CN105008541A - 用于生长素类似物缀合的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了组合物和方法以通过使用具有氨基酸/生长素类似物除草剂缀合活性的至少一种GH3多肽来对生长素类似物除草剂解毒。在存在生长素类似物除草剂的情况下，这种GH3多肽将产生具有降低的除草活性的氨基酸/生长素类似物缀合物。本发明提供了采用所述GH3多肽和编码所述GH3多肽的所述多核苷酸的各种方法。此类方法包括对生长素类似物除草剂解毒的方法，所述方法包括将生长素类似物除草剂施加于植物、植物细胞或种子，其中所述植物、植物细胞或种子包含编码GH3多肽的异源多核苷酸，并且所述GH3多肽的表达产生非除草性的天冬氨酸/生长素类似物缀合物或谷氨酸/生长素类似物缀合物。本发明提供了用于在包含作物或所述作物的种子的耕作区中控制至少一种杂草的另外的方法，同样提供了对具有生长素类似物除草剂的被污染材料解毒的方法。

Description

用于生长素类似物缀合的组合物和方法
相关专利申请的交叉引用
本申请要求提交于2012年12月21日的美国临时申请No.61/740,759；提交于2013年3月12日的美国临时申请No.61/777,045；以及提交于2013年3月14日的美国临时申请No.61/781,996的权益；这些申请中的每一者全文以引用方式并入本文中。
技术领域
本发明属于分子生物学领域。更具体地讲，本发明涉及用于通过使用GH3多肽或其活性变体或片段对生长素类似物除草剂解毒的方法和组合物。
对通过EFS-WEB作为文本文件提交的序列表的引用
通过EFS-Web以电子方式将序列表的正式文本作为ASCII格式的序列表提交，该文件名称为431145SEQLIST.txt，创建日期为2013年12月19日，文件大小为716KB，并且该文件与本说明书同时提交。该ASCII格式文档中所含的序列表是本说明书的一部分，并且全文以引用的方式并入本文。
背景技术
在作物的商业生产中，希望从作物植物的田地中简便及迅速地消除不需要的植物(即，“杂草”)。理想的处理剂将为可施加到整个田地但是将仅消除不需要的植物，同时使作物植物不受损害的处理剂。一种这样的处理系统将涉及除草剂耐受性的作物植物的使用，以便当将除草剂喷洒到除草剂耐受性作物植物的田地或者包含该作物的耕作区上时，该作物植物将继续茁壮成长，而无除草剂耐受性的杂草被杀灭或者严重损伤。理想的是，这样的处理系统将利用变化的除草剂特性以使得杂草控制可提供灵活性与经济性的最佳可能组合。例如，单独除草剂具有不同的田地寿命，并且一些除草剂在施加至田地之后在相对较长时间内存留并且有效，而其他的除草剂迅速分解成其他和/或无活性的化合物。
可通过如下方式赋予作物对具体除草剂的耐受性：通过工程改造将基因引入作物中，所述基因编码适当的除草剂代谢酶和/或非敏感性除草剂靶标。在一些情况下，这些酶以及编码这些酶的核酸起源于植物。在其他情况下，它们源自其他生物体，诸如微生物。参见，例如Padgette et al.(1996)“New weed control opportunities：Development of soybeans with a Roundupgene”(Padgette等人，1996年，“杂草控制新机遇：利用Roundup基因开发大豆”)以及Vasil(1996)“Phosphinothricin-resistant crops，”(Vasil，1996年，“草丁膦抗性作物”)，这两篇文献均载于Herbicide-Resistant Crops，ed.Duke(CRC Press，Boca Raton，Florida)pp.54-84and pp.85-91(《除草剂抗性作物》，Duke编辑(佛罗里达州博卡拉顿的CRC出版社)，第54-84页和第85-91页)。事实上，转基因植物已经过工程改造以表达来自多种生物体的多种除草剂耐受性基因。
虽然多种除草剂耐受性作物植物现在为可商购的，但是仍然持续需要作物生产的每一方面的改善、杂草控制选项、残余杂草控制的延长，以及作物产量的改善。具体地讲，由于优势杂草物种以及优选作物物种的地方和区域变化，存在对用于作物保护和杂草治理的定制系统的持续需要，该系统可适应特定区域、地形和/或产地的需要。因此存在对作物保护和杂草治理的组合物和方法的持续需求。
发明内容
提供组合物和方法以通过使用具有氨基酸/生长素缀合活性的至少一种GH3多肽来对生长素类似物除草剂解毒。在存在生长素类似物除草剂的情况下，这种GH3多肽将产生具有降低的除草活性的氨基酸/生长素类似物缀合物。
提供采用GH3多肽和编码该GH3多肽的多核苷酸的各种方法。此类方法包括对生长素类似物除草剂解毒的方法，所述方法包括将生长素类似物除草剂施加于植物、植物细胞或种子，其中该植物、植物细胞或种子包含编码具有氨基酸/生长素类似物缀合活性的GH3多肽的异源多核苷酸，并且其中GH3多肽的表达产生具有降低的除草活性的氨基酸/生长素类似物缀合物。另外的方法包括通过使含有生长素类似物除草剂的被污染材料接触有效量的含异源GH3多肽的宿主细胞来对该被污染材料解毒。
提供了用于在包括作物或作物种子的耕作区中控制至少一种杂草的另外方法。该方法包括向该耕作区和/或向该耕作区中的作物或作物种子施加足量的生长素类似物除草剂以控制杂草但不显著地影响作物，其中该耕作区中的作物或其种子包含编码具有氨基酸/生长素类似物缀合活性的GH3多肽的异源多核苷酸。
附图说明
图1提供示意图，示出由具有酰基酸酰胺合成酶活性的GH3多肽引起的天冬氨酸/麦草畏缀合物(A)和谷氨酸/麦草畏缀合物(B)的形成。
图2提供示意图，示出由具有酰基酸酰胺合成酶活性的GH3多肽引起的天冬氨酸/2，4-D缀合物(A)和谷氨酸/2，4-D缀合物(B)的形成。
图3示出大豆萌发不受天冬氨酸和谷氨酸的生长素类似物缀合物的影响。
图4A、4B和4C提供246种GH3多肽的系统发育关系。该一致树是使用CLUSTAL W和具有1000次迭代的自展检验(在每一分支处指示自展值)产生的。亚组A、B、C是基于系统发育树分析标记的。
图5使用CLUSTAL W提供145个GH3多肽的系统发育关系。该系统发育树是使用邻接法推断的(Saitou and Nei(1987)Molecular Biology andEvolution 4：406-425(Saitou和Nei，1987年，《分子生物学与进化》，第4卷，第406-425页))。示出了分支长度总和＝17.20082290的最优树。进化距离是使用泊松修正法计算的(Zuckerkandl and Pauling(1965)In EvolvingGenes and Proteins by Bryson and Vogel，pp.97-166.Academic Press，NewYork(Zuckerkandl和Pauling，1965年，载于由Bryson和Vogel编辑的“进化的基因和蛋白质”，第97-166页，学术出版社，纽约))并且以每一位点的氨基酸置换数为单位。分析涉及145个氨基酸序列。包含空位和缺失数据的所有位置均被排除。在最终的数据集中存在总共112个位置。进化分析是在MEGA5中进行的(Tamura et al.(2011)Molecular Biology andEvolution 28：2731-2739(Tamura等人，2011年，《分子生物学与进化》，第28卷，第2731-2739页))。亚组A、B和C是基于系统发育树分析标记的。圆圈：针对Asp和Glu与IAA、2，4-D和麦草畏的缀合活性进行测试的GH3蛋白。实心圆圈：作为2，4-D与Asp和/或Glu的活性缀合酶的GH3蛋白。
图6提供使用CLUSTAL W获得的78个活性经测试的GH3多肽的系统发育关系。该系统发育树是使用邻接法推断的(Saitou and Nei(1987)Molecular Biology and Evolution 4：406-425(Saitou和Nei，1987年，《分子生物学与进化》，第4卷，第406-425页))。示出了分支长度总和＝8.67906939的最优树。该树是按比例绘制的，其中分支长度的单位与用于推断系统发育树的进化距离的那些单位相同。进化距离是使用泊松修正法计算的(Zuckerkandl and Pauling(1965)In Evolving Genes and Proteins byBryson and Vogel，pp.97-166.Academic Press，New York(Zuckerkandl和Pauling，1965年，载于由Bryson和Vogel编辑的“进化的基因和蛋白质”，第97-166页，学术出版社，纽约))并且以每一位点的氨基酸置换数为单位。包含空位和缺失数据的所有位置均被排除。在最终的数据集中存在总共212个位置。进化分析是在MEGA5中进行的(Tamura et al.，2011.Molecular Biology and Evolution 28：2731-2739(Tamura等人，2011年，《分子生物学与进化》，第28卷，第2731-2739页))。所有78个经测试的GH3蛋白具有2，4-D与Asp和/或Glu的缀合活性，但是用实心菱形或实心三角形标记的GH3蛋白除外。空心或实心菱形：不具有IAA与Asp或Glu的缀合活性的GH3蛋白；空心方块：具有麦草畏与Glu的缀合活性的GH3蛋白。亚组A、B和C是基于系统发育树分析标记的。
图7示出SEQ ID NO：52(PpGH3-2)的麦草畏-Glu缀合活性。PpGH3-2能够使麦草畏与谷氨酸缀合。麦草畏-Glu缀合物的量随着反应中PpGH3-2蛋白量的增加而增加。
具体实施方式
下文将结合附图更详细地描述本发明，附图中只显示了本发明的一些实施例，而非全部实施例。事实上，这些发明可以多种不同形式呈现，且不应理解为受限于本文陈述的实施例；更确切地说，提供这些实施例以使得本公开将满足适用的法律要求。类似的编号在全文中是指类似的要素。
借助前面的描述和随附的附图中给出的教导，本发明所属领域的技术人员将会想到本发明的许多修改形式和其他实施例。因此，应当了解，本发明不限于所公开的特定实施例，并旨在将修改形式和其他实施例包括在所附权利要求的范围内。虽然本文中采用特定术语，但所述术语仅在一般性和描述性意义上使用而并非用于限制目的。
I.经解毒的生长素类似物除草剂
提供了方法和组合物以通过氨基酸缀合对生长素类似物除草剂解毒。如本文所证实的，将生长素类似物除草剂转换成氨基酸/生长素缀合物，诸如天冬氨酸/生长素类似物缀合物和/或谷氨酸/生长素类似物缀合物，降低了生长素类似物除草剂的除草活性。如在本文中更详细讨论的，氨基酸与生长素类似物除草剂的缀合可以通过使用至少一种GH3多肽或其活性变体或片段而实现。
提供了方法和组合物以对生长素类似物除草剂解毒。如本文所用，对生长素类似物除草剂“解毒”包括对生长素类似物除草剂的任何改性，该改性降低了该化合物的除草效果。“降低”的除草效果包括植物或植物细胞对经改性的生长素类似物的敏感性发生任何统计意义上的显著降低。经改性的生长素类似物除草剂的降低的除草活性可以多种方式测定，所述方式包括例如，测定植物、植物细胞或者植物外植体对该经改性的生长素类似物的存在的降低的敏感性。参见，例如，本文提供的实例2。在此类情况下，当相较于与未改性的生长素类似物除草剂接触的对照植物、植物细胞或者植物外植体时，植物、植物细胞或者植物外植体将表现出对经改性的生长素类似物降低的敏感性。因此，在一个例子中，当与施加未改性的生长素类似物除草剂相比较，植物显示出对经改性的生长素类似物增加的耐受性并且剂量/响应曲线向右偏移时，“降低的除草效果”得到证实。此类剂量/响应曲线具有绘制在x轴上的“剂量”和绘制在y轴上的“伤害百分比”、“除草效果”等。
在一个实施例中，提供方法和组合物以通过氨基酸缀合来对生长素类似物除草剂解毒。生长素氨基酸缀合是两步酶反应。第一步骤涉及腺苷酰作用：AMP从ATP转移至酰基底物的羧酸基团，形成活化的酰基腺苷酸中间体并且释放焦磷酸盐(PPi)。第二步骤涉及转移酶反应，该反应通过形成酰胺键来用氨基酸取代中间体的AMP。参见图1和图2。在具体的实施例中，缀合至生长素类似物除草剂的氨基酸包括天冬氨酸和/或谷氨酸氨基酸。在此类实施例中，经解毒的生长素类似物包括天冬氨酸/生长素类似物缀合物和/或谷氨酸/生长素类似物缀合物。在另外的实施例中，该经解毒的生长素类似物包括天冬氨酸/2，4-D缀合物和/或谷氨酸/2，4-D缀合物，而在其他实施例中，该经解毒的生长素类似物包括天冬氨酸/麦草畏缀合物和/或谷氨酸/麦草畏缀合物。如本文所用，术语“天冬氨酸”和“谷氨酸”是指氨基酸的酸或酯形式。技术人员将认识到酯或酸的形成将取决于氨基酸所处的条件。
还会认识到缀合至生长素类似物除草剂的氨基酸不一定为天冬氨酸和/或谷氨酸氨基酸。在一些实施例中，缀合至生长素类似物(包括2，4-D缀合物，或者麦草畏缀合物)的氨基酸可包括组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸、丙氨酸、酪氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、半胱氨酸、天冬酰胺、精氨酸、丝氨酸，和/或脯氨酸氨基酸，或它们的任意组合。
如本文所用，“生长素类似物除草剂”或者“合成的生长素除草剂”可互换使用并且包括任何生长素除草剂或者生长调节剂除草剂，其也称为第4组除草剂(基于它们的作用模式)。这些类型的除草剂模拟或者行为类似被称为生长素的天然植物生长调节剂。生长素类似物除草剂的作用表现为影响可导致不受控制的细胞分裂和生长的细胞壁可塑性以及核酸代谢。参见，例如，Cox et al.(1994)Journal of Pesticide Reform 14：30-35(Cox等人，1994年，《农药改革杂志》，第14卷，第30-35页)；Dayan et al.(2010)Weed Science 58：340-350(Dayan等人，2010年，《杂草科学》，第58卷，第340-350页)；Davidonis et al.(1982)Plant Physiol70：357-360(Davidonis等人，1982年，《植物生理学》，第70卷，第357-360页)；Mithila et al.(2011)Weed Science 59：445-457(Mithila等人，2011年，《杂草科学》，第59卷，第445-457页)；Grossmann(2007)PlantSignalling and Behavior 2：421-423(Grossmann，2007年，《植物信号转导与行为》，第2卷，第421-423页)，美国专利7,855,326；美国申请公布2012/0178627；美国申请公布2011/0124503；以及美国专利7,838,733，将每篇文献和专利以引用方式并入本文。
生长素类似物除草剂包括化学族：苯氧基、羧酸(或吡啶)、苯甲酸、喹啉羧酸，以及环丙嘧啶酸(MAT28)。苯氧基除草剂是最常见的并且已经被用作除草剂。苯氧基除草剂的一个例子包括(2，4-二氯苯氧基)乙酸，也称为2，4-D。其他例子包括4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸(2，4-DB)、2-(2，4-二氯苯氧基)丙酸(2，4-DP)、(2，4，5-三氯苯氧基)乙酸(2，4，5-T)、2-(2，4，5-三氯苯氧基)丙酸(2，4，5-TP)、2-(2，4-二氯-3-甲基苯氧基)-N-苯丙酰胺(氯甲酰草胺)、(4-氯-2-甲基苯氧基)乙酸(MCPA)、4-(4-氯-邻甲苯氧基)丁酸(MCPB)，以及2-(4-氯-2-甲基苯氧基)丙酸(MCPP)。
第二大化学族是羧酸除草剂，也称为吡啶除草剂。例子包括3，6-二氯-2-吡啶甲酸(二氯吡啶酸)、4-氨基-3，5，6-三氯-2-吡啶甲酸(毒莠定)、(2，4，5-三氯苯氧基)乙酸(绿草定)，以及4-氨基-3，5-二氯-6-氟-2-吡啶氧基乙酸(氟草烟)。
苯甲酸的例子包括3，6-二氯-邻甲氧基苯甲酸(麦草畏)与3-氨基-2，5-二氯苯甲酸(草灭畏)。麦草畏是一种用于本文所公开的方法和组合物的特别有用的除草剂。
生长素类似物除草剂的第四化学族是喹啉羧酸族。例子包括3，7-二氯-8-喹啉羧酸(二氯喹啉酸)。该除草剂是独特的，因为该除草剂还将控制一些禾本科杂草，不像其他仅主要控制阔叶或双子叶植物的生长素类似物除草剂。此类别的其他除草剂是7-氯-3-甲基-8-喹啉羧酸(氯甲喹啉酸)。在其他实施例中，该生长素类似物除草剂包括环丙嘧啶酸、氯氨吡啶酸、草除灵乙酯、草灭畏、氯甲酰草胺、二氯吡啶酸、麦草畏、2，4-D、2，4-DB、2，4-滴丙酸、氯氟吡氧乙酸、2-甲-4-氯丙酸、MCPA、MCPB、2，3，6-TBA、毒莠定、绿草定、二氯喹啉酸，或者氯甲喹啉酸。参见，例如，WO2010/046422、WO2011/161131、WO2012/033548，以及美国申请公布20110287935、20100069248，以及20100048399，将每一专利全文以引用方式并入本文。
虽然任意生长素类似物除草剂可用于本文所公开的方法和组合物，但是在一个实施例中，该生长素类似物除草剂包括麦草畏或者2，4-D，以及该经解毒的生长素类似物除草剂包括天冬氨酸/麦草畏缀合物、谷氨酸/麦草畏缀合物、天冬氨酸/2，4-D缀合物和/或谷氨酸/2，4-D缀合物。
II.形成氨基酸/生长素类似物缀合物的方法
对于生长素类似物除草剂，酰胺缀合物的合成与降解是未知的，具体是因为2，4-D和麦草畏不被视为酰基酰胺合成酶的底物(Staswick et al.(2005)Plant Cell 17：616-627(Staswick等人，2005年，《植物细胞》，第17卷，第616-627页)；Chen et al.(2010)J Biol Chem 285：29780-29786(Chen等人，2010年，《生物化学杂志》，第285卷，第29780-29786页))，并且未在植物中发现此类缀合物。如本文所证实的，生长素类似物除草剂可形成酰胺缀合物，并且本文示出的经缀合的天冬氨酸/生长素类似物和/或谷氨酸/生长素类似物在植物中表现出降低的除草活性。
i.GH3多肽和编码该GH3多肽的多核苷酸
可采用各种方法来形成生长素类似物除草剂/氨基酸缀合物。在一个实施例中，采用GH3多肽。该GH3蛋白家族包括具有酰基酸酰胺合成酶活性并且催化ATP依赖性的氨基酸缀合物形成的多肽，从而调节至少一种活性植物化合物的水平，该活性植物化合物包括例如，生长素和/或茉莉酸类和/或苯甲酸酯底物。本文所公开的方法和组合物中采用的GH3多肽将具有酰基酸酰胺合成酶活性并且催化至少形成具有降低的除草活性的氨基酸/生长素类似物缀合物。在更具体的实施例中，该具有酰基酸酰胺活性的GH3多肽将催化形成谷氨酸/生长素类似物缀合物、天冬氨酸/生长素类似物缀合物、谷氨酸/麦草畏缀合物、天冬氨酸/麦草畏缀合物、谷氨酸/2，4-D缀合物和/或天冬氨酸/2，4-D缀合物；其中该生长素类似物缀合物具有降低的除草活性。
已知有各种GH3多肽，对GH3蛋白家族的底物特异性的先前研究已导致该GH3蛋白家族被表征为三个主要的亚组。参见，Staswick et al.(2002)Plant Cell 14：1405-1415(Staswick等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1405-1415页)以及Wang et al.(2008)Plant Growth Regul56：225-232(Wang等人，2008年，《植物生长调节》，第56卷，第225-232页)，该两篇文献均以引用方式并入本文。GH3多肽的亚组I催化氨基酸连接至茉莉酸(Staswick et al.(2002)Plant Cell 14：1405-1415(Staswick等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1405-1415页)，该文献以引用方式并入本文)。诸如IAA、PAA、IBA和水杨酸的生长素是亚组II的底物(Staswick et al.(2002)Plant Cell 14：1405-1415(Staswick等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1405-1415页)；Staswick et al.(2005)Plant Cell 17：616-627(Staswick等人，2005年，《植物细胞》，第17卷，第616-627页)，该两篇文献均以引用方式并入)。亚组III蛋白AtGH3-12可缀合4-羟基苯甲酸酯，以及其他的苯甲酸酯(Okrent et al.(2009)J BiolChem 284：9742-9754(Okrent等人，2009年，《生物化学杂志》，第284卷，第9742-9754页))。在另一个实施例中，各种GH3多肽(A组、B组和C组)的系统发育多样性在图4、图5和图6中示出。
本文提供了各种GH3酶的非限制性例子。组I GH3多肽包括例如，SEQ ID NO：15、16、17、51、52、53、54、55、56、57、59、60、61、62、63、64、65、66、67、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、122、134、135、136、137、138、139、140、141，及其活性变体和片段。组II GH3多肽包括例如，SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、58、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、117、118、119、120、121、124、142、144、145，及其活性变体和片段。组III GH3多肽包括例如，SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、123、125、126、127、128、129、130、131、132、133、143，及其活性变体和片段。还提供了编码上述各种多肽及其活性变体和片段的多核苷酸。
ii.GH3序列的活性片段和变体
提供采用GH3多肽的方法和组合物，该GH3多肽具有催化形成氨基酸/生长素类似物缀合物的酰基酸酰胺活性，所述氨基酸/生长素类似物缀合物诸如谷氨酸/生长素类似物缀合物和/或天冬氨酸/生长素类似物缀合物，其中该生长素类似物缀合物具有降低的除草活性。
iii.多核苷酸和多肽片段
GH3多核苷酸和多肽的片段和变体可用于本文所公开的方法和组合物中。所谓“片段”，意指多核苷酸的一部分或由其编码的氨基酸序列从而由其编码的蛋白质的一部分。多核苷酸的片段可编码保持酰基酸酰胺活性并且保持催化形成谷氨酸/生长素类似物缀合物和/或天冬氨酸/生长素类似物缀合物的能力的蛋白片段，其中该生长素类似物缀合物具有降低的除草活性。因此，核苷酸序列的片段可在至少约20个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸直至编码GH3多肽的全长多核苷酸的范围内。
编码GH3多肽的生物活性部分的GH3多核苷酸的片段将编码至少50、75、100、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、410、415、420、425、430、435、440、480、500、550、600、620个连续氨基酸或最多至存在于全长GH3多肽中的氨基酸总数，如在例如SEQID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144或者145中示出。
因此，GH3多核苷酸的片段编码GH3多肽的生物活性部分。GH3多肽的生物活性部分可通过以下步骤制备：分离编码GH3多肽的多核苷酸中的一者的一部分，表达该GH3多肽的编码部分(例如，通过体外重组表达)，以及评估酰基酸酰胺活性和催化形成谷氨酸/生长素类似物缀合物和/或天冬氨酸/生长素类似物缀合物的能力，其中该氨基酸生长素类似物缀合物具有降低的除草活性。作为GH3核苷酸序列的片段的多核苷酸包含至少16、20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、800、900、1,000、1,100、1,200、1,300或者1,400个连续核苷酸或最多至存在于编码本文所公开的GH3多肽的全长多核苷酸中的核苷酸的数量。
iv.多核苷酸和多肽变体
“变体”蛋白旨在意指通过在天然蛋白质中的一个或多个内部位点处缺失(即，在5′和/或3′末端截短)和/或缺失或添加一个或多个氨基酸和/或在天然蛋白质的一个或多个位点处置换一个或多个氨基酸而从该蛋白质衍生的蛋白质。所涵盖的变体蛋白是有生物活性的，即所述变体蛋白仍然具有所需的天然蛋白生物活性，即具有酰基酸酰胺活性和催化形成氨基酸/生长素缀合物(诸如，谷氨酸/生长素类似物缀合物和/或天冬氨酸/生长素类似物缀合物)的能力，其中该氨基酸/生长素类似物缀合物具有降低的除草活性。
“变体”旨在意指实质上相似的序列。对于多核苷酸，变体包括具有5′和/或3′末端处的缺失(即，截短)和/或天然多核苷酸内的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的置换的多核苷酸。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸而言，保守变体包含那些由于遗传密码的简并性而编码GH3多肽中的一者的氨基酸序列的序列。诸如这些变体的天然存在的变体可用公知的分子生物学技术(例如，用下文概述的聚合酶链反应(PCR)和杂交技术以及测序技术)进行鉴定。变体多核苷酸还包括通过合成获得的多核苷酸，如那些例如通过使用定点诱变或基因合成产生但仍编码GH3多肽的多核苷酸。
GH3多肽(以及编码该GH3多肽的多核苷酸)的生物活性变体将与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144或者145中任一者的多肽具有至少约80％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、95.7％、96％、97％、98％、99％或者更大的序列同一性，如由本文别处所描述的序列比对程序和参数所确定的。
该GH3多肽及其活性变体和片段可以多种方式改变，包括氨基酸置换、缺失、截短和插入。这类操纵的方法是本领域公知的。例如，GH3多肽的氨基酸序列变体和片段可通过在DNA中作出突变来制备。诱变和多核苷酸变更的方法是本领域公知的。参见，例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488-492(Kunkel，1985年，《美国国家科学院院刊》，第82卷，第488-492页)；Kunkel et al.(1987)Methods in Enzymol.154：367-382(Kunkel等人，1987年，《酶学方法》，第154卷，第367-382页)；美国专利No.4,873,192；Walker and Gaastra，eds.(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillan Publishing Company，New York)(Walker和Gaastra编辑，1983年，《分子生物学技术》，麦克米伦出版公司，纽约)以及其中所引用的参考文献。有关不影响所关注蛋白的生物活性的适当氨基酸置换的指导，可见Dayhoff et al.(1978)Atlas of ProteinSequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，D.C.(Dayhoff等人，1978年，《蛋白质序列和结构图表集》，美国国家生物医学研究基金会，华盛顿特区)的模型，该文献以引用方式并入本文。保守置换，如将一个氨基酸用另一具有相似性质的氨基酸进行交换，可能是最佳的。
