MXPA06015054A - Polipeptidos antifungales. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones y metodos para proteger a una planta de un patogeno, particularmente un patogeno fungal. Las composiciones incluyen secuencias de aminoacidos novedosas, y variantes y fragmentos de las mismas, para polipeptidos antipatogenicos que se aislaron de caldos de fermentacion microbianos. Tambien se proporcionan moleculas de acido nucleico que comprenden secuencias de nucleotidos que codifican los polipeptidos antipatogenicos de la invencion. Ademas se proporciona un metodo para inducir resistencia a patogenos en una planta utilizando las secuencias de nucleotidos divulgadas en la presente. El metodo comprende introducir en una planta un casete de expresion que comprende un promotor operablemente enlazado a una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido antipatogenico de la invencion. Ademas se proporcionan composiciones que comprenden un polipeptido antipatogenico o un microorganismo transformado que comprende un acido nucleico de la invencion en combinacion con un portador y metodos para usar estas composiciones para proteger a una planta de un patogeno. Tambien se divulgan plantas, celulas de plantas, semillas y microorganismos transformados que comprenden una secuencia de nucleotidos que codifica un polipeptido antipatogenico de la invencion, o variante o fragmento del mismo.

Description

POLIPEPTIDOS ANTIFU GALES CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona a polipéptidos que tienen actividad antipatogénica y las secuencias de ácido nucleico que los codifican. Los métodos de la invención utilizan estos polipéptidos antipatogénicos y secuencias de ácido nucleico para controlar patógenos de plantas y para incrementar la resistencia a patógenos en plantas. • ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las enfermedades de plantas son frecuentemente una seria limitación en la productividad de la agricultura y por lo tanto han influenciado la historia y el desarrollo de las prácticas de la agricultura. Una variedad de patógenos son responsables para las enfermedades de plantas, incluyendo hongos, bacterias, virus y nematodos. Entre los agentes causales de enfermedades infecciosas de plantas* de cultivo, sin embargo, los hongos son el grupo económicamente más importante de patógenos de plantas y son responsables para las enormes pérdidas anuales de comida, fibra y alimento comercializables . La incidencia de enfermedades de plantas se ha controlado tradicionalmente mediante prácticas agronómicas que incluyen la rotación de cultivos, el uso de agroquímicos y técnicas de reproducción convencionales. El uso de químicos para controlar patógenos de plantas, sin embargo, incrementa los costos a los granjeros y causa efectos perjudiciales en el ecosistema.- Los consumidores y reguladores del gobierno igualmente están llegando a estar cada ves más interesados con los peligros ambientales asociados con la producción y el uso de agroquímicos sintéticos para proteger plantas de patógenos. Debido a tales problemas, los reguladores han prohibido o limitado el uso de algunos de los químicos más peligrosos. La incidencia de enfermedades fúngales' se ha controlado . en -algún grado al reproducir cultivos resistentes. Los métodos de reproducción tradicionales, sin embargo, son consumidores de tiempo y requieren esfuerzo continuo para mantener la resistencia a la enfermedad conforme se desarrollan los patógenos. Ver,- por ejemplo, Grover y Gowthaman (2003) Curr. Sci . 84:330-340. Así, hay una necesidad significante para alternativas novedosas para- el control de patógenos de plantas' que presenten un menor riesgo de contaminación y peligros ambientales que es característico de los métodos basados en agroquímicos tradicionales y que sean menos difíciles de manejar que las técnicas de reproducción convencionales. Muchas enfermedades de plantas, incluyendo, pero no limitadas a, la roya del tallo de maíz y el moho de mazorca, pueden ser causadas por una variedad de patógenos. La roya del tallo, por ejemplo, es una de las enfermedades más destructivas y difundidas del maíz. La enfermedad es causada por un complejo de hongos y bacterias que atacan y degradan los tallos cerca de la madurez de la planta. La pérdida de rendimiento significante puede ocurrir como un resultado de la fijación de tallos debilitados así como la muerte prematura de la planta. La roya del tallo de maíz es típicamente causada por más de una especie fungal, pero la roya del tallo de Gibberella, causada por Gibberella zeae, la roya del tallo de Fusarium, causada por Fusarium verticillioides, F. prolif eratum o F. subglutinans, y la roya del tallo de Anthracnose, causada por Colletotrichum graminicola son las más frecuentemente reportadas (Smith y White (1988) ; Diseases of corn, pp. 701-766 in Corn and Corn I provement, Agronomy Series #18 (3rd ed.) Sprague, C.F, y Dudley, J.W, eds. Madison, Wl) . Debido al hecho de que las enfermedades de plantas pueden ser causadas por un complejo de patógenos, se requiere resistencia de amplio espectro para mediar efectivamente el control de la enfermedad. Así, existe una necesidad significante por composiciones antifungales que se dirijan a múltiples patógenos causantes de la roya del tallo y del moho de mazorca. Recientemente, los científicos de la agricultura han desarrollado plantas de cultivo con resistencia a patógenos aumentada al diseñar genéticamente plantas para expresar proteínas antipatogénicas. Por ejemplo, las plantas de papa y de tabaco genéticamente diseñadas para producir una proteína de endoquitinasa antifungal se mostraron que exhiben resistencia incrementada a los patógenos fúngales foliares y portados por la tierra. Ver Lorito y colaboradores (1998) Proc . Na ti . Acad. Sci . 95:7860-7865. Además, también se ha desarrollado cebada transgénica que es resistente al hongo de roya de tallo. Ver Horvath y colaboradores, (2003) Proc . Nati . Acad. Sci . 100:364-369. Un esfuerzo continuo para identificar agentes antipatogénicos y para diseñar genéticamente plantas resistentes a enfermedad es llevado a cabo. Así, en vista del impacto significante de los patógenos de plantas, particularmente patógenos fúngales, en el rendimiento y la calidad de los cultivos, se necesitan nuevas composiciones y métodos para proteger a las plantas de tales patógenos. Los métodos y composiciones para controlar múltiples patógenos fúngales son de particular interés . BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN Se proporcionan composiciones y métodos para proteger a una planta de un patógeno. Las composiciones incluyen secuencias de nucleótidos y de aminoácidos novedosas para polipéptidos antipatogénicos, particularmente antifungales . Los polipéptidos de la invención exhiben actividad antipatogénica contra patógenos fúngales de plantas. Más particularmente, las composiciones de la invención comprenden los polipéptidos antipatogénicos expuestos en las SEQ ID NOs: 1 , 3 , 5 , 1 y 9, y variantes y fragmentos de los mismos. Además se proporcionan moléculas de ácido nucleico que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican los polipéptidos antipatogénicos de la invención. Las composiciones también incluyen casetes de expresión que comprenden un promotor operablemente enlazado a una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido antipatogénico de la invención. Además se proporcionan plantas, células de plantas, semillas y microorganismos transformados que comprenden un cásete de expresión de la invención. Las composiciones de la invención son útiles en métodos dirigidos a inducir resistencia a patógenos, particularmente resistencia fungal, en plantas. En modalidades particulares, los métodos comprenden la introducción en una planta de por lo menos un cásete de expresión que comprende un promotor operablemente enlazado en una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido antipatogénico de la invención. Como resultado, el polipéptido antipatogénico se expresa en la planta, y el patógeno se expone a la proteína en el sitio de ataque del patógeno, conduciendo de esta manera a resistencia a patógeno incrementada. Un promotor preferido de tejido se puede utilizar para inducir la expresión de una proteína antipatogénica en tejidos de planta específicos que son particularmente vulnerables al ataque de patógenos, tales como, por ejemplo, las raíces, hojas, tallos, tejidos vasculares y semillas. Los productores inducibles de patógeno también se pueden utilizar para inducir la expresión de una proteína antipatogénica de la invención en o cerca del sitio de la infección del patógeno. La presente invención además proporciona composiciones antipatogénicas y formulaciones y métodos para su uso en la protección de una planta de un patógeno, particularmente un patógeno fungal. En algunas modalidades, las composiciones comprenden un polipéptido antipatogénico o un microorganismo transformado que comprende una secuencia de nucleótido que codifican un polipéptido antipatogénico de la invención en combinación con un portador. Los métodos para utilizar estas composiciones par proteger una planta de un patógeno comprenden aplicar la composición antipatogénica al medioambiente del patógeno de planta mediante, por ejemplo, rociado, espolvoreamiento, dispersión o recubrimiento de semilla. Los métodos y composiciones de la invención encuentran uso en la protección de plantas de los patógenos, incluyendo patógenos fúngales, virus, nemátodos y los similares . BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura 1 muestra una alineación de secuencia de las secuencias de aminoácidos de la invención con varias proteínas conocidas que comparten similitud de secuencia a los polipéptidos divulgados en la presente. Además se proporcionan secuencias consensúales derivadas de la región resaltada de todos los polipéptidos que aparecen en la alineación. La Figura 2 muestra una alineación de secuencia de las secuencias de aminoácidos novedosas de la invención. La Figura 3 muestra ejemplos fotográficos del nivel de inhibición asociado con . cada registro numérico en el ensayo de placa antifungal descrito en el Ejemplo 3. La Figura 4 proporciona los resultados fotográficos de los ensayos de actividad antifungal realizados con el polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 1 , como es descrito en el Ejemplo 3. Se observó actividad antifungal contra Colletotrichum graminicola , Diplodia maydis , Fusarium graminearum y Fusarium verticillioides . Las Figuras 5A y 5B muestran los resultados de los ensayos de actividad antifungal realizados con los péptidos expuestos en la SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 9 , respectivamente. Ambos polipéptidos inhibieron Colletotrichum graminicola , Diplodia maydis, Fusarium graminearum y Fusarium verticillioides en una manera dependiente de la dosis. Detalles experimentales se proporcionan en el Ejemplo 3. La Figura 6 proporciona los resultados de un ensayo de estimulación de Fusari um verticillioides de plántulas de maíz que expresan el polipéptido antifungal designado LBNL-5220 (SEQ ID NO: 1) . Los detalles experimentales se proporcionan en el Ejemplo 8. Los resultados obtenidos con plántulas de control negativas trasformadas con un plásmido de control de vector vacío se presentan como una barra sombreada. Las barras blancas representan resultados de plántulas de maíz transformadas con la construcción LBNL-5220 en la cual se observo una diferencia estadísticamente significante (en el nivel de confidencia de 95%) en la actividad GUS con relación aquellas de las nuestras de control. Los eventos de transformación en los cueles las disminuciones en la actividad GUS con relación a los controles no fueron estadísticamente significante (en el nivel de confidencia de 95%) se presentan como barras negras. La Figura 7 proporciona los resultados fotográficos de un ensayo de actividad antifungal de F. verticillioides realizado utilizando extractos de callo LBNL-5220 (SEQ ID NO: 1) transgénicos. Los detalles experimentales se proporcionan en el Ejemplo 9. La Figura 8 proporciona los resultados de los ensayos de resistencia a Colletotrichum graminicola de plantas de maíz LBNL-5220 (SEQ ID NO: 1) transgénicas. Los detalles experimentales se proporcionan en el Ejemplo 10. Los resultados obtenidos con controles negativos (es decir, eventos de control de vector vacío) se presentan como una barra sombreada. Los resultados obtenidos en internodos de tallo superior de los eventos de transformación marcados con barras blancas fueron estadísticamente más resistentes a la infección por C. graminicola que los tallos de control negativos. Los eventos de transformación en los cuales una mejora estadísticamente significante en la resistencia fungal no se observó se presentan como barras negras. La Figura 9 proporciona la distribución de los registros de resistencia a C. graminicola de tallo superior para las plantas de maíz LBNL-5220 transgénicas y de control.

Los detalles experimentales se proporcionan en el Ejemplo 10. La Figura 10 proporciona la distribución de los registros de resistencia a C. graminicola de tallo inferior para plantas de maíz LBNL-5220 transgénicas y de control. Los detalles experimentales se proporcionan en el Ejemplo 10. DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones y métodos dirigidos a la inducción de resistencia a patógenos, particularmente la resistencia fungal, en plantas. Las composiciones son secuencias de nucleótidos y de aminoácidos novedosos para polipéptidos antipatogénicos. Específicamente, la presente invención proporciona polipéptidos antipatogénicos que tienen las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 1 , 3 , 5, 1 y 9 , y variantes y fragmentos de las mismas, que se aislaron de varios caldos de fermentación microbianos. Además se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas, y variantes y fragmentos de las mismas, que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NOs: 1, 3 , 5, 7 y 9. .Las secuencias de nucleótidos que son optimizadas para la expresión' en plantas, particularmente maíz, y que codifican los polipéptidos de las SEQ ID NOs: 1, 3 , 5 , 1 y 9 se generaron utilizando métodos estándares conocidos en la técnica. Estas secuencias de nucleótidos deducidas se exponen en las SEQ ID NOs: 2 , 4, 6, 8 y 10. También se divulgan en la presente plantas, células de plantas, semillas y microorganismos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido antipatogénico de la invención. Además se proporcionan composiciones antipatogénicas que comprenden un polipéptido antipatogénico aislado, particularmente un antifungal, un microorganismo que expresa un polípéptido de la invención en combinación con un portador. Las composiciones de la invención encuentran uso en la generación de plantas resistentes a patógenos y en la protección de plantas de los patógenos, particularmente patógenos fúngales. Los polipéptidos divulgados en la presente en las SEQ ID NOs: 1 , 3 , 5, 7 y 9 exhiben actividad antifungal contra patógenos de plantas fúngales, tales, por ejemplo, Colletotrichum graminicola , Diplodia maydis, Fusarium graminearum y Fusarium verticillioides . En las especies de origen de estos polipéptidos antifungales se ha • determinado. Estas proteínas son de origen fungal y lamentoso. En particular, la fuente fungal del polipéptido la SEQ ID NO: 1 es Penicillium simplicissímum, mientras que la fuente fungal de los polipéptidos SEQ ID NOs: 3 y 5 son dos cepas de la especie de Penicillium miczyinskii . La fuente fungal de los polipéptidos de las SEQ ID NOs: 7 y 9 es Monascur ruber. Se proporcionan polipéptidos novedosos adicionales que comparten homología con las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 y 9. En particular, los polipéptidos expuestos en las SEQ ID NOs: 11 y 15 se identificaron utilizando búsquedas de homología en computadora a partir de un contaminante fungal de maíz y de Fusarium graminearum, en respectivamente. Los péptidos maduros que carecen de un péptido N-terminal presentes en las secuencias de longitud completa de las SEQ ID NOs: 11 y 15 también se divulgan y se exponen en las SEQ ID NOs: 13 y 17. Además se proporcionan moléculas de ácido nucleico aisladas, y variantes y fragmentos de los mismos, que comprenden secuencias de nucleótidos que codifican las secuencias de aminoácidos mostradas en las SEQ ID NOs: 11, 13, 15 y 17. Las secuencias de nucleótidos que codifican estos polipéptidos se han generado, y estas secuencias deducidas se exponen en las SEQ ID NOs: 12, 14, 16 y 18. Los polipéptidos de la invención comparten homología con proteínas antifungales conocidas, así como otras proteínas de función desconocida. En particular, los polipéptidos novedosos de la invención comparten homología con proteínas antifungales aisladas de Aspergillus giganteus (Acceso No. AAE78772; SEQ ID NO: 59) y Penicillium chrysogenum (Acceso No. AAC86132; SEQ ID NO: 60) y una proteína de función desconocida aislada de Aspergillus Niger (Accesión No. CAD66625; SEQ ID NO: 61) . Ver las patentes norteamericanas Nos. 5,747285, 5,804,184, y 6,271,438 y la publicación internacional No. WO 02/09034, incorporadas en la presente por referencia en su totalidad. La Figura 1 proporciona una alineación de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, 9, 13 y 17 con las proteínas antifungales de A. giganteus y P. chrysogenum y la proteína de A. niger de función desconocida. Las secuencias de aminoácidos novedosas divulgadas comprenden las secuencias consensual mostrada en la SEQ ID NO: '68 (es decir G-X-C-X-X-X-X-N-X-C-X-Y-X-X-X-X-X-X-X-X-Z-V-X-C-X-X-X-A-N-X-X-C-X-X-D-X-X-X-C-X-X-D-X-X-X-X-X-V-X-C, en donde "X" se refiere a cualquier aminoácido y Z" se refiere a cualquier aminoácido o no aminoácido) . Las secuencias consensúales pueden ser más específicamente representadas por las secuencias expuestas en la SEQ ID NO: 39 (G-X-C-X-X-X-X- N-X-C-X-Y-X-X-X-X-X-X-X-X-V-X-C-X-X-X-A-N-X-X-C-X-X-D-X-X-X-C-X-X-D-X-X-X-X-X-V-X-C) , o en la SEQ ID NO: 40 (G-X-C-X-X-X-X-N-X-C-X-Y-X-X-X-X-X-X-X-X-X-V-X-C-X-X-X-A-N-X-X-C-X-X-D-X-X-X-C-X-X-D-X-X-X-X-X-V-X-C) , en donde "X" se refiere a cualquier aminoácido. Esta secuencia consensual es única entre las proteínas de antifungales conocidas. La secuencia consensual divulgada en la presente además puede comprender la secuencia consensual como es mostrada en la SEQ ID NO: 41 ( (K o Q)-(Y o F)-X-G-X-C-X-X-X-X-N-X-C-(T o K) -Y-X-X-X-X-X-X-X-X-V-X-C-(P o G)-(S o T)-(A o F)-A-N-X-(R o K) -C-X-X-D- (R o G)-X-X-C-X-(Y o F)-D-X-(H o Y) -X-X-X-V-X-C- (Q o D) ) o SEQ ID NO: 42 ( (K o Q)-(Y o F) -X-G-X-C-X-X-X-X-N-X-C- (T o K) -Y-X-X-X~X-X-X-X-X-X-V-X-C-(P o G)-(S o T)-(A o F) -A-N-X- (R o K) -C-X-X-D-(R o G)-X-X-C-X-(Y o F) -D-X- (H o Y) -X-X-X-V-X-C- (Q o D) ) , en donde "X" se refiere a cualquiera aminoácido, y en donde "o" indica uno o los otros aminoácidos (de los dos indicados entre paréntesis) puede ser sustituido en las posiciones respectivas. Los datos de alineación indican que la SEQ ID NO: 1 comparte aproximadamente 49% de identidad de secuencia con la proteína antifungal de A. giganteus y 58% de identidad de secuencia con la proteína antifungal de P. chrysogenum . Las SEQ ID NOs: 5 y 7 comparten aproximadamente 81% y 79% de identidad de secuencia con la proteína A. niger de función desconocida, respectivamente. Globalmente, las secuencias de polipéptido de la invención comparten aproximadamente 26-45% de identidad de secuencia con la proteína antifungal A. giganteus, aproximadamente 25-60% de identidad de secuencia con la proteína antifungal de P. chrysogenum, y aproximadamente 26-86% de identidad de secuencia con la proteína A. niger. Las tablas que resumen la identidad global y los datos de similitud se proporcionan en la Tabla ÍA y IB. La proteína antifungal A. giganteus causa i permeabilización de membranas de los hongos susceptibles y exhibe actividad antifungal potente contra los hongos fitopatogénicos Magnaporthe grísea y Fusarium moniliforme y el patógeno de oomicete Phytophthora infestans . Ver, por ejemplo, Vila y colaboradores, (2001) Mol . Plant . Microte Interact . 14:1327-31; Theis y colaboradores, (2003) Antimicrob . Agents Chemother. 47:588-93; y Meyer y colaboradores, (2003) J. Basic Microbiol . 43:68-74. Por otra parte el trigo transformado con la proteína antifungal A. giganteus muestra resistencia fungal incrementada a Erysiphe graminis y Puccinia recondi te . Ver, por ejemplo, Oldach y colaboradores, (2001) Mol . Plant . Microte Interact . 14:832-8. De manera similar, la proteína antifungal aislado de P. chrysogenum se ha mostrado que causa permeabilización de membrana y fuga iónica en ciertos iones y que inhibe el crecimiento de varios hongos y filamentosos. Ver, por ejemplo, Kaiserer y colaboradores, (2003) Arch . Microbiol . 180:204-10. Los ácidos nucleicos y polipéptidos de la presente invención encuentran uso en métodos para inducir resistencia a patógenos en una planta. Por consiguiente, las composiciones y métodos divulgados en la presente son utilizan la protección de plantas contra patógenos fúngales, virus, nemátodos y los similares. "Resistencia a patógenos" o "resistencia a enfermedades" se propone para dar entender que la planta evita los síntomas de enfermedad que son el efecto de las interacciones de planta-patógeno. Esto es, los patógenos son impedidos de causar enfermedades de plantas y los síntomas de enfermedad asociados, o alternativamente, los síntomas de enfermedad causados por el patógeno son minimizados o disminuidos, tal, por ejemplo, la reducción del estrés y la perdida de rendimiento asociado. Un experto en la técnica apreciará que las 'composiciones y métodos divulgados en la presente se pueden utilizar con otras composiciones y métodos disponibles en la técnica para proteger plantas del ataque de insectos y de patógenos. "Composiciones antipatogénicas" o "polipéptidos antipatogénicos" se proponen para dar a entender que las composiciones de la invención tienen actividad antipatogénica y de es está manera son capaces de suprimir, controlar y/o exterminar el. organismo patogénico invasor. Un polipéptido antipatogénico de la invención reducirá los síntomas de enfermedad que resultan de la estimulación por patógeno por al menos aproximadamente 5%, a aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 10%, a aproximadamente 60%, al menos aproximadamente 30%, a aproximadamente 70%, al menos aproximadamente 40%, a aproximadamente 80%, o al menos aproximadamente 50%, a aproximadamente 90% o más grande. Por consiguiente, los métodos de la invención se pueden utilizar para proteger plantas de enfermedad, particularmente aquellas enfermedades que son causadas por patógenos de plantas. En modalidades particulares, la actividad antipatogénica exhibida por los polipéptidos de la invención es la actividad antifungal. Como se utiliza en la presente, "actividad antifungal" se refiere la habilidad para suprimir, controlar y/o exterminar el patógeno fungal invasor. Del mismo modo, "resistencia fungal" se refiere a la tolerancia aumentada a un patógeno fungal cuando se compara con aquellas de una planta de tipo silvestre o no tratada. La resistencia puede variar de un incremento ligero en la tolerancia a los efectos del patógeno fungal (por ejemplo, inhibición parcial) a la resistencia total tal que la planta no es afectada por la presencia del patógeno fungal. ün nivel incrementado de resistencia contra un patógeno fungal particular o contra un espectro más amplio de patógenos fúngales puede tanto constituir la actividad antifungal o resistencia fungal mejorada.

