CZ20013859A3 - Herbicidně rezistentní rostliny - Google Patents

Description

Oblast techniky

Vynález se týká rekombinantní DNA technologie, a zejména produkce transgenních rostlin, které vykazují významnou rezistenci nebo významnou toleranci vůči herbicidům v porovnání s netransgenními rostlinami. Vynález se kromě jiného dále týká nukleotidových sekvencí (a jejich expresních produktů), které se používají při produkci těchto transgenních rostlin nebo které jsou těmito transgenními rostlinami produkovány.

Dosavadní stav techniky

Rostliny, které jsou v podstatě „tolerantní vůči herbicidům, pokud jsou vystaveny jejich působení, poskytují dávkově-odezvovou křivku, která je v porovnání s křivkou, kterou poskytují stejným herbicidům vystavené netolerantní rostliny, posunuta směrem doprava. Tyto dávkovš/odezvové křivky mají na x-ose vynesenu „dávku a „procentické hubení, „herbicidní účinek atd. jsou vyneseny na y-ose. Tolerantní rostliny budou pro dosažení daného herbicidního účinku vyžadovat minimálně 2x vyšší množství herbicidu než netolerantní rostliny. Rostliny, které jsou v podstatě „rezistentní vůči herbicidu, vykazují po vystavení účinku herbicidu, který se aplikuje v koncentracích a režimu, které jsou v zemědělství běžně používány pro hubení plevelů na polích osetých komerčně využívanými plodinami, pouze malá, pokud vůbec nějaká, nekrotická, lytická, chlorotická nebo jiná poškození.

01-3037-01-Če

Zvláště výhodné je, pokud jsou rostliny v podstatě rezistentní nebo tolerantní vůči herbicidům (dále jen „glyfosát), které mají jako své místo účinku 5-enolpyruvylšikimatfosfátsyntetasu (dále jen „EPSPS), jejichž významným příkladem je N-fosfonomethylglycin (a různé jeho soli).

Herbicidy lze aplikovat buď preemergentne nebo postemergentně za použití běžných technik navržených pro aplikaci herbicidu na pole obsahující plodiny, které byly upraveny tak, že jsou rezistentní vůči herbicidu. Vynález kromě jiného poskytuje nukleotidové sekvence, které lze použít při výrobě těchto vůči herbicidům tolerantních nebo rezistentních rostlin.

Vynález tedy poskytuje izolovaný polynukleotid obsahující sekvenci označenou jako SEQ ID No. 33. Vynález rovněž poskytuje polynukleotid, vyjma cDNA kódující rýžovou a kukuřičnou EPSPS, který kóduje EPSPS a který je komplimentární s polynukleotidem, který pokud se inkubuje při teplotě 65 °C až 70 °C v 0,1 silném citrátem pufrovaném solném roztoku obsahujícím 0,1 % SDS a následně opláchne při stejné teplotě 0,1 silným citrátem pufrovaným solným roztokem obsahujícím 0,1 % SDS, ještě hybridizuje se sekvencí označenou jako SEQ ID No. 33. EPSPS kódující polynukleotid podle vynálezu lze nicméně získat screenováním rostlinných genomových DNA knihoven s nukleotidem tvořící intron v sekvenci SEQ ID No. 33 a vynález rovněž zahrnuje sekvenci získanou tímto screenováním.

Vynález rovněž zahrnuje izolovaný polynukleotid obsahující oblast kódující chloroplastový transitní peptid a glyfosátově rezistentní 5-enolpyruvylšikimátfosfátsynthasu (EPSPS) 3' tohoto peptidu, přičemž uvedená oblast

01-3037-01-Če •· ·· · ·« ·· · • · · · ·· · · · ··· • ·· · · * · · • · · · · · · · · « • · · · « ·»· ·*·· ·· ··· ·«·· ·· ··· je pod exprimační kontrolou rostlinného operativního promotoru, za předpokladu, že uvedený promotor není heterologní s uvedenou oblastí a chloroplastový transitní peptid není heterologní s uvedenou syntasou.

Výrazem „heterologní se rozumí, že pochází z různých zdrojů a odpovídajícím výrazem „neheterologní se rozumí, že jsou odvozeny ze stejného zdroje, ale spíše myšleno na úrovni genů a nikoliv na úrovni organismů nebo tkání. Například CaMV35S promotor je čistě heterologní s sekvenci kódující EPSPS petúnie, protože promotor je odvozen z viru a sekvence, jejíž expresi kontroluje, z rostliny. Výraz „heterologní použitý v rámci vynálezu má však ještě užší význam. Například výraz „heterologní, použitý v rámci vynálezu, znamená, že sekvence kódující EPSPS petúnie je „heterologní například s promotorem, který je rovněž odvozen z petúnie, a to jiné, než která kontroluje expresi EPSPS genu. V tomto smyslu je promotor odvozený z EPSPS genu petúnie, který se následně použije pro kontrolu exprese sekvence kódující EPSPS rovněž odvozené z petúnie, „neheterologní s uvedenou kódovací sekvencí. „Neheterologní však neznamená, že by promotor a kódovací sekvence musely být nezbytně získány z jednoho a téhož (původní nebo předek) polynukleotidu. Podobný výklad platí pro transitní peptidy. Například chloroplastový transitní peptid rubisco odvozený ze slunečnice je „heterologní s kódovací sekvencí EPSPS genu rovněž odvozeného ze slunečnice (stejné rostliny, tkáně nebo buňky). Sekvence kódující transitní peptid rubisco odvozená ze slunečnice je „neheterologní se sekvencí kódující enzym rubisco rovněž odvozený ze slunečnice a to i tehdy, pokud jsou úvodem pro obě sekvence různé polynukleotidy, které mohou být přítomny v různých buňkách, tkáních nebo rostlinách slunečnice.

01-3037-01-Če

• ·

Výhodná forma polynukleotidu obsahuje následující složky ve směru transkripce 5 -> 3':

(i) alespoň jeden zesilovač transkripce, kterým je zesilující oblast sousedící s transkripčním startem sekvence, proti směru transkripce,· ze které se získal zesilovač a jejíž zesilovač nepůsobí jako promotor v sekvenci, do které je endogenně zabudován, nebo nepůsobí jako promotor, pokud je heterologně přítomen jako část konstruktu;

(ii) promotor z rýžového EPSPS genu;

(iii) rýžová genomová sekvence, která kóduje rýžový EPSPS chloroplastový transitní peptid;

(iv) genomová sekvence, která kóduje rýžovou EPSPS;

(v) transkripční terminátor;

přičemž rýžová EPSPS kódující sekvence je modifikována tak, že první poloha je mutována tak, že zbytkem v této poloze je Ile a nikoliv Thr a druhá poloha je zmutována tak, že zbytkem v této poloze je Ser a nikoliv Pro, přičemž tyto mutace jsou zavedeny do EPSPS sekvencí, které obsahují následující konzervovanou oblast GNAGTAMRPLTAAV ve standardním typu enzymu, takže modifikovanou sekvenci lze číst jako GNABIAMRSLTAAV.

Zesilující oblast výhodně obsahuje sekvenci, jejíž 3'konec je tvořen alespoň 40 nukleotidy, které nejblíže sousedí s transkripčním startem sekvence, ze které je získán zesilovač, myšleno proti směru transkripce. U dalšího provedení polynukleotidu obsahuje zesilující oblast 3'koncová oblast, která je tvořena alespoň 60 nukleotidy nejblíže sousedícími se startem transkripce, myšleno proti směru transkripce, a u ještě dalšího provedení polynukleotidu obsahuje zesilující oblast sekvenci 3'konce

01-3037-01-Če

tvořenou alespoň 10 nukleotidy sousedícími s prvním nukleotidem TATA konce sekvence z níž byl získán zesilovač, myšleno proti směru transkripce.

Polynukleotid podle vynálezu může obsahovat dva nebo více transkripčních zesilovačů, které mohou být u výhodného provedení nukleotidu přítomny v tandemu.

s kodonem, transitního

U polynukleotidu podle vynálezu může být 3' konec zesilovače nebo prvního zesilovače, pokud je přítomno více než jeden zesilovač, tvořen 100 až 1000 nukleotidů sousedícími, myšleno proti směru transkripce, který odpovídá translačnímu startu EPSPS peptidu, nebo s prvním nukleotidem intronu v 5oblasti, která nepodlehla transkripci, v případě, že uvedená oblast obsahuje intron. U výhodnějšího provedení nukleotidu je 3konec zesilovače, nebo prvního zesilovače, tvořen 150 až 1000 nukleotidů sousedících, myšleno proti směru transkripce, s kodonem odpovídajícím translačnímu startu EPSPS transitního peptidu nebo s prvním nukleotidem intronu v 5oblasti, která nepodlehla translaci, a u ještě výhodnějšího provedení je 3konec zesilovače, nebo prvního zesilovače, tvořen 300 až 950 nukleotidy sousedícími, myšleno proti směru transkripce, s kodonem odpovídajícím translačnímu startu EPSPS transitního peptidu nebo s prvním nukleotidem intronu v 5'oblasti, která nepodlehla translaci. U ještě výhodnějšího provedení je 3'konec zesilovače, nebo prvního zesilovače, tvořen 770 až 790 nukleotidy sousedícími, myšleno proti směru transkripce, s kodonem odpovídajícím translačnímu startu EPSPS transitního peptidu nebo s prvním nukleotidem intronu v 5oblasti, která nepodlehla translaci.

01-3037-01-Če • · · 9 «94 • 4 4 · *444

9 9 9 9 ·

94 <99 9499 94

U alternativního polynukleotidu podle vynálezu se může 3'konec zesilovače, nebo prvního zesilovače nacházet mezi 300 až 380 nukleotidy sousedícími s kodonem odpovídajícím translačnímu startu EPSPS transitního peptidu nebo s prvním nukleotidem intronu v 5'oblasti, která nepodlehla translaci a u výhodného provedení tohoto alternativního polynukleotidu se 3'konec zesilovače, nebo prvního zesilovače nachází mezi 320 až 350 nukleotidy sousedícími, proti směru transkripce, s kodonem odpovídajícím translačnímu startu EPSPS transitního peptidu nebo s prvním nukleotidem intronu v 5'oblasti, která nepodlehla translaci.

U polypeptidu podle vynálezu může oblast sousedící s promotorem z rýžového EPSPS genu, proti směru transkripce, obsahovat alespoň jeden zesilovač odvozený ze sekvence, která sousedí, proti směru transkripce, s transkripčním startem promotoru ječmenného plastokyaninu nebo GOS 2.

Z výše uvedeného vyplývá, že polynukleotid může obsahovat ve směru 5' -> 3' první zesilovač obsahující transkripční zesilující oblast odvozenou ze sekvence, která sousedí, proti směru transkripce, s transkripčním startem ječmenného plastokyaninového promotoru; a druhý zesilovač obsahující transkripční zesilující oblast odvozenou ze sekvence, která sousedí, proti směru transkripce, s transkripčním startem GOS 2 promotoru.

Alternativně může polynukleotid obsahovat ve směru 5' 3' první zesilovač obsahující transkripční zesilující oblast odvozenou ze sekvence, která sousedí, proti směru transkripce, s transkripčním startem GOS 2 promotoru a druhý zesilovač obsahující transkripční zesilující oblast odvozenou ze sekvence, která sousedí, proti směru

01-3037-01-Če ·«

4· · · ·· * · • «4 · 444 4 · · 4 «

444 · 4 « 4 4

4 4 4 4 4444 4

444 44 444

4444 44 4444444 44 444 transkripce, s transkripčním startem ječmenného plastokyaninového promotoru.

Pokud jde o identitu a vzájemnou polohu různých zesilovačů přítomných v polynukleotidu, může být nukleotidy 5'kodonu, který tvoří translační start rýžového EPSPS chloroplastového transitního peptidu, výhodně Kozack. Odborník v daném oboru si je vědom toho, co se tím rozumí. Nicméně pro vyloučení jakéhokoliv mylného výkladu bude tento pojem objasněn v následujících příkladech.

Zvláště výhodná provedení polynukleotidu podle vynálezu mají oblast, která nepodlehla translaci a která obsahuje sekvenci fungující jako intron nacházející se v 5'konci rýžové genomové sekvence, která kóduje rýžový EPSPS chloroplastový transitní peptid. Oblast, která nepodlehla translaci, může zahrnovat sekvenci označenou jako SEQ ID No 40. Konkrétněji může oblast, která nepodlehla translaci, obsahovat kukuřičný ADHI intron a má sekvenci označenou jako SEQ ID No 40.

Polynukleotid podle vynálezů může obsahovat translační zesilovač, který je odvozen z viru a který se nachází v oblasti 5'konce rýžové genomové sekvence kódující rýžový EPSPS chloroplastový transitní peptid, která nepodlehla translaci. Odborník v daném oboru si je vědom identity takto vhodných translačních zesilovačů, jakými jsou například sekvence Omega a Omega prime odvozené z TMV, které jsou odvozeny z viru „tabacco etch a toho jak lze tyto translační zesilovače zavést do polynukleotidu, tak aby poskytly požadovaný výsledek.

Polynukleotid podle vynálezu může dále obsahovat oblasti kódující proteiny, které jsou schopny propůjčit

01-3037-01-Če • α ι ··« ·· rostlinnému materiálu obsahujícímu tento nukleotid alespoň jeden z následujících zemědělsky významných a žádaných charakteristických znaků: rezistenci proti hmyzu, houbám a plísním, virům, bakteriím, hlístům, stresu, vysychání a herbicidům. Tento polynukleotidu očekává, že genem poskytujícím rezistenci proti herbicidu bude jiný gen než EPSPS, například glyfosátoxid-oreduktasa (GOX), nicméně herbicidem může být jiný herbicid než glyfósát a v tomto případě lze geny, které propůjčují rezistenci, zvolit ze skupiny kódující následující proteiny: fosfinothricinacetyltransferasu (PAT), hydroxyfenylpyruvatdioxygenasu (HPPD), glutathion-S-transferasu (GST) , cytochrom P450, acetyl-COA karboxylasu (ACCasu), acetolaktátsynthasu (ALS), protoporfirinogenoxidasu (PPO), dihydropteorátsynthasu, polyaminové transportní proteiny, superoxiddismutasu (SOD), bromoxynilnitrilasu, fytoendesaturasu (PDS) , produkt tfcZA genu získaný z Alcaligenes eutrophus a známých mutovaných nebo jinak modifikovaných variant uvedených proteinů. V případě, že polynukleotid poskytuje vícenásobnou herbicidní rezistenci, lze herbicidy zvolit ze skupiny sestávající z dinitroanilinového herbicidu, triazolo-pyrimidinů, uracilu, fenylmočoviny, triketonu, isoxazolu, acetanilidu, oxadiazolu, triazinonu, sulfonanilidu, amidu, anilidu, RP201772, fluorochloridinonu, norflurazonu a herbicidu triazolinonového typu a postemergentní herbicid se zvolí ze skupiny sestávající z glyfosátu a jeho solí, glufosinatu, asulamu, bentazonu, bialaphosu, bromacilu, sethoxydimu nebo dalšího cyklohexandionu, dicamby, fosaminu, flupoxamu, feroxypropionátu, chizalofopu nebo dalšího aryloxyfenoxypropanoátu, picloramu, fluormetronu, atrazinu nebo dalšího triazinu, metribuzinu, chlorimuronu, chlorsulfuronu, flumetsulamu, halosulfuronu, sulfometronu, imazaquinu, imazethapyru, isoxabenu, imazamoxu, metosulamu,

01-3037-01-Če • · ♦ · ► « · 4 • ·· • 9 99 9 pyrithrobacu, rimsulfuronu, bensulfuronu, nicosulfuronu, fomesafenu, fluroglycofenu, KIH9201, ET751, carfentrazonu, ZA1296, sulcotrionu, paraquátu, diquátu, bromoxynilu a fenoxapropu.

V případě, že polynukleotid obsahuje sekvence kódující insekticidní proteiny, potom lze tyto proteiny zvolit ze skupiny sestávající z krystalických toxinů odvozených z Bt, včetně vylučovaných Bt toxinů; inhibitorů proteasy, lektinů, Xenhorabdus/Photorhabdus toxinů; geny propůjčující rezistenci proti houbám a plísním lze zvolit ze skupiny tvořené geny kódujícími známé AFPs, defensiny, chytanasu, glukanasu, Avr-Cf9. Zvláště výhodnými insekticidními proteiny jsou crylAc, crylAb, cry3A, Vip 1A, Vip 1B, inhibitory cysteinproteasy a lektin odvozený ze sněženky. V případě, že polynukleotid obsahuje geny poskytující rezistenci proti bakteriím, potom je lze zvolit ze skupiny sestávající z genů kódujících cekropiny a techyplesin a jejich analogy. Geny poskytující rezistenci proti virům lze zvolit ze skupiny sestávající z genů kódujících proteinové virového obalu, pohybové proteiny, virové replikace a protismyslné rybozimové sekvence, o kterých je známo, že poskytují rezistenci proti viru; zatímco geny poskytující odolnost proti nepříznivým podmínkám soli a suchu lze zvolit z genů kódujících glutathion-S-transferasu a peroxidasu, sekvence, která tvoří známou CBF1 regulační sekvenci, a genů, o nichž je známo, že zajišťují akumulaci trehalosy.

Tento polynukleotid podle vynálezu lze modifikovat a posílit tak expresi sekvencí kódujících tímto polynukleotidem tvořený protein tak, že se odstraní mRNA nestabilní motivy a/nebo oblasti nahodilého sestřihu, nebo lze kodony výhodné pro plodiny použít tak, aby exprese takto

01-3037-01-Če · * · · « 9 « ft · • *· · · * « · ♦ ··· · ··«· « • « · · · ««· ···· ·· ««t ···· M ««« modifikovaného polynukleotidu v rostlině poskytla v podstatě stejný protein mající v podstatě stejnou aktivitu/funkci jako protein získaný expresí nemodifikovaného polynukleotidu v organismu, ve kterém jsou oblasti nemodifikovaného polynukleotidu kódující protein endogenní. Stupeň identity mezi modifikovaným polynukleotidem a polynukleotidem endogenně obsaženým v uvedené rostlině a kódujícím v podstatě stejný protein může být takový, aby zabránil ko-supresi mezi modifikovanou a endogenní sekvencí. V tomto případě by měl být stupeň identity mezi zmiňovanými sekvencemi výhodně menší než přibližně 70 %.

Vynález ještě dále zahrnuje biologický nebo transformační vektor obsahující polynukleotid podle vynálezu. Výraz „vektor mimo jiné zahrnuje plasmid, virus, kosmid nebo bakterii transformované nebo transfektované tak, že obsahují uvedený polynukleotid.

Vynález dále zahrnuje rostlinný materiál transformovaný pomocí uvedeného polynukleotidu nebo vektoru a rovněž tento transformovaný rostlinný materiál, který je nebo byl dále transformován polynukleotidem obsahujícím oblasti kódující proteiny, které jsou schopny poskytnout rostlinnému materiálu alespoň jednu z následujících zemědělsky žádaných vlastností: odolnost proti hmyzu, houbám a plísním, virům, bakteriím, hlístům, stresu, vysychání a herbicidům.

Vynález se rovněž týká morfologicky normálních úrodných rostlin, které se regenerovaly z materiálu popsaného v bezprostředně předcházejícím odstavci, jejich semen a částí, přičemž dceřinné rostliny semena a jejich části obsahují polynukleotid nebo jejich vektor podle

01-3037-01-Če * · · 9 9 9 9 ·9 9 • »9 · 9 9* · · · 9 9 • 99 9 9 9 * 9

9 9 ·« « * « ♦··» «♦ ·** 9·9* *« «99 vynálezu, který je stabilně zabudován do- jejich genu a je dědičný mendelovským způsobem.

Vynález dále zahrnuje morfologicky normální plodiny, které obsahují polynukleotid podle vynálezu a které vznikly jako výsledek křížení rostlin, které se regenerovaly z materiálu transformovaného pomocí polynukleotidu nebo vektoru podle vynálezu, a rostlin, které se transformovaly pomocí polynukleotidu obsahujícího oblasti kódující proteiny, které jsou schopny poskytnout rostlinnému materiálu, ve kterém jsou obsaženy alespoň jednu z následujících zemědělsky žádaných vlastností: odolnost proti hmyzu, houbám a plísním, virům, bakteriím, hlístům, stresu, vysychání a herbicidům; dceřinných rostlin, semen těchto rostlin a jednotlivých částí těchto rostlin.

Rostliny podle vynálezu lze zvolit ze skupiny sestávající z polních plodin, ovoce a zeleniny, například řepky (canela), slunečnice, tabákovníku, cukrové řepy, bavlníku, kukuřice, pšenice, ječmene, rýže, čiroku, rajských jablíček, mango, broskev, jablka, hrušky, jahody, banánu, melounu, brambory, mrkve, salátu, kapusty, cibule, sóji, cukrové třtiny, hrachu, polní fazole, topolu, vinné révy, citrusu, vojtěšky, žita, ovsa,luční a krmné trávy, lnu, rostlin produkujících olejová semena a ořechů a stejně tak jejich semen a jednotlivých části.

Zvláště výhodnými rostlinami jsou kukuřice, sójové bobý, bavlna, cukrová řepa a řepka.

Vynález se dále týká způsobu selektivní kontroly plevelů na poli, kde se nacházejí různé druhy plevele a rostliny podle vynálezu nebo jejich herbicidně rezistentní semena, přičemž tento způsob zahrnuje aplikaci herbicidu

01-3037-01-Če glyfosátového typu na pole v množství dostatečném pro dosažení kontroly plevele bez toho, že by došlo k významnějšímu poškození rostlin. Podle tohoto způsobu lze na pole (a tedy i na rostliny, které se zde nacházejí) aplikovat před nebo po aplikaci glyfosátového herbicidu jeden nebo více herbicidů, insekticidů, fungicidů, nematocidů, bakteriocidů a antivirových přípravků.

Vynález dále poskytuje způsob produkce rostlin, které jsou v podstatě tolerantní nebo rezistentní vůči glyfosátovému herbicidu, přičemž tento způsob zahrnuje:

(i) transformaci rostlinného materiálu pomocí polynukleotidu nebo vektoru podle vynálezu;

(ii) výběr takto transformovaného materiálu; a (iii) regeneraci takto zvoleného materiálu do morfologicky normálních celých rostlin.

Tato transformace může zahrnovat zavedení polynukleotidu do uvedeného materiálu libovolným známým způsobem, ale zejména: (i) biolistickým bombardováním materiálu částicemi potaženými polynukleotidem; (ii) „impalement materiálu na vlákna z karbidu křemíku, která jsou potažena roztokem obsahujícím polynukleotid; nebo (iii) zavedením polynukleotidu nebo vektoru do Agrobacterium a kokultivací takto transformovaného Agrobacetrium s rostlinným materiálem, který se tímto transformuje a následně regeneruje. K transformaci výběru a regeneraci rostlin, které mohou příslušné rostlinné druhy vyžadovat, se používají v odborníkům v daném oboru známé techniky. Transformovaný rostlinný materiál lze vybrat na základě jeho rezistence proti glyfosátu.

Vynález dále poskytuje použití polynukleotidu nebo vektoru podle vynálezu při produkci rostlinných tkání

01-3037-01-Če · ·9 9 · * · 9 • · · · « » t « 9 « 9 • · · ·

9 9 9 · 99« *«·» «· 999 99·· 99 999 a/nebo morfologicky normálních celých rostlin, které jsou v podstatě tolerantní nebo rezistentní vůči glyfosátovému herbicidu.

Vynález ještě dále zahrnuje způsob výběru biologického materiálu transformovaného tak, že exprimuje požadovaný gen, přičemž transformovaný materiál obsahuje polynukleotid nebo vektoru podle vynálezu a výběr zahrnuje vystavení transformovaného materiálu účinkům glyfosátu nebo jeho solí a výběr materiálu, který přežil. Uvedený materiál může být rostlinného původu a může být odvozen z jednoděložných rostlin zvolených ze skupiny sestávající z ječmene, pšence, kukuřice, rýže, ovsa, žita, čiroku, ananasu, cukrové třtiny, banánu, cibule, chřestu a pórku.