显然，将在编码该变体的DNA中所作的突变一定不能将序列设置在阅读框外，并且优选将不会生成可能产生二级mRNA结构的互补区。参见EP专利申请公布No.75,444。
III.宿主细胞、植物和植物部分
提供了具有本文所公开的GH3序列的异源拷贝的宿主细胞、植物、植物细胞、植物部分和种子，以及谷粒。预计本领域技术人员了解多种可用于将本文所公开的多肽或核苷酸序列引入宿主细胞的系统。无意于详细描述已知用于在原核生物或真核生物中提供序列的各种方法。
所谓“宿主细胞”意指包含异源GH3序列的细胞。宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞，例如酵母细胞。宿主细胞还可为单子叶或者双子叶植物细胞。
在具体的实施例中，宿主细胞、植物和/或植物部分已经稳定地掺入了至少一种编码GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸。因此，提供了包含至少一种异源多核苷酸的宿主细胞、植物、植物细胞、植物部分和种子，所述异源多核苷酸编码SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、74、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、61、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144或者145中任一者的GH3多肽和/或其活性片段和/或变体。该GH3多肽具有酰基酸酰胺活性，并且因此具有催化形成氨基酸/生长素类似物缀合物(诸如谷氨酸/生长素类似物缀合物和/或天冬氨酸/生长素类似物缀合物)的能力，其中该氨基酸/生长素类似物缀合物具有降低的除草活性。
因此，表达编码GH3多肽的异源多核苷酸的宿主细胞、植物、植物细胞和种子可表现出对生长素类似物除草剂增强的耐受性。当显示出对除草剂增强的耐受性的植物经受生长素类似物除草剂并且相较于由适当的对照植物提供的剂量/响应曲线，该植物的剂量/响应曲线向右偏移时，对除草剂“增强的耐受性”得以证实。此类剂量/响应曲线具有绘制在x轴上的“剂量”和绘制在y轴上的“伤害百分比”、“除草效果”等。实质上“抵抗”或“耐受”除草剂的植物当经受农业界通常用来杀灭田地中杂草的浓度和比率的除草剂时，表现出很少(如果有的话)明显的负农艺效应。
在具体的实施例中，在宿主细胞、植物或植物部分中编码该GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸有效连接至组成型启动子、组织偏好启动子或者其他启动子，以用于在宿主细胞或所关注植物中表达。
如本文所用，术语植物包括从中可再生出植物的植物细胞、植物原生质体、植物细胞组织培养物、在植物或植物部分中完好的植物愈伤组织、植物块和植物细胞，所述植物部分诸如为胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、仁、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花粉囊等。谷粒意在表示由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。再生的植物的子代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含所引入的多核苷酸。
编码GH3多肽及其活性变体和片段的多核苷酸可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。所关注植物物种的例子包括但不限于：玉米(Zea mays)、芸苔属(Brassica)物种(如，甘蓝型油菜(B.napus)、芜菁(B.rapa)、芥菜(B.juncea))尤其是可用作种子油来源的那些芸苔属物种、苜蓿(Medicago sativa)、水稻(Oryza sativa)、裸麦(Secalecereale)、高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、粟(如，珍珠粟(Pennisetum glaucum)、黄米(Panicum miliaceum)、谷子(Setaria italica)、龙爪稷(Eleusine coracana))、向日葵(Helianthus annuus)、红花(Carthamustinctorius)、小麦(Triticum aestivum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotianatabacum)、马铃薯(Solanum tuberosum)、落花生(Arachis hypogaea)、棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))、甘薯(Ipomoeabatatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、菠萝(Ananas comosus)、柑橘(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、鳄梨(Persea americana)、无花果(Ficuscasica)、番石榴(Psidium guajava)、芒果(Mangifera indica)、橄榄(Oleaeuropaea)、木瓜(Carica papaya)、腰果(Anacardium occidentale)、澳洲坚果(Macadamia integrifolia)、杏树(Prunus amygdalus)、糖用甜菜(Beta vulgaris)、甘蔗(Saccharum spp.)、燕麦、大麦、蔬菜、观赏植物和针叶树。
蔬菜包括番茄(Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如Lactuca sativa)、青豆(Phaseolus vulgaris)、利马豆(Phaseolus limensis)、豌豆(Lathyrus spp.)和黄瓜属(Cucumis)的成员如黄瓜(C.sativus)、香瓜(C.cantalupensis)和甜瓜(C.melo)。观赏植物包括杜鹃(Rhododendron spp.)、八仙花(Macrophyllahydrangea)、朱槿(Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(Rosa spp.)、郁金香(Tulipaspp.)、水仙(Narcissus spp.)、矮牵牛(Petunia hybrida)、康乃馨(Dianthuscaryophyllus)、一品红(Euphorbia pulcherrima)和菊花。
可用于实施本发明的针叶树包括(例如)松树如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、西黄松(Pinus ponderosa)、黑松(Pinus contorta)和辐射松(Pinus radiata)；花旗松(Pseudotsuga menziesii)；西铁杉(Tsugacanadensis)；北美云杉(Picea glauca)；红杉(Sequoia sempervirens)；枞树(truefirs)如银枞(Abies amabilis)和胶枞(Abies balsamea)；以及雪松如西方红雪松(Thuja plicata)和阿拉斯加黄雪松(Chamaecyparis nootkatensis)，以及杨树和桉树。在具体的实施例中，本发明的植物是作物植物(例如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等等)。在其他实施例中，玉米和大豆植株是所关注的。
其他的所关注植物包括提供所关注种子的谷物植物、油料种子植物和豆科植物。所关注种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、水稻、高粱、裸麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。
“受试植物或植物细胞”是其中已针对所关注基因进行了遗传变更(如转化)的植物或植物细胞，或者是从经如此变更的植物或细胞遗传下来并包含该变更的植物或植物细胞。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供测量受试植物或植物细胞的表型变化的参考点。
对照植物或植物细胞可例如包括：(a)野生型植物或植物细胞，即，具有与用于进行遗传变更的起始材料相同的种质、品种、品系的植物或植物细胞，该遗传变更会得到受试植物或细胞；(b)具有与起始材料相同的基因型但已用无效构建体(即，用对所关注性状不具有已知效果的构建体，诸如包含标记基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)为受试植物或植物细胞的子代中的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)在遗传上与受试植物或植物细胞相同但不暴露于会诱导所关注基因的表达的条件或刺激因素的植物或植物细胞；或者(e)处于所关注基因不被表达的条件下的受试植物或植物细胞本身。
IV.多核苷酸构建体
术语“多核苷酸”的使用并不旨在将该方法和组合物局限于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员会认识到，多核苷酸可包含核糖核苷酸以及包含核糖核苷酸和脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然的分子也包括合成的类似物。本文所用的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。
编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸可在表达盒中提供以在所关注植物中表达。表达盒可包括有效连接到编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸的5′和3′调控序列。“有效连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，所关注多核苷酸与调控序列(即启动子)之间的有效连接是可使该所关注多核苷酸得以表达的功能连接。有效连接的元件可以是连续的或非连续的。当用来指两个蛋白质编码区域的连接时，所谓有效连接意指所述编码区域处于相同的阅读框中。可在多个表达盒上提供另外的基因。此类表达盒设有多个限制性位点和/或重组位点，以使编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸的插入处于调控区的转录调控之下。
表达盒按5′-3′转录方向可包含在植物中发挥功能的转录和翻译起始区(即，启动子)、编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸，以及转录和翻译终止区(即，终止区)。调控区(即，启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸对于宿主细胞或对于彼此可以是天然/相似的。或者，调控区和/或编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸对于宿主细胞或对于彼此可以是异源的。此外，如在本文别处进一步详细讨论的，编码该GH3多肽的多核苷酸还可包含编码“靶向信号”的多核苷酸，该靶向信号将引导该GH3多肽至所需的亚细胞位置。
如本文所用，指涉序列的“异源”，为起源于外来物种的序列，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预从其天然形式在组成和/或基因座方面进行修饰得到的序列。例如，有效连接至异源多核苷酸的启动子来自于与得到该多核苷酸的物种不同的物种，或者如果来自于相同/类似的物种的话，一者或两者从它们的原始形式和/或基因座经修饰而得，或者启动子不是被有效连接的多核苷酸的天然启动子。
虽然可优选使用异源启动子来表达序列，但可以使用天然的启动子序列。此类构建体可以改变编码GH3多肽的多核苷酸在宿主细胞、植物或植物细胞中的表达水平。因此，可使宿主细胞、植物或植物细胞的表型改变。
终止区可以对于翻译起始区而言是天然的，可以对于编码GH3多肽或其活性变体或片段的有效连接的多核苷酸而言是天然的，可以对于宿主细胞(即，植物细胞)而言是天然的，或者可以源自对于该启动子、编码GH3多肽或其活性片段或变体的该多核苷酸、该植物宿主，或它们的任何组合而言别的来源(即外来的或者异源的)。便利的终止区可获自根瘤农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，如章鱼氨酸合成酶和胭脂氨酸合成酶终止区。另参见Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144(Guerineau等人，1991年，《分子遗传学与普通遗传学》，第262卷，第141-144页)；Proudfoot(1991)Cell 64：671-674(Proudfoot，1991年，《细胞》，第64卷，第671-674页)；Sanfacon et al.(1991)Genes Dev.5：141-149(Sanfacon等人，1991年，《基因和发育》，第5卷，第141-149页)；Mogen et al.(1990)Plant Cell 2：1261-1272(Mogen等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第1261-1272页)；Munroe et al.(1990)Gene 91：151-158(Munroe等人，1990年，《基因》，第91卷，第151-158页)；Ballas etal.(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903(Ballas等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第7891-7903页)；以及Joshi et al.(1987)Nucleic AcidsRes.15：9627-9639(Joshi等人，1987年，《核酸研究》，第15卷，第9627-9639页)。
在适当情况下，该多核苷酸可经优化以提高在转化的宿主细胞(即，植物细胞)中的表达。在具体的实施例中，可使用植物偏好的密码子来合成多核苷酸，以改进表达。有关宿主偏好密码子用法的讨论，参见例如Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11(Campbell和Gowri，1990年，《植物生理学》，第92卷，第1-11页)。本领域可获得用于合成植物偏好基因的方法。参见，例如，美国专利No.5,380,831和No.5,436,391，以及Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498(Murray等人，1989年，《核酸研究》，第17卷，第477-498页)，所述专利和文献以引用方式并入本文。
已知另外的序列修饰增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号的序列、转座子样重复序列以及其他此类充分表征的可能有害于基因表达的序列。可将序列的G-C含量调整到给定的细胞宿主的平均水平，这通过参考在宿主细胞中表达的已知基因计算得到。当可能时，修饰序列以避免预测的发夹二级mRNA结构。
表达盒可以另外含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的并且包括：小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5′非编码区)(Elroy-Stein et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：6126-6130(Elroy-Stein等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86页，第6126-6130页))；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie et al.(1995)Gene165(2)：233-238(Gallie等人，1995年，《基因》，第165卷，第2期，第233-238页))、MDMV前导序列(玉米矮小花叶病毒)(Virology 154：9-20(《病毒学》，第154卷，第9-20页))以及人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak et al.(1991)Nature 353：90-94(Macejak等人，1991年，《自然》，第353卷，第90-94页))；来自苜蓿花叶病毒的外壳蛋白mRNA(AMV RNA 4)的非翻译前导序列(Jobling et al.(1987)Nature325：622-625(Jobling等人，1987年，《自然》，第325卷，第622-625页))；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie et al.(1989)in MolecularBiology of RNA，ed.Cech(Liss，New York)，pp.237-256(Gallie等人，1989年，载于《RNA的分子生物学》，Cech编辑(Liss，纽约)，第237-256页))；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel et al.(1991)Virology 81：382-385(Lommel等人，1991年，《病毒学》，第81卷，第382-385页))。还可参见Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84：965-968(Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页)。
在制备表达盒时，可对各种DNA片段进行操纵，以提供处于正确取向的DNA序列，且适当时提供处于正确的阅读框的DNA序列。为此目的，可应用衔接子或接头将DNA片段连接在一起，或者可涉及其他的操纵以提供便利的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。出于这个目的，可涉及到体外诱变、引物修复、限制性酶切、退火、再置换(例如，转换和颠换)。
多种启动子可用于表达本文所公开的多种GH3序列，包括所关注的多核苷酸序列的天然启动子。启动子可基于所需的结果来选择。此类启动子包括，例如，组成型启动子、组织偏好启动子或者其他启动子以用于在植物中表达。
组成型启动子包括(例如)Rsyn7启动子的核心启动子和WO99/43838和美国专利No.6,072,050中公开的其他组成型启动子；CaMV 35S核心启动子(Odell et al.(1985)Nature 313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))；水稻肌动蛋白(McElroy et al.(1990)Plant Cell 2：163-171(McElroy等人，1990年，《植物细胞》，第2卷，第163-171页))；泛素(Christensen et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632(Christensen等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第619-632页)和Christensen et al.(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689(Christensen等人，1992年，《植物分子生物学》，第18卷，第675-689页))；pEMU(Last et al.(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588(Last等人，1991年，《理论和应用遗传学》，第81卷，第581-588页))；MAS(Velten et al.(1984)EMBO J.3：2723-2730(Velten等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2723-2730页))；ALS启动子(美国专利No.5,659,026)；等。其他组成型启动子包括例如美国专利No.5,608,149；No.5,608,144；No.5,604,121；No.5,569,597；No.5,466,785；No.5,399,680；No.5,268,463；No.5,608,142；和No.6,177,611。
组织偏好的启动子可用于编码GH3多肽的多核苷酸在特定植物组织内的靶向增强表达。组织偏好的启动子包括以下文献中描述的那些启动子：Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页；Kawamata et al.(1997)Plant Cell Physiol.38(7)：792-803(Kawamata等人，1997年，《植物细胞生理学》，第38卷，第7期，第792-803页)；Hansen et al.(1997)Mol.GenGenet.254(3)：337-343(Hansen等人，1997年，《分子遗传学与普通遗传学》，第254卷，第3期，第337-343页)；Russell et al.(1997)TransgenicRes.6(2)：157-168(Russell等人，1997年，《转基因研究》，第6卷，第2期，第157-168页)；Rinehart et al.(1996)Plant Physiol.112(3)：1331-1341(Rinehart等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第3期，第1331-1341页)；Van Camp et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：525-535(Van Camp等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第525-535页)；Canevascini et al.(1996)Plant Physiol.112(2)：513-524(Canevascini等人，1996年，《植物生理学》，第112卷，第2期，第513-524页)；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.20：181-196(Lam，1994年，《细胞变异研究结果与问题》，第20卷，第181-196页)；Orozco et al.(1993)Plant MolBiol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6期，第1129-1138页)；Matsuoka et al.(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA 90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)；以及Guevara-Garcia et al.(1993)Plant J.4(3)：495-505(Guevara-Garcia等人，1993年，《植物杂志》，第4卷，第3期，第495-505页)。如有必要，可对这种启动子进行修饰以用于弱表达。
叶偏好的启动子是本领域已知的。参见例如，Yamamoto et al.(1997)Plant J.12(2)：255-265(Yamamoto等人，1997年，《植物杂志》，第12卷，第2期，第255-265页)；Kwon et al.(1994)Plant Physiol.105：357-67(Kwon等人，1994年，《植物生理学》，第105卷，第357-367页)；Yamamoto et al.(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778(Yamamoto等人，1994年，《植物细胞生理学》，第35卷，第5期，第773-778页)；Gotoret al.(1993)Plant J.3：509-18(Gotor等人，1993年，《植物杂志》，第3卷，第509-518页)；Orozco et al.(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138(Orozco等人，1993年，《植物分子生物学》，第23卷，第6页，第1129-1138页)；以及Matsuoka et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590(Matsuoka等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第20期，第9586-9590页)。
还可采用分生组织偏好的启动子。此类启动子可驱动分生组织中的表达，分生组织包括例如，顶端分生组织、腋芽、根分生组织、子叶分生组织和/或下胚轴分生组织。分生组织偏好的启动子的非限制性例子包括苗分生组织特异性启动子，诸如拟南芥UFO基因启动子(异常花器官(UFO))(USA6239329)，如在美国专利申请20120255064中讨论的FTM1、FTM2、FTM3基因和SVP1、SVP2、SVP3基因的分生组织特异性启动子以及在美国专利No.5,880,330中所公开的苗分生组织特异性启动子。这些参考文献的每一篇全文以引用方式并入本文。
