JPH11137251A - ヒトｐ２７Ｋｉｐ１遺伝子のプロモーター - Google Patents
ヒトｐ２７Ｋｉｐ１遺伝子のプロモーターInfo
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- JPH11137251A JPH11137251A JP9305196A JP30519697A JPH11137251A JP H11137251 A JPH11137251 A JP H11137251A JP 9305196 A JP9305196 A JP 9305196A JP 30519697 A JP30519697 A JP 30519697A JP H11137251 A JPH11137251 A JP H11137251A
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- protein
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- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
- C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
- C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
- C07K14/4738—Cell cycle regulated proteins, e.g. cyclin, CDC, INK-CCR
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒトp27Kip1遺伝子のプロモーター、および
該プロモーターの活性を調節する化合物のスクリーニン
グ方法を提供することを課題とする。 【解決手段】 p27Kip1cDNAの部分断片を調製し、これ
をプローブとしてヒト白血球ゲノムライブラリーをスク
リーニングすることにより、ヒトp27Kip1遺伝子の上流
域を単離することに成功した。さらに、単離した上流域
の欠失変異体を調製し、そのプロモーター活性を検出す
ることにより、該上流域における基本的なプロモーター
活性領域を見いだすことに成功した。単離したプロモー
ター領域を用いることにより、これに結合する転写因子
をスクリーニングすることが可能であることを見いだし
た。
該プロモーターの活性を調節する化合物のスクリーニン
グ方法を提供することを課題とする。 【解決手段】 p27Kip1cDNAの部分断片を調製し、これ
をプローブとしてヒト白血球ゲノムライブラリーをスク
リーニングすることにより、ヒトp27Kip1遺伝子の上流
域を単離することに成功した。さらに、単離した上流域
の欠失変異体を調製し、そのプロモーター活性を検出す
ることにより、該上流域における基本的なプロモーター
活性領域を見いだすことに成功した。単離したプロモー
ター領域を用いることにより、これに結合する転写因子
をスクリーニングすることが可能であることを見いだし
た。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒトp27Kip1遺伝
子のプロモーター、および該プロモーターの活性を調節
する化合物のスクリーニング方法に関する。
子のプロモーター、および該プロモーターの活性を調節
する化合物のスクリーニング方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】真核細胞周期においては、いくつかの正
及び負の因子が細胞周期の進行を調節している。正の因
子の中で重要な役割を果たしているのは、プロテインキ
ナーゼファミリーであり、それぞれは調節サブユニッ
ト、あるいはサイクリン及びサイクリン依存性キナーゼ
(cdk)と名付けられた触媒サブユニット構成している。
サイクリンD-cdk4，サイクリンD-cdk6及びサイクリンE-
cdk2が、網膜芽細胞腫蛋白質(pRB)のリン酸化によるG1
期からS期への移行の促進において重要な役割を果たし
ていることが、多くの報告によって示唆されている。最
近、さらに高いレベルでの調節が明らかになった。すな
わち、cdk阻害剤の発現である（Sherr,C.J. and Robert
s,J.M. (1995) Genes & Dev. 9: 1149-1163）。哺乳動
物細胞において、作用様式の異なる２つのcdk阻害剤フ
ァミリーが、すでに同定されている。１つめのグループ
は、p21cip1，p27kip1及びp57kip2として知られている
関連蛋白質から構成され、サイクリン／cdk複合体ファ
ミリーに対する主要な特異的阻害剤として機能している
と考えられている（Harper,J.W., Adami,G.R., Wei,N.,
Keyomarsi,K. and Elledge,S.J. (1993) Cell 75: 805
-816、Polyak,K., Lee,M.-H., Erdjument-Bromage,H.,
Koff A., Roberts,J.M., Tempst,P. and Massague,J.
(1994) Cell 78: 59-66、Toyoshima,H. and Hunter,T.
(1994) Cell 78: 67-74、Matsuoka,S., Edwards,M.C.,
Bai,C., Parker,S, Zhang,P., Baldini,A., Harper,J.
W. and Elledge,S.J. (1995) Genes Dev. 9: 650-66
2）。cdk阻害剤の２つめのファミリーは、INK4ファミリ
ー蛋白質と呼ばれている。p15，p16，p18，p19と呼ばれ
るこのファミリーの４つのメンバーは、cdk4及びcdk6と
直接結合することから、サイクリンD依存性キナーゼに
特異的な阻害剤である（Hannon,G.J. and Beach,D. (19
94) Nature 371: 257-261、Serrano,M., Hannon,G.J. a
ndBeach,D. (1993) Nature 366: 704-707、Hirai,H., R
oussel,M. F., Kato,J., Ashmun,R.A. and Sherr,C.J.
(1995) Mol.Cell.Biol. 15: 2672-2681）。
及び負の因子が細胞周期の進行を調節している。正の因
子の中で重要な役割を果たしているのは、プロテインキ
ナーゼファミリーであり、それぞれは調節サブユニッ
ト、あるいはサイクリン及びサイクリン依存性キナーゼ
(cdk)と名付けられた触媒サブユニット構成している。
サイクリンD-cdk4，サイクリンD-cdk6及びサイクリンE-
cdk2が、網膜芽細胞腫蛋白質(pRB)のリン酸化によるG1
期からS期への移行の促進において重要な役割を果たし
ていることが、多くの報告によって示唆されている。最
近、さらに高いレベルでの調節が明らかになった。すな
わち、cdk阻害剤の発現である（Sherr,C.J. and Robert
s,J.M. (1995) Genes & Dev. 9: 1149-1163）。哺乳動
物細胞において、作用様式の異なる２つのcdk阻害剤フ
ァミリーが、すでに同定されている。１つめのグループ
は、p21cip1，p27kip1及びp57kip2として知られている
関連蛋白質から構成され、サイクリン／cdk複合体ファ
ミリーに対する主要な特異的阻害剤として機能している
と考えられている（Harper,J.W., Adami,G.R., Wei,N.,
Keyomarsi,K. and Elledge,S.J. (1993) Cell 75: 805
-816、Polyak,K., Lee,M.-H., Erdjument-Bromage,H.,
Koff A., Roberts,J.M., Tempst,P. and Massague,J.
(1994) Cell 78: 59-66、Toyoshima,H. and Hunter,T.
(1994) Cell 78: 67-74、Matsuoka,S., Edwards,M.C.,
Bai,C., Parker,S, Zhang,P., Baldini,A., Harper,J.
W. and Elledge,S.J. (1995) Genes Dev. 9: 650-66
2）。cdk阻害剤の２つめのファミリーは、INK4ファミリ
ー蛋白質と呼ばれている。p15，p16，p18，p19と呼ばれ
るこのファミリーの４つのメンバーは、cdk4及びcdk6と
直接結合することから、サイクリンD依存性キナーゼに
特異的な阻害剤である（Hannon,G.J. and Beach,D. (19
94) Nature 371: 257-261、Serrano,M., Hannon,G.J. a
ndBeach,D. (1993) Nature 366: 704-707、Hirai,H., R
oussel,M. F., Kato,J., Ashmun,R.A. and Sherr,C.J.
(1995) Mol.Cell.Biol. 15: 2672-2681）。
【０００３】p27Kip1の正確な役割はほとんどわかって
いないが、そのレベルは、細胞が刺激され、細胞周期に
入る時には減少し、細胞がTGF-βの変化あるいは接触阻
害によって停止状態にあるときには増大する（Polyak,
K., Kato,J., Solomon,M.J.,Sherr,C.J., Massague,J.,
Roberts,J.M. and Koff,A. (1994) Genes Dev. 8: 9-2
2）。p27Kip1はサイクリンE-cdk2（Polyak,K., Lee,M.-
H., Erdjument-Bromage,H., Koff A., Roberts,J.M., T
empst,P.and Massague,J. (1994) Cell 78: 59-66）あ
るいはサイクリンD-cdk4（Toyoshima,H. and Hunter,T.
(1994) Cell 78: 67-74）に結合する蛋白質としてクロ
ーニングされた。p27Kip1は、ほとんどのサイクリン−c
dk複合体の活性を阻害し、さらに、CAK(cdk-活性化キナ
ーゼ)によるサイクリン／cdk複合体のリン酸化を阻害し
うる（Kato,J., Matsuoka,M., Polyak,K., Massague,J.
and Sherr,C.J. (1994) Cell 79: 487-496）。そのた
め、p27Kip1はG1/S進行の負の調節因子として機能す
る。
いないが、そのレベルは、細胞が刺激され、細胞周期に
入る時には減少し、細胞がTGF-βの変化あるいは接触阻
害によって停止状態にあるときには増大する（Polyak,
K., Kato,J., Solomon,M.J.,Sherr,C.J., Massague,J.,
Roberts,J.M. and Koff,A. (1994) Genes Dev. 8: 9-2
2）。p27Kip1はサイクリンE-cdk2（Polyak,K., Lee,M.-
H., Erdjument-Bromage,H., Koff A., Roberts,J.M., T
empst,P.and Massague,J. (1994) Cell 78: 59-66）あ
るいはサイクリンD-cdk4（Toyoshima,H. and Hunter,T.
(1994) Cell 78: 67-74）に結合する蛋白質としてクロ
ーニングされた。p27Kip1は、ほとんどのサイクリン−c
dk複合体の活性を阻害し、さらに、CAK(cdk-活性化キナ
ーゼ)によるサイクリン／cdk複合体のリン酸化を阻害し
うる（Kato,J., Matsuoka,M., Polyak,K., Massague,J.
and Sherr,C.J. (1994) Cell 79: 487-496）。そのた
め、p27Kip1はG1/S進行の負の調節因子として機能す
る。
【０００４】p16，p53及びRBのようないくつかの細胞周
期調節物質は、いくつかの癌においては頻繁に変異し、
腫瘍抑制遺伝子であることが示されてきたのに対し、腫
瘍に特異的なp27Kip1遺伝子の突然変異はまれである（P
once-Castaneda,M.V., Lee,M.-H., Latres,E., Polyak,
K., Lacombe,L., Montgomery,K., Mathew,S., Krauter,
K., Sheinfeld,J., Massague,J. and Cordon-Cardo,C.
(1995) Cancer Res. 55: 1211-1214）。しかしながら、
p27Kip1欠損マウスでは、体の肥大化、多様な器官の過
形成、網膜の異形成、下垂体腫瘍の形成が観察された
（Fero,M.L., Rivkin,M., Tasch,M., Porter,P., Caro
w,C.E., Firpo,E., Polyak,K., Tsai,L.-H.,Broudy,V.,
Perlmutter,R.M., Kaushansky,K. and Roberts,J.M.
(1996) CelI 85: 733-744、Kiyokawa,H., Kineman,R.
D., Manova-Todorova,K.O., Soares,V.C., Hoffman,E.
S., Ono,M., Khanam,D., Hayday,A.C., Frohman,L.A. a
nd Koff,A.(1996) Cell 85: 721-732、Nakayama,K., Is
hida,N., Shirane,M., Inomata,A., Inoue,T., Shishid
o,N., Horii,I., Loh,D.Y. and Nakayama,K. (1996) Ce
ll85: 707-720）。このことはRBヘテロ接合体ノックア
ウトマウスの場合と一部類似している（Hu,N., Gutsman
n,A., Herbert,D.C., Bradley,A., Lee,W.-H. andLee,
E.Y.-H.P.(1994) Oncogene 9: 1021-1027）。さらに、
乳癌及び結腸直腸癌において、p27Kip1蛋白質の発現の
低さと生存率の低さに相関があることが示された（Port
er,P.L., Malone,K.E., Heagerty,P.J., Alexander G.
M., Gatti,L.A., Firpo,E.J., Daling,J.R. and Robert
s,J.M. (1997) Nature Medicine 3: 222-225、Catzavel
os,C., Bhattacharya,N., Ung,Y.C., Wilson,J.A., Ron
cari,L., Sandhu,C., Shaw,P., Yeger,H., Morava-Prot
zner,I., Kapsuta,L., Franssen,E., Pritchard,K.I. a
nd Slingerland,J.M. (1997) Nature Medicine 3: 227-
230、Loda,M., Cukor,B., Tam,S.W., Lavin,P., Fioren
tino,M., Draetta,G.F.,Jessup,J.M. and Pagano,M. (1
997) Nature Mediene 3: 231-234）。これらの結果は、
p27Kip1が、明らかに腫瘍の形成と腫瘍の進行の阻害に
重要な役割を果たしていることを示している。また、腫
瘍細胞の抗ガン剤に対する感受性の増強または癌予後因
子への影響において、p27Kip1遺伝子が重要であること
も報告されている（Croix,B.S., Florenes,V.A., Rak,
J.W., Flanagan,M., Bhattacharya,N., Slingerland,J.
M. and Kerbel,R.S. (1996) Nature Medicine 2: 1204-
1210、Loda,M., Cukor,B., Tam,S.W., Lavin,P., Fiore
ntino,M., Draetta,G.F., Jessup,J.M. and Pagano,M.
(1997) Nature Mediene 3: 231-234、Hengst,L. andRee
d,S.I. (1996) Science 271: 1861-1864、Pagano,M., T
am,S.W., Theodoras,A.M., Beer-Romero,P., Sal,G.D.,
Chau,V., Yew,P.R., Draetta,G.F. and Rolfe,M. (199
5) Science 269: 682-685）。このため悪性腫瘍の予防
または治療のための、p27K ip1遺伝子の転写を調節する
薬剤の開発が期待されている。
期調節物質は、いくつかの癌においては頻繁に変異し、
腫瘍抑制遺伝子であることが示されてきたのに対し、腫
瘍に特異的なp27Kip1遺伝子の突然変異はまれである（P
once-Castaneda,M.V., Lee,M.-H., Latres,E., Polyak,
K., Lacombe,L., Montgomery,K., Mathew,S., Krauter,
K., Sheinfeld,J., Massague,J. and Cordon-Cardo,C.