Vynález dále zahrnuje způsob regenerace úrodné transformované rostliny, která bude obsahovat cizí DNA, přičemž tento způsob zahrnuje následující kroky:

(a) produkci regenerovatelné tkáně z rostliny, která má být transformovaná (b) transformaci regenerovatelné tkáně cizí DNA, přičemž cizí DNA obsahuje volitelnou DNA sekvenci, která působí v regenerovatelné tkáni jako výběrové zařízení;

(c) umístění regenerovatelné tkáně z kroku (b), 1 den až 60 dní po kroku (b) , do média, ve kterém je tkáň schopna produkovat semena, přičemž uvedené médium dále obsahuje sloučeninu používanou pro výběr regenerovatelné tkáně obsahující volitelnou DNA sekvenci, která umožní identifikovat nebo vybrat transformovanou regenerovanou tkáň;

(d) po vytvoření alespoň jednoho semene z vybrané tkáně z kroku (c) se toto semeno přemístí do

01-3037-01-Če • · ·· · · · ·* · ♦ · * φ * · ♦ · · · · · • ·· · · · * · • φ * · · φ ♦ · · · • « # · · · · · ··*· ·· ··· ·'·· 99 druhého média, které umožní zakořenění semene a růst rostlinky, přičemž druhé médium případně opět obsahuje sloučeninu použitou pro výběr regenerovatelné tkáně; a (e) růst uvedené rostlinky a získání transgenní rostliny, ve které se cizí DNA přenáší na dceřinné rostliny mendelovským způsobem, přičemž uvedený způsob je charakteristický tím, že cizí DNA je, nebo selektovatelná DNA sekvence obsahující cizí DNA obsahuje, polynukleotid podle některého z nároků 1 až 34 a zmíněnou sloučeninou je glyfošát nebo jeho sůl. Rostlinou může být jednoděložná rostlina a výhodněji se tato rostlina zvolí z banánu, pšenice, rýže, kukuřice a ječmene a uvedenou regenerovatelnou tkání může být embriogenní kalus, somatické embryo, nezralé embryo atd.

Vynález se stane zřejmějším po prostudování následujícího popisu, přiložených výkresů a sekvenčních listin.

Seznam sekvencí

SEQ ID No. 1-32 PCR primery.

SEQ ID No. 33 rýžová genomová EPSPS sekvence (z ATG).

SEQ.ID No. 34 rýžová genomová EPSPS sekvence obsahující dvojitou mutaci.

SEQ	ID	No.	35	GOS 2 zesilovač.
SEQ	ID	No.	36	BPC zesilovač
SEQ	ID	No.	37	rýžová genomová G1 EPSPS	(do ATG)
SEQ	ID	No.	38	rýžová genomová G3 EPSPS	(do ATG).

01-3037-01-Če

49 * 9 9 9 • 94 »49 9 9 9 • 49 · 9 9

«

9 «99

SEQ ID No. 39 rýžová genomová G2 EPSPS + kukuřičný Adhl intron

SEQ ID No. 40 kukuřičný Adhl intron

Stručný popis obrázků

Obr. 1 znázorňuje rýžovou EPSPS genomovou schematickou mapu ;

Obr. 2 znázorňuje vektor pCR4-OSEPSPS (rýžový dmEPSPS gen ve vektoru pCR-sestřih) ;

Obr. 3 schematicky znázorňuje strategii použitou při zavádění dvojité mutace;

Obr. 4 znázorňuje vektor pTCVIOOl;

Obr. 5 znázorňuje vektor pTCVIOOlOSEPSPS (obsahující rýžový dmEPSPS gen ve vektoru pTCBlOOl) ;

Obr. 6 znázorňuje vektor pTCVIOOlOSEPSPSAC (obsahující rýžový dmEPSPS gen ve vektoru pTCBlOOl);

Obr. 7 znázorňuje vektor pBluSK+EPSPS ((obsahující rýžový dmEPSPS gen ve vektoru pBluScriptSK+) ;

Obr. 8 znázorňuje vektor pPACl;

Obr. 9 znázorňuje vektor pTCVEPSPSPH;

Obr. 10 znázorňuje vektor pTCVEPSPSADH;

Obr. 11 znázorňuje vektor pBluSKEPSPSADH (obsahující rýžový dmEPSPS gen obsahující Adhl intron);

Obr.	12	znázorňuj e	vektor	pIGPD9;
Obr.	13	znázorňuje	vektor	Zen 8;
Obr.	14	znázorňuj e	vektor	Zen 19;
Obr.	15	znázorňuje	vektor	Zen 21;

Obr. 16 znázorňuje zavedení Zen vektoru do superbinárních vektorů.

01-3037-01-Ce «* ·· * 9 9 99 9 * ·· ♦ ·*· · « « 9 9

99 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9

9999 99 ··· 9999 99 999

Produkce rostlin tolerantních vůči glyfosátovému ošetření overexpresí mutované EPSPS pod kontrolou nehetero-logního promotoru.

Výraz „zesilovač, jak je použit v celé popisné části, označuje sekvence sousedící s promotorem, proti směru transkripce, které neobsahují promotor samotný, ale které zvyšují účinnost promotoru a regulují transkripci promotoru. Výraz „delece EPSPS promotoru, jak je použit v popisu vynálezu, se týká EPSPS promotor společně s nukleotidy tvořícími alespoň část EPSPS genů přirozeného zesilovače, t j. z EPSPS odvozených sekvencí sousedících s EPSPS promotorem proti směru transkripce (5').

Pokud jde o transformaci rostlinného materiálu, musí si odborník v daném oboru uvědomit, že ačkoliv jsou v následujících příkladech použity konkrétní typy cílového materiálu (například embriogenní buněčná suspenzní kultura nebo dediferenciační nezralá embrya), neomezuje se vynález pouze na tato konkrétní provedení a cílové materiály lze stejně jako použité metody zaměnit. Výraz „rostlinné buňky, jak je použit v popise vynálezu, zahrnuje izolované buňky včetně suspenzních kultur a rovněž buňky v nedotčené nebo částečně nedotčené tkání, jakou je například embryo, scutella, mikrospor, embryo odvozené z mikrosporu nebo somatické buňky rostlinných orgánů. I v tomto případě je třeba poznamenat, že ačkoliv se konkrétní příklady omezily na kukuřici, pšenici a rýži, lze vynález stejně tak aplikovat na libovolnou zemědělskou plodinu nebo okrasnou rostlinu, kterou lze transformovat za použití vhodných metod transformace rostlinné buňky.

01-3037-01-Če ·♦ ♦· · ·· ·· · ··*♦ ♦ · · · · · ·♦ • ·· ♦ · · · · ♦ · ♦ · · · · · · · ♦ ·· ·· · t ' ···· ·· *·· ···· ·· ·♦·

Běžné molekulární biologické metody se prováděly podle Sambrook a kol. (1989) „Molecular cloning: A laboratory Manual, 2.Ed., Cold Spring Harbour Lab.Press.

Příklady provedeni vynálezu

Příklad 1. Generování cDNA sondy pro rýžovou EPSPS

Část délky cDNA kódující rýžovou EPSPS se získala pomocí polymerasové řetězové reakce reverzní transkriptasy (RT-PCR). Celý řetězec RNA se izoloval ze 2 týdny starých rostlin rýže (Oryza sativa L.indice var. Koshihikari) za použití metody TRI-ZOL (Life Technelogies). Syntéza prvního řetězce cDNA se provedla za použití Superscript II reverzní transkriptasy (Life Technelogies) a 200 ng EPSPS degeneračního reverzního primeru 10 (SEQ ID NO.l) a 2 pg celého řetězce RNA podle dodaných protokolů. Syntéza druhého řetězce a cDNA amplifikace pomocí PCR se prováděla za použití EPSPS degeneračních primerů 10 a 4 (SEQ ID NO.2) a PCR zrn (Pharmacia) podle instrukcí výrobce. Všechny písmenné kódy jsou standardními zkratkami (Eur. J. Biochem. (1985) 150:15).

SEQ ID No.l

EPSPS degenerační reverzní 10 5' gcacargcigcaagigaraaigccatigccat 3

SEQ ID No.2

EPSPS degenerační klasický 4 s* gcwggaacwgcmatgcgiccrytiacigc 3'

Produkty se nakloňovaly do vektoru pCR2.1 (Invitrogen) za použití TA klonovacího kitu podle doporuční dodavatele. Plasmid se izoloval z vybraných kolonií a sekvence se analyzovala za použití způsobu, který zahrnuje počítačový

01-3037-01-Če průzkum homologie (BLAST), který potvrdil, že klonovaný RTPCR produkt vykazuje vysokou homologii se známými rostlinnými EPSPS sekvencemi.

Příklad 2. Izolace rýžové EPSPS genomové sekvence a klonování rýžového EPSPS genu

Oblast genomové DNA obsahující úplný rýžový EPSPS gen a 5'upstream oblast se izolovala z ÁEMBLSP6/T7 genomové knihovny sestavené z 5denních oslabených rýžových zrn (Oryza sativa L.Indica var. IR 36) (Clontech). lxlO⁶ jednotek tvořících plak (pfu) se screenevalo za použití ³²P-značené rýžové EPSPS cDNA sondy (příklad 1) a protokolů poskytnutých výrobcem. Pozitivní plaky se podrobily následujícím cyklům hybridizačního screenování, dokud se nezískala plaková čistota křížově hybridizujícího plaku. λ-DNA se připravila z fágově čisté zásobní suroviny metodou, kterou popsal Sambrook a kol., 1989. Získaná DNA se analyzovala pomocí restrikčního digestu a southernového přenesu, při kterých se jako sonda použila stejná ³²P-značená rýžová EPSPS DNA. Restrikční fragmenty této křížové hybridizace se zakončily sestřihem pomocí metody, jakou je například metoda „Perfectly Blunt (Nevagten) a nakloňovaly do vhodného vektoru, jakým je například pSTBlue(Novagen). DNA se následně sekvencovala za použití ABI 377A PRISM automatizovaného DNA sekvenceru. Obr. 1 schématicky znázorňuje rýžový EPSPS gen, ve kterém jsou některé z restrikčních míst značena.

3,86 kb Fragment rýžového EPSPS genu obsahující kódovací oblast, EPSPS promotor, část 5' upstream oblasti a terminátor se získal pomocí PCR. Oligonukleotidový primer OSGRA1 (SEQ ID No. 3) se použil ve spojení s OSEPSPS3

01-3037-01-Če

44 ♦ 4 4 • 44 • 4 • 4

4··· 44

44

4 4 4

(SEQ ID No.4) při amplifikaci požadované oblasti. OSEPSPS3 Obsahuje další Sac 1 a Srna 1 restrikční enzymatická místa, která usnadňují nakloňování genu během pozdějších stádií vektorové konstrukce. Schématické umístění těchto primerů je patrné z obr. 1.

SEQ ID No.3

OSSGRA1 5' ATT TCT TCT TCT tcc TCC CTT CTC CgC CTC 3'

SEQ ID No.4

OSEPSPS3

5'. gAg CTC CCC ggg CgA gTg TTg TTg TgT TCT gTC TAA Tg 3·

Velmi věrná Pfu polymerasa (Stratagene) se použila při provádění PCYR reakce s DNA získanou z λ přípravy (popsané výše) a použitou jako amplifikační templát. PCR produkt očekávané velikosti se nakloňoval do pCRblunt 4-TOPO (Invítrogen) a sekvencoval ve snaze ověřit jeho integritu.

Příklad 3. Mutace T na I a

P na S v rýžové

EPSPS

Mutace I a P do dvou bodových mutací. genomového EPSPS oligonukleotidových mutaci. Schématický použitých primerů je samostatné PCR reakce

S rýžové EPSPS se získala zavedením

Tyto mutace se zavedly do rýžového genu pomocí PCR za použití primerů obsahujících požadovanou diagram naznačující vazebná místa znázorněn na obr. 3. Provedly se dvě (obě za použití λ DNA jako templátu).

1) EcoRVEND (SEQ ID No.5) + OSMutBot (SEQ ID No.6)

2) OsMutTop (SEQ ID No.7) + SalEnd (SEQ ID No.8j

SEQ ID No.5

01-3037-01-Če

Ecorovend

SEQ ID No.6

OsMutBot

SEQ ID No.7

OsMutTop

SEQ ID No.8

5' GCTTACGAAGGTATGATATCCTCCTACATGTCAGGC 3'

5' GCAGTCACGGCTGCTGTCAATGATCGCATTGCAATTCCAGCGTTCC 3'

5' GGAACGCTGGAATTGCAATGCGATCATTGACAGCAGCCGTGACTGC 3'

Sal

5' GGTGGGCATTCAGTGCCAAGGAAACAGTCGACATCCGCACCAAGTTGTTTCAACC 3

Výsledné PCR produkty se spojily za použiti ekvimolárních koncentrací každého PCR produktu jako templátu se dvěma oligonukleotidy SalIEnd a EcoRVEnd v nové PCR reakci. Alikvotní podíl reakčního produktu se analyzoval elektroforézou na agarovém gelu a nakloňoval do pCR-Blunt II (Invitrogen). Plasmidová DNA se izolovala a následně detekovala ve snaze potvrdit úspěšné zabudování dvojité mutace.

DNA fragment obsahující dvojitou mutaci se zabudoval do rýžového EPSPS genomového klonu (obr. 1) následujícím způsobem. Klon obsahující dvojitý mutant se digeroval pomocí Eco RV a Sáli. Plasmid obsahující rýžový EPSPS DNA PCR produkt se digeroval podobným způsobem a Eco RV/SalI fragment obsahující dvojitý mutant se ligoval do rýžového EPSPS genu v pCR4Blunt-TOPO za použití standardních klonovacích metod popsaných v Sambrook a kol., 1989 a transformoval do kompetentní E. coli. Plasmid se isoloval z výsledných kolonií a sekvencoval s cílem potvrdit přítomnost dvojité mutace bez žádných dalších změn. Tento plasmid, tj. pCR4-OSEPSPS, je znázorněn na (obr. 2) Genomový rýžový EPSPS gen obsahující dvojitý mutant i

01-3037-01-Če

99		• 9		9	»»	99
• 9	9		9	9 9	• 9	9	9
9		99		9	9	9 9
•	9		9 9	9	9	9 9	9
9	9		9	9	9	9 9
9 9··		99				• 9

·«* (obr. 2) se excidoval z pCR4-Blunt-TOPO za použití Pst 1 a Net 1 a ligoval do vektoru pTCVlOOl (obr. 4), čímž se získal pTCVIOOlOSEPSPS (obr. 5), který se transformoval do E.coli za účelem amplifikace. Potom se restrikční fragment Pacl/Eco RV excidoval z λ DNA (obr. 1) a zavedl-· do pTCVIOOlOSEPSPS (obr. 5), čímž se generoval pTCVIOOlEPSPSPAC (obr. 6). Rýžový dmEPSPS, nyní obsahující sekvenci od Pac 1 do Sac 1 (obr. 6), se excidoval z pTCVIOOlEPSPSPAC (obr. 6 ) jako Eagl/Sacl fragment a ligoval do podobně digerovaného pBluescript SK+, čímž se získal pBluSK+EPSPS (obr. 7). Sestavily se další rýžové EPSPS upstream oblasti a požadované zesilovače (jak bude popsáno níže) a ty se ligovaly do pBluescript SK+ vektoru za použití Xbal/Pacl.

Příklad 4. Generování jednoduše zesílených fúzí rýžového EPSPS promotoru

Obr. 1 naznačuje vazebná místa primerů G1 a G2 použitých při generování řady delecí na 5'konci rýžového EPSPS genu. Primery G1 a G2 (SEQ ID No. 9 a SEQ ID No. 10) se použily v kombinaci s primerem RQCR 10 primer (SEQ ID No. 11), rýžovým EPSPS lambda DNA templátem a Pfu Turbo polymerasou (Stratagene) podle protokolů poskytnutých dodavatelem.

SEQ ID No.9

G1 5' CGCCTGCAGCTCGAGGTTGGTTGGTGAGAGTGAGACACC 3'

SEQ ID No.10

5' CGCCTGCAGCTCGAGGCCACACCAATCCAGCTGGTGTGG 3'

G2

01-3037-01-Če ·* · · ··

SEQ ID No.11 • ·· » W 9 4b

RQCR10

5'GAACCTCAGTTATATCTCATCG 3

Získané produkty se analyzovaly elektroforézou na agarovém gelu a klonovaly do pCR-Blunt II-TOPO vektoru (Invitrogen). Sekvence výsledných produktů se určila ve snaze ověřit, že v sekvenci rýžového genomového EPSPS klonu nedošlo k žádné změně. Klony pro vývoj se vybraly na základě jejich orientace ve vektoru určením toho, zda Xho I digeriace odstraní z vektoru pouze polylinkerovou sekvenci a ne celý insert, nebo nikoliv.

Sekvence ječmenového plastokyaninového a rýžového GOS2 genu a jejich přidružené 5'upstream oblasti jsou publikované v EMBL databázi (Z28347 resp. X51910). Primery se navrhly tak, aby amplifikovaly pouze upstream zesilující oblasti uvedených genů. Pomocí PCR a za použití primerů SEQ ID No. 12 a SEQ ID No. 13 ve spojení s Pfu Turbo polymerasou a ječmenovou genomovou DNA jako templátem se tedy získal ječmenový plastokyaninový zesilovač (SEQ ID No. 36) . GOS2 zesilovač (SEQ ID No. 35) se získá podobným způsobem při použití primerů (SEQ ID No. 14 a SEQ ID No. 15) a rýžové genomové DNA jako templářů.

Použily se další oligonukleotidové primery.

SEQ ID No. 12

MPU5 5' CGCTCTAGAGGCCGGCCCČAAAATCTCCCATGAGGAGCACC 3'

SEQ'ID No. 13

MPU3 5' CGCTGCAGCTCGAGCCGCCTCTCCATCCGGATGAGG 3'

SEQ ID No. 14

RA5 5' CGCTCTAGAGGCCGGCCGAATCCGAAAAGTTTCTGCACCGTTTTCACC 3'

SEQ ID No. 15

RA3 5' CGCTGCAGCTCGAGGCTGTCCTCCGTTAGATCATCG 3'

01-3037-01-Če • · · · » · · <

• ··

Sekvence amplifikovaných a klonovaných molekul se potvrdila jejich následným nakloňováním do PCR Blunt-IITOPO vektoru (Invitrogen). pCR Blunt-II-TOPO vektor obsahující EPSPS 5'UTR deleci se digeroval buď pomocí Xba 1/Xho 1. Zesilovač se ze svého příslušného pCR BluntII-TOPO vektoru odstranil rovněž za použití Xba 1/Xho 1 digerace a ligoval do prvních vektorů obsahujících EPSPS delece generované PCR.

Příklad 5. Generování dvojitě zesílených fúzí rýžového EPSPS promotoru

Pro další zesílení exprese vyvolané rýžovým EPSPS promotorem se zabudoval druhý zesilovač obsahující buď ječmenový plastokyanin nebo rýžový GOS2. Aby se toho dosáhlo, bylo třeba nejprve provést fúze zesilovač/EPSPS (znázorněné na obr. 4) obsahující jediný (první) zesilovač. Druhý zesilovač, kterým je rovněž buď z ječmenového plastokyaninu nebo rýžového GOS2, se použití primerů BPCXho a BPC3 (SEQ ID No.

13), resp. GOS2Xho a GOS3 (SEQ ID No. 17 a SEQ ID No. 15). Tyto primery usnadňují zavedení místa Xho 1 na 5'konci a 3'konci zesilovače.

amplifikoval za 16 a SEQ ID No.

SEQ ID No. 16 RAPST

SEQ_ ID No. 17 RAPAC

5' ctcgagGGCCGGCCgcagctggcttg 3'

5' ctcgagttttgtggtcgtcactgcgttcg 3'

Po sekvencování se PCR (jako Xho l:Xho 1) zavedl do konstruktu, který obsahoval fúzi prvního zesilovače: EPSPS genu na Xhol místě. Orientace zesilovače se určí pomocí PCR.

01-3037-01-Če • »

« · • · · • · 9 • · * • · · · · ·

Přiklad 6 Inzerce Adhl intronu do 5'ÚTR rýžového EPSPS genu

Inzerce kukuřičného Adhl intronu do požadované delece rýžového EPSPS promotoru (viz. příklad 4) se provedla před generováním fúzního konstruktu s požadovaným zesilovačem (zesilovači). V tomto konkrétním příkladu se Adhl intron zavedl do delece G2 EPSPS promotoru. Odborník v daném oboru si je vědom toho, že podobnou metodologii lze přizpůsobit zabudování Adhl intronu do dalších delecí EPSPS promotoru. Kukuřičný Adhl intron se do konstruktů zavedl pomocí PCR. Adhl intron se amplifikoval z vhodného zdroje, jakým je například kukuřičná genomová DNA nebo vektor, například pPACl (obr. 8), za použití primerů Adh5(SEQ ID No. 18) a Adh3(SEQ ID No. 19) :

SEQ ID No. 18

Adh5 cccatcctcccgacctccacgccgccggcaggatcaagtgcaaaggtccgccttgtttctcctctg SEQ ID NO. 19

Adh3 , gacgccatggtcgccgccatccgcagctgcacgggtccaggaaagcaatc

Výsledný PCR produkt se denaturoval a použil jako primer ve spojení s Adh5Pac (SEQ ID No. 20) při amplifikaci požadovaného produktu, která se prováděla za použití vektoru pTCVIOOlEPSPSPAC (obr. 2) jako templátu.

SEQ ID No. 20

Adh5Pac cgagttcttatagtagatttcaccttaattaaaac

Výsledný PCR produkt se nakloňoval do PCR-blunt II (Invitrogen). Pac l:Hind III fragment se excidoval z rýžového genomového klonu (obr. 1) a zavedl do pTCVIOOl za vzniku pTCVEPSPSPH (obr. 9) . Potom se Pac I/Nco 1 PCR produkt obsahující Adhl intron zavedl do pTCVEPSPSPH, jak schématicky ukazuje obr. 9. Pac l:Eco RV fragment, který se nachází v klonovaném EPSPS genu obsahujícím dvojitý mutant

01-3037-01-Če • · (obr. 10) se excidoval a nahradil Pac 1/Eco RV fragmentem z pTCVEPSPSPH, který obsahoval Adhl intronové sekvence (obr. 9). Na závěr se úplný EPSPS gen obsahující Adhl sekvenci excidoval z pTCVEPSPSPH jako Eag 1/Sac 1 fragment a nakloňoval do pBluescript SK+ a poskytl pBluSKEPSPSADH (obr. 11).

Příklad 7 Zavedení optimalizované pre ATG koncové sekvence (Kozák) pomocí místně směrované mutageneze konstruktů obsahujících kukuřičný Adhl intron

Případně se na konstruktech obsahujících Adhl intron prováděla místně směrovaná mutageneze za použití QuickChange Site Directed Mutagenesis kit (Stratagene). Tato mutageneze se provádí na fragmentu Pac l/Sac 1 EPSPS v pBluescript SK + (obr. 11) před fúzí s fúzemi zesilovač: EPSPS promotor. Pro optimalizaci sekvence KOZÁK se podle vydaných protokolů použily následující oligonukleotidy.

SEQ ID No. 21

OS Kozák 5' GGACCCGTGCAGCTGCGGTACCATGGCGGCGACCATGGC 3'

SEQ ID No. 22

OS KOZak 5'GCCATGGTCGCCGCCATGGTACCGCAGCTGCACGGGTCC 3'

Klony se analyzovaly restrikční analýzou za použití Kpn 1 na izolovaném plasmidu. Správně upravená DNA je charakteristická dalším Kpn 1 restrikčním místem v porovnání s neupravenou DNA. Tato sekvence se následně ověřila automatizovaným DNA sekvencováním.

Upravená DNA sekvence může být přenesena původními konstrukty za použití unikátních restrikčních enzymových

01-3037-01-Če míst Sph 1 nebo Pac 1 na 5' konci a Avr II nebo Eco RV na 3'konci, která jsou vhodná pro každý jednotlivý vektor.

Příklad 8 Kompletace EPSPS expresních kazet obsahujících ve směru 5' -> 3'zesilující oblast (oblasti), oblast upstream rýžového EPSPS promotoru, EPSPS promotor, EPSPS 5'UTR + (případný) kukuřičný Adhl intron 1, oblast kódující rýžový EPSPS transitní peptid, oblast kódující rýžovou zralou EPSPS, a terminační oblast rýžového EPSPS genu

Jednoduše a dvojitě zesílená fúze rýžového EPSPS promotoru (příklad 4 a 5), které jsou obsaženy v pCR BluntII-TOPO vektorech, se excidovaly za použití Xba 1 a Pac 1 a zavedly do podobně digerovaného pBluescript SK+ klonu obsahujícího zbytek rýžové EPSPS sekvence (obr. 7/11). Tento poslední krok klonování vede k získání požadovaných genových konstruktů. Příklady EPSPS expresních kazet, které lze získat za použití výše popsaných strategií, jsou shrnuty v níže uvedené tabulce 1. Obr. 13 až 15 uvádějí schématické mapy.