Los ensayos que miden la actividad antipatogénica son comúnmente conocidos en la técnica, como son los métodos para cuantificar la resistencia de enfermedad en plantas después de la infección por patógeno. Ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,614,395, incorporada en la presente por referencia. Tales técnicas incluyen, la medición a tr vés del tiempo, el diámetro de lesión promedio, la biomasa de patógeno, y el porcentaje total de los tejidos de planta decaídos. Por ejemplo, una planta ya sea que exprese un polipéptido antipatogénico o que tiene una composición antipatogénica aplicada a su superficie muestra una disminución en la necrosis de tejido (es decir, diámetro de lesión) o una disminución en la muerte de la planta después de la estimulación con patógeno cuando se compara con una planta de control que no se expuso a la composición antipatogénica. Alternativamente, la actividad antipatogénica se puede medir mediante una disminución en la biomasa de patógeno. Por ejemplo, una planta que expresa un polipéptido antipatogénico o expuesta a una composición antipatogénica es estimulada con un patógeno de interés. A través del tiempo, las muestras de tejido de los tejidos inoculados con patógeno se obtienen y se extrae el RNA. El por ciento de un trascripto de RNA de patógeno específico con relación al nivel de un trascripto específico de planta permite que sea determinado el nivel de biomasa de patógeno. Ver, por ejemplo, Thomma y colaboradores, (1998) Plant Biology 95:15107-15111, incorporada en la presente por referencia. Además, los ensayos antipatogénicos in vitro incluyen, por ejemplo, la adición de concentraciones variables de la composición antipatogénica a discos de papel y la colocación de los discos en agar que contiene una suspensión de patógeno de interés. Después de la incubación, zonas de inhibición claras se desarrollan alrededor de los discos que contiene una concentración efectiva del polipéptido antipatogénico (Liu y colaboradores, (1994) Plant Biology 91:1888-1892, incorporada por la presente por referencia) . Adicionalmente, el análisis microexpectrofotométrico se puede utilizar para medir las propiedades antipatogénicas in vi tro de una composición (Hu y colaboradores, (1997) Plant Mol . Biol . 34:949-959 y Cammue y colaboradores, (1992) J. Biol . Chem . 267:2228-2233, ambas de las cuales son incorporadas en la presente por referencia) . Los ensayos que específicamente miden la actividad antifungal son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Duvick y colaboradores, (1992) J. Biol . Chem . 267:18814-18820; Lacadena y colaboradores, (1995) Arch . Biochem . Biophys . 324:273-281; Xu y colaboradores, (1997) Plant Mol Biol . 34:949-959; Lee y colaboradores, (1999) Biochem . Biophys . Res Comm . 263:646-651; Vila y colaboradores, (2001) Mol . Plant Microbe Interact . 14:1327-1331; Moreno y colaboradores, (2003) Phytpathol . 93:1344-1353; Kaiseres y colaboradores, (2003) Arch . Microbiol . 180:204-210; y la patente norteamericana No. 6,015,941. Las composiciones divulgadas en la presente comprenden ácidos nucleicos aislados que codifican polipéptidos antipatogénicos, casetes de expresión que comprenden las secuencias de nucleótidos de la invención y polipéptidos antipatogénicos aislados. También se proporcionan composiciones antipatogénicas que comprenden un polipéptido de la invención en combinación con un portador. La invención además divulga plantas y microorganismos transformados con ácido nucleicos que codifican proteínas antipatogénicas. Las composiciones encuentran uso en métodos para inducir resistencia a patógenos en una planta y para proteger a una planta de un patógeno, particularmente patógenos fúngales. En aspectos particulares, los métodos para inducir resistencia a patógenos en una planta comprenden introducir en una planta por lo menos un cásete de expresión, en donde el cásete de expresión comprende una secuencia de nucleótidos que codifican un polipéptido antipatogénico de la invención operablemente enlazada a un promotor que induce expresión en la planta. La planta expresa el polipéptido antipatogénico, para de esta manera exponer el patógeno al polipéptido en el sito de ataque del patógeno. En modalidades particulares, el polipéptido tiene actividad antifungal y el patógeno es un hongo, tal, por ejemplo, Colletotrichum graminicola , Diplodia maydis, Fusarium graminearum, o Fusarium verticillioides . La expresión de un polipéptido antipatogénico de la invención puede ser dirigida a tejidos de plantas específicos donde la resistencia a patógenos es particularmente importante, tal, por ejemplo, las hojas, raíces, tallos o tejidos vasculares. Tal expresión preferida de tejida puede ser realizada por promotores preferidos de raíz, preferidos de hoja, preferidos de tejido vascular, preferidos de tallo o preferidos de semillas. Además, los polipéptidos de la invención también pueden ser dirigidos a localizaciones subcelulares específicas dentro de una célula de planta o, alternativamente, secretados de la célula, como es descrito en la presente enseguida. Precisamente como la expresión de un polipéptido antipatogénico de la invención puede ser dirigida a tejido de plantas específicos o tipos de células a través del uso de promotores apropiados, este también puede ser dirigido a diferentes localizaciones dentro de la célula a través del uso de la información de dirección o "marcas de dirección". Distinto al promotor, que actúa en el nivel trascripcional, tal información de dirección es parte del producto de traducción inicial. Dependiendo del modo de infección del patógeno o la función metabólica del tipo de tejido o célula, la localización de la proteína en diferentes compartimientos de la célula puede hacerla más eficaz contra un patógeno dado o hacerla interferir menos con las funciones de las células. Por ejemplo., se puede producir una proteína precedida por un péptido de señal, que dirige el producto de traducción en el retículo endoplásmico al incluir en la construcción (es decir cásete de expresión) secuencias que codifican un péptido de señal (tales secuencias también pueden ser llamadas la "secuencia de señal") . La secuencia de señal podría ser, por ejemplo, una asociada con el gen que codifica el polipéptido, o puede ser tomada de otro gen. Existen muchos péptidos de señal descritos en la literatura, y ellos son grandemente intercambiables (Raikhel y Chrispeeis, "Protein sortin and vesicle traffic" in Buchanan y colaboradores, eds, (2000) Biochemistry and Molecular Biology of Plants (American Society of Plant Physiologists, Rockville, MD) , incorporada por la presente por referencia) . La adición de un péptido de señal dará por resultado que el producto de traducción que entra al retículo endoplásmico (en el proceso del cual el péptido de señal mismo es removido del polipéptido) , pero la localización intracelular final de la proteína depende de otros factores, que pueden ser manipulados para dar por resultado la localización más apropiada para el patógeno y el tipo de célula. La ruta de error, esto es, la ruta tomada por el polipéptido sí no se incluye otras marcas de dirección, da por resultado la secreción del polipéptido a través de la membrana de la célula (Raikhel y Chrispeeis, supra) en el apoplasto. El apoplasto es la externa del sistema de membrana de plasma e incluye paredes celulares, espacios intracelulares y los vasos de xilema que forman un sistema permeable continuo a través del cual puede moverse, el agua y los solutos. Este f ecuentemente será una localización adecuada. En modalidades particulares, una secuencia de nucleótidos que codifican un péptido de señal de alfa-amilasa de cebada (SEQ ID NO: 34) se une en la estructura con un polinucleótido de la invención. Ver, por ejemplo, las secuencias de nucleótidos expuestas en las SEQ ID NOs: 19, 21, 23, 25, 27, 29 y 31. Otros patógenos pueden ser más efectivamente combatidos al localizar el péptido dentro de la célula antes que afuera de la membrana de la célula. Esto se puede realizar, por ejemplo, al adicionar una secuencia de codificación de señal de retención de retículo endoplásmico a la secuencia del gen. Los métodos y secuencias para ser esto se describen en Raikhel y Chrispeeis, supra ; por ejemplo, la adición de secuencias que codifican los aminoácidos K; D; E y L en ese orden, o variaciones de las mismas descritas en la literatura, al final de la región de codificación de proteína del polipéptido realizará esto. La secuencias de retención ER son bien conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, KDEL (SEQ ID NO: 62), SEKDEL (SEQ ID NO: 63 ) , HDEL (SEQ ID NO: 64), y HDEF (SEQ ID NO: 65). Ver, por ejemplo, Denecke y colaboradores, (1992). EMBO J. 11:2345-2355; Wandelt y colaboradores, (1992) Plant J. 2:181-192; Denecke y colaboradores, (1993) J. Exp . Bot . 44:213-221; Vítale y colaboradores, (1993) J. Exp . Bot . 44:1417-1444; Gomord y colaboradores, (1996) Plant Physiol . Biochem . 34:165-181; Lehmann y colaboradores, (2001) Plant Physiol . 127 (2): 436-449. Alternativamente, el uso de las marcas de dirección vacuolar tales como aquellas descritas por Raikhel y Chrispeeis, supra , además del péptido de señal dará por resultado la localización del péptido en una estructura vacuolar. Como es descrito en Raikhel y Chrispeeis, supra , la marca de dirección vacuolar se puede colocar en diferentes posiciones en la construcción. El uso de una secuencia de codificación de péptido de transito de plásmido en lugar de una secuencia de codificación de un péptido de señal dará por resultado la. localización del polipéptido en la plástida de tipo de célula seleccionado (Raikhel y Chrispeeis, supra ) . Tales péptidos de transito son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Von Heijne y colaboradores, (1991) Plant Mol . Biol . Rep . 9:104-126; Clark y colaboradores, (1989) J. Biol . Chem . 264:17544-17550; Della-Cioppa y colaboradores, (1987) Plant Physiol . 84:965-968; Romer y colaboradores, (1993) Biochem . Biophys . Res . Commun 196:1414-1421; y Shah y colaboradores, (1986) Science 233:478-481. La secuencias de dirección de cloroplasto que codifican tales péptidos de transito también son conocidas en la técnica e incluyen la subunidad pequeña de cloroplasto de ribulosa-1, 5-bisfofato carboxilasas (Rubisco) (de Castro Silva Filho y colaboradores, (1996) Plant Mol . Biol . 30:769-780; Schnell y colaboradores, (1991) J. Biol . Chem . 266 (5) : 3335-3342) ; 5- (enolpiruvil) shikimato-3-fosfato sintasa (EPSPS) (Archer y colaboradores, (1990) J. Bioenerg. Biomemb . 22 (6) : 789-810) ; triptofano sintasa (Zhao y colaboradores, (1995) J. Biol . Chem . 270 (11) : 6081-6087) ; plastocianina, (Lawrence y colaboradores, (1997) J. Biol . Chem . 272 (33) : 20357-20363) : coris ato sintasa (Schmidt y colaboradores, (1993) J. Biol . Chem . 268 (36) : 27447-274557) ; y la proteína de enlace a/b de clorofila de recolección de luz (LHBP) (Lamppa y colaboradores, (1988) J. Biol . Chem . 263:14996-14999). También se podría contemplar la localización del polipéptido en otros compartimientos celulares mediante la adición de la información de dirección adecuada. (Raikhel y Chrispeeis, supra ) . Un sitio útil disponible en la red mundial que proporciona información y referencias que consideran el reconocimiento de varias secuencias de dirección se pueden encontrar en: psort . nibb. ac. jp/ruit . Otras referencias que consideran el estado de la técnica de dirección de proteína incluyen, Silva-Filho (2003) Curr. Opin . Plant Biol . 6:589-595; Nicchitta (2002) Curr . Opin . Cell Biol . 14:412-416; Bruce (2001)' Biochim Biophys Acta 1541: 2-21; Hedlington & Denecke (2000) Curr. Opin . Plant Biol . 3 : 461-468; Emanuelsson y colaboradores, (2000) J Mol . Biol . 300: 1005-1016; E anuelsson & Von Heijne (2001) Biochim Biophys Acta 1541: 114-119, incorporadas en la presente por referencia. Las composiciones de la invención encuentran uso adicional en métodos dirigidos a proteger una planta de un patógeno. "Protección a una planta de un patógeno" se propone para dar entender la exterminación del patógeno o la prevención o limitación de la formación de enfermedad en una planta. En algunas modalidades como una composición antipatogénica que comprende un polipéptido antipatogénico y un portador se aplica directamente al medio ambiente de un patógeno de planta, tal, por ejemplo, sobre una planta o en la tierra u otro medio de crecimiento que circunda las raíces de la planta con el fin de proteger la planta del ataque de patógeno. Además se proporcionan microorganismos transformados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína antipatogénica de la invención y métodos para usar estos para proteger a una planta de un patógeno. En algunas modalidades, el microorganismo transformado se aplica directamente a una planta o a la tierra en la cual crece una planta. Como se utiliza en la presente, "ácido nucleico" incluye en la referencia a un desoxirribonucleótido o polímeros de ribonucleótido en forma de ya sea de una sola o doble hebra, y a menos que se limite de otra manera, comprende análogos conocidos (por ejemplo, ácidos nucleicos de péptido) que tienen la naturaleza esencial de los nucleótidos naturales en que hibridan a ácidos nucleicos de una sola hebra de una manera similar de los nucleótidos que ocurren naturalmente. Los términos "polipéptido", "péptido", y "proteína", se utilizan intercambiablemente en la presente para referirse a un polímero de residuos de aminoácidos. Los términos se aplican a polímeros de aminoácidos en los cuales uno o más residuos de aminoácidos es un análogo químico artificial de un aminoácido que ocurre naturalmente correspondiente, así como a polímeros de aminoácidos que ocurren naturalmente. Los polipéptidos de la invención se pueden producir ya sea de un ácido nucleico divulgado en la presente, o mediante el uso de técnicas de biología molecular estándares. Por ejemplo, una proteína truncada de la invención se puede producir mediante la expresión de un ácido nucleico recombinante de la invención en una célula hospedera apropiada, o alternativamente mediante una combinación de procedimientos ex vivo, tal como la digestión y purificación de proteasa. Como se utiliza en la presente, los términos "que codifica" o "codificado" cuando se utilizan en el contexto de un ácido nucleico específico significan que el ácido nucleico comprende la información necesaria para dirigir la traducción de la secuencia de nucleótidos a una proteína específica. La información mediante la cual una proteína es codificada es especificada por el uso de codones. Una molécula de ácido nucleico que codifica una proteína puede comprender secuencias no traducidas (por ejemplo, intrones) dentro de las regiones traducidas del ácido nucleico o pueden carecer de tales secuencias no traducidas de intervención (por ejemplo, como en cDNA) . La invención comprende composiciones de polinucleótido o de proteína aisladas o sustancialmente purificadas. Un polinucleótido o proteína, "aislado" o "purificado", o porción biológicamente activo del mismo, está sustancialmente o esencialmente libres de componentes que normalmente acompañan o interactúan con el polinucleótido o proteica como se encuentra en su medio ambiente en que ocurren naturalmente. Así, un polinucleótido o proteína aislado o purificado está sustancialmente libre de otro material celular, o medio de cultivo cuando se produce mediante técnicas recombinantes o sustancialmente libre de precursores químicos u otros químicos cuando se sintetizan químicamente. Óptimamente, un polinucleótido "aislado" esta libre de secuencias (óptimamente secuencias de codificación de proteínas) que naturalmente flanquean al polinucleótido (es decir secuencias localizadas en los extremos 5' y 3' del polinucleótido) en el DNA genómico del organismo del cual se deriva el polinucleótido. Por, ejemplo, en varias modalidades el polinucleótido aislado puede contener menos de aproximadamente 5 Kb, 4 Kb, 3 Kb, 2 Kb, 1 Kb, 0.5 Kb, o 0.1 Kb de secuencia de nucleótidos que naturalmente flanquea el polinucleótido en el DNA genómico de la célula de la cual se deriva el polinucleótido. Una proteína que está sustancialmente libre de material celular incluye preparaciones de proteína que tiene menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% o 1% (en peso seco) de proteína contaminante. Cuando la proteína de la invención o una proporción biológicamente activa de la misma es recombinantemente producida, el medio de cultivo óptimamente representa menos de aproximadamente 30%, 20%, 10%, 5% o 1% (en peso seco) de precursores químicos o sustancias químicas no de interés para la proteína. Los fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos divulgadas y proteínas codificadas de esta manera también están comprendidos por las modalidades. "Fragmento" se propone para dar entender una porción de la secuencia de nucleótidos o una porción de la secuencia de aminoácidos y por consiguientes la proteína codificada de tal manera. Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden codificar fragmentos de proteína que retienen la actividad biológica de la proteína nativa, y por consiguiente tienen actividad antifungal. Alternativamente, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos que son útiles como sondas de hibridación generalmente no codifican proteínas de fragmento que retienen la actividad biológica. Así, los fragmentos de una secuencia de nucleótidos pueden variar de por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos, aproximadamente 50 nucleótidos, aproximadamente 100 nucleótidos, y hasta la secuencia de nucleótidos de longitud completa que codifica los polipéptidqs de la invención. Un fragmento de una secuencia de nucleótidos que codifica una porción biológicamente activa de un polipéptido antifungal de las modalidades codificará por lo menos 15, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 o 100 aminoácidos contiguos, o hasta el número total de aminoácidos presentes en un polipéptido antifungal de longitud completa de longitud completa de la invención (por ejemplo, 55 aminoácidos para la SEQ ID NO: 1) . Los fragmentos de una secuencia de nucleótidos que son útiles como sondas de hibridación o cebadores de PCR generalmente necesitan no codificar una porción biológicamente activa de una proteína antipatogénica. Como se utiliza en la presente, "secuencia de longitud completa" en referencia a un polinucleótido especificado significa que tiene la secuencia de ácido nucleico completa de una secuencia nativa. "Secuencia nativa" se propone para dar a entender una secuencia endógena, es decir, una secuencia no diseñada encontrada en el genoma de un organismo. Así, un fragmento de una secuencia de nucleótidos de la invención puede codificar una porción biológicamente activa de un polipéptido antipatogénico, o puede ser un fragmento que puede ser utilizado como una sonda de hibridación o cebador de PCR . utilizando los métodos divulgados enseguida. Una porción biológicamente activa de un polipéptido antipatogénico se puede preparar al aislar una porción de una de las secuencias de nucleótidos de las modalidades que expresan la porción codificada de la proteína antipatogénica (por ejemplo, mediante la expresión recombinante in vitro) , y al estimar la actividad de la porción codificada de la proteína antifungal. Las moléculas de ácido nucleico que son fragmentos de una secuencia de nucleótidos de las modalidades comprenden por lo menos 15, 20, 50, 75, 100 o 150 nucleótidos contiguos o hasta el número de nucleótidos presentes en una secuencia de nucleótidos de longitud completa divulgada en la presente. "Variantes" se propone para dar a entender secuencias sustancialmente similares. Para polinucleótidos, una variante comprende una supresión y/o adición de uno o más nucleótidos en uno o más sitios internos dentro del polinucleótido nativo y/o una sustitución de una o más nucleótidos en uno más sitios en el polinucleótido nativo. Como se dice en la presente, un polinucleótido o polipéptido "nativo" comprende una secuencia de nucleótidos que ocurren naturalmente o secuencias de aminoácidos, respectivamente. Un experto en la técnica reconocerá que las variantes de las secuencias de ácido nucleico de las modalidades serán construidas tal que la estructura de lectura abierta es mantenida. Para polinucleótidos, las variantes conservativas incluyen aquellas secuencias que, debido a la degeneración del código genético, codifican las secuencias de aminoácidos de los polipéptidos antipatogénicos de las modalidades. Las variantes alélicas que ocurren naturalmente tales como estas pueden ser identificadas con el uso de las técnicas de biología molecular bien conocidas, como, por ejemplo, con la reacción de cadena de polimerasa (PCR) y las técnicas de hibridación como se resumen enseguida. Los polinucleótidos variantes también incluyen polinucleótido sintéticamente derivados, tales como aquellos generados por ejemplo, al utilizar la mutagénesis dirigida al sitio pero que todavía codifica una proteína antipatogénica de las modalidades. Generalmente, -las variantes de un polinucleótido particular de las modalidades tendrán por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia a ese polinucleótido particular como es determinado con los programas de alineación de secuencias y los parámetros descritos en otra parte en la presente. Las variantes de un polinucleótido particular de las modalidades (es decir, el polinucleótído de referencia) también se pueden evaluar mediante la comparación del por ciento de identidad de secuencia entre el polipéptido codificado por ' un polinucleótido variante y el polipéptido codificado por el polinucleótido de referencia. Así, por ejemplo, un polinucleótido aislado que codifica un polipéptido con un por ciento de identidad de secuencia dado a los polipéptidos de la SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, y 9 son divulgados. El por ciento de identidad de secuencia entre cualquiera de dos polipéptidos se puede calcular utilizando programas de alineación de secuencia y parámetros descritos en otra parte en la presente. Donde cualquier par dado de polinucleótidos de las modalidades se evalúan mediante la comparación del por ciento de identidad de secuencia compartido por los dos polipéptidos ellos codifican, el por ciento de identidad de secuencia entre los polipéptidos codificados es de por lo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia.

Proteína "variante" se propone para dar a entender una proteína derivada de la proteína nativa mediante la supresión o adición de uno o más aminoácidos en uno más sitios internos en la proteína nativa y/o sustitución de uno o más aminoácidos en uno o más sitios de la proteína nativa. Las proteínas variantes comprendidas por las modalidades son biológicamente activas, esto es continúan presentando la actividad biológica deseada de la proteína nativa, esto es, la actividad antifungal como es descrito en la presente. Tales variantes pueden resultar de, por ejemplo, el polimorfismo genético o de la manipulación humana. Las variantes biológicamente activas de una proteína antifungal nativa de las modalidades tendrá por lo menos aproximadamente 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más identidad de secuencia a la secuencia de aminoácido de la proteína nativa como es determinado por los programas de alineación de secuencias y los parámetros descritos en otra parte en la presente. Una variante biológicamente activa de una proteína de las modalidades puede diferir de esa proteína por tan pocos como 1-15 residuos de aminoácidos, tan pocos como 1-10, tales como 6-10, tan pocos como 5, tan pocos como 4, 3, 2, o un 1 un residuo de aminoácido. Las proteínas de las modalidades se pueden alterar de varias maneras incluyendo las sustituciones, supresiones, truncamientos e inserciones de aminoácidos. Los métodos para tales manipulaciones son generalmente conocidos en la técnica. Por ejemplo, las variantes y fragmentos de la secuencia de aminoácidos de las proteínas antifungales se pueden preparar mediante mutaciones en el DNA. Los métodos para la mutagénesis y alteraciones de polinucleótidos son bien conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Kunkel (1985) Proc. Na ti . Acad. Scí . USA 82:488-492; Kunkel y colaboradores, . (1987) Methods ín Enzymol . 154:367-382; patente norteamericana No. 4,873,192; Walter y Gaastra, eds. (1983) Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, New York) y las referencias citadas en las mismas.

La guía en cuanto la sustitución de aminoácidos apropiadas que no afectan la actividad biológica de la proteína de interés se pueden encontrar el modelo de Dayhoff y colaboradores, (1978) Atlas of Protein Sequence and Structure (Nati. Biomed. Res. Found, Washington, D.C.), incorporada en la presente por referencia. Las sustituciones conservativas, tal como el intercambio de un aminoácido con otro que tiene propiedades similares, pueden ser óptimas. Así, los genes y polinucleótidos de las modalidades incluyen tanto las secuencias que ocurren naturalmente así como formas mutantes. Del mismo modo, las proteínas de las modalidades comprenden proteínas que ocurren naturalmente, así como variaciones y formas modificadas de las mismas. Tales variantes continuarán presentando la actividad antipatogénica, particularmente antifungal, deseada. Obviamente, las mutaciones que serán hechas en el DNA que codifica la variante no deben colocar la secuencia fuera de la estructura de lectura y óptimamente no crearán regiones complementarias que podrían, producir estructura de mRNA secundaria. Ver, la patente Europea No. 007544. En la naturaleza, algunos polipéptidos se producen como precursores complejos que, además de las marcas de dirección tales como los péptidos de señal discutidos en otra parte en esta solicitud, también contienen otros fragmentos o péptidos que son removidos (procesados) en algún punto durante la maduración de la proteína, dando por resultado una forma madura del polipéptido que es diferente del producto de traducción primaria (además de la remoción del péptido de señal) . "Proteína madura" se refiere a un polipéptido 'post-traduccionalmente procesado; es decir, uno del cual cualquiera de los pre-o propéptidos presentes en el producto de traducción primaria se ha removido. "Proteína precursora" o "prepropéptido" o "preproproteínas" todos se refieren al producto primario de traducción de mRNA; es decir, con pre- y propéptidos todavía presentes. El pre- y propéptidos pueden incluir, pero no están limitados a, señales de. localiza'ción intracelulares. "Pre" en esta nomenclatura generalmente se refiere al péptído de señal. La forma del producto de traducción con solamente el péptido de señal removido pero sin procesamiento adicional todavía es llamado un "prepropéptido" o "proproteína". Los fragmentos o seguimientos que son removidos pueden ser por sí mismos también referidos como "propéptidos". Una proproteína o propéptido así ha tenido el péptido de señal removido, pero contiene propéptidos (aquí con referencias a segmentos de propéptidos) y las porciones que constituirán la proteína madura. La persona experta es capaz de determinar, dependiendo de la especie en la cual las proteínas están siendo expresadas y la localización intracelular deseada, sin niveles de expresión más altos podría ser obtenidos al utilizar una construcción de gen que codifica precisamente la forma madura de la proteína, la forma madura con un péptido de señal, o la proproteína (es decir, una forma que incluye propéptido) con un péptido de señal. Para expresión óptima en plantas u hongos, se pueden necesitar secuencias de pre- y propéptido. Los segmentos de propéptido pueden desempeñar una función en ayudar al plegamiento con el péptido correcto. Las supresiones, inserciones, y sustituciones de las secuencias de las proteínas comprendidas en la presente no se esperan que produzcan cambios radicales en las características de la proteína. Sin embargo, cuando es difícil predecir el efecto exacto de la sustitución, supresión o inserción por adelantado haciéndolo de esta manera, un experto en la técnica apreciará que el efecto será evaluado mediante los ensayos de clasificación de rutina. Esto es, la actividad se puede evaluar mediante ensayos que miden la actividad antipatogénica tales como, por ejemplo, ensayos de placa antifungal y otros métodos descritos en otra parte en esta descripción. Ver, por ejemplo, Duvick y colaboradores. (1992) J. Biol . Chem . 267:18841-18820, incorporada en la presente por referencia. Los polinucleótidos y proteínas variantes * también comprenden secuencias y proteínas derivadas de un • procedimiento mutagénico y recombinogénico tal como el entremezclado de DNA. Con tal procedimiento, una o más secuencias de codificación de proteína antifungales diferentes se pueden manipular para crear una nueva proteína antifungal que posee las propiedades deseadas. De esta manera, librerías de polinucleótidos recombinantes se generan de una población de polinucleótidos de secuencia relacionada que comprende regiones de secuencias que tienen identidad de secuencia sustancial y pueden ser homólogamente recombinadas in vitro o in vivo . Por ejemplo, utilizando este procedimiento, las porciones de secuencia que codifican un dominio de interés pueden ser entremezcladas entre el gen que codifica una -proteína antífungal de las modalidades y otros genes conocidos que codifican proteínas antifungales para obtener una nueva codificación de gen para una proteína con una propiedad mejorada de interés, tal como la actividad antifungal incrementada. Las estrategias para tal entremezclado de DNA son conocidas en la técnica. Ver, por ejemplo, Steiraner (1994) Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 911:10751; Stemmer (1994) Na ture 370:389-391; Crameri y colaboradores, (1997) Nature Biotech . 15:436-438; Moore y colaboradores, (1997) J. Mol . Biol . 272:336-347; Zhang y colaboradores, (1997) Proc . Nati . Acad. Sci EUA 94:4504-4509; Crameri y colaboradores, (1998) Na ture 391:288-291; y las patentes norteamericanas Nos. 5,605,793 y 5,837,458. Los polinucleótidos de la invención se pueden utilizar para aislar secuencias correspondientes de otros organismos, particularmente otro microorganismo, más particularmente otros hongos. De esta manera, métodos tales como PCR, hibridación y los similares se pueden utilizar para identificar tales secuencias basadas en su homología de secuencia a las secuencias expuestas en la presente. Las secuencias aisladas, basadas en su identidad de secuencia a las secuencias completas expuestas en la presente o variantes o fragmentos de las mismas están comprendidas por las modalidades. Tales secuencias incluyen secuencias que son ortólogas de las secuencias divulgadas. "Ortólogos" se proponen para dar entender genes derivados de un gen ancestral común y que se encuentran en diferentes especies como un resultado de la especiación. Los genes encontrados en diferentes especies se consideran ortólogos cuando sus secuencias de nucleótidos y/o sus secuencias de proteínas codificadas" comparten por lo menos 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o identidad de secuencia más grande. Las funciones de los ortólogos son de manera frecuente altamente conservadas entre las especies. Así, los polinucleótidos aislados que codifican para una proteína antipatogénica, particularmente antifungal, y que hibridan bajo condiciones severas a las secuencias divulgadas en la presente, variantes o fragmentos de la misma, están comprendidos por la presente invención. En un procedimiento de PCR, los cebadores de oligonucleótido se pueden diseñar para el uso en reacciones de PCR para amplificar secuencias de DNA correspondientes a partir del cDNA o DNA genómico extraído de cualquier organismo de interés. Los métodos para diseñar cebadores de PCR y la clonación de PCR son generalmente conocidos en la técnica y son divulgados en Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: .A- Laboratory Manual (2d ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York)'. Ver también Innis y colaboradores, eds. (1990) PCR Protocols : A Guide to Methods y Applica tions (Academic Press, New York) ; e Innis y Gelfand eds. (1995) PCR Stra tegies (Academic Press, New Cork); e Innis y Gelfand, eds. (1999) PCR Methods Manual (Academic Press, New York) . Los métodos conocidos de PCR incluyen, pero no están limitados a, métodos utilizando cebadores por pares, cebadores empalmados, cebadores específicos individuales, cebadores degenerados, cebadores específicos de gen, cebadores específicos de vector, cebadores parcialmente desigualados y los similares. En las técnicas de hibridación, todo o parte de un polinucleótido conocido se utiliza como una sonda que selectivamente ' hibrida a otros polinucleótidos correspondientes presentes en una población de fragmentos de DNA genómico clonados o fragmentos de cDNA (es decir, librerías genómicas o de cDNA) a partir de un organismo seleccionado. Las sondas de hibridación pueden ser fragmentos de DNA. genómico, fragmentos de cDNA, fragmentos de RNA u otros oligonucleótidos y pueden ser marcadas con un grupo detectable tal como 32p, o cualquier otro marcador detectable. Así, por ejemplo, las sondas para hibridación se pueden hacer al marcar oligonucleótidos sintéticos basados en los polinucleótidos de las modalidades . Los métodos para la preparación de sondas para la hibridación y para la construcción de librerías de cDNA y genómicas son generalmente conocidos en la técnica y son divulgados en Sambrook y colaboradores, (1989) Molecular Cloning: A Labora tory Manual (2d ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, New York) . Por ejemplo, un polinucleótido completo divulgado en la presente, o una o más porciones del mismo, se puede utilizar como una sonda capaz de hibridar específicamente a polinucleótidos correspondientes y RNAs mensajeros. Para lograr la hibridación especifica bajo una variedad de condiciones, tales sondas incluyen secuencias que son únicas entre las secuencias de polinucleótido antifungales y son óptimamente de por lo menos aproximadamente 10 nucleótidos en longitud, y más óptimamente por lo menos aproximadamente 20 nucleótidos en longitud. Tales sondas se pueden utilizar para amplificar polinucleótidos correspondiente de un organismo seleccionado mediante PCR. Esta técnica se puede utilizar para* aislar secuencias de codificación adicionales de un organismo deseado o como un ensayo de diagnóstico para determinar la presencia de secuencia de codificación en un organismo. Las técnicas de hibridación incluyen la clasificación de hibridación de librerías de DNA en placas (ya sea placas o colonias, ver, por ejemplo, Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Labora tory Manual (2d ed. Cold, Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York) . La hibridación de tales secuencias se puede llevar a cabo bajo condiciones severas. "Condiciones severas" o "condiciones de hibridación severas" se proponen para dar a entender condiciones bajo las cuales una sonda hibridará a su secuencia objetivo a un grado detectablemente más grande que a otras secuencias (por ejemplo, por lo menos dos veces sobre el antecedente) . Las condicione severas son dependientes de la secuencia y serán diferentes en diferentes circunstancias. Al controlar la severidad de la hibridación y/o las condiciones de lavado, se pueden identificar secuencias objetivo que son 100% complementarias a las sondas (sondeo homólogo) . Alternativamente, las condiciones de severidad se pueden ajustar para permitir una desigualación en las secuencias de modo que grados menores de similitud son detectados (sondeo heterólogo) . Generalmente, una sonda es de menos de aproximadamente 1000 nucleótidos en longitud, óptimamente menos de 500 nucleótidos en longitud. Típicamente, -las condiciones severas serán aquellas en las cuales la concentración de sal es de menos de aproximadamente 1.5 M de ion Na, típicamente de manera aproximada 0.01 a 1.0 M de concentración de ion Na (u otras sales) en pH 7.0 a 8.3 y la temperatura es de por lo menos aproximadamente 30 °C para sondas cortas (por ejemplo 10 a 50 nucleótidos) y por lo menos aproximadamente 60 °C para sondas largas (por ejemplo mayor que 50 nucleótidos) . Las condiciones severas también se pueden lograr con la adición de agentes desestabilizantes tal como formamida. Las condiciones de baja severidad ejemplares incluyen la hibridación con una solución reguladora de formamida al 30 al 35%, NaCl 1 M, SDS al 1% (dodecil sulfato de sodio) a 37°C, y un lavado IX a 2X SSC (20X SSC = NaCl 3.0 M/citrato de trisodio 0.3 M) a 50 a 55°C. Las condiciones de severidad moderada ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 40 a 45%, NaCl 1.0 M, SDS al 1% a 37°C y un lavado en 0.5X a lx SSC a 55 a 60°C. Las condiciones de alta severidad ejemplares incluyen la hibridación en formamida al 50%, NaCl, SDS al 1% a 37°C, y un lavado final 0. IX SSC a 60 a 65°C por al menos 30 minutos. Opcionalmente, las soluciones reguladoras de lavado pueden comprender aproximadamente 0.1% a aproximadamente 1% SDS. La duración de hibridación es generalmente menor que aproximadamente 24 horas, de manera usual aproximadamente 4 a aproximadamente 12 horas. La duración del tiempo de lavado será de por lo menos una duración de tiempo suficiente para alcanzar el equilibrio. La especificidad es típicamente la función de los lavados de post-hibridación, los factores críticos que son la intensidad iónica y la temperatura de la solución de lavado final-. Para híbridos de DNA-DNA, el punto de fusión térmico (Tm) puede ser aproximado de la ecuación de Meinkoth y Wahl (1984) Anal . Biochem . 138:267-284: Tm =81.5°C+16.6 (log M)+0.41 (%GC) - 0.61 (%form) -500/L; donde M es la molaridad de cationes monovalentes, % GC es el porcentaje de los nucleótidos guanosina y citosina en el DNA, % form es el porcentaje de formamida en la solución de hibridación, y L es la longitud del híbrido en pares de bases. La Tm es la temperatura (bajo intensidad iónica de definida y pH) en la cual 50% de una secuencia objetivo complementaria hibrida a una sonda perfectamente igualada. Tm se reduce por aproximadamente 1°C por cada 1% de desigualación; así, Tm, hibridación y/o las condiciones de lavado se pueden ajustar para hibridar las secuencias de la identidad deseada. Por ejemplo, sí las secuencias con =90% de identidad son buscadas, la Tm puede ser disminuida 10 °C. Generalmente, las condiciones severas se seleccionan para ser de aproximadamente 5°C menor que la Tm para la secuencia especifica y su complemento en una intensidad iónica definida y pH. Sin embargo, las condiciones severamente severas puede utilizar una hibridación y/o lavado en 1, 2, 3, o 4°C menor que la Tm; las condiciones moderadamente severas puede utilizar una hibridación y/o lavado en 6, 7, 8, 9, o 10°C menor que la ,Tm; las condiciones de baja severidad puede utilizar una hibridación y/o lavado en 11, 12, 13, 14, 15, o 20°C menor que la Tm. Utilizando la ecuación, las composiciones de hibridación y de lavado, y la Tm deseada, aquellos expertos ordinarios entenderán que las variaciones en la severidad de hibridación y/o soluciones de lavado son inherentemente descritos. Si el grado deseado de desigualación da por resultado una Tm de menos de 45°C (solución acuosa) o 32°C (solución de formamida), es óptimo incrementar la concentración de SSC de modo que se puede utilizar una temperatura más alta. Una guía extensiva para la hibridación de secuencias de ácido nucleico se encuentra en Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry y Molecular Biology— Hibridization With Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 (Elsevier, New York) ; y Ausubel y colaboradores, eds. (1995) Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2 (Greene Publishing y Wiley-Intercience, New York) . Ver Sambrook y colaboradores (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2d ed. Cold, Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York) . Los siguientes términos se utilizan para describir las relaciones de secuencia entre dos o más polinucleótidos o polipéptidos: (a) "secuencia de referencia", (b) "ventana de comparación", (c) "identidad de secuencia", (d) "porcentaje de identidad de secuencia". (a) Como se utiliza en la presente, "secuencia de referencia" es una secuencia definida utilizada como una base para la comparación de secuencia. Una secuencia de referencia puede ser subconjunto o la totalidad de una secuencia específica; por ejemplo, como un segmento de un cDNA de longitud completa o secuencia de gen, o es cDNA completo o secuencia de gen. (b) Como se utiliza en la presente, "ventana de comparación" hace referencia a un segmento contiguo y específico de una secuencia de polinucleótido, en donde la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir espacios) comparada a la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de los dos polinucleótidos. Generalmente,, la ventana de comparación es de por lo menos 20 nucleótidos contiguos en longitud, y opcionalmente puede ser de 30, 40, 50, 100, o más larga. Aquellos expertos en la técnica entienden que para evitar una alta similitud a una secuencia de referencia debido a la inclusión de espacios en la secuencia de polinucleótido, una sanción de espacio es típicamente introducida y es substraída del número de igualaciones . Los métodos de alineación de secuencias para comparación son bien conocidos en la técnica. Así, la determinación del por ciento de identidad de secuencia entre cualquiera de dos secuencias se puede realizar utilizando un algoritmo matemático. Ejemplos no limitativos de tales algoritmos matemáticos son el algoritmo de Myers y Miller (1988) CABIOS 4:11-17; el algoritmo de alineación local de Smith y colaboradores, (1981) ' Adv. Appl . Math . 2:482; el algoritmo de alineación global de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol . Biol . 48:443-453; el método de búsqueda para alineación local de Pearson y Lipman (1988) . Proc . Nati . Acad. Sci . 85:2444-2448; el algoritmo de Karlin y Altschul (1990) Proc . Nati . Acad. Sci . EUA 872264, modificado como en Karlin y Altschul (1993) Proc . Nati . Acad. Sci EUA 90:5873-5877. Las implementaciones en computadora de estos algoritmos matemáticos se pueden utilizar para comparación de secuencias para determinar la identidad de secuencia. Tales implementaciones incluyen, pero no están limitadas a: CLUSTAL en el programa PC/Gene (disponible de Intelligenetics, Mountain View, California); el programa ALIGN (Versión 2.0) y GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, y TFASTA en el Paquete de Software de W sconsin Genetics GCG, Versión 10 (disponible de Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, California, USA) . Las alineaciones utilizando estos programas se pueden realizar utilizando los parámetros de error. El programa CLUSTAL es bien conocido por Higgins (1988) Gene 73:237-244 (1988); Higgins y colaboradores (1989) CABIOS 5: 151-153; Corpet y colaboradores (1988) Nucleic Acids Res . 16:10881-90; Huang y colaboradores (1992) CABIOS 8: 155-65; y Pearson y colaboradores (1994) Meth . Mol . Biol . 24:307-331. El programa ALIGN está basado en el algoritmo de Myers y Miller (1988) supra. Una tabla de residuo ponderado PAM120, una sanción de longitud de espacio de 12 y una sanción de espacio de 4 se puede utilizar con el programa ALIGN cuando se comparan secuencias de aminoácidos. Los programas BLAST de Altschul y colaboradores (1990) J. Mol . Biol . 215:403 están basados en el algoritmo de Karlm y Altschul (1990) supra . Las búsquedas de nucleótidos BLAST se pueden realizar con el programa BLASTN, registro = 100, longitud de palabra = 12, para obtener secuencias de nucleótidos homologas a una secuencia de nucleótidos que codifica una proteína de las modalidades. Las búsquedas de proteína BLAST se pueden realizar en el programa BLASTX, registro = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a una proteína o polipéptido de la invención. Para obtener alineaciones espaciadas para propósitos de comparación, Gapped BLAST (en BLAST 2.0) se puede utilizar como es descrito en Altschul y colaboradores (1997) Nucleic Acids Res . 25:3389.