(1995) Cancer Res. 55: 1211-1214）。しかしながら、
p27Kip1欠損マウスでは、体の肥大化、多様な器官の過
形成、網膜の異形成、下垂体腫瘍の形成が観察された
（Fero,M.L., Rivkin,M., Tasch,M., Porter,P., Caro
w,C.E., Firpo,E., Polyak,K., Tsai,L.-H.,Broudy,V.,
Perlmutter,R.M., Kaushansky,K. and Roberts,J.M.
(1996) CelI 85: 733-744、Kiyokawa,H., Kineman,R.
D., Manova-Todorova,K.O., Soares,V.C., Hoffman,E.
S., Ono,M., Khanam,D., Hayday,A.C., Frohman,L.A. a
nd Koff,A.(1996) Cell 85: 721-732、Nakayama,K., Is
hida,N., Shirane,M., Inomata,A., Inoue,T., Shishid
o,N., Horii,I., Loh,D.Y. and Nakayama,K. (1996) Ce
ll85: 707-720）。このことはRBヘテロ接合体ノックア
ウトマウスの場合と一部類似している（Hu,N., Gutsman
n,A., Herbert,D.C., Bradley,A., Lee,W.-H. andLee,
E.Y.-H.P.(1994) Oncogene 9: 1021-1027）。さらに、
乳癌及び結腸直腸癌において、p27Kip1蛋白質の発現の
低さと生存率の低さに相関があることが示された（Port
er,P.L., Malone,K.E., Heagerty,P.J., Alexander G.
M., Gatti,L.A., Firpo,E.J., Daling,J.R. and Robert
s,J.M. (1997) Nature Medicine 3: 222-225、Catzavel
os,C., Bhattacharya,N., Ung,Y.C., Wilson,J.A., Ron
cari,L., Sandhu,C., Shaw,P., Yeger,H., Morava-Prot
zner,I., Kapsuta,L., Franssen,E., Pritchard,K.I. a
nd Slingerland,J.M. (1997) Nature Medicine 3: 227-
230、Loda,M., Cukor,B., Tam,S.W., Lavin,P., Fioren
tino,M., Draetta,G.F.,Jessup,J.M. and Pagano,M. (1
997) Nature Mediene 3: 231-234）。これらの結果は、
p27Kip1が、明らかに腫瘍の形成と腫瘍の進行の阻害に
重要な役割を果たしていることを示している。また、腫
瘍細胞の抗ガン剤に対する感受性の増強または癌予後因
子への影響において、p27Kip1遺伝子が重要であること
も報告されている（Croix,B.S., Florenes,V.A., Rak,
J.W., Flanagan,M., Bhattacharya,N., Slingerland,J.
M. and Kerbel,R.S. (1996) Nature Medicine 2: 1204-
1210、Loda,M., Cukor,B., Tam,S.W., Lavin,P., Fiore
ntino,M., Draetta,G.F., Jessup,J.M. and Pagano,M.
(1997) Nature Mediene 3: 231-234、Hengst,L. andRee
d,S.I. (1996) Science 271: 1861-1864、Pagano,M., T
am,S.W., Theodoras,A.M., Beer-Romero,P., Sal,G.D.,
Chau,V., Yew,P.R., Draetta,G.F. and Rolfe,M. (199
5) Science 269: 682-685）。このため悪性腫瘍の予防
または治療のための、p27K ip1遺伝子の転写を調節する
薬剤の開発が期待されている。
【０００５】また、p27Kip1のmRNAが、U937細胞におい
てはビタミンD3によって誘導され（Liu,M., Lee,M.-H.,
Cohen,M., Bommakanti,M. and Freedman,L.P. (1996)
GenesDev.10: 142-153）、さらにニューロンの分化によ
って誘導されること（Poluha,W., Poluha,D.K., Chang,
B., Crosbie,N.E., Schonhoff C.M., Kilpatrick,D.L.
and Ross,A.H. (1996) Mol.Cell.Biol. 16: 1335-134
1）が最近の報告によって示された。このことから、p27
Kip1遺伝子の転写段階の調節が細胞の分化においても重
要であることが示唆されている。
てはビタミンD3によって誘導され（Liu,M., Lee,M.-H.,
Cohen,M., Bommakanti,M. and Freedman,L.P. (1996)
GenesDev.10: 142-153）、さらにニューロンの分化によ
って誘導されること（Poluha,W., Poluha,D.K., Chang,
B., Crosbie,N.E., Schonhoff C.M., Kilpatrick,D.L.
and Ross,A.H. (1996) Mol.Cell.Biol. 16: 1335-134
1）が最近の報告によって示された。このことから、p27
Kip1遺伝子の転写段階の調節が細胞の分化においても重
要であることが示唆されている。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、ヒトp27
Kip1遺伝子のプロモーター、および該プロモーターの活
性を調節する化合物のスクリーニング方法を提供するこ
とを課題とする。
Kip1遺伝子のプロモーター、および該プロモーターの活
性を調節する化合物のスクリーニング方法を提供するこ
とを課題とする。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、上記課題
を解決すべく鋭意研究を行った結果、p27Kip1cDNAの部
分断片を調製し、これをプローブとしてヒト白血球ゲノ
ムライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒト
p27Kip1遺伝子の上流域を単離することに成功した。さ
らに本発明者等は、単離した上流域の欠失変異体を調製
し、そのプロモーター活性を検出することにより、該上
流域における基本的なプロモーター活性領域を見いだす
ことに成功した。さらに、本発明者等は、単離したプロ
モーター領域を用いることにより、該プロモーターの活
性を調節する化合物をスクリーニングすることが可能で
あることを見いだした。
を解決すべく鋭意研究を行った結果、p27Kip1cDNAの部
分断片を調製し、これをプローブとしてヒト白血球ゲノ
ムライブラリーをスクリーニングすることにより、ヒト
p27Kip1遺伝子の上流域を単離することに成功した。さ
らに本発明者等は、単離した上流域の欠失変異体を調製
し、そのプロモーター活性を検出することにより、該上
流域における基本的なプロモーター活性領域を見いだす
ことに成功した。さらに、本発明者等は、単離したプロ
モーター領域を用いることにより、該プロモーターの活
性を調節する化合物をスクリーニングすることが可能で
あることを見いだした。
【０００８】即ち、本発明は、ヒトp27Kip1遺伝子のプ
ロモーター領域、及び該プロモーター領域を用いた化合
物のスクリーニング方法に関し、より具体的には、
（１） 配列番号：１に記載の塩基配列の少なくとも一
部を含むDNA、（２） 配列番号：１に記載の塩基配列
の少なくとも一部を含みプロモーター活性を有するDN
A、（３） （２）に記載のDNAを含むベクター、（４）
（３）に記載のベクターを保持する細胞、（５）
（２）に記載のDNAのプロモーター活性を調節するタン
パク質のスクリーニング方法であって、（ａ）（２）に
記載のDNAに被検試料を接触させ、請求項２に記載のDNA
に結合するタンパク質を選択する工程、（ｂ）（２）に
記載のDNAの下流に連結されたレポーター遺伝子を保持
する細胞に被検DNAを導入し、レポーター遺伝子の発現
を調節する発現産物を選択する工程、（ｃ）（２）に記
載のDNAの下流に連結されたレポーター遺伝子を保持す
る細胞に被検試料を接触させ、レポーター遺伝子の発現
を調節するタンパク質を選択する工程、のいずれかの工
程を含む方法。（６） （２）に記載のDNAのプロモー
ター活性を調節するタンパク質をコードするDNAのスク
リーニング方法であって、（ａ）（２）に記載のDNAに
被検DNAの発現産物を接触させ、（２）に記載のDNAに結
合する発現産物をコードするDNAを選択する工程、
（ｂ）（２）に記載のDNAの下流に連結されたレポータ
ー遺伝子を保持する細胞に被検DNAを導入し、レポータ
ー遺伝子の発現を調節する発現産物をコードするDNAを
選択する工程、（ｃ）（２）に記載のDNAの下流に連結
されたレポーター遺伝子を保持する細胞に被検DNAの発
現産物を接触させ、レポーター遺伝子の発現を調節する
発現産物をコードするDNAを選択する工程、のいずれか
の工程を含む方法、（７） （２）に記載のDNAのプロ
モーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法で
あって、（ａ）被検化合物の存在下で（２）に記載のDN
Aと被検試料とを接触させ、（２）に記載のDNAと被検試
料中のタンパク質との結合を促進または阻害する化合物
を選択する工程、（ｂ）（２）に記載のDNAの下流に連
結されたレポーター遺伝子を保持する細胞に被検化合物
を接触させ、レポーター遺伝子の発現を調節する化合物
を選択する工程、のいずれかの工程を含む方法、（８）
（２）に記載のDNAのプロモーター活性を調節するタ
ンパク質、（９） （５）に記載の方法により単離しう
る、（８）に記載のタンパク質、（１０） （２）に記
載のDNAのプロモーター活性を調節するタンパク質をコ
ードするDNA、（１１） （６）に記載の方法により単
離しうる、（１０）に記載のDNA、（１２） （２）に
記載のDNAのプロモーター活性を調節する化合物、（１
３） （７）に記載の方法により単離しうる、（１２）
に記載の化合物、に関する。
ロモーター領域、及び該プロモーター領域を用いた化合
物のスクリーニング方法に関し、より具体的には、
（１） 配列番号：１に記載の塩基配列の少なくとも一
部を含むDNA、（２） 配列番号：１に記載の塩基配列
の少なくとも一部を含みプロモーター活性を有するDN
A、（３） （２）に記載のDNAを含むベクター、（４）
（３）に記載のベクターを保持する細胞、（５）
（２）に記載のDNAのプロモーター活性を調節するタン
パク質のスクリーニング方法であって、（ａ）（２）に
記載のDNAに被検試料を接触させ、請求項２に記載のDNA
に結合するタンパク質を選択する工程、（ｂ）（２）に
記載のDNAの下流に連結されたレポーター遺伝子を保持
する細胞に被検DNAを導入し、レポーター遺伝子の発現
を調節する発現産物を選択する工程、（ｃ）（２）に記
載のDNAの下流に連結されたレポーター遺伝子を保持す
る細胞に被検試料を接触させ、レポーター遺伝子の発現
を調節するタンパク質を選択する工程、のいずれかの工
程を含む方法。（６） （２）に記載のDNAのプロモー
ター活性を調節するタンパク質をコードするDNAのスク
リーニング方法であって、（ａ）（２）に記載のDNAに
被検DNAの発現産物を接触させ、（２）に記載のDNAに結
合する発現産物をコードするDNAを選択する工程、
（ｂ）（２）に記載のDNAの下流に連結されたレポータ
ー遺伝子を保持する細胞に被検DNAを導入し、レポータ
ー遺伝子の発現を調節する発現産物をコードするDNAを
選択する工程、（ｃ）（２）に記載のDNAの下流に連結
されたレポーター遺伝子を保持する細胞に被検DNAの発
現産物を接触させ、レポーター遺伝子の発現を調節する
発現産物をコードするDNAを選択する工程、のいずれか
の工程を含む方法、（７） （２）に記載のDNAのプロ
モーター活性を調節する化合物のスクリーニング方法で
あって、（ａ）被検化合物の存在下で（２）に記載のDN
Aと被検試料とを接触させ、（２）に記載のDNAと被検試
料中のタンパク質との結合を促進または阻害する化合物
を選択する工程、（ｂ）（２）に記載のDNAの下流に連
結されたレポーター遺伝子を保持する細胞に被検化合物
を接触させ、レポーター遺伝子の発現を調節する化合物
を選択する工程、のいずれかの工程を含む方法、（８）
（２）に記載のDNAのプロモーター活性を調節するタ
ンパク質、（９） （５）に記載の方法により単離しう
る、（８）に記載のタンパク質、（１０） （２）に記
載のDNAのプロモーター活性を調節するタンパク質をコ
ードするDNA、（１１） （６）に記載の方法により単
離しうる、（１０）に記載のDNA、（１２） （２）に
記載のDNAのプロモーター活性を調節する化合物、（１
３） （７）に記載の方法により単離しうる、（１２）
に記載の化合物、に関する。
【０００９】なお、本発明における「化合物」には、合
成されたものの他天然のものも含まれ、低分子であるか
高分子であるか、また有機物であるか無機物であるかを
問わない。
成されたものの他天然のものも含まれ、低分子であるか
高分子であるか、また有機物であるか無機物であるかを
問わない。
【００１０】
【発明の実施の形態】本発明は、ヒトp27Kip1遺伝子の
プロモーターに関する。より具体的には、本発明は、ヒ
トp27Kip1遺伝子の上流に存在しプロモーター活性を有
するDNAに関する。本発明のプロモーターDNAは、ヒトp2
7Kip1遺伝子の5'上流域の塩基配列の少なくとも一部を
含む。プロモーター活性を有する限り、ヒトp27Kip1遺
伝子の5'上流域のいかなる塩基配列を含んでいてもよ
い。ヒトp27Kip1遺伝子の上流に存在しプロモーター活
性を有するDNAとしては、例えば、ヒトp27Kip1遺伝子の
5'上流-3568位から-12位の塩基配列からなるDNA、-1797
位から-12位の塩基配列からなるDNA、-774位から-12位
の塩基配列からなるDNAが挙げられる（ヒトp27Kip1遺伝
子の5'上流-3568位から-1位の塩基配列からなるDNAを配
列番号：１に示す）。一方、ヒトp27Kip1遺伝子の5'上
流域-435位から-12位の塩基配列からなるDNAは実質的に
プロモーター活性を有しない。-774位から-12位の塩基
