ES2245487T3 - Composiciones y metodos para la modificacion genetica de plantas. - Google Patents
Composiciones y metodos para la modificacion genetica de plantas.Info
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Abstract
Un método para dirigir la inserción de una secuencia nucleotídica de interés a un sitio cromosómico específico dentro de un genoma de una célula de planta, que comprende: (a) introducir en dicha célula de planta cuyo genoma comprende un sitio diana flanqueado por sitios de recombinación no idénticos un casete de transferencia que comprende la secuencia nucleotídica de interés flanqueada por sitios de recombinación no idénticos correspondientes; y (b) proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos.
Description
Composiciones y métodos para la modificación
genética de plantas.
La invención se refiere a la modificación
genética de plantas. Particularmente, se proporciona el control de
la integración y la expresión génica en plantas.
Las técnicas de modificación genéticas permiten
insertar secuencias nucleotídicas exógenas en el genoma de un
organismo. Se ha descrito un número de métodos para la modificación
genética de plantas. Todos estos métodos se basan en introducir un
DNA extraño en la célula de planta, el aislamiento de aquellas
células que contienen el DNA extraño integrado en el genoma, seguido
por la regeneración subsiguiente de una planta entera.
Desgraciadamente, tales métodos producen células transformadas que
contienen el DNA extraño introducido insertado aleatoriamente en
todo el genoma y a menudo en múltiples copias.
La inserción aleatoria de DNA introducido en el
genoma de células huésped puede ser letal si acaso el DNA extraño se
inserta en, y así muta, un gen natural críticamente importante.
Además, aun cuando un caso de inserción aleatoria no deteriore el
funcionamiento de un gen de la célula huésped, la expresión de un
gen extraño insertado puede estar influenciada por "efectos de
posición" provocados por el DNA genómico circundante. En algunos
casos, el gen se inserta en sitios en los que los efectos de
posición son suficientemente fuertes para evitar la síntesis de una
cantidad eficaz de producto a partir del gen introducido. En otros
casos, la sobreproducción del producto génico tiene efectos
perjudiciales sobre la célula.
La expresión transgénica está típicamente
gobernada por las secuencias, incluyendo promotores y potenciadores,
que está físicamente conectadas al transgén. Actualmente, no es
posible modificar precisamente la estructura de los transgenes una
vez que han sido introducidos en células de planta. En muchas
aplicaciones de tecnología transgénica, sería deseable introducir el
transgén en una forma y a continuación poder modificar el transgén
de una manera definida. Por estos medios, los transgenes podrían
activarse o inactivarse cuando las secuencias que controlan la
expresión transgénica pudieran alterarse retirando secuencias
presentes en el transgén original o insertando secuencias
adicionales en el transgén.
Para eucariotas superiores, la recombinación
homóloga es un caso esencial que participa en procesos como la
reparación de DNA y el intercambio de cromátidas durante la mitosis
y la meiosis. La recombinación depende de dos secuencias extendidas
altamente homólogas y varias proteínas auxiliares. La separación de
hebras puede producirse en cualquier punto entre las regiones de
homología, aunque las secuencias particulares pueden influir en la
eficacia. Estos procesos pueden explotarse para una integración
orientada de transgenes en el genoma de ciertos tipos de
células.
Incluso con los avances en la modificación
genética de plantas superiores, los principales problemas asociados
con las técnicas de transformación génica convencionales han
permanecido esencialmente sin resolver en cuanto a los problemas
analizados previamente relativos a niveles de expresión variables
debidos a efectos de posición cromosómicos y variación del número de
copias de genes transferidos. Por estas razones, se necesitan
métodos eficaces para la orientación y el control de la inserción de
secuencias nucleotídicas que han de integrarse en un genoma de
planta.
Se proporcionan composiciones y métodos para la
integración orientada de secuencias nucleotídicas en una planta
transformada. Los métodos emplean casetes de transferencia que están
flanqueados por sitios de recombinación no idénticos.
Los métodos encuentran uso para orientar la
integración de secuencias nucleotídicas de interés en un sitio
cromosómico específico, encontrar sitios de integración óptimos en
un genoma de planta, comparar la actividad promotora en plantas
transformadas, manejar transposiciones cromosómicas y otra
manipulación genética de plantas.
También se proporcionan plantas trasnsgénicas y
células de planta que contienen sitios de recombinación no idénticos
correspondientes.
De acuerdo con esto, la invención proporciona un
método para orientar la inserción de una secuencia nucleotídica de
interés en un sitio cromosómico específico dentro de un genoma de
una célula de planta, que comprende (a) introducir en dicha célula
de planta cuyo genoma comprende un sitio diana flanqueado por sitios
de recombinación no idénticos un casete de transferencia que
comprende la secuencia nucleotídica de interés flanqueada por sitios
de recombinación no idénticos correspondientes; y (b) proporcionar
una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación de los
sitios de recombinación no idénticos.
La invención también proporciona un método para
situar sitios de integración preferidos dentro de un genoma de una
célula de planta, que comprende introducir en dicha célula de planta
un sitio diana que comprende una secuencia nucleotídica flanqueada
por sitios de recombinación no idénticos; (a) determinar el nivel de
expresión de dicha secuencia nucleotídica; y (b) seleccionar una
célula de planta que expresa dicha secuencia nucleotídica.
La invención también proporciona un método para
determinar la actividad promotora en una célula de planta, que
comprende (a) introducir en dicha célula de planta cuyo genoma
comprende un sitio diana flanqueado por sitios de recombinación no
idénticos un casete de transferencia que comprende un promotor
conectado operablemente a una secuencia nucleotídica que codifica un
gen marcador; estando flanqueado dicho casete de transferencia por
sitios de recombinación no idénticos correspondientes; y (b)
proporcionar una recombinasa que reconoce y establece la
recombinación en los sitios de recombinación no idénticos.
La invención también proporciona un método para
minimizar o eliminar la expresión resultante de la integración
aleatoria de secuencias de DNA en el genoma de una célula de planta,
que comprende (a) introducir en el genoma de la célula de planta una
secuencia nucleotídica que comprende un sitio diana que comprende
dos sitios de recombinación no idénticos, en donde sitio diana está
situado aguas abajo de un promotor fusionado a una secuencia de
iniciación traduccional ATG; (b) introducir un casete de
transferencia que comprende una secuencia nucleotídica de interés
flanqueada por sitios de recombinación no idénticos
correspondientes, en donde la secuencia de iniciación traduccional
ATG de dicha secuencia nucleotídica de interés está reemplazado por
uno de los sitios de recombinación no idénticos correspondientes del
sitio diana, y de una manera tal que después de la orientación
satisfactoria la secuencia nucleotídica de interés se sitúa en el
marco de lectura correcto para formar una fusión traduccional entre
la secuencia de iniciación traduccional ATG y la secuencia
nucleotídica de interés; y (c) proporcionar una recombinasa que
reconoce y establece la recombinación en los sitios de recombinación
no idénticos.
La invención también proporciona un método para
seleccionar directamente células de planta transformadas, que
comprende (a) introducir en los genomas de células de planta un
casete de transferencia, comprendiendo dichos genomas de células de
planta un sitio diana que comprende un promotor conectado
operablemente a una secuencia nucleotídica que comprende un primer
sitio de recombinación no idéntico, una secuencia nucleotídica de
interés y un segundo sitio de recombinación no idéntico, y
comprendiendo dicho casete de transferencia una secuencia
nucleotídica que codifica un gen marcador seleccionable no conectado
operablemente a un promotor, en donde dicho casete de transferencia
está flanqueado por dichos sitios de recombinación no idénticos
primero y segundo; y (b) proporcionar una recombinasa que reconoce y
realiza la recombinación en los sitios de recombinación no
idénticos, y hacer crecer dichas células de planta sobre un agente
selectivo apropiado para recuperar células que expresan el marcador
seleccionable.
La invención también proporciona un método para
reducir la complejidad de la integración de transgenes en un genoma
de célula de planta, que comprende (a) introducir en la célula de
planta un casete de transferencia flanqueado por sitios de
recombinación no idénticos, comprendiendo dicho casete de
transferencia una secuencia nucleotídica de interés, comprendiendo
dicho genoma de células de planta un sitio diana que comprende
sitios de recombinación no idénticos correspondientes; (b)
proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación
en los sitios de recombinación no idénticos; y (c) seleccionar
células de planta con patrones de integración simples en su
genoma.
La invención también proporciona un método para
combinar múltiples casetes de transferencia en una localización en
un genoma de una planta, que comprende (a) introducir en el genoma
de la célula de planta un primer casete de transferencia que
comprende al menos tres sitios de recombinación no idénticos, en
donde al menos dos de dichos sitios de recombinación no idénticos,
que se denominan aquí los sitios de reorientación primero y segundo,
están en estrecha proximidad entre sí; (b) introducir en el genoma
de la célula de planta un segundo casete de transferencia flanqueado
por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los
primeros sitios de reorientación de dicho primer casete de
transferencia; y (c) proporcionar una recombinasa que reconoce y
realiza la recombinación en el primer sitio de reorientación.
La invención también proporciona un método para
combinar múltiples casetes de transferencia en una posición en un
genoma de una célula de planta, comprendiendo dicho método (a)
introducir en la célula de planta un sitio diana que comprende al
menos un primer y un segundo sitio de recombinación no idéntico; (b)
introducir en la célula de planta un primer casete de transferencia
que comprende en el siguiente orden al menos el primero, un tercero
y el segundo sitio de recombinación no idéntico, en donde los sitios
de recombinación no idénticos primero y tercero del primer casete de
transferencia flanquean una primera secuencia nucleotídica de
interés; (c) proporcionar una primera recombinasa que reconoce y
realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos
primero y segundo; (d) introducir en la célula de planta un segundo
casete de transferencia que comprende al menos los sitios de
recombinación no idénticos segundo y tercero, en donde los sitios de
recombinación no idénticos segundo y tercero del segundo casete de
transferencia flanquean una segunda secuencia nucleotídica de
interés; y (e) proporcionar una segunda recombinasa que reconoce y
realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos
segundo y tercero.
La invención también proporciona un método para
retirar una secuencia nucleotídica de interés introducida en el
genoma de una célula de planta, que comprende (a) proporcionar dicha
célula de planta, en la que dicha secuencia nucleotídica de interés
está flanqueada por sitios de recombinación no idénticos; (b)
introducir en la célula de planta una molécula oligonucleotídica de
RNA-DNA quimérica capaz de reconocer y establecer
una conversión de nucleótidos en uno de los sitios de recombinación
no idénticos del casete de transferencia a fin de crear dos sitios
de recombinación idénticos; y (c) proporcionar una recombinasa que
reconoce y realiza la escisión de las secuencias entre los dos
sitios de recombinación idénticos.
La invención también proporciona una célula de
planta dicotiledónea o monocotiledónea que tiene establemente
incorporados en su genoma: (a) un casete de transferencia que
comprende una secuencia nucleotídica de interés flanqueada por o que
comprende al menos dos sitios de recombinación FRT no idénticos; o
(b) al menos un primer y un segundo casete de transferencia, en
donde: (i) dicho primer casete de transferencia comprende una
primera secuencia nucleotídica de interés flanqueada por un primer y
un segundo sitio de recombinación, en donde dichos sitios de
recombinación primero y segundo no son idénticos; (ii) dicho segundo
casete de transferencia comprende una segunda secuencia nucleotídica
de interés flanqueada por el segundo sitio de recombinación y un
tercer sitio de recombinación, en donde dicho tercer sitio de
recombinación no es idéntico a dicho sitio de recombinación primero
y segundo; y (iii) dicho segundo sitio de recombinación está
compartido entre el primer y el segundo casete de transferencia, de
modo que el genoma de la célula de planta comprende en el siguiente
orden el primer sitio de recombinación, la primera secuencia
nucleotídica de interés, el segundo sitio de recombinación, la
segunda secuencia nucleotídica de interés y el tercer sitio de
recombinación.
La invención también proporciona una célula de
planta monocotiledónea que tiene establemente incorporado en su
genoma un casete de transferencia que comprende una secuencia
nucleotídica de interés flanqueada por o que comprende al menos dos
sitios de recombinación FRT no idénticos o dos sitios de
recombinación LOX no idénticos, en donde dicha célula de planta es
de una monocotiledónea.
La invención también proporciona una planta
transformada que comprende una célula de planta de la invención.
La invención también proporciona una semilla
transformada de tal planta.
La Figura 1 proporciona un esquema para el
apilamiento génico a través de la integración específica para el
sitio usando el sistema de FLP.
La Figura 2 proporciona un constructo del
plásmido representativo PHP10616.
Se proporcionan composiciones y métodos para la
integración orientada direccional de nucleótidos exógenos en una
planta transformada. Los métodos usan nuevos sitios de recombinación
en un sistema de orientación génica que facilita la orientación
direccional de genes y secuencias nucleotídicas deseados en sitios
de recombinación correspondientes previamente introducidos en el
genoma de la planta diana.