Klon	první zesilovač	druhý zesilovač	Delece EPSPS promotoru	5'UTL intron	oblast kódující genomový EPSPS	EPSPS terminátor
ZEN7	GOS	Žádný	G1	Ne	Ano	Ano
ZEN8	BPC	Žádný	G1	Ne	Ano	Ano
ZEN17	GOS	RA	G2	Ano	Ano	Ano

01-3037-01-Če

ZEN19	BPC	Žádný	G2	Ano	Ano	Ano
ZEN21	BPC	GOS	G2	Ano	Ano	Ano
ZEN22	GOS	BPC	G2	Ano	Ano	Ano.

Přiklad 9 Subklonování EPSPS expresních kazet z pBluescript SK+ do pIGPD9

Tam, kde je to žádoucí, a zejména při transformaci rostlin přímými DNA metodami (tičinky, bombardování a protoplasty), se EPSPS expresní konstrukty excidují z pBluescriptu za použití Xma 1 a klonují se do pIGPD9 (Obr. 12) . Použití tohoto vektoru při transformaci brání transferu genu rezistentních proti protilátce do roztliny, protože selekce se opírá o komplementaci E. colí histidinového auxotrofus genem kódujícím IGPD. Plasmidy odvozené z pIGPD9 získané inzercí Xma 1 fragmentů 7, 8, 17, 19, 21 a 22 se označily jako ZEN7i, pZEN8i, pZEN17i, pZEN19i, pZEN21i a pZEN22i.

Velké DNA preparáty vhodné pro rostlinou transformaci se získaly za použití Maxi-prep postupu (Qiagen) a výrobcem dodaných protokolů.

Příklad 10 Příprava DNA pro transformaci rostlin

Výše popsaný postup popisuje sestavu EPSPS expresních kazet obsahujících, ve směru 5'-> 3', sekvenci (sekvence) zesilovače, EPSPS promotor z rýže, oblast kódující rýžový EPSPS transitní peptid, oblast kódující zralý rýžový EPSPS enzym, který je rezistentní vůči glyfosátu díky tomu, že má

01-3037-01-Če • · · · · · · · • ·· · · • · · · · · • « · · · • ··· · · ······· ve specifických polohách T nahrazené I a P nahrazené S, a terminátor rýžového EPSPS genu.

Požadované kazety případně dále obsahují drogově selekční markerový gen (například ampicilinová rezistence, kanamycinová rezistence atd.), T-DNA pravou nebo levou hraniční oblast a (případně) připojovací oblast pro proteinové lešení přidanou na 5'a/nebo 3'konci výše popsaného konstruktu. Odborníkovi v daném oboru je zřejmé, že metody podobné výše popsaným metodám lze použít pro získání těchto přidaných složek a pro jejich klonování do požadovaných poloh.

Příklad 11. Transformace kukuřičných linií za použití kmene Agrobacterium obsahující superbinární vektor, který má mezi pravou a levou hranicí T-DNA EPSPS expresní kazetu; výběr a regenerace rostlinných buněk a rostlin, které jsou rezistentní proti glyfosátům

Konstrukce kmene Agrobacterium

Bluescript plasmid DNA (například ZEN 7,8,17,19,21 a 22) se digeroval buď Xma 1 nebo s Xba 1/Sacl a takto získaný (přibližně 5.5-7 kb) EPSPS-kódující fragment ligovaný v poloze, ve které se klonované místo nachází mezi pravou a levou T-DNA hranicí podobně omezeného pSBl. Například v případě použití Xma 1 fragmentu pZEN 8 vytvoří tato ligace plasmid pZEN8SBll (obr. 16). Konstrukce plasmidu pSBll a konstrukce jeho rodičovského plasmidu pSB21 popsal Komáři (1996, Plant J. 10: 165-174). Oblast TDNA pZEN8 se integrovala do superbinárního pSBl vektoru

01-3037-01-Če

9 99 · 99 99

9 9 · 9 9 9 9 9 9 9 <9 99 · · » · • · · > · · 9 · 9

9 9 9 9 9 9

9999 99 999 9·99 99 · (Saito a kol. EP 672752 AI) způsobem homologní rekombinace (obr. 17) za vzniku plasmidu pSBlZEN8. Aby se toho dosáhlo, transformoval se plasmid pZEN8SBll do E.coli kmene HB101, který se následně metodou trojitého křížení (Ditta 1980, Proč. Nati. Acad. Sci USA 77:7347-7351), zkřížil- s Agrobacterium LBA4404 obsahujícím pSBl, čímž se vytvořil transformovaný kmen Agrobacteriuia, LBA4404 (pSBlZEN8), ve kterém se nacházel kointergrovaný plasmid pSBlZEN8 vybraný na základě rezistence proti spectinomycinu. Identita pSBlZEN8 se rovněž potvrdila pomocí Sal 1 restrikční analýzy (obr. 17). LBA4404 kmeny obsahující přímo analogické konstrukty pSBlZEN7, pSBlZEN17, pSBlZEN19, pSBZEN21 a pSBlZEN22 se zkonstruovaly podobným způsobem z Xma 1 fragmentů pZEN7, ZEN17, ZEN19, ZEN21 a ZEN22.

Alternativně se za použití podobných metod, jako jsou výše popsané, homologně zrekombinoval do polohy mezi pravým a levým okrajem superbinárního vektoru pTOK162 (obr. 1 v US 5591616) podobný fragment p ZEN7, ZEN8 atd., čímž se vytvořil podobný soubor kointegrovaných plasmidu zvolených pro Agrobacterium na základě kombinované rezistence proti kanamycinu a spectinomycinu.

Agrobacterium kmen LBA4404, který má pomocný plasmid PAL4404 (mající úplnou vir oblast) lze získat z American Type Culture Collection (ATCC 37349).

Alternativním použitelným kmenem je Agrobacterium EHA101 (1986, Hood a kol., J. Bacteriol., 168(3): 12831290) který má pomocný plasmid mající oblast vir ze silně virulentního kmene Agrobacterium tumefaciens A281.

01-3037-01-Če

··

Příprava suspenzí Agrobacterium

Kmeny Agrobacterium LBA4404 (pSBlZEN7) , LBA4404 (pSBlZEN8) se nanesly v proužcích na plotny obsahující pevné médium „PHI-L' a kultivovaly 3 až 10 dní ve tmě'při teplotě 28 °C.

PHI-L médium je popsáno na straně 26 (příklad 4) patentového dokumentu WO 98/32326. PHI-L médium připravené ve 2x předestilované vodě obsahuje 25 ml/1 zásobního roztoku A, 25 ml/1 zásobního roztoku B, 450,9 ml/1 zásobního roztoku C a 50 mg/1 spectinomycinu. Zásobní roztoky se sterilizovaly v autoklávu nebo filtrací. Zásobní roztok A tvořený 60 g/1 K₂HPO₄ a 20 g/1 NaH₂PO₄ se nastavil na pH 7,0 přidáním KOH; zásobní roztok B je tvořen 6 g/1 MgSO₄.7H₂O, 3 g/1 KC1, 20 g/1 NH₄C1, 0,2 g/1 CaCl₂ a 50 mg/1 FeSO₄.7H₂O; a zásobní roztok C je tvořen 5,56 g/1 glukosy a 16,67 g/1 agaru (A-7049, Sigma Chemicals, St. Louis, Mo, USA) .

Alternativně se Agrobacterium kultivuje 3 až 10 dní na plotně obsahující YP médium ( g/1 kvasnicového extraktu, 10 g/1 peptonu, 5 gl NaCl, 15 g/1 agaru při pH 6,8), které popsal Ishida a kol. (1996, Nátuře Biotechology, 14, 745750) nebo alternativně, které popsal (Hei a kol. v US 5591616 (AB medium (Drlica a Kado, 1974; Proč. Nati. Acad. Sci. USA 71:3677-3681)), ale v jednotlivých případech modifikované tak, aby umožnilo příslušný antibiotický výběr (například obsahuje 50 mg/ml spectinomycinu v případě kmene Agrobacterium LBA4404(pSBlZEN7) atd. nebo obsahuje 50 mg/ml spectomycinu a 50 mg/ml kanamycinu v případě, že se použije Agrobacterium obsahující pTOK 162-odvozený superbinární vektor.

01-3037-01-Če *

•4 · 44 44 • 444 4 4 · 4 44#

4· 4 4 4 4

4444 4 4444

4 4 4 4 4 4 • 444 · · 4444444 4 4 4

Plotny Agrobacterium připravené výše popsaným způsobem se skladovaly při 4 °C maximálně jeden měsíc před použitím. Při přípravě suspenzí se jedna kolonie z původní plotny nanesla ve formě pásů na plotnu obsahující při pH 6,8 5 g/1 kvasnicového extraktu (Difco), 10 g/1 (Difco) , 5 g/1 NaCl, 15 g/1 (nebo médium peptonu 50 mg/1 kmen agaru (Difco) a vhodné příslušný spéctinomycínu Agrobacterium). teplotě 28 °C.

Plotny se inkubovaly 2 dny ve tmě při

Suspenze Agrobacterium pro transformaci rostlinného materiálu se připravily způsobem, který je podobný způsobu popsanému v US 5591616 (za použití mikrobiologické praxe, která by vyloučila kontaminaci aseptickými kulturami). Z ploten se odstranilo množství Agrobacterium odpovídající třem 5mm očkovacím smyčkám, přeneslo a suspendovalo v 5 ml sterilního AA kapalného média, které se nacházelo ve 14ml Falconově zkumavce. Zde použité AA kapalné médium při pH 5,2 obsahuje zejména anorganické soli, aminokyseliny a vitamíny, které definoval Toriyama a Hinata (1985) v Plant Science 41, 179-183), a v minimální míře anorganické soli Murashigeho a Skoogeho média (Murashige a Skoog, 1962 v Physol. Plant 15, 473-497), 0,5 g/1 kasaminokyseliny („casamino acids, hydrolyzát kaseinu), 1 mg/1 kyseliny 2,4-dichlorfenoxyoctové (2,4-D), 0,2 mg/1 kinetinu, 0,1 mg/1 gibberellinu, 0,2M glukosy, 0,2M sacharózy a 0,lmM acetosyringonu.

Alternativně se suspenze Agrobacterium pro transformaci rostlinného materiálu připravuje způsobem podobným způsobu popsanému ve WO 98/32326. Množství Agrobacterium odpovídající třem 5mm očkovacím smyčkám se odstranilo z ploten, transformovalo a suspendovalo v 5 ml sterilního PHI-A bazického média popsaného v příkladu 4 na

01-3037-01-Če

4 ·· 4 44 44 • * · · 4 » 4 · 4 · · · · 4 4

4 4 4 · · 4 4 4

4 4 4 4 4 4

4444 «4 »44 4444 4» str. 26 WO 98/32326 nebo alternativně se suspendovalo v 5 ml sterilního PHI-I kombinovaného média rovněž popsaného v příkladu 4 na str. 26 WO 98/32326. V obou případech se rovněž přidalo 5 ml lOOmM 3'-5'-Dimethoxy-4'-hydroxyacetofenonu. PHI-A bazické médium obsahuje při pH 5,2 4 g/1

CHU(N6)bazálních solí (Sigma C-1416), 1,0 ml/1 Erikssonovi vitaminové směsi (1000X, Sigma E-1511), 0,5 ml/1 thiaminhydrochlorid, 1,5 mg/ml 2,4-D, 0,69 g/1 L-prolinu, 68,5 g/1 sacharózy a 68,5 g/1 glukosy. PHI-I kombinované médium rovněž nastavené na pH 5,2 přidáním KOH a sterilizované filtrací obsahuje 4,3 g/1 MS solí (GIBCO-BRL), 0,5 mg/ml kyseliny nikotinové, 0,5 mg/ml pyridoxinu-hydrochloridu,

1,0 mg/ml thiamin-hydrochloridu, 100 mg/1 myo-inositolu, g/1 vitaminových testovacích kasaminokyselin (Difco),

1,5 mg/ml 2,4-D,0,69 g/1 L-prolinu, 68,5 g/1 sacharózy a 36, g/1 glukózy.

Alternativně se suspenze Agrobacterium pro transformaci rostlinného materiálu připraví způsobem podobným způsobem, kterým popsal Ishida a kol. (1996) Nátuře Biotechnology, 14, 745-750. Množství Agrobacterium odpovídající třem 5mm očkovacím smyčkám se odstranilo z ploten, přemístilo a suspendovalo v 5 ml LS-inf media. LS-inf medium (Linsmayer a Skoog, 1965, Physiol. Plant 18, 100-127) nastavené na pH 5,2 přidáním KOH obsahovalo LS majoritní a minoritní anorganické soli, 0,5 mg/ml kyseliny nikotinové, 0,5 mg/ml pyridoxin-hydrochloridu, 1,0 mg/ml thiamin, hydrochloridu, 100-mg/l myo-inositolu, 1 g/1 vitaminové testovací kasaminokyseliny (Difco), 1,5 mg/ml 2,4-D, 68,5 g/1 sacharózy a 36 g/1 glukózy.

Připravená suspenze Agrobacterium se nicméně vířila ve snaze připravit homogenní suspenzi a buněčná populace se

01-3037-01-Če • · · · · · · • · · ♦ · · · · · • · · · · · · ···· ·· ··· «··· ·· · nastavila na 0,5 x 10⁹ až 2 x 10⁹ cfu/ml (výhodně nižší).

x 10⁹ cfu/ml odpovídá OD (1 cm) ~ 0,72 při 550 nm.

Suspenze Agrobacterium se rozdělily po 1 ml do sterilních 2ml kyvet odstředivky a použily co možná nejdříve.

Kukuřičné linie pro transformaci

Vhodné kukuřičné linie pro transformaci zahrnují neomezujícím způsobem A188, F1 P3732, F1(A188 x B73Ht),

Fl(B73Ht x A188), F1(A188 x BMS). Variety A188, BMS (Black Mexičan Sweet) a B73 Ht se získaly od ministerstva zemědělství a vodního hospodářství. P3732 se získalo od IWATA RAKUNEU KYODOKUMIAI. Vhodnými kukuřičnými liniemi jsou rovněž varieta A188 x inbrední křížení (například PHJ90 x A188, PHN46 x A188, PHPP8 x A188 v tabulce 8 WO98/32326) a rovněž elitní imbrední variety získané z různých heterotických skupin (například PHN46, PHP28 a PHJ90 v tabulce 9 WO98/32326).

Nezralé zárodky se například vyprodukovaly z „Hi-II kukuřice. „Hi-II je hybrid mezi (A188 x B73) generovaný reciprokým křížením mezi Hi-II rodičem A a Hi-II rodičem B, který je dostupný od Maize Genetic Cooperation Stock Center. University v Illinois at Champaign, Urbana, Illinois). Semena, označená „Hi-II semena získaná z těchto kříženců se zasadila a pěstovala ve skleníku nebo na poli. Výslednými Hi-II rostlinami jsou rostliny jako takové nebo rostliny vzniklé křížovým opylením sesterských rostlin.

01-3037-01-Če ····

Příprava nezralých zárodků, infikace a kokultivace

Transformace nezralých zárodků kukuřice se provádí uvedením nezralých zárodků do kontaktu s vhodnými výše popsanými rekombinantními kmeny Agrobacterium. Výrazem „nezralý zárodek se rozumí zárodek nezralého semene, který se nachází ve stádium zrání následujícím po opylení. Nezralými zárodky jsou nedotčené tkáně, které jsou schopny buněčného dělení poskytujícího kalusové buňky, které se následně dělí a produkují tkáně a orgány celých rostlin. Výhodným materiálem pro transformaci je rovněž scutella zárodků, která je rovněž schopná poskytnout dedifirenciované kalusové buňky se schopností regenerovat normální úrodné plodiny, které byly na počátku transformovány. Výhodným materiálem pro transformaci je tedy rovněž kalus odvozený z takto dediferenciovaných nezralých zigotních zárodků nebo scutelly.

Nezralé kukuřičné zárodky se asepticky izolovaly z vyvíjejících se klasů způsobem, který popsal Green a Philips (1976, Crop. Sci. 15: 417-421) nebo způsoby, které navrhl Neuffer a kol. (1982, „Growing Maize for genetic purposes v Maize for biological research, W.F. Sheridan ed., University Press, University of Nerth Dakota, Grand Forks, Nerth Dakota, USA)., Nezralé kukuřičné zárodky i

například o délce 1-2 mm (výhodně 1-1,2 mm) se asepticky izolovaly ze samičích klasů 9. až 12. den (výhodně 11. den) po 'opylení za použití sterilní stěrky. Povrch klasů se zpravidla před opláchnutím dionisovanou vodou a aseptickým odstraněním nezralých zárodků 20 min sterilizuje 2,63% roztokem hypochloritu sodného. Nezralé zárodky (výhodně přibližně 100 zárodků) se nasypou přímo do 2ml kyvety mikroodstředivky obsahující přibližně 2 ml stejného média,

01-3037-01-Če

jaké se použilo pro přípravu suspenze Agrobacterium (jeho alternativy jsou popsány výše). Kyveta se uzavře uzávěrem a obsah se míchá vířením po několik sekund. Médium se oddekantuje, přidají se 2 ml čerstvého média, které se opět míchá vířením. Všechno médium se následně odsaje a na dně kyvety se ponechají propláchnuté nezralé zárodky.

Po ukončení přípravy následuje další fáze, tj. připravené zárodky uvádějí kmenem Agrobacterium.

nezralých kukuřičných zárodků infekční krok, ve kterém se do kontaktu s transformovaným

V jednom z příkladů se infekční krok prováděl v kapalném médiu, které obsahuje majoritní anorganické soli a

Symp. Plant Tissue 43-50), které je vitaminy N6 média (1987, Chu C.C. Proč.

Culture, Science Press Peking. str. popsáno v příkladu 4 WO 98/32326. K zárodkům v kyvetě mikrocentrifugy se přidal 1,0 ml suspenze Agrobacterium připravené výše popsaným způsobem v PHI-A médiu a obsah kyvety se přibližně 30 s míchal vířením. Alternativně se použil 1,0 ml suspenze Agrobacterium připravené rovněž výše popsaným způsobem, a to buď v PHI-I médiu nebo v LS-inf médiu.

Potom, co se nechala suspenze Agrobacterium 5 min stát se zárodky vylily do Petriho misky obsahující 1) PHI-B médium nebo 2) PHI-J médium nebo 3) LS-AS médium podle toho, zda se původní suspenze Agrobacterium připravila v PHI-A médiu, PHI-I médiu nebo resp. LS-inf médiu. Suspenze Agrobacterium se odsála pomocí Pasteurovy pipety a zárodky se usadily tak, že jejich osová stana směřovala směrem dolů k médiu. Miska se utěsnila pomocí parafólie a inkubovala 3denní kokultivací ve tmě při 23 až 25 °C. PHI-B médium obsahovalo při pH 5,8 4 g/1 CHU(N6) bazálních solí (Sigma

01-3037-01-Če ♦ ♦ · · · · · *··· ·· ·*· ··♦· ♦·

C-1416), 1,0 ml/1 Erikssonovi vitaminové směsi (1000X, Sigma E-1511), 0,5 mg/1 thiamin-hydrochloridu, 1,5 mg/ml 2,4-D, 0,69 g/1 L-prolinu, 0,85 mg/1 dusičnanu stříbrného, g/1 sacharózy, 100 mM acetosyringonu a 3 g/1 gelritu (Sigma). PHI-J médium, které se rovněž nastavilo na pH-5,8 obsahovalo 4,3 g/1 MS solí (GIBCO-BRL) , 0,5 mg/ml kyseliny nikotinové, 0,5 mg/ml pyridoxin-hydrochloridu, 1,0 mg/ml thiamin-hydrochloridu, 100 ml/1 myo-inositolu, 1,5 mg/ml 2,4-D, 0,69 g/1 L-prolinu, 20 g/1 sacharózy, 10 g/1 glukózy, 0,5 g/1 MES (Sigma), 100 mM acetosyringonu a 8 g/1 purifikovaného agaru (Sigma A-7049). LS-AS médium (Linsmaier a Skoog, 1965, Physiol. Plant 18, 100-127) nastavené na pH 5,8 přidáním KOH obsahovalo LS majoritní a minoritní anorganické soli, 0,5 mg/ml kyseliny nikotinové,

0,5 mg/ml pyridoxin-hydrochloridu, 1,0 mg/ml thiaminhydrochloridu, 700 mg/1 L-prolinu, 100 mg/1 myo-inositolu,

1,5 mg/ml 2,4-D, 20 g/1 sacharózy, 10 g/1 glukózy, 0,5 g/1 MES, 100 mM acetosyringonu a 8 g/1 purif ikovaného agaru (Sigma A-7049).

Po ukončení přípravy nezralých zárodků, která byla popsána výše, lze použít alternativní způsob vedoucí k transformaci, kterým je infikování nezralých zárodků v průběhu dediferenciace a po dediferenciaci popsané v patentu US 5591616. Nezralé zárodky se umístily na pevné médium LSD 1.5 obsahující LS anorganické soli a vitamíny společně se 100 mg/ml kasaminokyselin, 700 mg/1 L-prolinu, 100 mg/1 myo-inositolu, 1,5 mg/ml 2,4-D, 20 g/1 sacharózy a 2,3 g/1 gerlitu. Po 3 týdnech při 25 °C se buňky pletiva pocházející se scutelly umístily do 2ml kyvety mikroodstředivky a ponořily do 1 ml suspenze Agrobacterium v AA médiu, která se připravila výše uvedeným způsobem, potom, co se nechaly 5 min stát, se pletivové

01-3037-01-Če ·· ·· · ·· ·· • · · · ·· * · · · • ·♦ · · · · ♦ ♦ · · · · · ···· ·· ··· ··<·· ·· buňky přenesly na 2N6 pevné médium obsahující 100 μΜ acetosyringonu a inkubovaly 3denní kokultivací ve tmě při 25 °C. 2N6 pevné médium obsahovalo anorganické soli a vitaminy N6 média (Chu C.C., 1978; Proč. Symp. Plant Tissue Culture, Science Press Peking, str. 43-50) obsahujícího g/1 kasaminokyselin, 2 mg/1 2,4-D, 30 g/1 sacharózy a g/1 gelritu.

Klidové stádium a výběr transformantů

Po ukončení kokultivace se zárodky případně přenesly na plotnu obsahující PHI-C médium, překryly parafólií a inkubovaly 3 dny ve tmě, tj. podrobily se klidovému stádiu. PHI-C médium obsahovalo při pH 5,8 4 g/1 CHU(N6) bazálních solí (Sigma C-1416), 1,0 ml/1 Eriksonnovi vitaminové směsi (1000X, Sigma E-1511), 0,5 mg/1 thiamin-hydrochloridu,

1,5 mg/ml 2,4-D, 0,69 g/1 L-prolinu, 0,85 mg/1 dusičnanu stříbrného, 30 g/1 sacharózy, 0,5 g/1 MES, 100 mg/1 carbenicilinu a 8 g/1 purifikovaného agaru (Sigma A-7049). jak popisuje patentový dokument WO 98/32326, nutnost zavedení tohoto klidového kroku do celkového transformačního procesu je závislá na konkrétní kukuřičné linii a je předmětem experimentu.

Při výběrovém kroku se přibližně 20 zárodků přeneslo na určitý počet čerstvých ploten obsahujících PHI-D sel-ekční médium nebo LSD 1,5 selekční médium, překrylo parafólií a inkubovalo ve tmě při 28 °C. PHI-D selekční médium nastavené na pH 5,8 přidáním KOH obsahovalo 4 g/1 CHU(n6) bazálních solí (Sigma C-1416), 1,0 ml/1 Erickssonovy vitaminové směsi (1000X, Sigma E-1511), 0,5 mg/1 thiamin-hydrochloridu, 1,5 mg/ml 2,4-D, 0,69 g/1

01-3037-01-Če ·-»

L-prolinu, 0,85 mg/1 dusičnanu stříbrného, 30 g/1 sacharózy, 0,5 g/1 MES, 100 mg/1 carbenicilinu, 8 g/1 purifikovaného agaru (Sigma A-7049) a 0,1 mM až 20 mM tkáňové kultury typu N-(fosfonomethyl)-glycin (Sigma P9556). LSD 1,5 selekční médium nastavené na pH 5,8 přidáním KOH obsahovalo LS majoritní a minoritní anorganické soli (Linsmaier a Skoog, 1965, Physiol. Plant 18, 100-127), 0,5 mg/ml kyseliny nikotinové, 0,5 mg/ml pyridoxinhydrochloridu, 1,0 mg/ml thiamin-hydrochloridu, 700 mg/1 L-prolinu, 100 mg/1 myo-inositolu, 1,5 mg/ml 2,4-D, 20 g/1 sacharózy, 0,5 g/1 MES, 250 mg/1 cefotaximu, 8 g/1 purifikovaného agar (Sigma A-7049) a 0,1 mM až 20 mM tkáňové kultury typu N-(fosfonomethyl)-glycin (Sigma P-9556).

