento de una planta, tendría múltiples aplicaciones en áreas como el mejoramiento de los cultivos, reproducción de plantas y en la producción de plantas ornamentales, arboricultura, horticultura, ingeniería forestal, la producción de algas para utilizarlas en bioreactores (para la producción biotecnológica de sustancias como farmacéuticos, anticuerpos o vacunas o para la bioconversión de residuos orgánicos) y otras áreas como estas.

Es un objetivo de la presente invención solucionar algunos de los problemas asociados con la expresión, practicada en la técnica anterior, de ciclina D3 en plantas.

Ahora se ha encontrado que la introducción en una planta de un ácido nucleico que codifique una ciclina D3 bajo el control de un promotor que pueda expresar preferentemente el ácido nucleico en brotes produce plantas con mejor rendimiento. Por tanto, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método para mejorar el rendimiento en una planta, el cual consiste en introducir en una planta un ácido nucleico que codifique una ciclina D3 bajo el control de un promotor que pueda expresar preferentemente el ácido nucleico en los brotes.

El término "rendimiento aumentado" como se define en la presente se toma para entender un aumento en uno o más de lo siguiente, cada uno en relación con las plantas de tipo nativas correspondientes: (i) biomasa aumentada (peso) de una o más partes sobre la superficie (que se pueden cosechar) de una planta; (ii) rendimiento aumentado de las semillas, el cual puede resultar de un aumento en la biomasa de la semilla (peso de la semilla) y que puede ser un aumento en el peso de la semilla por planta o con base en cada una de las semillas individuales, y cuyo aumento en el peso de las semillas puede ser debido a las dimensiones alteradas de las semillas, como puede ser la longitud y/o ancho y/o área de las semillas; (iii) cantidad aumentada de semillas (contenidas en la cascarilla) ; (iv) tamaño aumentado de las semillas, el cual también puede influir en la composición de las semillas; (v) volumen aumentado de las semillas, el cual también puede influir en la composición de las semillas; (vi) índice de cosecha aumentado, el cual se expresa como la relación del rendimiento de las partes cosechables, como las semillas, sobre la biomasa total; y (vii) peso aumentado de mil granos (TKW) , el cual se extrapola a partir del número de semillas contenidas, contadas y su peso total. Un TKW aumentado puede resultar de un tamaño y/o densidad de semillas aumentado .

Tomando como ejemplo el maíz, un aumento en el rendimiento puede manifestarse como uno o más de lo siguiente: aumento en la cantidad de plantas por hectárea o acre, un aumento en la cantidad de espigas por planta, un aumento en la cantidad de filas, cantidad de granos por fila, peso de los granos, el peso de 1000 granos, longitud/diámetro de la espiga, entre otros. Tomando como ejemplo el arroz, un aumento en el rendimiento se puede manifestar por un aumento en uno o más de lo siguiente: el número de plantas por hectárea o acre, el número de panículas por planta, la cantidad de espiguillas por panícula, la cantidad de flores por panícula, el aumento en la velocidad de mejoramiento de las semillas, el aumento en el peso de 1000 granos, entre otros . Un aumento en el rendimiento también puede dar como resultado estructura modificada, o puede presentarse como resultado de la arquitectura modificada.

De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el desempeño de los métodos de la invención da como resultado plantas que tienen rendimiento mejorado que se manifiesta por al menos uno de lo siguiente: área aumentada sobre la superficie, aumento en la cantidad total de las semillas, aumento en la cantidad de semillas contenidas, aumento en el peso de las semillas y aumento en el índice de cosecha, cada uno en relación con plantas tipo nativas correspondientes. Por tanto, de acuerdo con la presente invención se proporciona un método para aumentar el rendimiento de las plantas, particularmente el rendimiento de las semillas, cuyo método consiste en introducir en una planta un ácido nucleico que codifique una ciclina D3 bajo el control de un promotor que pueda expresar preferentemente el ácido nucleico en los brotes.

La eficacia de los métodos de la invención dan rendimiento mejorado en las plantas, ya sea que las plantas (habiendo introducido en esta un gen de ciclina D3 bajo el control de un promotor que exprese preferentemente el ácido nucleico en los brotes) estén bajo condiciones no agresivas o si la planta se expone a diferentes agresiones en comparación con las plantas control. Las plantas normalmente responden a la agresión creciendo más lentamente. En condiciones de agresión severa, la planta puede incluso detener su crecimiento. La agresión moderada, por otra parte, se define en la presente como cualquier agresión a la que se expone una planta y que no conduzca a que la planta deje de crecer. Debido a los avances en las prácticas agrícolas (riego, fertilización, tratamientos con plaguicidas) no se encuentran con mucha frecuencia agresiones severas en las plantas de cultivo. Como consecuencia, el crecimiento comprometido inducido por agresión leve es con mucha frecuencia una característica no deseada para la agricultura. Las agresiones moderadas son las agresiones comunes a las que se puede exponer a una planta. Estas agresiones pueden ser las agresiones bióticas y/o abióticas (ambientales) cotidianas a las que se expone una planta. Las agresiones abióticas o ambientales comunes pueden ser las agresiones de la temperatura causadas por temperaturas calientes o frías/congelación atípicas; agresión salina; agresión de agua (sequía o agua en abundancia) . Las agresiones abióticas también pueden ser causadas por sustancias químicas. Las agresiones bióticas normalmente son aquellas agresiones causadas por patógenos, bacterias, virus, hongos e insectos.

Más ventajosamente, los métodos de la presente invención se pueden materializar en cualquier planta.

El término "planta" cuando se utiliza en la presente comprende plantas completas, predecesores y progenie de las plantas y partes de las plantas, como las semillas, retoños, tallos, hojas, raíces (incluidos los tubérculos) y células, tejidos y órganos de las plantas, en donde cada uno de los antes mencionados preferentemente contiene el gen que interesa. El término "planta" también comprende cultivos en suspensión, embriones, regiones meristemáticas, tejido calloso, gametofitos, esporofitos, polen y microesporas, otra vez en donde cada uno de los cuales también contiene el gen que interesa.

Las plantas que son particularmente útiles en los métodos de la invención incluyen todas las plantas que pertenecen a la superfamilia Viridiplantae, en particular plantas monocotiledóneas y dicotiledóneas que incluyen legumbres para pienso o forraje, plantas ornamentales, cultivos para alimentos, árboles o arbustos seleccionados de la lista que consiste en: Acacia spp., Acer spp., Actinidia spp., Aesculus spp., Agathis australis, Albizía amara, Alsophila tricolor, Andropogon spp., Arachis spp, Areca catechu, Astelia fragrans, Astragalus cicer, Baikiaea plurijuga, Betula spp., Brassica spp-, Bruguiera gymnorrhiza, Burkea africana y Butea frondosa, Cadaba farinosa, Calliandra spp, Camellia sinensis , Canna índica, Capsicum. spp., Cassia spp., Centroema pubescens, Chaenomeles spp., Cinnamomum cassia, Coffea arábica , Colophospermum mopane, Coroníllia varia, Cotoneaster serótina, Crataegus spp., Cucumis spp., Cupressus -spp., Cyathea dealbata, Cydonia oblonga, Cryptomeria japónica, Cymbopogon spp., Cynthea dealbata, Cydonia oblonga, Dalbergia monetaria, Davallia divaricata, Desmodium spp., Dicksonía squarosa , Diheteropogon amplectens, Dioclea spp, Dolichos spp., Dorycnium rectum, Echinochloa pyramidalis , Ehrartia spp., Eleusine coracana, Eragrestis spp., Erythrina spp., Eucalyptus spp., Euclea schimperi, Eulalia villosa, Fagopyrum spp., Feijoa sellowiana, Fragaria spp., Flemingia spp, Freycinetia banksii, Geranium thunbergií, Ginkgo biloba, Glycine javanica , Glircidia spp, Gossypium hirsutum, Grevillea spp., Guibourtía coleosperma, Hedysarum spp., Hemarthia altissima, Heteropogon contortus, Hordeum vulgare, Hyparrhenia rufa, Hypericum erectum, Hyperthelia dissoluta, índigo incamata, Iris spp., Leptarrhena pyroli folia, Lespediza spp., Lettuca spp., Leucaena leucocephala, Loudetia simplex, Lotonus bainesii, Lotus spp., Macrotyloma axillare, Malus spp., Manihot esculenta, Medicago sativa, Metasequoia glyptostroboides, Musa sapientum, Nicotianum spp., Onobrychis spp., Ornithopus spp., Oryza spp., Peltophonim africanum, Pennisetum spp., Persea gratissima, Petunia spp., Phaseolus spp., Phoenix canariensis, Phormium cookianum, Photinia spp., Picea glauca, Pinus spp., Pisum sativum, Podocarpus totara, Pogonarthria fleckii, Pogonarthria squarrosa, Populus spp., Prosopis cineraria, Pseudotsuga menziesii, Pterolobium stellatum, Pyrus communis, Quercus spp., Rhaphiolepsis umbellata, Rhopalostylis sápida, Rhus natalensis, Ribes grossularia, Ribes spp., Robinia pseudoacacia, Rosa spp., Rubus spp., Salix spp., Schyzachyrium sanguineum, Sciadopitys verticillata , Sequoia sempervirens , Sequoiadendron giganteum, Sorghum bicolor, Spinacia spp., Sporobolus fimbriatus, Stiburus alopecuroides, Stylosanthos humilis, Tadehagi spp, Taxodium distichum, Themeda triandra , Trifolium spp., Triticum spp., Tsuga heterophylla , Vaccinium spp., Vicia spp., Vitis vinifera , Watsonia pyramida ta , Zantedeschia aethiopica , Zea mays , amaranto, alcachofa, espárrago, brócoli, coles de Bruselas, col, cánola, zanahoria, coliflor, apio, hojas verdes de colza, lino, berza, lenteja, colza oleaginosa, quingombó, cebolla, papa, arroz, soya, fresa, betabel, caña de azúcar, girasol, tomate, calabaza, té y algas, entre otros. De acuerdo con una modalidad preferida de la presente invención, la planta es una planta de cultivo como soya, girasol, cánola, alfalfa, colza, algodón, tomate, papa o tabaco. Además preferentemente, la planta es una planta monocotiledónea como la caña de azúcar. Más preferentemente, la planta es un cereal, como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, sorgo o avenas.