En los métodos de la invención, una secuencia
nucleotídica flanqueada por dos sitios de recombinación no idénticos
se introduce en el genoma del organismo diana estableciendo un sitio
diana para la inserción de secuencias nucleotídicas de interés. Una
vez que se establece una planta estable o un tejido cultivado, un
segundo constructo, o secuencia nucleotídica de interés, flanqueado
por sitios de recombinación correspondientes a los que flanquean el
sitio diana, se introduce en la planta o los tejidos transformados
establemente en presencia de una proteína recombinante. Este
procedimiento da como resultado el intercambio de las secuencias
nucleotídicas entre los sitios de recombinación no idénticos del
sitio diana y el casete de transferencia.
Se sabe que la planta transformada puede
comprender múltiples sitios diana; es decir, grupos de sitios de
recombinación no idénticos. De esta manera, están disponibles
múltiples manipulaciones del sitio diana en la planta transformada.
Por sitio diana en la planta transformada se entiende una secuencia
de DNA que se ha insertado en el genoma de la planta transformada y
comprende sitios de recombinación no idénticos.
Ejemplos de sitios de recombinación para usar en
la invención se conocen en la técnica e incluyen sitios FRT (Véanse,
por ejemplo, Schlake y Bode (1994) Biochemistry
33:12746-12751; Huang y otros (1991) Nucleic
Acids Research 19:443-448; Paul D. Sadowski
(1995) en Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology
vol. 51, pp. 53-91; Michael M. Cox (1989) en
Mobile DNA, Berg y Howe (eds) American Society of
Microbiology, Washington D. C., pp.116-670; Dixon y
otros (1995) 18:449-458; Umlauf y Cox (1988) The
EMBO Journal 7: 1845-1852; Buchholz y otros
(1996) Nucleic Acids Research 24:3118-3119;
Kilby y otros (1993) Trends Genet. 9:413-421:
Rossant y Geagy (1995) Nat. Med. 1: 592-594;
Albert y otros (1995) The Plant J. 7:649-659;
Bayley y otros (1992) Plant Mol. Biol.
18:353-361; Odell y otros (1990) Mol. Gen. Genet.
223: 369-378 y Dale y Ow (1991) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 88: 10558-105620; todas las
cuales se incorporan aquí mediante referencia); Lox (Albert
y otros (1995) Plant J. 7:649-659; Qui y
otros (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:
1706-1710; Stuurman y otros (1996) Plant Mol.
Biol. 32:901-913; Odell y otros (1990) Mol.
Gen. Gevet. 223: 369-378; Dale y otros (1990)
Gene 91: 79-85 y Bayley y otros (1992)
Plant Mol. Biol. 18: 353-361.).
El plásmido de dos micras encontrado en la
mayoría de las cepas presentes en la naturaleza de
Saccharomyces cerevisiae codifica una recombinasa
específica para el sitio que promueve una inversión del DNA entre
dos repeticiones invertidas. Esta inversión representa un papel
principal en la amplificación del número de copias del plásmido. La
proteína, denominada proteína FLP, cataliza sucesos de recombinación
específicos para el sitio. El sitio de recombinación mínimo (FRT, ID
SEC Nº 1) se ha definido y contiene dos repeticiones de 13 pares de
bases (pb) invertidas que rodean un espaciador asimétrico de 8 pb.
La proteína FLP segmenta el sitio en las uniones de las repeticiones
y el espaciador y está conectada covalentemente al DNA a través de
un fosfato 3'.
Recombinasas específicas para el sitio como FLP
segmentan y religan DNA en secuencias diana específicas, dando como
resultado una recombinación definida precisamente entre dos sitios
idénticos. Para funcionar, el sistema necesita los sitios de
recombinación y la recombinasa. No se necesitan factores auxiliares.
Así, todo el sistema puede insertarse en y funcionar en células de
planta.
Se ha observado que el sistema de recombinación
específico para el sitio FLP/FRT de levadura funciona en plantas.
Hasta la fecha, el sistema ha sido utilizado para la escisión de DNA
no deseado. Véanse Lyznik y otros (1993) Nucleic Acid Res.
21:969-975. En contraste, la presente invención
utiliza FRTs no idénticos para el intercambio, la orientación, la
disposición, la inserción y el control de la expresión de secuencias
nucleotídicas en el genoma de planta.
Para poner en práctica los métodos de la
invención, se necesita una planta transformada que contiene un sitio
diana integrado en su genoma. El sitio diana se caracteriza por
estar flanqueado por sitios de recombinación no idénticos. Se
requiere adicionalmente un casete de orientación que contiene una
secuencia nucleotídica flanqueada por sitios de recombinación no
idénticos correspondientes a los sitios contenidos en el sitio diana
del organismo transformado. Se requiere una recombinasa que reconoce
los sitios de recombinación no idénticos que cataliza la
recombinación específica para el sitio.
Se sabe que la recombinasa puede ser
proporcionada por cualquier medio conocido en la técnica. Esto es,
puede proporcionarse en el organismo o la célula de planta
transformando el organismo con un casete de expresión capaz de
expresar la recombinasa en el organismo, mediante expresión
transitoria; o proporcionando RNA mensajero (mRNA) para la
recombinasa o la proteína de recombinasa.
Por "sitios de recombinación no idénticos"
se entiende que los sitios de recombinación de flanqueo no son
idénticos en secuencia y no se recombinarán o la recombinación entre
los sitios será mínima. Esto es, un sitio de recombinación de
flanqueo puede ser un sitio FRT en el que el segundo sitio de
recombinación puede ser un sitio FRT mutado. Los sitios de
recombinación no idénticos usados en los métodos de la invención
impiden o suprimen mucho la recombinación entre los dos sitios de
recombinación de flanqueo y la escisión de la secuencia nucleotídica
contenida en los mismos. De acuerdo con esto, se sabe que
cualesquiera sitios de recombinación no idénticos adecuados pueden
utilizarse en la invención, incluyendo sitios FRT y FRT mutantes,
sitios FRT y lox, sitios lox y lox mutantes, así como otros sitios
de recombinación conocidos en la técnica.
Sitio de recombinación no idéntico adecuado
implica que, en presencia de recombinasa activa, se produce la
escisión de secuencias entre dos sitios de recombinación no
idénticos, si se produce, con una eficacia considerablemente
inferior que la disposición de orientación del intercambio mediada
recombinantemente de secuencias nucleotídicas en el genoma de
planta. Así, sitios no idénticos adecuados para usar en la invención
incluyen los sitios donde la eficacia de recombinación entre los
sitios es baja; por ejemplo, donde la eficacia es menor que
aproximadamente 30 a aproximadamente 50%, preferiblemente menor que
aproximadamente 10 a aproximadamente 30%, más preferiblemente menor
que aproximadamente 5 a aproximadamente 10%.
Según se apunta anteriormente, los sitios de
recombinación en el casete de orientación corresponden a los del
sitio diana de la planta transformada. Esto es, si el sitio diana de
la planta transformada contiene sitios de recombinación no idénticos
de flanqueo de FRT y un FRT mutante, el casete de orientación
contendrá los mismos sitios de recombinación no idénticos de FRT y
FRT mutante.
Se sabe además que la recombinasa, que se usa en
la invención, dependerá de los sitios de recombinación en el sitio
diana de la planta transformada y el casete de orientación. Esto es,
si se utilizan sitios FRT, la recombinasa FLP será necesaria. De la
misma manera, cuando se utilizan sitios lox, se requiere la
recombinasa Cre. Si los sitios de recombinación no idénticos
comprenden un sitio tanto FRT como lox, se requerirá la recombinasa
tanto FLP como Cre en la célula de planta.
La recombinasa FLP es una proteína que cataliza
una reacción específica para el sitio que está implicada en
amplificar el número de copias del plásmido de dos micras de S.
cerevisiae durante la replicación del DNA. La proteína FLP se ha
clonado y expresado. Véase, por ejemplo, Cox (1993) Proc. Natl.
Acad. Sci. U. S. A. 80:4223-4227. La recombinasa FLP
para usar en la invención puede ser la derivada del género
Saccharomyces. Puede ser preferible sintetizar la recombinasa
usando codones preferidos de planta para la expresión óptima en una
planta de interés. Véase, por ejemplo, la solicitud de EE.UU. Nº de
Serie 08/972.258, presentada el 18 de Noviembre de 1997, titulada
"Novel Nucleic Acid Sequence Encoding FLP Recombinase".
La recombinasa Cre de bacteriófago cataliza la
recombinación específica para el sitio entre dos sitios lox. La
recombinasa Cre es conocida en la técnica. Véanse, por ejemplo, Guo
y otros (1997) Nature 389:40-46; Abremski y
otros (1984) J. Biol. Chem. 259: 1509-1514;
Chen y otros (1996) Somat. Cell Mol. Genet.
22:477-488 y Shaikh y otros (1977) J. Biol. Chem.
272: 5695-5702. Tal secuencia Cre también puede
sintetizarse usando codones preferidos de plantas.
Cuando es apropiado, las secuencias nucleotídicas
que han de insertarse en el genoma de planta pueden optimizarse para
la expresión incrementada en la planta transformada. Cuando se usan
genes de mamífero, levadura o bacterianos en la invención, pueden
sintetizarse usando codones preferidos de planta para una expresión
mejorada. Se sabe que para la expresión en monocotiledóneas, también
pueden sintetizarse genes de dicotiledóneas usando codones
preferidos de monocotiledóneas. Están disponibles en la técnica
métodos para sintetizar genes preferidos de plantas. Véanse, por
ejemplo, las Patentes de EE.UU. Nº 5.380.831, 5.436.391 y Murray y
otros (1989) Nucleic Acids Res. 17:
477-498.
Los codones preferidos de planta pueden
determinarse a partir de los codones utilizados más frecuentemente
en las proteínas expresadas en la planta de interés. Se sabe que
pueden construirse secuencias preferidas de monocotiledóneas o
dicotiledóneas así como secuencias preferidas de plantas para
especies de plantas particulares. Véanse, por ejemplo, EPA 0359472;
EPA 0385962; WO 91/16432; Perlak y otros (1991) Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 88:3324-3328 y Murray y otros (1989)
Nucleic Acids Research, 17: 477-498. Patente
de EE.UU. Nº 5.380.831; Patente de EE.UU. Nº 5.436.391, y similares.
Se sabe además que la totalidad o cualquier parte de la secuencia
génica puede optimizarse o sintetizarse. Esto es, también pueden
usarse secuencias totalmente optimizadas o parcialmente
optimizadas.
Se sabe que las modificaciones de secuencia
adicionales potencian la expresión génica en un huésped celular y
pueden usarse en la invención. Estas incluyen eliminación de
secuencias que codifican señales de poliadenilación espúreas,
señales de sitios de corte y empalme exón-intrón,
repeticiones similares a transposones y otras de tales secuencias
bien caracterizadas, que pueden ser perjudiciales para la expresión
génica. El contenido de G-C de la secuencia puede
ajustarse hasta niveles medios para un huésped celular dado, según
se calcula mediante referencia a genes conocidos expresados en la
célula huésped. Cuando es posible, la secuencia se modifica para
evitar estructuras de mRNA secundarias de tipo horquilla
predichas.
La presente invención también abarca nuevos
sitios diana de recombinación de FLP (FRT). El FRT (ID SEC Nº 1) se
ha identificado como una secuencia mínima que comprende dos
repeticiones de 13 pares de bases, separadas por un espaciador de 8
bases, como sigue:
5'GAAGTTCCTATTC[TCTAGAAA]GTATAGGAACTTC3'
en donde los nucleótidos entre
corchetes indican la región espaciadora. Los nucleótidos de la
región espaciadora pueden reemplazarse por una combinación de
nucleótidos, con tal de que las dos repeticiones de 13 bases estén
separadas por 8 nucleótidos. Parece que la secuencia nucleotídica
real del espaciador no es crítica. Sin embargo, para la práctica de
la invención, algunas substituciones de nucleótidos en la región
espaciadora pueden funcionar mejor que
otras.
El espaciador de 8 pares de bases está implicado
en el apareamiento de DNA-DNA durante el intercambio
de hebras. La asimetría de la región determina la dirección de
alineamiento de sitios en el suceso de recombinación, lo que
subsiguientemente conducirá a inversión o escisión. Como se indica
previamente, la mayoría del espaciador puede mutarse sin una pérdida
de función. Véase, por ejemplo, Schlake y Bode (1994) Biochemistry
33:12746-12751.
Se proporcionan nuevos sitios mutantes FRT para
usar en la práctica de los métodos de la presente invención. Tales
sitios mutantes pueden construirse mediante mutagénesis basada en
PCR. Aunque se proporcionan aquí sitios FRT mutantes (ID SEC Nº 2,
3, 4 y 5), se sabe que pueden usarse otros sitios FRT mutantes en la
práctica de la invención. La presente invención no es el uso de un
sitio FRT o recombinación particular, sino que en cambio sitios de
recombinación no idénticos o sitios FRT pueden utilizarse para la
inserción y la expresión orientada de secuencias nucleotídicas en un
genoma de planta. Así, otros sitios FRT mutantes pueden construirse
y utilizarse basándose en la presente descripción.