Alternativamente, PSI-BLAST (en BLAST 2.0) se puede utilizar para realizar una búsqueda iterada que detecta relaciones distantes entre las moléculas. Ver Altschul y colaboradores (1997) supra . Cuando se utiliza BLAST, Gapped BLAST y PSI-BLAST, los parámetros de error de los programas respectivos (por ejemplo, BLASTN para secuencias de nucleótidos, BLASTX para proteínas) pueden ser utilizadas. Ver www.ncbi.nlm.nih.gov. La alineación también se puede realizar manualmente mediante inspección. A menos que se establezca de otra manera, los valores de identidad de secuencia/similitud proporcionados en la presente se refieren al valor obtenido utilizando GAP Versión 10 utilizando los siguientes parámetros: % de identidad y % de similitud para una secuencia de nucleótidos utilizando la Ponderación de Gap de 50 y Ponderación de Longitud de 3, y la matriz de registro nwsgapdna . cmp; % de identidad y % de similitud para una secuencia de aminoácidos utilizando la Ponderación de Gap de 8 y Ponderación de Longitud de 2, y la matriz de registro BLOSUM62;< o cualquier programa equivalente del mismo. "Programa equivalente" se propone para dar a entender cualquier programa de comparación de secuencias que, para cualquiera de dos secuencias en cuestión, genera una alineación que tiene igualaciones de residuos de nucleótidos o de aminoácidos idénticas y un por ciento de identidad de secuencia idéntico cuando se compara con la alineación correspondiente generada mediante GAP Versión 10. GAP utiliza el algoritmo de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol . Biol . 48-443-453, para encontrar la alineación de dos secuencias completas que maximiza el número de igualaciones y minimiza el número de espacios. GAP considera todas las alineaciones posibles y las posiciones de espacio y crea la alineación con el número más grande de bases igualadas y los menores espacios . Esto permite la provisión de una sanción de creación de espacio y una sanción de extensión de espacio en unidades de bases igualadas. GAP debe hacer un aprovechamiento del número de sanción de creación de espacio de las igualaciones para cada espacio que este inserta. Si se selecciona una sanción de extensión de espacio mayor que cero, GAP, debe hacer, además un aprovechamiento para cada espacio insertado en la longitud de los tiempos de espacio de la sanción de extensión de espacio. Los valores de sanción de creación de espacio de error y los valores de sanción de extensión de espacio en Versión 10 del paquete de Software Wisconsin Genetics GCG para secuencias de proteína son 8 y 2, respectivamente. Para secuencias de nucleótidos la sanción de creación de espacio de error es de 50 mientras que la sanción de extensión de espacio de error es 3. 'Las sanciones de creación de espació de extensión de espacio se pueden expresar como un número entero seleccionado del grupo de números enteros que consiste de 0 a 200, Así, por ejemplo, las sanciones de creación de espacio de extensión de espacio pueden ser 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65 o más grande. GAP presenta un miembro de la familia de mejores alineaciones. Pueden haber muchos miembros de esta familia, pero ningún otro miembro tiene mejor calidad. GAP exhibe cuatro figuras de mérito para alineaciones: Calidad, Relación, Identidad y Similitud. La Calidad es la métrica maximizada con el fin de alinear las secuencias. La Relación es la Calidad dividida entre el número de bases en el segmento más corto. Por ciento de identidad es el por ciento de los símbolos que realmente se igualan. El por ciento de Similitud es el por ciento de los símbolos que son similares.

Los símbolos que están a través de los espacies son ignorados. Una similitud se registra cuando el valor de matriz de registro para un par de símbolos es mayor que o igual a 0.50, el umbral de similitud. La matriz de registro utilizada en la Versión 10 del Paquete de Software de Genética de Wisconsin GCG es BLOSUM62 (ver Henikoff y Henikoff (1989) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 89:10915). (c) Como se utiliza en la presente, "identidad de secuencia" o "identidad" en el contexto de dos secuencias de polinucleótidos o de polipéptido hace referencia a los residuos en las dos secuencias que son las mismas cuando se alinean para correspondencia máxima sobre una ventana de comparación especificada. Cuando el porcentaje de identidad de secuencia se utiliza en referencia a proteínas se reconoce que las posiciones de residuo que no son idénticas frecuentemente difieren por sustituciones de aminoácidos conservativas, donde los residuos de aminoácido son sustituidos por otros residuos de aminoácidos con propiedades químicas similares (por ejemplo, carga o hidrofobicidad) y por lo tanto no cambian las propiedades funcionales de la molécula. Cuando las secuencias difieren en sustituciones conservativas, el por ciento de identidad de secuencia se pueden ajustar hacia arriba para corregir la naturaleza conservativa de la sustitución. Las secuencias que difieren con tales sustituciones conservativas se dice que tienen "similitud de secuencia" o "similitud". Medios para hacer este ajuste son bien conocidos para aquellos expertos en la técnica. Típicamente este involucra registrar una sustitución conservativa como una desigualación parcial antes que completa, para de esta manera incrementar el porcentaje de identidad de secuencia. Así, por ejemplo, donde un aminoácido idéntico se le da un registro de 1 y una sustitución no conservativa se le da un registro de cero, una sustitución conservativa se le da un registro entre cero y 1. El registro de sustituciones conservativas se calcula, por ejemplo, como es implementado en el programa PC/GENE (Intelligenetics, Mountain View, California) . (d) Como se utiliza en la presente, "porcentaje de identidad de secuencia" significa el valor determinado al comparar dos secuencias óptimamente alineadas sobre una ventana de comparación, en donde la porción de la secuencia de polinucleótido en la ventana de comparación puede comprender adiciones o supresiones (es decir, espacios) como es comparado con la secuencia de referencia (que no comprende adiciones o supresiones) para la alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula al determinar el número de posiciones en el cual la base de ácido nucleico idéntico o residuo de aminoácido ocurre en ambas secuencias para producir el número de posiciones igualadas, al dividir el número de posiciones igualadas entre el número total de posiciones en la ventana de comparación, y al multiplicar el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia. El uso del término "polinucleótido" no se propone para limitar las modalidades a polinucleótidos que comprenden DNA. Aquellos de habilidad ordinaria en la técnica reconocerán que los polinucleótidos, pueden comprender ribonucleótidos y combinaciones de ribonucleótidos y desoxirribonucleótidos . Tales desoxirribonucleótidos y ribonucleótid.os incluyen tanto moléculas que ocurren naturalmente como análogos sintéticos. Los polinucleótidos de las modalidades también comprenden todas las formas de secuencias que incluyen, pero no limitadas a, formas de una sola hebra, formas de doble hebra y los similares. En algunas modalidades, además se proporcionan casetes de expresión que comprenden un promotor operablemente enlazado a una secuencia nucleótidos heteróloga de la invención que codifica un polipéptido antipatogénico. Los casetes de expresión de la invención encuentran uso en la generación de plantas transformadas, células de plantas y microorganismos y en la práctica de los métodos para inducir resistencia a patógenos divulgados en la presente. El cásete de expresión incluirá secuencias regulatorias de 5' y 3' operablemente enlazados a un polinucleótido de la invención. "Operablemente enlazados" se propone para dar entender un enlace funcional entre dos o más elementos. Por ejemplo, un enlace operable ante un polinucleótido de interés y una secuencia regulatoria (es decir un promotor) es un enlace funcional que permite la expresión del polinucleótido de interés. -Los elementos operablemente enlazados pueden ser contiguos o no contiguos. Cuando se utilizan con referencia a la unión de dos regiones de codificación de proteína, por operablemente enlazados se proponen que las regiones de codificación están en la misma estructura de lectura. El cásete adicionalmente puede contener por lo menos un gen adicional que es cotransformado en el organismo. Alternativamente, el (los) gen (es) adicional (es) se puede proporcionar en múltiples casetes de expresión. Tal cásete de expresión se proporciona con una pluralidad de sitios de restricción y/o sitios de precombinación para la inserción del polinucleótido que codifica un polipéptido antipatogénico que está bajo la regulación transcripcional de la regiones regulatorias . El cásete de expresión adicionalmente puede contener genes marcadores seleccionables. El cásete de expresión incluirá en la dirección ' -3' de transcripción, una región de iniciación transcripcional (es decir un promotor) , región de iniciación traduccional, un polinucleótido de invención, una región de terminación traduccional y, opcionalmente como una región de terminación transcripcional funcional en el organismo hospedero. Las regiones regulatorias (es decir promotores, regiones regulatorias transcripcionales y regiones de terminación tradicional) y/o polinucleótido de la invención pueden ser nativas/análogas a la célula hospedera o entre sí. Alternativamente, las regiones , regulatorias y/o el polinucleótidos de la invención pueden se heterólogas a la célula hospedera o entre sí.- Como se utiliza en la presente, "heterólogos" en referencia a una secuencia es una secuencia que se origina de una especia foránea, o, sí es de la misma especie, es sustancialmente modificada de su forma nativa en composición y/o sitio genómico mediante la intervención humana deliberada. Por ejemplo, un promotor operablemente enlazado a un polinucleótido heterólogo es de una especie diferente de especie de la cual se derivó el polinucleótido, o- sí es de la misma/análoga especie, uno o ambos están sustancialmente modificados de su forma original y/o sitio genómico, o en promotor no es el .promotor nativo -para el nucleótido operablemente enlazado. La región de terminación opcionalmente incluida puede ser nativa con la región de iniciación transcripcional, puede ser nativa con el polinucleótido de interés operablemente enlazado, puede ser nativo el hospedero de planta, o puede ser derivado de otra fuente (es decir foráneo heterólogos) al promotor, el polinucleótido de interés, el hospedero, o cualquier combinación de los mismos. Las • regiones de terminación convenientes están disponibles del plásmido Ti de A. tumefaciens, tal como las regiones de terminación de octopina sintasa y nopalina sintasa. Ver también Guerineau y colaboradores, (1991) Mol . Gen . Genet . 262:141-144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y colaboradores, (1991). Genes Dev. 5:141-149; Mogen y colaboradores, (1990) Plant Cell 2:1261-1272; Munroe y colaboradores, (1990) Gene 91:151-158; Bailas y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res . 17:7891-7903; y Joshi y colaboradores, (1987) Nucleic Acids Res . 15:9627- 9639. En modalidades particulares, se utiliza el terminador del gen inhibidor de proteasa de papa II (Pinll) . Ver, por ejemplo Keil y colaboradores, (1986) Nucí . Acids Res . 14:5641-5650; y An y colaboradores, (1989) Plan Cell 1:115- 122, incorporadas en la presente por referencias en su totalidad. Donde es apropiado, los polinucleótidos pueden ser optimizados para la expresión incrementada en el organismo transformado. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden ser sintetizado utilizando codones preferidos de -plantas par la expresión mejoradas. Ver, por ejemplo, Campbell y Gowri (1990) Plant Physíol . 92:1-11 para una discusión de la utilización de codón preferida por el hospedero. Los métodos son disponibles en la técnica para sintetizar genes preferidos de plantas. Ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,380,831, y 5,436,391, y Murria y colaboradores, (1989) Nucleic Acids Res . 17:477-498, incorporadas en la presente por referencia. Las modificaciones de secuencia adicionales se conocen que aumentan la expresión de gen en un hospedero celular. Estas incluyen la eliminación de secuencias que codifican señales de poliadenilación espurias, señales de sitio de empalme de exón-intrón, repeticiones similares a transposón y otras de tales secuencias bien caracterizadas que pueden ser perjudiciales en la expresión de gen. El contenido de G-C de la secuencia se puede ajustar a niveles promedio para un hospedero celular dado, como es calculado por referencia a genes conocidos expresados en la célula hospedera. Cuando es posible, la secuencia se modifica para evitar las estructuras de mRNA secundarias de horquilla predichas . Los casetes de expresión adicionalmente pueden contener secuencias guía 5' . Tales secuencias guía pueden actuar para aumentar la traducción. Las guías de traducción son conocidas en la técnica e incluyen: guías de picornavirus, por ejemplo, guía de EMCV (región de no codificación 5' de encefalomiocarditis) (Elroy-Stein y colaboradores, (1989) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 86:6126-6130); guías de potivirus, por ejemplo, guías de TEV (virus de Grabado de Tabaco) (Gallie y colaboradores, (1995) Gene 165 (2) : 233-238) , guías MDMV (Virus de Mosaico de Maíz Enano), y proteína de enlace de cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP) (Macejak y colaboradores, (1991) Na ture 353:90-94); guía no traducida del mRNA de proteína de recubrimiento del virus de mosaico de alfalfa (AMV RNA 4) (Jobling y colaboradores, (1987) Nature 325:622-625); guía de virus de mosaico de tabaco (TMV) (Gallie y colaboradores, (1989) in Molecular Biology of RNA, ed. Cech (Liss, New York), pp . 237-256) ; y guía de virus moteado clorótico de maíz (MCMV) (Lommel y colaboradores, (1991) - Virilogy 81:382-385). También ver, Della-Cioppa y colaboradores, (1987) Plant Physiol . 84:965-968. En la preparación del cásete de expresión, los diversos fragmentos de DNA pueden ser manipulados, para proporcionar las secuencias de DNA en la orientación apropiada y, como sea apropiado, en la estructura de lectura apropiada. Hacia este fin, los adaptadores o enlazadores pueden ser empleados para unir los fragmentos de DNA u otras manipulaciones pueden ser involucradas para proporcionar sitios de restricción convenientes, remoción de DNA de superfluo, remoción de sitios de restricción o los similares. Para este propósito, la mutagénesis in vitro, reparación de cebador, restricción, templado, resustituciones, transiciones y transv.ersiones, pueden ser involucradas. El cásete de expresión también puede comprender un gen marcador seleccionable para la selección de células transformadas. Los genes marcadores seleccionables se utilizan para la selección de células o tejidos trasformados . Los genes marcadores incluyen genes que codifican la resistencia a antibiótico, tales como aquellos que codifican neomicina fosfotransferasa II (NEO) e higromicina fosfotransferasa (HPT) , así como genes que confieren resistencia a compuestos herbicidas, tales como glufosinato amonio, bromoxinilo, imidazolinonas y 2,4-diclorofenoxiacetato (2,4-D). Marcadores seleccionables adicionales incluyen marcadores fenotípicos tales como proteínas de ß-galactosidasa y fluorescentes tal como la proteína fluorescente (GFP) (Su y colaboradores, (2004) Biotechnol Bíoeng 85:610-9 y Fetter y colaboradores, (2004) Plant Cell 16:215-28), proteína fluorescente de ciano (CYP) (Bolte y colaboradores, (2004) J. Cell Science 117:943-54 y Kato y colaboradores, (2002) Plant Physiol 129:913-42) , y proteína fluorescente amarilla (PhiYFP™ de Evrogen, ver, Bolte y colaboradores, (2004) J. Cell Science 117:943-54) . Para marcadores seleccionables adicionales, ver generalmente, Yarranton (1992) Curr. Opin . Biotech . 3:506-511; Christopherson y colaboradores, (1992) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 89:6314-6318; Yao y colaboradores, (1992) Cell 71:63-72; Reznikoff (1992) Mol . Microbiol . 6:2419-2422; Barkley y colaboradores, (1980) in The Operon , pp. 177-220; Hu y colaboradores, (1987) Cell 48:555-566; Brown y colaboradores, (1987) Cell 49:603-612; Figge y colaboradores, (1988) Cell 52:713-722; Deuschle y colaboradores, (1989) Proc . Nati . Acad. Aci . USA 86:5400-5404; Fuerst y colaboradores, (1989) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 86:2549-2553; Deuschle y colaboradores, (1990) Science 248:480-483; Gossen (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Reines y colaboradores, (1993) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 90:1917-1921; Labow y colaboradores, (1990) Mol . Cell . Biol . 10:3343-3356; Zambretti y colaboradores, (1992) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 89:3952-3956; Baim y colaboradores, (1991) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 88:5072-5076; Wyborski y colaboradores, (1991) Nucleic Acids Res . 19:4647-4653; Hillenand-Wissman (1989) Topics Mol . Struc . Biol . 10:143-162; Degenkolb y colaboradores, (1991) Antimicrob . Ágents Chemother. 35:1591-1595; Kleinschnidt y colaboradores, (1988) Biochemistry 27:1094-1104; Bonin (1993) Ph.D. Thesis, University of Heidelberg; Gossen y colaboradores, (1992) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 89:5547-5551; Oliva y colaboradores, (1992) Antimicrob . Agents Chemother. 36:913-919; Hlavka y colaboradores, (1985) Handbook of Experimental Pharmacology, Vol. 78 (Springer-Verlag, Berlín); Gilí y colaboradores, (1988) Na ture 334:721-724. Tales descripciones se incorporan en la presente por referencia. La lista anterior de genes marcadores seleccionables no se propone para ser limitativa. Cualquier gen marcador seleccionable puede ser utilizado en la presente invención. Un número de promotores pueden ser utilizados en la práctica de la invención, incluyendo el promotor nativo de la secuencia de polinucleótido de interés. Los promotores pueden ser seleccionados en base al efecto deseado. Una amplia gama de promotores de plantas se discute en la revisión reciente de Potenza y colaboradores, (2004) In Vi tro Cell Dev Biol -Plant 40 : 1-22, incorporado en la presente por referencia. Por ejemplo, los ácidos nucleicos pueden ser combinados con promotores constitutivos, preferidos de tejido, inducibles por patógeno u otros promotores para la expresión en plantas. Tales promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, el promotor de núcleo -del promotor de Rsyn 7 y otros promotores constitutivos divulgados en WO 99/43838 y la patente norteamericana No. 6,072,050; el promotor 35S de CaMV de núcleo (Odell y colaboradores, (1985) Nature 313:810-812); actina de arroz (McElroy y colaboradores, (1990) Plant Cell 2:163-171); ubiquitin (Christensen y colaboradores, (1989) Plant Mol . Biol . 12:619-632 y Christensen y colaboradores, (1992) Plant Mol . Biol . 18:675-689); pEMU (Last y colaboradores, (1991) Theor. Appl . Genet . 81:581-588); MAS (Velten y colaboradores, (1984) EMBO J. 3:2723-2730); promotor ALS (patente norteamericana No. 5,659,026), y los similares. Otros promotores constitutivos incluyen, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,608,149; 5,608,144, 5,604,121; 5,569,597; 5,466,785; 5,399,680; 5,268,463; 5,608,142 y 6,177,611. Generalmente, será benéfico expresar el gen de un promotor inducible, particularmente de- un promotor inducible por patógeno. Tales promotores incluyen aquellos de la proteína relacionadas a la patogénesis (proteínas PR) , que son inducidas después de la infección por un patógeno, por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-1, 3-glucanasa, quitinasa, etc. Ver, por ejemplo, Redolfi y colaboradores, (1983) Neth . J. Plant Pathol . .89:245-254; Uknes y colaboradores, (1992) Plant Cell 4:645-656; y Van Loon (1985) Plant Mol . Virol . 4:111-116. Ver también. WO 99/43819, incorporadas en la presente por referencia. De interés son los promotores que dan por resultado la expresión de una proteína localmente en o cerca del sitio de la infección del patógeno. Ver, por ejemplo, Marineau y colaboradores, (1987) Plant Mol . Biol . 9:335-342; Matton y colaboradores, (1989.) Molecular Plant-Microbe - Interactions 2:325-331; Somsisch y colaboradores, (1986) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 83:2427-2430; Somsisch y colaboradores, (1988) Mol . Gen . Genet . 2:93-98 y Yang (1996) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 93:14972-14977. Ver también, Chen y colaboradores, (1996) Plant J. 10:955-966; Zhang y colaboradores, (1994) Proc .