表达盒还可包含用于选择转化细胞的选择性标记基因。选择性标记基因被利用于转化细胞或组织的选择。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些基因，以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物为例如草甘膦、草铵膦、溴苯腈、磺酰脲。另外的选择性标记包括表型标记如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白如绿荧光蛋白(GFP)(Su et al.(2004)Biotechnol Bioeng 85：610-9(Su等人，2004年，《生物技术和生物工程》，第85卷，第610-619页)和Fetter et al.(2004)Plant Cell 16：215-28(Fetter等人，2004年，《植物细胞》，第16卷，第215-228页))、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte et al.(2004)J.Cell Science 117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页)和Kato et al.(2002)Plant Physiol 129：913-42(Kato等人，2002年，《植物生理学》，第129卷，第913-942页))和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PhiYFPTM，参见Bolte et al.(2004)J.CellScience 117：943-54(Bolte等人，2004年，《细胞科学杂志》，第117卷，第943-954页))。对于另外的选择性标记，通常参见Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.3：506-511(Yarranton，1992年，《生物技术新见》，第3卷，第506-511页)；Christopherson et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：6314-6318(Christopherson等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第6314-6318页)；Yao et al.(1992)Cell 71：63-72(Yao等人，1992年，《细胞》，第71卷，第63-72页)；Reznikoff(1992)Mol.Microbiol.6：2419-2422(Reznikoff，1992年，《分子微生物学》，第6卷，第2419-2422页)；Barkley et al.(1980)in The Operon，pp.177-220(Barkley等人，1980年，载于《操纵子》，第177-220页)；Hu et al.(1987)Cell 48：555-566(Hu等人，1987年，《细胞》，第48卷，第555-566页)；Brown et al.(1987)Cell 49：603-612(Brown等人，1987年，《细胞》，第49卷，第603-612页)；Figge et al.(1988)Cell 52：713-722(Figge等人，1988年，《细胞》，第52卷，第713-722页)；Deuschle et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86：5400-5404(Deuschle等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第5400-5404页)；Fuerst et al.(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA86：2549-2553(Fuerst等人，1989年，《美国国家科学院院刊》，第86卷，第2549-2553页)；Deuschle et al.(1990)Science 248：480-483(Deuschle等人，1990年，《科学》，第248卷，第480-483页)；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(Gossen，1993年，海德尔堡大学博士论文)；Reines et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：1917-1921(Reines等人，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第1917-1921页)；Labow et al.(1990)Mol.Cell.Biol.10：3343-3356(Labow等人，1990年，《分子细胞生物学》，第10卷，第3343-3356页)；Zambretti et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：3952-3956(Zambretti等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第3952-3956页)；Baim et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：5072-5076(Baim等人，1991年，《美国国家科学院院刊》，第88卷，第5072-5076页)；Wyborski et al.(1991)Nucleic Acids Res.19：4647-4653(Wyborski等人，1991年，《核酸研究》，第19卷，第4647-4653页)；Hillenand-Wissman(1989)Topics Mol.Struc.Biol.10：143-162(Hillenand-Wissman，1989年，《分子和结构生物学专题》，第10卷，第143-162页)；Degenkolb et al.(1991)Antimicrob.AgentsChemother.35：1591-1595(Degenkolb等人，1991年，《抗微生物剂和化学治疗》，第35卷，第1591-1595页)；Kleinschnidt et al.(1988)Biochemistry 27：1094-1104(Kleinschnidt等人，1988年，《生物化学》，第27卷，第1094-1104页)；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg(Bonin，1993年，海德尔堡大学博士论文)；Gossen et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：5547-5551(Gossen等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第5547-5551页)；Oliva et al.(1992)Antimicrob.Agents Chemother.36：913-919(Oliva等人，1992年，《抗微生物剂和化学治疗》，第36卷，第913-919页)；Hlavka et al.(1985)Handbook of Experimental Pharmacology，Vol.78(Springer-Verlag，Berlin)(Hlavka等人，1985年，《实验药理学手册》，第78卷，斯普林格出版社，柏林)；Gill et al.(1988)Nature 334：721-724(Gill等人，1988年，《自然》，第334卷，第721-724页)。将这些公开内容以引用的方式并入本文。上面关于选择性标记基因的列表并不意指是限制性的。
虽然GH3多肽或其活性变体或片段的表达可通过使用适当的启动子而被靶向到特定的植物组织或细胞类型，但是其还可通过使用靶向信息或者“靶向标签”来靶向到细胞内不同的位置。不同于以转录水平作用的启动子，此类靶向信息是起始翻译产物的一部分。因此，在具体的实施例中，表达多种GH3多肽或其活性变体和片段，以使得GH3多肽靶向到亚细胞位置，诸如质体、叶绿体、液泡、内质网(ER)、线粒体和/或细胞核。
例如，可以通过在构建体(即表达盒)内添加编码信号肽的序列(此类序列也可以称为“信号序列”)，来产生前面有信号肽的蛋白质，信号肽引导翻译产物进入内质网。该信号序列可为例如，与编码GH3多肽的基因相关联的序列，或者该信号序列可源自另一基因并且因此对GH3序列是异源的。在文献中描述了多种信号肽。参见，例如，Raikhel and Chrispeels，“Protein sorting and vesicle traffic”in Buchanan et al.，eds.，(2000)Biochemistry and Molecular Biology of Plants(American Society of PlantPhysiologists，Rockville，Md.)(Raikhel和Chrispeels，“蛋白质分选和囊泡运输”，载于Buchanan等人编辑，2000年，《植物生物化学和分子生物学》，美国植物生理学家学会，马里兰州罗克维尔)，其以引用的方式并入本文。信号肽的添加将导致翻译产物进入内质网(在该过程中信号肽本身被从多肽移除)。蛋白质的最终细胞内位置取决于其他因素，可操纵这些因素以使得GH3多肽或其活性变体或片段位于所需的细胞位置。默认途径，即不包含其他靶向标签的多肽采用的途径，将使多肽的分泌跨过细胞膜进入质外体。质外体是质膜系统外部的区域，包括细胞壁、细胞间隙和木质部导管，其形成水和溶质可从中穿行的连续、可渗透系统。
在具体的实施例中，GH3多肽或其活性变体或片段位于细胞中，而不是位于细胞膜外。这可以例如通过添加编码内质网滞留信号序列的多核苷酸至该GH3多肽的序列来完成。该步骤的方法和序列在Raikhel和Chrispeels(出处同上)中有所描述；例如，将顺序编码氨基酸K、D、E和L的序列，或在文献中描述的其变体添加至多肽的蛋白编码部分末端可实现该步骤。ER滞留序列是本领域中熟知的，并且包括那些在美国专利7,772,370以及例如在Denecke et al.(1992).EMBO J.11：2345-2355(Denecke等人，1992年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第11卷，第2345-2355页)；Wandelt et al.(1992)Plant J.2：181-192(Wandelt等人，1992年，《植物杂志》，第2卷，第181-192页)；Denecke et al.(1993)J.Exp.Bot.44：213-221(Denecke等人，1993年，《实验植物学杂志》，第44卷，第213-221页)；Vitale et al.(1993)J.Exp.Bot.44：1417-1444(Vitale等人，1993年，《实验植物学杂志》，第44卷，第1417-1444页)；Gomord et al.(1996)Plant Physiol.Biochem.34：165-181(Gomord等人，1996年，《植物生理与生物化学》，第34卷，第165-181页)；Lehmann et al.(2001)PlantPhysiol.127(2)：436-449(Lehmann等人，2001年，《植物生理学》，第127卷，第2期，第436-449页)中描述的序列。
或者，除了信号肽以外，还可使用液泡靶向标签(例如Raikhel和Chrispeels(出处同上)所述的那些标签)使肽定位在液泡结构中。如Raikhel和Chrispeels(出处同上)中所述，液泡靶向标签可置于构建体中的不同位置。
使用质体转运肽编码序列代替信号肽编码序列将使多肽定位在所选细胞类型的质体中(Raikhel和Chrispeels，出处同上)。此类转运肽是本领域已知的。参见，例如，Von Heijne et al.(1991)Plant Mol.Biol.Rep.9：104-126(Von Heijne等人，1991年，《植物分子生物学导报》，第9卷，第104-126页)；Clark et al.(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550(Clark等人，1989年，《生物化学杂志》，第264卷，第17544-17550页)；Della-Cioppa et al.(1987)Plant Physiol.84：965-968(Della-Cioppa等人，1987年，《植物生理学》，第84卷，第965-968页)；Romer et al.(1993)Biochem.Biophys.Res.Comm.196：1414-1421(Romer等人，1993年，《生物化学和生物物理学研究通讯》，第196卷，第1414-1421页)；以及Shah et al.(1986)Science 233：478-481(Shah等人，1986年，《科学》，第233卷，第478-481页)。编码此类转运肽的叶绿体靶向序列也是本领域已知的，包括叶绿体核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶(Rubisco)的小亚基(de Castro Silva Filho etal.(1996)Plant Mol.Biol.30：769-780(de Castro Silva Filho等人，1996年，《植物分子生物学》，第30卷，第769-780页)；Schnell et al.(1991)J.Biol.Chem.266(5)：3335-3342(Schnell等人，1991年，《生物化学杂志》，第266卷，第5期，第3335-3342页))；5-(烯醇丙酮)莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)(Archer et al.(1990)J.Bioenerg.Biomemb.22(6)：789-810(Archer等人，1990年，《生物能与生物膜杂志》，第22卷，第6期，第789-810页))；色氨酸合成酶(Zhao et al.(1995)J.Biol.Chem.270(11)：6081-6087(Zhao等人，1995年，《生物化学杂志》，第270卷，第11期，第6081-6087页))；质体蓝素(Lawrence et al.(1997)J.Biol.Chem.272(33)：20357-20363(Lawrence等人，1997年，《生物化学杂志》，第272卷，第33期，第20357-20363页))；分支酸合成酶(Schmidt et al.(1993)J.Biol.Chem.268(36)：27447-27457(Schmidt等人，1993年，《生物化学杂志》，第268卷，第36期，第27447-27457页))；以及捕光叶绿素a/b结合蛋白(LHBP)(Lamppa et al.(1988)J.Biol.Chem.263：14996-14999(Lamppa等人，1988年，《生物化学杂志》，第263卷，第14996-14999页))，以及美国申请公布2012-0304336中陈述的多种叶绿体靶向序列，所述文献的每一篇以引用方式并入本文。
也可以设想通过添加合适的靶向信息将多肽定位在其他细胞隔室中。(Raikhel和Chrispeels，出处同上)。提供各种靶向序列识别有关的信息和参考文献的可用站点可见于：psort.nibb.acjp/mit。蛋白质靶向现有技术有关的其他参考文献包括Silva-Filho(2003)Curr.Opin.Plant Biol.6：589-595(Silva-Filho等人，2003年，《植物生物学新见》，第6卷，第589-595页)；Nicchitta(2002)Curr.Opin.Cell Biol.14：412-416(Nicchitta等人，2002年，《细胞生物学新见》，第14卷，第412-416页)；Bruce(2001)Biochim Biophys Acta 1541：2-21(Bruce，2001年，《生物化学和生物物理学学报》，第1541卷，第2-21页)；Hadlington&Denecke(2000)Curr.Opin.Plant Biol.3：461-468(Hadlington和Denecke，2000年，《植物生物学新见》，第3卷，第461-468页)；Emanuelsson et al.(2000)J Mol.Biol.300：1005-1016(Emanuelsson等人，2000年，《分子生物学杂志》，第300卷，第1005-1016页)；Emanuelsson&von Heijne(2001)BiochimBiophys Acta 1541：114-119(Emanuelsson和von Heijne，2001年，《生物化学与生物物理学报》，第1541卷，第114-119页)，所述文献的每一篇以引用方式并入本文。
V.堆叠其他所关注性状
在一些实施例中，将编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸通过工程改造引入到分子堆叠中。因此，本文所公开的多种宿主细胞、植物、植物细胞和种子还可具有一种或多种所关注性状，并且在更具体的实施例中，宿主细胞、植物、植物部分或植物细胞堆叠有所关注多核苷酸序列的任何组合以生成具有所需性状组合的植物。如本文所用，术语“堆叠”包括具有存在于同一植物中的多种性状(即，两种性状均掺入核基因组中，一种性状掺入核基因组中且一种性状掺入质体的基因组中，或者两种性状均掺入质体的基因组中)。在一个非限制性例子中，“堆叠性状”包含序列彼此物理相邻的分子堆叠。本文所用的性状是指衍自特定序列或序列群组的表型。在一个实施例中，该分子堆叠包含赋予对至少一种另外的生长素类似物除草剂的耐受性的至少一种另外的多核苷酸和/或赋予对第二除草剂的耐受性的至少一种另外的多核苷酸。
因此在一个实施例中，含有编码该GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸的宿主细胞、植物、植物细胞或者植物部分堆叠有至少一种其他的GH3序列。或者，含有编码该GH3多肽的异源多核苷酸的宿主细胞、植物、植物细胞或种子可具有堆叠有另外的序列的GH3序列，该另外的序列通过与GH3序列不同的作用模式来赋予对生长素类似物除草剂的耐受性。此类序列包括但不限于芳氧基链烷酸酯双加氧酶多核苷酸，该多核苷酸赋予对2，4-D与其他苯氧基生长素除草剂的耐受性，以及对芳氧苯氧基丙酸酯除草剂的耐受性，如在例如WO2005/107437中描述的。另外的序列还可包括麦草畏耐受性多核苷酸，如在例如Herman et al.(2005)J.Biol.Chem.280：24759-24767(Herman等人，2005年，《生物化学杂志》，第280卷，第24759-24767页)、美国专利7,820,883、8,088,979、8,071,874、8,119,380、7,105,724、7,855,3326、8,084,666、7,838,729、5,670,454；美国申请公布2012/0064539、2012/0064540、2011/0016591、2007/0220629、2001/0016890、2003/0115626、WO2012/094555、WO2007/46706、WO2012/024853、EP0716808以及EP1379539中所描述的，以及乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)多肽，所述文献的每一篇以引用方式并入本文。
在其他实施例中，包含编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸的宿主细胞、植物、植物细胞、外植体和表达盒堆叠有赋予对HPPD抑制剂的耐受性的序列。例如，可采用P450序列，该序列通过代谢除草剂来提供对HPPD抑制剂的耐受性。此类序列包括但不限于NSF1基因。参见，US 2007/0214515和US 2008/0052797，这两篇文献全文都以引用方式并入本文。赋予植物除草剂耐受性的另外的HPPD靶位点基因包括在美国专利No.6,245,968B1；No.6,268,549；和No.6,069,115；国际公布WO99/23886、美国申请公布2012-0042413和美国申请公布2012-0042414中陈述的那些，所述文献的每一篇以引用方式并入本文。
在一些实施例中，含有编码GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸的宿主细胞、植物或植物细胞可堆叠有赋予对草甘膦的耐受性的序列，例如，草甘膦N-乙酰转移酶。参见，例如，WO02/36782、美国专利公布2004/0082770和WO 2005/012515、美国专利No.7,462,481、美国专利No.7,405,074，所述文献的每一篇以引用方式并入本文。另外的草甘膦耐受性性状包括编码草甘膦氧化还原酶的序列，如在美国专利No.5,776,760和No.5,463,175中更完整描述的。可与编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸组合的其他性状包括那些从赋予植物产生更高水平的或对草甘膦不敏感的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)的能力的多核苷酸获得的性状，例如，如在美国专利No.6,248,876B1、No.5,627,061、No.5,804,425、No.5,633,435、No.5,145,783、No.4,971,908、No.5,312,910、No.5,188,642、No.4,940,835、No.5,866,775、No.6,225,114B1、No.6,130,366、No.5,310,667、No.4,535,060、No.4,769,061、No.5,633,448、No.5,510,471、No.RE 36,449、No.RE 37,287E、和No.5,491,288；以及国际公布WO 97/04103、WO 00/66746、WO 01/66704、以及WO 00/66747、6,040,497、5,094,945、5,554,798、6,040,497；Zhou et al.(1995)Plant CellRep.：159-163(Zhou等人，1995年，《植物细胞报告》，第159-163页)；WO 0234946；WO 9204449；6,225,112、4,535,060和6,040,497中更完整描述的，所述文献全文以引用方式并入本文以用于所有目的。
另外的EPSP合成酶序列包括gdc-1(美国申请公布20040205847)；具有III类结构域的EPSP合成酶(美国申请公布20060253921)；gdc-1(美国申请公布20060021093)；gdc-2(美国申请公布20060021094)；gro-1(美国申请公布20060150269)；grg23或者grg 51(美国申请公布20070136840)；GRG32(美国申请公布20070300325)；GRG33、GRG35、GRG36、GRG37、GRG38、GRG39和GRG50(美国申请公布20070300326)；或者EPSP合成酶序列，如在美国申请公布20040177399、20050204436、20060150270、20070004907、20070044175、2007010707、20070169218、20070289035和20070295251中所公开的；所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文。
在其他实施例中，具有编码GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸的宿主细胞、植物或植物细胞或者植物部分堆叠有例如，赋予对ALS抑制剂的耐受性的序列。如本文所用，“ALS抑制剂耐受性多肽”包括在植物中表达时赋予对至少一种ALS抑制剂的耐受性的任何多肽。多种ALS抑制剂是已知的并且包括例如，磺酰脲、咪唑啉酮、三唑嘧啶、嘧啶基氧基(硫代)苯甲酸酯和/或磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂。另外的ALS抑制剂是已知的并且公开于本文别处。本领域已知的是，对于对磺酰脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶和嘧啶基(硫代)苯甲酸酯的耐受性，ALS突变分成不同的类别，包括具有下列特性的突变：(1)对所有四个这些组的广泛耐受性；(2)对咪唑啉酮和嘧啶基(硫代)苯甲酸酯的耐受性；(3)对磺酰脲和三唑并嘧啶的耐受性；以及(4)对磺酰脲和咪唑啉酮的耐受性。
可采用多种ALS抑制剂耐受性多肽。在一些实施例中，ALS抑制剂耐受性多核苷酸包含至少一个核苷酸突变，产生ALS多肽的一个氨基酸变化。在具体实施例中，该变化发生于乙酰乳酸合成酶的七个实质上保守的区域之一中。参见，例如，Hattori et al.(1995)Molecular Genetics andGenomes 246：419-425(Hattori等人，1995年，《分子遗传和基因组学》，第246卷，第419-425页)；Lee et al.(1998)EMBO Journal 7：1241-1248(Lee等人，1998年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第7卷，第1241-1248页)；Mazur et al.(1989)Ann.Rev.Plant Phys.40：441-470(Mazur等人，1989年，《植物生理学年评》，第40卷，第441-470页)；以及美国专利No.5,605,011，所述文献的每一篇全文以引用方式并入本文。ALS抑制剂耐受性多肽可由例如ALS的SuRA或SuRB基因座编码。在具体实施例中，ALS抑制剂耐受性多肽包括C3ALS突变体、HRA ALS突变体、S4突变体或S4/HRA突变体或它们的任何组合。ALS中的不同突变已知能赋予对不同除草剂和多组(和/或多亚组)除草剂的耐受性。参见例如Traneland Wright(2002)Weed Science 50：700-712(Tranel和Wright，2002年，《杂草科学》，第50卷，第700-712页)。还可参见美国专利No.5,605,011、No.5,378,824、No.5,141,870和No.5,013,659，所述专利的每一篇全文以引用方式并入本文。在例如WO2007/024782中公开了大豆、玉蜀黍和拟南芥HRA序列，该专利以引用的方式并入本文。
在一些实施例中，ALS抑制剂耐受性多肽赋予对磺酰脲和咪唑啉酮除草剂的耐受性。磺酰脲耐受性植物和咪唑啉酮耐受性植物的产生更充分地描述于美国专利No.5,605,011、No.5,013,659、No.5,141,870、No.5,767,361、No.5,731,180、No.5,304,732、No.4,761,373、No.5,331,107、No.5,928,937和No.5,378,824；以及国际公布WO 96/33270，所述专利全文以引用方式并入本文以用于所有目的。在具体实施例中，ALS抑制剂耐受性多肽包含磺酰胺耐受性乙酰乳酸合成酶(也称为磺酰胺耐受性乙酰羟酸合成酶)或咪唑啉酮耐受性乙酰乳酸合成酶(也称为咪唑啉酮耐受性乙酰羟酸合成酶)。
在另外的实施例中，具有编码GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸的宿主细胞、植物或植物细胞或者植物部分堆叠有例如，赋予对ALS抑制剂的耐受性以及草甘膦耐受性的序列。在一个实施例中，编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸与HRA和草甘膦N-乙酰转移酶堆叠。参见，WO2007/024782、2008/0051288和WO 2008/112019，每篇所述专利以引用方式并入本文。
可与含有编码GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸的宿主细胞、植物或植物细胞或者植物部分组合的除草剂耐受性性状的其他例子包括那些由编码外源草丁膦乙酰转移酶的多核苷酸赋予的性状，如在美国专利No.5,969,213、No.5,489,520、No.5,550,318、No.5,874,265、No.5,919,675、No.5,561,236、No.5,648,477、No.5,646,024、No.6,177,616和No.5,879,903中所述。包含外源草丁膦乙酰转移酶的植物可表现出对抑制谷氨酰胺合成酶的草胺膦除草剂的改善的耐受性。可与含有编码GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸的植物或植物细胞或者植物部分组合的除草剂耐受性性状的其他例子包括那些由赋予改变的原卟啉原氧化酶(protox)活性的多核苷酸所赋予的性状，如在美国专利No.6,288,306B1、No.6,282,837B1和No.5,767,373以及国际公布WO 01/12825中所述。包含此类多核苷酸的植物可对靶向原卟啉原氧化酶(也称为“原卟啉原氧化酶抑制剂”)的多种除草剂中的任一种表现出改善的耐受性。