Según se analiza previamente, poner DNA genómico
que contiene un sitio diana con sitios de recombinación no idénticos
junto con un vector que contiene un casete de transferencia con
sitios de recombinación no idénticos correspondientes, en presencia
de la recombinasa, da como resultado la recombinación. La secuencia
nucleotídica del casete de transferencia situado entre los sitios de
recombinación de flanqueo se intercambia con la secuencia
nucleotídica del sitio diana situado entre los sitios de
recombinación de flanqueo. De esta manera, secuencias nucleotídicas
de interés pueden incorporarse precisamente en el genoma del
huésped.
Se sabe que pueden ponerse en práctica muchas
variaciones de la invención. Por ejemplo, pueden construirse sitios
diana que tienen múltiples sitios de recombinación no idénticos.
Así, múltiples genes o secuencias nucleotídicas pueden apilarse u
ordenarse en posiciones precisas en el genoma de planta. Asimismo,
una vez que se ha establecido un sitio diana dentro del genoma,
pueden introducirse sitios de recombinación adicionales mediante la
incorporación de tales sitios dentro de la secuencia nucleotídica
del casete de transferencia y la transferencia de los sitios a la
secuencia diana. Así, una vez que se ha establecido un sitio diana,
es posible añadir subsiguientemente sitios o alterar los sitios a
través de recombinación.
Otra variación incluye proporcionar una región
promotora o de iniciación de la transcripción conectada
operablemente con el sitio diana en un organismo. Preferiblemente,
el promotor estará 5' con respecto al primer sitio de recombinación.
Transformando el organismo con un casete de transferencia que
comprende una región de codificación, la expresión de la región de
codificación se producirá durante la integración del casete de
transferencia en el sitio diana. Esta modalidad proporciona un
método para seleccionar células transformadas, particularmente
células de planta, proporcionando una secuencia marcadora
seleccionable como la secuencia de codificación.
Otras ventajas del presente sistema incluyen la
posibilidad de reducir la complejidad de la integración de
transgenes o DNA transferido en un organismo utilizando casetes de
transferencia como los analizados anteriormente y seleccionando
organismos con patrones de integración simples. De la misma manera,
pueden identificarse sitios preferidos dentro del genoma comparando
varios sucesos de transformación. Un sitio preferido dentro del
genoma incluye uno que no rompe la expresión de secuencias
esenciales y proporciona la expresión adecuada de la secuencia
transgénica.
Los métodos de la invención también proporcionan
medios para combinar múltiples casetes en una posición dentro del
genoma. Véase, por ejemplo, la Figura 1. Pueden añadirse o
suprimirse sitios de recombinación en sitios diana dentro del
genoma.
Cualquier medio conocido en la técnica para poner
en contacto los tres componentes del sistema puede usarse en la
invención. Por ejemplo, una planta puede transformarse establemente
para alojar el sitio diana en su genoma. La recombinasa puede
expresarse o proporcionarse transitoriamente. Alternativamente, una
secuencia nucleotídica capaz de expresar la recombinasa puede
integrarse establemente en el genoma de la planta. En presencia del
sitio diana correspondiente y la recombinasa, el casete de
transferencia, flanqueado por sitios de recombinación no idénticos
correspondientes, se inserta en el genoma de la planta
transformada.
Alternativamente, los componentes del sistema
pueden ponerse en contacto cruzando sexualmente plantas
transformadas. En esta modalidad, una planta transformada,
progenitor uno, que contiene un sitio diana integrado en su genoma
puede cruzarse sexualmente con una segunda planta, progenitor dos,
que se ha transformado genéticamente con un casete de transferencia
que contiene sitios de recombinación no idénticos de flanqueo, que
corresponden a los de la planta uno. La planta uno o la planta dos
contiene dentro de su genoma una secuencia nucleotídica que expresa
recombinasa. La recombinasa puede estar bajo el control de un
promotor constitutivo o inducible.
Promotores inducibles incluyen promotores
inducibles térmicamente, promotores sensibles a estradiol,
promotores inducibles químicamente y similares. Promotores
inducibles por patógenos incluyen los de proteínas relacionadas con
la patogénesis (proteínas PR), que son inducidas después de la
infección por un patógeno; por ejemplo, proteínas PR, proteínas SAR,
beta-1,3-glucanasa, quitinasa, etc.
Véanse, por ejemplo, Redolfi y otros (1983) Neth. J. Plant
Pathol. 89:245-254; Uknes y otros (1992) The
Plant Cell 4:645-656 y Van Loon (1985) Plant
Mol. Virol. 4:111-116. De esta manera, pueden
controlarse la expresión de recombinasa y la actividad subsiguiente
en los sitios de recombinación.
Promotores constitutivos para usar en la
expresión de genes en plantas son conocidos en la técnica. Tales
promotores incluyen, pero no se limitan a, el promotor 35S del virus
del mosaico de la coliflor (Depicker y otros (1982) Mol. Appl.
Genet. 1:561-573; Odell y otros (1985)
Nature 313:810-812), promotor de ubitiquina
(Christensen y otros (1992) Plant Mol. Biol. 18:
675-689), promotores procedentes de genes tales como
ribulosa bisfosfato carboxilasa (De Almeida y otros (1989) Mol.
Gen. Genet. 218:78-98), actina (McElroy y otros
(1990) Plant J. 2:163-171), histona, DnaJ
(Baszczynski y otros (1997) Maydica
42:189-201) y similares.
Las composiciones y los métodos de la invención
encuentran uso en la orientación de la integración de secuencias
nucleotídicas transferidas a un sitio cromosómico específico. La
secuencia nucleotídica puede codificar cualquier secuencia
nucleotídica de interés. Genes particulares de interés incluyen los
que proporcionan un rasgo funcional fácilmente analizable a la
célula y/o el organismo huésped, tales como genes marcadores, así
como otros genes que alteran el fenotipo de las células receptoras,
y similares. Así, pueden utilizarse en la invención genes que
afectan al crecimiento de las plantas, la altura, la susceptibilidad
a una enfermedad, los insectos, el valor nutricional y similares. La
secuencia nucleotídica también puede codificar una secuencia
"antisentido" para interrumpir o modificar la expresión
génica.
Se sabe que las secuencias nucleotídicas se
utilizarán en una unidad o casete de expresión funcional. Por unidad
o casete de expresión funcional se entiende la secuencia
nucleotídica de interés con un promotor funcional y en la mayoría de
los casos una región de terminación. Existen diversos modos de
alcanzar la unidad de expresión funcional dentro de la práctica de
la invención. En una modalidad de la invención, el ácido nucleico de
interés se transfiere o inserta en el genoma como una unidad de
expresión funcional. Alternativamente, la secuencia nucleotídica
puede insertarse en un sitio dentro del genoma que está 3' con
respecto a una región promotora. En este último caso, la inserción
de la región de codificación 3' con respecto a la región promotora
es tal que se alcanza una unidad de expresión funcional durante la
integración. Por comodidad, para la expresión en plantas, el ácido
nucleico que codifica sitios diana y los casetes de transferencia,
incluyendo las secuencias nucleotídicas de interés, puede estar
contenido dentro de casetes de expresión. El casete de expresión
comprenderá una región de iniciación transcripcional, o promotor,
conectada operablemente al ácido nucleico que codifica el péptido de
interés. Tal casete de expresión está provisto de una pluralidad de
sitios de restricción para la inserción del gen o los genes de
interés para estar bajo la regulación transcripcional de las
regiones reguladoras.
La región de iniciación transcripcional, el
promotor, puede ser natural u homóloga o extraña o heteróloga para
el huésped, o podría ser la secuencia natural o una secuencia
sintética. Por extraña se entiende que la región de iniciación
transcripcional no se encuentra en el huésped silvestre en el que se
introduce la región de iniciación transcripcional. Puede usarse un
promotor natural o heterólogo con respecto a la secuencia de
codificación de interés.
El casete transcripcional incluirá en la
dirección 5'-3' de transcripción una región de
iniciación transcripcional y traduccional, una secuencia de DNA de
interés y una región de terminación transcripcional y traduccional
funcional en plantas. La región de terminación puede ser natural con
la región de iniciación transcripcional, puede ser natural con la
secuencia de DNA de interés o puede derivarse de otra fuente.
Regiones de terminación convenientes están disponibles del gen
inhibidor de proteinasa de patata (PinII) o del plásmido Ti de A.
tumefaciens, tal como las regiones de terminación de octopina
sintasa y nopalina sintasa. Véanse, además, Guerineau y otros (1991)
Mol. Gen. Genet. 262:141-144;
Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon y
otros (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen y
otros (1990) Plant Cell 2: 1261-1272; Munroe
y otros (1990) Gene 91:151-158; Ballas y
otros 1989) Nucleic Acids Res.17:7891-7903;
Joshi y otros (1987) Nucleic Acid Res.
15:9627-9639.
Los casetes de expresión pueden contener
adicionalmente secuencias líder 5' en el constructo del casete de
expresión. Tales secuencias líder pueden actuar para potenciar la
traducción. Los líderes de traducción se conocen en la técnica e
incluyen: líderes de picornavirus, por ejemplo, líder de EMCV
(región de no codificación 5' de encefalomiocarditis)
(Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R. y Moss, B. (1989)
PNAS USA, 86:6126-6130); líderes de
potivirus, por ejemplo, líder de TEV (virus del grabado del tabaco)
(Allison y otros (1986)); líder de MDMV (virus del mosaico del
enanismo del maíz); Virology,154:9-20) y proteína de
unión de la cadena pesada de inmunoglobulina humana (BiP), (Macejak,
D. G. y P. Sarnow (1991) Nature, 353: 90-94;
líder no traducido del mRNA de proteína de envuelta del virus del
mosaico de la alfalfa (RNA de AMV 4) (Jobling, S. A. y Gehrke, L.,
(1987) Nature, 325:622-625; líder del virus
del mosaico del tabaco (TMV), (Gallie y otros (1989) Molecular
Biology of RNA, páginas 237-256, Gallie y otros
(1987) Nucl. Acids Res. 15: 3257-3273 y líder del
virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel, S.A. y otros
(1991) Virology, 81:382-385). Véase, además,
Della-Cioppa y otros (1987) Plant Physiology,
84:965-968. También pueden utilizarse otros
métodos conocidos para potenciar la traducción, por ejemplo,
intrones y similares.
Los casetes de expresión pueden contener uno o
más de un gen o secuencia de ácido nucleico que ha de transferirse y
expresarse en la planta transformada. Así, cada secuencia de ácido
nucleico estará conectada operablemente a secuencias reguladoras 5'
y 3'. Alternativamente, pueden proporcionarse múltiples casetes de
expresión.
Generalmente, el casete de expresión comprenderá
un gen marcador seleccionable para la selección de células
transformadas. Los genes marcadores seleccionables se utilizan para
la selección de células o tejidos transformados.
Véanse, generalmente, G.T. Yarranton (1992)
Curr. Opin. Biotech., 3:506-511;
Christopherson y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89:6314-6318; Yao y otros (1992) Cell,
71:63-72; W.S. Reznikoff (1992) Mol.
Microbiol, 6:2419-2422; Barkley y otros (1980)
The Operon, pp. 177-220; Hu y otros (1987)
Cell, 48:555-566; Brown y otros (1987)
Cell, 49:603-612; Figge y otros (1988)
Cell, 52:713-722; Deuschle y otros (1989)
Proc. Natl. Acad. Aci. USA, 86:5400-5404;
Fuerst y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
86:2549-2553; Deuschle y otros (1990)
Science, 248:480-483; M. Gossen (1993) PhD
Thesis, University of Heidelberg; Reines y otros (1993) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 90:1917-1921; Labow y
otros (1990) Mol. Cell Bio., 10:3343-3356;
Zambretti y otros (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
89:3952-3956; Baim y otros (1991) Proc. Natl.
Acad. Sci. USA, 88:5072-5076; Wyborski y otros
(1991) Nuc. Acids Res., 19:4647-4653; A.
Hillenand-Wissman (1989) Topics in Mol. and
Struc. Biol., 10:143-162; Degenkolb y otros
(1991) Antimicrob. Agents Chemother.,
35:1591-1595; Kleinschnidt y otros (1988)
Biochemistry, 27:1094-1104; Gatz y otros
(1992) Plant J., 2:397-404; A.L. Bonin (1993)
PhD Thesis, University of Heidelberg; Gossen y otros (1992) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551; Oliva y
otros (1992) Antimicrob. Agents Chemother.,
36:913-919; Hlavka y otros (1985) Handbook of
Exp. Pharmacology, 78; Gill y otros (1988) Nature
334:721-724.
Los métodos de la invención también pueden
utilizarse para encontrar sitios de integración óptimos dentro de un
genoma de planta. De esta manera, una planta se transforma con un
casete de expresión que comprende un gen marcador seleccionable. El
casete de expresión es un sitio diana ya que el gen marcador está
flanqueado por sitios de recombinación no idénticos. Un protoplasto,
tejidos o plantas enteras transformados pueden probarse para
determinar los niveles de actividad del gen insertado. Por
comparación de actividades celulares del gen en diferentes sitios de
inserción, pueden encontrarse sitios de integración preferidos en
los que el gen se expresa a niveles altos o aceptables. Estas
plantas pueden utilizarse a continuación con técnicas de
reorientación subsiguientes para reemplazar el gen marcador por
otros genes o secuencias nucleotídicas de interés. De la misma
manera, múltiples genes pueden insertarse en el sitio óptimo para la
expresión. Véase, por ejemplo, la Figura 2, que indica un esquema
para el apilamiento génico que utiliza integración específica para
el sitio que usa el sistema FRT/FLP.