Na ti . Acad. Sci . USA 91:2507-2511; Warner y colaboradores, (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz y colaboradores, (1989) Plant Ceil 1:961-968; Patente norteamericana No. 5,750,386 (inducible por nemátodo) ; y las referencias citadas en las mismas. De particular interés es el promotor inducible para el gen PRms de maíz, cuya expresión es inducida por el patógeno Fusarium verticillioides (ver, por ejemplo, Cordero y colaboradores, (1992) Physiol . Mol . Plant Pa th . 41:189-200) . Adicionalmente, conforme los patógenos encuentran entrada en las plantas a través de lesiones o el daño por insectos, se puede utilizar un promotor inducible por lesión en las construcciones de las modalidades. Tales promotores inducibles por lesión incluyen el gen inhibidor de proteinasa de papa (pin II) (Ryan (1990) Ann . Rev . ^ Phytopath . 28:425-449; Duan y colaboradores, (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wunl y wun2, patente norteamericana No. 5,428,148; winl y win2 (Stanford y colaboradores, (1989) Mol . Gen . Genet . 215:200-208); sistemina (McGurl y colaboradores, (1992) Science 225:1570-1573); WIP1 (Rohmeier y colaboradores, (1993) Plant Mol . Biol . 22:783-792; Eckelka p y colaboradores, (1993) FEBS Letters 323:73-76); gen MPI (Corderok y colaboradores, (1994) Plant J. 6 (2) : 141-150) ; y los similares, incorporadas en la presente por referencia. Los promotores regulados químicamente se pueden utilizar para modular la expresión de un gen en una planta a través de la aplicación de ur. regulador químico exógeno. Dependiendo del objetivo, el promotor puede ser un promotor inducible químicamente, donde la aplicación del químico induce la expresión del gen, o un promotor reprimible de sustancia química, donde la aplicación de la sustancia química reprime la expresión del gen. Los promotores inducibles químicamente son conocidos en la técnica e incluyen, pero no son limitados al promotor In2-2 de maíz, que es activado por los moderadores de herbicida de bencensulfonamida, el promotor GST de maíz, que es activado por compuestos electrofílicos hidrofóbicos que se utilizan como herbicidas pre-emergentes, y el promotor PR-la de tabaco, que es activado por ácido salicílico. Otros promotores regulados químicamente de interés, incluyen los promotores responsivos a esteroides (ver, por ejemplo, el promotor irxducible por glucocorticoide en Schena y colaboradores, (1991) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 88:10421-10425 y McNellis y colaboradores, (1998) Plan t J. 14(2):247-257) y los promotores inducibles por tetraciclina y reprimibles de tetraciclina, ver, por ejemplo, Gatz y colaboradores, (1991) Mol . Gen . Genet . 227:229-237, y patentes norteamericanas Nos. 5,814,613 y 5,789,156), incorporadas en la presente por referencia. Los promotores preferidos de tejido se pueden utilizar para dirigir la expresión aumentada de los polipéptidos antifungales de las modalidades dentro de un tejido de planta particular. Por ejemplo, un promotor preferido de tejido se puede utilizar para expresar un polipéptido antifungal en un tejido de planta donde la resistencia a la enfermedad es particularmente importante, tal como, por ejemplo, las raíces, tallos o las hojas. Los promotores preferidos de tejido incluyen Yamamoto y colaboradores, (1997) Piant J. 12 (2) : 255-265; Kawamata y colaboradores, (1997) Pian t Cell Physiol . 38 (7 ): 792-803; Hansen y colaboradores, (1997) Moi . Gen Genet . 254(3) : 337-343; Russell y colaboradores, - (1997) Transgenic Res . 6 (2) : 157-168; Rinehart y colaboradores, (1996) Plant Physiol . 112(3) .1331-1341; Van Camp y colaboradores, (1996) Plant Physiol . 112 (2) : 525-535; Canevascini y colaboradores, (1996) Piant Physiol . 112 (2) : 513-524 ; Yamamoto y colaboradores, (1994) Plant Cell Physiol . 35 (5) : 773-778; Lam (1994) Resuí ts Probl . Cell Differ. 20:181-196; Orozco y colaboradores, (1993) Piant Mol Biol . 23 (6) : 1129-1138; Matsuoka y colaboradores, (1993) Proc Nati . Acad. Sci . USA 90(20) :9586-9590; y Guevara-Garcia y colaboradores, (1993) Plant J. 4 (3) : 495-505. Tales promotores se pueden modificar, sí es necesario, para la expresión débil. Los promotores preferidos de tejido vascular son conocidos en la técnica e incluyen aquellos promotores que selectivamente inducen la expresión de proteína en, por ejemplo, xilema y el tejido de floema. Los promotores preferidos de tejido vascular incluyen, pero no están limitados a, el promotor de gen hidrolasa de prunasina de Prunus serótina (ver, por ejemplo, la publicación internacional No. WO 03/006651), y también aquellos encontrados en la solicitud de patente norteamericana No. de serie 10/109,488. Los promotores preferidos de tallo se pueden utilizar para inducir la expresión de un polipéptido antipatogénico de la invención. Promotores preferidos de tallo ejemplares incluyen el promotor de gen MS8-15 de maíz (ver, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,986,174 y la publicación internacional No.* WO 98/00533), y aquellos encontrados en Graham y colaboradores, (1997) Plant Mol Bioi 33(4) : 729-735. Los promotores preferidos de hoja son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, Yamamoto y colaboradores,' (1997) Plant J. 12 (2) : 255-265; Kwon y colaboradores, (1994) Plant Physiol . 105:357-67; Yamamoto y colaboradores, (1994) Plant Cell Physiol . 35 (5) : 773-778 ; Gotor y colaboradores, (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco y colaboradores, (1993) Plant Mol . Biol . 23 (6) : 1129-1138; y Matsuoka y colaboradores, (1993) Proc . Nati . Acad . Sci . USA 90 (20) : 9586-9590. Los promotores preferidos de raíz son conocidos y se pueden seleccionar de los muchos disponibles de la literatura o aislados de novo de varias especies compatibles. Ver, por ejemplo, Hire y colaboradores, (1992) Plant Mol . Biol . 20 (2) : 207-218 (gen de glutamina sintetasa específico de raíz de soya) ; Keller y Baumgartner (1991) Plant Cell 3 (10) : 1051-1061 (elemento de control específico de raíz en el gen GRP 1.8 de judía verde) ; Sanger y colaboradores, (1990) Plant Mol . Biol . 14 (3) : 433-443 (el promotor específico de raíz del gen manopina sintasa (MAS) de Agrobacterium tumefaciens) ; y Miao y colaboradores, (1991) Plant Celi 3(1): 11-22 (glutamina sintetasa (GS) citosólica que codifica el clon de cDNA de longitud completa, expresado en raíces y nodulos de raíz de soya) . Ver también Bogusz y colaboradores, (1990) Plan t Cell 2 (7) : 633-641, donde dos promotores específicos de raíces aislados de los genes de hemoglobina de la no legumbre fijadora de nitrógeno Parasponia andersonii y la no legumbre no fijadora de nitrógeno relacionada a T efila tomentosa se describen. Los promotores de estos genes, se enlazaron a un gen reportador de ß-glucuronidasa y se introdujeron tanto en la no legumbre Nicotiana tabacum y la legumbre Lotus corniculatus , y en ambos casos se preservó la actividad del promotor específico de raíz. Leach y Aoyagi (1991) describe en su análisis de los promotores de los genes de inducción de raíz role y rolD altamente expresados de Agrobacterium rhizogenes (ver Plant Science (Limerick) 79 (1) : 69-76) . Ellos concluyeron que los determinantes de DNA preferidos de tejido y aumentadores son disociados en esos promotores. Teeri y colaboradores, (1989) utilizaron la - fusión de gen a lacZ para mostrar que la octopina sintasa que codifica el gen T-DNA de Agrobacteriúm es especialmente activo en la epidermis de la punta de la raíz y que el gen TR2' es específico de raíz en la planta intacta y estimulado por la lesión en el tejido de la hoja, una combinación especialmente deseable de características para el uso con un gen insecticida o larvicida (ver EMBO J. 8 (2) : 343-350) . El gen TR1' , fusionado a nptll (neomicina fosfotransferasa II) mostró características similares. Los promotores preferidos de raíz adicionales incluyen el promotor de gen VfENOD-GRP3 (Kuster y colaboradores, (1995) Plant Mol . Biol . 29(4) :759- 772); y el promotor rolB (Capana y colaboradores, (1994) Plant Mol . . Biol . 25 (4) : 681-691. Ver también las patentes norteamericanas Nos. 5,837,876; 5,750,386; 5,633,363; 5,459,252; 5,401,836; 5,110,732; y 5,023,179. Los promotores "preferidos de semilla" incluyen , tanto promotores "específicos de semilla" (aquellos promotores activos durante el desarrollo de la semilla tales como promotores de proteínas de almacenamiento de semilla) así como promotores de "germinación de semillas" (aquellos promotores activos durante la germinación de la semilla) . Ver Thompson y colaboradores, (1989) BioEssays 10:108, incorporada en la presente por referencia. Tales promotores preferidos de semilla incluyen, pero no están limitados a, Ciml (mensaje inducido de citoquinina) ; cZ19Bl (zeína de 19 kDa de maíz) ; milps (mio-inositol-1-fosfato sintasa) (Ver WO 00/11177 y la patente norteamericana No. 6,225,529; incorporadas en la presente por referencia) . La gama-zeína es un promotor específico de endosperma preferido. Giob-1 es un promotor específico de embrión preferido. Para dicotiledóneas, los promotores específicos de semilla incluyen, pero no están limitados a, ß-faseolina de fríjol, napina, ß-conglicinina, lectina de soya, cruciferina y los similares. Para monocotiledóneas, los promotores específicos de semilla incluyen, pero no están limitados a zeína de 15 kDa de maíz, zeína de 22 kDa, zeína de 27 kDa, g-zeína, ceroso, shrunken 1, shrunken 2, globulina 1, etc. Ver también WO 00/12733, donde los promotores preferidos de semilla de los genes endl y end2 son divulgados; incorporada en ia presente por referencia. En ciertas modalidades las secuencias de ácido nucleico de la presente invención pueden ser apiladas con cualquier combinación de secuencias de polinucleótido de interés con el fin de crear plantas con un fenotipo deseado. Por ejemplo, los polinucleótidos de la presente invención se pueden apilar con cualquiera de otros polinucleótidos de la presente invención, tal como cualquier combinación de las SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7, y 9, o con otros genes antifungales y los similares. Las combinaciones generadas también pueden incluir múltiples copias de cualquiera de los polinucleótidos de interés. Los polinucleótidos de la presente invención también pueden ser apilados con cualquier otro gen o combinación de genes para producir plantas con una variedad de combinaciones de atributos deseados incluyendo pero no limitados a atributos deseables para la alimentación animal tal como genes de alto contenido de aceite (por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,232,529); aminoácidos balanceados (por ejemplo hordotioninas (patentes norteamericanas Nos. ,990,389; 5,885,801; 5,885,802; y 5,703,409); cebada de alto contenido de lisina (Williamson y colaboradores-, (1987) Eur.

J. Biochem . 165:99-106;. y WO 98/20122); y proteínas de alto contenido de metionina (Pedersen y colaboradores, (1986) J. Biol . Chem . 261:6279; Kirihara y colaboradores, (1988) Gene 71:359; y Musuntura y colaboradores, (1989) Plant Mol . Biol . 12: 123)); digestibilidad incrementada (por ejemplo, proteínas de almacenamiento modificadas (solicitud norteamericana No. de serie 10/053,410, presentada el 7 de noviembre del 2001) ; y tioredoxinas (solicitud norteamericana No. de serie 10/005,429, presentada el 3 de diciembre del 2001) ) , las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Los polinucleótidos de la presente invención también se pueden apilar con atributos deseables para resistencia a insectos, enfermedades o herbicidas (por ejemplo, proteínas tóxicas de Bacill us thuringiensis (patentes norteamericanas Nos. 5,366,892; 5,747,450; 5,737,514; 5723,756; 5,593,881; Geiser y colaboradores, - (1986) Gene 48:109); lectinas (Van Damme y colaboradores, (1994) Plant Mol . Biol . 24:825); genes de detoxificación de fumonisina (patente norteamericana No. 5,792,931); genes de resistencia a avirulencia y enfermedad (Jones y colaboradores, (1994) Science 266:789; Martin y colaboradores, (1993) Science 262:1432; Mindrinos y colaboradores, (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintasa (ALS) que conducen a la resistencia a herbicida tal como las mutaciones S4 y/o Hra; inhibidores de glutamina sintasa tales como fosfinotricina o basta (por ejemplo, gen bar) ; y resistencia a glifosato (genes EPSPS, genes GAT tales como aquellos divulgados en la publicación de la solicitud de patente norteamericana US2004/0082770, también WO02/36782 y WO03/092360) ) ; y atributos deseables para el procesamiento o productos de proceso tales como alto contenido en aceite (por ejemplo, la patente norteamericana No. 6,232,529); aceites modificados (por ejemplo, genes de desaturasa de ácido graso (patente norteamericana o. 5,952,544; WO 94/11516)); almidones modificados (por ejemplo, pirofosforilasas de ADPG (AGPasa) , sintasas de almidón (SS) , enzimas de ramificación de almidón (S'DBE) y enzimas de desrramificación .de almidón (SDBE) ) ; y polímeros o bioplásticos (por ejemplo, la patente norteamericana No. 5.602,321; beta-cetoquiolasa, polihidroxíbutirato sintasa, y acetoacetil-CoA reductasa (Schubert y colaboradores, (1988) J. Bacteriol . 170:5837-5847) facilitan ia expresión de polihidroxialcanoatos (PHAs)), las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. También se podrían combinar los polinucleótidos de la presente invención con polinucleótidos que proporcionan atributos agronómicos tal como la esterilidad masculina (por ejemplo, ver la patente norteamericana No. 5.583,210), resistencia del tallo, tiempo de florecimiento, o atributos de tecnología de transformación tal como la regulación del ciclo celular o la dirección del gen (por ejemplo WO 99/61619; WO 00/17364; WO 99/25821), las descripciones de las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Estas combinaciones apiladas se pueden crear mediante cualquier método incluyendo pero no limitado a plantas de reproducción cruzada tal como mediante la metodología convencional o TopCross©, o la transformación genética. Sí los atributos se apilan al transformar genéticamente las plantas, las secuencias de polinucleótido de interés se pueden combinar en cualquier tiempo y en cualquier orden. Por ejemplo, una planta transgénica que comprende uno o más atributos deseados se puede utilizar como el objetivo paira introducir .atributos adicionales mediante la transformación subsecuente. Los atributos pueden ser introducidos simultáneamente en* un protocolo de co-transformación con los polinucleótidos de interés proporcionados mediante cualquier combinación de casetes de transformación. Por ejemplo, sí se introdujeran dos secuencias, las dos secuencias pueden ser contenidas en casetes de transformación separados (trans) o contenidos en el mismo cásete de transformación (cis) . La expresión de la secuencia se pueden inducir mediante el mismo promotor o por diferentes promotores. En ciertos casos, puede ser deseable introducir un cásete de transformación que suprimirá la expresión del polinucleótido de interés. Este se puede combinar con cualquier combinación de otros casetes de supresión o casetes de sobreexpresión para generar la combinación deseada de atributos en la planta. Además se reconoce que las secuencias del polinucleótido pueden ser apiladas en una localización genómica deseada utilizando un sistema de recombinación específica del sitio. Ver, por ejemplo, W099/25821, W099/25854, WO99/25840, W099/25855, y W099/25853, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Los métodos de ' la invención involucran la introducción de un polipéptido o polinucleótido en una planta. "Introducción" se propone para dar a entender que se presenta a la planta al polinucleótido. En algunas modalidades, el polinucleótido será presentado de tal manera que la secuencia gana acceso al interior de una célula de la planta, incluyendo su inserción potencial en el genoma de una planta. Los métodos de la invención no dependen de un método particular para introducir una secuencia en una planta, solamente que el polinucleótido gane acceso al interior de por lo menos una célula de la planta. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas son conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a, métodos de transformación estable, métodos de transformación transiente y métodos mediados por virus. Los polipéptidos también se pueden introducir en una planta de tal manera que ellos ganen acceso al interior de la célula de planta o permanezcan externos a la célula pero en estrecho contacto con ésta. "Transformación estable" se propone para dar a entender que la construcción de nucleótidos introducida en una planta se integra en el genoma de la planta y es capaz de ser heredada por la progenie de la misma. "Transformación transiente" o "expresión transiente" se propone para dar a entender que un polinucleótido se introduce en la planta y no se integra en el genoma de la planta o un polipéptido se introduce en una planta. Los protocolos de transformación así como protocolos para la introducción de polipéptidos o secuencias de polinucleótido en plantas pueden variar dependiendo del tipo de planta o célula de planta, es decir, monocotiledónea o dicotiledónea, dirigida para la transformación. Los métodos adecuados de introducción de polipéptidos y polinucleótidos en células de plantas incluyen la microinyección (Crossway y colaboradores, (1986) . Bíotechniques 4:320-334), electroporación (Riggs y colaboradores, (1986) Proc . Na ti . Acad. Sci . USA 83:5602-5606, transformación mediada por Agrobacterium (patentes norteamericanas Nos. 5,563,055 y 5,981,840), transferencia de gen directa (Paszkowski y colaboradores, (1984) EMBO J. 3 : 2111-2122 ) , y la aceleración de partículas balísticas (ver, por ejemplo, Sanford y colaboradores, patentes norteamericanas Nos. 4,945,050; 5,879,918; ' 5,886,244; y 5,932,782; Tomes y colaboradores, (1995) in Plant Cell , Tissue, and Organ Cul ture: Fundamental Methods, ed. Gamborg y Phillips (Sprínger-Verlag, Berlín) ; McCabe y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:923-926); y la transformación Lecl (WO 00/28058) . También ver Weissinger y colaboradores, (1988) Ann . Rev. Genet . 22: 21-477 ; Sanford y colaboradores, (1987) Particuíate Science y Technology 5:27-37 (cebolla); Christou y colaboradores, (1988) Plant Physiol . 87:671-674 (soya); McCabe y colaboradores, (1988) Bio/Technology 6:923-926 (soya); Finer y McMullen (1991) In Vi tro Cell Dev. Biol . 27P:175-182 (soya); Singh y colaboradores, (1998) Theor. Appl . Genet . 96:319-324 (soya); Datta y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:736-740 (arroz); Klein y colaboradores, (1988) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 85:4305-4309 (maíz); Klein y colaboradores, (1988) Biotechnology 6:559-563 (maíz); patentes norteamericanas Nos. 5,240,855; 5,322,783 y 5,324,646; Klein y colaboradores, (1988) Plant Physiol . 91:440-444 (maíz); Fromm y colaboradores, (1990) Biotechnology 8:833-839 (maíz) ; Hooykaas-Van Slogteren y colaboradores, (1984) Na ture (London) 311 : 763-764; patente norteamericana No. 5,736,369 (cereales); Bytebier y colaboradores, (1987) Proc . Nati . Acad. Sci . USA 84:5345-5349 (Liliáceas); De Wet y colaboradores, (1985) in The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed. Chapman y colaboradores, (Longman, New York), pp. 197-209 (polen); Kaeppler y colaboradores, (1990) Piant Ceil Reports 9:415-418 y Kaeppler y colaboradores, (1992) Theor. Áppl . Genet . 84:560-566 (transformación mediada por whisker) ; D'Halluin y colaboradores, (1992) Plant Cell 4:1495-1505 (electroporacíón) ; Li y colaboradores, (1993) Plant Cell Reports 12:250-255 y Christou y Ford (1995) Annals of Botany 75:407-413 (arroz); Osjoda y colaboradores, (1996) Nature Biotechnology 14:745-750 (maíz por la vía de Agrobacterium tumefaciens) ; todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. En modalidades específicas, las secuencias antipatogénicas de la invención se pueden proporcionar en una planta utilizando una variedad de métodos de transformación transiente. Tales métodos de transformación transiente incluyen, pero no están limitados a la introducción de la proteína antifungal o variantes y fragmentos de la misma directamente en la planta o la introducción del transcripto de proteína antipatogénica en la planta. Tales métodos incluyen, por ejemplo, la microinyección o bombardeo de partículas. Ver, por ejemplo, Crossway y colaboradores, (1986) Mol Gan . Genet . 202:179-185; Nomura y colaboradores, (1986) Plant Sci . 44:53-58; Hepler y colaboradores, (1994) Proc . Na ti . Acad. Sci . 91:2176-2180 y Hush y colaboradores, (1994) The Journal of Cell Science 107:775-784, todas las cuales son . incorporadas en la presente por referencia.

Alternativamente, el polinucleótido puede ser transformado transiente ente en la planta utilizando técnicas conocidas en el arte. Tales técnicas incluyen un sistema de vector viral y la precipitación del polinucleótido en una manera que evita la liberación subsecuente del DNA. Así, la transcripción del DNA enlazado a partícula puede ocurrir, pero la frecuencia con la cual es liberado para llegar a ser integrado en el genoma es grandemente reducida. Tales métodos incluyen el uso de partículas recubiertas con polietilenimina (PEÍ; Sigma #P3143) . En otras modalidades, el polinucleótido de la invención se puede introducir en plantas al poner en contacto las plantas con un virus o ácidos nucleicos virales! Generalmente, tales métodos involucran incorporar una construcción de nucleótidos de las modalidades dentro de una molécula de DNA o RNA viral. Se reconoce que el polipéptido antipatogénico de la invención puede ser inicialmente sintetizado como parte de una poliproteína viral, que después puede ser procesada mediante proteólisis in vivo o ín vitro para* producir la proteína recombinante deseada. Además se reconoce que los promotores de la invención también comprenden promotores utilizados para la transcripción mediante RNA polimerasas virales. Los métodos para introducir polinucleótidos en plantas y expresar, una proteína codificada en las mismas, que involucran molécula de DNA o RNA virales, son conocidos en la técnica. Ver, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 5,889,191, 5,889,190, 5,866,785, 5,589,367, 5,316,931, y Porta y colaboradores, (1996) Molecular Biotechnology 5:209-221; incorporados en la presente por referencia. Se conocen métodos en la técnica para la inserción dirigida de un polinucleótido en una localización específica en el genoma de la planta. En una modalidad, la inserción del polinucleótido en una localización genómica deseada se logra utilizando un sistema de recombinación específico del sitio. Ver, por ejemplo, W099/25821, W099/25854, WO99/25840, W099/25855, y W099/25853, todas las cuales son incorporadas en la presente por referencia. Brevemente, el polinucleótido de la invención puede ser contenido en un cásete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no recombinogénicos . El cásete de transferencia se introduce en una planta que tiene establemente incorporado en su genoma .un sitio objetivo que es flanqueado por dos sitios de recombinación no recombinogénicos que corresponden a los sitios del cásete de transferencia. Se- proporciona una recombinasa apropiada y el cásete de transferencia se integra en el sitio objetivo. El polinucleótido de interés es de esta manera integrado en una posición cromosómica específica en el genoma de la planta. Las células que se han transformado pueden ser cultivadas en plantas de acuerdo con maneras convencionales. Ver, por ejemplo, McCormick y colaboradores, (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Estas plantas luego pueden ser cultivadas y ya sea polinizadas con la misma cepa transformada o diferentes cepas, y la progenie resultante que tiene expresión constitutiva en la característica fenotípica deseada identificada. Dos o más generaciones pueden ser cultivadas para. asegurar que la expresión de la característica fenotípica deseada es establemente mantenida y heredada y luego las semillas cosechadas para asegurar que se ha logrado la expresión de la característica fenotípica deseada. De esta manera, la presente invención proporciona semilla transformada (también referida como "semilla transgénica") que tiene una construcción de nucleótidos de la invención, por ejemplo, un cásete de expresión de la invención, establemente incorporado en su genoma. La reproducción de raza pura inicia con la cruza de dos genotipos, tal como una línea de élite de interés y otra línea endogámica de élite que tiene una o más características deseables (es decir, que tiene establemente incorporado un polinucleótido de la invención, que tiene una actividad modulada y/o nivel del polipéptido de la invención, etc.) que complementa la línea de élite de interés..Sí los dos orígenes originales no proporcionan todas las características deseadas, otras fuentes pueden ser incluidas en la población de reproducción. En el método de raza pura, plantas superiores son .cruzadas y seleccionadas en generaciones filiales sucesivas . En las generaciones filiales sucesivas subsecuentes la condición heterocigota da manera a líneas homogéneas como un resultado de la auto-polinización y selección. Típicamente en el método de raza pura de reproducción, cinco o más generaciones filiales sucesivas de autocruzamiento y selección es practicado: Fl -> F2; F2 -> F3; F3 -> F4 ; F4 -> F5 , etc. Después de una cantidad suficiente de reproducción interna, las generaciones filiales sucesivas servirán para incrementar la semilla de la línea endogámica desarrollada. En modalidades específicas, la línea endogámica comprende alelos homocigotos en aproximadamente 95% o más de su sitio. Además de ser utilizada para crear una conversión de cruza hacia atrás, el cruzamiento hacia atrás también puede ser utilizado en combinación con la reproducción de raza pura para modificar una línea de élite de interés y un híbrido que se hace utilizando la línea de élite modificada. Como se discutió previamente, el cruzamiento hacia atrás se puede utilizar para transferir uno o más atributos específicamente deseables de una línea, el origen de donador, a una línea endogámica llamada el origen recurrente, que tiene buenas características agronómicas totales pero carece de ese atributo o atributos deseables. Sin embargo, el mismo procedimiento puede ser utilizado para mover la progenie hacia el genotipo del origen recurrente pero al mismo tiempo retiene muchos componentes del origen no recurrente al detener el cruzamiento hacia atrás en una etapa temprana y al proceder con el autocruzamiento y selección. Por ejemplo, Un Fl, tal como un híbrido comercial, es creado. Este híbrido comercial puede ser cruzado hacia atrás a una de sus líneas de origen para crear un BC1 o BC2. La progenie son autocruzadas y seleccionadas de modo que la línea endogámica recientemente desarrollada tiene muchos de los atributos del origen recurrente y todavía varios de los atributos deseados del origen no recurrente. Este procedimiento nivela el valor y las concentraciones del origen recurrente para el uso en nuevos híbridos y reproducción. Por lo tanto, una modalidad de esta invención es un método para hacer una conversión de cruza hacia atrás de la línea endogámica de maíz de interés, que comprende las etapas de cruzar una planta de la línea endogámica de maíz de interés con una planta donadora que comprende un gen mutante o transgen que confiere un atributo deseado (es decir, resistencia a patógenos incrementada) , seleccionar una planta de progenie Fl que comprende el gen mutante o transgen que confiere el atributo deseado y cruzar hacia atrás la planta de progenie Fl seleccionada a la planta de la línea endogámica de maíz de interés. Este método además puede comprender la etapa de obtener un perfil de marcador molecular de la línea endogámica de maíz de interés y utilizar el perfil de marcador molecular para seleccionar una planta de progenie con el atributo deseado y el perfil de marcador molecular de la línea endogámica de interés. De la misma manera, este método se puede utilizar para producir una semilla híbrida Fl al adicionar una etapa final de cruzamiento de la conversión de atributo deseada de la línea endogámica de maíz de interés con una planta de maíz diferente para hacer semilla de maíz híbrido Fl que comprenden un gen mutante o transgen que confiere el atributo deseado.