Alternativně v případě, že výchozím materiálem pro výběr jsou tkáňové buňky odvozené z nezralých zárodků popsané v patentovém dokumentu WO 5591616, se tyto tkáňové buňky propláchly sterilizovanou vodou obsahující 250 mg/1 cefotaximu a teprve potom následně kultivovaly na LSD 1,5 selekčním médiu.

Zárodky nebo shluky buněk, které přežily se ve 2týdenních intervalech (celková doba přibližně 2 měsíce) přemisťovaly (pokud to bylo nezbytné za použití sterilního skalpelu) na plotny obsahující čerstvé selekční médium. Herbicidně rezistentní tkáňové buňky se následně namnožily kontinuálním růstem na stejném médiu až do průměru vybrané tkáně přesahujícího 1,5 cm.

Koncentrace N-(fosfonomethyl)glycinu v selekčním médiu se vhodně zvolí tak, aby umožnila vybrat požadovaný počet pravých transformantů a zpravidla se pohybuje v rozmezí od 0,3 do 5 mM. První 2 týdny výběru dosahovala koncentrace

01-3037-01-Če < 9 9 9

9*

9 9 9

9 9

99 9 99 použitého N-(fosfonomethyl)-glycinu v selekčním médium přibližně 1 mM a po uplynutí této doby dosahovala přibližně 3 mM.

Regenerace transformantů, propagace a analýza transformovaného rostlinného materiálu

Vybrané tkáňové	buňky	se regenerovaly ve	formě
normálních úrodných	rostlin	například způsobem,	který
popsal Duncan a kol.	(1985, Planta, 165, 322-332),	Kamo a
kol. (1985, Bot. Gaz.	146(3),	327-334) a/nebo West	a kol.
(1993, The Plant Cell,	5, 1361-	1369) a/nebo Shillito	a kol.
(1989) Bio/Technol. 7,	581-587.
Vybrané tkáňové	buňky o	průměru 1,5 až 2	cm se
například přemístily	do média	pro regeneraci (zrání) a

inkubovaly ve tmě po dobu přibližně 1 až 3 týdnů, čímž se umožnilo somatickým zárodkům dozrát. Vhodné regenerační médium PHI-E (WO 98/32326) se nastavilo na pH 5,6 přidáním KOH a obsahovalo 4,3 g/1 MS solí (GIBCO-BRL) , 0,5 mg/ml kyseliny nikotinové, 0,5 mg/ml pyridoxin-hydrochloridu, 0,1 mg/ml thiamin-hydrochloridu, 100 mg/1 myo-inositolu, 2 mg/1 glycinu, 0,5 mg/1 zeatinu, 1,0 mg/ml kyseliny indoloctové, 0,1 mM kyseliny abscisové, 100 mg/1 carbenicilinu, 60 g/1 sacharózy, 8 g/1 purifikovaného agaru (Sigma A-7049) a případně 0,02 mM až 1 mM tkáňové kultury typu N-(fosfonomethyl)-glycinu (Sigma P-9556).

Tkáňové buňky se potom přemístily do kořenotvorného/ regeneračního média, kde se nechaly růst při 25 °C buď v režimu 16 h denní světlo (270 mE m~²) a 8 h tmy nebo za kontinuálního osvětlení (~250 mE m^_2s”¹) , dokud se nevyvinuly semena a kořeny. Vhodnými kořenotvor01-3037-01-Če • · ··

nými/regeneračními médii jsou buď médium LSZ, které bude popsáno v následujícím odstavci (případně nemusí obsahovat fosfonomethylglycin) nebo médium PHI-F, které při pH 5,6 obsahuje 4,3 g/1 MS solí (GIBCO-BRL), 0,5 mg/ml kyseliny nikotinové, 0,5 mg/ml pyridoxin-hydrochloridu, 0,1 mg/ml thiamin-hydrochloridu, 100 mg/1 myo-inositolu, 2 mg/1 glycinu, 40 g/1 sacharózy a 1,5 g/1 gelritu.

Alternativně se vybrané tkáňové buňky přemístily přímo do LSZ regeneračního média nastaveného na pH 5,8 přidáním KOH, které obsahovalo LS majoritní a minoritní anorganické soli (Linsmaier a Skoog, 1965, Physiol. Plant 18, 100-127), 0,5 mg/ml kyseliny nikotinové, 0,5 mg/ml pyridoxinhydrochloridu, 1,0 mg/ml thiamin-hydrochloridu, 700 mg/1 L-prolinu, 100 mg/1 myo-inositolu, 5 mg/ml zeatinu, 20 g/1 sacharózy, 0,5 g/1 MES, 250 mg/1 cefotaximu, 8 g/1 purifikovaného agaru (Sigma A-7049) a případně 0,02 mM a 1 mM tkáňové kultury typu N-(fosfonomethyl)-glycin (Sigma P-9556). Po ukončení inkubační periody na plotnách umístěných ve tmě se tkáňové buňky osvětlily (kontinuálním osvětlením nebo podle výše popsaného světelného režimu) a regenerovaly se ve formě rostlinek.

Malé rostlinky se přemístily do jednotlivých skleněných zkumavek obsahujících PHI-F médium nebo LSF médium s poloviční sílou, které při pH 5,8 obsahuje LS majoritní soli (Lindsmaier a Skoog, 1965, Physiol. Plant 18, 100-127) v poloviční síle, LS minoritní soli, 0,5 mg/ml kyseliny nikotinové, 0,5 mg/ml pyridoxin-hydrochloridu, 1,0 mg/ml thiamin-hydrochloridu, 100 mg/1 myo-inositolu, 20 g/1 sacharózy, 0,5 g/1 MES, 8 g/1 purifikovaného agaru (Sima A7049) a nechaly se růst na tomto médiu přibližně 1 týden. Rostlinky se následně přemístily do květníků naplněných půdou otužily v růstové komoře (85% relativní vlhkost,

01-3037-01-Če • 99 >9 « 9 9 9 9 9

9«9

9 9 9 9

9 9 9

999 9999 99 9 • · 99

9 9 9 «· • 99

9 9

9999 99

600 mg/1 CO₂ a 250 mE m~²s^-1) a ve skleníku nechaly růst ve smíšené půdě až do dosažení zralosti.

Druhá generace (TI) semen se získala samoopylením první generace (To) rostlin získaných výše popsaným způsobem. Alternativně (a výhodně) se první generace rostlin křížila reciprokým způsobem s další netransgenní kukuřičnou imbrední linií, čímž se získala druhá generace semen. Potomci těchto křížení (TI) se, jak lze očekávat, rozdělily v poměru 1:1 podle herbicidní rezistence. (Tl) semena se vysela, nechala růst ve skleníku nebo na poli a úroveň rezistence, dědičnost rezistence a rozdělení rezistence proti herbicidnímu glyfosátu se u této a následných generací analyzovala pozorováním rozdílného přežívání rostlin, úrodnosti a příznaků nekrózy tkání po ošetření rostlin glyfosátem (vhodně formulovaným, případně ve formě soli) v dávce 25 až 2000 g/ha a na růstových stádiích V2 až V8 (nebo alternativně 7-21 dní po vzejití rostliny). Jako kontrola pro tyto testy se použily citlivé segreganty a podobné netransformované linie kukuřice, které neobsahují geny podle vynálezu, které jsou schopny poskytnout rostlinám rezistenci proti glyfosátu. Transgenní linie, které vykazovaly rezistenci proti glyfosátu se opět samoopýlily nebo zpětně křížily na netransgenní inbred.

Všechna stádia výše popsaného procesu, kterými jsou tkáňové vzorky transformovaného kalusu, rostlinky, To a Tl rostlinný materiál, se případně odebraly a analyzovaly 1) Southernovým přenosem a PCR, které měly naznačit přítomnost, počet kopií a integritu transgenů, 2) northernovou (nebo podobnou) analýzou, která umožnila změřit expresi mRNA z transgenů, 3) kvantitativní westernovou analýzu SDS gelů, která umožnila změřit expresní úrovně EPSPS a 4) měřením úrovní EPSPS enzymatické aktivity v

01-3037-01-Če • 9 99

9 9 9

9 9 » 9 9 9

9 9

9' • « • • 999 ♦ 9

9 9

9

9 přítomnosti glyfosátu a za absence glyfosátu, které umožnilo přesněji odhadnout množství EPPS exprimované z transgenu.

Tyto analytické metody jsou v daném oboru známy. Vhodné metody pro provádění testů na přítomnost, integritu a expresi transgenu pomocí PCR, pro provádění Southernovy analýzy, pro klonování a expresi zralé rýžové EPSPS v E.coli, pro purifikaci rýžové EPSPS pro generování polyklonálních protilátek pro purifikovanou rýžovou EPSPS, pro westernovou analýzu koncentrace EPSPS v kalusu a v rostlinných tkáních a pro měření úrovně aktivity EPSPS v extraktech odvozených z rostliny při koncentraci glyfosátu jsou podrobně popsány v příkladech 17-20.

Příklad 12 Transformace kukuřičné linie bombardováním částicemi potaženými DNA, která zahrnuje EPSPS expresní kazetu; výběr a regenerace rostlinných buněk a rostlin, které jsou rezistentní proti glyfosátu

V dalším příkladu se drobivý embryogenní kalus odvozený ze zralých kukuřičných zárodků inicioval na pevném médiu a biolisticky transformoval. Podobně jako u způsobu popsaného v příkladu 11 se transformovaný kalus následně vybral na základě různé rychlosti růstu v médiu obsahujícím určité rozmezí koncentrací glyfosátu. Rezistentní kalus se vybere a po regeneraci poskytl (To) rostlinky, které se přemístily do květníků, nechaly dorůst ve zralé rostliny a ve skleníku buď samoopýlily nebo křížově opýlily. Z dceřinných semen (TI) se následně vypěstovala další generace rostlin, které se testovaly na rezistenci vůči

01-3037-01-Če glyfosátu a analyzovaly ve snaze ověřit transgenní přítomnost, integritu a expresi stejně jako v příkladu 11.

Iniciace kalusu z nezralých zárodků

Sypký embryogenní kalus Typ II vhodný pro transformaci se odvodil z nezralých zárodků kukuřice A188 X B73. Rovněž lze použít alternativní příbuzné linie kukuřice například odvozené z B73 a hybridní linie, mezi které lze zařadit linie, jejichž seznam uvádí příklad 11. Ze samičího klasu se zpravidla 11. den po opylení pomocí metod popsaných v příkladu 11 asepticky izolují 1-2 mm dlouhé nezralé zárodky kukuřice.

Nezralé zárodky se umístí například na médium na bázi N6 média (Chu a kol. , 1975, Scientia Sinica, 18, 659-668) nastavené přidáním KOH na pH 5,8 a obsahující 1 mg/1 2,4-D, 2,9 g/1 L-prolinu, 2 mg/1 L-glycinu, 100 mg/1 hydrolysátu kaseinu, N6 majoritní soli, N6 minoritní soli, N6 vitamíny, 2,5 g/1 gelritu (nebo 2 g/1 „Gelgro) a 20 g/1 sacharózy. Alternativní vhodné médium zahrnuje například jinak podobné médium, které však na místo N6 solí obsahuje MS soli (Murashige a Skoog, 1962, Physiol. Plant, 15, 473-497). Alternativně může toto médium na místo 2,4-D obsahovat ~10 mg/1 dicamby.

Kalus se iniciuje inkubací nezralých zárodků ve výše definovaném médiu ve tmě a při teplotě přibližně 25 °C. Kalusový materiál Typu II se zvolil vizuálním výběrem nej rychleji rostoucích sypkých embryogenních buněk způsobem, který je v daném oboru známý a který je popsán například v patentovém dokumentu WO 98/44140. Vhodný buněčný příjemce se například vybral manuálně výběrem

01-3037-01-Če ·· ·· « ·» ·· ♦ · · · ···· · nejvýhodnějších buněk, které se mohou nacházet na povrchu shluku buněk, přičemž tyto buňky jsou dále identifikovatelné na základě toho, že nejsou diferenciované, mají malou velikost a vysoký objemový poměr jádro/cytoplasma. Suspenzní kultura se iniciuje z tkáně v kalusu, který se jeví jako minimálně diferencovaný nejměkčí a nej drobivéjší. Tkáň s touto morfologií se přibližně 8 až 16 dní po první iniciaci nezralých zárodků přemístí na plotny s čerstvým médiem. Tkáň se potom běžným způsobem subkultivuje každých 14 až 21 dní odebráním přibližně 10 % kusů, které dosáhly váhy přibližně 1 g. V každém kroku se subkultivuje pouze materiál s požadovaný typem morfologie, tj. typem II nebo typem III.

Příprava buněčných suspenzních kultur

Výhodně v průběhu 6 měsíců od započetí iniciace kalusu se dispergované suspenzní kultury iniciují v kapalném médiu obsahující vhodné hormony například 2,4-D a ΝΑΆ případně podávané ve formě kapslí pozvolna uvolňující hormon, viz příklad 1 a 2 patentového dokumentu US 5550318. Koncentrace hormonů v kulturách se výhodně udržuje příležitostným „prošpikováním čerstvým hormonálním doplňkem. Suspenzní kultury se iniciovaly například přidáním přibližně 0,5 g kalusové tkáně do lOOml baňky obsahující 10 ml suspenzního kultivačního média. Každých 7 dní se kultura dále subkultivovala přenosem, pomocí sterilní pipety s širokým koncem, 1 ml usazených buněk a 4 ml vytemperovaného média do čerstvé baňky obsahující čerstvé médium. Velké agregáty buněk, které nebyly schopny projít koncem pipety se v každém subkultivačním kroku vyloučily. Suspenzní kultury se případně při každém subkultivačním kroku přesely přes

01-3037-01-Če vhodné síto (například přibližně s velikostí oka 0,5 mm až 1 mm) . Po 6 až 12 týdnech se kultura dispergovala. Vhodné buněčné suspenzní kultivační médium zahrnuje například médium, které po nastavení na pH 6,0 obsahuje Murashige a Skoog (1962) majoritní a minoritní soli (případně modifikované, takže obsahují redukovanou koncentraci dusičnanu amonného, t j . 1,55 g/1) 30 g/1 sacharózy, 0,25 mg/1 thiaminu, 100 mg/1 dicamby, 25 mM L-prolinu, 200 mg/1 hydrolysátu kaseinu, 100 mg/1 myo-inositolu, 500 mg/1 síranu draselného a 400 mg/1 hydrogenfosforečnanu draselného. Suspenzní médium může na místo dicamby obsahovat 2,4-D a/nebo NAA.

Konzervace buněčných suspenzních kultur zmrazením

Suspenzní kultury získané výše popsaným způsobem se případně konzervují zmrazením za použití látek, které napomáhají buňkám přežít zmrazení (cryoprotectants) a způsobů popsaných například v patentu US 5550318, konkrétně v příkladu 2. Konzervace zmrazením zahrnuje přidáváni látek napomáhajících buňkám přežít při zmrazení při teplotě mrazu k předchlazeným buňkám, a to krokovým způsobem v průběhu 1 až 2 hodin. Směs se udržuje na teplotě mrazu a případný objem látky, která pomáhá buňkám přežít při zmrazení odpovídá objemu buněčné suspenze. Konečnými koncentracemi látek pomáhajících buňkám přežít při zmrazení jsou například 10 % dimethylsulfoxidu, 10% polyethylenglykolu (6000 Mw) , 0,23 M L-prolinu a 0,23 M glukózy. Po 30minutové vyrovnávací periodě při teplotě mrazu se směs rozdělila na přibližně 0,5ml alikvotní podíly, přemístila do 2ml kyvet mikroodstředivky a rychlostí 0,5 °C/min pozvolna ochladila na teplotu -8 °C. Po nukleační periodě

01-3037-01-Če • · ·· · «· ·« ···· · · · · ··· • · · · · · · ···· · · · · · • · · · · · · • · · · · · ······· ·· · zmrazením se vzorek dále pozvolna ochlazoval na -35 °C a následně umístil do kapalného dusíku. Pokud to bylo pro použití nutné, nechaly se zmrazené vzorky natát umístěním společně s nádobou, ve které se nacházely, na 2 minuty do vody, jejíž teplota dosahovala přibližně 40 °C, a potom se nechaly pozvolna zcela roztát. Směs buněk a látky pomáhající buňkám přežít zmrazení se následně pomocí pipety přenesla na filtr ležící na vrstvě BMS „feeder buněk při 25 °C. Potom, co roztátá tkáň začne růst, se přemístí zpět na čerstvé pevné kultivační médium a během 1 až 2 týdnů se dále přenese do buněčného suspenzního kultivačního média.

Potom, co vyrostou v kapalné suspenzní kultuře, se buňky použijí pro transformaci.

Transformace zprostředkovaná částicemi purifikovala a zvětšila chromatografií nebo CsCl₂ aniontoměničovou densitometrickou

Plasmidová DNA odvozená pIGPD9 (obr. 12) obsahující Xmal EPSPS expresní kazety (tj . pZEN6i, ZENlOi, atd.) se (například gradienční izolací plasmidové DNA z buněk vhodného HisB-, Rec Ahostitelského kmene E.coli (například DH5a; hisB-) potom, co narostla do stacionární fáze v minimálně 5xA médiu (K₂HPO₄ 52,5 g, KH₂PO₄ 22,5 g, (NH₄)₂SO₄ 5 g a citrát sodný 2H₂O 2,5 g/1, a použila se jako koncentrovaný roztok (výhodně přibližně 1 mg/ml) ve sterilizované vodě. DNA se použila jako kruhová plasmidová DNA nebo po restrikci pomocí Xma 1 jako lineární fragment obsahující EPSPSexpresní kazetu, které se před použitím purifikovaly elektroforézou na agarovém gelu a elektroelucí.

01-3037-01-Če

Vhodným zařízením pro bombardování je například pistole Biorat PDS1000 Helium. Miska se umístila 5 až 6 cm pod zádržné síto (stopping screen), které mělo zadržet Kaptonův makroprojektil. DNA konstrukt se vysrážel na wolframových nebo zlatých částicích majících střední průměr přibližně 1,0 pm podobným způsobem jako u postupu, který popsal Klein a kol. 1987, Nátuře, 327, 70-73. 1,25 mg Wolframových nebo zlatých částic (předem opláchnutých v ethanolu, 65 °C po dobu 12 h) se například smísilo v uvedeném pořadí s přibližně 20 až 30 mg DNA, 1,1 M CaCl2 a

8,7 mM spermidinu do finálního objemu přibližně 0,6 ml. Směs se míchala lOminutovým vířením při 0 °C až 4 °C, podrobila 5minutovému nízkorychlostnímu odstřeďování (přibližně 500 G) a objem supernatantu se oddekantoval tak, že v nádobě zůstaly wolframové částice suspendované přibližně ve 30 ml finálního objemu. Ιμΐ až 10μ1 alikvotní podíly se odpipetovaly na makroprojektyl bombardovací pistole.

Suspenzní kultury odvozené z kalusu typu II a/nebo typu III se ponechaly v kultuře 3 až 5 měsíců (nebo alternativně regenerovaly z konzervace zamrazením) čerstvě subkultivovaly a následně přesily přes síto z nerezové oceli o velikosti ok 0,5 až 1 mm. Přibližně 0,5ml shluklých buněk (PCV) se izolovalo z filtrátu a následně napipetovalo na 5cm papírové filtry a před přemístěním na Petriho misku obsahující tři na sobě ležící 7cm papírové filtry zvlhčené suspenzním kultivačním médiem se vakuově sušilo. Každá plotna suspenzních buněk se vystředila na testovacím tácu, z Petriho misky se sejmulo víčko a obsah se bombardoval 2x při tlaku 3,73 KPa. Přibližně 2,5 cm pod koncovou desku se umístila 0,1 nebo l,0mm síta, která měla zmírnit poškození bombardované tkáně. Po ukončení bombardování se rostlinné

01-3037-01-Če • · * · · · * 99 · 9 9 · · · · · 9 · · · · 9 ·

9999 · 9*99 * * * 9 * * *

999 9· 99* *·9* *9 * buňky odstranily z filtru, resuspendovaly zpět do buněčného suspenzního kultivačního média a kultivovaly 2 až 21 dní. Alternativně se bombardovaný kalus přemístil, z plotny na plotnu, na plotnu obsahující podobné pevné médium (například obsahující 8 g/1 purifikovaného agaru)· a podobným způsobem kultivoval ve tmě při přibližně 25 °C.

Selekce transformantů

Po ukončení transformace se neselektované buňky rostoucí v kapalné nebo pevné kultuře přenesly na filtry a společně s filtry umístily na pevné médium obsahující určité rozmezí (0,1 až 20 mM) selekčních koncentrací N-(fosfonomethyl)glycin určeného tkáňové kultury (Sigma).

Vhodné pevné selekční médium zahrnuje médium, které po nastavení pH 5,8 nebo 6,0 přidáním KOH, obsahuje buď MS nebo N6 soli (například ty, které byly popsány výše v souvislosti s iniciací kalusu nebo po vhodném přidání agaru ty, které byly popsány výše v souvislosti s růstem buněk v kapalné suspenzi) a N-(fosfonomethyl)glycin. Vhodným selekčním médiem jsou například selekční média popsaná v příkladu 11, nicméně v tomto případě musí být modifikována tak, aby postrádala antibiotika. Transformované kalusy exprimující rezistentní EPSP synthasový enzym se vybraly na základě jejich růstu při koncentracích, které inhibovaly podobné přípravky netransformovaných buněk. Rostoucí shluky buněk se subkultivovaly na čerstvém selekčním médiu. Výhodnou koncentrací N-(fosfonomethyl)glycinu použitého v selekčním médiu je přibližně 1 mM během prvních 2 týdnů selekce a následně potom 3 mM. Po 6 až 18 týdnech se identifikují a vyberou zdánlivě rezistentní kalusy.

01-3037-01-Če

Regenerace transformantů/propagace a analýza transformovaného rostlinného materiálu

Vybrané kalusy se regenerovaly na normální odrůdy například způsobem, který popsal Duncan a kol. (1985, Planta, 165, 322-332), Kamo a kol. (1985, Bot. Gaz. 146(3), 327-334) a/nebo West a kol. (1993, The Plant Cell, 5, 13611369) a/nebo Shillito a kol. (1989) Bio/Technol. 7, 581587.

Rostliny se například účinně regenerovaly přenosem embryogenního kalusu do Murashogeho a Skoogeho média nastaveného na pH 6,0, které obsahuje 0,25 mg/1 2,4-D, 10 mg/1 6-benzyl-aminopurinu a případně 0,02/1 až 1 mM N-(fosfonomethyl)glycinu. Přibližně po 2 týdnech se tkáň přemístila do podobného média, které však postrádalo hormony. Případně se hladina hormonu snižovala krokovým způsobem více přenosy po delší časovou periodu (až 6-8 týdnů). Osivo, které se vyvinulo po 2 až 4 týdnech se přeneslo do MS média obsahujícího 1 % sacharózy a hutnělo se přídavkem 2 g/1 Gelgro, ve kterém se následně vytvořily kořeny.

Alternativně lze použít regenerační metody a média popsaná v příkladu 11 s tou výjimkou, že použitá média neobsahovala antibiotika.

Metody pěstování rostlin do zralosti, další propagace rostlin přes generace, analýzy dědičnosti rezistence vůči glyfosátu a analýzy přítomnosti, integrity a exprese EPSPS transgenu jsou popsány v příkladu 11.

01-3037-01-Če « · «* » · · «« ···· «· * · · » · • ·· · · · · • · ♦ « · » · · · • · · ♦ · · · ««·· · · «·····« ·· «

Přiklad 13 Transformace kukuřičných linií pomocí DNA, která obsahuje EPSPS expresní kazetu, nanesené na vlákna karbidu křemíku; selekce a regenerace rostlinných buněk a rostlin, které jsou rezistentní vůči glyfosátu kukuřičné linie mající genotyp a transformovaly karbidu křemíku

V dalším příkladu se připravily zahrnující například hybridní linie A188 x B73 ve formě buněčných suspenzí uvedením buněk do kontaktu s vlákny potaženými DNA způsoby, které v podstatě popsal Frame a kol. (1994, Plant J. 6, 941-948) . Jak již bylo popsáno v předcházejících příkladech, takto vyprodukovaný transformovaný kalus se vybíral na základě různé rychlosti růstu v médiu obsahujícím určitý rozsah koncentrací glyfosátu, regeneroval v rostlinkách (To), které se nechaly vyrůst do zralosti, a buďto samoopylením nebo křížovým opylením se získala dceřinná semena (Tl) použitelná pro další pěstování. Rostliny a rostlinný materiál se testovaly na rezistenci vůči glyfosátu a analyzovaly na transgenní přítomnost, integritu a expresi způsoby popsanými v předcházejících příkladech.