可与含有编码GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸的宿主细胞、植物或植物细胞或者植物部分组合的除草剂耐受性性状的其他例子包括在植物例如玉蜀黍植物或小飞蓬中赋予对至少一种除草剂的耐受性的那些性状。除草剂耐受性杂草是本领域中已知的，对特定除草剂的耐受性有差别的植物也是已知的。参见，例如，Green and Williams(2004)“Correlation of Corn(Zea mays)Inbred Response to Nicosulfuron andMesotrione，”poster presented at the WSSA Annual Meeting in Kansas City，Missouri，February 9-12，2004(Green和Williams，2004年，“玉米(Zeamays)自交系响应于烟嘧磺隆和硝磺草酮的相关性”，2004年2月9-12日在密苏里州堪萨斯城召开的WSSA年会中张贴的墙报)；Green(1998)Weed Technology 12：474-477(Green，1998年，《杂草技术》，第12卷，第474-477页)；Green and Ulrich(1993)Weed Science 41：508-516(Green和Ulrich，1993年，《杂草科学》，第41卷，第508-516页)。负责这些耐受性的性状可通过育种或者其他方法来与含有编码GH3或其活性变体或片段的异源多核苷酸的植物或植物细胞或者植物部分组合，从而提供本发明的植物及其使用方法。
在另外的实施例中，编码GH3多肽的多核苷酸可与编码尿黑酸茄尼基转移酶(HST)的至少一种多核苷酸堆叠。参见例如WO2010/023911，该专利全文以引用的方式并入本文。在此类实施例中，各类别除草化合物(完全或部分地通过抑制HST来起作用)可施加于具有HTS多肽的植物。
含有编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸的宿主细胞、植物或植物细胞或者植物部分还可与至少一种其他的性状组合，从而产生进一步包括多种所需性状组合的植物，所述性状组合包括但不限于动物饲料所需的性状，诸如高油含量(例如，美国专利No.6,232,529)；平衡的氨基酸含量(例如，大麦硫堇(hordothionin)(美国专利No.5,990,389、No.5,885,801、No.5,885,802和No.5,703,409；美国专利No.5,850,016)；大麦高赖氨酸(Williamson et al.(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106(Williamson等人，1987年，《欧洲生物化学杂志》，第165卷，第99-106页)；和WO 98/20122)以及高甲硫氨酸蛋白(Pedersen et al.(1986)J.Biol.Chem.261：6279(Pedersen等人，1986年，《生物化学杂志》，第261卷，第6279页)；Kirihara et al.(1988)Gene 71：359(Kirihara等人，1988年，《基因》，第71卷，第359页)；和Musumura et al.(1989)Plant Mol.Biol.12：123(Musumura等人，1989年，《植物分子生物学》，第12卷，第123页))；消化性提高(例如经修饰的贮藏蛋白(提交于2001年11月7日的美国申请序列号10/053,410)；和硫氧还蛋白(提交于2001年12月3日的美国申请序列号10/005,429))；以上公开内容以引用的方式并入本文。所需的性状组合还包括LLNC(低亚麻酸含量；参见例如，Dyer etal.(2002)Appl.Microbiol.Biotechnol.59：224-230(Dyer等人，2002年，《应用微生物学和生物技术》，第59卷，第224-230页))和OLCH(高油酸含量；参见例如，Fernandez-Moya et al.(2005)J.Agric.Food Chem.53：5326-5330(Fernandez-Moya等人，2005年，《农业与食品化学杂志》，第53卷，第5326-5330页))。
含有编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸的宿主细胞、植物或植物细胞或者植物部分还可与其他所需的性状组合，所述性状为例如串珠镰孢菌素解毒基因(美国专利No.5,792,931)、无毒性和疾病抗性基因(Jones et al.(1994)Science 266：789(Jones等人，1994年，《科学》，第266卷，第789页)；Martinet al(1993)Science)262：1432(Martin等人，1993年，《科学》，第262卷，第1432页)；Mindrinos et al.(1994)Cell78：1089(Mindrinos等人，1994年，《细胞》，第78卷，第1089页))，以及加工或加工产品所需的性状，诸如改良的油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利No.5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGP酶)、淀粉合成酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱支酶(SDBE))；以及聚合物或者生物塑料(例如美国专利No.5,602,321；β-酮基硫解酶、聚羟基丁酸合成酶和乙酰乙酰基-CoA还原酶(Schubert et al.(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847(Schubert等人，1988年，《细菌学杂志》，第170卷，第5837-5847页))有利于聚羟基链烷酸酯(PHA)的表达)；以上公开内容以引用的方式并入本文。还可将除草剂耐受性多核苷酸与提供例如雄性不育(如，参见美国专利No.5.583,210)、茎秆强度、开花时间之类的农艺性状或例如细胞周期调节或基因靶向(如，WO 99/61619、WO 00/17364和WO 99/25821)之类的转化技术性状的多核苷酸进行组合；以上公开内容以引用的方式并入本文。
在其他实施例中，含有编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸的宿主细胞、植物或植物细胞或者植物部分可堆叠有编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽的任何其他多核苷酸，所述具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽为诸如苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒性蛋白(在美国专利No.5,366,892、No.5,747,450、No.5,737,514、No.5,723,756、No.5,593,881；Geiser et al.(1986)Gene 48：109(Geiser等人，1986年，《基因》，第48卷，第109页)；Lee et al.(2003)Appl.Environ.Microbiol.)69：4648-4657(Lee等人，2003年，《应用和环境微生物学》，第69卷，第4648-4657页)(Vip3A)；Galitzky et al.(2001)Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.57：1101-1109(Galitzky等人，2001年，《结晶学报》，D辑：生物结晶学，第57卷，第1101-1109页)(Cry3Bb1)；以及Herman et al.(2004)J.Agric.Food Chem.52：2726-2734(Herman等人，2004年，《农业与食品化学杂志》，第52卷，第2726-2734页)(CrylF)中有所描述)；凝集素(VanDamme et al.(1994)Plant Mol.Biol.24：825(Van Damme等人，1994年，《植物分子生物学》，第24卷，第825页)、果胶(pentin)(美国专利No.5,981,722中有所描述)等。所产生的组合还可包括所关注的多核苷酸中的任何一者的多个拷贝。
在另一个实施例中，含有编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸的宿主细胞、植物或植物细胞或者植物部分还可与Rcg1序列或其生物活性变体或片段组合。该Rcg1序列是玉米中的炭疽茎腐病抗性基因。参见例如美国专利申请No.11/397,153、No.11/397,275和No.11/397,247，所述专利的每一篇以引用的方式并入本文。
这些堆叠的组合可通过任何方法来产生，包括但不限于通过任何常规方法或遗传转化来对植物进行育种。如果序列通过遗传转化植株来堆叠，则所关注的多核苷酸序列可在任何时间以任何顺序进行组合。可以用共转化方案将性状与所关注的多核苷酸同时引入，所述多核苷酸由转化盒的任何组合提供。例如，如果将要引入两条序列，则可将该两条序列包含在单独的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可通过相同启动子或不同启动子驱动所述序列表达。在某些情况下，可能需要引入会抑制所关注多核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中生成所需的性状组合。还认识到，可使用位点特异性重组系统在所需的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见(例如)WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，所有这些专利均以引用的方式并入本文。另外的系统可用于位点特异性整合，包括例如，各种大范围核酸酶系统，如在WO 2009/114321(以引用方式并入本文)中陈述的，该专利描述了“定制的”大范围核酸酶。还可参见，Gao et al.(2010)Plant Journal 1：176-187(Gao等人，2010年，《植物杂志》，第1卷，第176-187页)。另外的位点特异性整合系统包括但不限于锌指结构、大范围核酸酶和TAL核酸酶。参见例如WO2010/079430、WO2011/072246和US20110201118，所述专利的每一篇全文以引用方式并入本文。
VI.引入方法
可使用各种方法来将所关注序列引入宿主细胞、植物或植物部分。“引入”旨在意指将多核苷酸或多肽给予宿主细胞、植物、植物细胞或植物部分，使得该序列能够进入细胞的内部。本文所公开的方法不依赖于将序列引入宿主细胞、植物或植物部分的具体方法，只要多核苷酸或多肽可进入至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸或多肽引入植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
“稳定转化”旨在意指被引入到宿主细胞或植物中的核苷酸构建体整合到了宿主细胞或植物的基因组中，并能够被其子代遗传。“瞬时转化”旨在意指多核苷酸被引入到宿主细胞或植物中但是并不整合到宿主细胞或植物的基因组中，或者意指多肽被引入到宿主细胞或植物中。
转化方案以及将多肽或多核苷酸序列引入到植物中的方案，可根据要进行转化的植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)而异。将多肽和多核苷酸引入植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway et al.(1986)Biotechniques 4：320-334(Crossway等人，1986年，《生物技术》，第4卷，第320-334页))、电穿孔法(Riggs et al.(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：5602-5606(Riggs等人，1986年，《美国国家科学院院刊》，第83卷，第5602-5606页)、农杆菌(Agrobacterium)介导的转化(美国专利No.5,563,055和美国专利No.5,981,840)、直接基因转移(Paszkowskiet al.(1984)EMBO J.3：2717-2722(Paszkowski等人，1984年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第3卷，第2717-2722页))和弹道粒子加速(参见(例如)美国专利No.4,945,050、美国专利No.5,879,918、美国专利No.5,886,244和5,932,782；Tomes et al.(1995)in Plant Cell，Tissue，and OrganCulture：Fundamental Methods，ed.Gamborg and Phillips(Springer-Verlag，Berlin)(Tomes等人，1995年，载于《植物细胞、组织和器官培养：基本方法》，Gamborg和Phillips编辑(施普林格，柏林))；McCabe et al.(1988)Biotechnology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第923-926页))；以及Lec1转化(WO 00/28058)。还可参见Weissinger et al.(1988)Ann.Rev.Genet.22：421-477(Weissinger等人，1988年，《遗传学年鉴》，第22卷，第421-477页)；Sanford et al.(1987)Particulate Science and Technology 5：27-37(Sanford等人，1987年，《粒子科学和技术》，第5卷，第27-37页)(洋葱)；Christou et al.(1988)PlantPhysiol.87：671-674(Christou等人，1988年，《植物生理学》，第87卷，第671-674页)(大豆)；McCabe et al.(1988)Bio/Technology 6：923-926(McCabe等人，1988年，《生物/技术》，第6卷，第923-926页)(大豆)；Finer and McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.27P：175-182(Finer和McMullen，1991年，《体外细胞发育生物学》，第27P卷，第175-182页)(大豆)；Singh et al.(1998)Theor.Appl.Genet.96：319-324(Singh等人，1998年，《理论和应用遗传学》，第96卷，第319-324页)(大豆)；Datta et al.(1990)Biotechnology 8：736-740(Datta等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第736-740页)(水稻)；Klein et al.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：4305-4309(Klein等人，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第4305-4309页)(玉蜀黍)；Klein et al.(1988)Biotechnology 6：559-563(Klein等人，1988年，《生物技术》，第6卷，第559-563页)(玉蜀黍)；美国专利No.5,240,855、No.5,322,783和No.5,324,646；Klein et al.(1988)Plant Physiol.91：440-444(Klein等人，1988年，《植物生理学》，第91卷，第440-444页)(玉蜀黍)；Fromm et al.(1990)Biotechnology 8：833-839(Fromm等人，1990年，《生物技术》，第8卷，第833-839页)(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren et al.(1984)Nature(London)311：763-764(Hooykaas-Van Slogteren等人，1984年，《自然(伦敦)》，第311卷，第763-764页)；美国专利No.5,736,369(谷类)；Bytebier et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84：5345-5349(Bytebier等人，1987年，《美国国家科学院院刊》，第84卷，第5345-5349页)(百合科)；De Wet et al.(1985)in The Experimental Manipulationof Ovule Tissues，ed.Chapman et al.(Longman，New York)，pp.197-209(DeWet等人，1985年，载于《胚珠组织的实验操作》，Chapman等人编辑，朗文出版社，纽约，第197-209页)(花粉)；Kaeppler et al.(1990)PlantCell Reports 9：415-418(Kaeppler等人，1990年，《植物细胞报道》，第9卷，第415-418页)和Kaeppler et al.(1992)Theor.Appl.Genet.84：560-566(Kaeppler等人，1992年，《理论和应用遗传学》，第84卷，第560-566页)(晶须介导的转化)；D′Halluin et al.(1992)Plant Cell 4：1495-1505(D′Halluin等人，1992年，《植物细胞》，第4卷，第1495-1505页)(电穿孔)；Li et al.(1993)Plant Cell Reports12：250-255(Li等人，1993年，《植物细胞报道》，第12卷，第250-255页)和Christou and Ford(1995)Annals of Botany 75：407-413(Christou和Ford，1995年，《植物学年鉴》，第75卷，第407-413页)(水稻)；Osjoda et al.(1996)NatureBiotechnology 14：745-750(Osjoda等人，1996年，《自然生物技术》，第14卷，第745-750页)(通过根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)转化玉蜀黍)；所有这些文献均以引用方式并入本文。
在具体的实施例中，GH3序列或其活性变体或片段可用多种瞬时转化方法来提供给植物。这种瞬时转化方法包括但不限于将GH3蛋白或其活性变体和片段直接引入到植物中。这类方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见例如Crossway et al.(1986)Mol Gen.Genet.202：179-185(Crossway等人，1986年，《分子遗传学和基因组学》，第202卷，第179-185页)；Nomura et al.(1986)Plant Sci.44：53-58(Nomura等人，1986年，《植物科学》，第44卷，第53-58页)；Hepler et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.91：2176-2180(Hepler等人，1994年，《美国国家科学院院刊》，第91卷，第2176-2180页)以及Hush et al.(1994)The Journal of Cell Science 107：775-784(Hush等人，1994年，《细胞科学杂志》，第107卷，第775-784页)，所有文献均以引用方式并入本文。
在其他实施例中，编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触而被引入到植物中。通常，这类方法涉及将本发明的核苷酸构建体掺入DNA或RNA分子内部。应认识到，GH3序列可最初作为病毒多聚蛋白的一部分来合成，其以后可通过体内或体外蛋白水解加工而产生所需的重组蛋白。此外，应认识到，本发明的启动子还涵盖用于通过病毒RNA聚合成酶进行的转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子的用于将多核苷酸引入植物中并表达其中所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如美国专利No.5,889,191、No.5,889,190、No.5,866,785、No.5,589,367、No.5,316,931，以及Porta et al.(1996)MolecularBiotechnology 5：209-221(Porta等人，1996年，《分子生物技术》，第5卷，第209-221页)；所述文献以引用方式并入本文。
用于在植物基因组中特定位置处定向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，使用位点特异性重组系统，实现在所需的基因组位置处插入多核苷酸。参见(例如)WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，所有这些专利均以引用的方式并入本文。简单而言，可将本发明的多核苷酸包含在转移盒中，该转移盒两侧带有两个不引起重组的重组位点。将转移盒引入到在其基因组中稳定掺入了这样的靶标位点的植物中，该靶标位点两侧带有两个对应于该转移盒的所述位点的不引起重组的重组位点。提供适当的重组酶并且将所述转移盒整合在靶位点处。所关注的多核苷酸因此整合在植物基因组中的特定染色体位置。用于靶向多核苷酸的其他方法在WO 2009/114321(以引用方式并入本文)中有所描述，该专利描述了产生的“定制的”大范围核酸酶以用于修饰植物基因组，尤其是玉蜀黍的基因组。还可参见，Gao et al.(2010)Plant Journal 1：176-187(Gao等人，2010年，《植物杂志》，第1卷，第176-187页)。
转化的细胞可以根据常规方式培育成植株。参见例如，McCormick etal.(1986)Plant Cell Reports 5：81-84(McCormick等人，1986年，《植物细胞报道》，第5卷，第81-84页)。然后可使这些植物生长，用相同的转化植株或不同的植株进行授粉，并且鉴定具有所需表型特征的组成型表达的所得子代。可以培育两代或更多代以确保稳定保持和遗传所需表型特征的表达，然后收获种子以确保已经实现所需表型特征的表达。以此方式，本发明提供在其基因组中稳定掺入了本发明的多核苷酸(例如本发明的表达盒)的转化种子(也称为“转基因种子”)。
另外的所关注宿主细胞包括例如原核生物，包括各种大肠杆菌菌株和其他微生物菌株。在本文中定义为包括用于转录起始的启动子(任选具有操纵子)以及核糖体结合序列的常用原核控制序列包括诸如β-内酰胺酶(青霉素酶)启动子系统和乳糖(lac)启动子系统(Chang et al.(1977)Nature198：1056(Chang等人，1977年，《自然》，第198卷，第1056页))、色氨酸(trp)启动子系统(Goeddel et al.(1980)Nucleic Acids Res.8：4057(Goeddel等人，1980年，《核酸研究》，第8卷，第4057页))和λ衍生的PL启动子之类的常用启动子，以及N-基因核糖体结合位点(Shimatake et al.(1981)Nature 292：128(Shimatake等人，1981年，《自然》，第292卷，第128页))。在转染进大肠杆菌中的DNA载体中包含选择标记也是有用的。这种标记的例子包括确定对氨苄青霉素、四环素或氯霉素的抗性的基因。
选择载体以使得能引入到适当的宿主细胞中。细菌载体通常是质粒或噬菌体起源的。将适当的细菌细胞用噬菌体载体颗粒转染或用裸噬菌体载体DNA转染。如果使用质粒载体，则将细菌细胞用质粒载体DNA转染。表达本发明蛋白质的表达系统可以使用芽孢杆菌属(Bacillus)物种和沙门氏菌属(Salmonella)提供(Palva et al.(1983)Gene 22：229-235(Palva等人，1983年，《基因》，第22卷，第229-235页))；Mosbach et al.(1983)Nature 302：543-545(Mosbach等人，1983年，《自然》，第302卷，第543-545页))。
多种酵母表达系统是本领域的技术人员已知的。两种广泛采用的用于产生真核蛋白质的酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。用于在酿酒酵母和毕赤酵母中进行表达的载体、菌株和方案是本领域已知的，可从商业供应商获得。参见例如Sherman et al.(1982)Methods in Yeast Genetics，Cold Spring Harbor Laboratory(Sherman等人，1982年，《酵母遗传学方法》，冷泉港实验室出版社)。
VII.使用方法
A.对生长素类似物除草剂解毒的方法
提供了一种对生长素类似物除草剂解毒的方法。这种方法采用增加植物、植物细胞、植物部分、外植体、种子中GH3多肽或其活性变体或片段的水平以及将至少一种生长素类似物除草剂施加至该植物、植物细胞或植物部分。该GH3多肽具有氨基酸/生长素类似物除草剂缀合活性并且可作用以形成具有降低的除草剂活性的氨基酸/生长素缀合物。在具体的实施例中，该具有降低的除草活性的氨基酸/生长素缀合产物包括天冬氨酸/生长素类似物缀合物、谷氨酸/生长素类似物缀合物、天冬氨酸/麦草畏缀合物、谷氨酸/麦草畏缀合物、天冬氨酸/2，4-D缀合物，和/或谷氨酸/2，4-D缀合物。
在另外的实施例中，相对于不具有或不表达异源GH3序列的适当对照植物、植物部分或细胞，宿主细胞、植物或植物部分中该GH3多肽的浓度/水平增加至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％、500％、1000％、5000％或10,000％。在其他实施例中，相较于天然GH3序列的水平，在该植物或植物部分中GH3多肽的水平增加10、20、30、40、50、60、70、80、90、100倍或更多。GH3多肽水平的这种增加可用各种方法来实现，包括例如通过一种或多种GH3多肽的多个拷贝的表达和/或通过采用启动子来驱动该序列的更高水平表达。
在具体的实施例中，编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸被引入到宿主细胞、植物、植物细胞、外植体或植物部分中。随后，用本领域技术人员已知的方法选出具有引入的GH3序列的宿主细胞或植物细胞，所述方法诸如但不限于DNA印迹分析、DNA测序、PCR分析或表型分析。将经前述实施例改变或修饰的植物或植物部分在形成植物的条件下培育一段时间，该时间足以调节本发明多肽在该植物中的浓度和/或活性。形成植物的条件是本领域公知的，在本文别处有简要介绍。