Una ciclina D3 puede ser identificada por diversos métodos. Por ejemplo la consulta de la secuencia de las proteínas puede ser sometida a análisis BLAST (por ejemplo, utilizando los parámetros BLAST predeterminados para sanción por apertura de huecos y sanción por extensión de espacios) contra una base de datos de secuencias de ácidos nucleicos de Arabidopsis, traducidas. En el caso donde la secuencia consulta sea una ciclina D3 el primer resultado del análisis BLAST será una ciclina D3 de Arabidopsis . Otro método para identificar una ciclina D3 es por la alineación de la secuencia de consulta con secuencias conocidas de la proteína ciclina D3, utilizando por ejemplo el programa AlignX del paquete Vector NTI (InforMax, Bethesda, MD) . Luego se pueden llevar a cabo múltiples alineaciones con una sanción de apertura de espacios de 10 y una extensión de espacios de 0.01. También puede ser necesaria una corrección manual menor de la alineación para posicionar mejor algunas regiones conservadas. Si la secuencia de consulta es una ciclina D3 se alineará con las secuencias conocidas de ciclina D3.

Una "ciclina D3" como se define en la presente se refiere a cualquier secuencia de aminoácidos que, cuando se utiliza en la construcción de una ciclina o árbol filogenético de ciclina D3, como el representado en la Figura 1, cae en un grupo que incluye las ciclinas D3 (y no otras ciclinas tipo D, como la ciclina DI, D2, D4, D5, D6 y D7) . Cuando se menciona en la presente a un ácido nucleico que codifica una ciclina D3 es a un ácido nucleico que codifica un aminoácido de ciclina D3 como se define en lo anterior.

Una persona experta en la técnica podría determinar fácilmente si alguna secuencia de aminoácidos en cuestión entra dentro de la definición antes mencionada utilizando las técnicas y el software conocidos para preparar un árbol filogenético como éste, como el paquete GCG, EBI ó CLUSTAL, utilizando los parámetros predeterminados. Tras la construcción de un árbol filogenético como este, el agrupamiento de las secuencias en el grupo ciclina D3 será considerado que entra dentro de la definición de una "ciclina D3". Los ácidos nucleicos que codifican estas secuencias serán útiles para efectuar los métodos de la invención.

Las ciclinas D3 normalmente tienen la habilidad para unirse y activar las CDK y Rb de las plantas.

Además, las ciclinas D3 pueden contener uno o más y preferentemente todos los siguientes: (i) una caja de ciclina; (ii) un motivo LxCxE dentro de los primeros 40 o más aminoácidos (lo cual es característico de la mayoría de las ciclinas D) ; y (iii) una o más y preferentemente todas las regiones conservadas identificadas por las cajas que se muestran en la Figura 2 (como se muestra en la Figura 2, dentro de las cajas se permite un desacoplamiento) .

En la Tabla 1 siguiente se dan los ejemplos de los ácidos nucleicos que codifican las ciclinas D3 que entran en la definición antes mencionada de una ciclina D3. Los ácidos nucleicos que codifican ciclina D3 mostrados en la tabla pueden ser útiles para llevar a cabo los métodos de la invención, es decir, para obtener plantas que tengan mejor rendimiento en relación con las plantas tipo nativas correspondientes mediante la introducción y expresión de alguno de estos ácidos nucleicos bajo el control de un promotor que pueda expresar preferentemente los ácidos nucleicos en los brotes. El ácido nucleico que codifica una ciclina D3 es preferentemente el ácido nucleico que se representa por la SEQ ID NO: 1 o es una variante funcional de la SEQ ID NO: 1, como se describe más adelante.

Tabla 1: Ejemplos de los ácidos nucleicos que codifican ciclina D3 De acuerdo con la invención, se prevé la expresión mejorada o aumentada del ácido nucleico de ciclina D3 en brotes. Los métodos para obtener la expresión mejorada o aumentada de los genes o los productos génicos están bien documentados en la técnica e incluyen, por ejemplo, la sobreexpresión dirigida por los promotores, el uso de potenciadores de la transcripción o potenciadores de la traducción.

El ácido nucleico que codifica una ciclina D3 está ligado de manera operante a un promotor que pueda expresar preferentemente el ácido nucleico en brotes. Un ejemplo de un promotor como este es un promotor que tiene un perfil de expresión comparable con el promotor de beta expansina [sic] . Se debe aclarar que la aplicación de la presente invención no se limita a la ciclina D3 representada por la SEQ ID NO: 1, ni la aplicabilidad de la invención se limita al uso del promotor beta-expansina en los métodos de la invención.

El ácido nucleico que codifica una cicliria D3 se puede obtener de cualquier origen. El ácido nucleico/gen que codifica una ciclina D3 se puede separar de una fuente microbiana, como hongos o levaduras, o de una planta, algas o de origen animal (incluido el humano) . Este ácido nucleico puede ser modificado de su forma natural en composición y/o un entorno genómico mediante la manipulación humana premeditada. El ácido nucleico preferentemente es un ácido nucleico homólogo, es decir, un ácido nucleico obtenido de una planta, bien sea de la misma especie de planta en la que se va a introducir o de una especie de planta diferente. El ácido nucleico puede ser obtenido de una especie dicotiledónea, preferentemente de la familia Brassicaceae, además preferentemente de Arabidopsis thaliana . Más preferentemente, la ciclina D3 separada de Arabidopsis thalíana es una ciclina tipo D3, como una ciclina D3;l, ciclina D3;2 ó una ciclina D3;3. Más preferentemente, la ciclina D3 es ciclina D3;3 de Arabidopsis thaliana, particularmente la secuencia del ácido nucleico 'como se representa por la SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos correspondiente como se representa por la SEQ ID NO: 2.

La secuencia representada por SEQ ID NO: 1 muestra una ciclina D3;3 de Arabidopsis thaliana, con SEQ ID NO: 2 como la secuencia de aminoácidos correspondiente. Ventajosamente, la aflicción de la presente invención no se limita al uso de una ciclina D3;3 de Arabidopsis como se representa por la SEQ ID NO: 1. Los métodos de conformidad con la presente invención también se practican utilizando variantes funcionales de un ácido nucleico que codifique ciclina D3 o con las variantes funcionales del polipéptido codificado. Especialmente útiles en los métodos de la invención son las variantes funcionales del ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 1 o las variantes funcionales del aminoácido representada por la SEQ ID NO: 2.

El término "variante funcional" como se define en la presente es una ciclina D3 que conserva la habilidad para unirse y activar una CDK de plantas (ver por ejemplo Healy y col., 2001, J. Biol. Chem., 276 (10): 7041-7047)). Las variantes funcionales en las mayorías de los casos también complementarán los mutantes de levadura deficientes de los CLN (el término para las ciclinas tipo D en levadura), ver por ejemplo, Swaminathan y col. (2000, Plant Phys 124: 1658-1667), particularmente la página 1663. La variante funcional es una ciclina D3 en el sentido que es una secuencia de aminoácidos que, cuando se utiliza en la construcción de una ciclina o árbol filogenético de ciclina D, como el representado en la Figura 1, entra en un grupo que incluye las ciclinas D3 (y no otras ciclinas tipo D, como la ciclina Di, D2 , D4, D5, D6 y D7) . La referencia en la presente a un ácido nucleico que codifica una ciclina D3 es a un ácido nucleico que codifica un aminoácido de ciclina D3 como ya se definió. Además, la variante funcional puede contener uno o más, y preferentemente todo lo siguiente: (i) una caja de ciclina; (ii) un motivo LxCxE con de los primeros 40 o más aminoácidos (lo cual es característico de la mayoría de las ciclinas D) ; y (iii) una o más y preferentemente todas las regiones conservadas identificadas por las cajas que se muestran en la Figura 2 (como se muestra en la Figura 2, en las cajas se permite un desacoplamiento) . Además, una persona experta en la técnica también puede determinar fácilmente si una ciclina D3 particular es variante funcional (en el sentido de si puede mejorar el rendimiento de la planta) al sustituir simplemente la secuencia descrita en la sección Ejemplos siguiente con la variante que se va a probar en cuanto a su función.

El ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos de la variante funcional conveniente útiles para practicar el método de acuerdo con la invención incluyen: (i) Porciones de un ácido nucleico que codifica ciclina D3 preferentemente una parte de un ácido nucleico que codifica ciclina D3 como se representa por la secuencia SEQ ID NO: 1; (ii) Variantes de empalme alternativas de un ácido nucleico que codifica ciclina D3, preferentemente una variante de empalme alternativa de un ácido nucleico que codifica ciclina D3 como se representa por la SEQ ID NO : 1 ; (iii) Variantes alélicas de un ácido nucleico que codifica ciclina D3, preferentemente una variante alélica de un ácido nucleico que codifica ciclina D3 como se representa por la secuencia de la SEQ ID NO: 1; y homólogos, derivados y fragmentos activos de una secuencia de aminoácidos de ciclina D3, preferentemente una ciclina D3 como se representa por la secuencia de la SEQ ID NO: 2.

Será evidente para un experto en la técnica que el uso de la secuencia de DNA que codifica ciclina D3 de longitud completa no será una condición para llevar a cabo los métodos de acuerdo con la invención. Los métodos de acuerdo con la invención pueden practicarse ventajosamente utilizando porciones funcionales de un DNA/ácido nucleico que codifique ciclina D3, particularmente una parte funcional de un ácido nucleico que codifique ciclina D3 como se representa por la SEQ ID NO: 1. Una parte se refiere a un pedazo de DNA obtenido de una molécula de DNA original (más grande) . Una parte se puede preparar, por ejemplo, haciendo una o más deleciones a, por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico de SEQ ID NO: 1, utilizando las técnicas bien conocidas en la materia.