Iniciace kalusu z nezralých zárodků, příprava buněčných suspenzních kultur

Kukuřičné buněčné suspenze vhodné pro transformaci se případně konzervovaly zamrazením a připravily pro použití způsobem popsaným v příkladu 2.

01-3037-01-Če • ·

12) obsahující ZEN8i, atd.) se aniontoměničóvou densitometrickou

Transformace

Plasmidová DNA odvozená pIGPD9 (obr Xmal EPSPS expresní kazety (tj . pZEN7i, purifikovala a zvětšila (například chromatografií nebo CsCÍ2 gradienční izolací plasmidové DNA z buněk vhodného HisB-, Rec Ahostitelského kmene E.coli (například DH5ct;hisB-) potom, co narostla do stacionární fáze v minimálně 5xA médiu (K2HPO4 52,5 g, KH₂PO₄ 22,5 g, (NH₄)₂SO₄ 5 g a citrát sodný 2H₂O 2,5 g/1) a použila se jako koncentrovaný roztok (výhodně přibližně 1 mg/ml) ve sterilizované vodě. DNA se použila jako kruhová plasmidová DNA nebo po restrikci pomocí Xma 1 jako lineární fragment obsahující EPSPSexpresní kazetu, které se před použitím purifikovaly elektroforézou na agarovém gelu a elektroelucí.

Při transformaci se dodržel postup, který popsal Frame a kol., 1994. Alternativně se tento postup modifikoval níže popsaným způsobem.

Buňky, které vyrostly v kapalné kultuře v buněčném suspenzním médiu 1 den po subkultivaci se nechaly usadit v protřepávačce. Vyčerpané médium se oddekantovalo a odsálo a na 4 ml shluklých buněk (PCV) se přidalo 12 ml N6 média, které se modifikovalo tak, že při pH 6,0 (Chu a kol., 1975) obsahovalo 6 mM L-prolinu, 20 g/1 sacharózy, 2 mg/1 2,4-D, 0,25 M sorbitolu a 0,25 M mannitolu. Baňka se vrátila do protřepávačky (frekvence protřepávání 125 min^-1, inkubace při 26 až 28 °C) , kde se ponechala 45 min. Na konci této časové periody se pomocí pipety s širokým vnitřním,průměrem odpipetovaly do řady sterilních kyvet mikroodstředivky lml aiikvotní podíly buněčné suspenze. Potom, co se buňky v

01-3037-01-Če

d · · · • · · · • ·· • · * • · · «·· · « · každé z kyvet usadily, se z kyvet odstranilo 0,6 ml vyčerpaného média představujícího supernatant. 50 mg Vláken karbidu křemíku (Silar SC-9 vlákna, Advancet Composite Materials Corp., Greer, SC. USA) se protřepáváním suspendovalo v 1 ml modifikovaného N6 média, které bylo-již popsáno výše. 4 0 μΐ Těchto suspendovaných vláken a 25 mg plasmidové nebo lineární DNA obsahující EPSPS expresní kazetu se následně přidalo k usazeným buňkám v každé kývete. Kyvety se 2 až 3x zvířily prstem, po dobu 1 s míchaly v dentálním amalgamovém mixeru Mixomat (Degussa, Ontario, Canada) a následně se do každé kyvety mikroodstředivky přidalo 0,3 ml N6 média (modifikovaného výše popsaným způsobem). Suspendované buňky se následně nanesly (200 μΐ/plotna) na filtrační kotouč překrývající pevné N6 médium (stejné jako popsané modifikované N6 médium, které však postrádalo sorbitol a manitol a naopak obsahovalo 30 g/sacharózy a 3 g/gelritu). Každá plotna se následně přebalila páskou Urgopore (Stelrico, Brusel) a nechal se 1 týden inkubovat ve tmě při teplotě 26 až 28 °C.

Selekce transformantů

Transformovaný kalus se vybral způsobem popsaným v příkladu 12 nebo alternativně způsobem, který popisuje Frame a kol., 1994 s tou výjimkou, že se na místo bialaphos specifikovaného v publikaci, jejímž autorem je Frame a kol'., použil N-(fosfonomethyl) glycin, a to v rozmezí koncentrací 1 až 5 mM.

01-3037-01-Če

4

Regenerace transformantů/propagace a analýza transformovaného rostlinného materiálu

Rostliny se regenerovaly, propagovaly a pěstovaly způsobem uvedeným v příkladu 12. Rostliny se analyzovaly na rezistenci vůči glyfosátu a rostlinný materiál se analyzoval na transgenní přítomnost, integritu a expresi způsobem rovněž popsaným v příkladu 12.

Tabulka 2 Exprese EPSPS transgenu v regenerovatelném kalusu po transformaci, k níž se použila vlákna karbidu křemíku

Následující tabulka ukazuje výsledky EPSPS enzymatického testu (+/- 100 μΜ glyfosátu při 100 μΜ PEP), které se získaly při provádění enzymatických testů extraktů stabilně transformovaného kalusu regenerovatelné A188 x B73 regenerovatelné kukuřice, transformovaného pomocí vláken se ZEN8i DNA. Každá kalusová linie reprezentuje jediný případ, který je testován duplicitně. Vypočetl se poměr skutečné (připouští přibližně 8% inhibici) tolerantní enzymatické aktivity (vyjádřené pomocí transgenu) ku endogenní citlivosti (>98% inhibice + glyfosát). Mutantní EPSPS se exprimovala relativně silně v některých liniích, zejména v liniích 90928sr2-l a 90921sql-l, kde došlo k redukci Wmax tolerantního enzymu vzhledem k w/t (přibližně třetina) a lze tedy odhadnout, že tolerantní enzym se exprimoval v koncentraci 3 až 15X vyšší než je normální úroveň endogenní EPSPS (tento výpočet je komplikovaný vzhledem ke skutečnosti, že v některých vybraných kalusech dochází k expresi transgenu současně se značným ~ 2-3X zvýšením exprese citlivého endogenního enzymu na pozadí). Extrakty použité při tomto enzymatickém testu se rovněž analyzovaly

01-3037-01-Če westernovým způsobem (v tomto případě za použití polyklonálních protilátek proti purifikované Brassica napus EPSPS) a množství EPSPS se kvantifikovalo na základě reakce se standardní křivkou purifikované rýžové EPSPS. Výsledky westernové analýzy se vyjádřily jako násobná celková množství EPSPS vztažená k netransformovanému kukuřičnému kalusu. Ve shodě s výsledky enzymatických testů ukazují výsledky westernové analýzy vysokou úroveň EPSPS exprese například v liniích 90928sr2-l a 90921sql-l.

01-3037-01-Če •9

Linie	DNA konstrukt	Naměřená aktivita (nmol/min/ mg)+ ΙΟΟμΜ glyfosátu (skutečná tolerance = naměřená x 1,08)	Celková aktivita (nmole/mi n/mg) za absence glyfosátu	Poměr (skutečné) tolerance /citlivosti EPSPS	Westernová analýza (x-násobek vzhledem ke kontrole)
90928te5-l	PH8	4,17	10,2	1:2	6
		4,11	16, 93
90928te5-3	PH8	2,01	12,59	1:5	6
		2,16	14,22
90921sb3-l	PH8	2,8	13, 93	1:1,5-3,1	8
		7,08	20,15
90921sql-l	PH8	8,00	20,18	1:0, 9	10
		7,79	15,82
90928sal-l	PH8	0,39	5, 90	1:10	1
		0,60	9, 91
90928sr2-l	PH8	21,67	42,55	1:0,9	17
		21, 66	49,79
90928sd2-l	PH8	6, 69	15,16	1:1	10
		6,28	16,8
Příklad 14 Transformace rýžových linií za použití superbinárního vektoru obsahujícího kmen Agrobacterium,

01-3037-01-Če který zahrnuje EPSPS expresní kazetu mezi pravý a levým okrajem T-DNA; selekce a regenerace rostlinných buněk a rostlin, které jsou rezistentní vůči glyfosátu

U dalšího příkladu se ze zralých semen vhodných linií rýže (například včetně variet Koshihikari, Tsukinehikari a Asanohikari) izolovala scutella, dediferenciovala a takto získaný kalus se transformoval infikací kmenem Agrobacterium. Po selekci a regeneraci se získaly transgenní rostlinky (To), které se nechaly dozrát a po samoopylení nebo křížovém opylení poskytly dceřinné semeno (Tl) pro další pěstování. Rostliny a rostlinný materiál se testovaly na rezistenci proti glyfosátu a analyzovaly na transgenní přítomnost, integritu a expresi způsoby, které byly popsány v předcházejících příkladech. Alternativou již popsaných způsobů jsou níže popsané metody, které v podstatě představují vhodně přizpůsobenou metodu popsanou v příkladu 1 v patentu US 5591616, u které se pro selekci použil na místo hydromycinu glyfosát.

Konstrukce kmene Agrobacterium; příprava suspenze

Agrobacterium

Způsobem popsaným v příkladu 11 se připravil superbinární vektor obsahující kmen Agrobacterium, který měl mezi pravým a levým okrajem požadovanou EPSPS expresní kazetu (za použití elektroporace se Agrobacterium přeneslo s plasmidovou DNA). Suspenze se připravily způsoby popsanými v příkladu 11. Alternativně se transformovaný kmen Agrobaceterium nechal růst 3 dny na AB médiu (Chilton a kol., 1974,Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 71, 3672,-3676) obsahujícím příslušné selekční antibiotikum (například

01-3037-01-Če »9

9 9

9 9 ••99 99 mg/1 spectinomycinu v případě LBA4404 (pSBlZEN13 atd.)) a vyjmul se pomocí očkovací kličky za vzniku suspenze v AAM médiu (Hiei a kol., 1994, The Plant Journal, 6(2), 271282) při hustotě 1-5 x 10⁹ buněk/ml.

Rýžové kultivary, příprava kalusu ze scutelly

Rýžovými kultivátory jsou například Oryza sativa L. Tsukinehikari, Asanohikari a Koshihikari.

Zralá semena se zbavila slupek, povrchově sterilizovala mytím v 70% ethanolu a následně nechala 30 min nasakovat v 1,5% NaOCl. Po opláchnutí ve sterilizované vodě se 3 týdny kultivovala ve tmě při 30 °C na 2N6 médiu, které při pH 5,8 obsahovalo majoritní soli, minoritní soli a vitaminy N6 média (Chu 1978 v Proč. Symp. Plant Tissue Culture., Peking: Science Press, str. 43-50), 30 g/1 sacharózy, 1 g/1 hydrolysátu kaseinu, 2 mg/1 2,4-D a 2 g/1 gelritu. Proliferovaný kalus odvozený ze scutelly semene se až 7 dní subkultivoval na čerstvém 2N6 médiu. Rostoucí kalus (1 až 2 mm v průměru) se vybral, suspendoval ve 2N6 kapalném médiu (bez gelritu) a kultivoval v baňkách ve tmě na rotační protřepávačce (125 min^-1) při 25 °C. Médium se měnilo každých 7 dní. Buňky rostoucí v log fázi se po 3 až transformacích použily pro transformaci.

Infikace, transformace a selekce

Suspendované rýžové kalusové buňky se nechaly v suspenzi usadit a následně resuspendovaly v suspenzi Agrobacteria, ponechaly v kontaktu několik minut a potom se nechaly opět usadit a bez propláchnutí umístily na 2N6-AS

01-3037-01-Ce

·· • · *

• ·♦··

médium (2N6 médium nastavené na pH 5,2 a obsahující 10 g/1 D-glukózy a 100 μΜ acetosyringonu) a 3 až 5 dní inkubovaly ve tmě při 25 °C.

Rostoucí materiál se dokonale propláchnul 250 mg/1 cefotaximu ve sterilizované vodě a následně přenesl na 2N6-CH médium (2N6 médium nastavené na pH 5,8 přidáním KOH, které obsahuje 250 mg/1 cefotaximu a 0,5 až 5 mM N-(fosfonomethyl)glycinu určeného pro tkáňovou kulturu) nebo alternativně na 2N6K-CH médium (2N6 médium modifikované podle Hiei a kol., 1994, u kterého se však použilo na místo hydromycinu 0,5 až 5 mM N-(fosfonomethyl)glycinu určeného pro tkáňovou kulturu) a kultivoval 3 týdny ve tmě při 25 °C. Kolonie, které přežily se subkultivovaly na druhé plotně selekčního média po dalších 7 až 14 dní.

Regenerace a analýza rostlin

Rostoucí kolonie se umístily na regenerační médium, které při pH 5,8 obsahovalo N6 majoritní soli s poloviční sílou, N6 minoritní soli, N6 aminokyseliny, vitaminy AA média (Chiltonn a kol., 1974), 1 g/1 hydrolyzátu kaseinu, 20 g/1 sacharózy, 0,2 mg/1 kyseliny naftalenoctové, 1 mg/1 kinetinu, 3 g/1 gelritu a případně 0,04 až 0,1 mM N-(fosfonomethyl)glycinu. Tyto plotny se inkubovaly při 25 °C a ponechal za kontinuálního osvětlení (přibližně 2000 lux). Jak již bylo popsáno v příkladu 1 regenerované rostliny se eventuálně přemístily do půdy v květnících a nechaly dozrát ve skleníku. Rostliny se pěstovaly a množily (například transgenní rostliny samoopylením) v podstatě stejně jako v příkladu 11. Rostliny se analyzovaly na rezistenci vůči glyfosátu a rostlinný materiál se

01-3037-01-Če analyzoval na transgenní přítomnost, integritu a expresi v podstatě způsobem popsaným v příkladu 11.

Příklad 15 Transformace pšeničných linií pomocí DNA, která obsahuje EPSPS expresní kazetu s použitím mikroprojektilového bombardování; selekce a regenerace rostlinných buněk a rostlin, které jsou rezistentní vůči glyfosátu

U dalšího příkladu se nezralé zárodky izolovaly z vhodných linií pšenice (zahrnujících například jarní pšenici cv Bob White, a Jaggar) , 2 dny inkubovaly na médiu obsahujícím hormon (2,4-D) a transformovaly bombardováním částicemi potaženými DNA. Po periodě izolace a kontinuálního růstu kalusu se kalusové zárodky subkultivovaly řadou médií obsahujících pevnou koncentraci glyfosátu (sériově naředěné) snižující se koncentrace 2,4-D, čímž se indukovala somatická embryogeneze. Vybraný materiál se regeneroval za vzniku osiva na médiu, které rovněž obsahovalo glyfosát, toto osiv se přeneslo do kořenotvorného média a stejně jako v příkladech týkajících se kukuřice se regenerovalo v rostlinkách (To), které se nechaly dozrát a z nichž se buď samoopylením nebo křížovým opylením získala dceřinná semena (TI) pro další pěstování. Rostliny a rostlinný materiál se testovaly na rezistenci vůči glyfosátu a analyzovaly na transgenickou přítomnost, integritu a expresi způsoby popsanými v předchozích příkladech. Jako alternativa k popsaným metodám se použily metody popsané v příkladu 1 patentu US 5631152.

01-3037-01-Če

99 • · · · ♦ »♦ » * * • · ·

9999 99

99

9 9 9

9 9

9 9 · ·9

999 99 9

Příprava nezralých zárodků

Linie pšeničných rostlin (například jarní pšenice Triticum aestivum cv Bob White) se nechaly dozrát ve skleníku 11 až 15 po odkvětu. Obilky se povrchově sterilizovaly 15min ponořením do 5% NaOCl a následně opakovaně propláchly sterilizovanou vodou. Nezralé zárodky se asepticky izolovaly na 3cm čtverce nylonového pletiva (velikost ok 1,5 mm) překrývající A.2 médium. A2 médium nastavené na pH 5,8 je tvořeno 4,32 g/1 Murashigeho a Skoogeho solí, 20 g/1 sacharózy, 0,5 g/1 L-glutaminu, 2 mg/1 2,4-D, 100 mg/1 hydrolysátu kaseinu, 2 mg/1 glycinu, 100 mg/1 myo-inositolu, 0,5 mg/1 kyseliny nikotinové, 0,1 mg/1 thiamin-hydrochloridu a 2,5 g/1 gelritu. Zárodky se přibližně po 50 umístily na pevný 2,5cm kotouč. Plotny se překryly leukoporovou páskou a inkubovaly 2 dny ve tmě při 25 °C. 4 Hodiny před bombardováním se zárodky přenesly na plotny obsahující čerstvé A2 médium obohacené 36,44 g/1 D-sorbitolu a 36,44 g/1 D-mannitolu. Zárodky se přemístily z plotny na plotnu pomocí nylonové sítě, na které spočívaly. Zárodky se na tomto médiu se zvýšenou osmotickou sílou ponechaly 4 hodiny při 25 °C ve tmě a potom se bombardovaly.

Transformace zprostředkovná částicemi purifikovala a zvětšila chromatografií nebo CsCl2 aniontoměničovou densitometrickou

Plasmidová DNA odvozená z pIGPD9 (obr. 12) obsahující Xmal EPSPS expresní kazety (t j. pZEN6i, ZENlOi, atd.) se (například gradienční izolací plasmidové DNA z buněk vhodného HisB-, Rec Ahostitelského kmene E.coli (například DH5a;hisB-) potom, co narostla do stacionární fáze v minimálně 5xA médiu

01-3037-01-Če ····

(K₂HPO₄ 52,5 g, KH₂PO₄ 22,5 g, (NH₄)₂SO₄ 5 g a citrát sodný 2H₂O 2,5 g/1 a použila se jako koncentrovaný roztok (výhodně přibližně 1 mg/ml) ve sterilizované vodě. DNA se použila jako kruhová plasmidová DNA nebo po restrikci pomocí Xma 1 jako lineární fragment obsahující EPSPSexpresní kazetu, které se před použitím purifikovaly elektroforézou na agarovém gelu a elektroelucí.

Částice se připravily a potáhly DNA způsobem podobným způsobu, který popsal Klein a kol., 1987, Nátuře, 327, 70-73. Příprava částic potažených DNA a způsob použití bombardovací pistole je popsán v příkladu 12. Alternativně lze tuto transformaci provádět následujícím způsobem. 60 mg Zlatých nebo wolframových částic (přibližně 1,0 μτη) se v kyvetě mikroodstředivky opakovaně propláchlo ethanolem určeným pro HPLC a následně opakovaně sterilizovanou vodou. Částice se resuspendovaly v 1 ml sterilizované vody a následně rozdělily na 50 μΐ alikvotní podíly a umístily do kyvet mikroodstředivky. Zlaté částice se skladovaly při 4 °C, zatímco wolframové částice při -20 °C. Do každého alikvotního podílu (rozmražených) částic se přidaly 3 mg DNA a obsah kyvet se míchal vířením při maximální rychlosti. Za kontinuálního víření se přidalo 50 μΐ 2,5 M CaCl₂ a 20 μΐ 0,1 M spermicidinu. Po dalších 10 min víření se vzorky 5 min odstřeďovaly v mikroodstředivce Eppendorf, supernatant se odsál a částice se propláchly postupným přidáváním ethanolu určeného pro HPLC. Částice se dokonale resuspendovaly v 60 μΐ ethanolu a následně přemístily v 10μ1 alikvotních podílech na povrch jednotlivých Kaptonových membránových makronosičů, které se použily v pistoli PDS 1000. Součásti pistole PDS 1000 se povrchově sterilizovaly ponořením do 70% ethanolu a sušily na

01-3037-01-Če vzduchu. Cílové plotny připravené výše popsaným způsobem přibližně s 50 zárodky uspořádanými uvnitř v kruhu o průměru přibližně 2,5 cm se umístily do vzdálenosti 6 cm od koncového síta. Pro bombardování se potom použily 7,58MPa disky. Každá plotna se bombardovala lx nebo 2x.

Bombardované plotny se překryly porézní páskou a přibližně 16 hodin ponechaly ve tmě při 25 °C. Zárodky oddělené z izolovaly a povrchu média heliovou šokovou vlnou se rovněž inkubovaly přes noc na čerstvých plotnách se stejným A2 médiem obohaceným mannitolem a sorbitolem. Bombardované zárodky se následně přenesly do čerstvých ploten obsahujících A2 médium a 1 týden inkubovaly ve tmě při 25 °C. Po uplynutí této doby se provedla selekce.

Selekce a regenerace transformantů

Po této regenerační periodě se kalusová embrya odstranila ze sítí a při hustotě 20 explantátů na 1 plotnu přenesla do A2 2P média (A2 médium nastavené na pH 5,8 obsahovalo 2 mM N-(fosfonomethyl)-glycinu). Po uplynutí 1 týdne na A2 2P médiu se kalusy přemístily na AI 2P médium (A2 médium obsahující pouze 1,0 mg/1, 2,4-D a 2 mM N(fosfonomethyl)glycinu) , kde se ponechaly 2 týdny a potom se přemístily na A 0,5 2P médium (A2 médium obsahující pouze 0,5 mg/1 2,4-D a 2 mM N-(fosfonomethyl)-glycinu), kde se ponechaly další 2 týdny. Dvoutýdenní inkubační periody se případně zredukovaly na 1 týden a/nebo se prostřední inkubace na Al 2P médiu vynechala. Případně se zvolila koncentrace N-fosfonomethylglycinu v rozmezí 0,5 až 10 mM, nicméně za výhodnou koncentraci je považována koncentrace

01-3037-01-Če • ·

mM. Celková doba trvání indukce kalusu snižujícími se koncentracemi 2,4-D v médiu dosahuje 2 až 10 týdnů, výhodně až 6 týdnů a nej výhodněji asi 4 týdny.

Ve snaze podpořit maximálně růst osiva a potlačit vývoj kořenů se kalusy následně přemístily do Z média. Z médium je v podstatě A2 médium, ale na místo 2,4-D obsahuje 10 mg/1 zeatinu a dále obsahuje 0,1 mM N-fosfonomethyl)glycinu. Případně se koncentrace N-(fosfonométhyl)glycinu pohybuje v rozmezí od 0,04 do 0,25 mM. Regenerační kalusy se ponechaly v tomto médiu 3 týdny a následně subkultivovaly v momentu, kdy bylo osivo již dobře vyvinuté. Protože na jednom kalusu dojde pravděpodobně k produkci pouze jediného klonu (který reprezentuje jeden zárodek) , přemístí se celý kalus do čerstvé misky a zde se nechá s excidovaným osivem, čímž se zajistí, že z jednoho kalusu vznikne množina klonů, které nebudou počítány jako samostatné případy. Kalusy s pouze částečně vyvinutým osivem nebo bez regeneračních sektorů se vrátí na další týdny do Z média. Na konci této periody se vyřadily neregenerující se kalusy.

Osivo se ponechá na Z médiu, pokud se nevytvoří nebo více dobře vyvinutých listů (jejichž délka dosahuje přibližně 2 cm) . Regenerovaný rostlinný materiál se následně opatrně přemístí do umělohmotných vaniček obsahujících 0,5 MS médium. 0,5 MS médium je při pH 5,8 tvořeno 2,16 g/1 Murashigeho a Skoogeho solí, 15 g/1 sacharózy, 2,5 g aktivního uhlí, 2,5 g/1 gelritu, 1, mg/1 glycinu, 50 mg/1 myo-inositolu, 0,25 mg/1 kyseliny nikotinové, 0,25 mg/1 pyridoxin-hydrochloridu, 0,05 mg/1 thiamin-hydrochloridu a 0,1 mM N-(fosfonométhyl)glycinu (případně 0,0-0,25 mM).

01-3037-01-Če • · · · · · · · · ···· ···· · · · • ·· · · · · • t · · ♦ ···· • · · · · · · ···· ·· ··· ···· ·· ·

Po zakořenění se rostliny mohou přesadit do půdy nebo se přemístí do jednotlivých zkumavek z varného skla obsahujících 0,5MS (bez N-(fosfonomethyl)glycinu) a 2,5 g/1 aktivního uhlí. Přítomnost uhlí v kořenotvorném médiu je výhodná vzhledem k tomu, že uhlí adsorbuje veškeré zbývající PGRs nebo selekční chemikálie přenášené s rostlinkou a vytváří tmavé kořenotvorné prostředí a tím vylučuje vznik fyziologicky neobvyklých zelených kořenů.

Indukce kalusu a první týden regenerace probíhá ve tmě při 25 °C. Druhý týden regenerace probíhá za mírného světla při 25 °C a v následujících týdnech se použije osvětlení o intenzitě přibližně 2500 lux a 16 hodinová světelná perioda.