La selección recurrente es .un método utilizado en un programa de reproducción de plantas para mejorar una población de plantas. El método comprende polinizar cruzadamente plantas individuales con otra para formar progenie. La progenie son cultivadas y la progenie superior seleccionadas por cualquier número de métodos de selección, - que incluyen planta individual, progenie de mediano parentesco, progenie de completo parentesco, progenie autocruzada y cruzamiento superior. Las progenies seleccionadas son polinizadas cruzadamente entre sí para formar progenie de otra población. Esta población es plantada y nuevamente plantas superiores son seleccionadas para polinizarse cruzadamente entre sí. La selección recurrente es un proceso cíclico y por lo tanto puede ser repetido tantas veces como sea deseado. El objetivo de la selección recurrente es mejorar los atributos de * una población. La población mejorada luego puede ser utilizada como una fuente de material de reproducción para obtener líneas endogámicas que son utilizadas en híbridos o utilizadas como orígenes para una variedad de cultivo sintético. Una variedad de cultivo sintético es la progenie resultante formada por el intercruzamiento de varias líneas endogámicas seleccionadas. La selección de masa es una técnica útil cuando se utiliza en conjunción con la selección aumentada de marcador molecular. En la selección de masa las semillas de individuos son seleccionadas en base al fenotipo y/o genotipo. Estas semillas seleccionadas luego son acumuladas y utilizadas para cultivar la siguiente generación. La selección en volumen requiere el cultivo de una población de plantas en un lote en volumen, permitiendo que las plantas se auto-polinicen, recolectar la semilla en volumen y luego utilizar una muestra de la semilla recolectada en volumen para plantar la siguiente generación. En lugar de la auto-polinización, la polinización dirigida podría ser utilizada como parte del programa de reproducción. La reproducción de mutación es uno de muchos métodos que podrían ser utilizados para introducir nuevos atributos en una línea de élite. Las mutaciones que ocurren espontáneamente o son artificialmente inducidas pueden ser fuentes útiles de variabilidad para un reproductor de plantas. El objetivo de la mutagénesis artificial es incrementar la proporción de mutación para una característica deseada. Las proporciones de mutación se pueden incrementar por muchos medios diferentes incluyendo la temperatura, almacenamiento de semilla a largo plazo, condiciones de cultivo de tejido, radiación; tales como rayos X, rayos Gama (por ejemplo, cobalto 60 o cesio 137), neutrones (producto de la fisión nuclear mediante uranio 235 en un reactor atómico) , Radiación beta (emitida de radioisótopos, tal como fósforo 32 o carbono 14), o la radiación ultravioleta (de preferencia de 2500 a 2900 nm) , o mutágenos químicos (tales como los análogos de base (5-bromo-uracilo) , compuestos relacionados (8-etoxi cafeína) , antibióticos (estreptonigrina) , agentes de alquilación (mostazas de azufre, mostazas de nitrógeno, epóxidos, etilenaminas, sulfatos, sulfonatos, sulfonas, lactonas), azida, hidroxilamina, ácido nitroso o acridinas. Una vez que se observa un atributo , deseado a través de la mutagénesis el atributo luego puede ser incorporado en el plasma de germen existente mediante técnicas de reproducción tradicionales, tal como el cruzamiento hacia atrás. Los detalles de la reproducción de mutación se pueden encontrar en "Princip is of Cultivar Development" Fehr, 1992 Macmillan Publishing Company la descripción de la cual * es incorporada en la presente por referencia. Además, las mutaciones creadas en otras líneas se pueden utilizar para producir una conversión de cruzamiento hacia atrás de líneas de élite que comprenden tales mutaciones. Como se utiliza en la presente, el término "planta" incluye, células de plantas, protoplastos de plantas, cultivos de tejido de células de plantas de las cuales una planta de maíz puede ser regenerada, callos de plantas, agrupaciones de plantas y células de plantas que están intactas en las plantas o partes de plantas tales como embriones, polen, óvulos, semillas, hojas, flores, ramas, frutos, núcleos, mazorcas, elotes, farfollas, tallos, tubérculos, raíz, puntas de raíz, anteras, y los similares. El grano se propone para dar a entender la semilla madura producida por los cultivadores comerciales para propósitos diferentes al carecimiento o reproducción de las especies. La progenie, variantes y mutantes de las plantas regeneradas también se incluyen dentro del alcance de la invención, con la condición de que estas partes comprendan los polinucleótidos introducidos. La presente invención se puede utilizar para inducir la resistencia a patógenos, o proteger del ataque de patógeno a cualquier especie de planta, incluyendo, pero no limitada a monocotiledóneas y dicotiledóneas. Ejemplos de especies de plantas de interés incluyen, pero no están limitadas a, maíz ( Zea mays) , Brassica sp. (por ejemplo, B . napus , B . rapa , B . j úncea) , particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuente de aceite de semilla, alfalfa (Medicago sativa ) , arroz ( Oryza sativa ) , centeno ( Sécale cereale, ) sorgo ( Sorghum bicolor, Sorghum vulgare) , mijo (por ejemplo, mijo perlado ( Pennisetum g lau cum) , mijo proso ( Panicum miliaceum) , mijo de cola de zorra ( Setaria itálica) , mijo extendido (Eleusine coracana ) ) , girasol (Helianthus annuus) , cártamo ( Carthamus tinctorius) , trigo ( Tri ticum aestivum) , soya ( Glycine max) , tabaco (Nicotiana tabacum) , papa ( Solanum tuberosum) , cacahuates (Arachis hipogaea ) , algodón ( Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum) , camote (Ipomoea batatus) , casava (Manihot esculenta) , café (Coffea spp.), coco (Cocos nucífera), pina (Ananas comosus) , árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacaco) , te (Camellia sinensis) , plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana) , higo (Ficus casica) , guayaba (Psidium guajava) , mango (Mangifera indica), olivo (Olea europaea) , papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale) , macadamia (Macadamia integri folia) , almendra (Prunus amygdalus) , betabeles (Peta vulgaris) , caña de azúcar (Saccharum spp.), avenas, cebada, vegetales, plantas ornamentales y coniferas. Los vegetales incluyen tomates (Lycopersicon lycopersicon) , lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), habichuelas verdes (Phaseolus vulgaris), habas (Phaseolus limensis) , guisantes (Lathyrus spp.), y miembros del género Cucumis tal como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) , y melón (C. meló) . Las plantas ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hidrángea (Macrophylia hydrangea) , hibisco ' (Hibiscus rosasanensis) , rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida) , clavel (Dianthus caryophyllus) , pastora roja (Euphorbia pulcherríma) , y crisantemo. Las coniferas que pueden ser empleadas en la práctica de la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos tal como el pino del incienso (Pinus taeda) , pino de tala (Pinus elliotii) , pino ponderosa (Pinus ponderosa) , pino lodgepole ( Pinus contorta ) , y pino Monterrey ( Pinus radiata ) ; abeto de Douglas ( Pseudotsuga menziesil ) ; pinabete del occidente ( Tsuga canadensis) ; abeto Sitka ( Picea glauca) ; madera roja ( Sequoia sempervirens) ; abetos típicos tales como abeto plateado (Abies amabilis) y abeto de bálsamo (Abies balsamea ) ; y cedros tales como cedro rojo del occidente ( Thuja plica ta) y cedro amarillo de Alaska ( Chamaecyparis nootka tensis) .. En modalidades específicas, las plantas de la presente invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica , soya, algodón, cártamo, cacahuate, sorgo trigo, mijo, tabaco, etc.). En otras modalidades, las plantas de maíz y de soya son óptimas, y en todavía otras modalidades las plantas de maíz son óptimas. Otras plantas de interés incluyen plantas de grano que proporcionan semillas de interés, plantas de semilla de aceite y plantas leguminosas . Las semillas de interés incluyen semillas de grano, tales como maíz, trigo, cebada, arroz, sorgo, centeno, etc. Las plantas de semilla de aceite incluyen algodón, soya, cártamo, girasol, Brassica , maíz, alfalfa, palma, coco, etc. Las plantas leguminosas incluyen frijoles y guisantes. Los frijoles incluyen guar, algarroba, fenegreco, soya, frijoles de jardín, caupí, mungo, haba, fava bean, lentejas, garbanzo, etc. Las composiciones antipatogénicas, particularmente composiciones antifungales, también están abarcadas por la presente invención. Las composiciones antipatogénicas pueden comprender polipéptidos antipatogénicos c microorganismos transformados que comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido antipatogénico. Las composiciones antipatogénicas de la invención se pueden aplicar al medio ambiente de un patógeno de planta, como es descrito en la presente enseguida, para de esta manera proteger una planta del ataque de patógeno. Además, una composición antipatogénica se puede formular con un portador aceptable, esto es, por ejemplo, una suspensión, una solución, una emulsión, un polvo para espolvorear, un granulo dispersable, un polvo humectable y un concentrado emulsificable, un aerosol, un granulo impregnado, un adyuvante, una pasta recubrible y también encapsulaciones .en, por ejemplo, sustancias poliméricas. Un gen que codifica un polipéptido antipatogénico, particularmente antifungal, de la invención puede ser introducido en cualquier hospedero microbiano adecuado de acuerdo con los métodos estándares en la técnica. Por ejemplo, los hospederos de microorganismos que son conocidos que ocupan la "fitósfera" (filoplano, filósfera, rizósfera y/o rizoplana) de uno o más cultivos de interés pueden ser seleccionados. Estos microorganismos se seleccionan para ser capaces de competir exitosamente en el medio ambiente particular con los microorganismos de tipo silvestre, y para proporcionar mantenimiento y expresión estables del gen que expresa la proteína antifungal. Tales microorganismos incluyen bacterias, algas y hongos . De particular interés son los microorganismos tales como bacterias, por ejemplo, Pseudomonas , Erwinia , Serratia , Klebsiélla , Xanthomonas , Streptomyces , Rhizobium, Rhodopseudomonas , Methylius , Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus , Arthrobacter , Azotobacter, Leuconostoc, y Alcaligenes, hongos, particularmente levadura, por ejemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula , y Aureobasidium . De interés particular son tales especies bacterianas de fitósfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens , Serra tia marcescens , Acetobacter xylinum, Agrobacteria , Rhodopseudomonas spheroides , Xanthomonas campestris , Rhizobium melioti , Alcaligenes entrophus , Clavibacter xyli y Azotobacter vinlandir y especies de levadura de fitósfera tales como Rhodotorula rubra , R . glutinis , R . marina , R . aurantiaca , Cryptococcus albidus , C. diffluens, C. laurentii , Saccharomyces rosei , S . pretoriensis , S . cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S . Odorus , Kluyveromyces veronae y Aureobasidium pollulans . De particular interés son los microorganismos pigmentados. Otras procariotas ilustrativas, tanto gram negativas y gram positivas, incluyen Enterobacteriaceae, tal como Escherichia , Erwinia , Shígella , Salmonella , y Proteus ; Bacillaceae; Rhizobiceae, tal como Rhizobium; Spirillaceae, tal como photobacterium, Zymomonas , Serra tia , Aeromonas , Vibrio, Desulf ovibrio , Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae , tal como Pseudomonas y Acetobacter; Azotobacteraceae y Nitrobacteraceae . Entre las eucariotas están los hongos, tales como Phycomycetes y Ascomycetes , que incluye levadura, tales como Saccharomyces y Schizosaccharomyces ; y levadura de Basidiomycetes , tales como Rhodotorula , Aureobasidium, Sporobolomyces y los similares. Los organismos hospederos microbianos de interés particular incluyen levadura, tales como Rhodotorula spp . , Aureobasidium spp . , Saccharomyces spp . , y Sporobolomyces spp. , organismos filoplanos tales como Pseudomonas spp . f Erwinia spp . , y Flavobacterium spp . , y otros organismos de tal clase incluyendo Pseudomonas aeruginosa , Pseudomonas fluorescens , Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis , Escherichia coli , Bacillus subtilis , y los similares . Los genes que codifican las proteínas antifungales de la invención se pueden introducir en microorganismos que se multiplican en plantas (epífitos) para suministrar proteínas antifungales a pestes objetivos potenciales. Los epífitos, por ejemplo, pueden ser bacterias gram positivas o gram negativas . Las bacterias de colonización de raíz, por ejemplo, se pueden aislar de la planta de interés por métodos conocidos en la técnica. Específicamente, una cepa de Bacillus cereus que coloniza la raíz se puede aislar de las raíces de una planta (ver, por ejemplo, Haldelsman y colaboradores (1991) Appl . Environ . Microbiol . 56:713-718). Los genes que codifican los polipéptidos antifungales de las modalidades se pueden introducir en un Bacillus cereus de colonización de raíz mediante métodos estándares conocidos en la técnica. Los genes que codifican proteínas antifungales pueden ser introducidos, por ejemplo, en el Bacillus de colonización de raíz por medio de electrotransformación. Específicamente, los genes que codifican las proteínas pesticidas se pueden clonar en un vector de lanzadera, por ejemplo, pHT3101 (Lerecius y colaboradores (1989) FEMS Microbiol . Letts . 60:211-218). El vector de lanzadera pHT3101 que contiene la secuencia de codificación para el gen de proteína pesticida particular puede ser, por ejemplo, transformado en el Bacillus de colonización de raíz por medio de electroporación (Lerecius y colaboradores (1989) FEMS Microbiol . Letts . 60:211-218). Se proporcionan métodos para proteger a una planta de un patógeno que comprende aplicar una cantidad efectiva de una proteína o composición antipatogénica de ia invención al medio ambiente del patógeno. "Cantidad efectiva" se propone para dar a entender una cantidad de una proteína o composición suficiente para controlar un patógeno. Las proteínas antipatogénicas y composiciones se pueden aplicar al medio ambiente del patógeno por métodos conocidos para aquellos de habilidad ordinaria en la técnica. Las composiciones antifungales de la invención se pueden obtener mediante la adición de un agente activo en la superficie, un portador inerte, . un conservador, un humectante, un estimulante de alimentación, un atrayente, un agente, encapsulante, un aglutinante, un emulsificante, un tinte, un protector de UV, una solución reguladora, un agente de flujo o fertilizante, donadores de micronutrientes u otras preparaciones que influyen en el crecimiento de la planta. Uno o más agroquímicos que incluyen pero no limitados a, herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas, acaricidas, reguladores del crecimiento de plantas, auxiliares de cosecha y fertilizantes, se pueden combinar con portadores, surfactantes o adyuvantes usualmente empleados en la técnica de formulación u otros componentes para facilitar el manejo del producto y - la aplicación para patógenos objetivos particulares. Los portadores y adyuvantes adecuados pueden ser sólidos o líquidos y corresponden a las sustancias ordinariamente empleadas en la tecnología de formulación, por ejemplo, sustancias minerales, naturales o regeneradas, solventes, dispersantes, agentes humectantes, pegajosificantes, aglutinantes o fertilizantes. Los ingredientes activos de la presente invención normalmente se aplican en la forma de composiciones y se pueden aplicar al área de cultivo, planta o semilla a ser tratada. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención se pueden aplicar al grano en la preparación o durante el almacenamiento en un almacén o silo de granos, etc. Las composiciones de la presente invención se pueden aplicar simultáneamente o en sucesión con otros compuestos. Los métodos para aplicar un ingrediente activo de la presente invención en una composición agroquímica de la presente invención que contiene por lo menos una de las proteínas antipatogénicas de la presente invención incluyen, pero no están limitados a, la aplicación foliar, recubrimiento de semilla y la aplicación a la tierra. El número de aplicaciones y la proporción de aplicación dependen de la intensidad de infestación por la peste o patógeno correspondiente. Los agentes activos en la superficie adecuados incluyen, pero no están limitados a, compuestos aniónicos tal como un carboxilato de, por ejemplo, un metal; carboxilato de un ácido graso de cadena larga; un N-acilsarcosinato; mono o di-ésteres de ácido fosfórico con etoxilatos de alcohol graso o sales de tales esteres; sulfatos de alcohol graso tales como dodecil sulfato de sodio, octadecil sulfato de sodio o cetil sulfato de sodio; sulfatos de alcohol graso etoxilados; sulfatos de alquilfenol etoxiladcs; sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo; sulfonatos de alquil arilo tales como sulfonatos de alquil-benceno o sulfonatos de alquilnaftaleno inferior, por ejemplo, sulfonato de butil-naftaleno; sales de-condensado de naftaleno-formaldehídos sulfonados; sales de condensados de fenol-for aidehído sulfonados; sulfonatos más complejos tales como los sulfonatos de amida, por ejemplo, el producto de condensación sulfonado de ácido oleico y N-metil taurina; o los sulfosuccinatos de dialquilo, por ejemplo, el sulfonato de sodio o succinato de dioctilo. Agentes no iónicos incluyen productos de condensación de esteres de ácido graso, alcoholes grasos, amidas de ácido graso o fenoles sustituidos con alquilo graso o alquenilo con óxido de etileno, esteres grasos de éteres de alcohol polihídrico, por ejemplo, esteres de ácido graso de sorbitán, productos de condensación de tales esteres con óxido de etileno, por ejemplo esteres de ácido graso de polioxietilen sorbitán, copolímeros de bloque de óxido de etileno y óxido de propileno, glicoles acetilénicos tales como 2,4,7,9-tetraetil-5-decir-4, 7-oiol, o glicoles acetilénicos etoxilados. Ejemplos de un agente activo en la superficie catiónica incluyen, por ejemplo, una mono-, di- o poliamina alifática tal como un acetato, naftenato u oleato; o amina que contiene oxígeno tal como un óxido de amina de polioxietilen alquilamina; amina enlazada a amida preparada mediante la condensación de un ácido carboxílico con una di- o poliamina; o una sal de amonio cuaternaria. Ejemplos de materiales inertes incluyen, pero no están limitados a, minerales inorgánicos tales como caolín, filosilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, o materiales botánicos tal como corcho, mazorcas de maíz en polvo, vainas de cacahuate, vainas de arroz y cascaras de nuez. Las composiciones antipatogénicas de la presente invención pueden estar en una forma adecuada para la aplicación directa como un concentrado de composición primaria que requiere dilución con una cantidad adecuada de agua u otro diluyente antes de la aplicación. La concentración del poiipéptido antipatogénico variará dependiendo de la naturaleza de la formulación particular, específicamente, si es un concentrado o va a ser utilizada directamente. La composición contiene 1 a 98% de un portador inerte sólido o líquido, y de 0 a 50%, óptimamente' 0.1 a 50% de un surfactante. Estas composiciones serán administradas en la proporción etiquetada para el producto comercial, óptimamente de manera aproximada 0.01 lb-5.0 Ib por acre cuando está en forma seca y en aproximadamente 0.01 pts. -10 pts. por acre cuando está en forma líquida. En una modalidad adicional, las composiciones, así como ios microorganismos transformados y las proteínas antipatogénicas, de la invención se pueden tratar antes de la formulación para prolongar ia actividad antipatogénica, particularmente antifungal, cuando se' aplica al medio ambiente de un patógeno objetivo mientras que el pretratamiento no sea perjudicial a la actividad. Tal tratamiento puede ser . por medios químicos y/o físicos mientras que el tratamiento no afecte perjudicialmente las propiedades de la(s) composición (es) . Ejemplos de reactivos químicos incluyen, pero no están limitados a, agentes de halogenación; aldehidos tal como formaldehído y glutaraldehído; anti-infecciosos tal como' cloruro de zefirán; alcoholes, tal como isopropanol y etanol; y fijadores histológicos, tal como el fijador de Bouin y el fijador de Helly (ver, por ejemplo, Humason (1967) Animal Tissue Techniques (W.H. Freeman and Co.) . Las composiciones antipatogénicas de la invención se pueden aplicar al medio ambiente de un patógeno, de planta mediante, por ejemplo, rociado, atomización, espolvoreamiento, dispersión, recubrimiento o vaciado, la introducción dentro o sobre la tierra, la introducción en el agua de irrigación, mediante el tratamiento de semilla o la aplicación general o el espolvoreamiento en- el momento cuando el patógeno ha comenzado a aparecer o antes de la aparición de los patógenos como una medida .protectora. Por ejemplo, la proteína antipatogénica y/o un microorganismo transformado de la invención se puede mezclar con grano para proteger al grano durante el almacenamiento. Generalmente es importante obtener buen control de patógenos en las etapas tempranas del crecimiento de la planta, ya que este es el tiempo cuando la planta puede ser más severamente dañada. Las composiciones de la invención convenientemente pueden contener un insecticida sí esto se cree necesario. En una modalidad de la invención, la composición se puede aplicar directamente a la tierra, en el momento de la plantación, en forma granular de una composición de un portador y células muertas de una cepa de Bacillus o el microorganismo transformado de la invención. Otra modalidad es una forma granular de una composición que comprende un agroquímico tal como por ejemplo, un herbicida, un insecticida, un fertilizante, un portador inerte y células muertas de una cepa de Bacillus o microorganismo transformado de la invención. Las composiciones de la invención encuentran uso en la protección de plantas, semillas y productos de plantas en una variedad de maneras. Por ejemplo, las composiciones se pueden utilizar en un método que involucra colocar una cantidad efectiva de una composición antipatogénica, más particularmente antifungal, en el medio ambiente del patógeno mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de rociado, espolvoreamiento, - dispersión o recubrimiento de semilla.