Está disponible una variedad de manipulaciones
genéticas usando las composiciones de la presente invención,
incluyendo, por ejemplo, comparar la actividad promotora en una
planta transformada. Antes de la presente invención, la actividad
promotora no podía determinarse y compararse precisamente debido a
que los genes quiméricos estaban insertados en diferentes posiciones
dentro del genoma de planta. Tales posiciones cromosómicas afectaban
a la actividad. Utilizando los métodos de la presente invención, es
posible una comparación directa de la actividad promotora en un
contexto cromosómico definido. Así, usando los métodos puede
alcanzarse una actividad potenciada de genes seleccionando sitios
cromosómicos óptimos así como promotores óptimos para la expresión
en la célula de planta.
La presente invención puede usarse para la
transformación de cualquier especie de planta, incluyendo, pero no
limitada a, maíz (Zea mays), canola (Brassica napus,
especies de Brassica rapa), alfalfa (Medicago sativa),
arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale),
sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), girasol
(Helianthus annuus), trigo (Triticum aestivum),
soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum),
patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis
hypogaea), algodón (Gossypium hirsutum), boniato
(Ipomoea battus), guacamote (Manihot esculenta), café
(especies de Cofea), coco (Cocos nucifera), piña
(Ananas comosus), cítricos (especies de Citrus), cacao
(Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), plátano
(especies de Musa), aguacate (Persea americana), higo
(Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango
(Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya
(Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale),
macadamia (Macadamia integrifolia), almendras (Prunus
amygdalus), remolachas azucareras (Beta vulgaris),
avenas, cebada, hortalizas, plantas ornamenteales y coníferas.
Las hortalizas incluyen tomates (Lycopersicon
esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa),
judías verdes (Phaseolus vulgaris), judías de Lima
(Phaseolus limensis), guisantes (especies de Lathyrus)
y miembros del género Cucumis tales como pepino (C.
sativus), cantalupo (C. cantalupensis) y melón (C.
melo). Las plantas ornamentales incluyen azalea (especies de
Rhododendron), hortensia (Macrophylla hydrangea), hibisco
(Hibiscus rosasanensis), rosas (especies de Rosa),
tulipanes (especies de Tulipa), narcisos (especies de
Narcissus), petunias (Petunia hybrida), clavel
(Dianthus caryophyllus), flor de pascua (Euphorbia
pulcherrima) y crisantemo. Coníferas que pueden emplearse para
poner en práctica la presente invención incluyen, por ejemplo, pinos
tales como pino de incienso (Pinus taeda), pino elliotii
(Pinus elliotii), pino ponderoso (Pinus ponderosa),
pino contorcido (Pinus contorta) y pino de Monterrey
(Pinus radiata); pino de Oregón (Pseudotsuga menziesii);
tsuga del Pacífico (Tsuga canadensis); picea de Sitka
(Picea glauca); secuoya roja (Sequoia sempervirens);
abetos verdaderos tales como abeto común (Abies amabilis)
y balsamina (Abies balsamea) y cedros tales como tuya
gigante (Thuja plicata) y ciprés de Nootka (Chamaecyparis
nootkatensis). Preferiblemente, las plantas de la presente
invención son plantas de cultivo (por ejemplo, maíz, alfalfa,
girasol, canola, soja, algodón, cacahuete, sorgo, trigo, tabaco,
etc.), más preferiblemente plantas de maíz y soja, aún más
preferiblemente plantas de maíz. Se sabe que los métodos de la
invención pueden aplicarse en cualquier sistema de planta. Métodos
para la transformación de plantas son conocidos en la técnica. De
esta manera, pueden obtenerse plantas, células de planta, tejido de
planta, semillas y similares genéticamente modificados. Los
procedimientos de transformación pueden variar dependiendo del tipo
de planta o célula de planta, es decir, monocotiledónea o
dicotiledónea, elegida como diana para la transformación. Métodos
adecuados para transformar células de planta incluyen microinyección
(Crossway y otros (1986) Biotechniques 4:320-334),
electroporación (Riggs y otros (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
83:5602-5606, transformación mediada por
Agrobacterium (Hinchee y otros (1988) Biotechnology,
6:915-921), transferencia génica directa
(Paszkowski y otros (1984) EMBO J.,
3:2717-2722) y aceleración balística de
partículas (véase, por ejemplo, Sanford y otros, Patente de EE.UU.
4.945.050; WO91/10725 y McCabe y otros (1988) Biotechnology,
6:923-926). Véanse, además, Weissinger y otros
(1988) Annual Rev. Genet., 22:421-477;
Sanford y otros (1987) Partculate Science and Technology,
5:27-37 (cebolla); Christou y otros (1988)
Plant Physiol. 87:671-674 (soja); McCabe y
otros (1988) Bio/Technology, 6:923-926
(soja); Datta y otros (1990) Biotechnology,
8:736-740 (arroz); Klein y otros (1988) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4305-4309 (maíz);
Klein y otros (1988) Biotechnology, 6:559-563
(maíz); WO91/10725 (maíz); Klein y otros (1988) Plant Physiol.,
91:440-444 (maíz); Fromm y otros (1990)
Biotechnology, 8:833-839 y
Gordon-Kamm y otros (1990) Plant Cell,
2:603-618 (maíz); Hooydaas-Van
Slogteren & Hooykaas (1984) Nature (Londres),
311:763-764; Bytebier y otros (1987) Proc.
Natl. Acad. Sci. USA,
84:5345-5349(Liliaceae); De Wet y otros
(1985) En The Experimental Manipulation of Ovule Tissues, ed.
G. P. Chapman y otros, pp. 197-209. Longman, NY
(polen); Kaeppler y otros (1990) Plant Cell Reports,
9:415-418 y Kaeppler y otros (1992) Theor.
Appl. Genet., 84:560-566 (transformación mediada
por cristalitos filamentarios) D'Halluin y otros (1992) Plant
Cell, 4:1495-1505 (electroporación); Li y otros
(1993) Plant Cell Reports, 12:250-255 y
Christou y Ford (1995) Annals of Botany,
75:407-413 (arroz) y Osjoda y otros (1996)
Nature Biotechnology, 14:745-750 (maíz a
través de Agrobacterium tumefaciens).
Las células que se han transformado pueden
hacerse crecer como plantas de acuerdo con sistemas convencionales.
Véase, por ejemplo, McCormick y otros (1986) Plant Cell
Reports, 5:81-84. Estas plantas regeneradas
pueden polinizarse a continuación con la misma cepa transformada o
cepas diferentes, y el híbrido resultante tener la característica
fenotípica deseada identificada. Pueden hacerse crecer dos o más
generaciones para asegurar que la característica fenotípica de
interés se mantenga y se herede establemente y a continuación las
semillas se recojen para asegurar que se haya alcanzado el fenotipo
u otra propiedad deseada.
Se sabe que puede utilizarse cualquier medio de
transformación para la presente invención. Sin embargo, para
insertar el sitio diana dentro de la planta transformada, puede
preferirse la transformación mediada por Agrobacterium. La
transformación mediada por Agrobacterium tiende generalmente a
insertar un número de copias inferior de DNA transferido que el
bombardeo con partículas u otros medios de transformación.
Los siguientes ejemplos se ofrecen a modo de
ilustración y no a modo de limitación.
La presente invención general proporciona un
procedimiento para usar sitios FRT existentes y nuevos en un nuevo
sistema de orientación génica que facilita la reorientación
direccional de genes deseados en sitios FRT previamente introducidos
en el genoma del organismo diana. Los nuevos sitios FRT difieren de
sitios FRT descritos previamente en la secuencia de las regiones
espaciadoras de 8 pb de los sitios FRT. Publicaciones previas
también han mostrado que en presencia de proteína FLP, la
recombinación de secuencias entre dos sitios FRT se produce
eficazmente solo con dos sitios FRT idénticos. Véase, por ejemplo,
Umlauf y Cox (1988) Embo J. 7:1845- 1852; Schlake y Bode
(1994) Biochem. 33:12746-12751. Para usar la
invención, una secuencia génica o de DNA se flanquea por dos sitios
FRT no idénticos y se introduce en un genoma de un organismo diana.
El gen encerrado puede ser un marcador seleccionable, permitiendo de
ese modo la selección para secuencias introducidas
satisfactoriamente. La caracterización molecular confirma la
integración de secuencias deseadas incluyendo sitios FRT completos.
Se listan posteriormente ejemplos genéticos de construcciones de
vectores útiles para poner en práctica la invención:
- A.
- \underline{FRTa}-P1-G1-T1-\underline{FRTb}
- B.
- \underline{FRTa}-P1-G1-T1-\underline{FRTa}
- C.
- \underline{FRTb}-P1-G1-T1-\underline{FRTb}
- D.
- P1-\underline{FRTa}-G1-T1-\underline{FRTb}
- E.
- P1-\underline{FRTa}-G1-T1-\underline{FRTa}
- F.
- P1-\underline{FRTb}-G1-T1-\underline{FRTb}
- G.
- P1-ATG::\underline{FRTa}::G1(noATG)-TI-P2-G2-T2-\underline{FRTb}
- H.
- P1-ATG::\underline{FRTa}::G1(noATG)-TI-P2-G2-T2-\underline{FRTb}-P3-G3-T3
- I.
- P1-ATG::\underline{FRTa}::G1(noATG)-TI-\underline{FRTa}::G2(noATG)-T2-\underline{FRTb}
- J.
- P1-ATG::\underline{FRTa}::G1(noATG)-TI-\underline{FRTa}::G2(noATG)-T2-\underline{FRTb}-P3-G3-T3
- K.
- P1-\underline{FRTa}-G1-T1-P2-G2-T2-\underline{FRTb}
- L.
- P1-\underline{FRTa}-G1-T1-P2-G2-T2-\underline{FRTb}-P3-G3-T3
- M.
- P1-\underline{FRTa}-G1-T1-\underline{FRTa}-G2-T2-\underline{FRTb}
- N.
- P1-\underline{FRTa}-G1-T1-\underline{FRTa}-G2-T2-\underline{FRTb}-P3-G3-T3
Pueden construirse variaciones de los mismos con
otros promotores, genes, terminadores o sitios FRT.
FRTa y FRTb son dos ejemplos de sitios FRT no
idénticos. P1, P2 y P3 son diferentes promotores, G1, G2 y G3 son
diferentes genes, T1, T2 y T3 son diferentes terminadores. ATG es el
inicio del codón de traducción para el gen subsiguiente. La
denominación noATG indica que el gen particular carece del codón de
iniciación de la traducción ATG. El símbolo :: implica una fusión
entre elementos adyacentes, y cuando se usa entre ATG, FRT y un gen
implica que las secuencias se reúnen para generar una fusión
traducciinal en el marco que da como resultado un producto génico
apropiadamente expresado y funcional.
A a F son configuraciones preferidas para probar
nuevos sitios FRT con respecto a la capacidad para recombinar
secuencias entre ellos; siendo la situación deseada que cuando se
usan dos del mismo sitio, la recombinación es eficaz y que cuando se
usan dos sitios diferentes, no tiene lugar recombinación entre ellos
en presencia de proteína FLP. G a J son configuraciones preferidas
para el uso general al desarrollar líneas para la reorientación. Se
entiende que cualquier número de genes u otras combinaciones de
secuencias pueden ensamblarse para usar como parte de esta
invención. K a N son posibles configuraciones que también podrían
usarse.
Una vez que se establece una planta o tejido
cultivado estable con uno de los constructos anteriores, un segundo
constructo flanqueado por los mismos sitios FRT que flanquean las
secuencias del primer constructo anterior se introduce en los
tejidos establemente transformados junto con la expresión de
proteína FLP. Los nuevos constructos pueden ser, pero no se limitan
a, los siguientes:
- O.
- \underline{FRTa}::G1(noATG)-TI-\underline{FRTb}
- P.
- \underline{FRTa}::G1(noATG)-TI-P2-G2-T2-\underline{FRTb}
- Q.
- \underline{FRTa}-G1-T1-\underline{FRTb}
- R.
- \underline{FRTa}-G1-T1-P2-G2-T2-\underline{FRTb}
La proteína FLP puede suministrarse a)
cotransformando con un plásmido que porta un gen que codifica FLP;
b) cointroduciendo mRNA o proteína de FLP directamente; c) usando
una línea para la transformación inicial que expresa FLP
constitutivamente o después de la inducción; o d) haciendo crecer
las plantas que soportan los vectores elegidos como diana iniciales,
cruzando con plantas que expresan proteína FLP activa y
seleccionando casos en la progenie.