在一个实施例中，提供了一种制备生长素类似物除草剂耐受性植物细胞的方法，该方法包括用编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸转化植物细胞。在具体的实施例中，该方法还包括通过使植物细胞在足够浓度的生长素类似物除草剂中生长并且选择表现出对生长素类似物除草剂增强的耐受性的细胞或植物，来选择表现出对生长素类似物除草剂(诸如麦草畏或2，4-D)增强的抗性或耐受性的植物细胞。
还应认识到，植物或植物细胞中天然GH3序列的水平和/或活性可通过采用不能够在转化植物中引导蛋白或RNA表达的多核苷酸来改变。例如，编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸可用于设计能够在用于改变或突变生物体中的基因组核苷酸序列的方法中采用的多核苷酸构建体。这类多核苷酸构建体包括但不限于：RNA：DNA载体、RNA：DNA突变载体、RNA：DNA修复载体、混合双链体寡核苷酸、自身互补RNA：DNA寡核苷酸和引起重组的寡核苷酸。这类核苷酸构建体和使用方法是本领域已知的。参见美国专利No.5,565,350、No.5,731,181、No.5,756,325、No.5,760,012、No.5,795,972和No.5,871,984；所有这些专利均以引用方式并入本文。还可参见WO 98/49350、WO 99/07865、WO 99/25821和Beetham，et al.，(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96：8774-8778(Beetham等人，1999年，《美国国家科学院院刊》，第96卷，第8774-8778页)；所述文献以引用方式并入本文。
因此应认识到，本发明的方法并不依赖于将完整多核苷酸掺入到基因组中，只要将多核苷酸引入到细胞中而使植物或其细胞被改变即可。在一个实施例中，基因组可在将该多核苷酸引入细胞之后被改变。基因组的变更包括但不限于基因组中核苷酸的添加、缺失和置换。虽然本文所提供的方法并不依赖于任何具体数目的核苷酸的添加、缺失和置换，但应认识到此类添加、缺失或置换包含至少一个核苷酸。
在另一个实施例中，提供了一种产生生长素类似物除草剂耐受性宿主细胞(即，诸如大肠杆菌之类的微生物细胞)的方法，该方法包括将编码GH3多肽或其活性变体或片段的多核苷酸引入到宿主细胞(即，诸如大肠杆菌之类的微生物细胞)中。表达这种GH3序列的微生物宿主细胞可用于生物修复。
如本文所用，“生物修复”是使用微生物代谢来移除污染性材料。在此类实施例中，使表达GH3多肽的有效量的微生物宿主与含有生长素类似物除草剂(诸如，麦草畏或2，4-D)的被污染材料(即，土壤)接触。该微生物宿主对生长素类似物除草剂解毒并从而降低该材料(即，土壤)中的污染物水平。这种方法可原位或异位进行。原位生物修复涉及在现场处理被污染的材料，而异位生物修复涉及将被污染材料移除到其他地方进行处理。
B.生产作物和控制杂草的方法
提供了用于在耕作区中控制杂草、预防耕作区中除草剂抗性杂草的发育或出现、生产作物以及增加作物安全性的方法。术语“控制”及其衍生形式，例如“控制杂草”是指以下的一者或多者：抑制杂草生长、发芽、繁殖和/或增殖；和/或杀灭、移除、破坏杂草或者以其他方式减少杂草的发生率和/或活性。
本文所用的“耕作区”包括期望在其中栽培植物的任何区域。这种耕作区包括但不限于在其中栽培植物的田地(如作物田、草地、树林地、生产林、用于栽培水果和蔬菜的田地等等)、温室、生长室等等。
如本文所用，所谓“选择性地控制”意指耕作区中的大部分杂草被显著地损伤或杀灭，而如果该田地中还存在作物植物，那么大部分作物植物并无显著损伤。因此，当至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的杂草被显著地损伤或杀灭，同时如果该田地中还存在作物植物，则少于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％的作物植物被显著地损伤或杀灭时，方法被视为选择性控制杂草。
所提供的方法包括在耕作区中种植含有编码GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸的植物或种子，以及在具体的实施例中将有效量的所关注除草剂施加至该作物、种子、杂草和/或其耕作区。已经认识到可以在将作物种植于耕作区中之前或之后施加除草剂。这种除草剂应用可包括施加生长素类似物除草剂，该生长素类似物除草剂包括但不限于源自以下家族中的一者的生长素类似物除草剂：苯氧基、羧酸(或吡啶)、苯甲酸、环丙嘧啶酸，以及喹啉羧酸。在具体的实施例中，生长素类似物除草剂可包括下列中的至少一者：(2，4-二氯苯氧基)乙酸、4-(2，4-二氯苯氧基)丁酸(2，4-DB)、2-(2，4-二氯苯氧基)丙酸(2，4-DP)、(2，4，5-三氯苯氧基)乙酸(2，4，5-T)、2-(2，4，5-三氯苯氧基)丙酸(2，4，5-TP)、2-(2，4-二氯-3-甲基苯氧基)-N-苯丙酰胺(氯甲酰草胺)、(4-氯-2-甲基苯氧基)乙酸(MCPA)、4-(4-氯邻甲苯氧基)丁酸(MCPB)、2-(4-氯-2-甲基苯氧基)丙酸(MCPP)、3，6-二氯-2-吡啶甲酸(二氯吡啶酸)、4-氨基-3，5，6-三氯-2-吡啶甲酸(毒莠定)、(2，4，5-三氯苯氧基)乙酸(绿草定)、4-氨基-3，5-二氯-6-氟-2-吡啶氧基乙酸(氟草烟)、3，6-二氯-邻甲氧基苯甲酸(麦草畏)和3-氨基-2，5-二氯苯甲酸(草灭畏)、3，7-二氯-8-喹啉羧酸(二氯喹啉酸)和7-氯-3-甲基-8-喹啉羧酸(氯甲喹啉酸)。在具体的实施例中，生长素类似物除草剂包括麦草畏或2，4-D。一般来讲，施加至田地的有效量的除草剂足以选择性地控制杂草，而不会显著地影响作物。
本文所用的“杂草”是指不希望在特定区域中存在的植物。反之，本文所用的“作物植物”是指希望在特定区域中存在的植物，诸如玉蜀黍或大豆植株。因此，在一些实施例中，杂草是一种非作物类植物或非作物类物种，而在一些实施例中，杂草是力图被从特定区域中消除的一种作物物种，诸如在种植有含有编码GH3多肽或其活性变体或片段的异源核苷酸序列的植物的田地中的劣种和/或非转基因大豆植株。
还提供了一种通过使耐受生长素类似物除草剂的作物植物在使作物植物生产作物的条件下生长以及收获该作物来生产作物的方法，该作物耐受生长素类似物除草剂是因为用编码GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸进行了转化。优选地，以可有效控制杂草而不妨碍转基因作物植物生长并生产作物的浓度将生长素类似物除草剂施加到植物、或植物附近、或耕作区中。生长素类似物除草剂的施加可以在种植之前，或者在种植之后直至并且包括收获时间的任意时间。该生长素类似物除草剂可施加一次或多次。生长素类似物除草剂施加的时间安排、施加量、施加方式以及其他参数将基于作物植物的具体性质和生长环境而变化。本发明还提供通过这种方法生产的作物。
还提供了用于包含编码GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸的植物繁殖的方法。所述植物可为例如单子叶植物或双子叶植物。在一个方面，繁殖需要使包含编码GH3多肽转基因的异源多核苷酸的植株与第二植株杂交，以使得杂交的至少一些子代显示出生长素类似物除草剂耐受性。
本发明的方法还允许开发与含有编码GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸的植物一起使用的除草剂应用。在这种方法中，评价了耕作区中的环境条件。可评价的环境条件包括但不限于：地下和地表水污染问题、作物的预期使用、作物耐受性、土壤残留物、耕作区中存在的杂草、土壤结构、土壤的pH、土壤中有机物质的量、施用设备和耕作方式。在评价环境条件后，可将有效量的除草剂组合施加至作物、作物部分、作物的种子或耕作区。
可将任何除草剂或除草剂组合施加到含有编码本文所公开的GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸的植物，或者源于该植物的转基因种子、作物部分或者包含该作物植物的耕作区。所谓“用除草剂的组合处理”或者“将除草剂的组合施加至”作物、耕作区或田地，意指用被指示为该组合的一部分的除草剂和/或化学品中的每一者处理特定的田地、作物或杂草以便实现所需效果，即，以便杂草被选择性地控制同时作物无显著损伤。每种除草剂和/或化学品的施加可为同时的，或者所述施加可在不同时间(顺序的)，只要实现所需效果即可。此外，所述施加可在作物种植之前进行。
除草剂的分类(即，将除草剂分组为不同类别和子类别)是在本领域中熟知的并且包括由HRAC(除草剂抗性行动委员会)和WSSA(美国杂草科学协会)制定的分类(还可参见Retzinger and Mallory-Smith(1997)Weed Technology 11：384-393(Retzinger和Mallory-Smith，1997年，《杂草技术》，第11卷，第384-393页))。HRAC分类的简化版(带有关于相应WSSA分组的注释)在下表1中示出。
除草剂可以按照其作用模式和/或作用部位来分类并且还可以按照其施加时间(例如，出苗前或出苗后)、按照其施加方法(例如，叶面施加或土壤施加)，或者按照其如何被植物吸收或如何影响植物，或者按照其结构来分类。“作用模式”通常是指植物中除草剂抑制或以其他方式损害的代谢或生理过程，而“作用位点”通常是指植物中该除草剂作用或者直接相互作用的物理位置或生物化学位点。除草剂可以多种方式分类，包括按照其作用模式和/或作用位点分类(参见，例如，表1)。
在具体的实施例中，本发明的植物可耐受不同类型的除草剂(即，具有不同作用模式和/或不同作用位点的除草剂)的处理，从而允许所推荐的、改进的杂草治理策略，以便减少除草剂耐受性杂草的发生率和流行率。
表1：HRAC除草剂分类的简化版
I.ALS抑制剂(WSSA第2组)
A.磺酰脲
1.四唑嘧磺隆
2.氯嘧磺隆乙酯
3.甲磺隆甲酯
4.烟嘧磺隆
5.玉嘧磺隆
6.甲嘧磺隆甲酯
7.噻吩磺隆甲酯
8.苯磺隆甲酯
9.酰嘧磺隆
10.苄嘧磺隆甲酯
11.氯磺隆
12.醚磺隆
13.环丙嘧磺隆
14.胺苯磺隆甲酯
15.乙氧嘧磺隆
16.啶嘧磺隆
17.氟啶嘧磺隆甲酯
18.甲酰胺磺隆
19.咪唑磺隆
20.碘甲磺隆甲酯
21.甲基二磺隆甲酯
22.环氧嘧磺隆
23.氟嘧磺隆甲酯
24.氟丙磺隆
25.吡嘧磺隆乙酯
26.磺酰磺隆
27.醚苯磺隆
28.三氟啶磺隆
29.氟胺磺隆甲酯
30.三氟甲磺隆
31.氯吡嘧磺隆甲酯
32.氟吡磺隆
B.磺酰基氨基羰基三唑啉酮
1.氟酮磺隆
2.丙苯磺隆
C.三唑并嘧啶
1.氯酯磺草胺甲酯
2.唑嘧磺草胺
3.双氯磺草胺
4.双氟磺草胺
5.磺草唑胺
6.五氟磺草胺
7.甲氧磺草胺
D.嘧啶基氧基(硫代)苯甲酸酯
1.双草醚
2.环酯草醚
3.嘧啶肟草醚
4.嘧草硫醚
5.嘧草醚甲酯
E.咪唑啉酮
1.灭草烟
2.咪草烟
3.灭草喹
4.甲基咪草烟
5.咪草酸甲酯
6.甲氧咪草烟
II.其他除草剂--活性成分/另外的作用模式
A.乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)的抑制剂(WSSA第1组)
1.芳氧基苯氧基丙酸酯(‘FOP’)
a.精喹禾灵
b.禾草灵甲酯
c.炔草酯
d.精恶唑禾草灵
e.精吡氟禾草灵
f.喔草酯
g.高效氟吡甲禾灵
h.氰氟草酯
i.精喹禾灵
2.环己二酮(‘DIM’)
a.禾草灭
b.丁苯草酮
c.烯草酮
d.噻草酮
e.稀禾定
f.吡喃草酮
g.三甲苯草酮
B.光系统II的抑制剂-HRAC第C1组/WSSA第5组
1.三嗪
a.莠灭净
b.莠去津
c.氰草津
d.敌草净
e.二甲丙乙净
f.扑灭通
g.扑草净
h.扑灭津
i.西玛津
j.西草净
k.特丁通
l.特丁津
m.特丁净
n.草达津
2.三嗪酮
a.环嗪酮
b.嗪草酮
c.苯嗪草酮
3.三唑啉酮
a.氨唑草酮
4.尿嘧啶
a.除草定
b.环草定
c.特草定
5.哒嗪酮
a.杀草敏
6.苯基氨基甲酸酯
a.甜菜安
b.苯敌草
C.光系统II的抑制剂--HRAC第C2组/WSSA第7组
1.尿素
a.伏草隆
b.利谷隆
c.氯溴隆
d.绿麦隆
e.枯草隆
f.恶唑隆
g.敌草隆
h.磺噻隆
i.非草隆
j.异丙隆
k.异恶隆
l.甲基苯噻隆
m.溴谷隆
n.甲氧隆
o.绿谷隆
p.草不隆
q.环草隆
r.特丁噻草隆
2.酰胺
a.敌稗
b.甲氯酰草胺
D.光系统II的抑制剂--HRAC第C3组/WSSA第6组
1.腈
a.溴酚肟
b.溴苯腈
c.碘苯腈
2.苯并噻二嗪酮(苯达松)
a.苯达松
3.苯基哒嗪
a.达草特
b.氯苯哒醇
E.光系统I电子转移(联吡啶)(WSSA第22组)
1.杀草快
2.百草枯
F.PPO(原卟啉原氧化酶)的抑制剂(WSSA第14组)
1.二苯醚
a.三氟羧草醚钠盐
b.治草醚
c.甲氧除草醚
d.乙羧氟草醚
e.氟磺胺草醚
f.氟硝磺酰胺(Halosafen)
g.乳氟禾草灵
h.乙氧氟草醚
2.苯基吡唑
a.异丙吡草酯
b.吡草醚
3.N-苯基酞酰亚胺
a.吲哚酮草酯
b.丙炔氟草胺
c.氟烯草酸戊酯
4.噻二唑
a.嗪草酸甲酯
b.噻二唑草胺
5.噁二唑
a.噁草酮
b.丙炔噁草酮
6.三唑啉酮
a.唑酮草酯
b.甲磺草胺
7.噁唑烷二酮
a.环戊噁草酮
8.嘧啶二酮
a.双苯嘧草酮
b.氟丙嘧草酯
9.其他
a.双唑草腈
b.氟唑草胺
G.白化：八氢番茄红素去饱和酶步骤(PDS)处的类胡萝卜素生物合成的抑制(WSSA第12组)
1.哒嗪酮
a.哒草伏
2.吡啶羧基酰胺
a.吡氟酰草胺
b.氟吡酰草胺
3.其他
a.氟丁酰草胺
b.氟啶草酮
c.氟咯草酮
d.呋草酮
H.白化：4-羟苯基-丙酮酸-双加氧酶(4-HPPD)的抑制(WSSA第28组)
1.三酮
a.硝磺草酮
b.磺草酮
c.苯吡唑草酮
d.环磺酮
2.异噁唑
a.磺酰草吡脱
b.异噁氟草酮
3.吡唑
a.吡草酮
b.苄草唑
c.吡唑特
4.其他
a.苯并双环酮
I.白化：类胡萝卜素生物合成(未知靶标)的抑制(WSSA第11和13组)
1.三唑(WSSA第11组)
a.杀草强
2.异噁唑烷二酮(WSSA第13组)
a.异噁草酮
3.尿素
a.伏草隆
3.二苯醚
a.苯草醚
J.EPSP合成酶的抑制
1.甘氨酸(WSSA第9组)
a.草甘膦
b.草硫膦
K.谷氨酰胺合成酶的抑制
1.次膦酸
a.草铵膦
b.双丙氨磷
L.DHP(二氢蝶酸)合成酶的抑制(WSSA第18组)
1.氨基甲酸酯
a.黄草灵
M.微管组装抑制(WSSA第3组)
1.二硝基苯胺
a.氟草胺
b.丁乐灵
c.氨氟灵
d.乙丁烯氟灵
e.氨磺乐灵
f.二甲戊乐灵
g.氟乐灵
2.磷酸酰胺化物
a.甲基胺草磷
b.抑草磷
3.吡啶
a.氟硫草定
b.噻草啶
4.苯甲酰胺
a.拿草特
b.牧草胺
5.苯二羧酸
a.氯酞酸二甲酯
N.有丝分裂/微管组织的抑制(WSSA第23组)
1.氨基甲酸酯
a.氯苯胺灵
b.苯胺灵
c.卡草胺
O.细胞分裂的抑制(以所提出的机制抑制极长链脂肪酸；WSSA第15组)
1.氯乙酰胺
a.乙草胺
b.甲草胺
c.丁草胺
d.二甲草胺
e.二甲吩草胺
f.吡唑草胺
g.异丙甲草胺
h.烯草胺
i.丙草胺
j.毒草胺
k.异丙草胺
l.甲氧噻草胺
2.乙酰胺
a.双苯酰草胺
b.萘丙酰草胺
c.萘丙胺
3.氧乙酰胺
a.氟噻草胺
b.苯噻草胺
4.四唑啉酮
a.四唑酰草胺
5.其他
a.莎稗磷
b.苯酮唑
c.茚草酮
d.哌草磷
P.细胞壁(纤维素)合成的抑制
1.腈(WSSA第20组)
a.敌草腈
b.赛草青
2.苯甲酰胺(异噁草胺(WSSA第21组))
a.异噁草胺
3.三唑羧基酰胺(氟胺草唑)
a.氟胺草唑
Q.解偶联(膜破坏)：(WSSA第24组)
1.二硝基酚
a.DNOC
b.地乐酚
c.特乐酚
R.通过非ACC抑制的方式抑制脂质合成
1.硫代氨基甲酸酯(WSSA第8组)
a.丁草特
b.环草特
c.哌草丹
d.菌达灭
e.戊草丹
f.禾草敌
g.坪草丹
h.克草猛
i.苄草丹
j.杀草丹
k.仲草丹
l.野麦畏
m.灭草猛
2.二硫代磷酸酯
a.地散磷
3.苯并呋喃
a.呋草黄
b.乙呋草黄
4.卤化链烷酸(WSSA第26组)
a.TCA
b.茅草枯
c.四氟丙酸
S.合成生长素(IAA样)(WSSA第4组)
1.苯氧羧酸
a.氯甲酰草胺
b.，4-D
c.2-甲-4-氯丙酸
2.苯甲酸
a.麦草畏
b.草灭畏
c.TBA
3.吡啶羧酸
a.二氯吡啶酸
b.氯氟吡氧乙酸
c.毒莠定
d.绿草定
4.喹啉羧酸
a.二氯喹啉酸
b.氯甲喹啉酸
5.其他(草除灵乙酯)
a.草除灵乙酯
6.环丙嘧啶酸
T.生长素运输的抑制
1.邻苯二甲酸酯；缩氨基脲(WSSA第19组)
a.萘草胺
b.氟吡草腙钠盐
U.其他作用机制
1.芳氨基丙酸
a.麦草伏-M-甲酯/-异丙酯
2.吡唑鎓
a.野燕枯
3.有机砷
a.DSMA
b.MSMA
4.其他
a.溴丁酰草胺
b.环庚草醚
c.苄草隆
d.棉隆
e.杀草隆甲酯
f.杀草隆
g.乙氧苯草胺
h.蔓草磷
i.威百亩
j.噁嗪草酮
k.油酸
l.壬酸
m.稗草畏
在另外的方法中，生长素类似物除草剂可单独施加或者与另一所关注除草剂组合施加，并且可施加至含有编码GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸的植物或其耕作区。
可施加于含有编码GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸的植物或种子的另外的除草剂处理剂包括但不限于：乙草胺、三氟羧草醚及其钠盐、苯草醚、丙烯醛(2-丙烯醛)、甲草胺、禾草灭、莠灭净、氨唑草酮、酰嘧磺隆、氯氨吡啶酸、环丙嘧啶酸、杀草强、氨基磺酸铵、莎稗磷、黄草灵、莠去津、四唑嘧磺隆、氟丁酰草胺、草除灵、草除灵乙酯、苯卡巴腙、氟草胺、呋草黄、苄嘧磺隆甲酯、地散磷、灭草松、苯并双环酮、吡草酮、治草醚、双丙氨膦、双草醚及其钠盐、除草定、溴丁酰草胺、溴酚肟、溴苯腈、溴苯腈辛酸酯、丁草胺、氟丙嘧草酯、抑草磷、丁乐灵、丁苯草酮、丁草特、苯酮唑、卡草胺、唑酮草酯、儿茶素、甲氧除草醚、草灭畏、氯溴隆、氯甲丹、杀草敏、氯嘧磺隆乙酯、绿麦隆、氯苯胺灵、氯磺隆、氯酞酸二甲酯、赛草青、吲哚酮草酯、环庚草醚、醚磺隆、烯草酮、炔草酯、异噁草酮、氯甲酰草胺、二氯吡啶酸、二氯吡啶酸乙醇胺盐、氯酯磺草胺甲酯、CUH-35(2-甲氧基乙基2-[[[4-氯-2-氟-5-[(1-甲基-2-丙炔基)氧基]苯基](3-氟苯甲酰)氨基]羰基]-1-环己烯-1-羧酸酯)、苄草隆、氰草津、环草特、环丙嘧磺隆、噻草酮、氰氟草酯、2，4-D及其丁氧基乙酯、丁基酯、异辛酯和异丙基酯及其二甲基铵盐、二乙醇胺盐和三乙醇胺盐、杀草隆、茅草枯、茅草枯钠、棉隆、2，4-DB及其二甲基铵盐、钾盐和钠盐、甜菜安、敌草净、麦草畏及其二甘醇铵盐、二甲基铵盐、钾盐和钠盐、敌草腈、2，4-滴丙酸、禾草灵甲酯、双氯磺草安、野燕枯甲硫酸盐(difenzoquat metilsulfate)、吡氟酰草胺、氟吡草腙、恶唑隆、哌草丹、二甲草胺、二甲丙乙净、二甲吩草胺、精二甲吩草胺、噻节因、二甲胂酸及其钠盐、氨氟灵、特乐酚、双苯酰草胺、敌草快、氟硫草定、敌草隆、DNOC、草多索、菌达灭、戊草丹、乙丁烯氟灵、胺苯磺隆甲酯、乙呋草黄、氯氟草醚、乙氧嘧磺隆、乙氧苯草胺、恶唑禾草灵、精恶唑禾草灵、四唑酰草胺、非草隆、去草隆、麦草氟甲酯、麦草伏-M-异丙酯、麦草伏-M-甲酯、啶嘧磺隆、双氟磺草胺、吡氟禾草灵、精吡氟禾草灵、氟酮磺隆、氟吡磺隆、氟消草、氟噻草胺、氟哒嗪、氟哒嗪草酯、唑嘧磺草胺、氟烯草酸戊酯、丙炔氟草胺、伏草隆、乙羧氟草醚、氟啶嘧磺隆及其钠盐、抑草丁、芴醇丁酯、氟啶草酮、氟咯草酮、氯氟吡氧乙酸、呋草酮、嗪草酸甲酯、氟黄胺草醚、甲酰胺磺隆、氨基甲酰基膦酸乙酯铵盐、草胺磷、草铵磷、草甘膦及其盐类诸如铵盐、异丙基铵盐、钾盐、钠盐(包括倍半钠盐)以及三甲基锍盐(或者称为草硫膦盐)(参见，WO2007/024782，以引用的方式并入本文)、氯吡嘧磺隆甲酯、氯氟乙禾灵、氟吡甲禾灵、环嗪酮、HOK-201(N-(2，4-二氟苯基)-1，5-二氢-N-(1-甲基乙基)-5-氧代-1-[(四氢-2H-吡喃-2-基)甲基]-4H-1，2，4-三唑-4-酰胺)、咪草酸甲酯、甲氧咪草烟、甲基咪草烟、灭草烟、灭草喹、灭草喹铵盐、咪草烟、咪草烟铵盐、咪唑磺隆、茚草酮、碘甲磺隆甲酯、碘苯腈、碘苯腈辛酸酯、碘苯腈钠、异丙隆、异恶隆、异噁草胺、异噁氟草酮、磺酰草吡脱、乳氟禾草灵、环草定、利谷隆、抑芽丹、MCPA及其盐(例如，2甲4氯二甲胺盐、2甲4氯钾盐和2甲4氯钠盐)、酯(例如，2甲4氯-2-乙基己基酯、2甲4氯丁氧基乙酯)及硫酯(例如，2甲4氯乙硫酯)、MCPB及其盐(例如，2甲4氯丁酸钠)以及酯(例如，2甲4氯丁酸乙酯)、2-甲-4-氯丙酸、高2甲4氯丙酸、苯噻草胺、氟磺酰草胺、甲基二磺隆甲酯、硝磺草酮、威百亩、恶唑酰草胺、苯嗪草酮、吡唑草胺、甲基苯噻隆、甲胂酸及其钙盐、单铵盐、单钠盐及二钠盐、甲基杀草隆、甲氧苯草隆、溴谷隆、异丙甲草胺、精异丙甲草胺、磺草唑胺、甲氧隆、嗪草酮、甲磺隆甲酯、禾草敌、绿谷隆、萘丙胺、萘丙酰草胺、萘草胺、草不隆、烟嘧磺隆、哒草伏、坪草丹、氨磺乐灵、丙炔噁草酮、噁草酮、环氧嘧磺隆、噁嗪草酮、乙氧氟草醚、百草枯二氯盐、克草猛、壬酸、二甲戊乐灵、五氟磺草胺、甲氯酰草胺、环戊噁草酮、氟草磺胺、烯草胺、苯敌草、毒莠定、毒莠定钾盐、氟吡酰草胺、唑啉草酯、哌草磷、丙草胺、氟嘧磺隆甲酯、氨氟乐灵、环苯草酮、扑灭通、扑草净、毒草胺、敌稗、喔草酯、扑灭津、苯胺灵、异丙草胺、丙苯磺隆、戊炔草胺、苄草丹、氟磺隆、双唑草腈(pyraclonil)、吡草醚、磺酰草吡脱、双唑草腈(pyrazogyl)、吡唑特、苄草唑、吡嘧磺隆乙酯、嘧啶肟草醚、稗草畏、达草特、环酯草醚、嘧草醚甲酯、吡丙醚、嘧草硫醚(pyrithiobac)、嘧草硫醚(pyrithiobac-sodium)、甲氧磺草胺、二氯喹啉酸、氯甲喹啉酸、灭藻醌、喹禾灵、精喹禾灵、糖草酯、玉嘧磺隆、稀禾定、环草隆、西玛津、西草净、磺草酮、甲磺草胺、甲嘧磺隆甲酯、磺酰磺隆、2，3，6-TBA、三氯乙酸、三氯乙酸钠、牧草胺、特丁噻草隆、特呋三酮、环磺酮、吡喃草酮、特草定、特丁通、特丁津、特丁净、甲氧噻草胺、噻草啶、噻酮磺隆、噻吩磺隆甲酯、禾草丹、仲草丹、苯吡唑草酮、三甲苯草酮、野麦畏、醚苯磺隆、三嗪氟草胺、苯磺隆甲酯、绿草定、绿草定-2-丁氧基乙酯、绿草定-三乙基铵、灭草环、草达津、三氟啶磺隆、氟乐灵、氟胺磺隆甲酯、三氟甲磺隆和灭草猛。
另外的除草剂包括施加于含有尿黑酸茄尼基转移酶(HST)多肽的植物的那些除草剂，诸如在WO2010029311(A2)中描述的那些，该专利全文以引用方式并入本文。
其他合适的除草剂和农业化学品是本领域已知的，诸如，在WO2005/041654中描述的那些。其他除草剂还包括生物除草剂，诸如损毁链格孢(Ailernaria destruens Simmons)、刺盘孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporiodes(Penz.)Penz.&Sacc.)、稗内脐蠕孢菌(Drechsiera monoceras)(MTB-951)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria(Albertini&Schweinitz)Ditmar：Fries)、棕榈疫霉(Phytophthora palmivora(Butl.)Butl.)和遏蓝菜柄锈菌(Puccinia thlaspeos Schub)。各种除草剂的组合可得到对杂草大于加性(即，协同)的效应和/或对作物或者其他所需植物小于加性(即提高安全性)的效应。在某些情形中，生长素类似物除草剂与具有类似控制谱但是不同作用模式的其他除草剂的组合将尤其有利于预防抗性杂草的发育。
其中除草剂施加至所关注区域(以及其中的任何植物)的时间对于实现杂草最佳控制可为重要的。施加除草剂的时间可参考所关注区域中植物的大小和/或植物生长和/或发育阶段来决定，所述植物为例如，生长在该区域中的作物植物或杂草。
除草剂的有效量范围可在例如源自大学推广服务的各种出版物中找到。参见例如，Bernards et al.(2006)Guide for Weed Management inNebraska(Bernards等人，2006年，内布拉斯加州中的杂草治理指南)(WWW.ianrpubs.url.edu/sendlt/ec130)；Regher et al.(2005)Chemical WeedControl for Fields Crops，Pastures，Rangeland， and Noncropland，Kansas StateUniversity Agricultural Extension Station and Corporate Extension Service(Regher等人，2005年，用于田地作物、牧场、牧地和非耕地的化学杂草控制，堪萨斯州立大学农业推广站与企业推广服务)；Zollinger et al.(2006)North Dakota Weed Control Guide，North Dakota Extension Service(Zollinger等人，2006年，北达科他州杂草控制指南，北达科他州推广服务)，并且爱荷华州立大学推广网址为www.weeds.iastate.edu，所述文献的每一篇以引用方式并入本文。
许多植物物种可通过本文描述的除草剂来控制(即，杀灭或损伤)。因此，本发明的方法可用于在这些植物物种是非期望的地方(即，在它们是杂草的地方)控制这些植物物种。这些植物物种包括作物植物以及通常被视为杂草的物种，包括但不限于诸如以下物种：黑草(Alopecurusmyosuroides)、大狗尾草(Setaria faberi)、马唐(Digitaria sanguinalis)、苏里南草(Brachiaria decumbens)、野燕麦(Avena fatua)、普通苍耳(Xanthiumpensylvanicum)、普通藜(Chenopodium album)、牵牛花(Ipomoea coccinea)、猪草(Amaranthus spp.)、普通水萱麻(Amaranthus tuberculatus)、绒毛叶(Abutilion theophrasti)、普通稗草(Echinochloa crus-galli)、百慕大草(Cynodon dactylon)、旱雀麦(Bromus tectorum)、牛筋草(Eleusine indica)、狗尾草(Setaria viridis)、多花黑麦草(Lolium multiflorum)、约翰逊草(Sorghumhalepense)、小子虉草(Phalaris minor)、风剪草(Apera spica-venti)、域毛杯草(Erichloa villosa)、油莎草(Cyperus esculentus)、普通繁缕(Stellariamedia)、普通豚草(Ambrosia artemisiifolia)、地肤(Kochia scoparia)、小飞蓬(Conyza canadensis)、硬直黑麦草(Lolium rigidum)、牛筋草(Eleucineindica)、野塘蒿(Conyza bonariensis)、长叶车前(Plantago lanceolata)、热带紫露草(Commelina benghalensis)、田旋花(Convolvulus arvensis)、香附(Cyperus rotundus)、小红藤(Brunnichia ovata)、大果田菁(Sesbaniaexaltata)、决明(Senna obtusifolia)、德州蓝蓟(Helianthus ciliaris)以及钩果草(Proboscidea louisianica)。在其他实施例中，杂草包括除草剂抗性黑麦草，例如草甘膦抗性黑麦草、百草枯抗性黑麦草、ACC酶抑制剂抗性黑麦草，以及非选择性的除草剂抗性黑麦草。