Antes de que el material de propagación de plantas (fruto, tubérculo, bulbo, tallo bulboso, granos, semillas) , pero especialmente semilla, sea vendido como un producto comercial, este usualmente se trata con un recubrimiento protector que comprende herbicidas, insecticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, molusquicidas o mezclas de varias de estas preparaciones, sí es deseado junto con portadores adicionales, surfactantes o adyuvantes promotores de aplicación usualmente empleados en la técnica de formulación para proporcionar protección contra el daño causado por pestes bacterianas, fúngales o de animales. Con el fin de tratar la semilla, el recubrimiento protector puede ser aplicado a la semilla ya sea al impregnar los tubérculos o granos con una formulación líquida o al recubrirlos con una formulación húmeda o seca combinada. Además, en casos especiales, otros métodos de aplicación en una planta son posibles, por ejemplo, el tratamiento dirigido en los brotes o el fruto. La semilla de planta de la invención que comprende una molécula ?e DNA que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido antipatogénico de la invención se puede tratar con un recubrimiento protector de semilla que comprende un compuesto de tratamiento de semilla, tal como por ejemplo, captan, carboxin, tirara, metalaxilo, pirimifos-metilo y otros que son comúnmente utilizados en el tratamiento de semilla. Alternativamente, una semilla de la invención comprende un recubrimiento protector de semilla que comprende una composición antipatogénica, más particularmente antifungal, de la invención que se utiliza sólo o en combinación con uno de los recubrimientos protectores de semilla usualmente utilizados en el tratamiento de semilla. Los polipéptidos antifungales de la invención se pueden utilizar para cualquier aplicación incluyendo eí recubrimiento de superficies a microbios objetivo. De esta manera, los microbios objetivo incluyen patógenos o microorganismos de humanos. Las superficies que podrían ser recubiertas con los poiipéptidos antifungales de la invención incluyen alfombras e instalaciones médicas estériles. Los polipéptidos enlazados a polímeros de la invención se pueden utilizar para recubrir - superficies. Los métodos para incorporar composiciones con propiedades antimicrobianas en polímeros son conocidos en la técnica. Ver la patente norteamericana No. 5,847,047, incorporada en la presente por referencia. Las modalidades de la presente invención pueden ser efectivas contra una variedad de patógenos de plantas, tales como, por ejemplo, Colletotrichum grarainocola , Diplodia maydis , Verticillium dahliae, Fusarium graminearum y Fusarium verticillioides . Los patógenos de la invención incluyen, pero no están limitados a, virus o viroides, bacterias, insectos, nematodos, hongos y los similares. Los virus incluyen cualquier virus de planta, por ejemplo, el virus de mosaico de tabaco o pepino, virus de mancha de anillo, virus de necrosis, virus de mosaico de maíz enano, etc. Los patógenos fúngales, incluyen pero no están limitados a, Colletotrichum graminicola , Diplodia maydis , Fusarium gr.aminearum, y Fusarium verticillioides . Patógenos específicos para los cultivos mayores incluyen: Soyas : Phytophthora megasperma fsp. glycinaa , Macropho ina phaseolína , Rhizoctonia solani , Sclerotinia sclerotíorum , Fusarium oxysporum, Dlaporthe phaseolorum var. sojae (Phomopsis sojae) , Diaporthe phaseolorum var. caulivora , Sclerotium rolfsii , Cercospora kikuchii , Cercospora soj ina , Peronospora manshurica , Colletotrichum dema tíum (Colletotrichum trunca tum) , Corynespora cassíicola , Septoría giycines , Phyllosticta sojicola , Al ternarla al ternata , Pseudomonas syringae p.v. glycínea, Xanthomonas campestris p. v. phaseoli , Microsphaera dif f usa , Fusari um se itectum, Phialophora grega ta , virus de mosaico de soya, Glomerella glycines , virus de mancha de anillo de Tabaco, virus Rayado de Tabaco, Phakopsora pachyrhizi Pythium aphaniderma tum, Pythium ultimum, Pythium debaryanum, virus silvestre de mancha de Tomate, Heterodera glycines Fusari um solani ; Cañóla : Albugo Candida , Alternarla brassicae/ Leptosphaeria maculans , Rhizoctonia solani , Sclerotinia sclerotiorum,' Mycosphaerella brassicicola , Pythium ultimum, Peronospora parasítica, Fusarium roseum, Al ternaría al ternata; Alfalfa: Clavibacter michiganese subsp. insidiosum, Pythium ultimum, Pythium irregulare, Pythium splendens, Pythium debaryanum, Pythium aphanidermatum, Phytophthora megasperma, Peronospora trífoliorum, Phoma medicaginís var. medica ginis , Cercospora medicaginis , Pseudopeziza medicaginis , Leptotrochila medicaginis, Fusarium oxysporum, Verticillium albo-atrum, Xanthomonas campastris p. v. alfalfae, Aphanomyces auteiches , Stamphylium herbarum, Stamphylium alfalfas, Colletotríchum trifolii , Leptosphaerulina briosiana, Uromyces striatus , Scíerotinia trifoliorum, Stagonospora malilotí, Stemphylium botryosum, Leptotrichíia medícaginis; Trigo: Pseudomonas syringae p.v. a tro f aciens , Urocystis agropyri , Xanthomonas campestris p.v. translucens, Pseudomonas syringae p.v. syringae, Alternarla alternata , Cladosporium herbarum, Fusarium graminearum, Fusarium avenaceum, Fusarium cuímorum, Ustilago tritici , Ascochyta tritici , Cephalospcrium gramineum, Collotetrichum graminicola / Erysiphe graminis f. sp. tritici , Puccinia graminis f.sp. tritici , Puccinia recóndita f.sp. tritici , Puccinia striiformís , Pyrenophora triticí-repentis , Septoria nodorum, Saptoria tritici , Septoria avenae, Pseudocarcosporella herpotrichoides , Rhizoctonia solani, Rhizoctonia cerealis , Gaeumannomyces graminis var. tri tici , Pythium aphaniderma tum, Pythium arrhenomanes , Pythium ul timum, Bipolaris sorokiniana , Virus Enano Amarillo de Cebada, Virus de Mosaico de Bromo, Virus de Mosaico de Trigo Portado por la Tierra, Virus de Mosaico Rayado de Trigo, Virus Rayado de Espiga de Trigo, Virus Estriado de Trigo-Americano, Claviceps purpurea , Tilletia tri tici , Tilletla laevis, Ustilago tri tici , Tilletia indica , Rhizoctonia solani , Pythium arrhenomannes , Pythium gramicola , Pythium aphanidermatum, Virus de Altas Planicies, virus estriado de trigo Europeo; Girasol : Plasmopora haistadii , Sclerotinia sclerotiorum, ster Yellows, Septoria helian thi , Phomopsis helianthi , Al ternarla helian thi , Ai-ternaria zinniae, Botrytis cinérea , Phoma macdonaldii , Macrophomina phaseolina , Erysiphe cichoracearum, Rhizopus oryzae, Rhizopus arrhizus, Rhizopus stolonífe , Puccinia helianthi , Verticillium dahliae, Erwinia carotovorum pv. carotovora , Cephalosporium acremonium, Phytophthora cryptogea , Albugo tragopogonis; Maíz : Colletotrichum graminicola , Fusari um verti cillioides var. subgl utinans , Erwinia stewartii , F. verticillioides , Gibberella zeaa (Fusarium graminearum) , Stenocarpalla maydi (Diplodia maydis) , Pythium irregulare, Pythium debaryanum, Pythi um g-raminicoía , Pythium splendans , Pythium uitimum, Pythium - aphaniderma tum , Aspergillus flavus , Bipolaris maydis 0, T (Cochliobolus ' heterostrophus) , Helminthosporíum carbonum 1, II y III (Cochliobolus carbonum) , Exserohilum turcicum I, II y III, Helminthosporium pedicella tum , Physodarma maydis, Phyliosticta maydis, Kabatiella maydis, Cercospora sorghi, Ustilago maydis, Puccinia sorghi, Puccinia polysora , Macrophomina phaseolina, Penicillium oxalicum, Nigrospora oryzae, Cladosporium herbarum, Curvularia lunata , Curvularia inaequalis , Curvularia paliescens, Clavibacter michiganense subsp. nebraskense, Trichoderma viride, Virus de Mosaico de Maíz Enano A & B, Virus de Mosaico Rayado de Trigo, Virus Enano Clorótico de Maíz, Claviceps sorghi, Pseudomonas avenas, Erwinia chrysanthemi pv. zea, Erwinia carotovora, Corn stunt spiroplasma, Diplodia macrospora , Sclerophthora macrospora, Peronosclerospora sorghi, Peronosclerospora philíppinensis , Peronosclerospora maydis, Peronosclerospora sacchari, Sphacelotheca reiliana, Physopalla zeae, Cephalosporium maydis, Cephalosporium acremonium; Virus Moteado Clorótico de Maíz, Virus de Altas Planicies, Virus de Mosaico de Maíz, Virus Fino Rayado de Maíz, Virus Rayado de Maíz, Virus en Franjas de Maíz, Virus Enano Rugoso de Maíz; Sorgo : Exserohilum turcicum, C. sublineolum, Cercospora sorghi, Gloeocarcospora sorghi, Ascochyta sorghina, Pseudomonas syringae p.v. syringas, Xanthomonas camp&stris p.v. holcicola, Pseudomonas andropogonis, Puccinia purpurea, Macrophomina phaseolina, Parconia circinata, Fusaríum moniliforme, Alternaría alternata, Bipolaris sorghicola, Halminthosporium sorghicola, Curvularia lunata, Phoma insidiosa, Pseudomonas avenas (Pseudomonas alboprecípitans) , Ramuiispora sorghi , Ramulispora sorghicoia , Phyllachara sacchari , Sporisorium reilianum (Sphacelotheca reiliana) , Sphacelotheca cruenta , Sporisorium sorghi , Mosaico H de Caña de Azúcar, Virus de Mosaico de Maíz Enano A & B,- Claviceps sorghi , Rhizoctonia ' solani , Acremonium strictum, Sclerophthona, macrospora , Peronosclerospora sorghi , Peronoscierospora philippinensis, Sclerospora .graminicola , Fusarium graminearum, Fusarium oxysporum, Pythium arrhenomanes, Pythium graminicola, etc. Los nematodos incluyen nematodos parasíticos tales como nematodos de nudo de raíz, quiste y lesión, incluyendo Heterodsra spp., Meloidogyne spp., y Globodera spp.; particularmente miembros de los nematodos de quiste, incluyendo pero no limitados a, Heterodsra glicines (nematodo de quiste de soya) ; Heterodsra schachtii (nematodo de quiste de remolacha) ; Hetsrodsra avsnas (nematodo de quiste de cereal) ; y Globodsra rostochisnsis y Globodsra pailida (nematodos de quiste de papa) . Los nematodos de lesión incluyen Pratylsnchus spp. El artículo "un" y "una" se utilizan en la pre'sente para referirse a uno o más de uno (es decir, por lo menos uno) del objeto gramatical* del artículo. A manera de ejemplo, "un elemento" significa uno o más elementos. Por toda la especificación la palabra "que comprende", o variaciones tales como "comprende" o "comprendiendo", serán entendidos que implican la inclusión de un elemento, número entero o etapa establecido, o grupo de elementos, números enteros o etapas, pero no la exclusión de cualquier otro elemento, número entero o etapa, o grupo de elementos, números enteros o etapas. Las unidades, prefijos y símbolos se pueden denotar en su forma aceptada de SI. A menos que se indique de otra manera, los ácidos nucleicos se escriben de izquierda a derecha en la orientación 5' a 3' ; las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación de amino* a carboxi, respectivamente. Los intervalos numéricos son inclusivos de los números que definen el intervalo. Los aminoácidos pueden ser referidos en la presente por sus símbolos de tres letras comúnmente conocidos o por los símbolos de una letra recomendados por ia IUPAC-IUB Bióchemical Nomenchature Commíssion. Los nucleótidos, del mismo modo, pueden ser referidos por sus códigos de una sola letra comúnmente aceptado. Los términos definidos en lo anterior son más completamente definidos por referencia en la especificación como un conjunto. Los siguientes ejemplos se proporcionan a manera de ilustración, no a manera de limitación. EXPERIMENTAL Los métodos de crecimiento de cultivos fúngales son bien conocidos en la técnica. Para subcultivar los cultivos fúngales divulgados en la presente, cualquier caldo generalmente adecuado para cultivar hongos puede ser utilizado, incluyendo, por ejemplo, el caldo de dextrosa de papa infra (Becton Dickínson Microbiology Systems, Sparks, MD) , caldo Czapek-Dox infra (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks MD) , caldo Sabouraud (BBL #210986, Voigt Global Distribution LLC, Kansas City, MO) , y los similares. Ejemplo 1: Aislamiento del Polipéptido Antifungal LBNL-5220 (SEQ ID NO: 1) Una muestra ambiental se recolectó de una acumulación de lodo geotérmico (datos de GPS: 54°26'256" x 160°08' 385") localizado en el Kronotsky National Park en Kamchatka, Russia. El organismo, denotado en la presente como K01-17A5, que produjo el polipéptido antifungal LBNL-5220, se aisló de diversas colonias que crecieron en agar de dextrosa de papa utilizando técnicas de aislamiento y los medios como son publicados anteriormente (Hunter-Cevera, J.C. y Belt, A. 1999. Isolation of Cultures, Manual of Industrial Microbiology y Biotechnology, Chapter 1, pp. 3-20) . La caracterización a nivel molecular, basada en un análisis de éster metílico de ácido graso de células completas (FAME) y en la secuenciación de los dominios D1/D2 de los genes de codificación de RNA ribosomales de subunidad grande, se confirmó mediante la identificación basada en el fenotipo clásico. La cepa se identificó como el hongo ascomicetoso P&ni cillium simpli cissimum (Oudemans) Thorn (syn.

P. janthinellum Biourge) . Un conjunto designado de condiciones de crecimiento específicas, es decir, contenido de nutriente, temperatura, pH, tiempo.de incubación, aireación, etc., se aplicaron al hongo aislado para promover la producción de metabolitos secundarios y productos naturales novedosos. La biomasa y el sobrenadante de la fermentación microbiana resultante luego se separaron mediante centrifugación. El sobrenadante libre de células LBNL-5220 se analizó para determinar la presencia de la actividad antifungal inestable en calor. Después de la confirmación de que la actividad antifungal inestable con calor estuvo presente en el sobrenadante LBNL-5220, el sobrenadante libre de células de cultivo de 500 ml a gran escala se proporcionó y se sometió a la extracción en fase sólita, como es descrito enseguida. Los cartuchos de extracción HLB oasis (6 gramos, 35 mL) (Waters' Corporation, Milford, MA) se utilizaron para la extracción en fase sólida (SPE). Específicamente, el- cartucho SPE se hizo húmedo con un volumen de cartucho de metanol y luego se acondicionó con aproximadamente 40 mL de solvente A (acetonitrilo al 2%, TFA al 0.1%). El extracto se trató con 5X del solvente A a una concentración final de IX y se centrifugó durante 20 min a 3,000 x g. El sobrenadante se cargo en cartucho SPE, y el cartucho SPE se lavó con aproximadamente 40 mL de solvente A. El cartucho SPE se eluyó con aproximadamente 40 mL de acetonitrilo al 90%, TFA al 0.1%. La muestra eluída se secó parcialmente en un evaporador centrífugo (Speed Vac) y se congeló con nitrógeno líquido y se liofilizó a sequedad. El extracto seco se resuspendió en H20 desionizada (0.5 mL : 12.5 mL del filtrado de cultivo de partida) y el extracto resuspendido se enriqueció para las proteínas utilizando una columna de giro Sephadex GlO (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) . Las columnas de cromatografía desechable Bio-Spin (Bio-Rad Laboratories, Hercules CA) se llenaron a aproximadamente 0.75 mL del volumen de lecho con Sephadex GlO que se ha pre-equilibrado con solución salina regulada con fosfato (PBS) y se centrifugaron durante 1 minuto a 1,000 x g. 10X de PBS se adicionaron al extracto SPE a una concentración final de IX PBS. 200 µL del extracto SPE en PBS se adicionó a cada columna Bio-Spin pre-girada, y las columnas Bio-Spin cargadas se centrifugaron durante 5 minutos a 1,000 x g para eluir las proteínas. Los extractos tratados con Sephadex G-10 se probaron para la actividad antifungal contra FVE, CGR, FGR, y DMA utilizando un ensayo de placa antifungal, como es descrito en el Ejemplo 3. Los ensayos se realizaron en media área de las placas de fondo claro de 96 cavidades. FVE, FGR y DMA se probaron en 4,000 esporas/mL en X de caldo de dextrosa de papa (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks, MD) . CGR se probó en 4,000 esporas/mL en X de Czapek-Dox (Becton Dickinson Microbiology Systems, Sparks MD) + 180 mL/L de jugo V8. Los cultivos se dejaron desarrollar a 27 °C durante 24 horas. Los ensayos de registraron al visualizar el crecimiento fungal con un microscopio invertido . Los extractos antifungales se fraccionaron mediante HPLC con una columna Júpiter 5µ C5 300Á 150x4.6 mm (Phenomenex, Torrance, CA) . Las condiciones de partida de HPLC fueron acetonitrilo al 5%, ácido heptafluorobutírico (HFBA) al 0.5%, 0.4 mL/minuto. Después de la inyección, el gasto de flujo se elevó a 0.8 mL/minuto durante 1 minuto. Después de un minuto adicional, un gradiente de curva exponencial de 94 minutos (Waters gradient curve 7, Waters Corporation, Milford, MA) se inició a acetonitrilo al 86%, HFBA al 0.5%. Fracciones de 30 segundos se recolectaron en área de las placas se ensayo de fondo claro de 96 cavidades. Las placas que contienen extractos fraccionados luego se secaron en un evaporador centrífugo. Los extractos fraccionados secos luego se clasificaron para la actividad fungal como es descrito en lo anterior. Las fracciones de HPLC de aproximadamente 64 a 66 minutos se encontraron que tienen actividad antifungal contra FVE, CGR, FGR y DMA.

Fraccionamientos de HPLC adicionales se realizaron para acumular en volumen la fracción antifungal. Esta fracción antifungal acumulada en volumen además se purificó utilizando HPLC de µ-bore con una columna Zorbax 3.5µ C8 300Á 150x1.0 mm (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) . Las condiciones de partida fueron acetonitrilo al 5%, ácido trifluoroacético al 0.1% (TFA), 50 µL/minuto. Después de la inyección de la muestra un gradiente lineal de 40 minutos se inició a acetonitrilo a 23%, TFA al .0.1% TFA. Las fracciones se recolectaron manualmente, se secaron en un evaporador centrífugo y se analizaron para la actividad fungal como es descrito en lo anterior. Un pico que eluye en aproximadamente 27 minutos se encontró que tiene actividad de amplio espectro contra FVE, CGR, FGR y DMA. Los espectros de masa ESI se obtuvieron en un espectrómetro de masas Finnigan LCQ al infusionar directamente la muestra purificada de 1 µL/ minuto . La reducción y la alquilación se requirió para la secuenciación N-terminal eficiente. Aproximadamente 10 µg de proteína seca se resuspendió en 18 µL de bicarbonato de amonio 0.1 M, urea 8 M pH 8.3. Esta solución se transfirió al frasquito automuestreador de HPLC de volumen limitado. 1 µL de DTT 200 mM se adicionó y la solución se incubó a 50 °C durante 1 hora. Subsecuentemente, 1 µL de yodoacetamida 500 mM se adicionó, y la solución se incubó ,a 37 °C durante 30 minutos en 'la oscuridad. La alquilación con yodoacetamida luego se detuvo al adicionar 2 µL de ácido trifluoroacético al 25%. La proteína alquilada se purificó mediante HPLC de µ-bore en una columna Vydac C4 150x1.0 mm. Un gradiente lineal de 100 minutos se realizó a partir de acetonitrilo al 5%, TFA al 0.1% a acetonitrilo al 95% TFA al 0.1%. El gasto de flujo de la columna fue de' 50 µL'/minuto. Secuenciación N-terminal La elucidación completa de la secuencia expuesta en la SEQ ID NO: 1 mediante la secuenciación terminal requirió la secuenciación de los fragmentos LBNL-5220 digeridos con Asp-N (Calbiochem) . 5 µL (0.2 µg) de * Asp-N se adicionó a aproximadamente 10 µg de LBNL-5220 que se disolvió en 15 µL de fosfato de sodio a 50 mM, urea 0.5 M pH 7.5. Esta solución se incubó- durante aproximadamente 14 horas a 37 °C. Los fragmentos digeridos se purificaron mediante HPLC de µ-bore con una columna Zorbax 3.5µ C8 300Á 150x1.0 mm (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) . Las condiciones de partida fueron acetonitrilo al 5%, ácido trifluoroacético al 0.1% (TFA), 50 µL/minuto. Después de la inyección de la muestra un gradiente lineal, de 100 minutos se inició a acetonitrilo al 95%, TFA al 0.1%. Ejemplo 2: Aislamiento de los Polipéptidos Antifungales LBNL-5197/8-1 y LBNL-5197/8-2 (SED ID NOs: 3 y 5) y LBNL-09827 (SED ID NOs: 7 y 9) Las dos cepas distintas de otro organismo, denotadas en la presente como K01-17A2 y K01-17A4, que produjo los polipéptidos antifungales LBNL-5197/8-1 y LBNL- 5197/8-2 (SEQ ID NOs: 3 y 5) , respectivamente, se aislaron y una muestra ambiental que se recolectó como en el Ejemplo 1. Los organismos se seleccionaron a partir de diversas- colonias que crecieron en agar de dextrosa de papa. La caracterización a nivel molecular de las cepas, basada en el análisis de* éster metílico de ácido graso de célula completa (FAME) y la secuenciacíón de los dominios D1/D2 de los genes de codificación de RNA ribosomales de subunidad grande, se confirmó mediante la identificación basada en el fenotipo clásica. Los dos organismos se identificaron como cepas del hongo ascomicetoso Penicillium miczyinskii Zaleski (syn. 'P. soppi Zaleski). Un conjunto designado de condiciones de crecimiento específicas, es decir, contenido de nutrientes, temperatura, pH, tiempos de incubación, aereación, etc., se aplicaron a los hongos aislados para promover la producción de metabolitos secundarios y productos naturales novedosos. La biomasa y los sobrenadantes de las fermentaciones microbianas resultantes luego se separaron mediante centrifugación. Los sobrenadantes libres de células LBNL-5197 (K01-17A2) y LBNL- 5198 (K01-17A4) se analizaron para determinar la presencia de la actividad antifungal. inestable en calor. Después de confirmar que la actividad antifungal inestable en calor estuvo presente en los sobrenadantes LBNL-5197 (K01-17A2) y LBNL-5198 (K01-17A4), los sobrenadantes libres de células de cultivo de 500 ml a gran escala, se proporcionaron y se sometieron a la extracción en fase sólida, como es descrito en el Ejemplo 1. Otro organismo fungal de interés, IMV 00127, que produjo los polipéptidos antifungales LBNL-9827-1 y LBNL-9827-2 (SEQ ID NOs: 7 y 9), se aisló en agar de dextrosa de papa (PDA) de una muestra de grano de forraje aparentemente contaminada que se recolectó en la región Kharkov, Ucrania. El cultivo puro del organismo se mantuvo previamente en el D.K. Zabolotny Institute of Microbiology and Virology, Kiev, Ucrania, a temperatura ambiente en la lámina inclinada de agar de extracto de malta al sub-cultivarla en intervalos regulares. La cepa IMV 00127 se identificó como Monascus ruber al emplear métodos taxonómicos fúngales clásicos y las técnicas a nivel molecular, tal como el análisis de éster metílico de ácido graso (FAME) y la secuenciación del dominio D1/D2 del gel de codificación de rRNA de subunidad grande. Un conjunto designado de condiciones de crecimiento específicas, es decir, contenido de nutrientes, temperatura, pH, tiempo de incubación, aereación, etc., se aplicaron al hongo aislado para promover la producción de metabolitos secundarios y productos naturales novedosos. La biomasa y el sobrenadante de la fermentación microbiana resultante luego se separó mediante centrifugación. El sobrenadante libre de células LBNL-9827 se analizó para determinar la presencia de la actividad antifungal inestable en calor. Después de confirmar que la actividad antifungal inestable en calor estuvo presente en el sobrenadante LBNL-9827, el sobrenadante libre de células de un cultivo de 500-ml a gran escala se proporcionó y se sometió a la extracción en fase sólida, como es descrito en el Ejemplo 1. Los extractos antifungales se fraccionaron mediante HPLC como es descrito en el Ejemplo 1, y la actividad antifungal contra FV3, CGR, FGR y DMA se encontró en las fracciones de HPLC en 62-68 minutos. Los fraccionamientos de HPLC adicionales se realizaron para aumentar el volumen de la fracción antifungal como es descrito en el Ejemplo 1. Dos picos que contienen actividad anti-FVE se identificaron, los cuales se eluyeron a aproximadamente 23 (es decir, SEQ ID NO: 3) y 31 minutos (es decir, SEQ ID NO: 5), respectivamente. Los espectros de masas de ESI se obtuvieron en un espectrómetro de masas Finnigan LCQ al infusionar directamente la muestra purificada en 1 µL/minuto . La reducción y alquilación se realizó para preparar muestras para la secuenciación N-terminal eficiente como es descrito en el Ejemplo 1. La proteína alquilada se purificó mediante la HPLC de µ-bore en una columna Zorbax 3.5µ C8 300Á 150x1.0 mm (Agilent Technologies, Palo Alto, CA) . Las condiciones de partida fueron acetonitrilo al 5%, ácido trifluoroacético al 0.1% (TFA), 50 µL/minuto. 10 minutos después de la inyección de la muestra un gradiente lineal de 50 minutos se inició en acetonitrilo en 95%, TFA al 0.1%. Secuenciación N-terminal de la SEQ ID NO: 3 La elucidación adicional de la secuencia del Pico #1 (SEQ ID NO: 3) • mediante la secuenciación N-terminal requirió la secuenciación de los fragmentos del Pico #1 digeridos. Asp-N se utilizó para preparar fragmentos digeridos para la secuenciación. 5 µL de Asp-N 0.2 µg se adicionó aproximadamente 10 µg del Pico #1 que se disolvió en 15 µL de fosfato de sodio 50 mM, urea 0.5 M pH 7.5. Esta solución se incubó durante aproximadamente 14 horas a 37 °C.

Los fragmentos digeridos se purificaron mediante la HPLC de µ-bore con una columna Zorbax 3.5µ C8 300Á 150x1.0 mm.

(Agilent Technologies, Palo Alto, CA) . Las condiciones de partida fueron acetonitrilo al 5%, ácido trifluoroacético al 0.1% .(TFA), 50 µL/minuto. Después de la inyección de la muestra un gradiente lineal de 100 minutos se inició a acetonitrilo al 95%, TFA al 0.1%. Ejemplo 3: Ensayos de Actividad Fungal La actividad antifungal de los polipéptidos de la invención contra los patógenos fúngales Fusarium verticillioides (FVE) , Colletotríchum graminicola (CGR) , Fusarium graminsarum (FGR) y Diplodia maydis (DMA) se estimó utilizando un ensayo de placa estándar. Extractos de gel de sílice de cada hongo se almacenaron a -20 °C antes del uso. Preparación de cultivos para la producción de esporas: Cultivos de FVE se prepararon utilizando placas de agar V8. Los cultivos de FGR, CRG, y DMA se prepararon utilizando x de agar de harina de avena. Las recetas de los medios se proporcionan enseguida. Específicamente, los tubos que contienen extractos fúngales de gel de sílice almacenados a -20 °C se flamearon brevemente y aproximadamente 5 cristales se salpicaron sobre la superficie de agar. 2-3 placas de cada aislado fungal se prepararon. Los cultivos recientemente colocados en placa se almacenaron en una caja de plástico en la oscuridad a temperatura ambiente para impedir que se sequen los cultivos. Los cultivos nuevos se prepararon cada otra semana para mantener un suministro consistente de esporas. Preparación de Esporas Las esporas se prepararon de cultivo de 2-4 semanas de edad de FVE, FGR, CGR, y DMA. Para FGR, FVE, y DMA, una porción de la placa de cultivo se enjuagó con una pequeña cantidad del medio de ensayo. La solución de enjuague se permitió permanecer sobre las placas de DNA durante un tiempo suficiente para permitir la ruptura de los picnidios. El medio de ensayo luego se transfirió a un tubo estéril. Las muestras se giraron en vórtice, y las esporas se cuantificaron utilizando un hemacitómetro . Para CGR, una anilla estéril se arrastró suavemente a través de las áreas naranjas de la placa de cultivo. La anilla luego _ se inserto en un volumen pequeño del medio de ensayo, y el medio se mezcló con la anilla para suspender las esporas. Las muestras se estiraron en vórtice y las esporas se cuantificaron utilizando un hemacitómetro. Las esporas se diluyeron a la concentración deseada con el medio de ensayo (4,000 esporas por mL para FGR, FVE y CGR, y 6,000 esporas por mL para DMA) y se mantuvieron en hielo antes de comenzar el ensayo de actividad antifungal. Detalles de la Preparación de la Placa de Ensayo: Placas de fondo plano de 96 cavidades o placas no tratadas de área tratadas con cultivo no de tejido estándar (Costar) se utilizaron en los ensayos de placa antifungal. El medio de ensayo fue H x caldo de dextrosa de papa para FVE, FGR y DMA, y H x de Czapec-Dox V8 se utilizó para CGR. Los polipéptidos antifungales en varias concentraciones se adicionaron a las placas en 50 µL/cavidad para una placa de ensayo estándar o 25 µL/cavidad para una placa de media área. Un volumen igual del medio con esporas fúngales en 2 veces las concentraciones anterior luego se adicionó para iniciar el ensayo. Alternativamente las muestras conducidas fraccionadas de HPLC se analizaron al adicionar el medio con esporas fúngales (como en lo anterior) en placas de ensayo que las muestras de HPLC se han secado (Savant Speed-vac) . Las placas se sellaron con una membrana permeable.de gas ("Breathe-Easy", Cat. No. BEM-1, Diversified Biotech, Boston, MA) y el ensayo se dejó desarrollar en la oscuridad a 98 °C durante 24 a 48 horas. Después del período de incubación, las placas se colocaron en un microscopio invertido, y cada cavidad se examinó y se registró en una escala de 0-4, de acuerdo con los siguientes parámetros: 0=nada de inhibición de crecimiento fungal cuando se compara con el control negativo, 0.5=inhibición ligera (crecimiento total es menor que el control negativo pero el crecimiento de las esporas individuales no es distinto) , l=inhibición ligera (crecimiento total es menor que el control negativo pero el crecimiento de esporas individuales es evidente, aunque no muy confluentes), 2=inhibición moderada (crecimiento de 1 espora puede fácilmente ser identificado y es significativamente menos abundante que el control negativo; el crecimiento de cada espora tiende a hacerse esférica) , 3=inhibición fuerte (las esporas han germinado pero el crecimiento es limitado a unas cuantas ramificaciones de hifas cortas) , 4=inhibición completa (las esporas no han germinado. Ver, por ejemplo, Duvick y colaboradores, (1992) J. Biol . Chem . 267:* 18814-18820). Una hoja de registro que contiene ejemplos representativos, de cada nivel de actividad antifungal se proporciona en la Figura 3. Resultados La Figura 4 proporciona los resultados fotográficos de ensayos de actividad antifungal con el polipéptido expuesto en la SEQ ID NO: 1. Este polipéptido mostró actividad antifungal contra FVE, FGR, CGR, y DMA. Las Figuras 5A y 5B proporcionan los perfiles de actividad antifungal obtenidos en los ensayos con los polipéptidos expuestos en la SEQ ID NO: .3 y SEQ ID NO: 9, respectivamente. Ambos polipéptidos inhibieron FVE, FGR, CGR, y DMA en una manera dependiente de la dosis. El polipéptido LBNL-9827-1 (SEQ ID NO: 7) purificado- en HPLC parabién se probó en ensayos antifungales contra FVE. Los resultados de este experimento indicaron que este polipéptido es activo contra FVE (datos no mostrados) . Notablemente, la SEQ ID NO: 7 es idéntica a la SEQ ID NO: 9 excepto que la * SEQ ID NO: 9 comprende 3 aminoácidos N-terminales adicionales. Recetas de los Medios: Caldo lx Czapek-Dox V8 : Por cada litro, se suspenden 35 gramos de caldo Difco Czapek-Dox (#233810) en H20 y se adicionan 180 mililitros de jugo V8 que se ha clarificado mediante centrifugación (3,000 x g en abundancia). Se eleva el volumen final' a 1 litro y se pone en autoclave a 121°C durante 20 minutos. El medio se esteriliza en filtro para remover cualquiera de los residuos restantes. Caldo de dextrosa de papa lx Por cada litro, se suspenden 24 gramos de Caldo de Dextrosa de Papa Difco (#0549-17-9) en dH20 y se eleva el volumen final a 1 litro y se coloca en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. El medio se esteriliza en filtro para remover cualquiera de los residuos restantes. CCM (medio completo de Cochliobolus) : Solución A: 10 gramos de Ca (N03) 2 • 4H20 por 100 mL Solución B: 2 gramos de KH2P04 + 1.5 gramos de NaCl por 100 mL. Se ajusta el pH a 5.3 con NaOH Solution C: 2.5 grams MgS04.7H20 por 100 mL Se colocan 900 mL de dH20 en el recipiente sobre la placa de agitación. Se adiciona al agua en orden y se permite " que cada componente se disuelve ante de proceder a la siguiente etapa: 10 mL de* solución A 10 mL de solución B 10 mL de solución C 10 gramos de glucosa 1 gramo de extracto de levadura Difco 0.5 gramos de hidrolizado de caseína (ácido) 0.5 gramos de hidrolizado de caseína (enzima) . Se lleva el volumen vinal a 1 litro y se esteriliza el filtro, pero no se coloca en autoclave. x de CCM-fosfato se hace al diluir el medio CCM lx a ^ x con solución reguladora de fosfato de 10 mM, pH 5.8. Agar V8 : Para cada litro, se disuelven 180 mL de jugo V8 y 3 gramos de carbonato de calcio en 820 mL de agua desionizada y luego se adicionan 17 gramos de Bacto-agar en dH20 en un recipiente de 4 litros. 10 gotas de antiespumante A al 5% se pueden adicionar opcíonalmente por litro preparado. Se cubre y se coloca en autoclave a 121°C durante 20 minutos. Se vacían las placas en la campana estéril. Agar de Harina de Avena : Por cada litro, se suspenden 36.24 gramos de Agar de Harina de Avena Difco (#0552-17-3) y 4.25 gramos de agar en dH20 en un recipiente de 4 litros, se cubre y se coloca en autoclave a 121 °C durante 20 minutos. Se vacían las placas en la campana estéril.