配列からなるDNAがプロモーター活性を有するという事
実を考慮すると、ヒトp27Kip1遺伝子の5'上流域の-774
位から-436位の塩基配列にはプロモーター活性に必須の
領域が含まれると考えられる。従って、本発明のプロモ
ーターDNAは好ましくは、ヒトp27Kip1遺伝子の5'上流−
774位から−436位の塩基配列の少なくとも一部を含む。
ヒトp27Kip1遺伝子の5'上流域は、例えば、ヒトp27Kip1
遺伝子の塩基配列（Polyak,K., Lee,M.-H., Erdjument-
Breomage,H., Koff,A., Roberts,J.M., Tempst,P. and
Massague,J. (1994) Cell 78: 59-66、Toyoshima,H. an
d Hunter,T. (1994) Cell 78: 67-74）若しくはその一
部、配列番号：１に記載の塩基配列若しくはその一部を
利用したヒトゲノミックライブラリーのスクリーニング
により単離することができる。なお、当業者であれば、
天然型のプロモーターDNAの塩基配列の一部を他の塩基
への置換や塩基の欠失、付加などの改変により、天然型
のプロモーターDNAと同等のプロモーター活性を有するD
NAを調製することが可能である。このように天然型の塩
基配列において塩基が置換、欠失、もしくは付加した塩
基配列を有し、天然型のプロモーターDNAと同等のプロ
モーター活性を有するDNAもまた本発明のプロモーターD
NAに含まれる。塩基の改変は、例えば、制限酵素あるい
はDNAエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的
変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたPC
R法によるプロモーター配列の改変、合成変異DNAの直接
導入などの方法により行うことができる。
プロモーターに関する。より具体的には、本発明は、ヒ
トp27Kip1遺伝子の上流に存在しプロモーター活性を有
するDNAに関する。本発明のプロモーターDNAは、ヒトp2
7Kip1遺伝子の5'上流域の塩基配列の少なくとも一部を
含む。プロモーター活性を有する限り、ヒトp27Kip1遺
伝子の5'上流域のいかなる塩基配列を含んでいてもよ
い。ヒトp27Kip1遺伝子の上流に存在しプロモーター活
性を有するDNAとしては、例えば、ヒトp27Kip1遺伝子の
5'上流-3568位から-12位の塩基配列からなるDNA、-1797
位から-12位の塩基配列からなるDNA、-774位から-12位
の塩基配列からなるDNAが挙げられる（ヒトp27Kip1遺伝
子の5'上流-3568位から-1位の塩基配列からなるDNAを配
列番号：１に示す）。一方、ヒトp27Kip1遺伝子の5'上
流域-435位から-12位の塩基配列からなるDNAは実質的に
プロモーター活性を有しない。-774位から-12位の塩基
配列からなるDNAがプロモーター活性を有するという事
実を考慮すると、ヒトp27Kip1遺伝子の5'上流域の-774
位から-436位の塩基配列にはプロモーター活性に必須の
領域が含まれると考えられる。従って、本発明のプロモ
ーターDNAは好ましくは、ヒトp27Kip1遺伝子の5'上流−
774位から−436位の塩基配列の少なくとも一部を含む。
ヒトp27Kip1遺伝子の5'上流域は、例えば、ヒトp27Kip1
遺伝子の塩基配列（Polyak,K., Lee,M.-H., Erdjument-
Breomage,H., Koff,A., Roberts,J.M., Tempst,P. and
Massague,J. (1994) Cell 78: 59-66、Toyoshima,H. an
d Hunter,T. (1994) Cell 78: 67-74）若しくはその一
部、配列番号：１に記載の塩基配列若しくはその一部を
利用したヒトゲノミックライブラリーのスクリーニング
により単離することができる。なお、当業者であれば、
天然型のプロモーターDNAの塩基配列の一部を他の塩基
への置換や塩基の欠失、付加などの改変により、天然型
のプロモーターDNAと同等のプロモーター活性を有するD
NAを調製することが可能である。このように天然型の塩
基配列において塩基が置換、欠失、もしくは付加した塩
基配列を有し、天然型のプロモーターDNAと同等のプロ
モーター活性を有するDNAもまた本発明のプロモーターD
NAに含まれる。塩基の改変は、例えば、制限酵素あるい
はDNAエキソヌクレアーゼによる欠失導入、部位特異的
変異誘発法による変異導入、変異プライマーを用いたPC
R法によるプロモーター配列の改変、合成変異DNAの直接
導入などの方法により行うことができる。
【００１１】本発明のプロモーターDNAは、例えば、そ
の生体内における変異に由来するp27Kip1タンパク質の
欠損あるいは発現異常症などの治療や予防に利用するこ
とが可能である。即ち、本発明のプロモーターDNA（例
えば、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNA）を
有するp27Kip1遺伝子を、レトロウイルス、アデノウイ
ルス、アデノ随伴ウイルスなどのベクターに挿入し、あ
るいはリポソームなどに封入して体細胞に導入すること
により、正常な制御の下にp27Kip1タンパク質を発現さ
せることができ、これによりp27Kip1タンパク質の欠損
あるいは発現異常症などの改善を図ることができる。
の生体内における変異に由来するp27Kip1タンパク質の
欠損あるいは発現異常症などの治療や予防に利用するこ
とが可能である。即ち、本発明のプロモーターDNA（例
えば、配列番号：１に記載の塩基配列からなるDNA）を
有するp27Kip1遺伝子を、レトロウイルス、アデノウイ
ルス、アデノ随伴ウイルスなどのベクターに挿入し、あ
るいはリポソームなどに封入して体細胞に導入すること
により、正常な制御の下にp27Kip1タンパク質を発現さ
せることができ、これによりp27Kip1タンパク質の欠損
あるいは発現異常症などの改善を図ることができる。
【００１２】また、本発明のプロモーターDNAがある特
異的な刺激により活性化されることが判明した場合、所
望の遺伝子の上流に本発明のDNAを挿入したベクターな
どを作製して体細胞に導入し、該刺激を付加することに
より、該所望の遺伝子を誘導的に発現させることができ
る。例えば、所望の遺伝子として殺細胞遺伝子を用いれ
ば、該特異的な刺激により、本発明のプロモーターDNA
が導入された細胞を選択的に死滅させることが可能であ
る。このような本発明のプロモーターDNAの利用は、殺
傷したい細胞が存在する幅広い疾患（例えば、癌など）
に適用可能である。
異的な刺激により活性化されることが判明した場合、所
望の遺伝子の上流に本発明のDNAを挿入したベクターな
どを作製して体細胞に導入し、該刺激を付加することに
より、該所望の遺伝子を誘導的に発現させることができ
る。例えば、所望の遺伝子として殺細胞遺伝子を用いれ
ば、該特異的な刺激により、本発明のプロモーターDNA
が導入された細胞を選択的に死滅させることが可能であ
る。このような本発明のプロモーターDNAの利用は、殺
傷したい細胞が存在する幅広い疾患（例えば、癌など）
に適用可能である。
【００１３】また、本発明は、上記本発明のプロモータ
ーDNAの配列の少なくとも一部を含むDNA（その誘導体を
含む）に関する。このようなDNAであれば、プロモータ
ー活性を有するか否かを問わず、本発明のプロモーター
DNAとこれに結合しうるタンパク質（例えば、転写因
子）との結合を拮抗阻害しうる。このため該DNAが、本
発明のプロモーターDNAのプロモーター活性を阻害する
タンパク質の結合部位である場合には、この方法により
プロモーター活性を促進することができ、逆にプロモー
ター活性を促進するタンパク質の結合部位である場合に
は、この方法によりプロモーター活性を阻害することが
できる。拮抗阻害に用いるDNAは、通常少なくとも6塩基
以上、好ましくは10塩基以上の鎖長を有する。拮抗阻害
に用いるDNAとしては、例えば、図１および図５に記載
の転写因子の結合コンセンサス部位を含む配列が挙げら
れる。p27タンパク質はサイクリン／cdkを阻害して細胞
増殖を停止させることが知られているため、本発明のプ
ロモーターDNAの活性の促進は、悪性腫瘍、動脈硬化、
あるいはバルーン冠動脈拡張手術後の血管内皮細胞増殖
による再狭窄などの細胞増殖性疾患の治療などに、一
方、本発明のプロモーターDNAの活性の阻害は、再生不
良性貧血、肝硬変、創傷治癒などの細胞増殖を必要とす
る疾患の治療などに有効である。
ーDNAの配列の少なくとも一部を含むDNA（その誘導体を
含む）に関する。このようなDNAであれば、プロモータ
ー活性を有するか否かを問わず、本発明のプロモーター
DNAとこれに結合しうるタンパク質（例えば、転写因
子）との結合を拮抗阻害しうる。このため該DNAが、本
発明のプロモーターDNAのプロモーター活性を阻害する
タンパク質の結合部位である場合には、この方法により
プロモーター活性を促進することができ、逆にプロモー
ター活性を促進するタンパク質の結合部位である場合に
は、この方法によりプロモーター活性を阻害することが
できる。拮抗阻害に用いるDNAは、通常少なくとも6塩基
以上、好ましくは10塩基以上の鎖長を有する。拮抗阻害
に用いるDNAとしては、例えば、図１および図５に記載
の転写因子の結合コンセンサス部位を含む配列が挙げら
れる。p27タンパク質はサイクリン／cdkを阻害して細胞
増殖を停止させることが知られているため、本発明のプ
ロモーターDNAの活性の促進は、悪性腫瘍、動脈硬化、
あるいはバルーン冠動脈拡張手術後の血管内皮細胞増殖
による再狭窄などの細胞増殖性疾患の治療などに、一
方、本発明のプロモーターDNAの活性の阻害は、再生不
良性貧血、肝硬変、創傷治癒などの細胞増殖を必要とす
る疾患の治療などに有効である。
【００１４】本発明のプロモーターDNAの活性の調節に
は、上記のような本発明のプロモーターDNAの部分配列
などを用いた拮抗阻害の他に、本発明のプロモーターDN
Aの活性を調節するタンパク質を利用する方法を用いる
こともできる。本発明のプロモーターDNAは、そのプロ
モーター活性を調節するタンパク質のスクリーニングに
利用することが可能である。従って、本発明は、また、
本発明のプロモーターDNAの活性を調節するタンパク質
のスクリーニング方法に関する。本発明のプロモーター
DNAの活性を調節するタンパク質としては、直接本発明
のプロモーターDNAに結合してその活性を促進あるいは
阻害するタンパク質の他に、細胞膜受容体や細胞内タン
パク質に作用して間接的に本発明のプロモーターDNAの
活性を促進あるいは阻害するタンパク質が含まれる。
は、上記のような本発明のプロモーターDNAの部分配列
などを用いた拮抗阻害の他に、本発明のプロモーターDN
Aの活性を調節するタンパク質を利用する方法を用いる
こともできる。本発明のプロモーターDNAは、そのプロ
モーター活性を調節するタンパク質のスクリーニングに
利用することが可能である。従って、本発明は、また、
本発明のプロモーターDNAの活性を調節するタンパク質
のスクリーニング方法に関する。本発明のプロモーター
DNAの活性を調節するタンパク質としては、直接本発明
のプロモーターDNAに結合してその活性を促進あるいは
阻害するタンパク質の他に、細胞膜受容体や細胞内タン
パク質に作用して間接的に本発明のプロモーターDNAの
活性を促進あるいは阻害するタンパク質が含まれる。
【００１５】このスクリーニング方法の一つの態様は、
本発明のDNAに被検タンパク質試料を接触させ、本発明
のDNAに結合するタンパク質を選択する工程を含む。こ
のような方法としては、例えば、本発明のプロモーター
DNAを用いた、これに結合するタンパク質のアフィニテ
ィー精製が挙げられる。具体的な方法の一例を示せば、
本発明のプロモーターDNAをビオチン化し、ストレプト
アビジンを結合した磁気ビーズに結合させてDNAアフィ
ニティービーズを作製する。次いで、これを細胞の核抽
出液とインキュベートして本発明のプロモーターDNAと
特異的に結合する核抽出液中のタンパク質を精製し、こ
の構造を決定する。これにより、直接本発明のプロモー
ターDNAと結合するタンパク質、およびDNA結合活性は持
たないがサブユニットとして該タンパク質と複合体を形
成し本発明のプロモーターDNAに結合するタンパク質が
精製できる（Gabrielsen O.S et al., (1989) Nucleic
acid Research 17: 6253-6267、Savoysky E et al., (1
994) Oncogene 9: 1839-1846）。
本発明のDNAに被検タンパク質試料を接触させ、本発明
のDNAに結合するタンパク質を選択する工程を含む。こ
のような方法としては、例えば、本発明のプロモーター
DNAを用いた、これに結合するタンパク質のアフィニテ
ィー精製が挙げられる。具体的な方法の一例を示せば、
本発明のプロモーターDNAをビオチン化し、ストレプト
アビジンを結合した磁気ビーズに結合させてDNAアフィ
ニティービーズを作製する。次いで、これを細胞の核抽
出液とインキュベートして本発明のプロモーターDNAと
特異的に結合する核抽出液中のタンパク質を精製し、こ
の構造を決定する。これにより、直接本発明のプロモー
ターDNAと結合するタンパク質、およびDNA結合活性は持
たないがサブユニットとして該タンパク質と複合体を形
成し本発明のプロモーターDNAに結合するタンパク質が
精製できる（Gabrielsen O.S et al., (1989) Nucleic
acid Research 17: 6253-6267、Savoysky E et al., (1
994) Oncogene 9: 1839-1846）。
【００１６】また、他の一つの態様は、本発明のDNAの
下流に連結されたレポーター遺伝子を保持する細胞に被
検DNAを導入し、レポーター遺伝子の発現を調節する発
現産物を選択する工程を含む。このような方法には、例
えば、酵母や動物細胞を用いたone-hybrid法が含まれ
る。具体的には、本発明のプロモーターDNAを挿入した
レポーター遺伝子を細胞に安定に導入し、次いでこれに
遺伝子ライブラリーを導入して、レポーター遺伝子の発
現促進あるいは発現阻害を示すようなクローンを選択
し、本発明のプロモーターDNAに結合するタンパク質を
選択する。この方法により、直接本発明のプロモーター
DNAと結合するタンパク質の他に、細胞内の内在性タン
パク質に作用して間接的に本発明のプロモーターDNAの
活性を調節するタンパク質を得ることができる。なお、
酵母のone-hybrid法（Li J.J. and Herskowitz I.(199
3) Science 262: 1870-1873、Wang M.M.and Reed R.R.