Por tanto, de acuerdo con la invención, se proporciona un método para mejorar el rendimiento de las plantas, que consiste en introducir en una planta una porción funcional de un ácido nucleico como se representa por la SEQ ID NO: 1, cuya parte funcional está bajo el control de un promotor que pueda expresar preferentemente la porción funcional en los brotes.

Otra variante funcional útil en los métodos de la invención es una variante de empalme alternativa de un ácido nucleico que codifica ciclina D3 como se representa por la secuencia de SEQ ID NO: 1. El término "variante de empalme alternativa" cuando se utiliza en la presente comprende las variantes de una secuencia de ácido nucleico en las que se han escindido, sustituido o adicionado intrones y/o exones seleccionados. Estas variantes serán aquellas en las que no se afecte la actividad biológica de la proteína, las cuales pueden ser obtenidas reteniendo a elección segmentos funcionales de la proteína. Estas variantes de empalme se pueden encontrar en la naturaleza o se pueden sintetizar. Los métodos para preparar estas variantes de empalme son bien conocidos en la materia.

Por tanto, la invención también propone un método para mejorar el rendimiento en las plantas, el cual consiste en introducir en una planta una variante de empalme alternativa de un ácido nucleico que codifica ciclina D3, particularmente, una variante de empalme alternativa de un ácido nucleico que codifica ciclina D3 como se representa por la SEQ ID NO: 1 cuya variante de empalme alternativa esté bajo el control de un promotor que pueda expresar preferentemente la variante de empalme en los brotes.

Otra variante útil en los métodos de la invención es una variante alélica de un ácido nucleico que codifica ciclina D3 particularmente una variante alélica de un ácido nucleico que codifica ciclina D3 según se representa por la secuencia de SEQ ID NO: 1. Las variantes alélicas existen en la naturaleza y comprendido dentro de los métodos de la presente invención es el uso de estos alelos naturales. Las variantes alélicas comprenden Polimorfismos de un Solo Nucleótido (los SNP) , así como Polimorfismos por Inserción/Deleción Pequeña (los INDEL) . El tamaño de los INDEL normalmente es menor de 100 pb. Los SNP y los INDEL forman una serie más grande de variantes de secuencias en cepas polimórficas naturales de la mayoría de los organismos.

Por tanto, la invención también proporciona un método para mejorar el rendimiento en las plantas, el cual consiste en introducir en una planta una variante alélica de un ácido nucleico que codifica ciclina D3, particularmente, una variante alélica de un ácido nucleico que codifica ciclina D3 como se representa por la SEQ ID NO: 1 cuya variante alélica está bajo el control de un promotor que pueda expresar preferentemente la variante alélica en los brotes.

Como una ventaja más, los métodos de acuerdo con la invención también se pueden practicar utilizando homólogos, derivados o fragmentos activos de una ciclina D3 preferentemente utilizando homólogos, derivados o fragmentos activos de una ciclina D3 como se representa por la SEQ ID NO': 2. Los ácidos nucleicos que codifican los homólogos, derivados o fragmentos activos de un aminoácido, como puede ser el representado por la SEQ ID NO: 2 , se pueden detectar fácilmente utilizando técnicas de rutina bien conocidas para los expertos en la materia.

"Homólogo" de una proteína comprende los péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que tengan sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con la proteína no modificada pertinente y que tienen actividad biológica y funcional semejante a la proteína no modificada de la cual estos proceden. Para producir estos homólogos, los aminoácidos de la proteína pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan propiedades semejantes (por ejemplo hidrofobicidad, hidrofilicidad, antigenícidad, tendencia a formar o romper estructuras a-helicoidales o estructuras en forma de lámina ß) . Las tablas de la sustitución conservativa son bien conocidas en la técnica (ver, por ejemplo Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company) .

Los homólogos útiles en el método de conformidad con la invención son aquellos que entran en la definición de una variante funcional, es decir, que tienen la habilidad para unirse y activar una CDK de las plantas y que son una ciclina D3, como" ya se definió. Además, los homólogos pueden ser caracterizados en términos de tener un orden de preferencia incrementado de por lo menos 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de identidad de las secuencias con la secuencia de aminoácidos como se representa por la SEQ ID NO: 2 (ver Figura 3 que muestra que las ciclinas D3 tienen un bajo porcentaje de identidad entre sí pero no obstante el 30% de identidad con la SEQ ID NO: 2 es suficiente para identificar otras ciclinas D3) . Además, el homólogo puede contener uno o más y preferentemente todo lo siguiente: (i) una caja de ciclina; (ii) un motivo LxCxE con de los primeros 40 o más aminoácidos (lo cual es característico de la mayoría de las ciclinas D) ; y (iii) una o más y preferentemente todas las regiones conservadas identificadas por las cajas que se muestran en la Figura 2 (como se muestra en la Figura 2, en las cajas se permite un desacoplamiento) .

También comprendidas por el término "homólogos" están dos formas especiales de homología, las cuales incluyen las secuencias ortólogas y secuencias parálogas que comprenden conceptos evolutivos que se utilizan para describir relaciones ancestrales de los genes. El término "parálogo" se refiere a duplicaciones génicas dentro del genoma de una especie que da origen a genes parálogos. El término "ortólogos" se refiere a los genes homólogos en diferentes organismos debido a una relación ancestral.

Los ortólogos en, por ejemplo, especies de plantas monocotiledóneas se pueden encontrar fácilmente haciendo una búsqueda que se conoce como búsqueda blast recíproca. Esto se puede hacer mediante una primera herramienta que consiste en buscar la secuencia en cuestión (por ejemplo, la SEQ ID NO: 1 ó la SEQ ID NO: 2) contra cualquier base de datos de secuencias, como puede ser la base de datos del NCBl disponible para el público la cual se puede encontrar en: http://www.ncbi.nlm.nih.gov. Si se buscaran ortólogos del arroz, la secuencia en cuestión sería buscada contra, por ejemplo, los 28,469 clones de cDNA de longitud completa de Oryza sativa Nipponbare disponible en el NCBI. Es posible utilizar la base de datos Blasón cuando se comienza de nucleótidos o TBLASTX cuando se comienza de la proteína, con valores predeterminados normales (expectativa 10, alineación 50) . Es posible filtrar los resultados de BLAST. Las secuencias de longitud completa de los resultados filtrados o de los resultados no filtrados entonces se regresan a la herramienta BLAST (segunda búsqueda) contra la secuencia que interesa (SEQ ID NO: 1 ó 2) . Los resultados de la primera y segunda búsquedas en BLAST entonces se comparan. En el caso de familias grandes, se utiliza ClustaW seguido por un árbol de unión de los alrededores para ayudar a visualizar el agrupamiento.

Un homólogo puede estar en forma de una "variante por sustitución" de una proteína, es decir, donde por lo menos un residuo en una secuencia de aminoácidos ha sido retirado y se ha insertado un residuo diferente en su lugar. Las sustituciones de aminoácidos normalmente son de residuos individuales, pero se pueden agrupar dependiendo de las restricciones funcionales que se imponen en el polipéptido; las inserciones normalmente serán del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos de aminoácidos, y las deleciones abarcarán desde cerca de 1 a 20 residuos. Preferentemente, las sustituciones de aminoácidos comprenden sustituciones conservativas de aminoácidos .

Un homólogo también puede estar en la forma de una "variante por inserción" de una proteína, es decir, donde uno o más residuos de aminoácidos se introducen en un lugar predeterminado de una proteína. Las inserciones pueden consistir en fusiones amino terminales y/o carboxilo terminales así como inserciones intrasecuencias de un solo o múltiples aminoácidos. En general, las inserciones dentro de la secuencia de aminoácidos serán más pequeñas que las fusiones amino o carboxilo terminales, del orden de aproximadamente 1 a 10 residuos. Los ejemplos de las proteínas de fusión o péptidos amino o carboxilo terminales incluyen el dominio de unión o el dominio de activación de un activador de la transcripción como se utiliza en el sistema de levadura con dos tipos de híbridos, las proteínas de la capa del fago, la (histidina) 6-etiqueta, la glutation-S-trasnferasa-etiqueta, proteína A, proteína de unión a maltosa, dihidrofolato reductasa, el epítope Tag-100, el epítope c-myc, el epítope FLAG©, lacZ, CMP (péptido de unión a calmodulina) , el epítope HA, el epítope de la proteína C y el epítope VSV.

Los homólogos en la forma de "variantes por deleción" de una proteína se caracterizan por la eliminación de uno o más aminoácidos de una proteína.

Las variantes de aminoácidos de una proteína puede prepararse fácilmente utilizando las técnicas de síntesis de péptidos bien conocidas en la materia, como pueden ser las síntesis de péptidos en fase sólida y similares, o por manipulaciones del DNA recombinante. Los métodos para a manipulación de las secuencias de DNA para producir variantes por sustitución, inserción o deleción de una proteína son bien conocidos en la materia. Por ejemplo, las técnicas para preparar mutaciones por sustitución en lugares predeterminados del DNA son bien conocidas por los expertos en la materia e incluyen mutagenesia M13, mutagenesia T7-Gen in vitro (USB, Cleveland, OH) , mutagenesia dirigida al sitio QuickChange (Stratagene, San Diego, CA) , mutagenesia dirigida al sitio, teniendo como intermediaria la PCR u otros protocolos de mutagenesia dirigidas al sitio.