Como un ejemplo de trabajo, la secuencia O
anterior se introduce en una línea que contiene una copia de la
secuencia G integrada establemente en el genoma, en presencia de
proteína FLP funcional. Tiene lugar recombinación entre sitios FRT
idénticos de modo que la secuencia entre los sitios FRT en O
reemplaza a la secuencia entre los sitios FRT correspondientes de la
secuencia G, dando de ese modo una nueva secuencia reintegrada
orientada direccionalmente. El nuevo gen en O se elimina ahora del
promotor P1 en G. El propósito de diseñar algunos de los constructos
sin un codón de iniciación ATG en el gen es tal que si se produce la
integración aleatoria, existe una probabilidad extremadamente baja
de expresión del gen introducido, ya que para que esto ocurra el
fragmento necesitaría integrarse tras una región promotora endógena
en el marco de lectura correcto. Esto se produciría de forma
extremadamente rara y los datos hasta la fecha no han dado ejemplos
de este suceso usando una secuencia tal como O donde el gen
contenido es el gen GUS fácilmente evaluable. Un requisito para cada
gen que ha de construirse de este modo (es decir, sin ATG en el gen
pero con el ATG aguas arriba del sitio FRT) es la demostración de
que el gen puede tolerar una fusión de la secuencia FRT entre el
codón ATG y el segundo codón de la proteína. Hasta la fecha, esto ha
funcionado para un gran número pero no todos los genes. En los
últimos casos podría usarse la otra forma del constructo que retiene
el ATG (por ejemplo Q.). Se espera que todas las secuencias listadas
anteriormente funcionen en este esquema, algunas con frecuencias o
eficacias diferentes que otras.
Un problema al que se dirige esta estrategia es
las limitaciones con los sistemas de transformación actuales,
particularmente en plantas, donde el aporte de DNA a células o
núcleos y la integración subsiguiente en el genoma se producen más o
menos aleatoriamente e impredeciblemente. Esto es particularmente
cierto con métodos de bombardeo de partículas; se han elaborado
argumentos de que los métodos basados en Agrobacterium
tienden a aportar secuencias flanqueadas en el límite por
T-DNA a regiones más activamente transcritas del
genoma, pero aparte de eso el procedimiento todavía es en gran parte
aleatorio. Por lo tanto, para el desarrollo de productos
comerciales, necesitan generarse grandes números (estimaciones de
>200) de casos para identificar un caso: a) que se exprese en el
nivel deseado; b) en el que el producto sea funcional y eficaz; c)
que tenga una complejidad de integración simple para facilitar la
recuperación; d) que no contenga secuencias extrañas que planteen
posibles problemas reguladores; e) que se mantenga establemente la
expresión a lo largo de generaciones; f) lo más importante, que no
tenga un impacto negativo sobre las características de
comportamiento agrónomo cuando se pasa a través de un programa de
reproducción que implica la introgresión del rasgo en diferentes
fondos genéticos. La utilización de recursos es muy grande y así los
esquemas que pueden producir notablemente la demanda de recursos
serían muy beneficiosos para la producción de números mayores de
productos finales deseados.
Se construyeron fragmentos de DNA que contenían
nuevas secuencias FRT sintetizando, reasociando y ligando
oligonucleótidos complementarios o creando cebadores para
amplificación por PCR (Mullis y Faloona, 1987) de un producto de DNA
que contiene la nueva secuencia FRT cerca del extremo 5' del
producto de PCR. El producto de FRT recientemente construido incluye
sitios de restricción de flanqueo útiles para clonar en unidades de
expresión de plantas. En general, el extremo 5' está flanqueado por
un sitio NheI y un sitio NcoI terminal. El sitio NcoI incluye las
bases ATG, que se usan ventajosamente en constructos vectoriales
recientemente desarrollados como las secuencia de reconocimiento
para iniciar un marco de lectura abierto. En constructos basados en
la secuencia denominados noATG/FRT, el sitio NheI se usa para clonar
eliminando de ese modo el ATG aguas arriba en el procedimiento. En
el extremo 3' de la secuencia FRT, se incluye un sitio de
restricción que permite la identificación única de las secuencias
espaciadoras individuales. Como ejemplos específicos, el sitio FRT
silvestre (denominado FRT1 aquí) se clona con un sitio BglII de
flanqueo, el sito FRT5 (espaciador TTCAAAAG) tiene un sitio ScaI, el
sitio FRT6 (espaciador TTCAAAAA) tiene un sitio AatII y el sitio
FRT7 (espaciador TTCAATAA) tiene un sitio SpeI. El sitio de
restricción de flanqueo más externo es un sitio XhoI y se usa para
clonar un gen de interés en el marco de lectura abierto.
Las estructuras y las secuencias de los sitios
FRT que se indican y/o se usan en el presente ejemplo de la
invención se representan posteriormente con posiciones de sitios de
restricción, repeticiones y regiones espaciadoras indicadas.
Basándose en el diseño de sitios FRT que se
describe anteriormente, se usaron procedimientos de PCR o
mutagénesis estándar para crear un sitio XhoI que se solapa en el
inicio de una secuencia génica que ha de usarse para clonación aguas
arriba del sitio FRT, convirtiendo de ese modo el codón de
iniciación ATG en GTG. La ligación de un FRT a la secuencia génica
mutada en XhoI crea un nuevo marco de lectura abierto que se inicia
5' con respecto al FRT. Una segunda secuencia FRT puede clonarse
aguas abajo del terminador usando una variedad de métodos incluyendo
PCR o ligación. La unidad FRT/gen/terminador/FRT puede usarse a
continuación para elaborar constructos de diana o substrato.
Las dianas se crean insertando un promotor en el
sitio NcoI aguas arriba del primer FRT. Esto mantiene un marco de
lectura abierto completo de la fusión FRT/gen. Estos constructos
diana son para usar en experimentos de transformación para crear
"líneas diana" deseables. Se construyen vectores substrato
clonando con el sitio NheI para truncar el codón de iniciación de la
unidad FRT/gen, eliminando de ese modo el marco de lectura abierto
apropiado. Estos vectores substrato se usan en experimentos
diseñados para reorientar un nuevo gen flanqueado por sitios FRT en
los sitios FRT correspondientes introducidos previamente en las
líneas diana. En cualquier caso, para crear múltiples casetes
génicos, unidades de promotor/gen/terminador adicionales se insertan
entre el terminador y el segundo FRT en cualesquiera moléculas diana
o substrato.
Plásmidos que contenían dos secuencias FRT
idénticas o dos diferentes se ensayaron con respecto a la eficacia
de recombinación de secuencias entre los sitios FRT mediante
transformación en 294-FLP, una versión de la cepa
MM294 de E. coli con FLP recombinasa integrada en el locus
lacZ (Buchholz y otros, 1996). Las cepas se hicieron crecer durante
la noche a 37ºC con agitación, permitiendo la expresión constitutiva
de FLP recombinasa en los cultivos. El DNA plasmídico se aisló
usando procedimientos estándar y se digirió con enzimas de
restricción que crean nuevos fragmentos de restricción después de la
recombinación mediada por FLP. La extensión de la recombinación
entre los sitios FRT se estimó examinando patrones de formación de
bandas sobre un gel de agarosa. La Tabla 1 resume datos del análisis
del gel.
| Combinación de Sitios Diana | Extensión de la Recombinación |
| FRT1 y FRT1 | Completa |
| FRT5 y FRT5 | Extensiva, pero parcialmente incompleta |
| FRT6 y FRT6 | Completa |
| FRT7 y FRT7 | Completa |
| FRT1 y FRT5 | Sin recombinación |
| FRT1 y FRT6 | Sin recombinación |
| FRT1 y FRT7 | Sin recombinación |
| FRT5 y FRT6 | Sin recombinación |
| FRT5 y FRT7 | Sin recombinación |
| FRT6 y FRT7 | Cantidad muy pequeña de recombinación |
Los resultados de estos estudios indican que la
escisión de secuencias entre sitios FRT idénticos se produce con
alta eficacia en general (FT5, ID SEC Nº 3, parece ser menos eficaz
globalmente que los sitios FRT1, ID SEC Nº 2, o la nueva FRT6, ID
SEC Nº 4, y FRT7, ID SEC Nº 5). De forma igual de importante, la
recombinación con dos sitios FRT diferentes estaba ausente, o al
menos era indetectable bajo las condiciones de este ensayo para
todas las combinaciones menos FRT6, ID SEC Nº 4, y FRT7, ID SEC Nº
5, donde se apreciaba un pequeño grado de recombinación. Estos datos
proporcionaban un fuerte apoyo para la utilidad potencial de sitios
FRT no idénticos al desarrollar un sistema de integración génica
direccional. Un punto a resaltar es que debido a que la
recombinación de secuencias entre dos sitios FRT idénticos puede
producirse con diferentes eficacias dependiendo del sitio FRT
específico usado (por ejemplo, FRT5, ID SEC Nº 3, en el presente
experimento), el diseño de constructos para la integración orientada
direccional puede requerir la selección juiciosa de pares de sitios
FRT para optimizar con respecto a la eficacia de recombinación
deseada o para evitar cualquier recombinación no deseada.
Se produjo un número de casos transgénicos
estables que portaban sitios diana FRT. Estas líneas diana se
generaron introduciendo uno de una serie de constructos incluyendo,
por ejemplo, PHP9643, PHP10616, PHP11407, PHP11410, PHP11457,
PHP11599, PHP11893 o PHP14220 (Véase la Tabla 2) en células de maíz,
mediante bombardeo de partículas, según se describe en Register y
otros (1994) Plant Mol. Biol. 25:951-961 o a
través de cocultivo con Agrobacterium según se describe por
Heath y otros (1997) Mol. Plant-Microbe Interact.
10:22-227; Hiei y otros (1994) Plant J.
6:271-282 e Ishida y otros (1996) Nat.
Biotech. 14:745-750 y en la Solicitud
Provisional Nº de Serie 60/045.121 para "Agrobacterium Mediated
Sorghum Transformation", presentada el 30 de Abril de 1997. Todos
los vectores se construyeron usando técnicas de biología molecular
estándar como las descritas, por ejemplo, en Sambrook y otros,
(1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed., Cold
Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, N.Y.). La Tabla 2
posterior describe los componentes dentro de cada uno de los
vectores usados para crear un grupo de líneas diana. La estrategia
de ensamblaje era como sigue. La primera unidad de expresión en cada
caso contiene el fragmento PstI de 2,0 kb del promotor de ubiquitina
de maíz Ubi-1 (Christensen y otros (1992) Plant Mol.
Biol. 18:675-689). Aguas abajo del promotor de
ubiquitina, secuencias FRT variables se insertaron usando NcoI u
otros sitios que retenían el codón de iniciación ATG. PHP10616 tiene
la secuencia de codificación mo-PAT (Solicitud de
Patente Provisional de EE.UU. Nº de Serie 60/035.560 para "Methods
for Improving Transformation Efficiency", presentada el 14 de
Enero de 1997) fusionada en el marco en el sitio XhoI que flanquea
FRT1 (véase anteriormente, ID SEC Nº 2). PHP11407 y PHP11893 tienen
GFPm-C3 (PCT/US97/07688, presentada el 1 de Mayo de
1997 a partir de la Solicitud Provisional 0/016.345, presentada el 1
de Mayo de 1996) que contiene el segundo intrón de
ST-LS1 de patata (Vancanneyt y otros (1990) Mol.
Gen. Genet. 220:245-250) fusionado en el marco en el
sitio XhoI de FRT1 y FRT6, respectivamente. El terminador del
inhibidor de proteinasa de patata II (PinII) (bases 2 a 310 de An y
otros (1989) Plant Cell 1:115-122) se ligó aguas
abajo de las secuencias de codificación. PHP10616 tiene una
secuencia FRT5 (ID SEC Nº 3) clonada aguas abajo del terminador de
PinII.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Las segundas unidades de expresión tienen el
promotor de ubiquitina de maíz o alternativamente las versiones
potenciadas o estándar del promotor 35S del virus del mosaico de la
coliflor. El promotor 35S estándar incluye las bases -421 a +2 (de
Gardner y otros (1981) Nucl. Acids Res.
9:2871-2888), y la versión potenciada tiene
una duplicación de bases -421 a -90 aguas arriba de este promotor
35S estándar. El líder del virus del mosaico del tabaco de 79 pb O'
(Gallie y otros (1987) Nucl. Acids Res.
15:3257-3273) se inserta aguas abajo del promotor
35S seguido por el primer intrón del gen de alcohol deshidrogenasa
de maíz ADH1-S (Dennis y otros (1984) Nucl. Acids
Res. 12:3983-3990). Las secuencias de codificación
en estas segundas unidades de expresión incluyen los genes
mo-PAT, bar (Thompson y otros (1987) EMBO J.
6:2519-2523) o HM1 (Johal y Briggs, Science
258:985-987) seguidos por el terminador de PinII o
el terminador 35S (nucleótidos 7487-7639 en Gardner
y otros (1981) Nucl. Acids Res. 9:2871-2888). Los
sitios FRT variables se ligan aguas abajo de los terminadores según
se muestra en la tabla. Una tercera unidad de expresión está
presente en PHP9643 y tiene una fusión FRT1/GFPm clonada usando el
sitio NheI de flanqueo de FRT1 (ID SEC Nº 2) para retirar el codón
de iniciación ATG de GFPm, haciéndolo de ese modo no funcional en el
constructo existente, pero donde la escisión correcta de las
secuencias entre los sitios FRT1 (ID SEC Nº 2) puede poner la GFPm
en el marco con el promotor de ubiquitina y ATG de la primera unidad
de expresión, haciéndola de ese modo funcional. Aguas abajo de GFPm
está el terminador de PinII seguido por una secuencia FRT5 (ID SEC
Nº 3).