(1993)Nature 364: 121-126）などで、すでに「Matchma
ker system」(CLONTECH)等がキットとして発売されてい
る 。
下流に連結されたレポーター遺伝子を保持する細胞に被
検DNAを導入し、レポーター遺伝子の発現を調節する発
現産物を選択する工程を含む。このような方法には、例
えば、酵母や動物細胞を用いたone-hybrid法が含まれ
る。具体的には、本発明のプロモーターDNAを挿入した
レポーター遺伝子を細胞に安定に導入し、次いでこれに
遺伝子ライブラリーを導入して、レポーター遺伝子の発
現促進あるいは発現阻害を示すようなクローンを選択
し、本発明のプロモーターDNAに結合するタンパク質を
選択する。この方法により、直接本発明のプロモーター
DNAと結合するタンパク質の他に、細胞内の内在性タン
パク質に作用して間接的に本発明のプロモーターDNAの
活性を調節するタンパク質を得ることができる。なお、
酵母のone-hybrid法（Li J.J. and Herskowitz I.(199
3) Science 262: 1870-1873、Wang M.M.and Reed R.R.
(1993)Nature 364: 121-126）などで、すでに「Matchma
ker system」(CLONTECH)等がキットとして発売されてい
る 。
【００１７】さらに他の一つの態様は、本発明のプロモ
ーターDNAの下流に連結されたレポーター遺伝子を保持
する細胞に被検試料を接触させ、レポーター遺伝子の発
現を調節するタンパク質を選択する工程を含む。具体的
な方法の一例としては、本発明のプロモーターDNAを挿
入したレポーター遺伝子を安定に導入した細胞と、被検
試料（例えば、遺伝子ライブラリーを導入した細胞の培
養上清）とをインキュベートして、レポーター遺伝子の
発現促進あるいは発現阻害を示すようなタンパク質を選
択する。この方法では、細胞膜受容体などを介して間接
的に本発明のプロモーターDNAの活性に影響を与えるタ
ンパク質が得られる。
ーターDNAの下流に連結されたレポーター遺伝子を保持
する細胞に被検試料を接触させ、レポーター遺伝子の発
現を調節するタンパク質を選択する工程を含む。具体的
な方法の一例としては、本発明のプロモーターDNAを挿
入したレポーター遺伝子を安定に導入した細胞と、被検
試料（例えば、遺伝子ライブラリーを導入した細胞の培
養上清）とをインキュベートして、レポーター遺伝子の
発現促進あるいは発現阻害を示すようなタンパク質を選
択する。この方法では、細胞膜受容体などを介して間接
的に本発明のプロモーターDNAの活性に影響を与えるタ
ンパク質が得られる。
【００１８】また、本発明のDNAを用いて、そのプロモ
ーター活性を調節するタンパク質をコードするDNAを直
接単離することも可能である。本発明は、また、本発明
のDNAのプロモーター活性を調節するタンパク質をコー
ドするDNAのスクリーニング方法に関する。このスクリ
ーニング方法の一つの態様は、本発明のDNAに被検DNAの
発現産物を接触させ、本発明のDNAに結合する発現産物
をコードするDNAを選択する工程を含む。このような方
法には、例えば、サウスウエスタン法が含まれる。具体
的には、遺伝子ライブラリーを導入した大腸菌で各タン
パク質を発現させ、これらをフィルター膜に転写した
後、本発明のプロモーターDNAをプローブとして直接ブ
ロットし、該DNAプローブと結合するタンパク質を発現
するクローンを選択して、これをコードする遺伝子を単
離する。この方法により本発明のDNAに結合する活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子を得ることができ
る。
ーター活性を調節するタンパク質をコードするDNAを直
接単離することも可能である。本発明は、また、本発明
のDNAのプロモーター活性を調節するタンパク質をコー
ドするDNAのスクリーニング方法に関する。このスクリ
ーニング方法の一つの態様は、本発明のDNAに被検DNAの
発現産物を接触させ、本発明のDNAに結合する発現産物
をコードするDNAを選択する工程を含む。このような方
法には、例えば、サウスウエスタン法が含まれる。具体
的には、遺伝子ライブラリーを導入した大腸菌で各タン
パク質を発現させ、これらをフィルター膜に転写した
後、本発明のプロモーターDNAをプローブとして直接ブ
ロットし、該DNAプローブと結合するタンパク質を発現
するクローンを選択して、これをコードする遺伝子を単
離する。この方法により本発明のDNAに結合する活性を
有するタンパク質をコードする遺伝子を得ることができ
る。
【００１９】他の一つの態様は、本発明のDNAの下流に
連結されたレポーター遺伝子を保持する細胞に被検DNA
を導入し、レポーター遺伝子の発現を調節する発現産物
をコードするDNAを選択する工程を含む。このような方
法には、例えば、上記した酵母や動物細胞を用いたone-
hybrid法が含まれる。即ち、本発明のプロモーターDNA
を挿入したレポーター遺伝子を細胞に安定に導入し、次
いでこれに遺伝子ライブラリーを導入して、レポーター
遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなクロー
ンを選択し、本発明のプロモーターDNAに結合するタン
パク質をコードする遺伝子を選択する。この方法によ
り、直接本発明のプロモーターDNAと結合するタンパク
質をコードする遺伝子の他に、細胞内の内在性タンパク
質に作用して間接的に本発明のプロモーターDNAの活性
を調節するタンパク質をコードする遺伝子を得ることが
できる。
連結されたレポーター遺伝子を保持する細胞に被検DNA
を導入し、レポーター遺伝子の発現を調節する発現産物
をコードするDNAを選択する工程を含む。このような方
法には、例えば、上記した酵母や動物細胞を用いたone-
hybrid法が含まれる。即ち、本発明のプロモーターDNA
を挿入したレポーター遺伝子を細胞に安定に導入し、次
いでこれに遺伝子ライブラリーを導入して、レポーター
遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示すようなクロー
ンを選択し、本発明のプロモーターDNAに結合するタン
パク質をコードする遺伝子を選択する。この方法によ
り、直接本発明のプロモーターDNAと結合するタンパク
質をコードする遺伝子の他に、細胞内の内在性タンパク
質に作用して間接的に本発明のプロモーターDNAの活性
を調節するタンパク質をコードする遺伝子を得ることが
できる。
【００２０】さらに他の一つの態様は、本発明のDNAの
下流に連結されたレポーター遺伝子を保持する細胞に被
検DNAの発現産物を接触させ、レポーター遺伝子の発現
を調節する発現産物をコードするDNAを選択する工程を
含む。具体的な方法の一例を示せば、本発明のプロモー
ターDNAを挿入したレポーター遺伝子を安定にに導入し
た細胞と、被検タンパク質（例えば、遺伝子ライブラリ
ーを導入した細胞の培養上清）とをインキュベートし
て、レポーター遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示
すようなタンパク質あるいはこれをコードする遺伝子を
単離する。この方法により細胞膜受容体などを介して間
接的に本発明のプロモーターDNAの活性に作用するタン
パク質をコードする遺伝子を得ることができる。
下流に連結されたレポーター遺伝子を保持する細胞に被
検DNAの発現産物を接触させ、レポーター遺伝子の発現
を調節する発現産物をコードするDNAを選択する工程を
含む。具体的な方法の一例を示せば、本発明のプロモー
ターDNAを挿入したレポーター遺伝子を安定にに導入し
た細胞と、被検タンパク質（例えば、遺伝子ライブラリ
ーを導入した細胞の培養上清）とをインキュベートし
て、レポーター遺伝子の発現促進あるいは発現阻害を示
すようなタンパク質あるいはこれをコードする遺伝子を
単離する。この方法により細胞膜受容体などを介して間
接的に本発明のプロモーターDNAの活性に作用するタン
パク質をコードする遺伝子を得ることができる。
【００２１】また、本発明のプロモーターDNAを用いれ
ば、その活性を調節するタンパク質や該タンパク質をコ
ードする遺伝子の他、例えば、その活性を調節する合成
化合物のスクリーニングを行うことも可能である。本発
明は、また、本発明のプロモーターDNAのプロモーター
活性を調節する化合物のスクリーニング方法に関する。
このスクリーニング方法の一つの態様は、被検化合物の
存在下で本発明のプロモーターDNAと被検試料とを接触
させ、本発明のプロモーターDNAと被検試料中のタンパ
ク質との結合を促進または阻害する化合物を選択する工
程を含む。例えば、細胞の核抽出液を、アイソトープな
どにより標識した本発明のプロモーターDNAプローブと
結合させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、核
抽出液中のタンパク質と本発明のプロモーターDNAとの
複合体のバンドをゲルシフト法により検出する。DNAプ
ローブ添加の際、被検化合物も添加し、核抽出液中のタ
ンパク質と本発明のプロモーターDNAとの複合体のバン
ドの形成を促進あるいは阻害する化合物を選択する。こ
の方法では、直接本発明のプロモーターDNAに作用する
化合物および本発明のプロモーターDNAに結合するタン
パク質に作用する化合物が得られる。例えば、本発明の
プロモーターDNAに結合するタンパク質が生体内で本発
明のプロモーターDNAの活性を阻害するような場合、こ
のタンパク質と本発明のプロモーターDNAとの結合を阻
害するような化合物は、本発明のプロモーターDNAの活
性を促進できると考えられる。なお、本発明のプロモー
ターDNAに結合するタンパク質が既に単離されていれ
ば、細胞の核抽出液に代えて、該タンパク質の組み換え
タンパク質を利用することも可能である。
ば、その活性を調節するタンパク質や該タンパク質をコ
ードする遺伝子の他、例えば、その活性を調節する合成
化合物のスクリーニングを行うことも可能である。本発
明は、また、本発明のプロモーターDNAのプロモーター
活性を調節する化合物のスクリーニング方法に関する。
このスクリーニング方法の一つの態様は、被検化合物の
存在下で本発明のプロモーターDNAと被検試料とを接触
させ、本発明のプロモーターDNAと被検試料中のタンパ
ク質との結合を促進または阻害する化合物を選択する工
程を含む。例えば、細胞の核抽出液を、アイソトープな
どにより標識した本発明のプロモーターDNAプローブと
結合させ、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により、核
抽出液中のタンパク質と本発明のプロモーターDNAとの
複合体のバンドをゲルシフト法により検出する。DNAプ
ローブ添加の際、被検化合物も添加し、核抽出液中のタ
ンパク質と本発明のプロモーターDNAとの複合体のバン
ドの形成を促進あるいは阻害する化合物を選択する。こ
の方法では、直接本発明のプロモーターDNAに作用する
化合物および本発明のプロモーターDNAに結合するタン
パク質に作用する化合物が得られる。例えば、本発明の
プロモーターDNAに結合するタンパク質が生体内で本発
明のプロモーターDNAの活性を阻害するような場合、こ
のタンパク質と本発明のプロモーターDNAとの結合を阻
害するような化合物は、本発明のプロモーターDNAの活
性を促進できると考えられる。なお、本発明のプロモー
ターDNAに結合するタンパク質が既に単離されていれ
ば、細胞の核抽出液に代えて、該タンパク質の組み換え
タンパク質を利用することも可能である。
【００２２】また他の一つの態様は、本発明のプロモー
ターDNAの下流に連結されたレポーター遺伝子を保持す
る細胞に被検化合物を接触させ、レポーター遺伝子の発
現を調節する化合物を選択する工程を含む。例えば、本
発明のプロモーターDNAを上流に挿入したルシフェラー
ゼ遺伝子ベクターを細胞に導入して本発明のプロモータ
ーDNA依存性の安定にルシフェラーゼ活性を発現する細
胞を作製し、この細胞と被検化合物を培養液中でインキ
ュベートする。ルシフェラーゼ活性を指標に本発明のプ
ロモーターDNAのプロモーター活性を測定し、これを促
進あるいは阻害する化合物を選択する。この方法では、
直接、間接的に本発明のプロモーターDNAの活性を調節
する化合物が得られる。
ターDNAの下流に連結されたレポーター遺伝子を保持す
る細胞に被検化合物を接触させ、レポーター遺伝子の発
現を調節する化合物を選択する工程を含む。例えば、本
発明のプロモーターDNAを上流に挿入したルシフェラー
ゼ遺伝子ベクターを細胞に導入して本発明のプロモータ
ーDNA依存性の安定にルシフェラーゼ活性を発現する細
胞を作製し、この細胞と被検化合物を培養液中でインキ
ュベートする。ルシフェラーゼ活性を指標に本発明のプ
ロモーターDNAのプロモーター活性を測定し、これを促
進あるいは阻害する化合物を選択する。この方法では、
直接、間接的に本発明のプロモーターDNAの活性を調節
する化合物が得られる。
【００２３】なお、本発明のプロモーターDNAの活性を
調節するタンパク質が既に得られている場合には、被検
化合物の存在下で該タンパク質（またはその誘導体）と
本発明のプロモーターDNAとを接触させ、該タンパク質
（またはその誘導体）と本発明のプロモーターDNAとの
結合を促進または阻害する化合物を選択して、本発明の
プロモーターDNAの活性を調節する化合物をスクリーニ
ングすることが可能である。具体的には、例えば、グル
タチオンＳ−トランスフェラーゼを融合した本発明のプ
ロモーターDNAに結合するタンパク質（DNA結合ドメイン
のみでもよい）を精製して、抗グルタチオンＳ−トラン
スフェラーゼ抗体で覆ったマイクロプレートに結合させ
た後、ビチオン化した本発明のプロモーターDNAをこの
タンパク質と接触させ、該タンパク質と本発明プロモー
ターDNAとの結合をストレプトアビジン化アルカリフォ
スファターゼで検出する。本発明のプロモーターDNA添
加の際、被検化合物も添加し、該タンパク質と本発明の
プロモーターDNAとの結合を促進あるいは阻害する化合
物を選択する。この方法では、直接本発明のプロモータ
ーDNAに作用する化合物および本発明のプロモーターに
結合するタンパク質に作用する化合物が得られる。例え
ば、本発明のプロモーターDNAに結合するタンパク質が