Los "derivados" incluyen péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden comprender las sustituciones, deleciones o adiciones de residuos de aminoácidos como se encuentran en la naturaleza o que no se encuentran en la naturaleza, en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma natural de la proteína, por ejemplo, como se presenta en la SEQ ID NO: 2. "Derivados" de una proteína comprende los péptidos, oligopéptidos, polipéptidos, proteínas y enzimas que pueden contener residuos de aminoácidos que en forma natural pueden ser alterados, glucosilados, acilados o que no se encuentran en forma natural en comparación con la secuencia de aminoácidos de una forma natural del polipéptido. Un derivado también puede contener uno o más sustituyentes no aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de la cual se obtiene, por ejemplo, una molécula indicadora u otro ligando, unidos en forma covalente o no covalente a la secuencia de aminoácidos, como puede ser una molécula indicadora que se une para facilitar su detección, y residuos de aminoácidos que no se encuentran en el estado natural en relación con la secuencia de aminoácidos de una proteína natural .

"Fragmentos activos" de una proteína ciclina D3 comprende por lo menos cinco residuos de aminoácidos contiguos de una proteína, cuyos residuos conservan la actividad biológica y/o funcional semejante a la proteína natural. En cualquier caso, los "homólogos, derivados y fragmentos activos" son aquellos que entran en la definición de "variante funcional" como se define en lo anterior.

Los métodos para la búsqueda e identificación de los homólogos de la ciclina D3 están dentro de las habilidades de una persona experta en la materia. Los métodos para la alineación de las secuencias para la comparación también son conocidos en la materia, tales métodos incluyen GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, ALIGN X (de vector NTI) y TFASTA. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 443-453, 1970) para encontrar la alineación de dos secuencias completas que lleven al máximo la cantidad de apareamiento y lleve al mínimo el número de huecos . El algoritmo BLAST calcula el porcentaje de identidad de las secuencias y realiza un análisis estadístico de la similitud entre las dos secuencias. El software para hacer el análisis BLAST está a la disposición al público a través del National Centre for Biotechnology Information (Centro Nacional de Información de Biotecnología) . Los homólogos convenientes para utilizarlos en los métodos de la invención, es decir, aquellos que tengan por lo menos 30% de identidad de las secuencias respecto a la secuencia de aminoácidos representada por la SEQ ID NO: 2, pueden ser identificados tomando las secuencias de la proteína ciclina D3 de longitud completa y utilizando un generador de matrices de similitud/identidad, como puede ser MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) el cual calcula la similitud e identidad entre cada par de secuencias en una serie de datos determinados sin necesitar la prealineación de los datos. El programa realiza una serie de alineaciones por pares utilizando el algoritmo de alienación global de Myers y Miller (con una sanción por apertura de espacios de 12 y una sanción por extensión de espacios de 2) . Luego calcula la similitud e identidad utilizando, por ejemplo, Blosum 60 como matriz de puntuación, y luego coloca los resultados en una matriz de distancia.

Por tanto, la invención también propone un método para mejorar el rendimiento de una planta, el cual consiste en introducir en una planta un ácido nucleico que codifique un homólogo, derivado o fragmento activo de una ciclina D3, como puede ser un homólogo, derivado o fragmento activo como se representa por la SEQ ID NO: 2 cuyo homólogo, derivado o fragmento activo está bajo el control de un promotor que pueda expresar preferentemente el ácido nucleico en los brotes.

La invención también propone las construcciones y vectores genéticos para facilitar la introducción y/o expresión de las secuencias de nucleótidos útiles en los métodos de acuerdo con la invención.

Por tanto, se proporciona una construcción génica que contiene: (i) un ácido nucleico que codifica ciclina D3 o variante funcional de éste, preferentemente un ácido nucleico que codifica ciclina D3 como se representa por la SEQ ID NO: 1 ó una variante funcional de éste (como ya se definió) cuyo ácido nucleico codifica un polípéptido" ciclina D3 o variante funcional de éste, preferentemente un polipéptido ciclina D3 como se representa por la SEQ ID NO: 2 o una variante funcional de éste; (ii) un promotor capaz de expresar preferentemente el ácido nucleico de (i) en los brotes, particularmente en la zona de expansión celular de brotes vegetativos (sobre la superficie) ; y como una opción (iii) una secuencia de terminación de la transcripción .

Las construcciones útiles en los métodos de acuerdo con la presente invención pueden ser construidas utilizando la tecnología del DNA recombinante bien conocida para los expertos en la materia. Las construcciones génicas pueden ser insertadas en vectores, los cuales pueden estar a la disposición en el comercio, convenientes para la transformación en plantas y adecuados para la expresión del gen que interesa en las células transformadas.

Las plantas se transforman con un vector que contenga la secuencia que interesa (es decir, un ácido nucleico que codifica una ciclina D3 o una variante funcional de éste (como se define en lo anterior) , por ejemplo un ácido nucleico que codifica ciclina D3 como se representa por la SEQ ID NO: l o una variante funcional de éste (como ya se definió) ) . La secuencia que interesa se liga de manera operante a un promotor que pueda expresar preferentemente la secuencia que interesa en los brotes. Los términos "elemento regulador", "secuencia control" y "promotor" todas se utilizan de manera indistinta en la presente y deben tomarse en un contexto amplio para referirse a las secuencias de ácido nucleico reguladoras capaces de efectuar la expresión de las secuencias a las cuales se ligan. Comprendidas por los términos antes mencionados están las secuencias reguladoras de la transcripción obtenidas de un gen genómico eucariótico clásico (incluida la caja TATA que se necesita para la iniciación de la transcripción exacta, con o sin una secuencia de la caja CCAAT) y elementos reguladores adicionales (es decir, secuencias activadoras corriente arriba, potenciadores y silenciadores) que alteren la expresión génica en respuesta al desarrollo y/o estímulos externos, o en una forma específica de un tejido. Asimismo incluida' dentro del término está una secuencia reguladora de la transcripción de un gen procariótico clásico, en cuyo caso puede incluir una secuencia de caja -35 y/o secuencias reguladoras de la transcripción de la caja -10. El término "elemento regulador" también comprende una molécula de fusión sintética o derivado que confiere, activa o intensifica la expresión de una molécula de ácido nucleico en una célula, tejido u órgano. El término "ligado de manera operante" cuando se utiliza en la presente se refiere a un enlace funcional entre la secuencia promotora y el gen que interesa, de modo que la secuencia promotora pueda indicar la transcripción del gen que interesa.

El ácido nucleico que codifica una ciclina D3 o una variante funcional de éste, como puede ser un ácido nucleico que codifica ciclina D3 como se representa por la SEQ ID NO: l o una variante funcional de éste, se liga de manera operante a un promotor capaz de expresar preferentemente el ácido nucleico en los "brotes. Preferentemente, el promotor que puede expresar preferentemente el ácido nucleico en los brotes~ tiene un perfil de expresión comparable con un promotor beta-expansina, por ejemplo, como se muestra en la Figura 5. Una persona experta en la técnica podrá identificar fácilmente los promotores que tienen un perfil de expresión comparable con un promotor beta-expansina utilizando técnicas de rutina. Más específicamente, el promotor que puede expresar preferentemente el ácido nucleico en los brotes es un promotor que puede dirigir la expresión en la zona de expansión celular en un brote, particularmente en los brotes vegetativos (sobre la superficie) . Más preferentemente, el promotor que puede expresar preferentemente el ácido nucleico en los brotes es el promotor beta-expansina (SEQ ID NO: 3) .

Como una opción también es posible utilizar una o más secuencias terminadoras en la construcción que se puede introducir en una planta. El término "terminador" comprende una secuencia control que es una secuencia de DNA en el extremo de una unidad de transcripción que señala el procesamiento 3' y la poliadenilación de un transcrito primario y la terminación de la transcripción. Los elementos reguladores adicionales pueden incluir potenciadores de la transcripción así como de la traducción. Los expertos en la materia tendrán conocimiento de las secuencias terminadoras y potenciadoras que pueden ser convenientes para utilizarlas en la práctica de la invención. Estas secuencias serán conocidas o pueden ser obtenidas fácilmente por un experto en la materia.

Las construcciones genéticas de la invención además pueden incluir una secuencia origen de replicación que se necesita para el mantenimiento y/o la replicación o reproducción en un tipo específico de célula. Un ejemplo es cuando es necesario mantener una construcción genética en una célula bacteriana como un elemento genético episomal (por ejemplo molécula plásmido o cósmido) . Los orígenes de replicación preferidos pueden ser, pero no se limitan a, el fl-ori y colEl.

La construcción genética puede opcionalmente contener un gen marcador selectivo. Cuando se utiliza en la presente el término "gen marcador selectivo" incluye cualquier gen que confiere un fenotipo en una célula en la que se expresa para facilitar la identificación y/o selección de las células las cuales son transfectadas o transformadas con una construcción de ácido nucleico de la invención. Los marcadores adecuados pueden ser seleccionados de los marcadores que confieren resistencia a antibióticos o herbicidas que inducen un nuevo rasgo metabólico o que permiten la selección visual. Los ejemplos de los genes marcadores selectivos pueden ser los genes que confieren resistencia a los antibióticos (como nptll que fosforila neomicina y canamicina, ó hpt higromicina fosforilante) , a herbicidas (por ejemplo, bar que proporciona resistencia a Basta; aroA ó gox que proporcionan resistencia contra glifosato) , o genes que proporcionen un rasgo metabólico (como el manA que permite a las plantas utilizar mañosa como única fuente de carbono) . Los genes marcadores visuales permiten la formación de color (por ejemplo ß-glucuronidasa, GUS) , luminiscencia (como luciferasa) o fluorescencia (proteína fluorescente verde, GFP, y sus derivados) .

La presente invención también comprende plantas que pueden obtenerse por los métodos de acuerdo con la invención. La presente invención, por tanto, proporciona las plantas que pueden obtenerse por el método de conformidad con la presente invención, cuyas plantas contienen el ácido nucleico que codifica una ciclina D3 o variante funcional de éste ligado de manera operante a un promotor que puede expresar preferentemente el ácido nucleico en los brotes.