PHP9643 se clonó en una cadena principal
plasmídica derivada de pUC. Todos los otros vectores se clonaron en
un plásmido de tipo pSB11 (Véanse, por ejemplo, EPA0672753A1,
EPA0604662A1, EPA0687730A1 y la Patente de EE.UU. Nº 5.591.616) con
las unidades de expresión contenidas entre las secuencias límite de
TDNA. Todos se orientan con la unidad de expresión uno adyacente al
límite derecho. Los plásmidos basados en pSB11 se integraron en el
plásmido superbinario pSB1 (Véanse, por ejemplo, EPA0672752A1,
EPA0604662A1, EPA0687730A1 y la Patente de EE.UU. Nº 5.591.616)
mediante recombinación homóloga entre los dos plásmidos. La cepa
HB101 de E. coli que contiene los derivados de pSB11 se cruzó con la
cepa de Agrobacterium LBA4404 que aloja pSB1 para crear los
plásmidos cointegrados PHP10616, PHP11407, PHP11410, PHP11457,
PHP11599, PHP11893 y PHP14220 en Agrobacterium (mediante el método
de Ditta y otros (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA
77:7347-7351). Los cointegrados se verificaron
mediante la resistencia de Agrobacterium a la espectinomicina y
digestiones de restricción con SalI.
La Tabla 2 también incluye un ejemplo de un
vector para crear una línea diana donde los sitios FRT se insertan
en el intrón de ubiquitina de maíz (última entrada) como una
localización alternativa para la colocación de FRT u otros sitios
diana.
Después de la selección de casos establemente
transformados, muestras de estas líneas diana se criopreservaron
como un suministro para experimentos futuros usando el sistema
descrito por Peterson (véase la solicitud 08/859.313). Para varios
pero no todos los casos, se hizo crecer otra muestra de callo
procedente de varios de los casos transgénicos estables, se
transfirió a medio de regeneración para inducir la formación de
plántulas y las plantas se recuperaron subsiguientemente y se
hicieron crecer hasta la madurez (Register y otros (1994) Plant.
Mol. Biol. 25:951-961).
La extensión de la recombinación intraplasmídica
se examinó en plantas usando los constructos de escisión de FRT
descritos en la Tabla 3 posteriormente. Los vectores PHP10968,
PHP10998, PHP10969, PHP11272, PHP11243, PHP11244, PHP12140,
PHP12141, PHP12156 y PHP12157 se construyeron ligando el promotor de
ubiquitina de maíz aguas arriba de secuencias FRT usando NcoI u
otros sitios que mantenían el codón de iniciación ATG. La secuencia
FRT se fusionó en el marco en el sitio XhoI de flanqueo a una
secuencia GFPm que contenía una mutación de serina en treonina en el
residuo de aminoácido 65 en la secuencia silvestre (nueva secuencia
denominada GFPm-S65T). El terminador de pinII se
clonó aguas abajo de GFPm. La segunda unidad de expresión consiste
en una FRT sin promotor, clonada con el sitio NheI de flanqueo 5'
para retirar el codón de iniciación ATG, fusionada en el marco con
la secuencia de codificación de GUS (Jefferson y otros (1986) Proc.
Natl. Acad. Sci USA 83: 8447-8451) y seguida por el
terminador de pinII. La cadena principal vectorial es un plásmido
derivado de pUC en todos los casos. Se efectuaron experimentos
bombardeando los plásmidos indicados en células de maíz junto con el
constructo pHP5096, que soporta un casete de expresión funcional
para la proteína FLP. PHP5096, el vector de expresión de FLPm que se
usó en experimentos con los vectores de escisión y de substrato,
consiste en el promotor de ubiquitina de maíz clonado aguas arriba
de la secuencia de codificación de FLPm (Solicitud de Patente de
EE.UU. Nº de Serie 08/972.258 para "Novel Nucleic Acid Sequence
Encoding FLP Recombinase") y el terminador de pinII en una cadena
principal plasmídica derivada de pUC. En cada caso, la escisión
satisfactoria retiraría secuencias intermedias entre los sitios FRT
indicados poniendo de ese modo un gen uidA (GUS) inactivo en
el marco con y en proximidad al promotor de ubiquitina dando como
resultado actividad de GUS. Si no se produce la escisión, no se
espera expresión de GUS. Los resultados para la expresión de GUS a
partir de estos experimentos se indican en la Tabla 4
posteriormente. En estos estudios se producía escisión eficaz solo
cuando los constructos contenían dos sitios FRT idénticos. En el
caso de la combinación de FRT6 (ID SEC Nº 4) y FRT7 (ID SEC Nº 5),
se observó una pequeña cantidad de recombinación, de nuevo
enfatizando la necesidad de probar combinaciones de sitios diana y
seleccionar juiciosamente combinaciones apropiadas para la
aplicación.
| Plásmido | Recombinación probada entre | Expresión de GUS |
| PHP10968 | FRT1 y FRT1 | +++ |
| PHP10998 | FRT5 y FRT5 | ++ |
| PHP11272 | FRT6 y FRT6 | +++ |
| PHP12157 | FRT7 y FRT7 | +++ |
| PHP9643 | FRT1 y FRT5 | - |
| PHP11243 | FRT1 y FRT6 | - |
| PHP 12140 | FRT 1 y FRT7 | - |
| PHP11244 | FRT5 y FRT6 | - |
| PHP 12141 | FRT5 y FRT7 | - |
| PHP 12156 | FRT6 y FRT7 | + |
\vskip1.000000\baselineskip
Se resumen en la Tabla 5 posteriormente datos de
experimentos en los que líneas diana creadas usando los plásmidos
descritos en la Tabla 2 se bombardeaban con un plásmido substrato
que contenía un gen informador GUS flanqueado por los sitios FRT
correspondientes usados en los constructos diana. Este experimento
medía en la capacidad para detectar la expresión de GUS transitoria
poco después de la introducción del plásmido substrato. Puesto que
no hay promotor frente a la primera secuencia de codificación en los
plásmidos substrato, la integración aleatoria, a no ser que se
produjera en el marco detrás de una secuencia reguladora apropiada
en cualquier parte del genoma, no daría como resultado la expresión
de GUS. Este sistema de ensayo evalúa entonces la capacidad para
orientar genes flanqueados por FRT a sitios FRT del genoma. En
general, los vectores substrato de FRT (Tabla 6) se construyen como
fusiones FRT/gen sin promotor clonadas usando el sitio NheI de
flanqueo 5' del FRT para retirar el codón de iniciación ATG. Genes
fusionados en el marco al FRT con el sitio XhoI de flanqueo incluyen
uno de varios genes marcadores evaluables o seleccionables tales
como aadA (Svab y otros (1990) Plant Mol. Biol.
14:197-205), uidA, GFPm,
GFPm-C3/intrón o bar y están seguidos por un
terminador de pinII. En algunos casos (PHP10259, PHP10603, PHP11561
y PHP11633), los plásmidos contienen una sola unidad de expresión y
el segundo sitio FRT heterólogo está clonado aguas abajo del
terminador de pinII. Los plásmidos substrato PHP10859, PHP10997,
PHP11204, PHP11699 y PHP12190 tienen además de la primera unidad de
expresión descrita anteriormente una segunda unidad que consiste en
un promotor de ubiquitina de maíz, el promotor 35S potenciado o un
promotor quimérico que consiste en la región potenciadora de 35S
clonada aguas arriba de un promotor central sintético denominado
Rsyn7 (Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/661.601,
presentada el 11 de Junio de 1996) clonado aguas arriba de las
secuencias de codificación de HM1, aadA, GUS o bar y el terminador
de pinII. Un FRT heterólogo se inserta aguas abajo del segundo
terminador. Finalmente, PHP11003 y PHP11809 contienen tres unidades
de expresión. La primera unidad es una fusión noATG/FRT/gen sin
promotor como la descrita anteriormente. La segunda unidad contiene
el potenciador 35S/promotor Rsyn7 quimérico descrito anteriormente o
el promotor ZmdJ1 (Baszczynski y otros (1997) Maydica
42:189-201) clonado aguas arriba de la secuencia de
codificación de GUS y el terminador de pinII. La tercera unidad de
expresión consiste en el promotor de ubiquitina de maíz clonado
aguas arriba de la secuencia de codificación de HM1, el terminador
pinII y una secuencia FRT heteróloga. Todos los vectores substrato
de FRT se clonan en una cadena principal plasmídica derivada de pUC.
Detalles de los componentes de estos vectores se describen en la
Tabla 6. También se listan en la Tabla 6 dos vectores con situación
alternativa de los sitios FRT en la UTR 5' o el intrón de
ubiquitina.
| N° de manchas | PHP9643 | PHP1147 | PHP11410 | PHP11407 | PHP11457 |
| de GUS | (n = 74) | (n = 127) | (n = 32) | (n = 38) | (n = 113) |
| sin manchas | 17,57% | 3,15% | 6,25% | 2,63% | 7,96% |
| 1-25 | 22,97% | 48,03% | 62,50% | 10,53% | 27,43% |
| 26-100 | 31,08% | 37,80% | 18,75% | 18,42% | 32,74% |
| 101-200 | 14,86% | 8,66% | 12,50% | 57,89% | 27,43% |
| demasiadas para | 13,51% | 2,36% | 0,00% | 10,53% | 4,42% |
| contarlas |
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
Los resultados de la Tabla 5 indican que la
frecuencia y el nivel de la expresión de GUS varían entre diferentes
casos, como podría predecirse para genes insertados en diferentes
posiciones en el genoma. La predicción es que una vez que se
identifica una línea de alta frecuencia y alta expresión, la
expresión de los genes introducidos subsiguientemente en esos mismos
sitios también será superior que en otros casos de expresión
inferior.
Un subgrupo de las "líneas diana"
transgénicas estables descritas en el ejemplo 4 anteriormente se usó
en experimentos destinados a reorientar establemente a estas líneas
diana primarias un nuevo gen flanqueado por los mismos sitios FRT
usados en las líneas diana y clonados en un segundo plásmido
"substrato" de constructo. La Tabla 7 lista los constructos
contenidos en las líneas diana primarias (de la Tabla 2), los sitios
FRT contenidos en estas líneas y los plásmidos substrato (de la
Tabla 6) que se reorientaban subsiguientemente a las líneas
diana.
La Tabla 8 presenta datos de casos transgénicos
estables que demuestran orientación satisfactoria y reproducible de
secuencias introducidas hacia sitios diana genómicos previamente
creados. Los datos mostrados son para 18 líneas diana
independientes, cada una reorientada con un constructo de GUS sin
promotor. Puesto que el gen bar se introducía simultáneamente en el
mismo plásmido, la proporción de casos que expresan GUS de los casos
totales recuperados con selección con bialofós proporciona una
medida de la frecuencia de reorientación con relación a la
integración aleatoria.
\vskip1.000000\baselineskip
| Constructo diana | Sitios FRT | Substratos que se evalúan |
| PHP9643 | 1/1/5 | 10603, 10259, 10859, 10997, 11003 |
| PHP11147 | 1/5 | 10603, 10859, 11003 |
| PHP11407 | 1/5 | 10603, 11204, 12190 |
| PHP 11410 | 5/1 | 11633 |
| PHP11457 | 6/1 | 11561, 11699, 11809 |
| PHP11893 | 6/1 | Experimentos en marcha |
\vskip1.000000\baselineskip
| Líneas Diana | N° de Casos Aleatorios | N° de Casos Orientados | Frecuencia de Orientación (%) |
| A | 13 | 1 | 7,1 |
| B | 14 | 1 | 6,7 |
| C | 108 | 14 | 11,5 |
| D | 18 | 1 | 5,3 |
| E | 14 | 2 | 12,5 |
| F | 9 | 1 | 10,0 |
| G | 65 | 1 | 1,5 |
| H | 63 | 9 | 12,5 |
| I | 71 | 6 | 7,8 |
| J | 15 | 1 | 6,3 |
| Líneas Diana | N° de Casos Aleatorios | N° de Casos Orientados | Frecuencia de Orientación (%) |
| K | 33 | 9 | 21,4 |
| L | 19 | 2 | 9,5 |
| M | 8 | 1 | 11,1 |
| N | 12 | 1 | 7,7 |
| O | 29 | 4 | 12,1 |
| P | 43 | 4 | 8,5 |
| Q | 16 | 3 | 15,8 |
| R | 4 | 1 | 20,0 |
| S | 12 | 1 | 7,7 |
| T | 10 | 1 | 9,1 |
| U | 1 | 2 | 66,7 |
La evaluación inicial del impacto de las
secuencias introducidas sobre el crecimiento de las plantas y la
expresión génica se efectúa en el invernadero realizando
observaciones regulares a través de la polinización y la formación
de semillas. Las plantas tanto se autofecundan como se cruzan con
otros genotipos para obtener semillas T1 para la evaluación
subsiguiente en invernadero y campo. Para la evaluación de la
expresión génica, se recogen y analizan datos tanto cualitativos
como cuantitativos. Las semillas T1 procedentes de casos
transgénicos que dan niveles aceptables o deseables de expresión que
no muestran impacto negativo significativo en el desarrollo de las
plantas (por ejemplo, tienen morfología de desarrollo normal, son
andro- y geno-fértiles, etc.) se hacen crecer a
continuación en parcelas de campo manipuladas junto con plantas de
control no transgénicas, y los datos de comportamiento agrónomo
estándar se recogen y se evalúan.