生体内で本発明のプロモーターDNAの活性を阻害する場
合、このタンパク質と本発明のプロモーターDNAとの結
合を阻害するような化合物は本発明のプロモーターDNA
の活性を促進できると考えられる。
調節するタンパク質が既に得られている場合には、被検
化合物の存在下で該タンパク質（またはその誘導体）と
本発明のプロモーターDNAとを接触させ、該タンパク質
（またはその誘導体）と本発明のプロモーターDNAとの
結合を促進または阻害する化合物を選択して、本発明の
プロモーターDNAの活性を調節する化合物をスクリーニ
ングすることが可能である。具体的には、例えば、グル
タチオンＳ−トランスフェラーゼを融合した本発明のプ
ロモーターDNAに結合するタンパク質（DNA結合ドメイン
のみでもよい）を精製して、抗グルタチオンＳ−トラン
スフェラーゼ抗体で覆ったマイクロプレートに結合させ
た後、ビチオン化した本発明のプロモーターDNAをこの
タンパク質と接触させ、該タンパク質と本発明プロモー
ターDNAとの結合をストレプトアビジン化アルカリフォ
スファターゼで検出する。本発明のプロモーターDNA添
加の際、被検化合物も添加し、該タンパク質と本発明の
プロモーターDNAとの結合を促進あるいは阻害する化合
物を選択する。この方法では、直接本発明のプロモータ
ーDNAに作用する化合物および本発明のプロモーターに
結合するタンパク質に作用する化合物が得られる。例え
ば、本発明のプロモーターDNAに結合するタンパク質が
生体内で本発明のプロモーターDNAの活性を阻害する場
合、このタンパク質と本発明のプロモーターDNAとの結
合を阻害するような化合物は本発明のプロモーターDNA
の活性を促進できると考えられる。
【００２４】なお、DNAメチル化酵素などにより本発明
のプロモーターDNA自身が修飾されて活性が制御されて
いるような場合、本発明のプロモーターDNAは、この酵
素活性を促進あるいは阻害する化合物をスクリーニング
に利用しうる。例えば、DNAメチル化酵素においては、
本発明のプロモーターDNAへのメチル基の取り込みをア
イソトープを用いて測定し、この際、被検体である化合
物を同時に添加し、メチル基の取り込みを促進あるいは
阻害する化合物を選択してスクリーニングすることがで
きる。
のプロモーターDNA自身が修飾されて活性が制御されて
いるような場合、本発明のプロモーターDNAは、この酵
素活性を促進あるいは阻害する化合物をスクリーニング
に利用しうる。例えば、DNAメチル化酵素においては、
本発明のプロモーターDNAへのメチル基の取り込みをア
イソトープを用いて測定し、この際、被検体である化合
物を同時に添加し、メチル基の取り込みを促進あるいは
阻害する化合物を選択してスクリーニングすることがで
きる。
【００２５】上記化合物のスクリーニングにより単離し
た化合物が低分子化合物である場合には、遺伝子を用い
た治療における遺伝子導入の効率の低さやベクターの安
全性などの問題を考慮しなくともよい点で有利である。
また、p53、Rb、p16などのように、悪性腫瘍などでタン
パク質自身が欠失または失活している場合には、これら
の活性を補うためには正常遺伝子を遺伝子導入する必要
があり、プロモーターを活性化しても実効がない。この
点、p27Kip1は悪性腫瘍などにおいてはタンパク質自身
の変異による失活例が少なくその発現のみが低下してい
ることから、多くの場合、本発明のプロモーターDNAの
活性を促進する化合物の投与によってプロモーターを活
性化することで、細胞内には正常なp27Kip1タンパク質
が発現し、サイクリン／cdkを阻害して細胞増殖を停止
することができると考えられる。そしてこれにより実効
性のある悪性腫瘍の治療などが可能となると考えられ
る。
た化合物が低分子化合物である場合には、遺伝子を用い
た治療における遺伝子導入の効率の低さやベクターの安
全性などの問題を考慮しなくともよい点で有利である。
また、p53、Rb、p16などのように、悪性腫瘍などでタン
パク質自身が欠失または失活している場合には、これら
の活性を補うためには正常遺伝子を遺伝子導入する必要
があり、プロモーターを活性化しても実効がない。この
点、p27Kip1は悪性腫瘍などにおいてはタンパク質自身
の変異による失活例が少なくその発現のみが低下してい
ることから、多くの場合、本発明のプロモーターDNAの
活性を促進する化合物の投与によってプロモーターを活
性化することで、細胞内には正常なp27Kip1タンパク質
が発現し、サイクリン／cdkを阻害して細胞増殖を停止
することができると考えられる。そしてこれにより実効
性のある悪性腫瘍の治療などが可能となると考えられ
る。
【００２６】以下、本発明を実施例により具体的に説明
するが本発明はこれら実施例に制限されるものではな
い。
するが本発明はこれら実施例に制限されるものではな
い。
【００２７】
【実施例】[実施例１] 細胞の培養 ヒト骨肉腫細胞系Saos2及びU2OS（それぞれ、京都大学
の高橋玲博士、京都府立大学の原英二博士から入手）な
らびにヒト頚部癌細胞系C33A（米国メリーランド州ロッ
クビル、アメリカンタイプカルチャーコレクションから
購入）を10%ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグ
ル培地中で維持し、5%のCO2を含む湿潤大気中で37℃で
インキュベートした。U20S細胞内では、p53遺伝子及びR
B遺伝子は変異していないが（Huang,H.-J.S, Yee,J.-
K., Shew,J.-Y., Chen,P.-L., Bookstein,R., Friedman
n,T., Lee,E.Y.-H.P. and Lee,W.-H. (1988) Science 2
42:1563-1566）、Saos2細胞（Huang,H.-J.S, Yee,J.-
K., Shew,J.-Y., Chen,P.-L., Bookstein,R., Friedman
n,T., Lee,E.Y.-H.P. and Lee,W.-H. (1988) Science24
2: 1563-1566、Chen,P.-L., Chen,Y., Bookstein,R. an
d Lee,W.-H. (1990)Science 250: 1576-1580）及びC33A
細胞内（Scheffner,M., Munger,K., Byrne J.C. and Ho
wley P.M. (1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88: 5523-5
527）ではp53遺伝子及びRB遺伝子は、共に変異してい
る。
の高橋玲博士、京都府立大学の原英二博士から入手）な
らびにヒト頚部癌細胞系C33A（米国メリーランド州ロッ
クビル、アメリカンタイプカルチャーコレクションから
購入）を10%ウシ胎児血清を含むダルベッコ改変イーグ
ル培地中で維持し、5%のCO2を含む湿潤大気中で37℃で
インキュベートした。U20S細胞内では、p53遺伝子及びR
B遺伝子は変異していないが（Huang,H.-J.S, Yee,J.-
K., Shew,J.-Y., Chen,P.-L., Bookstein,R., Friedman
n,T., Lee,E.Y.-H.P. and Lee,W.-H. (1988) Science 2
42:1563-1566）、Saos2細胞（Huang,H.-J.S, Yee,J.-
K., Shew,J.-Y., Chen,P.-L., Bookstein,R., Friedman
n,T., Lee,E.Y.-H.P. and Lee,W.-H. (1988) Science24
2: 1563-1566、Chen,P.-L., Chen,Y., Bookstein,R. an
d Lee,W.-H. (1990)Science 250: 1576-1580）及びC33A
細胞内（Scheffner,M., Munger,K., Byrne J.C. and Ho
wley P.M. (1991) Proc.Natl.Acad.Sci.USA.88: 5523-5
527）ではp53遺伝子及びRB遺伝子は、共に変異してい
る。
【００２８】[実施例２] ヒトp27Kip1プロモーター断
片のクローニング プラスミドpBluescript SK-p27FL(米国、Memorial Sloa
n-Kettering Canser CenterのJ.Massague博士から入手)
に挿入したヒトp27Kip1cDNAから、EcoRI及びPstIで処理
することによって、エキソン1を含むヒトp27Kip1cDNAの
一部を得て、ヒト白血球ゲノミックライブラリーをスク
リーニングするためのプローブとして用いた。5'領域を
含むヒトp27Kip1遺伝子のゲノミックDNA断片を得るため
に、このプローブを用いて、EMBL3 SP6/T7ファージベク
ター（米国カリフォルニア州、Palo Alto、Clontech）
中のおよそ106 ファージプラークのヒト白血球ゲノムラ
イブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーシ
ョンは5xSSC，50%ホルムアルデヒド，1%SDS，5xデンハ
ルト溶液，変性させ超音波処理した魚の精子DNA.1μg/
μlを含む緩衝溶液中で42℃で16時間以上行った。１つ
の陽性のファージプラークを増幅し、そのDNAを精製し
た。ゲノミックDNA断片はいくつかの制限酵素で処理
し、サザンブロッティングにより分析した。
片のクローニング プラスミドpBluescript SK-p27FL(米国、Memorial Sloa
n-Kettering Canser CenterのJ.Massague博士から入手)
に挿入したヒトp27Kip1cDNAから、EcoRI及びPstIで処理
することによって、エキソン1を含むヒトp27Kip1cDNAの
一部を得て、ヒト白血球ゲノミックライブラリーをスク
リーニングするためのプローブとして用いた。5'領域を
含むヒトp27Kip1遺伝子のゲノミックDNA断片を得るため
に、このプローブを用いて、EMBL3 SP6/T7ファージベク
ター（米国カリフォルニア州、Palo Alto、Clontech）
中のおよそ106 ファージプラークのヒト白血球ゲノムラ
イブラリーをスクリーニングした。ハイブリダイゼーシ
ョンは5xSSC，50%ホルムアルデヒド，1%SDS，5xデンハ
ルト溶液，変性させ超音波処理した魚の精子DNA.1μg/
μlを含む緩衝溶液中で42℃で16時間以上行った。１つ
の陽性のファージプラークを増幅し、そのDNAを精製し
た。ゲノミックDNA断片はいくつかの制限酵素で処理
し、サザンブロッティングにより分析した。
【００２９】[実施例３] ヒトp27Kip1プロモーター
の配列分析 陽性ファージDNA由来のほぼ4.8kbのXhol断片をpBluescr
ipt SK+(米国カリフォルニア州,La Jolla)内にサブクロ
ーンニングし、その配列を決定した。この断片には、5'
隣接領域、第1エキソン及び第1イントロンが含まれてい
た。ゲノミックDNA断片の5'非翻訳領域の配列は、ヒトp
27Kip1cDNAプローブの配列と同一であった。プロモータ
ー領域内の調節因子の候補を、GENETYXソフトウェア（S
oftwareDevelopment Co, Tokyo, Japan）を用いてコン
ピューター検索することにより、p27Kip1遺伝子発現を
転写の段階で調節する、Sp1、PEA3、CTF、Myb、PEBP2、
AP2、NFκB、及びATFのような複数の転写因子結合部位
が存在することが明らかとなった（図1）。なお、転写
開始部位の周辺の領域を分析したが、TATAボックスの存
在は見出されなかった。
の配列分析 陽性ファージDNA由来のほぼ4.8kbのXhol断片をpBluescr
ipt SK+(米国カリフォルニア州,La Jolla)内にサブクロ
ーンニングし、その配列を決定した。この断片には、5'
隣接領域、第1エキソン及び第1イントロンが含まれてい
た。ゲノミックDNA断片の5'非翻訳領域の配列は、ヒトp
27Kip1cDNAプローブの配列と同一であった。プロモータ
ー領域内の調節因子の候補を、GENETYXソフトウェア（S
oftwareDevelopment Co, Tokyo, Japan）を用いてコン
ピューター検索することにより、p27Kip1遺伝子発現を
転写の段階で調節する、Sp1、PEA3、CTF、Myb、PEBP2、
AP2、NFκB、及びATFのような複数の転写因子結合部位
が存在することが明らかとなった（図1）。なお、転写
開始部位の周辺の領域を分析したが、TATAボックスの存
在は見出されなかった。
【００３０】[実施例４] ヒトp27Kip1プロモーターの
転写開始部位 転写開始部位を決定するために、2種類の20bpオリゴヌ
クレオチド、すなわち−120位から−101位の領域に相補
的な0-128(5'CCCAGCGACTGCCCTCGGAG-3'／配列番号：２)
及び−108位から−89位の領域に相補的な0-234(5'-CCCT
CTCGGAAGCCCAGCGA3'／配列番号：３)を、［γ-P32］ATP
及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ(日本，大阪，Toyobo)
を用いて末端標識した。この伸長プライマーを、ヒト骨
肉腫のMG63細胞及びSaos2細胞から単離した全RNA20μｇ
と42℃でハイブリダイズさせた。アニールしたプライマ
ーは、200ユニットのSuperscriptII逆転写酵素（米国メ
リーランド州、Gaithersburg、Gibco BRL）を用いて、4
2℃で50分間伸長させた。得られた産物は、同伸長プラ
イマーを用いて作製された配列決定反応と平行して、6%
ポリアクリルアミド未変性ゲル上で分析した。2つのプ
ライマーは、これらの2つの細胞系由来のmRNAにおい
て、再現性をもって、翻訳開始部位から−153位の同じG
残基まで伸長した（図２）。本発明者らは、その部位を
主要な転写開始部位であると推定した。なお、上流の領
域の、−225位及び−247位に、さらに2つの転写開始部
位が存在する可能性がある。
転写開始部位 転写開始部位を決定するために、2種類の20bpオリゴヌ
クレオチド、すなわち−120位から−101位の領域に相補
的な0-128(5'CCCAGCGACTGCCCTCGGAG-3'／配列番号：２)
及び−108位から−89位の領域に相補的な0-234(5'-CCCT