在一些实施例中，含有编码GH3多肽或其活性变体或片段的异源多核苷酸的植物未被施加至该植物的生长素类似物除草剂的处理显著损伤，而适当的对照植物被相同的处理显著地损伤。
一般来讲，生长素类似物除草剂施加至特定田地(以及该田地中生长的任何植物)一年不超过1、2、3、4、5、6、7或者8次，或者每个生长季节不超过1、2、3、4或者5次。因此本发明的方法涵盖“出苗前”、“出苗后”、“种植前掺入”和/或涉及种植前种子处理的除草剂施加。
在一个实施例中，提供了用于对种子包衣的方法。所述方法包括用有效量的除草剂或者除草剂组合(如在本文别处所公开的)对种子进行包衣。所述种子随后可种植于耕作区。还提供了具有包含有效量的除草剂或者除草剂组合的包衣的(如在本文别处所公开的)种子。在其他实施例中，所述种子可包被有至少一种杀真菌剂和/或至少一种杀昆虫剂和/或至少一种除草剂，或者它们的任何组合。
“出苗前”是指除草剂在植物从土壤中可见地冒出之前施加至所关注的区域(例如，田地或耕作区)。“出苗后”是指除草剂在植物从土壤中可见地冒出之后施加至某区域。在一些情况下，术语“出苗前”和“出苗后”结合所关注区域中的杂草使用，以及在一些情形中这些术语结合所关注区域中的作物植物使用。当结合杂草使用时，这些术语可仅适用于存在于或者据信存在于所关注区域中的特定杂草类型或特定杂草物种。虽然任何除草剂均可应用于出苗前和/或出苗后处理，但是已知一些除草剂在出苗前或者出苗后施加时能更有效地控制一种或多种杂草。例如，玉嘧磺隆具有出苗前和出苗后活性，而其他除草剂主要具有出苗前(异丙甲草胺)活性或者出苗后(草甘膦)活性。特定除草剂的这些特性是本领域已知的并且易于由本领域的技术人员确定。此外，本领域的技术人员将能够轻松选择适当的除草剂和施加次数以便与本发明的转基因植物一起使用和/或用于本发明的转基因植物将种植于其中的区域上。“种植前掺入”涉及在种植之前将化合物掺入土壤中。
因此，提供了使作物生长和/或控制杂草的改进方法，诸如“种植前灭生”，其中在种植所关注的作物之前用除草剂处理区域以便更好地控制杂草。本发明还提供使作物生长和/或控制杂草的方法，所述方法是“免耕”或“低耕”的(也称为“少耕法”)。在这种方法中，相较于传统方法，在生长周期期间土壤未经耕种或者耕种频率较低；这些方法可节约原本由于补耕而产生的成本，包括劳动力成本和燃料成本。
术语“安全剂”是指当添加至除草剂配方时消除或减少除草剂对某些作物的植物毒性作用的物质。本领域的普通技术人员将会知道，安全剂的选择部分地取决于所关注的作物植物和特定的除草剂或除草剂组合。适于与本发明公开的除草剂组合物一起使用的示例性安全剂包括但不限于在美国专利No.4,808,208、No.5,502,025、No.6,124,240和美国专利申请公布No.2006/0148647、No.2006/0030485、No.2005/0233904、No.2005/0049145、No.2004/0224849、No.2004/0224848、No.2004/0224844、No.2004/0157737、No.2004/0018940、No.2003/0171220、No.2003/0130120、No.2003/0078167中公开的那些，这些专利的公开内容全文以引用方式并入本文中。本发明的方法可涉及组合使用除草剂与除草剂安全剂从而增强作物安全性，所述安全剂为诸如解草酮、BCS(1-溴-4-[(氯甲基)磺酰基]苯)、解草酯、解草胺腈、二氯丙烯胺、2-(二氯甲基)-2-甲基-1，3-二氧杂环戊烷(MG 191)、解草唑、解草啶、解草安、氟草肟、解草噁唑、双苯恶唑酸、吡唑解草酯、苯草酮((4-甲氧基-3-甲基苯基)(3-甲基苯基)-甲酮)、萘酐(1，8-萘酐)和解草腈。解毒有效量的除草剂安全剂可与本发明的化合物同时施加，或者作为种子处理剂施加。因此，本文公开的方法的一个方面涉及包含生长素类似物除草剂、至少一种其他除草剂，以及解毒有效量的除草剂安全剂的混合物的使用。
种子处理可用于选择性的杂草控制，因为种子处理将解毒物理地局限于作物植物。因此，在一个实施例中，一种用于选择性控制田地中杂草生长的方法包括：用解毒有效量的安全剂处理从其长成作物的种子，以及用有效量的除草剂处理田地以控制杂草。
在用安全剂处理所需的植物使得相较于除草剂对未用该安全剂处理的植物的效果，除草剂对该植物的效果下降的情况下，存在解毒有效量的安全剂；一般来讲，解毒有效量的的安全剂预防对用安全剂处理的植物的损伤或严重损伤。本领域的技术人员能够确定安全剂的使用是否适当以及确定应该施用给作物的安全剂剂量。
如本文所用，“辅助剂”是添加至喷雾液或喷雾配方中以改进农业化学品的作用或者该喷雾液的物理特性的任何材料。参见例如，Green andFoy(2003)“Adjuvants：Tools for Enhancing Herbicide Performance，”inWeed Biology and Management，ed.Inderjit(Kluwer Academic Publishers，TheNetherlands)(Green和Foy，2003年，“辅助剂：用于提高除草剂性能的工具”，载于《杂草生物学与治理》，Inderjit编辑(Kluwer学术出版社，荷兰))。辅助剂可归类为或者细分为活化剂、酸化剂、缓冲剂、添加剂、附着剂、抗絮凝剂、防泡剂、消泡剂、防冻剂、引诱剂、基本混合剂、螯合剂、清洁剂、着色剂或染料、相容剂、助溶剂、偶联剂、作物油浓缩物、沉积剂、洗涤剂、分散剂、漂移控制剂、乳化剂、蒸发减速剂、增充剂、肥料、泡沫标记、调配剂、惰性组分、水分保持剂、甲基化种子油、高负载作物油浓缩物、聚合物、经改性的植物油、渗透剂、防水剂、矿物油浓缩物、防腐剂、耐雨剂、助留剂、增溶剂、表面活性剂、展着剂、粘着剂、粘展剂、增效剂、增稠剂、传导助剂、紫外保护剂、植物油、水质改善剂，以及湿润剂。
此外，本发明的方法可包括将除草剂或者除草剂混合物，以及一种或多种其他杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、杀螨剂、生长调节剂、化学不育剂、化学信息素、驱避剂、引诱剂、信息素、取食刺激剂或其他生物活性化合物或昆虫病原细菌、病毒或真菌用于形成多组分混合物，从而给予甚至更广谱的农业保护。可用于本发明方法的此类农业保护剂的例子包括：杀昆虫剂，诸如阿巴美丁、高灭磷、啶虫脒、磺胺螨酯(S-1955)、阿维菌素、印楝素、甲基谷硫磷、联苯菊酯、联苯肼酯、扑虱灵、克百威、杀螟丹、溴虫腈、定虫隆、毒死蜱、甲基毒死蜱、环虫酰肼、噻虫胺、丁氟螨酯、氟氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、高效三氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、灭蝇胺、溴氰菊酯、丁醚脲、二嗪农、狄氏剂、除虫脲、四氟甲醚菊酯、乐果、呋虫胺、苯虫醚、甲氨基阿维菌素、硫丹、高氰戊菊酯、乙虫腈、苯硫威、苯氧威、甲氰菊酯、氰戊菊酯、氟虫腈、氟啶虫酰胺、氟虫酰胺、氟氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、嘧虫胺(UR-50701)、氟虫脲、地虫硫磷、氯虫酰肼、氟铃脲、氟蚁腙、吡虫啉、茚虫威、异柳磷、虱螨脲、马拉硫磷、氰氟虫腙、多聚乙醛、甲胺磷、杀扑磷、灭多虫、甲氧普烯、甲氧滴滴涕、甲氧苄氟菊酯、久效磷、甲氧虫酰肼、烯啶虫胺、噻虫醛、双苯氟脲、多氟脲(XDE-007)、草氨酰、对硫磷、甲基对硫磷、扑灭司林、甲拌磷、伏杀硫磷、亚胺硫磷、磷胺、抗蚜威、丙溴磷、丙氟菊酯、吡蚜酮、吡嗪氟虫腈、除虫菊酯、啶虫丙醚、吡啶氟虫腈(pyriprole)、蚊蝇醚、鱼藤酮、利阿诺定、多杀菌素、季酮螨酯、螺甲螨酯(BSN 2060)、螺虫乙酯、硫丙磷、虫酰肼、伏虫脲、七氟菊酯、特丁磷、杀虫畏、噻虫啉、噻虫嗪、硫双灭多威、杀虫双、四溴菊酯、唑蚜威、敌百虫和杀铃脲；杀真菌剂，诸如阿拉酸式苯、艾敌吗啉(aldimorph)、吲唑磺菌胺、氧环唑、嘧菌酯、苯霜灵、苯菌灵、苯噻菌胺、苯噻菌胺-异丙基酯、binomial、联苯、双苯三唑醇、灭瘟素、波尔多液(三碱基硫酸铜)、啶酰菌胺(boscalid/nicobifen)、糠菌唑、乙嘧酚磺酸酯、丁赛特、萎锈灵、环丙酰菌胺、敌菌丹、克菌丹、多菌灵、地茂散、百菌清、乙菌利、克霉唑、王铜、铜盐诸如硫酸铜和氢氧化铜、氰霜唑、环氟菌胺、霜脲氰、环唑醇、嘧菌环胺、抑菌灵、双氯氰菌胺、哒菌清、氯硝胺、乙霉威、苯醚甲环唑、烯酰吗啉、醚菌胺、烯唑醇、烯唑醇-M、敌螨普、discostrobin、二噻农、十二环吗啉、多果定、益康唑、乙环唑、敌瘟磷、氟环唑、噻唑菌胺、乙嘧酚、氯唑灵(ethridiazole)、噁唑菌酮、咪唑菌酮、氯苯嘧啶醇、腈苯唑、缬霉威、甲呋酰苯胺、环酰菌胺、稻瘟菌胺、拌种咯、苯锈啶、丁苯吗啉、三苯基乙酸锡、三苯基氢氧化锡、福美铁、ferfurazoate、嘧菌腙、氟啶胺、咯菌腈、氟联苯菌(flumetover)、氟吡菌胺(fluopicolide)、氟嘧菌酯、氟喹唑、氟喹唑、氟硅唑、磺菌胺、氟酰胺、粉唑醇、灭菌丹、三乙膦酸铝、麦穗宁、呋霜灵、呋吡唑灵、己唑醇、恶霉灵、克热净、抑霉唑、亚胺唑、双胍辛胺、拉维因(iodicarb)、种菌唑、异稻瘟净、异菌脲、丙森锌、异康唑、稻瘟灵、春日霉素、醚菌酯、代森锰锌、双炔酰菌胺、代森锰、嘧菌胺(mapanipyrin)、精甲霜灵、灭锈胺、甲霜灵、叶菌唑、磺菌威、代森联、苯氧菌胺(metominostrobin/fenominostrobin)、嘧菌胺、苯菌酮、咪康唑、腈菌唑、甲胂铁铵(甲基胂酸铁)、氟苯嘧啶醇、辛噻酮、甲呋酰胺、肟醚菌胺、恶霜灵、噁喹酸、噁咪唑、氧化萎锈灵、多效唑、戊菌唑、戊菌隆、吡噻菌胺、稻瘟酯(perfurazoate)、膦酸、苯酞、氟吡菌胺(picobenzamid)、啶氧菌酯、多抗霉素、烯丙异噻唑、咪鲜安、腐霉利、霜霉威、霜霉威盐酸盐、丙环唑、丙森锌、丙氧喹啉、丙硫菌唑、唑菌胺酯、定菌磷、啶斑肟、嘧霉胺、啶斑肟、硝吡咯菌素、咯喹酮、氯苯喹唑、快诺芬、五氯硝基苯、硅噻菌胺、硅氟唑、螺环菌胺、链霉素、硫、戊唑醇、techrazene、叶枯酞、四氯硝基苯、氟醚唑、噻苯哒唑、噻氟酰胺、硫菌灵、甲基硫菌灵、福美双、噻酰菌胺、甲基立枯磷、甲苯氟磺胺、三唑酮、三唑醇、嘧菌醇、咪唑嗪、十三吗啉、trimoprhamide、三环唑、肟菌酯、嗪氨灵、灭菌唑、烯效唑、井冈霉素、乙烯菌核利、代森锌、福美锌和苯酰菌胺；杀线虫剂，诸如涕灭威、草氨酰和苯线磷；杀细菌剂，诸如链霉素；杀螨剂，诸如双甲脒、灭螨猛、克氯苯、三环锡、三氯杀螨醇、除螨灵、乙螨唑、喹螨醚、苯丁锡、甲氰菊酯、唑螨酯、噻螨酮、克螨特、哒螨灵和吡螨胺；以及生物制剂，包括昆虫病原细菌，诸如苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种(Bacillus thuringiensis subsp.Aizawai)、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki)、以及封装的苏云金芽孢杆菌δ-内毒素(例如，Cellcap、MPV、MPVII)；昆虫病原真菌，诸如绿僵菌；以及昆虫病原病毒，包括杆状病毒、核型多角体病毒(NPV)(诸如HzNPV、AfNPV)；以及颗粒体病毒(GV)，诸如CpGV。
控制杂草的方法还可包括施加生物有效量的所关注除草剂或者除草剂混合物，以及有效量的至少一种另外的生物活性化合物或试剂，并且还可包括表面活性剂、固体稀释剂或者液体稀释剂中的至少一者。此类生物活性化合物或试剂的例子为：杀昆虫剂，诸如阿巴美丁、高灭磷、啶虫脒、磺胺螨酯(S-1955)、阿维菌素、印楝素、甲基谷硫磷、联苯菊酯、联苯肼酯(binfenazate)、扑虱灵、克百威、溴虫腈、定虫隆、毒死蜱、甲基毒死蜱、环虫酰肼、噻虫胺、氟氯氰菊酯、高效氟氯氰菊酯、三氟氯氰菊酯、高效三氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、灭蝇胺、溴氰菊酯、丁醚脲、二嗪农、除虫脲、乐果、苯虫醚、甲氨基阿维菌素、硫丹、高氰戊菊酯、乙虫腈、苯硫威(fenothicarb)、苯氧威、甲氰菊酯、氰戊菊酯、氟虫腈、氟啶虫酰胺、氟氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、嘧虫胺(UR-50701)、氟虫脲、地虫硫磷、氯虫酰肼、氟铃脲、吡虫啉、茚虫威、异柳磷、虱螨脲、马拉硫磷、多聚乙醛、甲胺磷、杀扑磷、灭多虫、甲氧普烯、甲氧滴滴涕、久效磷、甲氧虫酰肼、噻虫醛(nithiazin)、双苯氟脲、多氟脲(XDE-007)、草氨酰、对硫磷、甲基对硫磷、扑灭司林、甲拌磷、伏杀硫磷、亚胺硫磷、磷胺、抗蚜威、丙溴磷、吡蚜酮、啶虫丙醚、蚊蝇醚、鱼藤酮、多杀菌素、螺甲螨酯(spiromesifin)(BSN 2060)、硫丙磷、虫酰肼、伏虫脲、七氟菊酯、特丁磷、杀虫畏、噻虫啉、噻虫嗪、硫双灭多威、杀虫双、四溴菊酯、敌百虫和杀铃脲；杀真菌剂诸如阿拉酸式苯、嘧菌酯、苯菌灵、灭瘟素、波尔多液(三碱基硫酸铜)、糠菌唑、环丙酰菌胺、敌菌丹、克菌丹、多菌灵、地茂散、百菌清、王铜、铜盐、环氟菌胺、霜脲氰、环唑醇、嘧菌环胺、(S)-3，5-二氯-N-(3-氯-1-乙基-1-甲基-2-氧代丙基)-4-甲基苯甲酰胺(RH 7281)、双氯氰菌胺(S-2900)、哒菌清、氯硝胺、苯醚甲环唑、(S)-3，5-二氢-5-甲基-2-(甲硫基)-5-苯基-3-(苯基氨基)-4H-咪唑啉-4-酮(RP 407213)、烯酰吗啉、醚菌胺、烯唑醇、烯唑醇-M、多果定、敌瘟磷、氟环唑、噁唑菌酮、咪唑菌酮、氯苯嘧啶醇、腈苯唑、缬霉威(SZX0722)、拌种咯、苯锈啶、丁苯吗啉、三苯基乙酸锡、三苯基氢氧化锡、氟啶胺、咯菌腈、氟联苯菌(RPA403397)、氟吗啉(flumorf/flumorlin)(SYP-L190)、氟嘧菌酯(HEC 5725)、氟喹唑、氟硅唑、氟酰胺、粉唑醇、灭菌丹、三乙膦酸铝、呋霜灵、呋吡唑灵(S-82658)、己唑醇、种菌唑、异稻瘟净、异菌脲、稻瘟灵、春日霉素、醚菌酯、代森锰锌、代森锰、精甲霜灵、灭锈胺、甲霜灵、叶菌唑、苯氧菌胺(metomino-strobin/fenominostrobin)(SSF-126)、苯菌酮(AC375839)、腈菌唑、甲胂铁铵(甲基胂酸铁)、啶酰菌胺(BAS 510)、肟醚菌胺、恶霜灵、戊菌唑、戊菌隆、烯丙异噻唑、咪鲜安、霜霉威、丙环唑、丙氧喹啉(DPX-KQ926)、丙硫菌唑(JAU 6476)、啶斑肟、唑菌胺酯、嘧霉胺、咯喹酮、快诺芬、螺环菌胺、硫、戊唑醇、氟醚唑、噻苯哒唑、噻氟酰胺、甲基硫菌灵、福美双、噻酰菌胺、三唑酮、三唑醇、三环唑、肟菌酯、灭菌唑、井冈霉素和乙烯菌核利；杀线虫剂，诸如涕灭威、草氨酰和苯线磷；杀细菌剂，诸如链霉素；杀螨剂，诸如双甲脒、灭螨猛、克氯苯、三环锡、三氯杀螨醇、除螨灵、乙螨唑、喹螨醚、苯丁锡、甲氰菊酯、唑螨酯、噻螨酮、克螨特、哒螨灵和吡螨胺；以及生物制剂，包括昆虫病原细菌，诸如苏云金芽孢杆菌鲇泽亚种(Bacillus thuringiensis subsp.Aizawai)、苏云金芽孢杆菌库尔斯塔克亚种(Bacillus thuringiensis subsp.Kurstaki)、以及封装的苏云金芽孢杆菌δ内毒素(例如，Cellcap、MPV、MPVII)；昆虫病原真菌，诸如绿僵菌；以及昆虫病原病毒，包括杆状病毒、核型多角体病毒(NPV)(诸如HzNPV、AfNPV)；以及颗粒体病毒(GV)，诸如CpGV。本发明的方法还可包括使用经遗传转化以表达对无脊椎害虫有毒的蛋白质(诸如苏云金芽孢杆菌δ内毒素)的植物。在此类实施例中，外源施加的无脊椎害虫控制化合物的效应可与所表达的毒性蛋白协同作用。这些农业保护剂的一般参考文献包括The Pesticide Manual，13th Edition，C.D.S.Tomlin，Ed.，British Crop Protection Council，Farnham，Surrey，U.K.，2003(《杀虫剂手册》，第13版，C.D.S.Tomlin编辑，英国作物保护委员会，英国萨里郡法纳姆，2003年)和The BioPesticide Manual，2nd Edition，L.G.Copping，Ed.，British Crop Protection Council，Farnham，Surrey，U.K.，2001(《生物杀虫剂手册》，第2版，L.G.Copping编辑，英国作物保护委员会，英国萨里郡法纳姆，2001年)。
在某些情形中，与具有类似的控制谱但是不同作用模式的其他无脊椎害虫控制化合物或试剂的组合将尤其有利于抗性治理。因此，本发明的组合物还可包括生物有效量的至少一种具有类似的控制谱但是不同作用模式的另外的无脊椎害虫控制化合物或试剂。使经遗传修饰以表达植物保护化合物(例如，蛋白质)的植物或该植物的所在位置与生物有效量的本发明化合物接触还可提供更广谱的植物保护并且有利于抗性治理。
因此，控制杂草的方法可采用除草剂或者除草剂组合，并且还可包括使用杀昆虫剂和/或杀真菌剂和/或其他农业化学品诸如肥料。本发明的此类组合处理剂的使用可以加宽对另外的杂草物种的活性谱并且抑制任何抗性生物型的增殖。
方法还可包括使用植物生长调节剂，诸如艾维激素、N-(苯基甲基)-iH-嘌呤-6-胺、乙烯利、丙酰芸苔素内酯、赤霉酸、赤霉素A4和A7、超敏蛋白、缩节胺、调环酸钙、茉莉酮、复硝酚钠和甲基抗倒酯，以及调节植物生长的生物体，诸如蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株BP01。
IIX.序列比较
以下术语用于描述两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”以及(d)“序列同一性百分数”。
(a)如本文所用，“参考序列”是用作序列比较的基础的确定的序列。参考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，为全长cDNA或基因序列的区段，或者完整的cDNA或基因序列或蛋白序列。
(b)如本文所用，“比较窗口”是指多肽序列的连续和指定的区段，其中该比较窗口中的该多肽序列相比于参考序列(不包含添加或者缺失)可包含添加或者缺失(即空位)，以便两条多肽的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少5、10、15或20个连续氨基酸，或者其可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员应理解，为避免由于在多肽序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
将序列比对以作比较的方法是本领域公知的。因此，可使用数学算法来完成任何两个序列之间序列同一性百分数的确定。此类数学算法的非限制性例子是Myers and Miller(1988)CABIOS 4：11-17(Myers和Miller，1988年，《生物信息学》，第4卷，第11-17页)的算法；Smith et al.(1981)Adv.Appl.Math.2：482(Smith等人，1981年，《应用数学进展》，第2卷，第482页)的局部比对算法；Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的全局比对算法；Pearson and Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448(Pearson和Lipman，1988年，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第2444-2448页)的局部搜索比对法；Karlin andAltschul(1990)Proc..Natl.Acad.Sci.USA 872264(Karlin和Altschul，1990年，《美国国家科学院院刊》，第872264页)的算法，其在Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877(Karlin和Altschul，1993年，《美国国家科学院院刊》，第90卷，第5873-5877页)中作了修正。
这些数学算法的计算机实现方式可以用来比较序列以确定序列同一性。此类实现方式包括、但不限于：PC/Gene程序(可获自Intelligenetics公司，加利福尼亚州山景城(Mountain View，California))中的CLUSTAL；GCG Wisconsin Genetics Software版本10(可得自美国加利福尼亚州圣地亚哥斯克兰顿路9685号的Accelrys有限公司(Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，California，USA))中的ALIGN程序(版本2.0)和GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。使用这些程序的比对可以使用默认参数进行。以下文献对CLUSTAL程序进行了详细描述：Higgins et al.(1988)Gene 73：237-244(1988)(Higgins等人，1988年，《基因》，第73卷，第237-244页，1988年)；Higgins et al.(1989)CABIOS5：151-153(Higgins等人，1989年，《计算机在生物科学中的应用》，第5卷，第151-153页)；Corpet et al.(1988)Nucleic AcidsRes.16：10881-90(Corpet等人，1988年，《核酸研究》，第16卷，第10881-10890页)；Huang et al.(1992)CABIOS 8：155-65(Huang等人，1992年，《计算机在生物科学中的应用》，第8卷，第155-165页)；以及Pearson et al.(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331(Pearson等人，1994年，《分子生物学方法》，第24卷，第307-331页)。ALIGN程序是基于Myers和Miller(1988)(出处同上)的算法。当比较氨基酸序列时，ALIGN程序可以使用PAMl20加权残基表(weight residue table)、空位长度罚分12和空位罚分4。Altschul et al(1990)J.Mol.Biol.215：403(Altschul等人，1990年，《分子生物学杂志》，第215卷，第403页)的BLAST程序是基于Karlin和Altschul(1990)(出处同上)的算法。BLAST核苷酸搜索可以用BLASTN程序、得分(score)＝100、字长(wordlength)＝12来进行，以获得与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。BLAST蛋白质搜索可以用BLASTX程序、得分＝50、字长＝3来进行，以获得与本发明蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。BLASTP蛋白搜索可以用默认参数进行。参见blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi。
为了出于比较目的获得带空位的比对结果，可以如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389页)中所描述采用Gapped BLAST(在BLAST 2.0中)。或者，PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)可以用来执行检测分子之间远源关系的迭代搜索。参见Altschul等人，(1997)，出处同上。当采用BLAST、Gapped BLAST、或PSI-BLAST时，可以使用各个程序的默认参数(例如BLASTN用于核苷酸序列，BLASTP用于蛋白)。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。还可以以手动方式通过检查来进行比对。
除非另外指明，否则本文提供的序列同一性值指使用采用如下参数的GAP版本10获得的值：氨基酸序列的同一性％和相似性％采用GAP权重8和长度权重2以及BLOSUM62评分矩阵；或任何其等同程序。所谓“等同程序”意指任何这样的序列比较程序，其对于任何两个所考虑的序列，相比于GAP版本10所产生的相应比对，能产生出具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配和相同的序列同一性百分数的比对。
GAP使用Needleman and Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453(Needleman和Wunsch，1970年，《分子生物学杂志》，第48卷，第443-453页)的算法，以找到两个完全序列的比对，该比对能使匹配数最大和使空位数最小。GAP考虑所有可能的比对和空位位置，并产生具有最大数目的匹配碱基和最少的空位的比对。它允许提供以匹配碱基数为单位的空位产生罚分和空位延伸罚分。GAP对于其插入的每个空位，必须利用匹配的空位产生罚分数。如果选择大于零的空位延伸罚分，GAP对于每个插入的空位必须另外利用空位长度乘以空位延伸罚分。对于蛋白质序列，GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中的默认空位产生罚分值和空位延伸罚分值分别为8和2。对于核苷酸序列，默认空位产生罚分为50，而默认空位延伸罚分为3。空位产生罚分和空位延伸罚分可以表述为选自0-200的整数。因此，例如，空位产生罚分和空位延伸罚分可以为0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。
GAP给出具有最佳比对的家族中的一个成员。可能存在这个家族的许多成员，但其他成员没有更好的品质。GAP显示用于比对的四个优值因子：品质、比率、同一性和相似性。品质是为了比对序列而最大化的指标(metric)。比率是品质除以较短区段中的碱基数。同一性百分数是实际匹配的符号的百分数。相似性百分数是相似的符号的百分数。将对应于空位的符号忽略。当一对符号的评分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)时，评定为相似性。GCG Wisconsin Genetics Software Package的版本10中使用的评分矩阵为BLOSUM62(参见Henikoff and Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(Henikoff和Henikoff，1989年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915页))。