Propagace, pěstování a analýza transformovaného rostlinného materiálu

Způsoby výroby generace TI a dalšího potomstva jsou v daném oboru dobře známy a jsou popsány v předcházejících příkladech. Způsoby analýzy dědičnosti rezistence vůči glyfosátu a přítomnost, integrita a exprese transgenů jsou rovněž popsány v předchozích příkladech.

Příklad 16 Transformace pšeničných linií pomocí DNA, která zahrnuje EPSPS expresní kazetu, elektroporací protoplastů; selekce a regenerace rostlinných buněk a rostlin, které jsou rezistentní vůči glyfosátu

U tohoto dalšího příkladu se plasmidová nebo lineární DNA obsahující EPSPS expresní kazetu, které jsou identické s DNA použitou v příkladech 12, 13 a 15, použila pro přímou

01-3037-01-Če

transformaci protoplastů linie pšenice, která je schopna se regenerovat do plodících rostlin (cf US 5231019). Izolované protoplasty pšenice, výhodně z tkáně nebo buněk listů v kultuře (cf Gamborg, O.L. a Wetter, L.R., Plant Tissue Culture Methods, 1975, 11-21), se připravily v koncentraci přibližně 2 X 10⁶ protoplastů/ml v 0,4M mannitolu při pH 5,8. Do této suspenze se nejprve přidalo 0,5 ml 40% hmotn./% obj. polyethylenglykolu (PEG) majícího molekulovou hmotnost 6000 v modifikovaném F médiu (Nátur (1982), 296, 72-74) při pH 5,8 a následně se přidalo 65 mi vody obsahující 15 mg požadované plasmidové nebo lineární DNA a 50 mg telecího brzlíku. Směs se inkubovala za příležitostného míchání 30 min při 26 °C a následně naředila v F médiu (Nátuře (1982), 296, 72-74). Protoplast se izoloval nízkorychlostním odstřeďováním, vyjmul ve 4 ml CC kultivačního média (Potrykus, Harms, Lorz, (1979) Theor. Appl. Genet., 54, 209-214) a inkuboval ve tmě při 24 °C.

Alternativně, a kromě ošetření PEG, se transformace obilných protoplastů prováděla pomocí dalších kroků tepelného šoku a/nebo elektroporace (Neumann a kol., (1982), EMBO J., 7, 841-845). Takže například pšeničné protoplasty se inkubovaly ve vodném roztoku DNA a mannitolu, 5 minut ohřívaly na 45 °C a následně během 10 s ochladily na 0 °C. Potom se polyethylenglykol přidával (Mr 3K až 8K) až do finální koncentrace přibližně 8% obj., načež se v elektroporátoru provedlo opatrné ale důkladné promíchání. Komora Dialog „Porator (Dialog, Dusseldorf, Německo) se sterilizovala propláchnutím 70% ethanolem a následným dosušením ve sterilním vzduchu. Suspenze protoplastů (přibližně 2 X 10⁶ protoplastů/ml v 0,4M mannitolu + DNA) se nastavila přidáním chloridu manganatého na měřený elektrický odpor přibližně 1,4 k-ohm. Na vzorky o

01-3037-01-Če

• · · objemu přibližně 0,4 ml se v lOsekondovém intervalech ve třech pulsech aplikovalo napětí 1000 až 2000 V. Takto transformované protoplasty se následné jímaly a naředily opět v CC kultivačním médiu.

Odborníci v daném oboru jsou seznámeni s tím, že lze použít různé permutace a varianty těchto transformačních postupů a že transformaci lze zlepšit zvýšením pH hodnoty na 9,5 a/nebo zvýšením koncentrace vápenatých iontů v roztoku, v němž se transformace provádí.

Po 3 až 14 dnech se alikvotní podíly buněčných kultur přenesly do média obsahujícího alternativní selektivní koncentrace N-(fosfonomethyl)glycinu určeného pro tkáňovou kulturu (Sigma), a to koncentrace 1 až 5 mM (výhodně 2 mM). Takto identifikované rezistenční buněčné kolonie (vykazujících růst na koncentracích glyfosátu alespoň 2x vyšších, než kterou tolerují netransformované kontrolní vzorky) se přenesly do čerstvého agarového média, které rovněž obsahovalo selektivní koncentrace glyfosátu a stejně jako v příkladu 15 se subkultivovaly mezi plotny obsahující postupně se snižující koncentrace 2,4-D. Rostoucí rezistentní kolonie lze analyzovat (pomocí PCR apod.) na přítomnost rekombinantní DNA. V kalusovém kroku je možné, nebo není, větší měrou ovlivnit selekci. V každém případě se všechny rostoucí kalusy použily v následujících krocích.

Rostoucí kalusy se následně přenesly do média určeného pro' regeneraci osiva obsahujícího zeatin a N-(fosfonomethyl) glycin a následně se stejným způsobem jako v příkladu 15 do kořenotvorného média. Potom se úrodné transgenní rostliny exprimující glyfosátově rezistentní EPSP synthasu regenerovaly, vybraly a testovaly v daném

01-3037-01-Če oboru známými postupy a postupy popsanými v příkladu 15 a v příkladu 11.

Příklad 17 Způsob testování EPSPS aktivity a určování kinetických konstant. Způsob testování EPSPS aktivit v surových rostlinných materiálech a odlišení části, která je rezistentní vůči glyfosátu

EPSPS enzymatický test

Testy se prováděly za použití radiochemické metody, kterou navrhl Padgette 1987 (Archives of Biochemistry and Biophysics, 258(2) 564-573) za použití K⁺ iontů jako hlavního druhu kationtového protiionu. Vzorky obsahovaly v celkovém objemu 50 μΐ v 50mM Hepes (KOH) pH 7,0 při 25 °C purifikovaný enzym nebo rostlinný extrakt (viz. níže) naředěný vhodně v Hepes pH 7,0 obsahujícím 10% glycerol a 5mM DTT, ¹⁴C PEP buď jako proměnný substrát (pro kinetická stanovení) nebo fixovaný při 100 nebo 250 μΜ a šikimát-3fosfát (K+ sůl) v koncentraci 2 nebo 0,75 mM. V případě vzorků surových rostlinných extraktů tyto vzorky případně obsahovaly 5 mM KF a/nebo 0,1 mM amoniummolybdátu. Testy se zahájily přidáním ¹⁴C fosfoenolpyruvat(cyklohexylamonium + soli) a ukončily po 2 až 10 minutách (2 minuty jsou výhodné) přidáním 50 μΐ roztoku tvořeného 1 dílem 1M roztoku kyseliny octové a 9 díly ethanolu. Po zastavení se 20 μΐ zavedlo do kolony synchropak AX100 (25 cm x 4,6 mm) a chromatograficky určovalo za použití isokratického elučního činidla a 0,28M fosfátu draselného pH 6,5 jako mobilní fáze proudící 35 minut rychlostí 0,5 ml/min. Za těchto podmínek dosahovala reakční doba pro PEP a EPSP přibližně 19 resp. 25 min. Na konec kolony AX 100 se připojil

01-3037-01-Če • · ·· • · · · • · · scintilační čítač CP 525TR. Tento čítač se napojil na 0,5ml průtokovou komoru a průtok scintilačního činidla (Ultima Flo AP) se nastavil na 1 ml/min. Na základě integrace relativních píkových ploch PEP a EPSP se určila procentická konverze značené PEP na EPSP. Hodnoty K_m a Vmax · se stanovily pomocí nejmenších čtverců, které se zvolily tak, aby odpovídaly hyperbole vzorku odváženého pomocí přístroje Grafit 3.09b od společnosti Erithacus Software Ltd. K_m hodnoty se zpravidla ověřily použitím 8 až 9 koncentrací proměnného substrátu pohybujících se od K_ra/2 do 10 K_m a trojice bodů. Pokud není uvedeno jinak, zahrnují výsledky pouze analýzy, u kterých byla konverze substrátu na EPSP menší než <30 %.

Shikimát-3-Pi (S3P) se připravil následujícím způsobem. Do 7 ml 0,3 M TAPS obsahujícího při pH 8,5 0,05 M Shikimatu, 0,0665 Μ ATP (Na soli), 10 mM KF, 5 mM DTT a 0,05M MgCl2.6H₂O, se přidalo 75 μΐ 77 jednotka (pmol min^-1) ml^-1 roztoku šikimátkinasy. Po 24 h při pokojové teplotě se reakce zastavila rychlým ohřátím na 95 °C. Reakční roztok se 50x naředil v 0,01 M Tris HCL pH 9 a chromatografoval aniontovou výměnou na Dowex 1X8- 400 za použití gradientu 0 až 0,34M LiCl₂. S3P frakce se sloučily, sušily vymrazením a následně opět rozpustily v 7 ml destilované H₂O. Potom se přidalo 28 ml 0,lM Ba (CH3COOH) ₂ a 189 ml bezvodého ethanolu. Tento roztok se míchal přes noc při 4 °C. Výsledná sraženina tri-Barium S3P se jímala a propláchla ve 30 ml 67% ethanolu. Propláchnutá sraženina se následně rozpustila ve 30 ml destilované H₂O. Přidáním K2SO4 se podle potřeby získala buď K⁺ nebo TMA⁺ sůl S3P. Velmi opatrně se přidal minimální přebytek sulfátu. BaSCL sraženina se odstranila a supernatant obsahující požadovanou sůl S3P se vysušil vymrazením. Každá sůl se zvážila a analyzovala

01-3037-01-Če • ·· ·· • · · · · * · protonovou NMR. Takto připravené S3P přípravky měly podle protonové NMR více než 90% čistotu a (podle své hmotnosti a integrace 31P NMR) obsahovaly pouze malé zbytky síranu draselného.

Příprava vhodných extraktů rostlinného materiálu pro EPSPS testy

V dusíkem chlazeném hmoždíři se kalus nebo materiál rostlinky rozemlel na jemný zmrazený prášek. Tento prášek se vyjmul v odpovídajícím objemu vhodně chlazeného extrakčního pufru (například, 50 mM Hepes/KOH pufru při pH 7,5 obsahujícím 1 mM EDTA, 3 mM DTT, 1,7 mM „pefabloc

1,5 mM leupeptinu, 1,5 mM a 1% polyvinyla odstřeďoval v usadily na dně.

(serinproteásový inhibitor), pepstatinu A, 10% obj./obj.glycerolu pyrrolidonu), resuspendoval, zamíchal chlazené odstředivce, kde se zbytky

Supernatant se přemístil dospod pomocí chlazené PD10 kolony Sephadex G25 ve 25 mM Hepes/KOH pufru při pH 7,5 obsahujícím 1 mM EDTA, 3 mM DTT a 10% obj.2/obj. glycerolu. Protein se určil Bradfordovou standardizovanou metodou za použití albuminu bovinního séra. Část extraktu se zmrazila v kapalném dusíku a druhá analyzovala.

část se bezprostředně

EPSPS testy rostlinných extraktů se standardně prováděly výše popsaným způsobem za použití 0,1 mM ¹⁴C-PEP a 0,75 mM šikimát-3-Pi, a to buď v přítomnosti nebo za absence 0,1 mM N-fosfonomethyl)glycinu. Za těchto analytických podmínek se za rezistentní formu EPSPS (viz. níže) považovala forma, která byly inhibována z méně než 8,5 %, zatímco za citlivou w/t formu se považovala forma,

01-3037-01-Če • · která byla vyhubena v podstatě zcela (z více jak 98 %) . Úroveň aktivity pozorovaná v přítomnosti glyfosátu (A) tedy reprezentovala přibližně 92 % koncentrace rezistentního enzymu odvozeného z exprese transgenu, zatímco úrovní citlivosti w/t EPSPS byly celková úroveň EPSPS aktivity pozorovaná za nepřítomnosti glyfosátu, od které se odečetla hodnota A x ~l,08. Protože se odhadlo, že Vmax zralého enzymu představuje pouze přibližně 1/3 Vmax w/t enzymu (a protože se odhadlo, že Km hodnoty pro PEP jak w/t, tak mutantní formy dosahují přibližně 20 μΜ nebo nižší hodnoty), je poměr úrovně exprese polypeptidu mutantního enzymu ku úrovni exprese endogenní w/t EPSPS přibližně 3x vyšší než poměr vypočtený na základě poměrů odpovídajících pozorovaných aktivit. Celková úroveň exprese EPSPS polypeptidu (mutant + w/t) se rovněž stanovila za použití westernové analýzy (viz níže).

Příklad 18 Klonování a exprese w/t a mutované cDNA kódující zralou rýžovou EPSPS v E.coli. Purifikace a charakterizace w/t a mutantní rýžové EPSPS.

Exprese, purifikace a charakterizace w/t zralé rýžové EPSPS

Rýžová EPSPS cDNA se amplifikovala za použití RT-PCR z RNA izolované z rýžové variety Koshihikari pomocí Superscript RT od BRL podle výrobcem doporučeného návodu. PCR se prováděla za použití Pfu turbopolymerasy od společnosti Stratagene metodami doporučenými výrobcem. Při amplifikační reakci a reverzních transkriptasových reakcích se použily následující oligonukleotidy.

SEQ ID No. 23

01-3037-01-Če

9« 9· • · 9 · • 9«

Rýžový 3'oligo 5' GCGCTCGAGTCAGTTCCTGACGAAAGTGCTTAGAACGTCG 3¹

SEQ ID NO. 24

Rýžový 5'oligo s< gcgcatatgaaggcggaggagatcgtgc 3'

PCR produkt se nakloňoval do pCRBlunt II pomocí Zero Blunt TOPO kitu od společnosti Inviterogens. Sekvence inzertu se potvrdila sekvencováním, které ověřilo předpokládaný otevřený čtecí rámec odpovídající otevřenému čtecímu rámci předpokládaného zralého chloroplastového rýžového EPSPS proteinu s výjimkou přítomnosti iniciačního Met. Klonovaná a ověřená rýžová EPSPS sekvence se excidovala pomocí Nde 1 a Xho 1 a purifikovaný fragment se nakloňoval do podobně digerovaného pET24a (Novagen). Rekombinantní klony se zavedly do BL21 (DE3) RP kmenu E.coli s optimalizovaným kodonem, který dodala společnost Stratagene. EPSPS protein se v tomto kmenu exprimoval po přidání 1 mM IPTG do média fermentoru (LB obohacené 100 pg/ml Kanamycinu) . Rekombinantní protein získané hmoty se identifikoval i) na základě obarvení buněčných extraktů SDS gely obarvenými barvivém Coomassie a srovnáním extraktů podobných E.coli buněk obarvených SDS gely obarvenými barvivém Coomassie a transformovaných prázdným pET24a vektorem a ii) westernovou analýzou za použití polyklonální protilátky proti předem purifikovanému rostlinnému EPSPS proteinu. Zralý rýžový EPSPS protein se purifikoval přibližně při 4 °C následujícím způsobem. 25 g Mokrých buněk se propláchlo v 50 ml 0,1 M Hepes/KOH pufru při pH 7,5 obsahujícím 5mM DTT, 2 mM EDTA a 20% % obj ./% obj . glycerolu. Po nízkorychlostním odstřeďování se buněčná peleta resuspendovala v 50 ml stejného pufru, který navíc obsahoval 2 mM serinproteasového inhibitoru

Buňky se rovnoměrně suspendovaly pomocí ,pefabloc . skleněného

01-3037-01-Ce ·· • · • · · · · homogenizéru a následně rozrušily při tlaku 68,9 MPa pomocí buněčného disruptéru Constant Systems (Budbrooke Rd, Warwick, U.K.) Basic Z. Surový extrakt se 1 hodinu odstřeďoval přibližně při 30 000 G a peleta se vyjmula. Protaminsulfát (salmin) se přidával do finální koncentrace 0,2 %, míchal a získaný roztok se nechal 30 min stát. Vysrážený materiál se odstranil odstřeďováním při 30 000 G, které trvalo 30 min. Síran amonný (Aristar) se přidával do konečné koncentrace 40% nasycení míchal 30 min a následně 30 min odstřeďoval při 27 000 G. Peleta se resuspendovala přibližně v 10 ml stejného pufru, který se použil pro rozrušení buněk a do roztoku se přidal síran amonný, kterým se dosáhlo přibližně 70% nasycení roztoku. Roztok se míchal 30 min a odstřeďování opět poskytlo pelety, které se resuspendovaly v přibližně 15 ml S200 pufru (10 mM Hepes/KOH (pH 7,8) obsahující 1 mM DTT, 1 mM EDTA a 20% glycerolu). Tento roztok se přefiltroval chromatograficky eluoval % obj./% obj. (0,45 μπι) a

K26/60 kolonou obsahující Superdex 200 vyvážený S200 pufrem. Frakce obsahující EPSPS se detekovaly na základě EPSPS enzymatické aktivity a po sloučení zavedly do xkl6 kolony obsahující 20 ml HP Q-Sepharosy vyvážený s S200 pufrem.

Kolona se propláchla S200 pufrem a EPSPS se následně eluovala v lineárním gradiendu počínajícím hodnotou 0,0 M a končící hodnotou 0,2 M KC1 ve stejném pufru. EPSPS se eluovala v jediném píku, který odpovídal koncentraci soli 0,lM. nebo nižší. Frakce obsahující EPSPS detekované na základě EPSPS enzymatické aktivity se sloučily a zavedly do HiLoad xk26/60 kolony naplněné Superdexem 75 vyváženým s pufrem Superdex 75 (25mM Hepes/KOH (pH 7,5)obsahujícím 2 mM DTT, 1 mM EDTA a 10% % obj ./% obj. glycerolu). EPSPS se z kolony eluovala později, než by se dalo očekávat na základě

01-3037-01-Če ·· ·· · *· ·· ···· · · ♦ « · · · • ·♦ · · « · ···· · · · · · • · · · · · · ···♦ ·· ··· ···· ·· · 73 molekulové hmotnosti předpokládaného dimeru. To může být způsobeno interakcí proteinu s gelovou matricí při nízké iontové pevnosti. Frakce obsahující EPSPS, identifikované na základě enzymatické aktivity, se sloučily a zavedly do lml kolony MonoQ vyvážené stejným pufrem Superdex.75. Kolona se propláchla startovacím pufrem a EPSPS se eluovala v jediném píku v průběhu 15ml lineárního gradientu 0,0 a 0,2M KC1. V tomto purifikačním stupni se získala EPSPS s více jak 90% čistotou. Případně se EPSPS dále čistila výměnou v pufru Supersex 75 obsahujícím l,0M (Aristar) síran amonný a zavedla do lOml kolony fenylsepharosy vyrovnané stejným pufrem. EPSPS se brzy eluovala jako jediný pík v průběhu lineárního gradientu s klesající koncentrací síranu amonného od 1,0 M do 0,0 M síranu amonného.

Klonování, exprese, purifikace a charakterizace glyfosátově rezistentní mutantní rýžové EPSPS

Rýžová EPSPS cDNA v pCRBluntu se použila jako templát pro dvě další PCR, které se provádějí za použití následujících příměrových párů navržených pro zavádění specifických změn.

SEQ ID No. 25

Rýžová 5'oligo 5' gcgcatatgaaggcggaggagatcgtgc 3*

SEQ ID No. 26

Rýžový mutant reversní k RV

5’ GCAGTCACGGCTGCTGTCAATGATCGCATTGCAATTCCAGCGTTCC 3'

01-3037-01-Če

99 9 99 99 9 • 9 9 9 9 9 9 9 9 999 • 99 9 9 9 9 9

9999 9 9 9 9 9 9

999 99 999

9999 99 «99 9999 99 999

SEQ ID No. 27

Rýžová 3'oligo s* gcgctcgagtcagttcctgacgaaagtgcttagaacgtcg 3'

SEQ ID No. 28

Ryzovy mutant smerem k sal s* ggaacgctggaattgcaatgcgatcattgacagcagccgtgactgc 3

Výsledné produkty se purifikovaly gelem a v ekvimolárních koncentracích umístily do zkumavky, kde slouží jako templát pro další kolo PCRs s rýžovými 5'a 3'oligonukleotidy. Výsledné produkty se nakloňovaly do pCRBlunt II za použití Invitrogeny Zero Blunt TOPO kitu. Potvrdilo se, že DNA inzertu a jeho předpokládaný otevřený čtecí rámec odpovídají DNA sekvenci a otevřenému čtecímu rámci předpokládaného zralého chloroplastového rýžového EPSPS proteinu (s výjimkou přítomnosti iniciačního Met) a že jsou zde rovněž zakódovány požadované změny (specifická mutace T na I a P na S ve specifických pozicích EPSPS sekvence.

Takto klonovaná a ověřená rýžová EPSPS sekvence se excidovala pomocí Nde 1 a Xho 1 a purifikovaný fragment se nakloňoval do podobně digerovaného pET24a (Novagen). Rekombinantní klony se zavedly do BL21 (DE3) RP kmenu E.coli s optimalizovaným kodonem, který dodala společnost Stratagene. EPSPS protein se v tomto kmenu exprimoval po přidání 1 mM IPTG do média fermentoru (LB obohacené 100 pg/ml Kanamycinu). Rekombinantní protein získané hmoty se identifikoval i) na základě obarvení buněčných extraktů SDS gely obarvenými barvivém Coomassie a srovnáním extraktů podobných E.coli buněk obarvených SDS gely obarvenými barvivém Coomassie a transformovaných prázdným pET24a vektorem a ii) westernovou analýzou za použití polyklonální protilátky proti předem purifikovanému rostlinnému EPSPS proteinu. Tato mutantní forma rýžové EPSPS se purifikovala

01-3037-01-Če ·· • 4

4444

4» • 4

4

4444

4 a charakterizovala podobným způsobem jako výše popsaná w/t rýžová EPSPS.

Takto získaná mutantní forma rýžové EPSPS, která se testovala výše popsaným způsobem v přítomnosti 2 mM šikimát-3-Pi, má vlastní Vmax přibližně 10 pm/min/mg a Km pro PEP 22 μΜ. Při 40 μΜ PEP dosahuje hodnota pro draselnou sůl glyfosátu přibližně 0,6 mM. Stanovená Ki hodnota pro glyfosát draselný mutantu EPSPS je přibližně 0,2 μΜ.

Příklad 19 Příprava protilátek pro purifikovanou rýžovou EPSPS a metody westernový analýzy

Pro generování polyklonálních antisér u králíků se použily standardní metody. Pro tyto účely se použily mladé králičí samičky New Zealand Whites. Imunizace se skládala ze 4 dávek (každá obsahovala přibližně 100 mg) podávaných v měsíčních intervalech. Každá dávka ve fosfátem pufrovaném solném roztoku se podávala jako emulze s Freundovým kompletním adjuvansem (dávka 1) nebo nekompletním adjuvansem (dávky 2 až 4) a vstřikovala na 4 subkutánních místech. Před podáním první dávky se provedl kontrolní odběr krve. 14 Dní po podání druhé dávky se provedl další odběr, který měl potvrdit imunitní odezvu. Konečný odběr se provedl 14 dní po aplikaci 4. dávky a použil pro experimentální účely. Pátá a poslední dávka se podala po uplynutí alespoň 6 týdnů od aplikace 4. dávky a finální odběr (který se rovněž použil pro experimenty) se provedl o 14 dní později. Protilátky působí jak proti (i) purifikované nativní zralé w/t rýžové EPSPS (příklad 8), tak rovněž (ii) proti SDS-denaturovanému rýžovému EPSPS polypeptidu, který se eluuje z pásové frakce 12% SDS gelu

01-3037-01-Če

9 9	··	• >·
9 ·	• ·	m ♦ ·	•	• «
•		• ·	•	•
•		• ·	•	•
····	♦ «	··* ··«»	··	•

(správná poloha proteinu je ze stran přesně označena zbarvením pásu barvivém (Coomassie).