La invención también proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen mejor rendimiento, el cual consiste en la introducción en una planta de un ácido nucleico que codifica ciclina D3 o una variante funcional de éste, particularmente un ácido nucleico que codifica ciclina D3 como se representa por SEQ ID NO: 1 o una variante funcional de éste (como se define en lo anterior) , cuyo ácido nucleico se liga de manera operante a un promotor que pueda expresar preferentemente el ácido nucleico en los brotes.

Más específicamente, la presente invención proporciona un método para la producción de plantas transgénicas que tienen mejores rendimientos, en relación con las plantas tipo nativas correspondientes, cuyo método consiste en: (i) introducir en una planta o una célula de planta un ácido nucleico que codifique ciclina D3 o una variante funcional de éste, preferentemente un ácido nucleico que codifique ciclina D3 como se representa por la SEQ ID NO: 1, o una variante funcional de éste, cuyo ácido nucleico o variante funcional de éste codifica un polipéptido ciclina D3 o variante funcional de éste, cuyo polipéptido preferentemente es como se representa por la SEQ ID NO: 2 o es una variante funcional de éste y cuyo ácido nucleico o variante funcional de éste está bajo el control de un promotor que puede expresar preferentemente el ácido nucleico en los brotes, particularmente en la zona de expresión de las células de brotes vegetatibos (sobre la superficie) ; (ii) cultivar la célula de la planta en las condiciones que favorezcan la regeneración y crecimiento de la planta madura.

El ácido nucleico o variante funcional puede ser introducido directamente en una célula de planta o en la propia planta (incluida la introducción en un tejido, órgano o cualquier otra parte de una planta) . De acuerdo con una característica preferida de la presente invención, el ácido nucleico preferentemente se introduce en una planta por transformación.

El término "introducir en una planta" se refiere principalmente a la transformación de una planta con el ácido nucleico específico que interese (un ácido nucleico que codifique ciclina D3 o una variante funcional de éste) , sin embargo, el término también se refiere a otros métodos que den como resultado la introducción en una planta del ácido nucleico específico que interese, como pueden ser las técnicas de reproducción o mejoramiento. Las técnicas de reproducción o mejoramiento son bien conocidas para los expertos en la materia.

El término "transformación" cuando se menciona en la presente comprende la transferencia de un polinucleótido exógeno en una célula hospedera, independientemente del método que se utilice para la transferencia. El tejido de la planta capaz de realizar la propagación clonal subsecuente, bien sea por organogenesia o embriogenesia, puede ser transformado con una construcción genética de la presente invención y se puede regenerar una planta completa a partir de éste. El tejido particular elegido variará dependiendo de los sistemas de propagación clonal disponibles y más adecuados para las especies específicas que se transformen. Los ejemplos de las dianas de tejidos incluyen los discos de las hojas, polen, embriones, cotiledones, hipocótilos, mega gametofitos', tejido calloso, tejido meristemático existente (por ejemplo meristemo apical, yemas auxiliares y meristemos de raíz) , y tejido meristemo inducido (por ejemplo meristemo cotiledón y meristemo hipocótilo) . El polinucleótido puede ser introducido de manera transitoria o estable en una célula hospedera y puede mantenerse no integrado, por ejemplo, como un plásmido. En otra versión, éste puede ser integrado en el genoma hospedero. La célula de la planta transformada resultante entonces se puede utilizar para regenerar una planta transformada en una forma conocida para los expertos en la materia.

La transformación de las especies de plantas ahora es una técnica prácticamente de rutina. Como una ventaja, cualquiera de los diferentes métodos de transformación se puede utilizar para introducir el gen que interesa en una célula progenitora conveniente. Los métodos de transformación incluyen el uso de liposomas, electroporación, sustancias químicas que aumentan la captación del DNA libre, inyección de DNA directamente en la planta, bombardeo con pistola de partículas, la transformación utilizando virus o polen y microproyección. Los métodos pueden ser elegidos a partir del método de calcio/polietilen glicol para protoplastos (Krens, F. A. y col., 1882, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. y col., junio de 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373); electroporación para los protoplastos (Shillito R. D. y col., 1985 Bio/Technol 3, 1099-1102); microinyección en material de plantas (Crossway A. y col., 1986, Mol. Gen Genet 202, 179-185); bombardeo de partículas recubiertas con DNA o RNA (Klein T. M. y col., 1987, Nature 327, 70) infección con (no para integración) virus y similares. Las plantas de arroz transgénico que expresan un ácido nucleico que codifica ciclina D3 o una variante funcional de éste se producen preferentemente a través de transformación mediada por Agrobacterium utilizando cualquiera de los métodos bien conocidos para la transformación del arroz, como se describe en cualquiera de lo siguiente: la solicitud de Patente Europea Publicada EP 1198985A1, Aldemita and Hodges (Planta, 199, 612-617, 1996); Chan y col. (Plant Mol. Biol. 22 (3) 491-506, 1993), Hiei y col. Plant J. 6 (2) 271-282, 1994), cuyas descripciones se incorporan como referencia en la presente en su totalidad. En el caso de la transformación del maíz, el método preferido es como se describe en Ishida y col. (Nat. Biotechnol. 1996 Jun; 14 (6): 745-50) o Frame y col. (Plant Physio. 2002 Mayo; 129(1): 13-22), cuyas descripciones se incorporan para referencia en la presente en su totalidad.

Por lo regular después de la transformación se seleccionan células o agrupamientos de células de las plantas por la presencia de uno o más marcadores que son codificados por los genes que se pueden expresar en las plantas, co-transferidos con el gen que interesa, luego de lo cual se regenera el material transformado en una planta completa.

Luego de la transferencia y regeneración del DNA es posible evaluar las plantas putativas transformadas, por ejemplo utilizando el análisis Southern, para la presencia del gen que interesa, la cantidad de copias y/o la organización genómica. Además o de otro modo, es posible analizar los niveles de expresión del DNA recién introducido utilizando el análisis Northern y/o Western, ambas técnicas son bien conocidas para los expertos en la materia.

Las plantas transformadas, obtenidas pueden ser propagadas por diversos medios, como puede ser por propagación clonal o las técnicas de reproducción tradicionales. Por ejemplo, una primera generación (o TI) de planta transformada puede ser reproducida para obtener transformantes homocigoto de segunda generación (o T2) , y las plantas T2 además pueden ser propagadas por las técnicas de reproducción tradicionales.

Los organismos transformados, obtenidos, pueden tener diversas formas. Por ejemplo, pueden ser quimeras o híbridos de células transformadas y células no transformadas; los transformantes clónales (por " ejemplo, todas las células transformadas para que contengan el cásete de expresión); insertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, en plantas, un material de raíz transformado injertado en una yema no transformada) .

Los métodos de conformidad con la invención también se pueden practicar sin introducir un ácido nucleico que codifique una ciclina D3 o variante funcional de éste en una planta. Esto se puede lograr introduciendo una modificación genética (preferentemente en el locus de un gen que codifique ciclina D3, para permitir la expresión del gen preferentemente en los brotes) . El locus de un gen como se define en la presente se toma para entender una región genómica, la cual incluye el gen que interesa y 10 KB corriente arriba o abajo de la región codificante.

La modificación genética se puede introducir, por ejemplo, mediante uno (o más) de los siguientes métodos: activación TDNA, TILLING, mutagenesia, recombinación homologa o, como ya se discutió en lo anterior, introduciendo y expresando en una planta (célula) un ácido nucleico que codifique una ciclina D3 o una variante funcional de éste, estando el ácido nucleico bajo el control de un promotor que pueda expresar preferentemente ese ácido nucleico en los brotes.

El etiquetado de la activación de T-DNA (Hayashi y col. Science (1992) 1350-1353) consiste en la inserción de T-DNA que contiene normalmente un promotor (también puede ser un potenciador de la traducción o un intrón) , en la región genómica del gen que interesa o 10 KB corriente arriba o debajo de la región codificante de un gen en una configuración tal que el promotor dirige la expresión del gen elegido. Normalmente la regulación de la expresión del gen elegido por su promotor natural se rompe y el gen cae bajo el control del promotor recién introducido. El promotor normalmente se incrusta en un T-DNA. Este T-DNA se inserta aleatoriamente en el genoma de la planta, por ejemplo, por infección de Agrobacterium y da origen a la sobreexpresión de los genes cerca del T-DNA insertado. Las plantas transgénicas resultantes muestran fenotipos dominantes por la sobreexpresión de los genes cercanos al promotor introducido. Para obtener el rendimiento mejorado, el promotor que va a ser introducido puede ser cualquier promotor que pueda expresar preferentemente en los brotes.

La modificación genética también se puede introducir en el locus de un ácido nucleicoVgen que codifica una ciclina D3 utilizando la técnica de TILLING (Targeted Induced Local Lesions IN Genomes) . Esta es una técnica de mutagenesia útil para obtener y/o identificar, y finalmente separar variantes sometidos a mutagenesia de un ácido nucleico que codifica ciclina D3 con la habilidad de presentar actividad biológica de ciclina D3. El procedimiento TILLING también permite la selección de plantas portadoras de estas variantes por mutación. Estas variantes por mutación pueden incluso presentar mayor actividad ciclina D3 de la presentada por el gen en su forma natural. El proceso TILLING combina mutagenesia de alta densidad con métodos de tamizaje de alto rendimiento. Los pasos normalmente seguidos en el proceso TILLING son: (a) mutagenesia EMS (Redei y Koncz, 1992; Feldmann y col., 1994; Lightner y Caspar, 1998); (b) preparación del DNA y combinación de los individuos; (c) amplificación por PCR de una región que interese; (d) desnaturalización y apareamiento para permitir la formación de heteroduplex; (e) DHPLC, donde se detecta la presencia de un heteroduplex en una combinación como un pico adicional en el cromatograma; (f) la identificación de individuos mutantes; y (g) la secuenciación de un producto de la PCR mutante. Los métodos para el procedimiento TILLING son bien conocidos en la técnica (McCallum Nat Biotechnol. Abril de 2000; 18(4): 455-7, revisado por Stemple 2004 (TILLING-a high-throughput harvest for functional genomics. Nat Rev Genet. Feb 2004; 5(2): 145-50.)) Se puede utilizar la mutagenesia para generar variantes de ácidos nucleicos que codifican ciclina D3. Los métodos para generar variantes por mutación son bien conocidos en la técnica.