CTCGGAAGCCCAGCGA3'／配列番号：３)を、［γ-P32］ATP
及びT4ポリヌクレオチドキナーゼ(日本，大阪，Toyobo)
を用いて末端標識した。この伸長プライマーを、ヒト骨
肉腫のMG63細胞及びSaos2細胞から単離した全RNA20μｇ
と42℃でハイブリダイズさせた。アニールしたプライマ
ーは、200ユニットのSuperscriptII逆転写酵素（米国メ
リーランド州、Gaithersburg、Gibco BRL）を用いて、4
2℃で50分間伸長させた。得られた産物は、同伸長プラ
イマーを用いて作製された配列決定反応と平行して、6%
ポリアクリルアミド未変性ゲル上で分析した。2つのプ
ライマーは、これらの2つの細胞系由来のmRNAにおい
て、再現性をもって、翻訳開始部位から−153位の同じG
残基まで伸長した（図２）。本発明者らは、その部位を
主要な転写開始部位であると推定した。なお、上流の領
域の、−225位及び−247位に、さらに2つの転写開始部
位が存在する可能性がある。
【００３１】[実施例５] ヒトp27Kip1プロモーターの
プロモーター活性及び欠失分析 ヒトp27Kip1遺伝子の翻訳開始部位から−3568位と−12
位との間のほぼ3.5kbの断片をルシフェラーゼレポータ
ープラスミドpGVB2(日本，東京，Nippon Gene)内にサブ
クローニングした。このヒトp27Kip1−ルシフェラーゼ
融合プラスミドを「p27PF」と名付けた。「p27PF」の欠
失変異体を作製するために、「p27PF」をKpnI, ApaI, S
acII及び BssHIIで別々に処理した。これらの酵素部位
はクレノウあるいはT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し
た後、自己ライゲーションした。これらのプラスミド
を、それぞれ「p27KpnI」, 「p27ApaI」, 「p27SacI
I」， 「p27BssHII」と名付けた。「p27MB-435」と名付
けられたもう１つの欠失変異体は、「Kilo-sequance De
letion Kit」(日本，東京，Takara )のマングビーンズ-
エキソヌクレアーゼIIIシステムを用いて作製した。作
製された一連の構築体（図3）の全てを、配列決定によ
って確認した。なお、配列は、「USB sequenase versio
n 2.0 DNA sequencing kit」(英国、Buckinghamshire、
Amersham)を用いたジデオキシヌクレオチド鎖末端法に
よって決定した。配列決定に用いたプライマーは、T3,T
7及びゲノミックDNA配列由来の合成オリゴヌクレオチド
である。
プロモーター活性及び欠失分析 ヒトp27Kip1遺伝子の翻訳開始部位から−3568位と−12
位との間のほぼ3.5kbの断片をルシフェラーゼレポータ
ープラスミドpGVB2(日本，東京，Nippon Gene)内にサブ
クローニングした。このヒトp27Kip1−ルシフェラーゼ
融合プラスミドを「p27PF」と名付けた。「p27PF」の欠
失変異体を作製するために、「p27PF」をKpnI, ApaI, S
acII及び BssHIIで別々に処理した。これらの酵素部位
はクレノウあるいはT4 DNAポリメラーゼで平滑末端化し
た後、自己ライゲーションした。これらのプラスミド
を、それぞれ「p27KpnI」, 「p27ApaI」, 「p27SacI
I」， 「p27BssHII」と名付けた。「p27MB-435」と名付
けられたもう１つの欠失変異体は、「Kilo-sequance De
letion Kit」(日本，東京，Takara )のマングビーンズ-
エキソヌクレアーゼIIIシステムを用いて作製した。作
製された一連の構築体（図3）の全てを、配列決定によ
って確認した。なお、配列は、「USB sequenase versio
n 2.0 DNA sequencing kit」(英国、Buckinghamshire、
Amersham)を用いたジデオキシヌクレオチド鎖末端法に
よって決定した。配列決定に用いたプライマーは、T3,T
7及びゲノミックDNA配列由来の合成オリゴヌクレオチド
である。
【００３２】次いで、一連の5'欠失構築体を、C33A細胞
及びSaos2細胞へと一時的に遺伝子導入した。具体的に
は、C33A細胞(5x105細胞)及びU2OS細胞(3x105細胞)を直
径6cmの組織培養皿に播種し、24時間後に、2μgのプラ
スミド及びラウス肉腫ウィルスプローモーターによって
調節されている（形質転換効率を正常化するため）β−
ガラクトシダーゼ遺伝子を含む1μgのRSVβ-galを、リ
ン酸カルシウム共沈殿法（Sambrook, J., Fritsch, E.
F. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A la
boratory manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Labor
atory, Cold Spring Harbor, NY）を用いて細胞にコト
ランスフェクトした。48時間後にルシフェラーゼ活性を
測定した結果、全長ヒトp27Kip1プロモーター構築体「p
27PF」と、欠失構築体「p27KpnI」及び「p27ApaI」との
間に、プロモーター活性に有意な差異は存在しなかっ
た。しかし、C33A細胞及びSaos2細胞（図4a、b）、なら
びにU2OS細胞（データは示していない）において、p27M
B-435構築体のプロモーター活性は、p27ApaI構築体と比
較しておよそ15倍から20倍、顕著に減少した。このプロ
モーター活性の減少は、p27Kip1プロモーター活性にと
って必須な転写因子結合部位またはエンハンサー部位が
この領域に存在することを示している。なお、各細胞溶
解物のルシフェラーゼ活性は文献「Brasier, A. R., Ta
te, J. E. and Habener, J. F. (1989) Biotechniques
7, 1116-1122」に記載の方法に従って測定し、細胞溶解
物中のβ−ガラクトシダーゼ活性によって標準化した。
すべての形質転換アッセイは、3回ずつ行った。それぞ
れの実験は少なくとも2回繰り返した。
及びSaos2細胞へと一時的に遺伝子導入した。具体的に
は、C33A細胞(5x105細胞)及びU2OS細胞(3x105細胞)を直
径6cmの組織培養皿に播種し、24時間後に、2μgのプラ
スミド及びラウス肉腫ウィルスプローモーターによって
調節されている（形質転換効率を正常化するため）β−
ガラクトシダーゼ遺伝子を含む1μgのRSVβ-galを、リ
ン酸カルシウム共沈殿法（Sambrook, J., Fritsch, E.
F. and Maniatis, T. (1989) Molecular cloning: A la
boratory manual, 2nd Ed. (Cold Spring Harbor Labor
atory, Cold Spring Harbor, NY）を用いて細胞にコト
ランスフェクトした。48時間後にルシフェラーゼ活性を
測定した結果、全長ヒトp27Kip1プロモーター構築体「p
27PF」と、欠失構築体「p27KpnI」及び「p27ApaI」との
間に、プロモーター活性に有意な差異は存在しなかっ
た。しかし、C33A細胞及びSaos2細胞（図4a、b）、なら
びにU2OS細胞（データは示していない）において、p27M
B-435構築体のプロモーター活性は、p27ApaI構築体と比
較しておよそ15倍から20倍、顕著に減少した。このプロ
モーター活性の減少は、p27Kip1プロモーター活性にと
って必須な転写因子結合部位またはエンハンサー部位が
この領域に存在することを示している。なお、各細胞溶
解物のルシフェラーゼ活性は文献「Brasier, A. R., Ta
te, J. E. and Habener, J. F. (1989) Biotechniques
7, 1116-1122」に記載の方法に従って測定し、細胞溶解
物中のβ−ガラクトシダーゼ活性によって標準化した。
すべての形質転換アッセイは、3回ずつ行った。それぞ
れの実験は少なくとも2回繰り返した。
【００３３】[実施例６] ヒトとマウスのp27Kip1プロ
モーター配列の比較 GENETYXソフトウェアを用いたコンピューター解析によ
る、ヒトとマウスのp27Kip1プロモーター配列の比較に
より、ヒトp27Kip1プロモーターの配列は、マウスp27
Kip1プロモーターと相同性が高いことが示された（図
5）（Kwon,T.K., Nagel,J.E., BuchhoIz,M.A. and Nord
in,A.A. (1996) Gene 180: 113-120）。基本的なプロモ
ーター活性のための領域を含む、−774位と−435位との
間の領域の配列は（図4a、b）、マウスの配列と85％一
致した。このことから、コンセンサスな必須の転写因子
がこの領域に作用する可能性が示されている。この領域
における推定転写因子結合部位は、3つのコンセンサスS
p1部位、AP2部位、2つのCTF部位、及びATF部位である
（図5）。これらのうち、2つのCTF部位及びATF部位が保
存されているが、他の未知の保存部位が基本的なp27
Kip1プロモーター活性に重要であるという可能性もあ
る。
モーター配列の比較 GENETYXソフトウェアを用いたコンピューター解析によ
る、ヒトとマウスのp27Kip1プロモーター配列の比較に
より、ヒトp27Kip1プロモーターの配列は、マウスp27
Kip1プロモーターと相同性が高いことが示された（図
5）（Kwon,T.K., Nagel,J.E., BuchhoIz,M.A. and Nord
in,A.A. (1996) Gene 180: 113-120）。基本的なプロモ
ーター活性のための領域を含む、−774位と−435位との
間の領域の配列は（図4a、b）、マウスの配列と85％一
致した。このことから、コンセンサスな必須の転写因子
がこの領域に作用する可能性が示されている。この領域
における推定転写因子結合部位は、3つのコンセンサスS
p1部位、AP2部位、2つのCTF部位、及びATF部位である
（図5）。これらのうち、2つのCTF部位及びATF部位が保
存されているが、他の未知の保存部位が基本的なp27
Kip1プロモーター活性に重要であるという可能性もあ
る。
【００３４】
【発明の効果】本発明によりヒトp27Kip1遺伝子のプロ
モーターが提供された。これにより該プロモーターを利
用した遺伝子治療が可能となるとともに、該プロモータ
ーの活性を調節し、p27タンパク質の発現を制御するタ
ンパク質や薬剤のスクリーニングが可能となった。
モーターが提供された。これにより該プロモーターを利
用した遺伝子治療が可能となるとともに、該プロモータ
ーの活性を調節し、p27タンパク質の発現を制御するタ
ンパク質や薬剤のスクリーニングが可能となった。
【００３５】
（１）出願人氏名又は名称： 株式会社中外分子医学研
究所 （２）発明の名称： ヒトｐ２７Ｋｉｐ１遺伝子のプロ
モーター （３）整理番号： Ｃ２−９０７ （４）出願番号： （５）出願日： （６）配列の数：３ 配列番号 : 1 配列の長さ : 3568 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号 : promoter 存在位置 : 1 .. 3568 特徴を決定した方法 : E 配 列 CTCGAGGAAG GACTGAAACT GTGTGCTTGC GGTGGGAGGG GCAGCTGGGC AAGGAACCGT 60 GAACCTTCGC AGAAACATTT GGGGCTGCAG AACTTGGGTG AGAGCGCTGC ATCTGGGAGC 120 TGGCGACGCT GGCGGCTTGC TCATTCACCC CATCTGAACA CTTGTCTATG ACACAGGTGT 180 TTTCTCTTAA GTTATTTTGG TCTTTGCCTC TCTCCTCAGG TTGTGAAGAT TACAGAAATC 240 TGGGATGGCT TATGGGACGC TTCTCAGCCC TAAGTAGGAA AACAGCAGTG AAAATGGCAA 300 CCAAAACATC ACGCAGGACT GGGGGTTTTG GGGAAACAGC TCACTTTAGA GCAGTGCAGT 360 GTAGAGCTTT CCGTCTTCTA CCAGGGTCCA CCTTTAACAC TGTTTATCTG AAAATTTTCC 420 CCCTGGCTTA CTCGCTTGCA GCTGCCCACT TTGCAGAAGG ATGGCGCTCT GATCTCTACG 480 CTCCCTGTTC CTTCAGGGAC TCCATAGTAT TTTTTTTCAC GCGTCGTCGC TACTACAGCA 540 GACGCCTGCG TTCTCATTAT TTGCTGTACA GATCTCCGGT GCCTTGACTG TAAACAAAAC 600 ACTTTAGATC ATTGTGAGGT CGATGTAAGC ACAGCCTTTC TGCTGGCAGC CAGACTTCTT 660 AAGGTGGTGT GACTGTGACT TGCTTACTTT TCGAGATCAA CAACAACAAA GCGACAAAAT 720 GGTGCTCCTA CATATTAGTT GAAAGATTCA GCATGTGAAG GGGATCGAAG TGTTTATTTT 780 CCACTTCCAT ATAAGACATG AATTCCATGA GTAAAATCAA CTTCTGTGGC AAGGTGAACT 840 ACTCTAGAAT GTCTCCATTT ACATACATGT GGTAGTTTGG ATGTTTATGC ATATGGATAG 900 ATGCACATAT ATAGAGTTCC TGTGTTGTCT AGCAATTGTT TTAAAATTTG GACAATTATC 960 TAATTTCTAG GGTAAGGTAT AAATTATGGT AGGGAGGCCT ACCCTAATTT TCCTGTTCCT 1020 TTTCCCCCAG TCTGCAGTCC AATAAATTGA CAGCCTTAAA AGTAGAAAAA CTAAAGAGGA 1080 TGAGACCTCT TGCTTGATCC TAGGTGAATT CTTTTCTGTC