(c)在两个多核苷酸或多肽序列的情形中，本文所用的“序列同一性”或“同一性”是指当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分数针对蛋白使用时，应认识到，不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基被其他具有相似的化学性质(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基置换。当序列差别在于保守置换，则可以上调百分比序列同一性以校正置换的保守性质。差异在于这类保守置换的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的方法是本领域技术人员公知的。通常，这涉及将保守置换打分为部分错配而不是完全错配，从而提高序列同一性百分数。因而，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。保守置换的评分是例如在程序PC/GENE(加利福尼亚州山景城(Mountain View，California)的Intelligenetics公司)中所执行那样进行计算。
(d)如本文所用，“序列同一性百分数”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比包含添加或缺失(即空位)，以便两条序列的最佳比对。该百分数是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分数。
(e)当使用定义的氨基酸置换矩阵(如，BLOSUM62)、空位存在罚分和空位延伸罚分对两条序列进行比对使得到的相似性评分达到该对序列最高可能分数时，这两条序列是“最佳比对的”。氨基酸置换矩阵及其在定量两条序列之间的相似性的用途是本领域熟知的并且在例如以下文献中有所描述：Dayhoff et al.(1978)“Amodel of evolutionary change in proteins.”In“Atlas of ProteinSequence and Structure，”Vol.5，Suppl.3(ed.M.O.Dayhoff)，pp.345-352.Natl.Biomed.Res.Found.，Washington，DC(Dayhoff等人，1978年，“蛋白进化变异模型”，载于“蛋白序列和结构图表集”，第5卷，增刊3(M.O.Dayhoff编辑)，第345-352页，美国国家生物医学研究基金会，华盛顿特区)和Henikoff et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915-10919(Henikoff等人，1992年，《美国国家科学院院刊》，第89卷，第10915-10919页)。BLOSU M62矩阵通常用作序列比对方案例如GappedBLAST 2.0中的默认评分置换矩阵。对比对序列之一中单个氨基酸空位的引入施以空位存在罚分，并对插入已开放空位中的每个附加空氨基酸位置施以空位延伸罚分。对比对序列之一中单个氨基酸空位的引入施以空位存在罚分，并对插入已开放空位中的每个附加空氨基酸位置施以空位延伸罚分。通过比对开始和终止的每个序列的氨基酸位置，并任选通过在一个或两个序列中插入一个空位或多个空位以达到最高可能分数，来限定比对。虽然可手动完成最佳比对和评分，但使用计算机实现的比对算法如gappedBLAST 2.0有利于该过程，该比对算法在Altschul et al.，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页)中有所描述并且公布于美国国家生物技术信息中心网站(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)。使用例如通过http：//www.ncbi.nlm.nih.gov可获得的及Altschul et al，(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402(Altschul等人，1997年，《核酸研究》，第25卷，第3389-3402页)所描述的PSI-BLAST，可制备包括多重比对在内的最佳比对。
非限制性实施例包括：
1.一种对生长素类似物除草剂解毒的方法，所述方法包括将生长素类似物除草剂施加于植物、植物细胞或种子，其中所述植物、植物细胞或种子包含编码具有氨基酸/生长素类似物缀合活性的GH3多肽的异源多核苷酸，并且其中所述GH3多肽的表达产生天冬氨酸/生长素类似物缀合物或者谷氨酸/生长素类似物缀合物，其中所述生长素类似物缀合物具有降低的除草活性。
2.一种用于在包括作物或作物种子的耕作区中控制至少一种杂草的方法，所述方法包括向耕作区和/或所述耕作区中的作物或作物种子施加足量的生长素类似物除草剂以控制杂草但不显著地影响作物，其中所述耕作区中的所述作物或其种子包含至少一种编码具有氨基酸/生长素类似物缀合活性的GH3多肽的异源多核苷酸。
3.一种用于在包括作物的耕作区中控制至少一种杂草的方法，所述方法包括
(a)向耕作区施加足量的生长素类似物除草剂以控制杂草但不显著地影响作物；
(b)在田地中种植含有编码具有氨基酸/生长素类似物缀合活性的GH3多肽的异源多核苷酸的作物或其种子。
4.实施例2或3中任一项所述的方法，其中相较于适当对照植物，所述作物表现出增强的对生长素类似物除草剂的不敏感性。
5.实施例3所述的方法，其中步骤(a)在步骤(b)之前发生或者与步骤(b)同时发生。
6.实施例1、2、3、4或5所述的方法，其中所述GH3多肽包括含有与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、58、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、117、118、119、120、121、124、142、144或145中的任一者具有至少85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
7.实施例1、2、3、4或5所述的方法，其中所述GH3多肽包括含有与SEQ ID NO：15、16、17、51、52、53、54、55、56、57、59、60、61、62、63、64、65、66、67、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、122、134、135、136、137、138、139、140、141中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
8.实施例1、2、3、4或5所述的方法，其中所述GH3多肽包括含有与SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、123、125、126、127、128、129、130、131、132、133或143中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
9.实施例1-8中任一项所述的方法，其中所述生长素类似物除草剂包括2，4-D或麦草畏。
10.实施例2-5中任一项所述的方法，其中所述作物还包括赋予对另外的除草剂的耐受性的至少一种多肽。
11.实施例10所述的方法，其中赋予对另外的除草剂的耐受性的所述至少一种多肽包括：
(a)磺酰脲耐受性乙酰乳酸合成酶；
(b)咪唑啉酮耐受性乙酰乳酸合成酶；
(c)草甘膦耐受性5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶；
(d)草甘膦耐受性草甘膦氧化还原酶；
(e)草甘膦N-乙酰转移酶；
(f)草丁膦乙酰转移酶；
(g)原卟啉原氧化酶；
(h)HPPD酶；
(i)P450多肽；或者，
(j)乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)。
12.实施例11所述的方法，其中赋予对另外的除草剂的耐受性的所述至少一种多肽包括乙酰乳酸合成酶(HRA)和/或草甘膦N-乙酰转移酶多肽的高抗性等位基因。
13.实施例2-5中任一项所述的方法，其中所述作物还包含赋予对生长素类似物除草剂的耐受性的至少一种另外的多肽，其中所述另外的多肽与由所述异源多核苷酸编码的所述GH3多肽相同或不同。
14.实施例1所述的方法，其中所述植物、植物细胞或种子源自单子叶植物。
15.实施例1所述的方法，其中所述植物、植物细胞或种子源自双子叶植物。
16.实施例2或3所述的方法，其中所述作物源自单子叶植物。
17.实施例2或3所述的方法，其中所述作物源自双子叶植物。
18.实施例14或16中任一项所述的方法，其中所述单子叶植物选自玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱或裸麦。
19.实施例15或17中任一项所述的方法，其中所述双子叶植物选自大豆、芸苔属、向日葵、棉花或苜蓿。
20.实施例1-19中任一项所述的方法，其中所述生长素类似物除草剂包括2，4-D。
21.实施例1-19中任一项所述的方法，其中所述生长素类似物除草剂包括麦草畏。
22.一种用于测试植物对一种或多种化合物的响应的方法，所述方法包括：
a)在容器中提供包含待测试的一种或多种化合物的组合物，所述容器具有供所述化合物进入和/或离开的至少一个开口以及用于将所述组合物移入或移出容器的一个或多个元件；
b)使容器的至少一个开口与植物的表面接触并将所述包含一种或多种化合物的组合物移动至植物的至少所述表面上。
23.实施例22所述的方法，其中用于移动组合物的容器和元件包括注射器主体和柱塞。
24.实施例22所述的方法，其中将组合物移动至所述植物表面包括以足以使所述组合物进入植物细胞的压力接触所述表面。
25.实施例22所述的方法，还包括相较于未与所述组合物接触的植物，测量所述组合物对所接触的植物的效应。
实验
缩写
使用了下列缩写：IAA：吲哚-3-乙酸；2，4-D：2，4-二氯苯氧基乙酸；以及麦草畏：3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸游离酸。IAA、2，4-D和麦草畏的缀合形式是通过用缀合至所述化合物的氨基酸的三字母代码以连接号附加成后缀来表示的。例如，缀合至天冬氨酸的IAA被表示为IAA-Asp，或者缀合至谷氨酸的2，4-D被表示为2，4-D-Glu。
实例1.用于测量生长素缀合活性的方法
生长素氨基酸缀合是两步酶反应。第一步骤涉及腺苷酰作用：AMP从ATP转移至酰基底物的羧酸基团，形成活化的酰基腺苷酸中间体并且释放焦磷酸盐(PPi)。第二步骤涉及转移酶反应，该反应通过形成酰胺键来用氨基酸取代中间体的AMP(参见图1和图2)。
腺苷酰化作用活性是通过使用焦磷酸盐试剂(Sigma试剂，目录号P7275)将焦磷酸盐的产生偶联至NADH的氧化，从而在340nm处通过分光光度计进行监测。包括焦磷酸盐依赖性的果糖-6-磷酸激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油脱氢酶在内的偶联酶和适当的底物，以及包括NADH的辅因子都包括在试剂盒中。为了开始测定，在4mL双蒸水(“ddH2O”)中复原焦磷酸盐试剂。制备包含6.45mM MgCl2、3.23mMATP、1.29mM DTT和65μL焦磷酸盐试剂，总共155μL的主混合物，并且将该主混合物添加至包含10μg GH3酶和20μl的10mM生长素或生长素除草剂的UV平板中，以获得1mM的最终浓度。通过添加ddH2O将反应体积定容至200μl。使用SpectraMax Plus 384仪器(分子仪器公司(MolecularDevices))测量所述反应平板在340nm、处于30℃时1小时内每30秒的吸光度变化。随后使用随附程序SOFTmax PRO 5.4，利用对线性范围的人工评估/确认，通过每一曲线的最小二乘法拟合将所测量的吸光度转换成速度。减去非生长素对照的速度。使用NADH的消光系数6.22mM-1cm-1将速度值从毫吸光度单位/分钟转换成微摩尔浓度/分钟。通过将最初的速度值拟合至米氏方程来估计动力学参数。
缀合的第二步骤是用分光光度计在340nm处测量通过酶偶联测定法进行的NADH氧化(Chen et al.2010.J Biol Chem 285：29780-29786(Chen等人，2010年，《生物化学杂志》，第285卷，第29780-29786页))。这种方法测量从酰基腺苷酸中间体的AMP释放。偶联酶包括：肌激酶、丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶。为了开始测定，制备了包含20mM Tris-HCl(pH8.0)、3mM MgCl2、2mM ATP、4mM生长素或生长素除草剂底物、6mM氨基酸、2mM DTT、2mM磷酸烯醇式丙酮酸、400μM NADH、8单位/100μL的兔肌肉肌激酶、8单位/100μL的兔肌肉丙酮酸激酶，以及8单位/100μL的兔肌肉乳酸脱氢酶的主混合物。将100μl主混合物添加到包含在100μl反应缓冲液(20mM Tris-HCl、3mM MgCl2pH 8.0)中的10μg GH3蛋白的UV微孔板中。在SpectraMax Plus 384仪器(分子仪器公司(MolecularDevices))中测量该反应平板在340nm处于30℃时1小时内每30秒的吸光度变化。随后使用随附程序SOFTmax PRO 5.4，利用对线性范围的人工评估/确认，通过每一曲线的最小二乘法拟合将所测量的吸光度转换成速度。减去非生长素对照的速度。使用NADH的消光系数6.22mM-1cm-1将速度值从毫吸光度单位/分钟转换成微摩尔浓度/分钟。通过将最初的速度值拟合至米氏方程来估计动力学参数。
为了检测和监测与2，4-D或麦草畏的酰基缀合物的形成，使用各自的氨基酸缀合物标准品开发了灵敏的LC-MS方法。使用这种程序，检测到2，4-D-Asp、2，4-D-Glu、麦草畏-Asp和麦草畏-Glu的水平分别低至2.5fmol、5fmol、20fmol和20fmol。IAA-Asp和IAA-Glu的检测限是类似的，处于25fmol。在100μL反应中，在30℃以105rpm在包含20mM Tris-HCl(pH 8.0)、5mM MgCl2、5mM生长素(IAA、2，4-D或麦草畏)、5mMATP、5mM Asp或Glu、1mM DTT和44至164μg/mL的经纯化GH3蛋白的缓冲液中进行反应3小时。在反应3小时之后，将400μL 100％MeOH添加至所述反应混合物中以用于蛋白沉淀。用水稀释上清液20倍，并且随后通过LC-MS(耦接于Shimadzu Nexera UHPLC的AB Sciex 4000QTrap)使用Phenomenex Luna 3μm苯基-己基(00B-4256-Y0)柱进行分析。LC-MS方法的细节在表2中列出。基于所述标准品计算缀合物浓度。通过将最初的速度值拟合至米氏方程来估计动力学参数。
表2.用于IAA、2，4-D、麦草畏及其缀合物的LC-MS方法。
溶剂A：5mM NH4Ac溶于H2O中
溶剂B：5mM NH4Ac溶于MeOH中
实例2.与天冬氨酸和谷氨酸缀合的2，4-D和麦草畏的植物毒性评价
为了评价合成生长素缀合物在植物中的效应，合成2，4-D-Asp、2，4-D-Glu、麦草畏-Asp和麦草畏-Glu(加利福尼亚州阿纳海姆的欧文化学实验室(Irvine Chemistry Laboratory，Anaheim，CA))并且测试它们在大豆萌发期间的生长素效应。
分别将2，4-D和麦草畏的Asp与Glu缀合物溶于少量的Na2CO3和乙醇中，在ddH2O中稀释以获得10mM储备溶液，并且过滤灭菌。按照如下方式用氯气对先锋公司(Pioneer)优良种质的大豆种子灭菌：a)将两层种子放置在100×25mm的塑料培养皿中；b)在排气通风柜中，将种子放置到玻璃干燥器中，该玻璃干燥器带有包含100mL漂白剂(5％NaOCl)的250mL烧杯，并且将3.5mL 12N HCl缓慢添加到该烧杯中；c)将封盖密封封闭于该干燥器上并将所述种子灭菌至少24小时。
随后在萌发测试前24小时，在无菌条件下，于25℃使经灭菌的大豆种子在ddH2O中吸胀。为了进行萌发测试，将6-8颗吸胀的种子放置到100×25mm深的培养皿平板中，该平板含有补充有或未补充生长素除草剂缀合物的50ml萌发培养基。1L的种子萌发培养基含有3.21g GAMBORGB-5基础培养基(PhytoTech)、20g蔗糖、5g组织培养琼脂，并且将pH调节至5.7。在121℃下将培养基高压灭菌25分钟，并且在添加生长素缀合物之前冷却到60℃。萌发是在Percival生长室中在25℃下按照18小时光照和6小时黑暗的周期，在90至150μE/m2/s下进行的，并且生长10天。
如图3所示，大豆种子在不含补充的生长素除草剂或生长素除草剂缀合物的培养基中萌发且生长得非常好(图3中的对照)。子叶完全展开，出现第一片真叶，并且根部非常良好地生长到培养基中。在其中添加了1μM 2，4-D或麦草畏的平板中，种子萌发受阻，如子叶白化以及根部畸形且生长受阻所明显表现出的。从这些种子中未观察到真叶的出现和次生根的形成。作为比较，在包含1μM生长素除草剂缀合物2，4-D-Asp、2，4-D-Glu、麦草畏-Asp以及麦草畏-Glu的平板中，种子萌发和生长都正常，类似于对照平板的萌发和生长。结果表明这些生长素除草剂缀合物对大豆无植物毒性。将2，4-D或者麦草畏转换成Asp或Glu缀合物可在植物中有效地将除草剂转变成非除草化合物。
实例3.GH3家族蛋白的系统发育分析
使用AtGH3.17蛋白序列(登录号Q9FZ87)通过对NCBI数据库(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)和先锋公司(Pioneer)内部数据库的BLAST分析(6/20/2012)获得总共246条GH3蛋白序列，并使用CLUSTAL W分析所述蛋白序列以获知它们的系统发育关系(图4)。从该系统发育分析选出145个GH3同源物用于活性评价(图5、表3和表6)。
基于对GH3家族蛋白的底物特异性的先前研究，提出三个主要的亚组(Staswick et al.(2002)Plant Cell 14：1405-1415(Staswick等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1405-1415页)；Wang et al.(2008)PlantGrowth Regul 56：225-232(Wang等人，2008年，《植物生长调节》，第56卷，第225-232页))。亚组I催化氨基酸连接至茉莉酸(Staswick et al.(2002)Plant Cell 14：1405-1415(Staswick等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1405-1415页))。诸如IAA、PAA、IBA和水杨酸的生长素是亚组II的底物(Staswick et al.(2002)Plant Cell 14：1405-1415(Staswick等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1405-1415页)；Staswick etal.(2005)Plant Cell 17：616-627(Staswick等人，2005年，《植物细胞》，第17卷，第616-627页))。亚组III蛋白AtGH3-12可缀合4-羟基苯甲酸酯，以及其他的苯甲酸酯(Okrent et al.(2009)J Biol Chem 284：9742-9754(Okrent等人，2009年，《生物化学杂志》，第284卷，第9742-9754页))。如图4中所示，GH3同源物在系统发育分析中分为三个主要组(组A、B、C)。根据先前的研究(Staswick et al.(2002)Plant Cell 14：1405-1415(Staswick等人，2002年，《植物细胞》，第14卷，第1405-1415页)；Staswick et al.(2005)Plant Cell 17：616-62(Staswick等人，2005年，《植物细胞》，第17卷，第616-662页)；Wang et al.(2008)PlantGrowth Regul56：225-232(Wang等人，2008年，《植物生长调节》，第56卷，第225-232页)；Okrent et al.(2009)J Biol Chem 284：9742-9754(Okrent等人，2009年，《生物化学杂志》，第284卷，第9742-9754页))，系统发育组A、B和C中的蛋白被预测为分别属于底物亚组I、II和III，这三个亚组的底物偏好分别为茉莉酸、IAA和苯甲酸酯。情况并不总是这样。例如，在含78个测试的GH3蛋白的组中，有18个蛋白不将IAA与Asp或Glu缀合。这些IAA非活性GH3蛋白中的大部分(18个中的14个)在系统发育上属于亚组A和C，证实了序列组的一般比对以及底物特异性(图6)。然而，系统发育分组无法基于底物特异性与亚组进行完全比对，如由其他四个IAA非活性蛋白AtGH3-3、OsGH3-10、SbEESl6535和ZmACF88044所示例的，该四个蛋白均属于亚组B。另一个例子使用AtGH3.17，系统发育上为亚组C蛋白(图4和图6)。然而，AtGH3-17将IAA与Asp或Glu非常好地缀合，其kcat值分别为52和868小时-1(表3和表4；Staswick et al.(2005)Plant Cell 17：616-627(Staswick等人，2005年，《植物细胞》，第17卷，第616-627页))，并且因此是亚组II蛋白。即使GH3家族蛋白中逐对的序列同一性从30％至98％变化，我们已经从所有底物特异性亚组中鉴定出了可将IAA缀合至Asp或Glu的蛋白质。例如，亚组C蛋白AtGH3-7、AtGH3.12、AtGH3-19、AlGH3-14和AlGH3-12还可将Glu缀合至IAA(图6)，IAA为亚组II的底物而非亚组III的底物。系统发育组A蛋白PpGH3-2和SmXP_002981880还可将IAA缀合至Asp和Glu(图6)。此外，来自序列亚组A、B和C的蛋白都显示出2，4-D缀合活性(图5和表4以及表5)。因此我们推断出系统发育位置本身不足以预测GH3蛋白的底物特异性并且不足以鉴定可将2，4-D或麦草畏缀合至Asp或Glu的蛋白质。
实例4.在与天冬氨酸和谷氨酸的缀合反应中使用IAA、2，4-D和麦草畏 来检查145个GH3超家族蛋白成员
使用LC-MS进行对IAA、2，4-D或麦草畏与Asp或Glu的GH3超家族缀合酶活性分析，以便分析最终的缀合产物，如在实例1中所述。GH3同源物的蛋白序列(表3)是从公用数据库(NCBI，http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/)，通过对AtGH3.17蛋白序列(登录号Q9FZ87)的Blast分析获得的。基于蛋白序列将编码序列设计成能在大肠杆菌中最佳表达并合成。将与N端his标签编码序列一起合成的编码序列克隆到基于pET24a的大肠杆菌表达载体中。将大肠杆菌表达载体转化到OverExpress C41(DE3)细胞(Lucigen公司(Lucigen))中以用于蛋白表达。将重组大肠杆菌菌株接种到补充有40mg/L卡那霉素的5ml LB培养基中，并且在37℃培养过夜。将所述过夜培养物(0.5mL)接种到添加有40mg/L卡那霉素的50mL LB培养基中，并且在30℃下生长直至OD600达到0.6。将所述培养物在16℃、230rpm下用0.2mM IPTG诱导过夜。通过以7,000rpm离心10分钟来收集细胞。将源自50mL细胞培养物的细胞沉淀物冻融两次，随后在800μL的裂解缓冲液A(150mM NaCl、50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM MgCl2、10％甘油)加20mM咪唑、1mM DTT、0.2mg/ml溶菌酶、1/200蛋白酶抑制剂混合物(EMD set3，不含EDTA)以及1/2000内切核酸酶中裂解。随后在4℃下以13,000rpm将裂解物离心30分钟。将上清液上样至200μL Ni-NTA柱上，该柱已用含20mM咪唑的缓冲液A在4℃下预平衡。随后将每个柱用(1)2X 800μL的含10mM咪唑的缓冲液A、(2)2X 800μL的含20mM咪唑的缓冲液A，以及(3)2X 200μL的含50mM咪唑的缓冲液A冲洗。用含250mM咪唑的200μL缓冲液A洗脱蛋白。通过Bradford测定法测量浓度。经纯化的蛋白质用于缀合反应测定法中，如实例1中所述。
如在表4和表5中所示，在该78个测试的GH3蛋白中，大部分蛋白(70个GH3蛋白)显示出与Asp或Glu的多种2，4-D缀合活性水平。所述蛋白中的十六个蛋白从含有5mM 2，4-D底物的反应产生大于1μM的2，4-D-Asp或2，4-D-Glu(表4)。该活性通常小于IAA缀合至Asp或Glu的相应活性。在一些情况下，该缀合酶对IAA的kcat是2，4-D的1,000倍以上(表5)。然而，已发现不表现出任何使IAA与Asp和Glu缀合的活性的十二个GH3蛋白会产生2，4-D-Asp或2，4-D-Glu缀合物(图6、表4和表5)。这些IAA非活性2，4-D缀合酶是：AlGH3-9、AtGH3-9、OsGH3-7、OsGH3-11、PtGH3-14、VvGH3-8、AtGH3-13、AtGH3-14、ZmACF88044、PpGH3-1、SmXP_002983845和SmXP_002986992(SEQ ID NO 1、4、5、6、15、16、25、26、45、51、57和66)。一种可用于IAA和2，4-D两者的活性GH3缀合酶PpGH3-2(SEQ ID NO：52)，可使麦草畏与Glu在16小时的反应中缀合。当增加量的PpGH3-2蛋白用于该缀合反应时检测到了增加量的麦草畏-Glu(图7)。
表3. 145个选择用于活性测试的GH3蛋白的蛋白名称。
表4.由GH3蛋白反应产生的缀合产物的相对量
表4.从GH3蛋白反应产生的缀合产物的相对量(续表)。
表格图解：
表5.78个测试的GH3蛋白的缀合酶酶活性(k cat )。
表5. 78个测试的GH3蛋白的缀合酶酶活性(kcat)(续表)。
表5.所测试的GH3蛋白的缀合酶酶活性(k cat )(续表)。
*其他基因的麦草畏-Glu缀合酶活性无相关数据。
表6.另外的GH3蛋白的缀合活性。
实例5.用GH3基因转化拟南芥并评价除草剂响应
表达GH3基因的拟南芥(Arabidopsis thaliana)是使用农杆菌介导转化的花序浸渍法产生的(Clough SJ and Bent AF，1998，Plant J.16：735-43(Clough SJ和Bent AF，1998年，《植物杂志》，第16卷，第735-743页)；Chung M.H.，Chen M.K.，Pan S.M.2000.Transgenic Res.9：471-476(Chung M.H.，Chen M.K.，Pan S.M.，2000年，《转基因研究》，第9卷，第471-476页)；Weigel D.and Glazebrook J.2006.In Planta Transformationof Arabidopsis.Cold Spring Harb.Protoc.4668 3(Weigel D.和Glazebrook J.，2006年，拟南芥的原位转化，《冷泉港实验手册》，第4668卷，第3页))。简而言之，拟南芥(Col-O)植物生长于盆栽土中。初生花序枝在刚抽出时即被移除。当次生花序枝约3英寸高时，植物已准备好用于转化。将携带合适的二元载体的农杆菌在28℃于5mL LB培养基中以200rpm振荡培养两天。随后将1mL的培养物接种到200ml新鲜的LB培养基中并且再次伴随剧烈搅拌在28℃温育另外的20-24小时。该农杆菌培养物随后在GSA转子(或等同物)中经受6000rpm的离心10分钟。将所述沉淀物重悬于包含5％(wt/v)蔗糖和0.01-0.2％(v/v)Silwet L-77的20-100mL的喷施介质中。将该农杆菌悬浮液转移到手持式喷雾器中以喷施到准备好进行转化的拟南芥植物的花序上。将经喷施的植物用保湿罩(humidity dome)覆盖24小时，然后再去除该覆盖件以在正常生长条件下生长。收获种子。在无菌条件下执行转化体的筛选。将经表面灭菌的种子放置到MS-琼脂板(植物技术实验室公司(Phyto Technology labs Prod.)产品号M519)上，该MS-琼脂板包含适当选择的抗生素(卡那霉素50mg/L、潮霉素20mg/L，或者双丙氨磷10mg/L)。抗农杆菌的抗生素特美汀也包括在该培养基中。将平板在21℃培养7-14天，每天给予16小时光照。使含有GH3基因的转基因事件萌发并且将其转移到温室中的土壤营养钵内以便评价除草剂耐受性。