La activación TDNA, el procedimiento TILLING y la mutagenesia dirigida al sitio son ejemplos de técnicas que permiten la obtención de alelos novedosos y variantes de ciclina D3.

La recombinación homologa permite la introducción en un genoma de un ácido nucleico seleccionado en una posición elegida, definida. La recombinación homologa es una técnica normalizada que se utiliza habitualmente en ciencias biológicas para organismos inferiores como levaduras y el musgo fiscomitrela. Los métodos para la recombinación homologa en plantas han sido descritos no solo para plantas modelo (Offringa y col., Extrachromosomal homologous recombination and gene targeting in plant cells alter Agrobacterium-mediated transformation. 1990 EMBO J. 1990 Oct; 9(10): 3077-84) sino también para plantas de cultivo, por ejemplo arroz (Terada R, Urawa H, Inagaki Y, Tsugane K, lida S.

Efficient gene targeting by homologous recombination in rice. Nat. Biotechnol. 2002 lida y Terada: A tale of two integrations, transgene and T-DNA: gene targeting by homologous recombination in rice. Curr. Opin Biotechnol. Abril 2004; 15(2): 132-8). El ácido nucleico que va a ser elegido (puede ser un ácido nucleico que codifica ciclina D3 o una variante de éste como se describe en lo anterior) no necesita ser elegido para el locus de un gen que codifica ciclina D3, sino puede ser introducido, por ejemplo, en regiones de alta expresión. El ácido nucleico que va a ser elegido puede ser un alelo mejorado que se utilice para sustituir el gen endógeno o puede ser introducido además del gen endógeno.

La presente invención se amplía evidentemente a cualquier célula de planta o plantas producida por cualquiera de los métodos descritos en la presente, y a todas las partes de las plantas y propágulos de éstas. La presente invención además comprende la progenie de una célula, tejido, órgano o toda la planta primarios, transformados o transfectados que hayan sido producidos por cualquiera de los métodos antes mencionados, siendo el único requisito que la progenie presente las misma (s) característica (s) genotípica (s) y/o fenotípica (s) que las producidas en el precursor por los métodos de acuerdo con la invención. La invención también incluye células hospederas que contengan una molécula de ácido nucleico separada que codifique una ciclina D3 ligado de manera operante a un promotor que pueda expresar el ácido nucleico en los brotes. Las células hospederas preferidas de acuerdo con la invención son células de plantas . La invención también se extiende a las partes cosechables de una planta, como pueden ser, pero no se limitan a, semillas, hojas, frutos, flores, cultivos de tallos, rizomas, tubérculos y bulbos.

La presente invención también comprende el uso de ácidos nucleicos que codifican las ciclinas D3 y el uso de los polipéptidos de ciclina D3.

Un uso de estos desde luego se refiere al uso de un ácido nucleico que codifica ciclina D3, ligado de manera operante a un promotor que pueda expresar preferentemente el ácido nucleico en los brotes, para el mejoramiento del rendimiento de las plantas, en particular en el mejoramiento del área sobre la superficie, el incremento en el número total de semillas, el incremento en el número total de semillas (contenidas), el aumento en el peso de las semillas y el aumento en el índice de cosecha, entre otros. El ácido nucleico que codifica ciclina D3 o una variante funcional de éste son como se define en lo anterior. Se prefiere un ácido nucleico como se representa por la SEQ ID NO: l o una variante funcional de éste como se define en lo anterior.

Los ácidos nucleicos que codifican las ciclinas D3 ,y los polipéptidos de ciclina D3 también pueden encontrar uso en los programas de mejoramiento. La ciclina D3 puede ser un ácido nucleico como se representa por la SEQ ID NO: l o una variante funcional de éste como se define en lo anterior; o la ciclina D3 puede ser un aminoácido representado por la SEQ ID NO: 2 o una variante funcional de éste como se define en lo anterior. Por ejemplo, el ácido nucleico que codifica ciclina D3 o una parte de éste puede ser en un cromosoma (o una parte de éste) , preferentemente junto con uno o más miembros de la familia relacionados. En un ejemplo de un programa de mejoramiento como éste, se identifica un marcador DNA que se pueda ligar genéticamente con un ácido nucleico que codifique una proteína ciclina D3 en una planta, cuyo gen puede ser un gen que codifique la propia proteína ciclina D3 o cualquier otro gen que pueda afectar directa o indirectamente la expresión de un gen que codifique una proteína ciclina D3 y/o la actividad de la propia proteína ciclina D3. Este DNA marcador entonces se puede utilizar en los programas de mejoramiento para seleccionar plantas que tengan mejor rendimiento en relación con las plantas nativas equivalentes.

También es posible utilizar variantes alélicas de una ciclina D3 en los programas de mejoramiento convencionales, como en el mejoramiento asistido con marcadores. Estos programas de mejoramiento muchas veces necesitan la introducción de variantes alélicas en las plantas por el tratamiento mutagénico de una planta. Un método mutagéníco adecuado es la mutagenesia EMS. La identificación de las variantes alélicas entonces se lleva a cabo, por ejemplo, por PCR. Esta es seguida por un paso de selección para elegir variantes alélicas superiores de la secuencia que interesa y las cuales den mejor rendimiento en una planta en relación con las plantas tipo nativas correspondientes. La selección normalmente se lleva a cabo supervisando el rendimiento de las plantas que contienen las diferentes variantes alélicas de la secuencia que interesa, por ejemplo, diferentes variantes alélicas de la SEQ ID NO: 1. La supevisión del rendimiento se puede hacer en un invernadero o en el campo. Otros pasos optativos pueden ser cruzar las plantas, en las cuales se identificó la variante alélica superior, con otra planta. Esto podría utilizarse, por ejemplo, para hacer una combinación de características fenotípicas interesantes.

Los ácidos nucleicos que codifican las ciclinas D3 y los polipéptidos de ciclina D3 también pueden encontrar uso como reguladores del crecimiento. La ciclina D3 puede ser un ácido nucleico representado por la SEQ ID NO: 1, o una variante funcional de éste como se define en lo anterior; o la ciclina D3 puede ser un aminoácido como se representa en la SEQ ID NO: 2 o una variante funcional de éste como se define en lo anterior. Puesto que estas ciclinas D3 son útiles para el mejoramiento del rendimiento de las plantas, las ciclinas D3 también serían útiles reguladores del crecimiento, como herbicidas o estimuladores del crecimiento. La presente invención, por tanto, propone una composición que contiene una ciclina D3, junto con un portador conveniente, diluyente o excipiente, que se puede utilizar como regulador de crecimiento.

Los métodos de conformidad con la presente invención dan como resultado plantas que tienen rendimiento mejorado, como se describe en lo anterior. Estos efectos ventajosos también se pueden combinar con otras características ventajosas desde el punto de vista económico, como puede ser otros rasgos mejoradores del rendimiento, tolerancia a diferentes agresiones, rasgos que modifiquen las diferentes características arquitectónicas y/o características bioquímicas y/o fisiológicas.

Descripción de las figuras La presente invención ahora se describirá haciendo referencia a las siguientes figuras, en las cuales: La Figura 1 es una alineación múltiple preparada utilizando ClustalW y valores predeterminados, seguido por el cálculo del árbol de distancia promedio. Se muestra el agrupamiento de ciclina D3.

La Figura 2 es una alineación de las secuencias conocidas de la proteína ciclina D3. Las secuencias fueron alineadas utilizado el programa AlignX del paquete Vector NTI (InforMax, Bethesda, MD) . La alineación múltiple se hizo con una sanción de apertura de espacios de 10 y una extensión de espacios de 0.01. También se llevó a cabo corrección manual menor cuando fue necesario para mejorar la posición de algunas regiones conservadas. La línea que se muestra indica la separación de las ciclinas D3 de otras ciclinas D. En el recuadro están algunos motivos específicos de las ciclinas D3.

La Figura 3 es una matriz de similitud/identidad preparada utilizando MatGAT (Matrix Global Alignment Tool) que calcula la identidad y similitud entre cada par de secuencias en una serie de datos determinada sin necesitar de alineación previa de los datos. El programa realiza una serie de alineaciones por pares utilizando el algoritmo de alineación global de Myers y Miller (con una sanción de apertura de espacios de 12 y una sanción de extensión de espacios de 2) . Luego calcula la similitud e identidad utilizando, por ejemplo Blosum 60 como matriz de puntuación, y luego coloca los resultados en una matriz de distancia. La similitud de las secuencias se muestra en la parte baja de la línea divisora y la identidad de la secuencia se muestra en la parte alta de la línea divisora. La secuencia de SEQ ID NO: 2 está indicada como número 5 en la matriz. Las secuencias que tienen por lo menos 30% de identidad de las secuencias con la secuencia de SEQ ID NO: 2 comprenden las ciclinas D3.

La Figura 4 es un vector binario para la expresión en Oryza sa tiva del gen cyclinD3 : 3 de Arabidopsis thaliana bajo el control del promotor beta-expansina.

La Figura 5 muestra fotografías de la expresión GUS accionada por un promotor beta-expansina. La fotografía de la "planta C" es de un GUS de una planta de arroz teñida cuando había llegado a un tamaño de aproximadamente 5 cm. La fotografía de la "planta B" es de un GUS de una planta de arroz teñida cuando había llegado a un tamaño de aproximadamente 10 cm. Los promotores con perfiles de expresión comparables también pueden ser útiles en los métodos de la invención.