AGTTAGGTAG GAAGTCCTGA 1140 CTTGAAAACT AGTTCTGGGC ACTGCCCCCT TTACTGTTCT CTGGGTATCA ACCCCTGTCC 1200 TTCAATTTTA GTTGAACTAG TGGATGGTGA TACCACAGGC TCAAGACAGC TGCATTTAAA 1260 TATCAGTGAC CACAGGCCAC ATCAAGGAAA CATCTGCAGG CAACCCAGGG CCTGGGAAGG 1320 AGCCATTTCA GTCACTTGTA AGACAGCAGG ACCTGCAGAC TACAGCACAA TCAAACTCAG 1380 ACAAAACCCT GAACCAGTGA GAACCATTAG GAAGGAAAGG AACAGAAAAT GAACCAACCT 1440 GAGTGTTAGG AGACTTGCAT CTAGTCCTGA CTCCGGTACC AACCGAATGC ATGTCCCTGG 1500 ACAGGAAACC TCTCTGAGTC TCGATTTCCT CCGTGGTAAA AAGGAGAGGG TTAAACCACA 1560 GGGTCCCGAG GGTCCCTTCC AGCTGTCACA TTCTGGAGCG TATGAGATGA GGTAGGCACA 1620 CAAAGTGGAC AAGATGTGGC TAAGAAAACA AGCTACACAT CAAGCTCATC TGTAGCATAG 1680 GTGCTTAAGA AAACTTTGCT GCTGTGTAAT ATTAGAACGG AAGGTTGGTT TCCAGTAAAA 1740 TGCATTAACT TTGGCTCAAA CCAAGATGAT GGGTACCGGG CATGGGGGTG GGGAGGCAGT 1800 TGAAGATCCA CTGAGCTTTG TCTCAGGGCA GCCCTGCTCA TCGTCCTACT TTACCTTCCA 1860 CCACGGTGCT CAAGCCCACA CTGAGAGAGA AATTTCCAGC TGCAAAAGGG AGAAGAGAAA 1920 CGCTGGAATA CTAGTATCGG ACGTTAGGAC ATGGTTGTGG TGTTTTAAAA ATCATTTCAT 1980 CATCTGGAGT TTGACCCCGA GGGGAGTATT TTCACCCTTC AGCCCTCTGA AAGCATTCAC 2040 TAGCATCTGA ATATTGTTCT GAGTTTGTTG GAGCAGTGAA ATCTGGTGAG AGAGAAGGGT 2100 GGAGGAAGGA AGGAGCTGTT GTATTTGGCG GCTGGACTCA GGTAGAGGAA ACTGCTACAA 2160 TCCCGGGAAA GAACAGAAAA GTAGAAAGGG ACGAGTTCCC ACACGCAGCC AATGTCCATG 2220 GCCTTAACTG TGCTTGGGAA GGAAGATCCT GGGCCAGGGG TGTACCCTCG TTTTTCAAAA 2280 ACTAAACGTG TCTGAGACAG CTACAAAGTT TATTAAGGGA CTTGAGAGAC TAGAGTTTTT 2340 TGTTTTTTTT TTTTAATCTT GAGTTCCTTT CTTATTTTCA TTGAGGGAGA GCTTGAGTTC 2400 ATGATAAGTG CCGCGTCTAC TCCTGGCTAA TTTCTAAAAG AAAGACGTTC GCTTTGGCTT 2460 CTTCCCTAGG CCCCCAGCCT CCCCAGGGAT GGCAGAAACT TCTGGGTTAA GGCTGAGCGA 2520 ACCATTGCCC ACTGCCTCCA CCAGCCCCCA GCAAAGGCAC GCCGGCGGGG GGGCGCCCAG 2580 CCCCCCCAGC AAACGCTCCG CGGCCTCCCC CGCAGACCAC GAGGTGGGGG CCGCTGGGGA 2640 GGGCCGAGCT GGGGGCAGCT CGCCACCCCG GCTCCTAGCG AGCTGCCGGC GACCTTCGCG 2700 GTCCTCTGGT CCAGGTCCCG GCTTCCCGGG AGAGGAGCGG GAGGGAGGTC GGGGCTTAGG 2760 CGCCGCTGCG AACCCGCCAA CGCAGCGCCG GGCCCCGAAC CTCAGGCCCC GCCCCAGGTT 2820 CCCGGCCGTT TGGCTAGTTT GTTTGTCTTA ATTTTAATTT CTCCGAGGCC AGCCAGAGCA 2880 GGTTTGTTGG CAGCAGTACC CCTCCAGCAG TCACGCGACC AGCCAATCTC CCGGCGGCGC 2940 TCGGGGAGGC GGCGCGCTCG GGAACGAGGG GAGGTGGCGG AACCGCGCCG GGGCCACCTT 3000 AAGGCCGCGC TCGCCAGCCT CGGCGGGGCG GCTCCCGCCG CCGCAACCAA TGGATCTCCT 3060 CCTCTGTTTA AATAGACTCG CCGTGTCAAT CATTTTCTTC TTCGTCAGCC TCCCTTCCAC 3120 CGCCATATTG GGCCACTAAA AAAAGGGGGC TCGTCTTTTC GGGGTGTTTT TCTCCCCCTC 3180 CCCTGTCCCC GCTTGCTCAC GGCTCTGCGA CTCCGACGCC GGCAAGGTTT GGAGAGCGGC 3240 TGGGTTCGCG GGACCGCGGG CTTGCACCCG CCCAGACTCG GACGGGCTTT GCCACCCTCT 3300 CCGCTTGCCT GGTCCCCTCT CCTCTCCGCC CTCCCGCTCG CCAGTCCATT TGATCAGCGG 3360 AGACTCGGCG GCCGGGCCGG GGCTTCCCCG CAGCCCCTGC GCGCTCCTAG AGCTCGGGCC 3420 GTGGCTCGTC GGGGTCTGTG TCTTTTGGCT CCGAGGGCAG TCGCTGGGCT TCCGAGAGGG 3480 GGTTCGGGCC GCGTAGGGGC GCTTTGTTTT GTTCGGTTTT GTTTTTTTGA GAGTGCGAGA 3540 GAGGCGGTCG TGCAGACCCG GGAGAAAG 3568 配列番号： 2 配列の長さ： 20 配列の型： 核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の特徴： 他の核酸 合成DNA 配列 CCCAGCGACT GCCCTCGGAG 20 配列番号： 3 配列の長さ： 20 配列の型： 核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の特徴： 他の核酸 合成DNA 配列 CCCTCTCGGA AGCCCAGCGA 20
究所 （２）発明の名称： ヒトｐ２７Ｋｉｐ１遺伝子のプロ
モーター （３）整理番号： Ｃ２−９０７ （４）出願番号： （５）出願日： （６）配列の数：３ 配列番号 : 1 配列の長さ : 3568 配列の型 : 核酸 鎖の数 : 二本鎖 トポロジー : 直鎖状 配列の種類 : Genomic DNA 配列の特徴 特徴を表す記号 : promoter 存在位置 : 1 .. 3568 特徴を決定した方法 : E 配 列 CTCGAGGAAG GACTGAAACT GTGTGCTTGC GGTGGGAGGG GCAGCTGGGC AAGGAACCGT 60 GAACCTTCGC AGAAACATTT GGGGCTGCAG AACTTGGGTG AGAGCGCTGC ATCTGGGAGC 120 TGGCGACGCT GGCGGCTTGC TCATTCACCC CATCTGAACA CTTGTCTATG ACACAGGTGT 180 TTTCTCTTAA GTTATTTTGG TCTTTGCCTC TCTCCTCAGG TTGTGAAGAT TACAGAAATC 240 TGGGATGGCT TATGGGACGC TTCTCAGCCC TAAGTAGGAA AACAGCAGTG AAAATGGCAA 300 CCAAAACATC ACGCAGGACT GGGGGTTTTG GGGAAACAGC TCACTTTAGA GCAGTGCAGT 360 GTAGAGCTTT CCGTCTTCTA CCAGGGTCCA CCTTTAACAC TGTTTATCTG AAAATTTTCC 420 CCCTGGCTTA CTCGCTTGCA GCTGCCCACT TTGCAGAAGG ATGGCGCTCT GATCTCTACG 480 CTCCCTGTTC CTTCAGGGAC TCCATAGTAT TTTTTTTCAC GCGTCGTCGC TACTACAGCA 540 GACGCCTGCG TTCTCATTAT TTGCTGTACA GATCTCCGGT GCCTTGACTG TAAACAAAAC 600 ACTTTAGATC ATTGTGAGGT CGATGTAAGC ACAGCCTTTC TGCTGGCAGC CAGACTTCTT 660 AAGGTGGTGT GACTGTGACT TGCTTACTTT TCGAGATCAA CAACAACAAA GCGACAAAAT 720 GGTGCTCCTA CATATTAGTT GAAAGATTCA GCATGTGAAG GGGATCGAAG TGTTTATTTT 780 CCACTTCCAT ATAAGACATG AATTCCATGA GTAAAATCAA CTTCTGTGGC AAGGTGAACT 840 ACTCTAGAAT GTCTCCATTT ACATACATGT GGTAGTTTGG ATGTTTATGC ATATGGATAG 900 ATGCACATAT ATAGAGTTCC TGTGTTGTCT AGCAATTGTT TTAAAATTTG GACAATTATC 960 TAATTTCTAG GGTAAGGTAT AAATTATGGT AGGGAGGCCT ACCCTAATTT TCCTGTTCCT 1020 TTTCCCCCAG TCTGCAGTCC AATAAATTGA CAGCCTTAAA AGTAGAAAAA CTAAAGAGGA 1080 TGAGACCTCT TGCTTGATCC TAGGTGAATT CTTTTCTGTC AGTTAGGTAG GAAGTCCTGA 1140 CTTGAAAACT AGTTCTGGGC ACTGCCCCCT TTACTGTTCT CTGGGTATCA ACCCCTGTCC 1200 TTCAATTTTA GTTGAACTAG TGGATGGTGA TACCACAGGC TCAAGACAGC TGCATTTAAA 1260 TATCAGTGAC CACAGGCCAC ATCAAGGAAA CATCTGCAGG CAACCCAGGG CCTGGGAAGG 1320 AGCCATTTCA GTCACTTGTA AGACAGCAGG ACCTGCAGAC TACAGCACAA TCAAACTCAG 1380 ACAAAACCCT GAACCAGTGA GAACCATTAG GAAGGAAAGG AACAGAAAAT GAACCAACCT 1440 GAGTGTTAGG AGACTTGCAT CTAGTCCTGA CTCCGGTACC AACCGAATGC ATGTCCCTGG 1500 ACAGGAAACC TCTCTGAGTC TCGATTTCCT CCGTGGTAAA AAGGAGAGGG TTAAACCACA 1560 GGGTCCCGAG GGTCCCTTCC AGCTGTCACA TTCTGGAGCG TATGAGATGA GGTAGGCACA 1620 CAAAGTGGAC AAGATGTGGC TAAGAAAACA AGCTACACAT CAAGCTCATC TGTAGCATAG 1680 GTGCTTAAGA AAACTTTGCT GCTGTGTAAT ATTAGAACGG AAGGTTGGTT TCCAGTAAAA 1740 TGCATTAACT TTGGCTCAAA CCAAGATGAT GGGTACCGGG CATGGGGGTG GGGAGGCAGT 1800 TGAAGATCCA CTGAGCTTTG TCTCAGGGCA GCCCTGCTCA TCGTCCTACT TTACCTTCCA 1860 CCACGGTGCT CAAGCCCACA CTGAGAGAGA AATTTCCAGC TGCAAAAGGG AGAAGAGAAA 1920 CGCTGGAATA CTAGTATCGG ACGTTAGGAC ATGGTTGTGG TGTTTTAAAA ATCATTTCAT 1980 CATCTGGAGT TTGACCCCGA GGGGAGTATT TTCACCCTTC AGCCCTCTGA AAGCATTCAC 2040 TAGCATCTGA ATATTGTTCT GAGTTTGTTG GAGCAGTGAA ATCTGGTGAG AGAGAAGGGT 2100 GGAGGAAGGA AGGAGCTGTT GTATTTGGCG GCTGGACTCA GGTAGAGGAA ACTGCTACAA 2160 TCCCGGGAAA GAACAGAAAA GTAGAAAGGG ACGAGTTCCC ACACGCAGCC AATGTCCATG 2220 GCCTTAACTG TGCTTGGGAA GGAAGATCCT GGGCCAGGGG TGTACCCTCG TTTTTCAAAA 2280 ACTAAACGTG TCTGAGACAG CTACAAAGTT TATTAAGGGA CTTGAGAGAC TAGAGTTTTT 2340 TGTTTTTTTT TTTTAATCTT GAGTTCCTTT CTTATTTTCA TTGAGGGAGA GCTTGAGTTC 2400 ATGATAAGTG CCGCGTCTAC TCCTGGCTAA TTTCTAAAAG AAAGACGTTC GCTTTGGCTT 2460 CTTCCCTAGG CCCCCAGCCT CCCCAGGGAT GGCAGAAACT TCTGGGTTAA GGCTGAGCGA 2520 ACCATTGCCC ACTGCCTCCA CCAGCCCCCA GCAAAGGCAC GCCGGCGGGG