Pro SDS gelovou elektroforézu a westernový přenos se použily 12% polyakrylamidové gely. Elektroforéza se prováděla při konstantním proudu 100 V po dobu 90 min. Gely se blotovaly proti nitrocelulózovým deskám přes noc při 4 °C a konstantním napětí 30 V. Desky se blokovaly 1 nebo 2 hodiny v 5% Marvelově fosfátem pufrovaném solném roztoku obsahujícím 0,1% Tween (PBS-tween), 3x propláchly v PBStween a inkubovaly v rýžové EPSPS-Rbl primární protilátce přibližně při 1,3 mg IgG/ml(normálně ekvivalentní k 1:4000 až 1:20 000 naředění krve odebrané 14 dní po 4. dávce). Tato ředění protilátky se aplikovala v PBS (fosfátem pufrovaným solný roztok) obsahujícím 1% Marvel a 0,05% Tween 20 po dobu 2 hodin. Sekundární protilátka, kterou byl kozí antikráličí HRP (Sigma A6154), se aplikovala v koncentracích 1:10 000 nebo 1:20 000 v PBS obsahujícím 0,05% Tween a 1% Marvel. Inkubace sekundární protilátkou trvala 1 hodinu, blot se 3x propláchnul v PBS (0,05 % tween) , ECL substrát se aplikoval obvykle 1 min a film se exponoval 10 až 60 s. Negativními kontrolními bloty byly bloty s (1) preimunitním sérem při ředění vypočteném tak, aby poskytlo stejnou hodnotu [IgG] jakou má testovací imunitní sérum (IgG se běžně purifikuje z alikvotního podílu každého séra a kvantifikuje tak, že lze tato naředění vypočíst přímo) a rovněž (2) s imunitním sérem proti samotnému Freundovu adjvansu. Koncentrace IgG se v kontrolním imunitním séru nastaví tak, že lze srovnání provádět při vhodných koncentracích IgG. Pro tento výpočet se IgG purifikuje ze surového protiséra filtrací přes 0,45pm injekční filtr a vedla dolů lml Hi Trap proteinovou G kolonou (Pharmacia kat. č.: 17-0404-01). Navázaný IgG se

01-3037-01-Če z kolony eluoval pomocí O,1M glycin-HCl pH 2,9 a přes noc dializoval proti PBS. Koncentrace IgG se určila UV determinací, (lem délka dráhy 1 mg ml”¹ roztoku čistého IgG má absorbanci při vlnové délce 280 nm 1,35). Z výtěžku IgG lze vypočíst koncentraci IgG v surovém antiséru a z této koncentrace lze potom vypočíst správná naředění ve westernových blotech.

Vzorky rostlinné tkáně se připravily například způsobem popsaným v příkladu 17.

Pro westernovou analýzu lze alternativně použít mnohem jednodušší metodu. 100 až 200 mg Rostlinné tkáně určené pro analýzu se rychle homogenizovalo (například za použití ultra turrax, Beadbeater nebo skleněného homogenizéru) ve stejném objemu pufru (podobně jako v příkladu 7), 5 min odstřeďovalo v chlazené mikroodstředivce Eppendorf a a) malá část supernatantu se analyzovala pomocí Bradfordovy metody na protein a b) zbývající většina se smísila v poměru 1:1 s Laemli SDS „vzorkovým pufrem, ohřála a následně skladovala ve stavu připraveném pro nanesení na gely. Do 10 jamek se společně s 10 proteinovými vzorky umístily SDS deskové gely. Těmito vzorky jsou zpravidla 1 až 10 pg surové extrakty rostlinného materiálu pro analýzu prováděnou podle standardní křivky mezi 0 až 20 ng čisté rýžové EPSPS. V některých případech se westernová analýza prováděla za použití protilátek vyvinutých proti purifikované w/t EPSPS z Brassica napus (exprimované a purifikované podobnými postupy jako výše popsané protilátky). V tomto případě je intenzita křížové reakce protilátek v případě rýžové EPSPS slabší (nebo v případě endogenní rostlinné pšeničné nebo kukuřičné EPSPS) než v případě, kdy se sice použijí protilátky vyvinuté proti rýžové EPSPS, ale zbývá ještě dostatečný prostor pro reakci použitelnou pro

01-3037-01-Če • · ·« · · · ·· • · · · · * ♦ · ·· • ·· · · · · • · · · · ···· • · · · · · · ···· ·· ······· ·· odvození kvantitativní informace (vztažené ke standardní křivce).

Příklad 20 Izolace genomové DNA z transgenního rostlinného materiálu. PCR analýza. Příprava DNA sondy a hybridizace. Počet kopií a integrita transgenů.

Genomová DNA se izolovala z rostlin, rostlinek a kalusového materiálu například za použití metody, kterou popsal Dellporta a kol., (1983) v Chromosome Structure and Function: Impact of New Concepts, 18'th Stadler Genetics Symposium., J.P. Gustafson and R. Appels, ed. (New York: Plenům Press), str. 263 až 282 nebo alternativně lze použít DNAeasový kit (Qiagen). Transgenní kalus a rostlinné segreganty, které obsahují mutovaný rýžový EPSPS transgen se identifikovaly za použití fluorescenční PCR a oligonukleotidových primerů SEQ ID No. 37 a 38, které mají specifické mutace v rýžové EPSPS genomové sekvenci. Při PCR se použilo fluorescenční barvivo zeleň SYBR, které interkaluje s dvojitým řetězcem DNA, takže vzorky obsahující mutovaný rýžový EPSPS gen se detekují zvýšením fluorescence ve vzorku pomocí přístroje ABI 3377. Odborníci v daném oboru jsou seznámeni s možností fluorescenčního preventivního značení primerů, pro které jsou k dispozici různé technologie, například technologie molekulárních „majáků nebo Scorpions.

SEQ ID No. 29

Rýžová DM přímý 2-3A 5'-gtg gaa cgc tgg aat tgc aat gca at SEQ ID No. 30

Universální reverzní 5'- gtt gca ttt cca cca gca gca gt - 3'

01-3037-01-Če

Typická PCR sestává z (vztaženo k 25μ1 celkovému objemu):

5,0 μΐ gDNA templátu (Qiagen Dneasy prep)

12.5 μΐ 2X SYBR zelený premix

2.5 μΐ 5pmol/pl zásobního přímého primerů

2,5 μΐ 5pmol/pl zásobního reverzního primerů

2,5 μΐ dd H₂O připravených v 96 jamkových optických plotnách uzavřených optickými víčky (PE Biosystems).

Sledovaly	se následující cyklizační parametry:
Stupeň 1:	50 °C po 2 min
Stupeň 2:	95 °C po 10 min
Stupeň 3:	95 °C po 15 s
	60 °C po 45 s

Změny fluorescence ve vzorcích se zaznamenávaly počínaje reakčním stupněm 3 každých 7 s.

Při southernovém blotu se pro každý restrikční digest použilo 10 pg DNA. Genomová DNA se digerovala vhodnými restrikčními enzymy (například Hind III) podle instrukcí výrobce (například Promega). Restrikční enzymy se zvolily tak; že poskytly střih jak uvnitř mutantní EPSPS sekvence, tak vně této sekvence. DNA se separovala za použití TAE (0,04 M tris-acetát, 1 mM EDTA) 0,8% agarosových gelů. Southernový blot se prováděl metodami, které navrhl Sambrook a kol., 1989 za použití HyBond N + nitrocelulosové

01-3037-01-Če ···· · · ♦ · · * · • ·· · · · · ···♦ · 9 · · · • · · · · · · ···· 99 999 9999 99 9 přenosové membrány (AmershamPharmacia). DNA se pomocí UV záření navázala na membránu.

DNA fragmenty použité pro sestrojení specifických sond se izolovaly purifikací na gelech restrikčních digestů plasmidové DNA nebo se generovaly pomocí PCR. Například 700 bp fragment obsahující intron 1 rýžového EPSPS genu se generoval pomocí PCR za použití následujících primerů.

SEQ ID No. 31

INT1/55' cccttcctcttgcgtgaattccatttc 3’

SEQ ID No. 32

INT1/35' gttgtgcccctaataaccagag 3’

Tyto sondy se značily pomocí ³²P za použití metody náhodného postřiku, například „Ready-To-Go-DNA labelling beads (AmershamPharmacia) a purifikovaly, například za použití kolon MicroSpin G-25 (AmershamPharmacia).

Bloty DNA gelů se předhybridizovaly při 65 °C v 5x SSC, 0,5% SDS, 2x Denhardtsově roztoku, 0,15 mg/ml denaturovaného lososové zárodečné DNA po dobu alespoň 1 h.

Blot se následně hybridizoval 16 až 24 h při 65 °C denaturovanou sondou v čerstvém předhybridizačním roztoku. Membrány se přenášely suché a vizualizovaly za použití autoradiografie.

V případech, kdy southernový blot naznačil jedinou integraci transgenu v jediném lokusu označeném sondovou hybridizací s pouze jediným restrikčním fragmentem o specifické velikosti, se výsledek potvrdil rehybridizací blotu za použití alternativní sondy. Pro kontrolu se použil

01-3037-01-Če • 4 · 9 4 4·· 4 · 4 • ·4 · 9 · ·

4 » 4 9 · 4 4 · • 9 4 4 9 4 9 • 4*4 44 444 44*4 44 4 netransformovaný materiál. Blot lze dále sondovat pomocí hybridizačních sond specifických pro další oblasti transgenního konstruktu (například promotor, 5'UTR intron nebo upstream sekvence zesilovače) a tím ověřit integritu konstruktu. V případě, že se použije transformace Agrobacterium, potom lze dále použít specifické sondy, které naznačí přítomnost nebo absenci jakékoliv DNA vybíhající za RB a LB superbinární vektor.

01-3037-01-Če

-82SEQ ID No.33 Rýžová EPSPS genomová (ATG - WT sekvence) •atggcggcgaccatggcgtccaacgccgcggctgcggcggcggtgtccctggaccaggccgtggcggcgtcggcggcgttctc gtcgcggaagcagctgcggctgcccgccgcggcgcgcggggggatgcgggtgcgggtgcgggcgckggggcggcgggaggcgg tggtggtggcgtccgcgtcgtcgtcgtcggtggcagcgccggcggcgaaggcggaggagatcgtgctccagcccatcagggag atctccggggcggttcagctgccagggtccaagtcgctctccaacaggatcctcctcctctccgccctctccgaggtgagacg cggatcccttcctcttgcgtgaattccatttctggagatgagattttagggggtttattaggtgaggtggctgtgtttgcgaa atcctaggaattatctctcaagtcaatctaacgacgagatataactgaggttctggttttaatcacacactcatataaccaac ttattgaaacattttggtttggcataagaaactgcttacgaaggtatgatatcctcctacatgtcaggctactaaattttcac gacggtatgatccactcaaaacaagtttctcaacgagtcCggtgaggtctgttatgaaatttgtgtaaactaaggcaactttg gaggtttcgcactgtaccaatgttatgtttgaacattttgcaagcagtgctttctcccaaaattatgcaatttcgaggctcct ctacatcattataattccccaatacattgctctttattcttaatagctttgatcgcgaaatttaacattttaattcttgagct gttattttgtagcatcagtttatcatgagccatgtttggtactaaatatacaatcccttgggtttatttgtttccaagcatgt cattaacttatcttaatgtggacaagaaactgatgcctgcttacattgctattatttcaagcgggtattgatcctttgacatg tgattgatcatttttttttctctggttattagggcacaacagtggtggacaacttgctgaacagtgaggatgttcactacatg cttgaggccctgaaagccctcgggctctctgtggaagcagataaagttgcaaaaagagctgtagtcgttggctgtggtggcaa gtttcctgttgagaaggatgcgaaagaggaagtgcaactcttcttggggaacgctggaactgcaátgcgaccattgacagcag ccgtgactgctgctggtggaaatgcaacgtatgcttttttttttaatgtttatgaaaatatgtatggaattcatggggtatgt tttatgacctttttctttaccatcagttatgtgcttgatggagtgccacgaatgagggagagaccgattggtgacttggtcgt cgggttgaaacaacttggtgcggatgtcgactgtttccttggcactgaatgcccacctgttcgtgtcaagggaattggaggac ttcctggtggcaaggttagttactcctaaactgcatcctttgtacttctgtatgcacctcaattctttgtcaaccttctgcat ttataaggaacattctatgatgcaattcgaccttacactgcacagtaacttgaaatgtttcatgcttaatcaatatgccatat tcctgccaagctcaagcgagcaatatttgtttgaatttggtaccatatttttgtatatttgggcattcctttttggtcttgat gtcttcttttgaattagcatttaactgaattacactcaacaggttaagctctctggttccatcagcagtcagtacttgagtgc cttgctgatggctgctcctttggcccttggggatgtggagatcgaaatcattgacaaactaatctccattccttacgttgaaa tgacattgagattgatggagcgttttggtgtgaaggcagagcattctgatagttgggacagattctatattaagggagggcag aagtacaagtaagcttctacctgccttactgagctgaattattcgggtgtttatgattaactccctaaactaaccctttttct tttctCtggcattgacagatctcctggaaatgcctatgttgaaggtgatgcctcaagcgcgagctatttcttggctggtgctg caatcactggaggcactgtgacagttcaaggttgtggtacgaccagtttgcaggtataactgtagtgcctgttttgacattct accgtttagtcaagtttagtcagtagtcacatattcagaatatagcacaatctgtattatgccactgttaatcaaatacgctt gacctagagagcgctacataccctagcCtaatcetcaaactaaacagttctcttgtggcttgctgtgctgttatgttccctga cctacatgttaatattacagggtgatgtcaaatttgctgaggtacttgagatgatgggagcaaaggttacatggactgacacc agtgtaaccgtaactggtccaccacgtgagccttatgggaagaaacacctgaaagctgttgatgtcaacatgaacaaaatgcc tgatgttgccatgacccttgccgttgttgcactcttcgctga tggtccaactgctatcagagatggtaaacattaaggcctat tatacctgttctatcatactagcaattactgcctagcattgtgacaaaacaaataaccaaactttcttcaaaataacttagaa atataagaaaggttcgttttgtgtggtaaacagtactactgtagtttcagctatgaagtttgctgctggcaattttctgaacg gtttcagctaaatcgcatgtttgttcatcatacttatccattgtcttccacagtggcttcctggagagtaaaggaaaccgaaa ggatggttgcaattcggaccgagctaacaaaggtaaattcattaggtcccgtgtcctttcattcttcaagtagtttgttcata agctgaattctccttcaatgatgtttaaattcatcatctccttttttggtgttgtgccagctgggagcatcggttgaagaagg tcctgactactgcatcatcaccccaccggagaagctgaacatcacggcaatcgacacctacgatgatcacaggatggccatgg ccttctccctcgctgcctgcgccgacgtgcccgtgacgatcagggaccctggttgcacccgcaagaccttccccaactacttc gacgttctaagcactttcgtcaggaactgaactgagcttttaaaagagtgaggtctaggttctgtegtctgtctgtccatcat ccatgtgttgactgttgaaggaactcgtttcttcttttcttcacgagatgagtttttgtgtgcctgtaatactagtttgtagc aaaggctgcgttacataaggtgatgagaattgaggCaaaatgagatctgtacactaaattcattcagactgttttggcataaa gaataatttggccttctgcgatttcagaagctataaattgccatctcacCaaattctccttggtcctcatggcaatgcaacga cagtgtgaagcactgaagcccgtaatgctctatcaccaccatgtacgacagaaccatatatgtccatatgtacaactcgagtg ttgtctgagtggccagcaaactggctgaccaagccacacgagagagaatactataaactcaatcatacataacaagcccaagc aacattagacagaacacaacaacactcg

01-3037-01-Če

SEQ ID No.34

Rýžová EPSPS genomová (z ATG dvojitý mutant-znázorněný) zahrnuj ící atggcggcgaccatggcgcccaacgccgcggctgcggcggcggtgtccctggaccaggccgtggcggcgtcggcggcgttctc gtcgcggaagcagctgcggctgcccgccgcggcgcgcggggggatgcgggtgcgggtgcgggcgckggggcggcgggaggcgg tggCggtggcgtccgcgtcgtcgtcgtcggtggcagcgccggcggcgaaggcggaggagatcgtgctccagcccatcagggag atctccggggcggttcagctgccagggtccaagtcgctctccaacaggatcctcctcctccccgccctctccgaggtgagacg cggatcccttcctcttgcgtgaattccatttctggagatgagattttagggggtttattaggtgaggtggctgegtttgtgaa atcctaggaattatctctcaagtcaatctaacgatgagatataactgaggttctggctttaatcacacactcatataaccaat;

.ttattgaaacattttggtttggcataagaaaccgctcacgaaggtatgatatcctcctacatgtcaggctactaaattttcac gacggtatgatccactcaaaacaagtttcttaacgagtctggtgaggtctgttatgaaatttgcgtaaactaaggcaactttg gaggtttcgcactgtaccaatgttatgtttgaacattttgcaagcagcgctttctcccaaaattatgcaatcttgaggctcct ctacatcattataattccccaatacattgctctttattcctaatagctttgatcgcgaaatttaacattttaattcttgagct gttattttgtagcatcagtttatcatgagccatgtttggtactaaatatacaatcccttgggtttatttgtttccaagcatgt cattaacttatcttaatgtggacaagaaactgatgcctgcttacattgctattatttcaagcgggtattgatcctttgacatg tgattgatcatttttttttctctggttattagggcacaacagtggtggacaacECgctgaacagtgaggatgctcactacatg cttgaggccctgaaagccctcgggctctctgtggaagcagataaagttgcaaaaagagctgtagtcgttggctgtggtggcaa gtttcctgttgagaaggatgcgaaagaggaagtgcaactcttcttggggaacgctggaaTcgcaatgcgaTcattgacagcag ccgtgactgctgctggtggaaatgcaacgtatgtttttttttttaatgtttatgaaaatatgtatggaattcatggggtatgt tttatgacctttttctttaccatcagttatgtgcttgatggagtgccacgaatgagggagagaccgattggtgacttggttgt cgggCtgaaacaacttggtgcggatgtcgactgtttccttggcactgaatgcccacctgttcgtgtcaagggaaCtggaggac ttcctggtggcaaggttagttacEcctaaactgcatcctttgtacttctgtatgcacctcaattctttgtcaaccttctgcat ttataaggaacattctatgatgcaattcgaccttacactgcacagtaacttgaaatgtttcaCgcctaatcaatatgccatat tcctgccaagctcaagcgagcaatatttgcttgaatttggtaccatatttttgtatatttgggcattcctttttggtcttgat gtcttctttcgaattagcatttaactgaattacactcaacaggttaagctctctggttccatcagcagtcagtacttgagtgc cttgctgatggctgctcctttggcccttggggatgtggagatcgaaatcattgacaaaccaatctccattccttacgttgaaa tgacattgagattgatggagcgttttggtgtgaaggcagagcattctgatagttgggacagatCctatattaagggagggcag aagtacaagtaagcttctacctgccttactgagctgaattacCcgggtgtttatgatcaactccctaaactaaccctttttct tttctttggcattgacagatctcctggaaatgcctatgttgaaggtgatgcctcaagcgcgagctatttcttggctggtgctg caatcactggaggcactgtgacagttcaaggttgtggtacgaccagtttgcaggtataactgtagtgcctgttttgacattct accgcttagtcaagtttagtcagcagtcacacattcagaatatagcacaatctgtattatgccactgttaatcaaatacgctt gacctagagagtgctatataccctagcttaatcttcaaactaaacagttctcttgtggcttgctgtgctgttatgttccctga cccacatgetaatattacagggtgatgtcaaatttgctgaggtacttgagatgatgggagcaaaggttacatggactgacacc agtgCaaccgcaactggtccaccacgtgagccttatgggaagaaacacctgaaagctgttgatgtcaacatgaacaaaatgcc tgacgttgccatgacccttgccgttgttgcactcttcgccgatggtccaactgctatcagagatggtaaacattaaggcctat tatacctgttctatcatactagcaattactgcttagcattgcgacaaaacaaataaccaaactttcttcaaaataacttagaa atataagaaaggttcgttttgtgtggtaaacagtactactgtagtttcagctatgaagtttgctgctggcaatCttctgaacg gtttcagctaaattgcatgtttgttcatcatacttatccattgCcttccacagtggcttcctggagagtaaaggaaaccgaaa ggatggCcgcaattcggaccgagctaacaaaggtaaattcattaggtcccgtgtcctttcattcttcaagtagtttgttcata agttgaactctccttcaatgatgtttaaattcatcatcttcttttttggtgttgtgccagctgggagcatcggttgaagaagg tccegactactgcatcatcaccccaccggagaagctgaacatcacggcaatcgacacctacgatgatcacaggatggccatgg ccttctccctcgctgcctgcgccgacgtgcccgtgacgatcagggaccctggttgcacccgcaagaccttccccaactacttc gacgttctaagcactttcgtcaggaaccgaactgagcttttaaaagagtgaggtccaggttctgetgtctgtctgtccatcat ccatgtgttgactgttgagggaactcgtttcttcttttctCcacgagatgagtttctgtgtgccCgtaatactagttcgtagc aaaggctgcgttacataaggtgatgagaattgaggtaaaatgagatctgtacactaaactcattcagactgttttggcataaa gaataatttggccttctgcgatttcagaagctataaattgccatctcactaaattctccttggtcctcatggcaatgcaacga cagtgtgaagcactgaagcccgtaatgctctatcaccaccatgtacgacagaaccatatatgtccatatgtacaactcgagtg tcgtttgagtggccagcaaactggctgaccaagccacacgagagagaatactataaacCcaatcatacataacaagcccaagc aacattagacagaacacaacaacactcg

01-3037-01-Če • · 44 * • 4 4 4 4 4

4 4 4

4 4 4 4

4 4 4

44444 44 444

SEQ ID No.35 Rýžový GOS2 zesilovač gaatccgaaaagtttctgcaccgttttcacgttctaactaacaatatagggaacgtgtgctaaatataaaatgagaccttata tatgtagcgctgacaactagaactatgtaagaaaaactcaCccacctactttagtggcaatcgggctaaataaaaaagagccg ctacactagtttcgttttccttagtaattaagtgggaaaatgaaatcattactgcttagaatatacgttcacatctctgtcat gaagttaaattattcgaggtagccataattgtcatcaaacccttcttgaataaaaaaatctttctagctgaactcaatgggta aagagagatattttttttaaaaaaatagaatgaagatattctgaacgtatcggcaaagatttaaacatataattatataattt tatagtctgtgcattcgttatatcgcacgtcattaaggacatgtcttactccatctcaatttttatttagtaattaaagacaa ttgacttatttttattatttatcttttttcgattagatgcaaggtacttacgcacacactttgtgctcatgtgcatgtgtgag tgcacctccccaatacacgttcaactagcgacacatctctaatatcactcgcctatctaatacatttaggtagcaatatctga attcaagcactccaccatcaccagaccacttttaataatacctaaaatacaaaaaataattttacagaatagcatgaaaagca tgaaacgaactatttaggtttttcacatacaaaaaaaaaaagaatttCgctcgtgcgcgagcgccaatctcccatattgggca cacaggcaacaacagagtggctgcccacagaacaacccacaaaaaacgatgatctaacggaggacagc

SEQ ID No.36 Ječmenový plastokyaninový zesilovač ccaaaatctcccatgaggagcacctcaatgcccccgggtgccgtgtagatttccacccgacacatatttgttactccttccgt cacagtttataaggcatgcacgtatacctaggtcgccaatttgaccaacttaatgagagacatatattacaaaaaatatatca ttaaaaacttttagatgtactattttgtaatgatataattcttatgttaaacaatatátttnatttaagttaagttgacgacc taggtacacgtgtacgcctcatnaactgtgacggagggagcattgtagctatgaataactttttctacacacttttttgtggg ggaactttttctataaacctgaccacgataataactgcaattcttatctaaaacaaCacetatgttgttccttgtcacggtaa gatacgtaccatggttaatgatggaggtagcttcaaaataaatatctcaagtttaatacacatttatatactagagctaatac aaagttaagacaattatgttgaaacggaagaagtatatatatacaaagttaatagaatgagttggtacatacactatataaat agtggagcgtggaggcgatcgagtgaatgtatacgtcgcagccgtggagaagacgaggaggggatcatgtgtttgtggaccat atatattatgatgaggacatgcatgtggagacatatatatatggatgggatgatactgggctacctcacctcatccggatgga gaggcgg

SEQ ID No.37 Rýžová genomová G1 EPSPS (k ATG) gttggttggtgagagtgagacaccgacggaacggaaggagaaccacgccgcttggatCtttcCCttttaccctCtcaaatCtt aatttaaaaaataaaaccattttaaaaacttatcttcaaatacaaatcttttaaaaacaccaacacgtgacacacagcgggca cgtcacccaaacgggcgtgacaatattgttttgccacaccaatccagctggtgtggacaaaatgEtcatatattgaaaataaa atttaaaacaatttatattttttatctatatcattataaaaattgaagatgtttttaccggtattttgttactcatttgtgca tgagtcggtttttaagtttgttcgcttttggaaatacatatccgtatttgagtatgtttttaagttcgttcgttttttgaaat acaaaaggaatcgtaaaataaatctattttaaaaaactcgcatgctaacttgagacgatcgaactgctaattgcagctcataa ttttccaaaaaaaaatatatccaaacgagttcttatagtagatttcaccttaattaaaacatataaatgttcacccggtacaa cgcacgagtatttttataagtaaaattaaaagtttaaaataaataaaaatcccgccaccacggcgcgatggtaaaagggggac gcttccaaacgggccgggcacgggacgatcggccccgaacccggcccatctaaccgctgtaggcccaccgcccaccaatccaa ctccgtactacgtgaagcgcCggatccgcaacccgttaagcagtccacacgacccgactcgactcgcgcactcgccgCggtag gtggcaacccCtcttcctcctcCattccctcttcttcctcccttctccgccCcaccacaccaaccgcaccaaccccaaccccg cgcgcgctctcccctctcccctcccaccaaccccaccccatcctcccgacctccacgccgccggcaatg