La Figura 6 detalla los ejemplos de las secuencias útiles en la práctica de los métodos de acuerdo con la presente invención.

Ejemplos La presente invención ahora será descrita haciendo referencia a los siguientes ejemplos, los cuales son solo para demostración.

Manipulación del DNA: a menos que se indique de otro modo, las técnicas de DNA recombinantes se efectúan de acuerdo con los protocolos normalizados descritos en Sambrook (2001) Molecular Cloning: a laboratory manual, 3a Edición Cold Spring Harbor Laboratory Press, CSH, Nueva York) o en los Volúmenes 1 y 2 de Ausubel et al. (1994), Current Protocols in Molecular Biology, Current Protocols. Los materiales normalizados y los métodos para el trabajo molecular en plantas molecular están descritos en Plant Molecular Biology Labfase (1993) por R. D. D. Croy, publicad por BIOS Scientific Publications Ltd (RU) y Blackwell Scientific Publications (RU) .

Ejemplo 1 : Clona.ción génica Se amplificó por PCR el gen cyclin D3;3 (referencia interna CDS0018) de Arabidopsis utilizando como modelo una biblioteca de cDNA de plántulas de Arabidopsis thaliana (Invitrogen, Paisley, RU) . Después de a transcripción inversa del RNA extraído de las plántulas, los cDNAs fueron clonados en pCMV Sport 6.0. El tamaño promedio de los insertos del banco fue de 1.5 kb, y la cantidad original de clones fue de 1.59 x 107 ufe. El título original se determinó de 9.6 x 105 ufc/mL, después de la primera amplificación de 6 x 1011 ufc/mL. Después de la extracción de los plásmidos, 200 ng de modelo fueron utilizados en una mezcla de 50 µL de PCR. Para la amplificación por PCR se utilizaron cebadores prm2676 (codón de inicio, efector en negritas, sitio AttBl en itálicas: 5' GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCACA ATGGAACAGCCGAAGAAAG 3') y el prm3677 (codón de terminación, complementario, inverso en negritas, sitio AttB2 en itálicas: 5' GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT CCTATAGGAACTCGAGATCAAGTT 3'), los cuales incluyen los sitios AttB para la recombinación Gateway. Se hizo la PCR utilizando Hifi Taq DNA polimerasa en condiciones normales. El fragmento de la PCR de 1256 pb fue amplificad y purificado también utilizando los métodos normalizados. Luego se hizo el primer paso del procedimiento Gateway, la reacción BP, durante el cual el fragmento de la PCR se recombina in vivo con el plásmido pDONR201 para producir, de acuerdo con la terminología Gateway, un "clon de entrada", p0443. El plásmido pDONR201 fue adquirido a Invitrogen, como parte de la técnica Gateway®.

Ejemplo 2: Construcción del vector El clon de entrada p0443 posteriormente se utilizó en una reacción LR con p3169, un vector destino utilizado para la transformación de Oryza sativa . Este vector contenía dentro de los límites de T-DNA: un marcador selectivo de plantas; un marcador que podía ser filtrado; y un cásete Gateway propuesto para la recombinación LR in vivo con la secuencia que interesa ya clonada en el clon de entrada. Un promotor beta-expansina para la expresión en la zona de expansión de los brotes vegetativos (por encima de la superficie) se ubica corriente arriba de este cásete Gateway.

Después del paso de recombinación LR, el vector de expresión resultante como se muestra en la Figura 4 se transformó en la cepa LBA4404 de Agrobacterium y posteriormente en plantas Oryza sativa . Las plantas de arroz transformadas se dejaron crecer y luego fueron examinadas en cuanto a los parámetros descritos en el Ej emplo 3.

Ejemplo 3: Evaluación y resultados Se obtuvieron aproximadamente 15 a 20 transformantes de arroz TO independientes. Los transformantes primarios fueron transferidos de las cámaras de cultivo de tejidos a un invernadero para el crecimiento y cosecha de la semilla TI. Se conservaron tres productos, de los cuales la progenie T? segregó 3:1 para presencia/ausencia del transgen. Para cada uno de estos productos, aproximadamente 10 plántulas TI que contenían el transgen (hetero y homocigotos) y aproximadamente 10 plántulas TI carentes del transgen (nulicigotos) , fueron elegidos para supervisar la expresión visual del marcador. Los mejores episodios de TI fueron además evaluados en la generación de T2 siguiendo el mismo procedimiento que para la generación de TI, pero con más individuos por evento.

Análisis estadístico: prueba t y prueba F Se utilizó el programa ANOVA (análisis de variantes) factor 2 como modelo estadístico para la evaluación total de las características fenotípicas de las plantas. Se llevó a cabo una prueba F en todos los parámetros medidos de todas las plantas de todos los productos transformados con el gen de la presente invención. La prueba F se llevó a cabo para comprobar un efecto del gen sobre todos los productos de la transformación y para verificar un efecto general del gen, también conocido como un efecto génico global. El umbral para la significación de un efecto génico global real se estableció en un nivel de probabilidad de 5% para la prueba F. Un valor de la prueba F significativo señala un efecto génico, entendiéndose que no solo es la presencia o posición del gen el que está causando las diferencias en el fenotipo. 3. 1 Mediciones del crecimiento vegetativo: Las plantas TI seleccionadas (aproximadamente 10 con el transgen y aproximadamente 10 sin el transgen) fueron transferidas a un invernadero. Cada planta recibió una etiqueta de código de barras única para vincular de manera inequívoca los datos del fenotipo con la planta correspondiente. Las plantas TI elegidas fueron crecidas en tierra en macetas de 10 cm de diámetro con las siguientes condiciones ambientales. Fotoperiodo = 11.5 h, intensidad de la luz diurna = 30,000 lux o más, temperatura durante el día = 28 °C o mayor, temperatura durante la noche = 22°C, humedad relativa = 60-70%. Las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes fueron crecidos lado a lado en posiciones aleatorias. Desde la etapa de siembra hasta la etapa de madurez cada planta fue pasada varias veces a través de una cámara digital para procesamiento de imágenes y se tomó la imagen. En cada punto de tiempo las imágenes digitales (2048 x 1536 píxeles, 16 millones de colores) se tomaron de cada planta desde por lo menos 6 ángulos diferentes. Los parámetros que se describen más adelante fueron obtenidos en una forma automatizada de todas las imágenes digitales de todas las plantas, utilizando un software de análisis de imágenes. 3.1.1 Área de la planta sobre la superficie Se determinó de área de la planta sobre la superficie contando la cantidad total de píxeles de las partes de la planta sobre la superficie con discriminación del fondo. Este valor fue promediado para las imágenes tomadas en el mismo punto de tiempo, desde diferentes ángulos y se convirtió en un valor físico de la superficie expresado en mm2 por calibración. Los experimentos muestran que el área de la planta sobre la superficie medida de esta forma se correlaciona con la biomasa de las partes de la planta sobre el suelo. Los resultados de la evaluación para T2 se muestran en la Tabla 1 siguiente. Se muestra el porcentaje de la diferencia entre las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes. El valor p de la prueba F fue significativo en la evaluación de TI y T2, indicando un efecto total de la presencia del transgen en el área sobre el suelo.

Tabla 2: Área sobre la superficie del suelo 3.2 Mediciones de los parámetros relacionados con las semillas Las panículas primarias maduras fueron cosechadas, se metieron en bolsas, se etiquetaron con código de barras y luego se secaron durante tres días en el horno a 37°C. Las panículas fueron luego trilladas y todas las semillas fueron recolectadas y contadas. Las cascarillas que contenían semillas fueron separadas de las vacías utilizando un dispositivo soplador de aire. Las cascarillas vacías fueron desechadas y la fracción restante fue contada otra vez. Las cascarillas que contenían semillas fueron pesadas en una balanza analítica. Este procedimiento dio como "resultado la determinación de los parámetros relacionados con las semillas que se describen más adelante. 3.2.1 Cantidad total de semillas Cantidad total de semillas por planta: se midió contando la cantidad de cascarillas cosechadas de una planta. Los resultados de las evaluaciones de TI y T2 se muestran en la Tabla 2 siguiente. Se muestra el porcentaje de la diferencia entre las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes. El valor p de la prueba F fue significativo en la evaluación de TI y T2, indicando que la presencia del transgen tiene un efecto significativo en la cantidad total de semillas producidas .

Tabla 3 Cantidad total de semillas 3.2.2 Cantidad de semillas contenidas en las cascarillas La cantidad de semillas contenidas en las cascarillas se determinó contando la cantidad de semillas con contenido que quedaban después del paso de separación. Los resultados de las evaluaciones de TI y T2 se muestran en la Tabla 3 siguiente. Se muestra el porcentaje de la diferencia entre las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes. El valor p de la prueba F fue significativo en las evaluaciones de TI y T2, indicando que la presencia del transgen aumenta significativamente la cantidad de semillas contenidas, producidas .

Tabla 3 Cantidad de semillas contenidas 3.2.3 Peso total de las semillas Se midió el rendimiento total de las semillas pesando todas las cascarillas contenidas cosechadas de una planta. Los resultados de las evaluaciones de TI y T2 se muestran en la Tabla 4 siguiente. Se muestra el porcentaje de la diferencia entre las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes. El valor p de la prueba F fue significativo para las evaluaciones de Ti y T2, indicando que la presencia del transgen aumenta significativamente el peso de las semillas.

Tabla 5 Peso total de las semillas 3.2.4 índice de cosecha de las plantas El índice de cosecha en la presente invención se define como la relación entre el rendimiento total de las semillas y el área sobre la superficie del suelo (mm ) , multiplicado por un factor de 106. Los resultados de las evaluaciones de TI y T2 se muestran en la Tabla 5 siguiente. Se muestra el porcentaje de la diferencia entre las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes. El valor p de la prueba F fue significativo para la evaluación de Ti y T2, indicando que la presencia del transgen aumenta significativamente el índice de cosecha.