GGGCGCCCAG 2580 CCCCCCCAGC AAACGCTCCG CGGCCTCCCC CGCAGACCAC GAGGTGGGGG CCGCTGGGGA 2640 GGGCCGAGCT GGGGGCAGCT CGCCACCCCG GCTCCTAGCG AGCTGCCGGC GACCTTCGCG 2700 GTCCTCTGGT CCAGGTCCCG GCTTCCCGGG AGAGGAGCGG GAGGGAGGTC GGGGCTTAGG 2760 CGCCGCTGCG AACCCGCCAA CGCAGCGCCG GGCCCCGAAC CTCAGGCCCC GCCCCAGGTT 2820 CCCGGCCGTT TGGCTAGTTT GTTTGTCTTA ATTTTAATTT CTCCGAGGCC AGCCAGAGCA 2880 GGTTTGTTGG CAGCAGTACC CCTCCAGCAG TCACGCGACC AGCCAATCTC CCGGCGGCGC 2940 TCGGGGAGGC GGCGCGCTCG GGAACGAGGG GAGGTGGCGG AACCGCGCCG GGGCCACCTT 3000 AAGGCCGCGC TCGCCAGCCT CGGCGGGGCG GCTCCCGCCG CCGCAACCAA TGGATCTCCT 3060 CCTCTGTTTA AATAGACTCG CCGTGTCAAT CATTTTCTTC TTCGTCAGCC TCCCTTCCAC 3120 CGCCATATTG GGCCACTAAA AAAAGGGGGC TCGTCTTTTC GGGGTGTTTT TCTCCCCCTC 3180 CCCTGTCCCC GCTTGCTCAC GGCTCTGCGA CTCCGACGCC GGCAAGGTTT GGAGAGCGGC 3240 TGGGTTCGCG GGACCGCGGG CTTGCACCCG CCCAGACTCG GACGGGCTTT GCCACCCTCT 3300 CCGCTTGCCT GGTCCCCTCT CCTCTCCGCC CTCCCGCTCG CCAGTCCATT TGATCAGCGG 3360 AGACTCGGCG GCCGGGCCGG GGCTTCCCCG CAGCCCCTGC GCGCTCCTAG AGCTCGGGCC 3420 GTGGCTCGTC GGGGTCTGTG TCTTTTGGCT CCGAGGGCAG TCGCTGGGCT TCCGAGAGGG 3480 GGTTCGGGCC GCGTAGGGGC GCTTTGTTTT GTTCGGTTTT GTTTTTTTGA GAGTGCGAGA 3540 GAGGCGGTCG TGCAGACCCG GGAGAAAG 3568 配列番号： 2 配列の長さ： 20 配列の型： 核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の特徴： 他の核酸 合成DNA 配列 CCCAGCGACT GCCCTCGGAG 20 配列番号： 3 配列の長さ： 20 配列の型： 核酸 鎖の数： 1本鎖 トポロジー： 直鎖状 配列の特徴： 他の核酸 合成DNA 配列 CCCTCTCGGA AGCCCAGCGA 20
【図１】ヒトp27Kip1遺伝子の5'隣接領域のヌクレオチ
ド配列を示す。ヒトp27Kip1遺伝子の転写開始部位を、
プライマーの伸長により決定し、矢尻の形で示した（黒
三角）。様々な転写因子のコンセンサス部位を、アンダ
ーラインで示した。ヌクレオチドの数は転写開始部位か
ら数えた。矢印は、図３に示したp27Kip1プロモーター
の欠失変異体の5'末端を示している。
ド配列を示す。ヒトp27Kip1遺伝子の転写開始部位を、
プライマーの伸長により決定し、矢尻の形で示した（黒
三角）。様々な転写因子のコンセンサス部位を、アンダ
ーラインで示した。ヌクレオチドの数は転写開始部位か
ら数えた。矢印は、図３に示したp27Kip1プロモーター
の欠失変異体の5'末端を示している。
【図２】ヒトp27Kip1遺伝子のプライマー伸長マップを
示す。プライマーの伸長は、実施例に記載の方法で行っ
た。プライマーO-128由来の伸長産物を、鋳型としてMG6
3細胞及びSaos2細胞の全RNAを用いて示している。この
図では、アンチセンス配列ladderを示している。矢印
は、C残基（センス鎖ではG残基）を推定される転写開始
部位として示している。S；センス鎖，AS；アンチセン
ス鎖。
示す。プライマーの伸長は、実施例に記載の方法で行っ
た。プライマーO-128由来の伸長産物を、鋳型としてMG6
3細胞及びSaos2細胞の全RNAを用いて示している。この
図では、アンチセンス配列ladderを示している。矢印
は、C残基（センス鎖ではG残基）を推定される転写開始
部位として示している。S；センス鎖，AS；アンチセン
ス鎖。
【図３】ヒトp27Kip1プロモーター−ルシフェラーゼ構
築体の欠失変異体を示す。ヒト全長p27Kip1プロモータ
ー−ルシフェラーゼ構築体，p27PFは、pGVB2におけるル
シフェラーゼレポーター遺伝子より先に、XhoI部位(−3
568位）からSmaI部位(−12位)までのDNA断片のサブクロ
ーニングによって作製した。5'欠失構築体は、制限酵素
部位あるいはマングビーンズ-エキソヌクレアーゼIIIシ
ステムを用いて作製した。
築体の欠失変異体を示す。ヒト全長p27Kip1プロモータ
ー−ルシフェラーゼ構築体，p27PFは、pGVB2におけるル
シフェラーゼレポーター遺伝子より先に、XhoI部位(−3
568位）からSmaI部位(−12位)までのDNA断片のサブクロ
ーニングによって作製した。5'欠失構築体は、制限酵素
部位あるいはマングビーンズ-エキソヌクレアーゼIIIシ
ステムを用いて作製した。
【図４】ヒトp27Kip1プロモーター構築体の基本的なプ
ロモーター活性を示す。転写は、実施例に記載の方法に
従い、C33A細胞(a)及びSao2細胞(b)を用いた様々な5'欠
失ヒトp27Kip1プロモーター−ルシフェラーゼ構築体に
よって行った。ルシフェラーゼ活性は、コトランスフェ
クトしたRSV-βgalによって操作されるβ−ガラクトシ
ダーゼー活性によって標準化した。
ロモーター活性を示す。転写は、実施例に記載の方法に
従い、C33A細胞(a)及びSao2細胞(b)を用いた様々な5'欠
失ヒトp27Kip1プロモーター−ルシフェラーゼ構築体に
よって行った。ルシフェラーゼ活性は、コトランスフェ
クトしたRSV-βgalによって操作されるβ−ガラクトシ
ダーゼー活性によって標準化した。
【図５】ヒトとマウスのp27Kip1プロモーターの配列の
相同性を示す。DNA配列の比較は、ヒト("hu"と示す)と
マウス("mo"と示す)のp27Kip1遺伝子のプロモーター間
で、GENETYX ソフトウェアを用いて行った。−774位か
ら−435位までの推定される基本的な活性領域は、波線
で囲んだ。ヒト（黒三角）とマウス（白三角）のp27
Kip1遺伝子の転写開始部位は、矢尻の形で示した。様々
な転写因子のコンセンサス部位は、アンダーラインで示
した。
相同性を示す。DNA配列の比較は、ヒト("hu"と示す)と
マウス("mo"と示す)のp27Kip1遺伝子のプロモーター間
で、GENETYX ソフトウェアを用いて行った。−774位か
ら−435位までの推定される基本的な活性領域は、波線
で囲んだ。ヒト（黒三角）とマウス（白三角）のp27
Kip1遺伝子の転写開始部位は、矢尻の形で示した。様々
な転写因子のコンセンサス部位は、アンダーラインで示
した。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (13)
- 【請求項１】 配列番号：１に記載の塩基配列の少なく
とも一部を含むDNA。 - 【請求項２】 配列番号：１に記載の塩基配列の少なく
とも一部を含みプロモーター活性を有するDNA。 - 【請求項３】 請求項２に記載のDNAを含むベクター。
- 【請求項４】 請求項３に記載のベクターを保持する細
胞。 - 【請求項５】 請求項２に記載のDNAのプロモーター活
性を調節するタンパク質のスクリーニング方法であっ
て、 （ａ）請求項２に記載のDNAに被検試料を接触させ、請
求項２に記載のDNAに結合するタンパク質を選択する工
程、 （ｂ）請求項２に記載のDNAの下流に連結されたレポー
ター遺伝子を保持する細胞に被検DNAを導入し、レポー
ター遺伝子の発現を調節する発現産物を選択する工程、 （ｃ）請求項２に記載のDNAの下流に連結されたレポー
ター遺伝子を保持する細胞に被検試料を接触させ、レポ
ーター遺伝子の発現を調節するタンパク質を選択する工
程、のいずれかの工程を含む方法。 - 【請求項６】 請求項２に記載のDNAのプロモーター活
性を調節するタンパク質をコードするDNAのスクリーニ
ング方法であって、 （ａ）請求項２に記載のDNAに被検DNAの発現産物を接触
させ、請求項２に記載のDNAに結合する発現産物をコー
ドするDNAを選択する工程、 （ｂ）請求項２に記載のDNAの下流に連結されたレポー
ター遺伝子を保持する細胞に被検DNAを導入し、レポー
ター遺伝子の発現を調節する発現産物をコードするDNA
を選択する工程、 （ｃ）請求項２に記載のDNAの下流に連結されたレポー
ター遺伝子を保持する細胞に被検DNAの発現産物を接触
させ、レポーター遺伝子の発現を調節する発現産物をコ
ードするDNAを選択する工程、のいずれかの工程を含む
方法。 - 【請求項７】 請求項２に記載のDNAのプロモーター活
性を調節する化合物のスクリーニング方法であって、 （ａ）被検化合物の存在下で請求項２に記載のDNAと被
検試料とを接触させ、請求項２に記載のDNAと被検試料
中のタンパク質との結合を促進または阻害する化合物を
選択する工程、 （ｂ）請求項２に記載のDNAの下流に連結されたレポー
ター遺伝子を保持する細胞に被検化合物を接触させ、レ
ポーター遺伝子の発現を調節する化合物を選択する工
程、のいずれかの工程を含む方法。 - 【請求項８】 請求項２に記載のDNAのプロモーター活
性を調節するタンパク質。 - 【請求項９】 請求項５に記載の方法により単離しう
る、請求項８に記載のタンパク質。 - 【請求項１０】 請求項２に記載のDNAのプロモーター
活性を調節するタンパク質をコードするDNA。 - 【請求項１１】 請求項６に記載の方法により単離しう
る、請求項１０に記載のDNA。 - 【請求項１２】 請求項２に記載のDNAのプロモーター
活性を調節する化合物。 - 【請求項１３】 請求項７に記載の方法により単離しう
る、請求項１２に記載の化合物。
Priority Applications (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9305196A JPH11137251A (ja) | 1997-11-07 | 1997-11-07 | ヒトｐ２７Ｋｉｐ１遺伝子のプロモーター |
| US09/103,510 US6225112B1 (en) | 1997-11-07 | 1998-06-23 | Human p27Kip1 gene promoter |
| CA002236455A CA2236455C (en) | 1997-11-07 | 1998-06-30 | Human p27kip1 gene promoter |
| US09/491,970 US6623925B1 (en) | 1997-11-07 | 2000-01-27 | Human p27Kip1 gene promoter |
| US09/492,639 US6489104B1 (en) | 1997-11-07 | 2000-01-27 | Human p27Kip1 gene promoter |
| US09/491,971 US6524796B1 (en) | 1997-11-07 | 2000-01-27 | Human p27kip1 gene promoter |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9305196A JPH11137251A (ja) | 1997-11-07 | 1997-11-07 | ヒトｐ２７Ｋｉｐ１遺伝子のプロモーター |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH11137251A true JPH11137251A (ja) | 1999-05-25 |
Family
ID=17942215
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9305196A Pending JPH11137251A (ja) | 1997-11-07 | 1997-11-07 | ヒトｐ２７Ｋｉｐ１遺伝子のプロモーター |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US6225112B1 (ja) |
| JP (1) | JPH11137251A (ja) |
| CA (1) | CA2236455C (ja) |
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|---|---|---|---|---|
| WO2000017238A1 (fr) * | 1998-09-24 | 2000-03-30 | Taisho Pharmaceutical Co., Ltd. | Proteine ayant un effet de promotion de la proliferation cellulaire |
| JP4828070B2 (ja) * | 2000-01-21 | 2011-11-30 | 中外製薬株式会社 | ｐ２７／Ｋｉｐ１遺伝子の５’上流に存在するビタミンＤ３応答配列、および該配列を利用した薬剤のスクリーニング方法 |
| JP2014504871A (ja) * | 2011-01-07 | 2014-02-27 | アプライド ジェネティック テクノロジーズ コーポレイション | １色覚および他の疾患の治療のためのプロモーター、発現カセット、ベクター、キット、ならびに方法 |
Families Citing this family (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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