用于促进拟南芥转化的选择性标记基因是由以下组分组成的嵌合基因：源自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell et al.1985.Nature 313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))、源自吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因(Thompson et al.，1987.EMBO J.6：2519-2523(Thompson等人，1987年，《欧洲分子生物学组织杂志》，第6卷，第2519-2523页))，以及源自拟南芥的3’UBQ14终止子区(Callis et al.，1995.Genetics 139(2)，921-939(Callis等人，1995年，《基因组学》，第139卷，第2期，第921-939页))。另一种用于促进拟南芥转化的可视选择性标记基因是由以下组分组成的嵌合基因：源自大豆的UBQ启动子(Xing et al.，2010.Plant Biotechnology Journal 8：772-782(Xing等人，2010年，《植物生物技术杂志》，第8卷，第772-782页))、YFP编码序列，以及源自根癌农杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合成酶基因的3’区。双丙氨膦用作转化过程期间的选择剂。GH3基因采用如下进行表达：组成型启动子例如用于强效或适度表达的拟南芥UBQ10启动子(Norris et al.，1993.Plant Mol Biol 21：895-906(Norris等人，1993年，《植物分子生物学》，第21卷，第895-906页))或者UBQ3启动子(Norris et al.，1993.Plant Mol Biol 21：895-906(Norris等人，1993年，《植物分子生物学》，第21卷，第895-906页))、GH3编码序列以及法国菜豆的菜豆素基因的3’终止子区(Sun et al.，1981.Nature 289：37-41(Sun等人，1981年，《自然》，第289卷，第37-41页)；Slightom et al.，1983.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80(7)，1897-1901(Slightom等人，1983年，《美国国家科学院院刊》，第80卷，第7期，第1897-1901页))
哥伦比亚生态型拟南芥的种子(Col-0)和GH3转基因事件用70％(v/v)的乙醇表面灭菌5分钟以及用10％(v/v)的漂白剂表面灭菌15分钟。在用蒸馏水洗涤三次后，将所述种子在4℃温育4天。随后在pH 5.7且含3％(w/v)蔗糖和0.8％(w/v)琼脂的1×Murashige和Skoog(MS)培养基上使所述种子萌发。在温育3.5天之后，将幼苗转移到包含B5维生素、3％(w/v)蔗糖、2.5mm MES(pH 5.7)、1.2％(w/v)琼脂的基础培养基中，并且将过滤灭菌的生长素除草剂2，4-D或麦草畏在60℃添加至该培养基中。2，4-D的浓度为0μM、0.1μM、0.5μM、0.7μM和1.0μM。麦草畏的浓度为0μM、1.0μM、5.0μM、7.0μM和10μM。该基础培养基包含1/10×MS大量营养元素(2.05mm NH4NO3、1.8mm KNO3、0.3mm CaCl2，以及0.156mm MgSO4)和1×MS微量营养元素(100μm H3BO3、100μm MnSO4、30μm ZnSO4、5μm KI、1μm Na2MoO4、0.1μm CuSO4、0.1μm CoCl2、0.1mm FeSO4，以及0.1mm Na2EDTA)。将幼苗垂直放置，并且将温度维持在23℃以允许根部沿着琼脂的表面生长，其中光周期为16小时光照与8小时黑暗。
在含有各种浓度的2，4-D或麦草畏的培养基上培养6天后，测量初生根的长度。在野生型拟南芥中，预期通过生长素除草剂处理会出现根生长抑制。在2，4-D或麦草畏处理下，野生型植物的初生根长度变短。2，4-D或麦草畏越多，初生根越短。比较野生型和GH3转基因事件之间根生长抑制的差异。2，4-D或麦草畏对根生长抑制的缓解是由于GH3缀合活性造成的生长素除草剂解毒的指示。
实例6.用GH3基因转化大豆
表达GH3转基因的大豆植物采用粒子枪轰击方法(Klein et al.(1987)Nature 327：70-73(Klein等人，1987年，《自然》，第327卷，第70-73页)，美国专利No.4,945,050)并使用DuPont Biolistic PDS1000/He仪器产生。GH3转基因包括活性2，4-D或麦草畏缀合酶的编码序列，诸如PtGH3-1(SEQ ID NO：85)、PtGH3-7(SEQ ID NO：8)和RcGH3-6(SEQ ID NO：92)。用于促进大豆转化的选择性标记基因是由以下组分组成的嵌合基因：来自花椰菜花叶病毒的35S启动子(Odell，et al.(1985)Nature 313：810-812(Odell等人，1985年，《自然》，第313卷，第810-812页))、来自质粒pJR225的潮霉素磷酸转移酶基因(来自大肠杆菌；Gritz et al.(1983)Gene25：179-188(Gritz等人，1983年，《基因》，第25卷，第179-188页)和来自根癌农杆菌的Ti质粒的T-DNA的胭脂碱合成酶基因的3′区。另一种用于促进大豆转化的选择性标记是由以下组分组成的嵌合基因：来自大豆的S-腺苷甲硫氨酸合成酶(SAMS)启动子(US 7,741,537)、ALS的高度抗性等位基因(美国专利No.5,605,011、No.5,378,824、No.5,141,870和No.5,013,659)，以及天然的大豆ALS终止子区。在转化过程期间使用的选择剂根据所存在的标记基因而为潮霉素或氯磺隆。GH3基因采用如下进行表达：组成型启动子例如拟南芥UBQ10启动子(Norris et al.(1993)Plant MolBiol 21：895-906(Norris等人，1993年，《植物分子生物学》，第21卷，第895-906页))、GH3多肽，以及菜豆素基因终止子(Sun SM et al.(1981)Nature 289：37-41(Sun SM等人，1981年，《自然》，第289卷，第37-41页)和Slightom et al.(1983)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80(7)，1897-1901(Slightom等人，1983年，《美国国家科学院院刊》，第80卷，第7期，第1897-1901页))。轰击是使用从任何细菌载体DNA纯化所得的线性DNA片段进行的。选择性标记基因盒与GH3盒处于相同的DNA片段。将经轰击的大豆胚性悬浮组织在不存在选择剂的条件下培养一周，随后放入液体选择培养基中6周。对推定的转基因悬浮组织取样以进行PCR分析，从而确定GH3基因的存在。将推定的转基因悬浮培养组织维持在选择培养基中3周以获得足够的组织用于植物再生。使用标准程序使悬浮组织经4周变成熟；将成熟的体细胞胚干燥4-7天，然后放置在萌发诱导培养基上2-4周。将萌发的小植株转移到孔托盘(cell pack tray)中的土壤内3周以进行驯化。将小植株盆栽于温室内10英寸的营养钵中以用于评价除草剂抗性。转基因大豆、拟南芥和其他物种植物也可采用农杆菌转化并使用多种外植体来产生。
实例7.GH3转基因大豆植物的除草剂耐受性评价
表达GH3转基因的T0植物生长于受控环境(例如，25℃、70％湿度、16小时光照)直至V2或V8生长阶段，然后用商业2，4-D或麦草畏除草剂配方以最高至450克/公顷的比率喷施所述植物。可在添加0.25％的非离子表面活性剂和1％的硫酸铵的情况下进行除草剂施加，喷施体积为374升/公顷。将各个植物与类似遗传背景的未处理植物作比较，评价所述植物在处理后七至二十一天时的除草剂响应，并且分配从0％至100％损伤的可见响应得分(0＝无效到100＝植物死亡)。GH3基因的表达因独特T0植物中的基因组位置而变化。不表达转基因GH3基因的植物被2，4-D或麦草畏除草剂严重损伤。表达所引入的GH3基因的T0植物由于GH3蛋白的活性而可显示出对2，4-D或麦草畏除草剂的耐受性。
或者，除草剂耐受性的评价是通过对缀合产物的分析进行的。对GH3转基因大豆植物的种子进行表面灭菌，并且使所述种子在补充有2，4-D或麦草畏的GB-5基础培养基上萌发，如在实例1中所述。萌发后十天，在形态学上检查GH3转基因种子并与非转基因种子比较。非转基因种子在低至1μM浓度的培养基中不耐受2，4-D或麦草畏并且因此无法很好地萌发和生长。对2，4-D或麦草畏具有耐受性的转基因种子萌发和生长良好，其根部很好地伸展并且出现真叶。收集萌发种子的组织并且在包含100mM磷酸钾(pH 7.0)、5mM MgSO4和1mM DTT的提取缓冲液中使用研钵和研杵进行研磨。使总提取物经受14,000rpm、4℃的离心30分钟，转移上清液并且与冰冷的甲醇混合以达到90％的最终甲醇浓度。将所述混合物再次以14,000rpm离心30分钟。随后在ddH2O中稀释上清液以达到5％的最终甲醇浓度，然后进行LC-MS分析。相较于从非转基因组织制备的样品，从GH3转基因组织制备的样品中检测到的2，4-D-Glu或2，4-D-Asp或麦草畏-Glu或麦草畏-Asp的水平较高，这指示大豆植物中的转基因GH3酶更有效地将生长素除草剂解毒为非除草性的Asp-缀合物或Glu-缀合物。
还使用植物提取物来评价大豆转基因GH3蛋白的活性。收集经处理的GH3转基因植物的组织并且在包含100mM磷酸钾(pH 7.8)、1mM EDTA、7mM β-巯基乙醇、1％Triton和10％甘油的CCLR缓冲液中研磨所述组织以获得总蛋白提取物。在4℃下以14,000rpm离心30分钟后，将上清液转移到包含100mM磷酸钾(pH 7.0)、5mM MgSO4、1mM DTT和5mM 2，4-D或麦草畏的缀合反应缓冲液中。所述反应是在室温下进行的，并且将在不同时间点采集的样品与冰冷的甲醇混合以达到90％的最终甲醇浓度。使该混合物再次经受14,000rpm的离心30分钟。随后在ddH2O中稀释上清液以达到5％的最终甲醇浓度，然后进行LC-MS分析。相较于从非转基因组织制备的样品，从GH3转基因组织制备的样品中检测到的2，4-D-Glu或2，4-D-Asp或麦草畏-Glu或麦草畏-Asp的水平较高，这指示大豆植物中的转基因GH3酶更有效地将生长素除草剂解毒为非除草性的Asp-缀合物或Glu-缀合物。相同的方案可适用于表达所引入的GH3基因变体的拟南芥和其他植物。
实例8.过表达GH3生长素缀合酶的转基因拟南芥的2，4-D耐受性的实 例
产生过表达SEQ ID NO：3的转基因拟南芥品系，然后评价该品系的2，4-D除草剂响应，如在实例5中所述。使用拟南芥UBQ10启动子来驱动SEQ ID NO：3的表达。表7示出过表达SEQ ID NO：3的拟南芥T2转基因植 物(8个植株；这一代分离得到这个群组中纯合和杂合的植株)中2，4-D对根生长抑制的缓解。测量每一转基因品系的8个植株的根长度，并将平均值与相同遗传背景的未处理幼苗进行比较。根生长抑制被表述为在2，4-D环境生长的植物的根长度减少百分比。在野生型Col-0拟南芥中，当在10nM2，4-D环境中生长时初生根长度减少至77％。当在10nM 2，4-D环境中生长时，过表达SEQ ID NO：3的转基因品系表现出不同程度的根生长抑制的缓解，相较于野生型具有较小的根长度减少(表7)。在转基因品系#4中，在10nM 2，4-D处，2，4-D对根生长的抑制被完全缓解。
表7.在野生型(Col-0)和转基因拟南芥植物中2，4-D对根生长的抑制。
*相较于0nM 2，4-D处理，相同遗传背景的植物的平均根长度百分比。
可以预期的是，上述技术可用于产生转基因拟南芥以及针对如在实例5中所述的2，4-D除草剂或者麦草畏响应进行评价。例如，拟南芥UBQ10启动子可用于驱动SEQ ID#26、#52、#57、#81和#121的表达。2，4-D对根生长抑制的缓解可在过表达SEQ ID#26、#52、#57和#81的拟南芥T2转基因植物(筛选和选择纯合植株)中确定。测量每一转基因品系的8个植株的根长度，并可将平均值与相同遗传背景的未处理幼苗进行比较。
实例9.大豆幼苗对所施加的生长素缀合物的响应的实例。
当通过点渗透(一种用于将外源试剂引入植物细胞中的无针头法)施加时，生长素化合物为缀合物形式。首先，将各种浓度的分析级(98％+纯)IAA、2，4-D和麦草畏制备为溶液，通过点渗透将所述溶液直接施加至9日龄大豆幼苗的单叶型叶子(uni-foliate leaves)，以确定生长素响应和严重度的范围。
点渗透包括将待测试的化合物施加于组合物中，所述组合物施加至植物表面，例如，施加至叶子或其他植物结构。例如，使用点渗透测试植物对一种或多种化合物的响应的方法包括：a)在容器中提供包含待测试的一种或多种化合物的组合物，该容器具有供化合物进入和/或离开的至少一个开口以及用于将所述组合物移入或移出所述容器的一个或多个元件；b)使容器的至少一个开口与植物的表面接触并将所述包含一种或多种化合物的组合物移动至植物的至少所述表面上。用于移动所述组合物的容器和元件可包括注射器主体和柱塞。将所述组合物移动至所述植物表面包括以足以使所述组合物进入植物细胞的压力接触所述表面。在一个方面，点过滤测试包括测量所述组合物对所接触的植物的效应以及将该量度或效应与未与该组合物接触的植物进行比较。
记录点渗透后一天的植物响应表型，并且随后记录每隔一天的植物响应表型，直至处理后九天。基于再现性选择三种浓度。在下文所描述的研究中，在有适当阴性对照的情况下对每一缀合物形式执行5次重复处理。数据汇总于下表8中。
以1、2.5和5mM的浓度用IAA在1％MeOH中的溶液进行点渗透的大豆植物在处理后1天显示出适度的茎秆扭转和弯曲(偏上性)，在测试范围内具有不断增加的严重度。在用所有测试水平的缀合物形式IAA-Asp、IAA-Glu或AA-Phe处理过的幼苗中未观察到可辨别的表型。溶于50％EtOH中的IAA-Phe的点渗透在叶面的施加点处产生坏死病斑，这与仅50％EtOH对照的观察结果一致。
以50、100和250μM的浓度点渗透麦草畏在5％EtOH中的溶液的大豆植物再现性地在处理后第1天显示出偏上性，并且在所有剂量下在处理后的2-4天内均显示出第一个三叶叶片的卷叶。以更高浓度点渗透麦草畏的植物显示出更显著的生长素表型。以麦草畏-Asp或麦草畏-Glu点渗透的植物显示出与阴性对照或以5％EtOH渗透的植物类似的表型。在这些植物中未观察到明显的生长素表型。
以100、250和500μM的浓度点渗透2，4-D在5％EtOH中的溶液的大豆植物显示出增强的生长素响应，该响应对于所施加的量分别在轻微到极端偏上性的范围内。对于麦草畏，在第一个三叶叶片处观察到程度小得多的卷叶；然而，对于所有的2，4-D和缀合物形式，显示出从溶液施加点起渐变的失绿。未在阴性对照中观察到这种响应。以2，4-D-Asp点渗透的植物显示出几乎与2，4-D的生长素响应等同的生长素响应，在各自的浓度处具有类似的偏上性程度。相似地，经2，4-D-Phe处理的植物在各自水平处显示出与2，4-D类似的偏上性程度。在以2，4-D-Glu点渗透的植物上观察到明显较低的严重度水平，仅在500μM浓度处出现适度的偏上性。以较低浓度的2，4-D-Glu点渗透的植物未表现出可辨别的生长素响应。
表8.大豆幼苗对所施加的生长素缀合物的响应。
0＝无表型
+/-＝阈值
实例10.拟南芥对所施加的生长素缀合物的响应的实例。
使用拟南芥(Arabidopsis thialiana)生态型Col-0植株来评估生长素缀合物的效应。在使用生长素缀合物研究之前，将各种水平的分析级(98％+纯)IAA、2，4-D和麦草畏溶液以各种浓度通过无针头注射器点渗透法直接施加到20-23日龄的拟南芥幼苗的发育类似的叶片上，以确定生长素响应和严重度的范围。相对于对照记录点渗透后1天的表型，并且随后记录每隔一天的表型，直至处理后九天。基于再现性选择三种浓度，并且随后在有适当的阴性对照(H2O和10％EtOH)的情况下对每一缀合形式进行4次或更多次重复处理来研究缀合形式。
以1、2.5和5mM的浓度施加至(2)21日龄植物的发育类似的叶片的IAA(溶于5％EtOH)，在以5mM(高剂量)处理后1-2天表现出适度的叶柄扭转(偏上性)和卷叶。在用所有测试水平的缀合物形式IAA-Asp或IAA-Glu处理过的植物中未观察到可辨别的表型。
以50、100和250μM的浓度施加的麦草畏游离酸(溶于5％EtOH)在第1天再现地表现出叶柄偏上性和卷叶，在250μM时具有最显著的严重度。在以相同时间和水平进行缀合型麦草畏-Asp处理时未观察到明显的表型；表现与阴性对照等同。在100和250μM水平时，相较于单独的麦草畏，麦草畏-Glu显示出适度的偏上性。
通过点渗透以50、150和500μM的浓度施加的2，4-D(溶于5％EtOH)显示出增强的生长素响应，该响应相对于所施加的2，4-D浓度在轻微到更极端的偏上性范围内。这两种2，4-D缀合物在所施加的各自浓度水平处表现出与2，4-D类似的响应。
实例11.点渗透法。
实例9和10利用点渗透法来将除草剂直接递送到植物的叶片中。所述方法通常允许将多种试剂直接递送到植物的局部区域，例如叶片的局部区域，以用于筛选或评估目的，例如用于快速评估植物对试剂的响应。如在上述实例中所使用的，点渗透法用于将特定除草剂或特定除草剂缀合物引入到幼苗植株的叶片中。在引入所述除草剂或适当缀合物后，每天观察植物的偏上性、三叶叶片卷叶、失绿和新生恢复特性，共持续九天。
简而言之，所需试剂的溶液由所需试剂制备，例如，如上文在实例10中描述的1、2.5和5mM IAA的溶液(5％EtOH)。随后将所述溶液抽吸到具有100μL标记的1mL BDTM滑动尖头注射器(散装非无菌注射器)(例如，碧迪医疗公司(Becton，Dickinson and Company)，产品号301025)中。随后将所需的体积施加到叶片上，例如如实例9和实例10中所描述的，使注射器的尖头抵靠所述叶片并且施加正压力到注射器柱塞上。施加足够的压力以灌注注射器开口下方的区域，但是压力不能太大以致在所述叶片中形成肉眼可见的刺孔或洞。预计在注射器开口周围具有一定程度的溶液径流。在上述实例中，在每个大豆植物幼苗的两个叶片的每一者上施加两个点。因此，通常对于每个浓度的测试试剂，处理约四个植物。在大豆中，每个叶片上的两个点在叶子的远侧部分，相隔大约1-2cm。当将该方法应用于拟南芥时，每个植株选择两个发育中间龄期的叶片，并且每个叶片进行一次点渗透。
一般来讲，对于拟南芥，从莲座丛的相对侧选择两个叶片。一般来讲，在较幼小的植物上进行点渗透法，以最小化实验占地面积以及维持发育一致性。然而，该方法并不限于用于幼小植物，并且可容易地应用于较老的植物，可视具体实验目的而定。
本领域的技术人员可以理解，本文所述的点渗透法可用于幼小植物和老植物的基本特征部位、不同大小的叶片，以及用于各种用来筛选植物的目标试剂。所述试剂可包括除草剂、杀昆虫剂、生长诱导剂、生长抑制剂等等。可按照实验要求的需要，通过利用较大或较小的市售注射器而容易地将所渗透点的体积和尺寸调整为适合于较大或较小的植株。在一些情况下，定制具有特定尺寸开口或体积的注射器可为有用的。多种溶媒溶液可用于目标试剂，只要溶媒不直接对实验结果有害即可。例如，水溶液可为未改性的或者包含另外的组分，诸如短链醇(例如，乙醇)、离子或非离子洗涤剂、盐类或脂质。可添加此类另外的组分以增强点渗透效率和/或增加所评估的特定试剂的溶解度。
本文所用的词语“一个”和“一种”指一个(种)或不止一个(种)(即，指至少一个(种))该词语的语法对象。举例而言，“一个要素”意指一个或多个要素。
本说明书中提及的所有公布和专利申请指示了本发明所属领域的技术人员的水平。所有公布和专利申请在相同程度上全文以引用方式并入本文，如同每个单独的公布或专利申请被具体地和独立地指出全文以引用方式并入本文一样。
虽然为了清楚地理解而已经通过举例说明和实例较详细地描述了本发明，但显然可以在所附权利要求书范围内实施一些改变和修饰。

Claims (25)

1.一种对生长素类似物除草剂解毒的方法，所述方法包括将生长素类似物除草剂施加于植物、植物细胞或种子，其中所述植物、植物细胞或种子包含编码具有氨基酸/生长素类似物缀合活性的GH3多肽的异源多核苷酸，并且其中所述GH3多肽的表达产生天冬氨酸/生长素类似物缀合物或者谷氨酸/生长素类似物缀合物，其中所述生长素类似物缀合物具有降低的除草活性。
2.一种用于在包括作物或所述作物的种子的耕作区中控制至少一种杂草的方法，所述方法包括向所述耕作区和/或所述耕作区中的所述作物或所述作物的种子施加足量的生长素类似物除草剂以控制杂草但不显著地影响所述作物，其中所述耕作区中的所述作物或其种子包含至少一种编码具有氨基酸/生长素类似物缀合活性的GH3多肽的异源多核苷酸。
3.一种用于在包括作物的耕作区中控制至少一种杂草的方法，所述方法包括
(a)向所述耕作区施加足量的生长素类似物除草剂以控制杂草但不显著地影响所述作物；
(b)在田地中种植含有编码具有氨基酸/生长素类似物缀合活性的GH3多肽的异源多核苷酸的作物或其种子。
4.根据权利要求2或3中任一项所述的方法，其中相较于适当对照植物，所述作物表现出增强的对所述生长素类似物除草剂的不敏感性。
5.根据权利要求3所述的方法，其中步骤(a)在步骤(b)之前发生或者与步骤(b)同时发生。
6.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述GH3多肽包括含有与SEQ ID NO：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、58、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、117、118、119、120、121、124、142、144或145中的任一者具有至少85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
7.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述GH3多肽包括含有与SEQ ID NO：15、16、17、51、52、53、54、55、56、57、59、60、61、62、63、64、65、66、67、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、122、134、135、136、137、138、139、140、141中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
8.根据权利要求1、2、3、4或5所述的方法，其中所述GH3多肽包括含有与SEQ ID NO：18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、123、125、126、127、128、129、130、131、132、133或143中的任一者具有至少80％、85％、90％、95％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述生长素类似物除草剂包括2，4-D或麦草畏。
10.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其中所述作物还包含赋予对另外的除草剂的耐受性的至少一种多肽。
11.根据权利要求10所述的方法，其中赋予对另外的除草剂的耐受性的所述至少一种多肽包括：
(a)磺酰脲耐受性乙酰乳酸合成酶；
(b)咪唑啉酮耐受性乙酰乳酸合成酶；
(c)草甘膦耐受性5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶；
(d)草甘膦耐受性草甘膦氧化还原酶；
(e)草甘膦N-乙酰转移酶；
(f)草丁膦乙酰转移酶；
(g)原卟啉原氧化酶；
(h)HPPD酶；
(i)P450多肽；或者，
(j)乙酰辅酶A羧化酶(ACC酶)。
12.根据权利要求11所述的方法，其中赋予对另外的除草剂的耐受性的所述至少一种多肽包括乙酰乳酸合成酶(HRA)和/或草甘膦N-乙酰转移酶多肽的高抗性等位基因。
13.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其中所述作物还包括赋予对生长素类似物除草剂的耐受性的至少一种另外的多肽，其中所述另外的多肽与由所述异源多核苷酸编码的所述GH3多肽相同或不同。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物、植物细胞或种子源自单子叶植物。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物、植物细胞或种子源自双子叶植物。
16.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述作物源自单子叶植物。
17.根据权利要求2或3所述的方法，其中所述作物源自双子叶植物。
18.根据权利要求14或16中任一项所述的方法，其中所述单子叶植物选自玉蜀黍、小麦、水稻、大麦、高粱或裸麦。
19.根据权利要求15或17中任一项所述的方法，其中所述双子叶植物选自大豆、芸苔属(Brassica)、向日葵、棉花或苜蓿。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述生长素类似物除草剂包括2，4-D。
21.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述生长素类似物除草剂包括麦草畏。
22.一种用于测试植物对一种或多种化合物的响应的方法，所述方法包括：
a)在容器中提供包含待测试的一种或多种化合物的组合物，所述容器具有供所述化合物进入和/或离开的至少一个开口以及用于将所述组合物移入或移出所述容器的一个或多个元件；
b)使所述容器的至少一个开口与植物的表面接触并将所述包含一种或多种化合物的组合物移动至所述植物的至少所述表面上。
23.根据权利要求22所述的方法，其中用于移动所述组合物的所述容器和元件包括注射器主体和柱塞。
24.根据权利要求22所述的方法，其中将所述组合物移动至所述植物表面包括以足以使所述组合物进入所述植物的所述细胞的压力接触所述表面。
25.根据权利要求22所述的方法，还包括相较于未与所述组合物接触的植物，测量所述组合物对所述所接触的植物的效应。
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Application publication date: 20151028