Ejemplo 4: Identificación de la SEQ ID NO: 11 y 15 a Partir de una Búsqueda de Homología en Computadora Las identidades de gen se pueden determinar al conducir búsquedas BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S.F., y colaboradores, (1993) J. Mol . Biol . 215:403-410; ver también www. ncbi . nlm. nih. gov/BLAST/) bajo parámetros de error para la similitud de secuencias contenidas en la base de datos BLAST "nr" (que comprende todas las traducciones de GenBank CDS no redundantes, secuencias derivadas de la estructura tridimensional Brookhacen Protein Data Bank, la última mayor liberación de la base de datos de secuencia de proteína SWISS-PROT, EMBL y bases de datos de DDBJ) . Las secuencias de polinucleótido de la invención (es decir, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 y 9) se analizaron para la similitud a todas las secuencias de DNA públicamente disponible contenidas en la base de datos "nr" utilizando el algoritmo BLASTN. Las secuencias de DNA se tradujeron en todas las estructuras de lectura y se compararon para la similitud a todas las secuencias de proteína públicamente disponible contenidas en la base de datos "nr" utilizando el algoritmo BLASTX (Gish, W. y States, D.J. Na tura Gsnstics 3:266-272 (1993)) proporcionado por el NCBI . La alineación múltiple de las secuencias se realizó utilizando el método de alineación Clustal (Higgins y Sharp (1989) CABIOS. 5:151-153) con los parámetros de error (SANCIÓN DE ESPACIO=10, SANCIÓN DE LONGITUD DE ESPACIO=10) . Los parámetros de error para las alineaciones por pares utilizando el método de Clustal son KTUPLE 1, SANCIÓN DE ESPACI0=3, VENTANA=5 y DIAGONALES SALVADAS=5. La SEQ ID NO: 11 se identificó a partir de una base de datos de Pioneer patentada y se concluyó que se origina de un hongo no específico endémico a plantas de maíz (cereal) . La secuencia se encontró que está relacionada a aquellas secuencias ya identificadas de la prueba de los caldos de fermentación microbianos y mostrada que tiene actividad antifungal (es decir, SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 y 9). La SEQ ID NO: 11 es claramente un miembro de la misma familia de proteínas antifungales . La SEQ ID NO: 15 se identificó de una base de datos de secuencia pública, sin embargo, el gen no fue específicamente identificado en la secuencia disponible; esto es, la ORF no fue predicha ni anotada por el dominio público. Los inventores encontraron e identificaron el gen y su ORF que codifica una secuencia de péptido, que fue claramente relacionada a las otras secuencias probadas, conocidas de la invención. La secuencia identificada (SEQ ID NO: 15) claramente pertenece a la misma familia de proteínas antifungales . Ejemplo 5: Análisis de Secuencia de Polipéptidos Antifungales La Figura 1 muestra una alineación de las secuencias de aminoácidos expuestas en las SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7, y 9 con varios polipéptidos conocidos que comparten similitud de secuencia con los polipéptidos antipatogénicos de la invención. Además, las tablas que resumen los datos de identidad y similitud globales se presentan en la Tabla ÍA y Tabla IB. Los valores de por ciento de identidad y similitud se calcularon utilizando GAP con todos los parámetros de error, excepto que se seleccionó el parámetro de los espacios de extremo de penalización. Ver la Figura 2 para la alineación limitada a las secuencias novedosas divulgadas en la presente. TABLA ÍA: Tabla de Identidad Global En particular, el análisis de las secuencias de aminoácidos divulgadas en la presente reveló que la SEQ ID NO: 1 comparte 48.2% de identidad de secuencia y 55.6% de similitud de secuencia con la SEQ ID NÓ: 3; 40.7% de identidad de secuencia y 48.2% de similitud de secuencia con la SEQ ID NO: 5; 35.2% de identidad de secuencia y 44.4% de similitud de secuencia' con la SEQ ID NO: 7 y 33.3% dé identidad de secuencia y 42.6% de similitud de secuencia con la SEQ ID NO: 9. La SEQ ID NO: 3 comparte 36.8% de identidad de secuencia y 40.4% de similitud de secuencia con la SEQ ID NO: 5; 38.6% de identidad de secuencia y 45.6% de similitud de secuencia con la SEQ ID NO: 7; y 40.4% de identidad de secuencia. y 47.4% de similitud de secuencia con la SEQ ID NO: 9. La SEQ ID NO: 5 comparte 84.5% de identidad de secuencia con ambas de la SEQ ID NOs: 7 y 9 y comparte 89.7% de similitud con ambas de las SEQ ID Nos: 7 y 9. De particular interés fue la relación de las secuencias de aminoácido de la SEQ ID NOs: 7 y 9. Estos dos polipéptidos comparten 100% de identidad de secuencia sobre un estiramiento de 58 residuos de aminoácido. Las dos secuencias difieren solamente en que la SEQ ID NO: 9 tiene 3 aminoácidos adicionales en la porción N-terminal del polipéptido. LBNL-9827-1 (SEQ ID NO: 7) y LBNL-9827-2 (SEQ ID NO: 9) se cree que son- codificadas por el mismo gen pero resultan de diferencias en el procesamiento post-transcripcional. Notablemente, ' ambos de estos polipéptidos exhiben actividad antifungal, como es descrito en el Ejemplo 3. Ejemplo 6: Aislamiento del Gen LBNL-5197/8-1 Para el aislamiento del gen LBNL-5197/8-1, un número de cebadores degenerados se diseñaron a la secuencia de péptido. Estos fueron en cada muestra de DNA (DL1 a DL4) con los cebadores de GenomeWalker apropiados en dos rondas de PCR. La combinación de cebadores que produjo un fragmento del gen LBNL-5197/8-1 y como se realizó esta PCR se describen enseguida: En la PCR de primera ronda, el cebador de Clontech API (secuencia 5' -GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' ) (SEQ ID NO: 43) y el cebador específico de gen (gsp) 12R (secuencia 5'-RTCRTANGTRCAYTTRTTNCCRTCYTTYTC-3' ) (SEQ ID NO: 44) se utilizaron. La PCR se realizó en un ciclador térmico modelo PTC-100 con Hot'Bonnet de MJ Research (Watertown, Maine) utilizando reactivos suministrados con el equipo de GenomeWalker . Los siguientes parámetros de ciclado se utilizaron: siete ciclos de 94 °C durante 2 segundos, luego 65 °C durante 3 minutos, seguido por 28 ciclos de 94 °C durante 2 segundos y 45 °C durante 3 min. Finalmente, las muestras se mantuvieron a 45°C durante 7 minutos, luego a 4°C hasta el análisis adicional. Como es descrito en el Manual del Usuario de GenomeWalker, el DNA de la primera ronda de PCR luego se diluyó y sirvió como una plantilla en una segunda ronda de PCR utilizando el cebador de Clontech AP2 (secuencia 5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3' ) (SEQ ID NO: 45) y gsplOR (secuencia 5'-NGGRCAYTTNACRAARTGNGT-3' ) (SEQ ID NO: 46). Los parámetros del ciclado para la segunda ronda fueron: 5 ciclos de 94 °C durante 2 segundos, luego 65 °C durante 3 minutos, seguido por 20 ciclos de 94 °C durante 2 segundos y 45 °C durante 3 minutos y finalmente 7 minutos a 45 °C. Aproximadamente 8 µL de cada reacción se corrieron un gel de agarosa al 1.0% y las bandas se extirparon y se purificaron con el kit de extracción de gel QIAquick, Qiagen, Inc. (Valencia, Calif.) y se clonaron en el vector de pCR-Blunt (Invitrogen, San Diego, Calif.). Los clones se secuenciaron para la verificación. Un fragmento que contiene 124 bp del gen LBNL-5197/8-1 (secuencia 5'- AGGACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCTCGGGCTGGTTAATTACTTGT TCCAGAAATGTTATACAAATGGCAACAATTGTAAGTACGATAGTGATGGG AAGACCC?TTTCGTCA??TGTCCC-3' ) (SEQ ID NO: 47) se obtuvo de la plantilla DL-2 utilizando las combinaciones de cebadores anteriores. Este 124 bp corresponde a la secuencia de aminoácidos en negritas, enseguida, de la secuencia de aminoácidos madura de LBNL-5197/8-1 y 55 bp del primer intrón: I0YTG?KCYTNGNNCK DSDGKTHFVKCPS7ANTK CEKDGNKCTYDSYNGKVKCDFRH (SEQ ID NO: 3; secuencia en negritas SEQ ID NO: 48) . Con el fin de obtener la secuencia de gen completa, cebadores de GenomeWalker adicionales, no degenerados o "genuinos" se diseñaron de la secuencia de 124 bp que corre en ambas de las' direcciones delantera y trasera. La PCR de primera ronda se llevó - a cabo con el cebador delantero phn76125 (secuencia 5' -TGGTTAATTACTTGTTCCAGAAA-3' ) (SEQ ID NO: 49) o el cebador trasero phn76Í28 (secuencia 5'-CCCATCACTATCGTACTTACAAT-3' ) (SEQ ID NO: 50) y el cebador de Clontech API utilizando DL1-4 como plantilla. La PCR de segunda ronda se realizó utilizando el cebador de Clontech AP2 ya sea el cebador delantero para phn76127 (secuencia 5'- AAATGGCAACAATTGTAAGTACG-3' ) (SEQ ID NO: 51) o el cebador trasero phn76129 (secuencia 5' -GTATAACATTTCTGGAACAAGTAAT-3' ) (SEQ ID NO: 52) de productos diluidos de las reacciones de primera ronda. Sí se utilizó un cebador delantero en la primera ronda, entonces el cebador delantero interno se utilizó en esa plantilla diluida para la segunda ronda, la misma que es verdadera para como se utilizaron los cebadores traseros. Las condiciones de ciclado para ambas rondas de PCR fueron las mismas como se utilizaron para clonar el fragmento de 124 bp . La purificación de -la banda y la clonación fueron como es descrito en lo anterior. Fragmento de gen de 124 bp (SEQ ID NO: 47) y colocación de los cebadores "genuinos": phn76129 AGGACTATAGX^CACGCGTGGTCGACGGCTCGGGCTGOTTAATTACTTGTTCCIAGAAATGTT AT phn76125 phn76128 AC^ ^TGGCAAClAATTGTAAGTACGATAGTGATGGGAAGACCCATT rCGTa^A?TGTCCC phn76127 Notablemente , las primeras 3 bases , AGG , pueden ser del vector de clonación . La porción 5 ' del gen 5197 / 8 - 1 se obtuvo utili zando el par de cebadores traseros y DL-2 como plantilla : >R2-8, 432 bp.(SEQ ID NO:53) CTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGTCTGAACATCTTCGACTATGTAATAA TAGCCCTTATTAGGCTCAATAATCTTTCGGTAACGGCCCCCATGATGACTGCGTCGAAAA TGGTGATCATGCTTGTCACATCTTCTACAGGGATCATGATAACTCCTATATAAGACAGCC CCTCGGAACLATTTGATCCATCTTCCCAATCGTCTCGACC^ACGATTCAAGCCATTCACCA TGCAGATTGCCAATATTTCGCTTTTCCTTTTCGCTGCCATGGGTACGATTGCTAGTCCCC TTGATGCCGAGTCCGACGACCTCAGTGCTAGAGACGTGAATGCTGCCGACATTCAGTACA CCGGA[GTGAGATTATTACAGCACATGCAGACATGAGAACGAAGCTAATTACTTGTTCCAG] AAATGTTATACC (Las regiones exónícas en cursivas, íntrónicas en corchetes; el codón de 'inicio predicho en negritas) . La mitad 3*" del gen 5197/8-1 y las secuencias corriente abajo se obtuvieron utilizando el par de cebadores delanteros y la plantilla DL-1: >Fl-3, 960 bp.(SEQ ID NO:54) AATGGCAACAATTGTAAGTACGATAGTGATGGGAAGACGCACTTTGTCAAGTGCCCTAGC GCCGCCAACACAAA[GGTATCTTTCCTTTATAATTAAGCATATTGACCTCGACTAACCTT GATCATTAACTTTCGAG] TGCGAGAAGGACGGAAATAAGTGCACATATGACTCCTACAAC GGAAAGGTCAAGTGCGACRRCCGCCA? IVTTAAGCTATTTCAAACGGCTGTTCCTGGCCAT TCTTCTTACCAGCAAGTGTGAGATGCCATGTGATTCTCAGTGCCTACAATTCGTGTCAAG AAAGGCTAGGAACAAGCAGTATTGAATATGTGTTGGGTGAATACATATGTGATGTCCATC CCCAGTATCTCGCTCTTCTGTGATTTTTGCTATGACCCCACTCGTTTATTATCTAGCTAG ATACTTTTGCTTATCAATATTTTTGCTCATCAATAAATTGCTCATTGACTGCCTGATGTT TTGAGCATCTCTGTGAATCAGACAATATCCTAGTCATCTATGTATTGCTA?GTCATGCTA GTAGCCTGACACTCTGGTAGCTACCAACTTCTCAACGAATCTGACCGGAAGGATTCTCTC CGGC.AGTTTGAACAATCCGAAAGTTTGACAATTACCAGAACCTCAGAACATATATATTTC TATCTGGTGCATGTAAGGGGTGTAATCATTTCTTATTTGTATACCTTAGAAGATATAGCG GACGTGCGAAGGGCTGCATTGAGAGAAAAGAGAAACATTGAACTCGGAAGCCAAAGTAGG AGAGAAGCTAAGAAAGAAGGAGAGAGATCTGATGGACTTCTTTCTTGAAAACTGCTTTCG GGCCTTCCTTCACGTCTTACTTAATTTGCGCCATCCTTTGAGTCATCCTTCAAGTCTTCA TTTCCCGTAGCCTCACTCTTTACCAGCCCGGGCCGTCGACCACGCGTGCCCTATAGTCCT (Regiones exónicas en cursivas, intrónicas en corchetes; el codón de detención en negritas, la señal de poliadenilación putativa subrayada) . Basada en la secuencia de DNA el polipéptido de longitud completa tiene la secuencia (SEQ ID NO: 55) : MOIAMSLFIJAAMGTIASPLPAESDPLSABPVNAAl) IQYT^KCYWGNNCK?DSDGKmFVKCPSAANTK^CEKDGNKCTYDSYNGKVKCDFRH Letras subrayadas : secuencia de señal predicha Letras en negritas : secuencia de propéptido Letras en cursivas : péptido maduro ? : posición del intrón en la secuencia genómica correspondiente . Con el fin de clonar el gen LBNL-5197/8-1 como una sola molécula, la PCR se realizó en el DNA genómico de LBNL-5197 utilizando phn76685 (secuencia 5'- AATTGCGGCCGCATGCAGATTGCCAATATTTCGCTTTTCC-3 ' ; el sitio para la enzima de restricción Notl subrayado) (SEQ ID NO: 56) y phn76686 (secuencia 5'- TATATGGATCCTTAATGGCGGAAGTCGCACTTGACCTTTC-3 ' ; el sitio para la enzima de restricción BamHl subrayado) (SEQ ID NO: 57). La PCR se- corrió en un MJ PTC100 con HotBonnet utilizando el kit de PCR Advantage-HF2 (BD BioSciences) con las siguientes condiciones de ciclado: 94 °C durante 30 segundos, seguido por 35 ciclos de 94 °C durante 15 segundos, 54 °C durante 30 segundos, 74°C durante 1.5 minutos, después de lo cual las reacciones se incubaron a 74 °C por 2 minutos adicionales, luego se mantuvieron a 4°C hasta el análisis adicional. Las bandas se purificaron como es descrito en lo anterior, se cortaron con BamHl y Notl, se purificaron en gel nuevamente, y luego se clonaron en un vector interno para la verificación de la secuencia. La secuencia genómica para LBNL-5197/8-1 se expone en la SEQ ID NO: 58. El gen que codifica la secuencia de péptido de longitud completa para LBNL-9827-1 y LBNL-9827-2 se aisló de manera similar mediante los experimentos de GenomeWalker . La secuencia genómica de M. ruber que codifica LBNL-9827-1 y LBNL-9827-2 de longitud completa se expone en la SEQ ID NO: 66. El polipéptido de longitud completa codificado por la SEQ ID NO: 66, incluyendo un péptido de señal predicha y una región de pro-péptido, se expone en la SEQ ID NO: 67.

Ejemplo 7: Preparación de Construcciones de Expresión Una construcción de expresión de T-DNA se hizo para la transformación del maíz por la vía de Agrobacterium tumsfacisns para lograr altos niveles de acumulación extracelular constitutiva del péptido de la SEQ ID NO: 1 (péptido maduro LBNL-5220) . El promotor en este caso fue el promotor de ubicuitin de maíz y el primer intrón (UBI) fusionado corriente abajo al elemento aumentador 35S (un elemento aumentador derivado del aumentador 35S del virus de mosaico de coliflor SEQ ID NO: 33) . Este promotor estuvo corriente arriba de la secuencia de nucleótido (SEQ ID NO: 34) que codifica el péptido de señal de alfa-amilasa de cebada (SEQ ID NO: 35). Esta secuencia de codificación de péptido de señal estuvo corriente arriba en la estructura de la secuencia de nucleótidos artificial de la SEQ ID NO: 2 que codifica el aminoácido de la SEQ ID NO: 1. La señal de poliadenilación fue del inhibidor de proteinaza de papa II (PINII) . La .fusión resultante se diseño en un vector de expresión de T-DNA (designado PHP22300) para la transformación del maíz por la vía de Agrobacterium tumefaciens . Con el fin de lograr la acumulación inducible por * patógeno del péptido con la SEQ ID NO: 1 dentro del lumen de retículo endoplásmico en el maíz, se diseñó un vector de expresión de T-DNA diferente. El promotor de ZmPRl-81 (SEQ ID NO: 36; patente norteamericana No. 6,429,362) se enlazó a la secuencia de nucleótidos que codifica el péptido de señal de alfa-amilasa de cebada (SEQ ID NO: 34) y estuvo corriente arriba en la estructura de la secuencia de nucleótido artificial de la SEQ ID NO: 37, que codifica el péptido maduro en LBNL-5220 con un KDEL de COOH-terminal (SEQ ID NO: 38) . La señal de poliadenilación fue del inhibidor de proteinaza de papa II (PINII) . La fusión resultante se diseñó en un vector de expresión de T-DNA (designado PHP22300-PR1) • para la transformación del maíz por la vía de Agrobacterium tumsfacisns . La construcción PHP22300 contuvo el gen BAR para la selección basada en herbicida de tejidos transformados en medio sólido. Los embriones inmaduros del genotipo GS3 se transformaron con la construcción PHP22300 por la vía del co-cultivo de Agrobacterium, y el callo establemente transformado se obtuvo al continuar la selección de herbicida en el medio sólido. La construcción PHP22300-PR1 contuvo el gen BAR para la selección basada en • herbicida de tejidos transformados en el medio sólido. Los embriones inmaduros de genotipo GS3 se transforman con la construcción PHP22300-PR1 por la vía del co-cultivo de Agrobacterium, y el callo establemente transformado se obtiene al continuar la selección de herbicida en el medio sólido.

Ejemplo 8: Ensayo de Estimulación de Fusarium verticillioides de Plántulas de Maíz que Expresan el Polipéptido Antifungal LBNL-5220 (SEQ ID NO: 1) Plántulas de maíz transformadas con la construcción PHP22300 descrito en lo anterior en el Ejemplo 7 que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido antifungal designado LBNL-5220 (SEQ ID NO: 1) operablemente enlazado al promotor ubicuitin se expusieron a una suspensión de esporas de una línea de F. vsrticilioidss transgénica que expresa el gen reportador ß-glucuronidasa (GUS) . Después de tres días, el tejido de explanta se recolectó y se analizó para los niveles de actividad de GUS.