El sistema adoptado aquí para desarrollar un
método para convertir entre diferentes sitios FRT para usar en
diversas aplicaciones se basa en la estrategia de
"quimeraplastia" previamente descrita para realizar
modificaciones nucleotídicas orientadas específicas en una secuencia
diana estracromosómica o genómica especificada en células animales
(Yoon y otros (1996) Proc. Natl. Acad. Sci.
93:2071-2076; Cole-Strauss y otros
(1996) Science 273:1386-1389). Esta capacidad
en las plantas, según se demostró recientemente en estos
laboratorios, es beneficiosa para extender el uso potencial de la
presente invención para una aplicación más amplia. El uso propuesto
de esta tecnología de "quimeraplastia" en la presente invención
sería orientar y modificar nucleótidos en un sitio FRT de un par de
sitios FRT no idénticos que flanquean una secuencia de DNA de
interés en un modo que a continuación hace idénticos los dos sitos
FRT. La expresión subsiguiente o simultánea de FLP recombinasa en
células con estas modificaciones de sitios FRT conduciría a la
escisión de las secuencias entre estos sitios FRT ahora idénticos,
retirando de ese modo específicamente las secuencias de DNA no
deseables del caso transgénico estable creado previamente que
contiene esas secuencias. Una aplicación de ese sistema estaría, por
ejemplo, en el caso de un marcador seleccionable que se requiere
durante etapas iniciales de un programa de reproducción o
retrocruzamiento para mantener y seleccionar plantas individuales
preferidas, pero que no se desea en el producto final.
Los vectores diana para evaluar esta estrategia
de modificación de sitios FRT se muestran específicamente
posteriormente, donde P1 y P2 representan dos promotores diferentes,
G1 y G2 representan dos genes y T1 y T2 representan dos regiones
terminadoras; estas regiones se muestran como cajas blancas.
Diferentes sitios FRT se indican y se muestran como cajas oscuras.
Una versión del constructo incorpora un tercer sitio FRT único aguas
abajo del segundo gen y se usa para evaluar si la conversión
orientada, en este caso, de FRT5 en FRT6 (ID SEC Nº 4), también da
como resultado la conversión del sitio FRT1 (ID SEC Nº 2) aguas
abajo en un sitio FRT6 (ID SEC Nº 4). En el primer caso, la
dispersión del gen (G1) aguas abajo debe detectarse, mientras que si
la conversión no es específica para FRT5 (ID SEC Nº 3) y el sitio
FRT1 (ID SEC Nº 2) también se convierte, entonces ambas actividades
génicas se perderán. Para los ejemplos específicos usados aquí, P1
es el promotor de ubiquitina de maíz, P2 es el promotor 35S de CaMV
potenciado, G1 es el gen uidA (GUS), G2 es el gen bar
y T1 y T2 son terminadores de pinII. Se entiende que basándose en
las diversas descripciones de constructos vectoriales previas en
esta solicitud, una variedad de diferentes promotores, genes,
terminadores o secuencias de DNA o sitios FRT podría usarse para
poner en práctica este método de componentes. Los casetes de DNA que
se muestran posteriormente podrían ensamblarse en un plásmido basado
en pUC para métodos de aporte de DNA directos (tales como bombardeo
de partículas) o en un vector binario para la transformación basada
en Agrobacterium según se describe previamente.
Se muestran posteriormente ejemplos específicos
de moléculas quiméricas que se usarían para modificar un solo
nucleótido a fin de convertir el sitio FRT5 (ID SEC Nº 3) en un
sitio FRT6 (ID SEC Nº 4) en constructos como los descritos
anteriormente. Se muestra tanto la secuencia lineal de estas
moléculas quiméricas como la forma activa predicha de la molécula
(basada en las publicaciones anteriores de Yoon y otros y
Cole-Strauss y otros). Los residuos de DNA se
representan en mayúsculas, los residuos de RNA en minúsculas y el
sitio que ha de modificarse (una sola diferencia de nucleótidos
entre FRT5, ID SEC Nº 3, y FRT6, ID SEC Nº 4) está subrayado y en
negrita. Se representan posteriormente dos ejemplos de quimeras que
difieren en el número de residuos aguas abajo del sitio FRT5 (ID SEC
Nº 4) que podrían incluirse en el diseño de moléculas quiméricas y
que determinarían así la especificidad para la secuencia diana.
1. Secuencia lineal oligonucleotídica
quimérica (la secuencia incluye seis residuos específicos para
la diana aguas abajo del sitio FRT que se modifica en el constructo
diana y debe convertir solo este sitio FRT5, ID SEC Nº 3, específico
en un sitio FRT6, ID SEC Nº 4)
2. Secuencia lineal oligonucleotídica
quimérica (la secuencia contiene residuos específicos solo para
secuencias en el sitio FRT y así debe convertir cualquier sitio
FRT5, ID SEC Nº 3, en una molécula diana en un sitio FRT6, ID SEC Nº
4)
Construcciones vectoriales y moléculas
oligonucleotídicas quiméricas como las descritas anteriormente se
generaron y se usaron en los experimentos.
Se generan líneas de maíz transgénico estables
con los constructos que se describen anteriormente o con otros
relacionados transformando en los constructos y seleccionando sobre
bialofós según se describe anteriormente. Tejidos que han de usarse
para el aporte de quimeras se transfieren sobre medio que no
contiene bialofós y los oligonucleótidos quiméricos se aportan a
células de estos casos estables mediante bombardeo de partículas,
junto con el co-suministro de PHP5096 que soporta un
casete de expresión de FLP recombinasa funcional. En experimentos de
control, solo se aportan moléculas quiméricas o solo PHP5096.
Después de un tiempo suficiente para que las células se recuperen
sin selección con bialofós, muestras de los casos bombardeados se
evalúan con respecto a la expresión de GUS. Para aquellos casos
bombardeados que contienen el constructo con el sitio FRT1 (ID SEC
Nº 2) aguas abajo que no muestra expresión de GUS, una muestra de
células equivalente se cultiva en placa y se hace crecer sobre medio
con o sin selección con bialofós para determinar la sensibilidad al
producto químico. Si las moléculas quiméricas son específicas para
modificar solo el sitio FRT5 (ID SEC Nº 3), entonces no deben
observarse diferencias en el número y el crecimiento de células
entre tratamientos con o sin selección. Por lo demás, deben
apreciarse crecimiento y recuperación reducidos.
DNA de las muestras que exhiben expresión de GUS
se aísla, se amplifica mediante PCR si es necesario y se somete a
secuenciación mediante métodos estándar a través de la región
correspondiente a la conversión nucleotídica predicha. Una extensión
suficiente de DNA se somete a secuenciación para cubrir toda la
región introducida originalmente de DNA a fin de confirmar la
conversión correcta y específica. Usar métodos estándar para PCR,
análisis Southern y/o secuenciación de muestras que expresan y no
expresan GUS establece la presencia o ausencia de fragmentos de DNA
específicos antes de y después del aporte de moléculas quiméricas y
FLP recombinasa, y así substancia las observaciones visuales y
químicas realizadas anteriormente.
Se describe en la Figura 1 una estrategia
potencial para combinar o apilar múltiples transgenes deseados en
una posición genómica usando el sistema basado en FRT no idénticos
de la presente invención. Aunque el apilamiento de genes puede
alcanzarse sin el uso del método de conversión de FRT orientado
descrito en este ejemplo 7, este último método extiende las
capacidades del sistema permitiendo la conversión in vivo de
sitos FRT para crear nuevos sitios, en vez de reintroducir nuevos
sitios FRT mediante transformación. En el diagrama de la Figura 1,
un sitio FRT con un asterisco junto a él indica que inicialmente fue
creado para ser no funcional con respecto a la recombinación entre
él y el sitio FRT equivalente sin asterisco, pero que durante la
conversión con el sistema basado en quimeraplastia descrito aquí se
hace capaz de recombinación con su homólogo sin asterisco
equivalente. En el ejemplo específico presentado en la figura, esto
facilitaría, por ejemplo, la retirada de un marcador seleccionable
para que ya nunca estuviera presente o para permitir reutilizar el
marcador seleccionable en transformaciones futuras. Así, este método
también proporciona un mecanismo para reciclar marcadores
seleccionables, que solo es posible al usar el sistema de FRT de la
presente invención.
Hasta la fecha, en las plantas, la principal
aplicación del sistema FLP/FRT ha sido para la escisión de DNA
(Lyznik y otros (1993) Nucleic Acid Res.
21:969-975). Por ejemplo, un gen tal como un
marcador seleccionable flanqueado por sitios FRT se introduce en
primer lugar en células de planta mediante uno de varios sistemas de
transformación y se recuperan casos o plantas transgénicos estables
a través de la selección apropiada. A continuación, para eliminar el
gen marcador seleccionable, la proteína FLP se expresa en las
células transitoriamente introduciendo un plásmido que porta un
casete de expresión de FLP, siguiendo establemente la integración de
un casete de expresión de FLP introducido, o cruzando plantas que
portan el gen marcador seleccionable flanqueado por FRT con plantas
que portan secuencias para y que expresan proteína FLP activa
(Patente de EE.UU. Nº de Serie 08/972.258 para "Novel Nucleic Acid
Sequence Encoding FLP Recombinase").
Un problema principal asociado con el desarrollo
del sistema FLP/FRT para integrar genes en animales o plantas
proviene del hecho de que la reacción de recombinación catalizada
por FLP recombinasa de levadura es un proceso reversible (Sadowski
(1995) en Progress in Nucleic Acid Research and Molecular
Biology, 51:53-91). Por ejemplo, después de la
introducción de una secuencia de DNA flanqueada por sitios FRT
orientados de forma similar en células de planta en presencia de FLP
recombinasa que se expresa activamente, la recombinación debe
conducir a la inserción de las nuevas secuencias de DNA en el sitio
FRT endógeno. Sin embargo, con la expresión continuada de enzima
FLP, la reacción inversa conduciría a la reescisión de las
secuencias introducidas debido a la recombinación entre los sitios
FRT idénticos. Puesto que la reacción es reversible, la integración
y la escisión pueden continuar repetidamente hacia el equilibrio. A
medida que las células se dividen y la concentración de substrato de
DNA por célula disminuye, la probabilidad de integración disminuye,
de modo que, en general, con tal de que se exprese proteína FLP
activa, la reacción se conducirá hacia el estado no integrado. Para
favorecer la integración, debe establecerse una situación que evite
la reescisión una vez que se produce la integración. Se ha sugerido
un número de estrategias, incluyendo limitar la duración de la
actividad de FLP recombinasa a través de la expresión inducible o
introduciendo directamente proteína o RNA de FLP en las células
Sadowski (1995) en Progress on Nucleic Acid Research and
Molecular Biology, 51:53-91), pero hasta la
fecha no se ha establecido un sistema de integración no aleatorio
para plantas.
La presente invención describe el desarrollo de
un nuevo sistema de orientación génica útil para plantas que utiliza
la FLP recombinasa de levadura o una FLP recombinasa modificada
diseñada para funcionar más eficazmente en ciertas especies de
planta y nuevos sitios FRT no idénticos que pueden usarse para la
integración de DNA no reversible direccional. Adicionalmente, se
describe aquí un nuevo uso de tecnologías auxiliares tales como
"quimeraplastia" que permiten la modificación in vivo o in
vitro de secuencias de DNA, tales como sitios FRT, para ampliar
adicionalmente la utilidad del sistema. Los datos proporcionados
demuestran la integración estable satisfactoria de secuencias de DNA
entre dos sitios FRT no idénticos previamente introducidos, en maíz.
Se muestra además que las secuencias de DNA entre los sitios FRT
pueden reemplazarse subsiguientemente por una segunda secuencia de
DNA flanqueada por los mismos sitios FRT que la primera. Juntos,
estos resultados demuestran que es posible introducir y recuperar
pares de sitios FRT no idénticos en ciertas posiciones genómicas,
que pueden seleccionarse posiciones genómicas deseables o preferidas
para expresar secuencias de DNA de interés y que estas posiciones
seleccionadas pueden usarse para reorientar otras secuencias de DNA
de interés. Aparte de los beneficios obvios de poder integrar genes
en el genoma de plantas, la presente invención proporcionar medios
para facilitar la introducción de nuevos genes o secuencias de DNA
en posiciones genómicas que se ha determinado previamente que son
particularmente beneficiosas para la integración génica desde la
perspectiva de proporcionar niveles adecuados de expresión estable
del gen o los genes introducidos y no exhibir impactos perjudiciales
sobre las características agrónomas incluyendo el rendimiento.