Tabla 6 índice de cosecha Ejemplo 4 : Datos comparativos pOleosin: : cyclin D3; 3 Las plantas que contenían la construcción anterior fueron producidas y evaluadas utilizando los mismos procedimientos descritos en lo anterior para pBeta-expansin: : cyclin D3;3. Los resultados de las evaluaciones de TI se muestran en las Tablas 6 a 8 siguientes. En cada una de las tablas se muestra el porcentaje de la diferencia entre las plantas transgénicas y los nulicigotos correspondientes. También se muestra el valor p de la prueba F.

Tabla 7 Área sobre la superficie del suelo El valor p de la prueba F fue significativo indicando que la presencia del transgen impulsada por este promotor disminuye significativamente el área sobre la superficie del suelo.

Tabla 8 Peso total de las semillas Los resultados muestran que el peso total de las semillas de las plantas transgénicas fue menor que el peso total de las semillas de los nulicigotos correspondientes .

Tabla 9 Cantidad de semillas contenidas Los resultados muestran que la cantidad de semillas contenidas de las plantas transgénicas fue menor que la cantidad de semillas contenidas de los nulicigotos correspondientes .

Ejemplo 5: Expresión GUS impulsada por el promotor beta-expansina Se clonó el promotor beta-expansina en el plásmido de entrada pDONR201 del sistema Gateway TM (Life Technologies) utilizando la "reacción de recombinación BP". La identidad y la composición de los pares de bases de la inserción clonada se confirmó determinando la secuencia y además se probó el plásmido resultante mediante digestiones por restricción.

Para clonar el promotor en frente de un gen indicador, cada clon de entrada posteriormente se utilizó en una "reacción de recombinación LR" (Gateway TM) con un vector de destino. Este vector de destino fue diseñado para ligarse de manera operante al promotor del gen de beta-glucuronidasa (GUS) de Escherichia coli mediante la sustitución del cásete de recombinación Gateway en frente del gen de GUS. Los vectores indicadores resultantes, que contenían el promotor ligado de manera operante a GUS fueron posteriormente transformados en Agrobacterium cepa LBA4044 y posteriormente en plantas de arroz utilizando técnicas de transformación normalizadas.

Las plantas de arroz transgénicas fueron generadas de las células transformadas. El crecimiento de las plantas se hizo en condiciones normales.

Las plantas o partes de las plantas que iban a ser analizadas se cubrieron con acetona enfriada en hielo al 90% y se incubaron durante 30 min a 4°C. Después de tres lavados de 5 min con búfer Tris [15.76 g de Trizma HCl (Sigma T3253) + 2.922 g de NaCl en un litro de agua bidestilada, ajustado a pH 7.0 con NaOH], el material se cubrió con una solución Tris/ferricianato/X-Gluc [9.8 mL de búfer Tris + 0.2 mL de solución madre de ferricianato (0.33 g de ferricianato de potasio de Sigma P3667, y 10 mL de búfer Tris) + 0.2 mL de solución madre X-Gluc (26.1 mg de X-Gluc (Europa Bioproducts ML 113A) en 500 µL de DMSO) ] . Se aplicó infiltración en vacío durante 15 a 30 minutos. Las plantas o las partes de las plantas fueron incubadas hasta 16 horas a 37°C hasta que fue visible un color azul. Las muestras fueron lavadas tres veces durante 5 minutos con búfer Tris. Se extrajo la clorofila en series de etanol de 50%, 70% y 90% (cada una durante 30 minutos) .

Claims (23)

REIVINDICACIONES

1. Un método para mejorar el rendimiento de las plantas, el cual consiste en introducir en una planta un ácido nucleico que codifique una ciclina D3 bajo el control de un promotor que pueda expresar preferentemente el ácido nucleico en los brotes.

2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el rendimiento mejorado es el rendimiento de semillas aumentado.

3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el rendimiento mejorado es el área aumentada sobre la superficie del suelo.

4. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el rendimiento aumentado se selecciona del grupo que consiste en: (i) biomasa aumentada de las semillas; (ii) cantidad aumentada de las semillas (contenidas) ; (iii) tamaño aumentado de las semillas; (iv) volumen aumentado de las semillas; (v) índice de cosecha aumentado; y (vi) peso aumentado de mil granos (TKW) .

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica una ciclina D3 se obtiene de una planta.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que consiste en introducir en una planta un ácido nucleico que codifique una ciclina D3 o una variante funcional de éste, cuyo ácido nucleico o variante funcional de éste se selecciona de: (i) Porciones de un ácido nucleico que codifica ciclina D3; (ii) Variantes de empalme alternativas de un ácido nucleico que codifica ciclina D3; (iv) Variantes alélicas de un ácido nucleico codifica ciclina D3; y (v) Homólogos, derivados y fragmentos activos de un aminoácido de ciclina D3 en donde las variantes funcionales (i) a (iv) son capaces de unir y activar una CDK de plantas.

7. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el promotor que puede expresar preferentemente el ácido nucleico en los brotes tiene un perfil de expresión que se puede comparar con un promotor de beta-expansina.

Un método para la producción de una planta transgénica que tiene mejor rendimiento en relación con las plantas tipo nativas correspondientes, cuyo método consiste en: (i) introducir en una planta o una célula de planta un ácido nucleico que codifique ciclina D3 o una variante de éste, preferentemente un ácido nucleico que codifica ciclina D3 como se representa por la SEQ ID NO: l o una variante funcional de éste, cuyo ácido nucleico o variante funcional de éste codifica un polipéptido de ciclina D3 o variante funcional de éste, cuyo polipéptido preferentemente es como se representa por la SEQ ID NO: 2 o es una variante funcional de éste y cuyo ácido nucleico o variante funcional de éste se liga de manera operante a un promotor que puede preferentemente expresar el ácido nucleico en brotes, particularmente en la zona de expansión de las células de brotes vegetativos (sobre la superficie del suelo) ; (ii) cultivar la célula de la planta en condiciones que favorezcan la regeneración y el crecimiento de una planta madura.

9. El método de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el rendimiento mejorado es rendimiento aumentado de las semillas.

10. El método de conformidad con la reivindicación 8 ó 9, caracterizado porque el rendimiento aumentado consiste en el área aumentada sobre la superficie del suelo y en donde el rendimiento aumentado de las semillas se selecciona de: (i) biomasa aumentada de las semillas; (ii) cantidad aumentada de las semillas (contenidas) ; (iii) tamaño aumentado de las semillas; (iv) volumen aumentado de las semillas; (v) índice de cosecha aumentado y (vi) peso aumentado de 1000 granos.

11. Un método para mejorar el rendimiento de las plantas, especialmente el rendimiento de las semillas, el cual consiste en introducir una modificación genética en una planta en el locus del gen que codifica un polipéptido de ciclina D3 o una variante funcional de éste para permitir la expresión del gen preferentemente en los brotes .

12. El método de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la modificación genética se efectúa mediante uno o más de los siguientes: mutagenesia, recombinación homologa, TILLING y activación de T-DNA.

13. Plantas que pueden obtenerse por un método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12.

14. Una construcción que contiene: (i) un ácido nucleico que codifica ciclina D3, o una variante funcional de éste, preferentemente un ácido nucleico que codifica ciclina D3 como se representa por la SEQ ID NO: l o una variante funcional de éste, cuyo ácido nucleico codifica un polipéptido de ciclina D3 o variante funcional de éste, preferentemente un polipéptido de ciclina D3 como se representa por la SEQ ID NO: 2 o es una variante funcional de éste; (ii) un promotor capaz de expresar preferentemente el ácido nucleico de (i) en los brotes, en particular en la zona de expansión de brotes vegetativos (sobre la superficie del suelo) ; y como una opción (iii) una secuencia terminadora de la transcripció .

15. La construcción de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el promotor tiene un perfil de expresión que se puede comparar con un promotor de beta-expansina.

16. Una planta transformada con una construcción de conformidad con la reivindicación 14 ó 15.

17. Una planta transgénica que tiene mejor rendimiento en relación con las plantas tipo nativas correspondientes, caracterizada porque la planta contiene un ácido nucleico que codifica una ciclina D3, o variante funcional de éste, bajo el control de un promotor que puede expresar preferentemente el ácido nucleico en los brotes.

18. La planta transgénica de conformidad con la reivindicación 13, 16 ó 17, caracterizada porque la planta es una planta monocotíledónea, como caña de azúcar y en donde la planta es un cereal, como arroz, maíz, trigo, cebada, mijo, centeno, sorgo o avenas.

19. Las plantas cosechables o una planta transgénica de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 16 a 18.

20. Las partes cosechables de conformidad con la reivindicación 19, caracterizadas porque las partes cosechables son las semillas.

21. El uso de un ácido nucleico que codifica ciclina D3, aislado, ligado de manera operante a un promotor capaz de expresar preferentemente el ácido nucleico en los brotes para el mejoramiento del rendimiento, en particular para aumentar el rendimiento de las semillas.

22. El uso de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el rendimiento de las semillas incluye cualquiera o más de lo siguiente: (i) biomasa aumentada de las semillas; (ii) cantidad aumentada de las semillas (contenidas) ; (iii) tamaño aumentado de las semillas; (iv) volumen aumentado de las semillas; (v) índice de cosecha aumentado y (vi) peso aumentado de 1000 granos.

23. El uso de conformidad con la reivindicación 21 ó 22, caracterizado porque el ácido nucleico que codifica ciclina D3 es un ácido nucleico como se representa por la SEQ ID NO: 1 o una variante funcional de éste, o en donde la ciclina D3 es un aminoácido como se representa por la SEQ ID NO: 2 o una variante funcional de éste.