La actividad de GUS se correlaciona con la biomasa fungal y, por lo tanto es indicativa de la resistencia de la plántula a la infección fungal. Esto es, entre menor es la actividad de GUS, menos presente está el hongo en el tejido de la plántula, y más resistente es la plántula de maíz al hongo. Los resultados del ensayo de estimulación de F. vsrticilioides se resumen en la Figura 6. El eje X representa diferentes eventos de transformación de maíz. Los niveles de actividad de la enzima GUS promedio (+/- error estándar de la media) para 4 explantas por evento de transformación de maíz se muestran en el eje Y. Los resultados obtenidos con las plántulas de control negativo transformadas con un plásmido de control de vector vacío se presentan como una barra sombreada. Una. disminución en la actividad de GUS promedio en las plántulas de maíz transformadas con PHP22300 para expresar el polipéptido antifungal LBNL-5220 (SEQ ID NO: 1) con relación a los controles se observó con todos los eventos de transformación del maíz, a grados variables. Las barras blancas representan los eventos de transformación en los cuales se observó una diferencia estadísticamente significante (eri el nivel de confidencia de 95%) en la actividad GUS con relación a aquella de las muestras de control. Los eventos de transformación en los cuales las disminuciones en la actividad de GUS con relación a los controles no fueron estadísticamente significantes (en el nivel de confidencia de 95%) se presentan como barras negras. Ejemplo 9: Acumulación y Actividad Antifungal de LBNL-5220 (SEQ ID NO: 1) en el Callo de Maíz Transgénico Acumulación de LBNL-5220-Análisis del Manchado de Western Los embriones de maíz de genotipo GS3 se transformaron con la construcción PHP22300 descrita en lo anterior. Los embriones se cultivaron para permitir el crecimiento del callo transgénico. 200 mg de eventos de callos seleccionados se homogenizaron en 400 µL de la solución desrreguladora de tratamiento de la muestra LDS NuPage (Invitrogen). 2.5 µL de sobrenadante tratado con calor (equivalente a -1.25 mg de tejido) se cargaron por franja de un gel de poliacrilamida. La electroforesis se realizó con geles de poliacrilamida Bis-Tris 4-12% NuPage (Invitrogen) en la solución reguladora de corrimiento de MES. El análisis de Western se realizó utilizando anticuerpos monoclonales dirigidos al polipéptido antifungal LBNL-5200. Los anticuerpos LBNL5220 se generaron previamente en ratones genéticamente inmunizados. Algunos de los eventos de transformación aparecieron para acumular cerca de 30 µg de LBNL-5220/g peso fresco (datos de manchado de Western no mostrados) . Acumulación de LBNL-5220 en Extractos de Callo de Maíz Transqénico - Análisis LC-MS (ESI-TOF) La acumulación de LBNL-5220 funcional en el callo de maíz transgénico también se estimó utilizando el análisis LC-MS (ESI-TOF) de los extractos de callo. Método de Extracción ds Callo 200 mg de muestra de callo se mezcló con 1.5 mL de PBS y se rompió con un batidor de cuentas (batidor de cuentas de 3-3/16") durante 2 minutos. Las muestras se centrifugaron y 1.3 mL del sobrenadante se transfirieron. Los sobrenadantes se llevaron a acetonitrilo al 2% y TFA al 0.1%. Las muestras se aplicaron a un cartucho HLB SPE Oasis- de 60 mg. El cartucho se lavó con acetonitrilo al 2%/TFA al 0.1%. La proteína se eluyó con acetonitrilo al 95%/TFA al 0.1% y se secó en un speed-vac. Las muestras luego se resuspendieron en 50 µL de agua y 10 µL (correspondiente a 35 mg de equivalente de peso fresco) se inyectaron sobre el LC-MS (0.3 mm x 100 mm Zorbax 300SB C8) . Resultados Un pico correspondiente a un péptido de origen de masa. 6174 Da, la masa de la proteína antifungal LBNL-5220 madura, se identificó (datos no mostrados) . Estos resultados confirman que la construcción de péptido de señal de alfa amilasa de cebada quimérico/LBNL-5220 es correctamente expresado y segmentado en el tejido de maíz para liberar la proteína LBNL-5220 madura. Ensayo de Actividad Antifungal del Polipéptido Antifungal al LBNL-5220 Aislado del Callo de Maíz Transgénico Extractos de callo de maíz transgénico se prepararon utilizando el método de extracción descrito en lo anterior con la excepción de que el extracto final se resuspendió en 100 µL de 1/4X PBS. Los extractos se registraron y se analizaron para la actividad antifungal contra Fusarium vsrticillioidss (FVE) esencialmente como es descrito en el Ejemplo 3. Resultados Los resultados de los ensayos de actividad antifungal se resumen enseguida en la Tabla 2 y en la Figura 7. Las guías de registro se proporcionaron en el Ejemplo 3. Los resultados indican que la proteína LBNL-5220 producida y aislada del callo de maíz transgénico tiene actividad antifungal . Tabla 2 :_ Registro de Actividad Antifungal de FVE de 30 Horas del Extracto de Callo de Maíz Transgénico ^Concentración relativa "1" = extracto de 240 mg de callo/100 µL Ejemplo 10: Acumulación de LBNL-5220 en las Plantas de Maíz Transgénicas de Generación TO - Análisis de Manchado de Western y Resistencia Fungal de Plantas de Maíz Transgénicas Los embriones de maíz de genotipo EFWWETX se transformaron con PHP22300, como es descrito en la presente. Los embriones se cultivaron para permitir la regeneración de las plantas de maíz transgénicas. La acumulación de LBNL-5220 en las muestras de hoja y del tallo superior se estimó mediante el manchado de Western, y la resistencia de las plantas de maíz transgénicas a Collstotrichum graminicola se analizó, como es descrito enseguida. Análisis del Manchado de Western Musstras ds Hoja Cuatro punciones de hoja se tomaron de cada etapa ~V7. Específicamente, dos punciones de hoja se tomaron de cada una de la hoja de arriba y abajo de una hoja inoculada y acumulada. Las punciones de hoja se homogenizaron en 200 µL de la solución reguladora de tratamiento de muestra LDS, y 50 µL del sobrenadante de cada miembro de evento se acumuló. 20 µL de sobrenadante (equivalente a ~5 mg de equivalentes de peso fresco) se cargó por franja de un gel de poliacrilamida. La electroforesis se realizó con los geles de poliacrilamida Bis-Tris 4-12% NuPage (Invitrogen) en la solución reguladora de corrimiento de MES. El análisis de Western se realizó como antes utilizando anticuerpos monoclonales dirigidos al polipéptido antifungal LBNL-5220. Musstras ds Tallo Superior Muestras de tallos superiores se tomaron aproximadamente 10 días después de la polinización (DAP). 1.5 cm del nodo e internodo inmediatamente abajo del internodo más superior inoculado se tomó. Las muestras se liofilizaron, se homogenizaron y se acumularon (10 mg de DW de cada uno de 4 miembros de evento) . Las muestras se extrajeron con 400 µL de la solución reguladora de tratamiento de muestra LDS, y µL (equivalente a 2 mg de DW o ~6 mg equivalente de FW) se cargó por franja. Para estimar la variabilidad de los niveles de LBNL-5220 entre los miembros de los mismos eventos de transformación, 5 mg de DW del polvo de tallo liofilizado de cada miembro se extrajo con 200 µL de la solución reguladora de tratamiento de muestra LDS, y 10 µL (0.25 nig de DW o -0.8 mg de equivalentes de FW) se cargó por franja. La electroforesis y el análisis de manchado de Western se realizaron para las muestras acumuladas y no acumuladas como antes. Resultados Todos los eventos PHP22300 se acumularon un polipéptido antifungal LBNL-5220 (datos no mostrados) . Los resultados de Western indican que el tejido de la hoja acumuló aproximadamente 2 µg de LBNL-5220/g FW, mientras que el tejido del tallo superior acumuló mayor que 20 µg de LBNL-5220/g DW. La variabilidad en los niveles de acumulación de LBNL-5220 entre los miembros del mismo evento transgénico se observó (datos no mostrados). Resistencia de las Plantas de Maíz Transgénicas que Expresan LBNL-5220 a Coll&totrichum graminicola Resistencia dsl tallo superior El iñternodo de tallo más superior inmediatamente abajo de la espiguilla de las plantas de maíz transgénicas de generación T0 se inocularon con C. graminicola . Después de aproximadamente cinco días, los tallos se registraron para la resistencia fungal al medir el por ciento de tejido infectado en un área de 10 cm2 centrada alrededor del sitio de inoculación. El por ciento de área infectada media para las plantas de control fue 84.7±2.6% y 54.4±1.4% para las plantas LBNL-5220. Los resultados de los ensayos de resistencia fungal se presenta en la Figura 8. Los internodos del tallo superior de los eventos transgénicos representados por las barras blancas fueron estadísticamente más resistentes a la infección de C. graminicola que los tallos del evento de control de vector vacío (barra sombreada; p<0.01 de Dunnett). Los asteriscos marcan los eventos que se utilizaron para el análisis de manchado de Western descrito en lo anterior. El tejido utilizado para los análisis de Western se recolectaron el mismo día que los internodos inoculados se registraron para la resistencia de enfermedad. La distribución de los registros de resistencia de C. graminicola del tallo superior para las plantas de control y LBNL-5220 se presentan en la Figura 9. Resistencia del tallo inferior El internodo más bajo de las plantas transgénicas de generación TO se inoculó con la suspensión de esporas de C. graminicola 10 DAP. Después de 21 días, los tallos se dividieron y el número de internodos que muestran más de 75% de la enfermedad se contaron. Solamente se analizaron los 5 internodos más inferiores. El registro medio para las -plantas LBNL-5220 'fue de 2.2+0.1 comparado con 4. O±O .2 para las plantas de control de vector vacío. La distribución de los registros de resistencia de C. graminicola del tallo inferior para las plantas de control LBNL-5220 se presentan en la Figura 10. Ejemplo 11: Expresión Transiente de LBNL-5220 (SEQ ID NO: 1) en Hojas de Nicotiana benthamíana Hojas de Nicotiana bsnthamiana se trataron ya sea simuladamente o se infiltraron con Agrobacterium que comprende una de las siguientes construcciones de expresión, utilizando los métodos estándares conocidos en la técnica: Prepro-LBNL-5220 (SEQ ID NO: 69) codifica la región de prepropéptido de la secuencia genómica para LBNL-5197/8-1 (SEQ ID NO: 58) enlazada al péptido LBNL-5220 maduro. La región de propéptido comprende el péptido de señal y la región de propéptido de la proteína LBNL-5197/8-1 de longitud completa (ver la SEQ ID NO: 55) . BAA-Pro-LBNL-5220 (SEQ ID NO: 70) codifica el péptido de señal de alfa-amilasa de cebada enlazada a la región de propéptido de la secuencia genómica para LBNL- 5197/8-1 (SEQ ID NO: 58) además enlazado al péptido LBNL-5220 maduro. BAA-LBNL-5220 (SEQ ID NO: 19) codifica el péptido de señal de alfa amilasa de cebada enlazado al péptido LBNL-5220 maduro. Todas las construcciones de expresión contuvieron el promotor de caulimovirus de mosaico Mirabilis (SEQ ID NO: 71) seguido por una secuencia guía de A-rich (SEQ ID NO: 72) que se ha mostrado que incrementan la expresión transiente de N. bsnthamiana . Las secuencias de nucleótidos para el vector que contiene las construcciones Prepro-LB?L-5220, BAA-Pro-LB?L-5220, y BAA-LB?L-5220 se exponen en la SEQ ID ?Os : 73, 74, y 75, respectivamente. Varios días después de la infiltración, se recolectó el tejido de hoja. La electroforesis y el análisis de manchado de Western de las muestras de extracto de tejido de hoja de control LB?L-5220 se realizaron como antes. El análisis de Western indicó que el péptido maduro LB?L-5220 se acumula en las hojas de N. bsnthamiana que expresan BAA-Pro-LB?L-5220 o BAA-LB?L-5220. La región de propéptido de LB?L-5197/8-1 se presentó que es reconocida en las hojas de tabaco y segmentado del péptido maduro LB?L-5220. El análisis de LC-MS además confirmó que el LB?L-5220 se acumulo en las hojas de N. benthamiana que expresan BAA-Pro-LB?L-5220 o BAA-LB?L-5220. Ejemplo 12: Transformación y Regeneración de Plantas de Maíz Transgénicas Embriones de maíz inmaduros de plantas donadoras de invernadero se bombardean con un plásmido que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido antipatogénico expuesto en la SEQ ID NO: 1 operablemente enlazado a un promotor que induce la expresión en una célula de planta de maíz y un marcador seleccionable (por ejemplo, el gen marcador seleccionable PAT (Wohlleben y colaboradores, (1988) Gsne 70:25-37), que confiere resistencia al herbicida Bialafos) . Alternativamente, el gen marcador seleccionable se proporciona en un plásmido separado. La transformación se realiza como sigue. Las recetas de los medios se muestran enseguida. 'Preparación del Tejido Objetivo Las mazorcas se despinochan y se esterilizan en la superficie en blanqueador Clorox al 30% más 0.5% de Micro detergente durante 20 minutos, y se enjuagan dos veces con agua estéril. Los embriones inmaduros se extirpan y se colocan con el lado del eje del embrión hacia abajo (lado del escutelo hacía arriba) , 25 embriones por placa, en el medio 560Y durante 4 horas y luego se alinean dentro de la zona objetivo de 2.5 cm en la preparación para el bombardeo. Preparación de DNA Se hace un vector de plásmido que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido antifungal expuesto en la SEQ ID NO: 1 operablemente enlazado a un promotor que induce expresión en una célula de maíz.

Este DNA de plásmido más el DNA de p'lásmido que contiene un marcador seleccionable (por ejemplo, PAT) se' precipita sobre pelotillas de tungsteno de 1.1 µm (diámetro promedio) utilizando un procedimiento de precipitación de CaCl2 como sigue: 100 µL de partículas de tungsteno preparados en agua 10 µL (1 µg) de DNA en solución reguladora de Tris EDTA (1 µg de DNA total) 100 µL de CaCl22.5 M 10 µL de espermidina 0.1 M . Cada reactivo se adiciona' secuencialmente a la suspensión de partículas de tungsteno, mientras que se mantiene en el aparato formador de vórtice de multitubos. La mezcla final se sónica brevemente y se deja incubar bajo formación de vórtice constante durante 10 minutos. Después del período de precipitación, los tubos se centrifugan brevemente, se remueve el líquido, se lavan con 500 raL de etanol al 100% y se centrifugan durante 30 segundos.

Nuevamente el líquido se remueve, y 105 µL de etanol al 100% se adiciona a la pelotilla de partícula de tungsteno final.

Para el bombardeo con pistola de partículas, las partículas de tungsteno/DNA se sonican brevemente y 10 µL se mancha sobre el centro de cada macroportador y se dejan secar aproximadamente 2 minutos antes del bombardeo. Tratamiento -con Pistola de Partículas Las placas de muestra se bombardean en el nivel #4 en la pistola de partículas #HE34-1 o #HE34-2. Todas las muestras reciben un solo disparo a 650 PS1, con un total de diez alícuotas tomada de cada tubo de partículas/DNA preparadas. Tratamiento Subsecuente Después del bombardeo, los embriones se conservan en el medio 650Y durante 2 días, luego se transfieren al medio de selección de 560R que contiene 3 mg/L de Bialafos, y se subcultivan cada 2 semanas. Después de aproximadamente 10 semanas de selección, los clones de callos resistentes a la selección se transfieren al medio a 288J para iniciar la regeneración de la planta. Después de la maduración del embrión somático (2-4 semanas) , los embriones somáticos bien desarrollados se transfieren al medio para la germinación y se transfieren al cuarto de cultivo alumbrado. Aproximadamente 7-10 días después, las plantitas en desarrollo se transfieren al medio libre de hormona 272V en tubos durante 7-10 días hasta que las plantitas son bien establecidas. Las plantas luego se transfieren a insertos en cajones semilleros (equivalente a una maceta de 2.5") que contiene tierra para maceta y se cultivan durante 1 semana en una cámara de crecimiento, subsecuentemente se cultivan 1-2 •semanas adicionales en el invernadero, luego se transfieren a 600 macetas clásicas (1.6 galones) y se cultivan a la madurez. Las plantas se monitorean y se registran para la resistencia fungal. Medio de Bombardeo y de Cultivo El medio de bombardeo (560Y) comprende 4.0 g/L de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1.0 mL/L de Mezcla de Vitamina de Eriksson (1000X SIGMA-1511) , 0.5 mg/l de HCl de tiamina, 120.0 g/L de sacarosa, 1.0 mg/L de 2,4-D y 2.88 g/L de L-prolina (llevado al volumen con H20 de D-I después del ajuste a pH 5.8 con KOH); 2.0 s/L de Gelrite (adicionado después de llevar al volumen con HA D-I); y 8.5 mg/L de nitrato de plata (adicionado después de la esterilización del medio y el enfriamiento a temperatura ambiente) . El medio de selección (560R) comprende 4.0 g/L de sales básales N6 (SIGMA C-1416), 1.0 mL/L de Mezcla de Vitamina de Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0.5 mg/L de HCl de tiamina, 30.0 g/L de sacarosa y 2.0 mg/L de 2,4-D (llevado a volumen con H20 D-I después del ajuste a pH 5.8 con KOH); 3.0 g/L de Gelrite (se adicionó después de llevar a volumen con H^O D-I); y 0.85 mg/L de nitrato de pata y 3.0 mg/L de bialafos (ambos adicionados después de la esterilización del medio y el enfriamiento a temperatura ambiente) . El medio de regeneración de planta (288J) comprende 4.3 g/L de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 mL/L de solución de extracto de vitamina MS (0.100 g de ácido nícotínico, 0.02 g/L de HCl de tiamina, 0.10 g/L de HCl de piridoxina y 0.40 g/L de glicina llevado a un volumen con H;0 D-I purificado) (Murashige y Skoog (1962) Physiol . Plan t . 15:473), 100 mg/L de mio-inositol, 0.5 mg/L de zeatin, 60 g/L de sacarosa y 1.0 mL/L de ácido abscísico 0.1 mM (llevado a volumen con H20 D-I purificada después de ajustar ai pH 5.6); 3.0 g/L de Gelrite (se adicionó después de llevar al volumen con el H^O D-I) ; y 1.0 mg/L de ácido indolacético y 3.0 mg/L de bialafos (adicionados después de la esterilización del medio y el enfriamiento a 60°C). El medio libre de hormona (272V) comprende 4.3 g/L de sales MS (GIBCO 11117-074), 5.0 mL/L de solución de extracto de vitaminas MS (0.100 g/L de ácido nicotíníco, 0.02 g/L de HCl de tiamina, 0.10 g/L de HCl de piridoxina y 0.40 g/L de glicina llevado a volumen con H20 D-I purificada), 0.1 g/L de mio-inositol y 40.0 g/L de sacarosa (llevado a volumen con H20 D-I purificada después de ajustar el pH a 5.6); y 6 g/L de bacto-agar (se adicionó después de llevar al volumen con H20 D-I purificado) , esterilizado y enfriado a 60°C. Ejemplo 3: Transformación del Maíz Mediada por Agrobacterium y Regeneración de Plantas Transgénicas Para la transformación del maíz mediada por Agrobacteri um con la construcción de polinucleótido del Ejemplo 7, se emplea el método de Zhao (patente norteamericana No. 5,981,840 y la publicación de patente de PCT W098/32326; ios contenidos de los cuales son incorporados en la presente por referencia) . Brevemente, los embriones inmaduros se aislan del maíz, y los embriones se ponen en contacto con una suspensión de Agrobacterium, donde las bacterias son capaces de transferir . la construcción de polinucleótido a por lo menos una célula de por lo menos uno de los embriones inmaduros (etapa 1:1a etapa de infección) . En esta etapa los embriones inmaduros se sumergen en una suspensión de Agrobactsriu para la iniciación de la inoculación. Los embriones de co-cultivan durante un tiempo con el Agrobacterium (etapa 2: la etapa de co-cultivo). Los embriones inmaduros se cultivan en medio sólido después de la etapa de infección. Después de este período de co-cuitivo se realiza una etapa de "reposo" opcional. En esta etapa de reposo, los embriones se incuban en la presencia de por io menos un antibiótico conocido que inhibe el crecimiento del Agrobacterium sin la adición de un agente selectivo para transformantes de plantas (etapa 3:1a etapa de reposo). Los embriones inmaduros se cultivan en el medio sólido con el antibiótico, pero sin un agente de selección, para la eliminación de Agroba cterium y para una fase de reposo para las células infectadas. Enseguida, los embriones inoculados se cultivan en el medio que contiene un agente selectivo y se recupera el callo transformado en el crecimiento (etapa 4:1a etapa de selección) . Los embriones inmaduros se cultivan en un medio sólido con un agente selectivo que da por resultado el crecimiento selectivo de las células transformadas. El callo luego se regenera en plantas (etapa 5:1a etapa de regeneración) y los callos crecidos en el medio selectivo se cultivan sobre el medio sólido para regenerar las plantas. Ejemplo 4: Transformación de" Cultivo de Embrión de Soya Somático y Regeneración de Plantas de Soya Las siguientes soluciones de extracto y medios se utilizan para la transformación y' regeneración de plantas de soya. Soluciones de extracto Extracto 100 X Sulfato: 37.0 g MgS04.7H20, 1.69 g MnS04.H«0, 0.86 g ZnS04.7H20, 0.0025 g CuS04.5H20. Solución 100 X de Haluros: 30.0 g CaCl2.2H20, 0.083 g Ki, 0.0025 g CoCI2.6H20. Solución 100X de P,B, Mo: 18.5 g KH2P04, 0.62 g H3B03, 0.025 g Na2Mo0 .2H20 Solución 100X de EDTA: 3.724 g Na2EDTA, 2.784 g F*eS04.7H20.

Extracto de 2,4-D: 10 mg/mL. Extracto 1000X de Vitamina B5 : 10.0 g ipyo-inositol, 0.10 g de ácido nicotínico, 0.10 g de piridoxina HCl, 1 g de tiamina.

Medio (por Litro) SB196: 10 ml de cada una de las soluciones de extracto anteriores, 1 mL de extracto de vitamina B5, 0.463g de ÍNH4)2S04, 2.83 g KN03, 1 mL de extracto de 2,4- D, 1 g asparagina, 10 g sacarosa, pH 5.7.

SB103: 1 pk. Mezcla de sales de Murashige & Skocg, 1 mL de extracto de vitamina B5, 750 mg de hexahidrato de MgCI2, 60 g de maltosa, 2 g de gelrite, pH 5.7. SB166: SB103 suplementado con 5 g por litro de carbón vegetal activado. SB71-4: Sales B5 de Garaborg (Gibco-BRL catálogo No. 21153- 028), 1 mL de extracto de vitamina B5, 30 g de sacarosa, 5 g de agar TC, pH 5.7. Los cultivos de suspensión embriogénicos de soyas se mantienen en 35 mL de medio líquido (SB 196) en un agitador rotatorio (150 rpm) a 28 °C con luces fluorescentes que proporcionan un ciclo de 16 horas de día/8 horas de noche. Los cultivos se subcultivan cada 2 semanas al inocular aproximadamente 35 mg de tejido en 35 mL de medio líquido fresco. Los cultivos de suspensión embriogénicos de soya se transforman mediante el método de bombardeo con pistola de partícula (ver Klein y colaboradores, (1987) Na turs 327:70-73) utilizando un instrumento DuPont Biolistic PDS 1000/He.' E los procedimientos de bombardeo con pistola de partículas es posible utilizar 1) DNA de plásmido completo purificado o, 2) fragmentos de DMA que contienen solamente el (los) cásete (s) de expresión de DNA recombinante de interés. Por cada ocho transformaciones de bombardeo, 30 µl de suspensión se prepara que contiene 1 a 90 picogramos (pg) de fragmento de DNA por par de base de fragmento de DNA. El plásmido o fragmento de DNA recombinante utilizado para expresar el gen antifungal está en un plásmido de DNA recombinante separado o fragmento del gen marcador seleccionable. Tanto los plásmidos de DNA recombinantes o fragmentos se precipitan en partículas de oro como sigue. Los D s en suspensión se adicionan a 50 µL de una suspensión de partículas de oro de 0.6 µm de 20-60 mg/mL y luego se combinan con 50 µL de CaCl2 (2.5 M) y 20 µL de espermidina (0.1 M) . La mezcla se pulsa con vórtice 5 veces, se gira en una microcentrífuga durante 10. segundos y el sobrenadante se remueve. Las partículas recubiertas con DNA luego se lava una vez con 150 µL de etanol al 100%, se pulsa con vórtice y se giran en una microcentrífuga nuevamente y se resuspenden en 85 µL de etanol anhidro. Cinco µL de las partículas de oro recubiertas de DNA luego se cargan en cada disco macroportador . Aproximadamente 150 a 250 mg de cultivo de suspensión de dos semanas se coloca en una placa petri vacía de 60 mm X 15 mm y el líquido residual se remueve del tejido utilizando una pipeta. -El tejido se coloca aproximadamente 3.5 pulgadas lejos de la criba de retención y cada placa de tejido se bombardea una vez. La presión de ruptura de la membrana se ajusta a 650 psi y ia cámara se evacúa a -28 pulgadas de Hg. Dieciocho placas se bombardean y, después del bombardeo, el tejido de cada placa se divide entre dos matraces, se colocan nuevamente en el medio líquido y se cultivan como es descrito en lo anterior. Siete días después del bombardeo, el medio líquido se intercambia con medio SB196 fresco suplementado con 50 mg/mL de higromicina o 100 ng/mL de clorosulfurón, dependiendo del gen marcador seleccionable utilizado en la transformación. El medio selectivo se renueva cada semana o bisemanalmente. Siete semanas después del bombardeo, el tejido transformado verde se observa creciendo de las agrupaciones embriogénicas necróticas, no transformadas. El tejido verde aislado se remueve y se inocula en matraces individuales para generar nuevos cultivos de suspensión embriogénicos transformados, clonalmente propagados. Así, cada íiueva línea se trata como evento de transformación independiente. Estas suspensiones luego se pueden mantener como suspensiones de embriones agrupadas en una etapa de desarrollo inmadura a través del subcultivo o se pueden regenerar en plantas completas mediante la maduración y germinación de embriones somáticos individuales. Las agrupaciones embríogénicas transformadas se remueven del cultivo líquido y se colocan en el medio agar sólido (SB166) que no contiene hormonas o antibióticos por una semana. Los embriones se cultivan a 26°C con luces fluorescentes e incandescentes mezcladas en un programa de 16 horas de día: 8 horas de noche. Después de una semana, los cultivos luego se transfieren al medio SB103 y se mantiene en las mismas condiciones de crecimiento durante 3 semanas adicionales. Antes de la transferencia del cultivo líquido al medio sólido, el tejido de las líneas seleccionadas se analiza mediante PCR o el análisis de Southern para la presencia del gen antifungal. .Los embriones somáticos se vuelven adecuados para la germinación después de 4 semanas y luego se remueven del medio de maduración y se secan en placas petri vaciadas durante 1 a 5 días. Los embriones secados luego se plantan en un medio SB71-4 donde se permiten germinar bajo las mismas condiciones de luz y germinación descritos en lo anterior. Los embriones germinados se transfieren a tierra estéril y se cultivan hasta la madurez. Todas las publicaciones y solicitudes de patente mencionadas en la especificación son indicativas del nivel de aquellos expertos en la técnica a la cual esta invención pertenece. Todas las publicaciones y solicitudes de patentes son incorporadas en la presente por referencia al mismo grado como sí cada publicación individual o solicitud de patente * fuera específicamente e individualmente indicada que es incorporada por referencia. Aunque, la invención anterior se ha descrito en algún detalle a manera de ilustración y ejemplo para propósitos de claridad de entendimiento, será obvio que ciertos cambios y modificaciones se pueden practicar dentro del alcance de las reivindicaciones adjuntas.

Claims (31)

1. REIVINDICACIONES 1. Un polipéptido aislado, caracterizado porque tiene actividad antifungal y que comprende la secuencia de aminoácidos : G-X-C-X-X-X-X-N-X-C-X-Y-X-X-X-X-X-X-X-X-Z-V-X-C-X-X-X-A-N-X-X-C-X-X-D-X-X-X-C-X-X-D-X-X-X-X-X-V-X-C (SEQ ID NO: 68), en donde "X" es cualquier aminoácido y en donde "Z" es cualquier aminoácido o ningún aminoácido.
2. 2. El polipéptido. de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido tiene actividad antifungal contra un hongo seleccionado del grupo que consiste de Collstotrichum graminicola , Diplodia maydis , Fusarium gramínearum y Fusarium verticillioides .
3. 3. Una molécula de ácido nucleico aislada, caracterizada porque codifica un polipéptido aislado de la reivindicación 1.
4. 4. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 3, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos es optimizada para la expresión en una planta.
5. 5. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótidos de la reivindicación 3 operablemente enlazada a un promotor que induce la expresión en una planta.
6. 6. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque además comprende un polinucleótido operablemente enlazado que codifica un péptido de señal.
7. 7. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el polinucleótido comprende la secuencia de nucleótidos de la SEQ ID NO: 34.
8. 8. El cásete de expresión de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el péptido de señal comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 35.
9. 9. Una célula de planta, caracterizada porque comprende por lo menos un cásete de expresión, el cásete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga de la reivindicación 3 operablemente enlazada a un promotor que induce la expresión en' la célula de planta.
10. 10. La célula de planta de conformidad con la reivindicación 9, 'caracterizada porque la célula de planta es una monocotiledónea.
11. 11. La célula de planta de conformidad con la reivindicación 10, caracterizada porque la monocotiledónea es maíz, trigo, arroz, cebada, sorgo o centeno.
12. 12. La célula de planta de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada porque la célula de planta es de una dicotiledónea.
13. 13. La célula de planta de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque la dicotiledónea es soya, Brassica , girasol, algodón o alfalfa. '
14. 14. Una planta, caracterizada porque comprende por lo menos un cásete de expresión, el cásete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga de la reivindicación 3 operablemente enlazada a un promotor que induce expresión en la planta.
15. 15. La planta de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque la planta exhibe resistencia incrementada a un patógeno de planta.
16. 16. La planta de conformidad con la reivindicación 15, caracterizada porque el patógeno de planta es un hongo.
17. 17. La planta de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada porque el hongo es seleccionado del grupo que consiste de Colletotrichum graminicola , Diplodia maydis, Fusarium graminsarum y Fusarium verticillioidss .
18. 18. La planta de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el promotor es un promotor preferido de tejido.
19. 19. La planta de conformidad con la reivindicación 18, caracterizada porque el promotor preferido de tejido es seleccionado del grupo que consiste de un promotor preferido de hoja, un promotor preferido de raíz, un promotor preferido de semilla, un promotor preferido de tallo y un promotor preferido de tejido vascular.
20. 20. La planta de conformidad con la reivindicación 14, caracterizada porque el promotor es un promotor inducible por patógeno.
21. 21. Una semilla transformada, caracterizada porque es de la planta de la reivindicación 14.
22. 22. Un método para inducir resistencia a patógenos de planta en una planta, el método caracterizado porque comprende introducir en una planta por lo menos un cásete de expresión, el cásete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga de la reivindicación 3 operablemente enlazada a un promotor que induce expresión en la planta.
23. 23. Una composición antipatogénica, caracterizada porque comprende por lo menos un polipéptido de conformidad con la reivindicación 1.
24. 24. La composición de conformidad con la reivindicación 23, caracterizada porque además comprende un portador.
25. 25. Un método para proteger a una planta de un patógeno de planta, caracterizado porque comprende aplicar la composición de conformidad con la reivindicación 24 al medio ambiente de un patógeno de planta.
26. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque la composición se aplica mediante un procedimiento seleccionado del grupo que consiste de rociado, espolvoreamiento, dispersión y recubrimiento de semilla.
27. 27. Un cásete de expresión, caracterizado porque comprende una secuencia de nucleótídos de la reivindicación 3 operablemente enlazada a un promotor que induce expresión en un microorganismo.
28. 28. Un microorganismo transformado, caracterizado porque comprende por lo menos un cásete de expresión, el cásete de expresión que comprende una secuencia de nucleótidos heteróloga de la reivindicación 3 operablemente enlazada a un promotor que induce - expresión en el microorganismo.
29. 29. Una composición antipatogénica, caracterizada porque comprende por lo menos un microorganismo transformado de conformidad con la reivindicación 28.
30. 30. La composición de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque además comprende un portador.
31. 31. Un método para proteger a una planta de un patógeno, caracterizado porque comprende aplicar la composición de conformidad con la reivindicación 30 al medio ambiente de un patógeno de planta.