SEQ ID No.38 Rýžová genomová G3 EPSPS (k ATG) ttaactaaaacatataaatgttcacccggtacaacgcacgagtatttttataagtaaaattaaaagtttaaaaCaaataaaaa tcccgccaccacggcgcgatggtaaaagggggacgcttctaaacgggccgggcacgggacgatcggccccgaacccggcccat ctaaccgctgtaggcccaccgcccaccaatccaactccgtactacgtgaagcgctggatccgcaacccgttaagcagtccaca cgacccgactcgactcgcgcactcgccgtggtaggtggcaacccCtcttcctcctctatttcCtcttcttcctcccttctccg

01-3037-01-Če • · cctcáccacaccaaccgcaccaaccccaaccccgcgcgcgctctcccctctcccctcccaccaaccccaccccatcctcccga cctccacgccgccggcaatg

SEQ ID No.39 Rýžová genomová G2 EPSPS + kukuřičný Adh 1 nitron gccacaccaatccagctggtgtggacaaaatgttcatatattgaaaataaaatttaaaacaatttatattttť.tatctatatc attataaaaattgaagatgtttttaccggtattttgttactcatttgtgcatgagtcggtttttaagtttgttcgcttttgga aatacatatccgtatttgagtatgtttttaagttcgttcgttttttgaaatacaaaaggaatcgtaaaataaatctattttaa aaaacccgcatgctaacttgagacgatcgaactgctaattgcagctcataattttccaaaaaaaaatatatccaaacgagttc ttatagtagatttcaccttaattaaaacatataaatgttcacccggtacaacgcacgagtatttttataagtaaaattaaaag tttaaaataaataaaaatcccgccaccacggcgcgatggtaaaagggggacgcttctaaacgggccgggcacgggacgatcgg ccccgaacccggcccatctaaccgctgtaggcccaccgcccaccaatccaactccgtactacgtgaagcgctggatccgcaac ccgttaagcagtccacacgactcgactcgactcgcgcactcgccgtggtaggtggcaaccct tet tcc tcctc tatt tet tec tcttcctcccttctccgcctcaccacaccaaccgcaccaaccccaaccccgcgcgcgctctcccctctcccctcccaccaacc ccaccccatcctcccgacctccacgccgccggcaggatcaagtgcaaaggtccgccttgtttctcctctgtctcttgatctga ctaatcttggtttatgattcgttgagtaattttggggaaagctagcttcgtccacagtttttttttcgatgaacagtgccgca gtggcgctgatcttgtatgctatcctgcaatcgtggtgaacttatttcttttatatccttcactcccatgaaaaggctagtaa tctttctcgatgtaacatcgtccagcactgctattaccgtgtggtccatccgacagtctggctgaacacatcatacgatattg agcaaagatctatcctccctgttctttaatgaaagacgtcattttcatcagtatgatctaagaatgttgcaacttgcaaggag gcgtttctttctttgaatttaactaactcgttgagtggccctgtttctcggacgtaaggcctttgctgctccacacatgtcca ttcgaattttaccgtgtttagcaagagcgaaaagtttgcatcttgatgatttagcttgactatgcgattgctttcctggaccc gtgcagctgcggatg

SEQ ID No.40 Kukuřičný Adh 1 nitron gtccgccttgt ttc tecte tg tctcttgatctgactaatcttggtttatgattcgttgagtaattttggggaaagctagcttc gtccacagtttttttttcgatgaacagtgccgcagtggcgctgatcttgtatgctatcctgcaatcgtggtgaacttatttct tttatatccttcactcccatgaaaaggctagtaatctttctcgatgtaacatcgtccagcactgctattaccgtgtggtccat ccgacagtctggctgaacacatcatacgatattgagcaaagatctatcctccctgttctttaatgaaagacgtcattttcatc agtatgatctaagaatgttgcaacttgcaaggaggcgtttctttctttgaatttaactaactcgttgagtggccctgtttctc ggacgtaaggcctttgctgctccacacatgtccattcgaattttaccgtgtttagcaagagcgaaaagtttgcatcttgatga tttagcttgactatgcgattgctttcctggacccgtgcag

01-3037-01-Če

Claims (51)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   1. Izolovaný polynukleotid obsahující sekvenci SEQ ID No. 33.
2. 2. Polynukleotid kódující EPSPS s výjimkou cDNA kódující rýžovou a kukuřičnou EPSPS, který je komplimentární s polynukleotidem, který, pokud se inkubuje při teplotě 65 °C až 70 °C v 0,1 silným citrátem pufrovaném solném roztoku obsahujícím 0,1% SDS a následně opláchne při stejné teplotě 0,1 silným citrátovým roztokem obsahujícím 0,1% SDS, stále hybridizuje se sekvencí SEQ ID No. 33.
3. 3. Polynukleotid kódující EPSPS jinou než kukuřičnou EPSPS, který lze získat screenováním rostlinných genomových DNA knihoven poly-nukleotidem tvořícím intron v sekvenci SEQ ID No. 33.
4. 4. Izolovaný polynukleotid obsahující oblast kódující chloroplastový transitní peptid a glyfosátově rezistentní 5-enolpyruvylšikimátfosfátsyntázu (EPSPS) 3' tohoto peptidu, přičemž uvedená oblast je pod expresní kontrolou rostlinného operativního promotoru za předpoklad, že uvedený promotor není heterologní s uvedenou oblastí a chloroplastový transitní peptid není heterologní s uvedenou syntézou.

   01-3037-01-Ce ··
5. 5. Polynukleotid podle některého z nároku 1 až 4 obsahující následující složky v 5'-> 3'transkripce:

   (i) alespoň jeden transkripční zesilovač, kterým je zesilující oblast ležící za transkripčním startem sekvence, ze které se zesilovač získal, přičemž zesilovač jako takový nemá funkci promotoru buď v sekvenci, ve které je endogenně obsažen nebo pokud je přítomen heterologně jako část konstruktu;

   (ii) promotor z rýžového EPSPS genu;

   (iii) rýžovou genomovou sekvenci, která kóduje rýžový EPSPS chloroplastový transitní peptid;

   (iv) genomovou sekvenci, která kóduje rýžovou EPSPS;

   (v) transkripční terminátor;

   přičemž rýžovou EPSPS kódující sekvence je modifikována tak, že má v první poloze Ile zbytek a nikoliv Thr a v druhé poloze má Ser zbytek a nikoliv Pro, přičemž tyto mutace jsou zavedeny do EPSPS sekvencí, které obsahují následující konzervovanou oblast GNAGTAMRPLTAAV v enzymu standardního typu, takže modifikovanou sekvenci lze číst jako GNAGIAMRSLTAAV.
6. 6. Polynukleotid podle nároku 5, ve kterém zesilovač obsahuje sekvenci jejíž 3'konec je tvořen alespoň 40 nukleotidy, které leží nejblíže transkripčnímu startu sekvence, ze které se zesilovač získal, proti směru transkripce.
7. 7. Polynukleotid podle nároku 5 nebo 6, ve kterém zesilovač obsahuje oblast jejíž 3'konec je tvořen alespoň

   01-3037-01-Če nukleotidy, které leží nejblíže transkripčnímu startu, proti směru transkripce.
8. 8. Polynukleotid podle nároku 5, ve kterém zesilovač obsahuje sekvenci jejíž 3'konec je tvořen alespoň 10 nukleotidy počítáno od prvního nukleotidu TATA konce sekvence, ze které je zesilovač získán, proti směru transkripce.
9. 9. Polynukleotid podle některého z nároků 1 až 8 obsahující první a druhý transkripční zesilovač.
10. 10. Polynukleotid podle nároku 9, ve kterém první a druhý zesilovač jsou v polynukleotidu přítomny v tandemu.
11. 11. Polynukleotid podle některého z nároků 1 až 10, ve kterém 3'konec zesilovače, nebo prvního zesilovače tvoří přibližně 100 až 1000 nukleotidů počítáno od kodonu odpovídajícího translačnímu startu EPSPS transitního peptidu nebo prvního nukleotidu intronu v 5'oblasti, která nepodlehla translaci, proti směru transkripce.
12. 12. Polynukleotid podle některého z nároků 1 až 11, ve kterém 3'konec zesilovače, nebo prvního zesilovače tvoří přibližně 150 až 1000 nukleotidů počítáno od kodonu odpovídajícímu translačnímu startu EPSPS transitního

    01-3037-01-Če « ·

    4« » *· 4« • » · · · 4 · · · · • ·· · 4 « 4 • · · * · · · · · • * » O · 9 9

    999 9 99 9999999 99 9 peptidu nebo prvního nukleotidu intronu v 5'oblasti, která nepodlehla translaci, proti směru transkripce.
13. 13. Polynukleotid podle některého z nároků 1 až 12/ ve kterém 3' konec zesilovače, nebo prvního zesilovače tvoří přibližně 300 až 950 nukleotidů počítáno od kodonu odpovídajícímu translačnímu startu EPSPS transitního peptidu nebo prvního nukleotidu intronu v 5'oblasti, která nepodlehla translaci, proti směru transkripce.
14. 14. Polynukleotid podle některého z nároků 1 až 13, ve kterém 3' konec zesilovače, nebo prvního zesilovače tvoří přibližně 770 až 790 nukleotidů počítáno od kodonu odpovídajícímu translačnímu startu EPSPS transitního peptidu nebo prvního nukleotidu intronu v 5'oblasti, která nepodlehla translaci, proti směru transkripce.
15. 15. Polynukleotid podle některého z nároků 1 až 13, ve kterém 3' konec zesilovače, nebo prvního zesilovače tvoří přibližně 300 až 380 nukleotidů počítáno od kodonu odpovídajícímu translačnímu startu EPSPS transitního peptidu nebo prvního nukleotidu intronu v 5'oblasti, která nepodlehla translaci, proti směru transkripce.
16. 16. Polynukleotid podle některého z nároků 1 až 13 a 15, ve kterém 3' konec zesilovače, nebo prvního zesilovače tvoří přibližně 320 až 350 nukleotidů počítáno od kodonu odpovídajícímu translačnímu startu EPSPS transitního

    01-3037-01-Če ** 4* • * · 4 · • 4« · ·4

    4 4

    44*4 44 4 • 4 44

    4 4 4 4

    4 4

    4 4 4

    4 4 peptidu nebo prvního nukleotidu intronu v 5'oblasti, která nepodlehla translaci, proti směru transkripce.
17. 17. Polynukleotid podle některého z nároků 1 až ’16, kde oblast sousedící s promotorem z rýžového EPSPS genu, proti směru transkripce, obsahuje alespoň jeden zesilovač odvozený ze sekvence, která sousedí s transkripčním startem ječmenového plastokyaninového nebo GOS2 promotor proti směru transkripce.
18. 18. Polynukleotid podle nároku 17 obsahující v 5' 3' směru první zesilovač zahrnující transkripční zesilující oblast odvozenou ze sekvence, která sousedí s transkripčním startem rýžového aktinového promotoru, proti směru transkripce, a druhý zesilovač obsahující transkripční zesilující oblast odvozenou ze sekvence, která sousedí s transkripčním startem GOS 2 promotoru, proti směru transkripce.
19. 19. Polynukleotid podle nároku 17 obsahující v 5' -> 3'směru první zesilovač zahrnující transkripční zesilující oblast odvozenou ze sekvence, která sousedí s transkripčním startem GOS 2 promotoru, proti směru transkripce, a druhý zesilovač obsahující transkripční zesilující oblast odvozenou ze sekvence, která sousedí s transkripčním startem ječmenového plastokyaninového promotoru, proti směru transkripce.

    01-3037-01-Če
20. 20. Polynukleotid podle některého z nároků 4 až 19, kde jsou nukleotidy 5' kodonu, který tvoří translační start rýžového EPSPS chloroplastového transitního peptidu, výhodně Kozack.
21. 21. Polynukleotid podle některého z nároků 4 až 20, ve kterém se v 5' rýžové genomové sekvenci, která kóduje rýžový EPSPS chloroplastový transitní peptid, nachází oblast, která nepodlehla translaci a která obsahuje sekvenci působící jako intron.
22. 22. Polynukleotid podle nároku 21, ve kterém oblast, která nepodlehla translaci, obsahuje intron, přičemž intronem je kukuřičný ADHI intron.
23. 23. Polynukleotid podle nároků 21 nebo 22, kde oblast, která nepodlehla translaci obsahuje sekvenci SEQ ID No. 40.
24. 24. Polynukleotid podle některého z nároků 4 až 23, který obsahuje virově odvozený translační zesilovač, který se nachází v oblasti 5' rýžové genomové sekvence, která nepodlehla translaci a která kóduje rýžový EPSPS chloroplastový transitní peptid.
25. 25. Polynukleotid podle některého z nároků 4 až 24, který dále obsahuje oblasti kódující proteiny, které jsou schopny udělit rostlinnému materiálu, který ho obsahuje

    01-3037-01-Če • · ·· · ·· · · · • ·· · ··· · · · ·· ··· · · · · · ···· · ···· · • · · ·· · · · ···· ·· ··· ···· ·· ··· alespoň jednu z následujících zemědělsky žádaných vlastností: rezistenci proti hmyzu, houbám, virům, bakteriím, hlístům, stresu, vysychání a herbicidům.
26. 26. Polynukleotid podle nároku 25, kdy herbicid je jiný než glyfosát.
27. 27. Polynukleotid podle nároku 25 nebo 26, kdy oblasti udílející rezistenci proti hmyzu kódují z krystalické toxiny odvozené z Bt, včetně vylučovaných Bt toxinů; inhibitoru proteasy, lektinů, Xenhorabdus/Photorhabdus toxinů; oblasti propůjčující rezistenci proti houbám a plísním se zvolí ze skupiny tvořené geny kódujícími známé AFPs, defensivy, chytanasu, glukanasu, Avr-Cf9; oblasti poskytující rezistenci proti bakteriím se zvolí ze skupiny sestávající z oblastí kódujících cekropiny a techyplesin a jejich analogy; oblasti poskytující rezistenci proti virům se zvolí ze skupiny sestávající z genů kódujících proteiny virových obalů, pohybové proteiny, virové replikace a protismyslné a rybozimové sekvence, o kterých je známo, že poskytují rezistenci proti viru; zatímco geny poskytující odolnost proti stresu, soli a suchu lze zvolit z genů kódujících glutathion-S-transferasu a peroxidasu, sekvence, která tvoří známou CBF1 regulační sekvenci, a genů, o nichž je známo, že poskytují akumulaci trehalosy.
28. 28. Polynukleotid podle nároku 27, kde se oblasti v poskytující rezistenci proti hmyzu zvolí ze skupiny sestávající z crylAc, crylAb, cry3A, Vip 1A, Vip 1B, cisteinproteasového inhibitoru a lectinových genů odvozených ze sněženky.

    01-3037-01-Če • · · · ···· ··· • ·· · · · · ···· · · · · · • · · · · · · ···· ·· ··· ···· ·· ·
29. 29. Polynukleotid podle některého z předcházejících nároků, který je modifikován tak, že jsou odstraněny mRNA nestabilní motivy a/nebo nežádoucí oblasti sestřihu; nebo pro úrodu výhodné kodony se použijí tak, že exprese takto modifikovaného polynukleotidu v rostlině poskytne podobný protein mající podobnou aktivitu/funkci jako v případě, kdy se protein kódující oblasti nemodifikovaného nukleotidu exprimují v organismu, ve kterém jsou endogenní.

    Polynukleotid podle některého z předcházejících nároků, kde je stupeň identity mezi modifikovaným polynukleotidem a polynukleotidem endogenně obsaženým v uvedené rostlině a kódujícím v podstatě stejný protein takový, aby zabránil ko-supresi mezi modifikovanou a endogenní sekvencí.
30. 31. Polynukleotid podle předcházejícího nároku, kde je stupeň integrity nižší než přibližně 70 %.
31. 32. Vektor obsahující polynukleotid podle některého z předcházejících nároků.

    '
32. 33. Rostlinný materiál transformovaný polynukleotidem podle některého z nároků 1 až 31 nebo vektorem podle nároku 32.

    01-3037-01-Če
33. 34. Rostlinný materiál transformovaný polynukleotidem podle některého z nároků 1 až 31 nebo vektorem podle nároku 32 a který byl nebo je nadále transformován polynukleotidem obsahujícím oblasti kódující proteiny, který je schopen poskytnout rostlinnému materiálu, ve kterém je obsažen alespoň jednu z následujících zemědělsky žádaných vlastností: odolnost proti hmyzu, houbám, virům, bakteriím, hlístům, stresu, vysychání a herbicidům.
34. 35. Morfologicky normální úrodné celé rostliny regenerované z materiálu podle nároku 33 nebo 34, jejich dceřinná semena a části.
35. 36. Morfologicky normální úrodné celé rostliny, které obsahují polynukleotid podle některého z nároků 1 až 31 a které jsou výsledkem křížení rostlin regenerovaných z materiálů transformovaného polynukleotidem podle některého z nároků 1 až 31 nebo vektorem podle nároku 32 a rostliny které se transformovaly polynukleotidem obsahujícím oblasti kódující proteiny, který je schopen poskytnout rostlinnému materiálu, ve kterém je obsažen alespoň jednu z následujících zemědělsky žádaných vlastností: odolnost proti hmyzu, houbám, virům, bakteriím, hlístům, stresu, vysychání a herbicidům, potomstvo výsledných rostlin, jejich semena a části.
36. 37. Rostliny podle nároku 35 nebo 36 zvolené ze skupiny sestávající z polních plodin, ovoce a zeleniny, jakými jsou například řepka, slunečnice, tabák, cukrová řepa, bavlna, kukuřice, pšenice, ječmen, rýže, čirok, rajčata, mango, broskve, jablko, hruška, jahody, banány,

    01-3037-01-Če ·· ·· · ·· · · • ♦ · · · · · · · · • · · · · · · • · · · · · · ···· ·· «·· ···· ·· meloun, brambory, mrkev, hlávkový salát, kapusta, cibule, sója, cukrová třtina, hrách, fazole polní, topol, vinná réva, citrusy, vojtěška, žito, oves, luční a krmná tráva, len a řepka olejka, a rostliny produkující kořeny, pokud již nebyly specificky zmiňovány, jejich potomstvo, semena a části.
37. 38. Kukuřičné rostliny podle některého z nároků 35 až 37.
38. 39. Způsob selektivní kontroly plevelů na poli, na kterém jsou obsaženy plevely a rostliny nebo jejich potomstvo podle některého z nároků 35 až 38 vyznačený tím, že se na pole aplikuje herbicid glyfosátového typu v množství dostatečném pro kontrolu plevelů bez podstatnějšího poškození rostlin.

    který dále fungicidu,
39. 40. Způsob podle předchozího nároku, zahrnuje aplikaci herbicidu, insekticidu, nematocidu, bakteriocidu a/nebo antivirového činidla na pole před nebo po aplikaci glyfosátového herbicidu.
40. 41. Způsob generování rostlin, které jsou v podstatě tolerantní nebo v podstatě rezistentní proti glyfosátovému herbicidu vyznačený tím, že zahrnuje:

    (i) transformování rostlinného materiálu polynukleotidem podle některého z nároků 1 až 31 nebo vektorem podle nároku 32;

    01-3037-01-Če • 9 • 9 9 9 · 9 · · · «99

    99 · 9 9 9 9 • 9 9 9 9 9·«· 9

    994 94 ··· ···· ·· 994 ···· 99 999 (ii) selekce takto transformovaného materiálu ;a (iii) regenerace takto vybraného materiálu v morfologicky normálních úrodných celých rostlinách.
41. 42. Způsob podle předcházejících nároků vy z n ač e n ý tím, že transformace zahrnuje zavedení polynukleotidu do materiálu:

    (i) biolistickým bombardováním materiálu částicemi potaženými polynukleotidem; nebo (ii) inpalementem materiálu na vláknech karbidu křemíku, která jsou potažena roztokem obsahujícím polynukleotid; nebo (iii) zavedením polynukleotidu nebo vektoru do Agrobacterium a kokultivací takto transformovaného Agrobacterium rostlinným materiálem, který se tímto transformuje a následně regeneruje.
42. 43. Způsob podle předcházejícího nároku vy z n ač e n ý tím, že se transformovaný materiál zvolil na základě své rezistence vůči glyfosátu.
43. 44. Použití polynukleotidu podle některého z nároků 1 až 31 nebo vektoru podle nároku 32 při produkci rostlinných tkání a/nebo morfologicky normálních úrodných celých rostlin, které jsou v podstatě tolerantní nebo v podstatě rezistentní vůči glyfosátovému herbicidu.

    01-3037-01-Če ·· ·· · ·· ··

    V J. w s 9«·9 99·4·· • · · < 9 9 9

    99·· 9 · » · ·

    9 9 9 9 9 9

    9999 ·· 999 ···· 9·
44. 45. Použití polynukleotidu podle některého z nároků až 31 nebo vektoru podle nároku 32 při produkci herbicidního cíle pro vysoce výkonné in vitro screenování potenciálních herbicidů.
45. 46. Způsob selekce biologického materiálu transformovaného tak, že exprimuje požadovaný gen, přičemž transformovaný materiál obsahuje polynukleotid podle některého z nároků 1 až 31 nebo vektor podle nároku 32, přičemž selekce zahrnuje vystavení transformovaného materiálu účinkům glyfosátu nebo jeho soli a výběr přežívajícího materiálu.
46. 47. Způsob podle předcházejícího nároku, vy z n ač e n ý tím, že biologický materiál je rostlinného původu.
47. 48. Způsob podle předcházejícího nároku vy z n ač e n ý tím, že rostlina je jednoděložná.
48. 49. Způsob podle předcházejícího nároku vy z n ač e n ý tím, že se jednoděložná rostlina zvolí ze skupiny sestávající z ječmene, pšenice, kukuřice, rýže, ovsa, žita, čiroku, ananasu, cukrové třtiny, banánů, cibule, chřestu, pórku.

    01-3037-01-Če
49. 50. Způsob regenerace úrodné transformované rostliny obsahující cizí DNA vyznačený tím, že zahrnuj e:

    (a) produkci regenerovatelné tkáně z rostliny, která má být transformovaná (b) transformaci regenerovatelné tkáně cizí DNA, přičemž cizí DNA obsahuje volitelnou DNA sekvenci, která působí v regenerovatelné tkáni jako výběrové zařízení;

    (c) umístění regenerovatelné tkáně z kroku (b), 1 den až 60 dní po kroku (b) , do média, ve kterém je tkáň schopna produkovat semena, přičemž uvedené médium dále obsahuje sloučeninu použitou pro výběr regenerovatelné tkáně obsahující volitelnou DNA sekvenci, která umožní identifikovat nebo vybrat transformovanou regenerovanou tkáň;

    (d) po vytvoření alespoň jednoho semene z vybrané tkáně z kroku (c) se toto semeno přemístí do druhého média, které umožní zakořenění semene a růst rostlinky, přičemž druhé médium případně opět obsahuje sloučeninu použitou pro výběr regenerovatelné tkáně; a (e) růst uvedené rostlinky a získání transgenní rostliny, ve které se cizí DNA přenáší na dceřinné rostliny mendelovým způsobem a cizí DNA nebo selektovatelná DNA sekvence obsažená v cizí DNA obsahuje polynukleotid podle některého z nároků 1 až 34 a zmíněnou sloučeninou je glyfósát nebo jeho sůl.
50. 51. Způsob podle předcházejícího nároku vy z n ač e n ý tím, že rostlinou je jednoděložná rostlina

    01-3037-01-Če zvolená ze skupiny sestávající z banánu, pšenice, rýže, kukuřice a ječmene.
51. 52. Způsob podle nároku 50 nebo 51vyznače-ný tím, že se regenerovatelná tkáň zvolí ze skupiny sestávající embriogenních kalusů, somatických embryí, nezralých embryí atd.

    Zastupuje:

    01-3037-01-Če í ·* ’ ^: · • · · · · · · ···· ·· ··· ·♦·· ·· · <

    z

    Q υ

    co

    P4

    CO

    CM

    W 'Ctí >

    O g

    O d

    a CV Cn # 'CÚ >

    o >N '£1

    Pí sr

    LO

    CM

    CO

    1/15

    01-3037-01-Če • ·· ·

    Pst 1(7590) o

    CC

    Translační start

    CM <§

    2/15

    01-3037-01-Če • · ·· ·· * · ·