Además, la invención proporciona un sistema por el que la
integración de dos o más genes puede dirigirse a la misma posición
genómica, proporcionando un mecanismo para el "apilamiento
génico". Estos genes apilados pueden mantenerse a continuación y
manipularse como un par estrechamente conectado de rasgos en
programas de reproducción. Así, esta invención también proporciona
un método mejorado para introducir, mantener y reproducir múltiples
rasgos genéticos de interés, incluyendo rasgos agrónomos, genes
comercialmente importantes u otros productos génicos
heterólogos.
La invención proporciona además usar la
característica de no recombinación de sitios FRT no idénticos para
permitir la creación de un grupo de líneas "parentales", que
están inicialmente bien caracterizadas para todos los parámetros de
expresión y comportamiento deseados descritos anteriormente. Estas
líneas sirven a continuación como la base para la introducción de
nuevos rasgos en los mismos sitios predefinidos del genoma donde se
introdujeron los genes iniciales. Necesitan generarse muchos menos
casos, ya que la integración se produciría preferentemente en sitios
que se muestra que se expresan bien y tienen un impacto negativo
mínimo sobre el comportamiento.
Aunque la invención precedente se ha descrito con
algún detalle a modo de ilustración y ejemplo con propósitos de
claridad de comprensión, será obvio que pueden ponerse en práctica
ciertos cambios y modificaciones dentro del alcance de las
reivindicaciones adjuntas.
<110> Baszczynski, Christopher
\hskip2,9cm Bowen, Benjamin A.
\hskip2,9cm Peterson, David J.
\hskip2,9cm Tagliani, Laura A.
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Composición y Métodos para la
Modificación Genética de Plantas
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 035718-158667
\vskip0.400000\baselineskip
<140>
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
\vskip0.400000\baselineskip
<150> 60/065.627
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
1997-11-18
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 34
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Saccharomyces cerevisiae
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> (14)...(21) región espaciadora
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgaagttccta ttctctagaa agtataggaa cttc
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> (39)...(46) región espaciadora
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del Organismo
Desconocido: Construido sintetizando, reasociando y ligando
oligonucleótidos complementarios o creando cebadores para
amplificaciones por
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipPCR
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatggctag cgaagttcct attccgaagt tcctattctc tagaaagtat aggaacttca
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgatctcgag
\hfill69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del Organismo
Desconocido: Construido sintetizando, reasociando y ligando
oligonucleótidos complementarios o creando cebadores para
amplificaciones por
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipPCR
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> (39)...(46) región espaciadora
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatggctag cgaagttcct attccgaagt ttctattctt caaaaggtat aggaacttca
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgtactcgag
\hfill69
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del Organismo
Desconocido: Construido sintetizando, reasociando y ligando
oligonucleótidos complementarios o creando cebadores para
amplificaciones por
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipPCR
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> (36)...(49) región espaciadora
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatggctag cgaagttcct attccgaagt tcctattctt caaaaagtat aggaacttca
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipgacgtcctcg ag
\hfill72
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del Organismo
Desconocido: Construido sintetizando, reasociando y ligando
oligonucleótidos complementarios o creando cebadores para
amplificaciones por
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipPCR
\hfill
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> (39)...(46) región espaciadora
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipccatggctag cgaagttcct attccgaagt tcctattctt caataagtat aggaacttca
\hfill60
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagttctcg ag
\hfill72
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (37)
1. Un método para dirigir la inserción de una
secuencia nucleotídica de interés a un sitio cromosómico específico
dentro de un genoma de una célula de planta, que comprende:
- (a)
- introducir en dicha célula de planta cuyo genoma comprende un sitio diana flanqueado por sitios de recombinación no idénticos un casete de transferencia que comprende la secuencia nucleotídica de interés flanqueada por sitios de recombinación no idénticos correspondientes; y
- (b)
- proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos.
2. Un método para situar sitios de integración
preferidos dentro de un genoma de una célula de planta, que
comprende:
- (a)
- introducir en dicha célula de planta un sitio diana que comprende una secuencia nucleotídica flanqueada por sitios de recombinación no idénticos;
- (b)
- determinar el nivel de expresión de dicha secuencia nucleotídica; y
- (c)
- seleccionar una célula de planta que expresa dicha secuencia nucleotídica.
3. Un método de acuerdo con la reivindicación 2,
que comprende además:
- (d)
- introducir en la célula de planta de la etapa (c) un casete de transferencia, comprendiendo dicho casete de transferencia una secuencia nucleotídica de interés flanqueada por sitios de recombinación no idénticos correspondientes; y
- (e)
- proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos.
4. Un método para determinar la actividad
promotora en una célula de planta, que comprende:
- (a)
- introducir en dicha célula de planta cuyo genoma comprende un sitio diana flanqueado por sitios de recombinación no idénticos un casete de transferencia que comprende un promotor conectado operablemente a una secuencia nucleotídica que codifica un gen marcador, estando flanqueado dicho casete de transferencia por sitios de recombinación no idénticos correspondientes; y
- (b)
- proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos.
5. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 ó
3, en el que dicho casete de transferencia comprende además un gen
marcador seleccionable.
6. Un método para minimizar o eliminar la
expresión resultante de la integración aleatoria de secuencias de
DNA en el genoma de una célula de planta, que comprende:
- (a)
- introducir en el genoma de la célula de planta una secuencia nucleotídica que comprende un sitio diana que comprende dos sitios de recombinación no idénticos, en donde dicho sitio diana está situado aguas abajo de un promotor fusionado a una secuencia de iniciación de la traducción ATG;
- (b)
- introducir un casete de transferencia que comprende una secuencia nucleotídica de interés flanqueada por sitios de recombinación no idénticos correspondientes, en donde la secuencia de iniciación de la traducción ATG de dicha secuencia nucleotídica de interés se ha reemplazado por uno de los sitios de recombinación no idénticos correspondientes del sitio diana, y de una manera tal que después de la orientación satisfactoria, la secuencia nucleotídica de interés se sitúa en el marco de lectura correcto para formar una fusión traduccional entre la secuencia de iniciación traduccional ATG y la secuencia nucleotídica de interés; y
- (c)
- proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos.
7. Un método para seleccionar directamente
células de planta transformadas que comprende:
- (a)
- introducir en los genomas de célula de planta un casete de transferencia, comprendiendo dichos genomas de célula de planta un sitio diana que comprende un promotor conectado operablemente a una secuencia nucleotídica que comprende un primer sitio de recombinación no idéntico, una secuencia nucleotídica de interés y un segundo sitio de recombinación no idéntico, y comprendiendo dicho casete de transferencia una secuencia nucleotídica que codifica un gen marcador seleccionable no conectado operablemente a un promotor, en donde dicho casete de transferencia está flanqueado por dichos sitios de recombinación no idénticos primero y segundo; y
- (b)
- proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos, y hacer crecer dichas células de planta sobre un agente selectivo apropiado para recuperar células que expresan el marcador seleccionable.
8. Un método de acuerdo con la reivindicación 7,
en el que dicho casete de transferencia comprende al menos una
región de codificación adicional conectada operablemente a un tercer
promotor que conduce la expresión en dicha célula de planta.
9. Un método para reducir la complicidad de
integración de transgenes en un genoma de célula de planta, que
comprende:
- (a)
- introducir en la célula de planta un casete de transferencia flanqueado por sitios de recombinación no idénticos, comprendiendo dicho casete de transferencia una secuencia nucleotídica de interés, comprendiendo dicho genoma de célula de planta un sitio diana que comprende sitios de recombinación no idénticos correspondientes;
- (b)
- proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos; y
- (c)
- seleccionar células de planta con patrones de integración simples en su genoma.
10. Un método para combinar múltiples casetes de
transferencia en una posición en un genoma y una célula de planta,
que comprende:
- (a)
- introducir en el genoma de la célula de planta un primer casete de transferencia que comprende al menos tres sitios de recombinación no idénticos, en donde al menos dos de dichos sitios de recombinación no idénticos, denominados aquí los sitios de reorientación primero y segundo, están en estrecha proximidad entre sí;
- (b)
- introducir en el genoma de la célula de planta un segundo casete de transferencia flanqueado por dos sitios de recombinación no idénticos que corresponden a los primeros sitios de reorientación de dicho primer casete de transferencia; y
- (c)
- proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en el primer sitio de reorientación.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación
10, en el que el segundo casete de transferencia comprende un cuarto
sitio de recombinación no idéntico.
12. Un método de acuerdo con la reivindicación 10
u 11, en el que el segundo casete de transferencia comprende un
marcador seleccionable.
13. Un método para combinar múltiples casetes de
transferencia en una posición en un genoma de una célula de planta,
comprendiendo dicho método:
- (a)
- introducir en la célula de planta un sitio diana que comprende al menos un primer y un segundo sitio de recombinación no idéntico;
- (b)
- introducir en la célula de planta un primer casete de transferencia que comprende en el siguiente orden el primero, un tercero y el segundo sitio de recombinación no idéntico, en donde los sitios de recombinación no idénticos primero y tercero del primer casete de transferencia flanquean una primera secuencia nucleotídica de interés;
- (c)
- proporcionar una primera recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos primero y segundo;
- (d)
- introducir en la célula de planta un segundo casete de transferencia que comprende al menos los sitios de recombinación no idénticos segundo y tercero, en donde los sitios de recombinación no idénticos segundo y tercero del segundo casete de transferencia flanquean una segunda secuencia nucleotídica de interés; y
- (e)
- proporcionar una segunda recombinasa que reconoce y realiza la recombinación en los sitios de recombinación no idénticos segundo y tercero.
14. Un método para retirar una secuencia
nucleotídica de interés introducida en el genoma de una célula de
planta, que comprende:
- (a)
- proporcionar dicha célula de planta, en la que dicha secuencia nucleotídica de interés está flanqueada por sitios de recombinación no idénticos;
- (b)
- introducir en la célula de planta una molécula oligonucleotídica de RNA-DNA quimérica capaz de reconocer y realizar una conversión de nucleótidos en uno de los sitios de recombinación no idénticos del casete de transferencia a fin de crear dos sitios de recombinación idénticos; y
- (c)
- proporcionar una recombinasa que reconoce y realiza la escisión de las secuencias entre los dos sitios de recombinación idénticos.
15. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que al menos uno de dichos
sitios de recombinación no idénticos es un sitio FRT, FRT mutante,
LOX o LOX mutante.
16. Un método de acuerdo con la reivindicación
15, en el que al menos uno de los sitios es un sitio FRT o un sitio
FRT mutante.
17. Un método de acuerdo con la reivindicación
16, en el que dicho sitio FRT mutante es FRT5 (ID SEC Nº 3), FRT 6
(ID SEC Nº 4) o FRT7 ((ID SEC Nº 5).
18. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 3 a 14, en el que proporcionar la
recombinasa comprende transformar genéticamente la planta con un
casete de expresión que contiene una secuencia nucleotídica que
codifica la recombinasa.
19. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 ó 3 a 12, 14 ó 15, en el que la recombinasa
comprende FLP o Cre.
20. Un método de acuerdo con la reivindicación
13, en el que al menos dicha primera o dicha segunda recombinasa
comprende FLP o Cre.
21. Un método de acuerdo con la reivindicación 19
ó 20, en el que la recombinasa se ha sintetizado usando codones
preferidos de maíz.
22. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que la célula de planta es
de una monocotiledónea.
23. Un método de acuerdo con la reivindicación
22, en el que la monocotiledónea es maíz.
24. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 21, en el que la célula de planta es de una
dicotiledónea.
25. Un método de acuerdo con la reivindicación
24, en el que la dicotiledónea es canola, Brassica, soja, girasol o
algodón.
26. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones precedentes, en el que dicha célula de planta
está contenida en una planta.
27. Una célula de planta dicotiledónea o
monocotiledónea que tiene incorporado establemente en su genoma:
- (a)
- un casete de transferencia que comprende una secuencia nucleotídica de interés flanqueada por o que comprende al menos dos sitios de recombinación FRT no idénticos; o
- (b)
- al menos un primer y un segundo casete de transferencia, en donde:
- (i)
- dicho primer casete de transferencia comprende una primera secuencia nucleotídica de interés flanqueada por un primer y un segundo sitio de recombinación, en donde dicho primer y dicho segundo sitios de recombinación son no idénticos;
- (ii)
- dicho segundo casete de transferencia comprende una segunda secuencia nucleotídica de interés flanqueada por el segundo sitio de recombinación y un tercer sitio de recombinación, en donde dicho tercer sitio de recombinación es no idéntico a dicho primer y dicho segundo sitio de recombinación; y
- (iii)
- dicho segundo sitio de recombinación está compartido entre el primer y el segundo casete de transferencia, de modo que el genoma de la célula de planta comprende en el siguiente orden el primer sitio de recombinación, la primera secuencia nucleotídica de interés, el segundo sitio de recombinación, la segunda secuencia nucleotídica de interés y el tercer sitio de recombinación;
o
una célula de planta
monocotiledónea que tiene establemente incorporado en su genoma un
casete de transferencia que comprende una secuencia nucleotídica de
interés flanqueada por o que comprende al menos dos sitios de
recombinación FRT no idénticos o dos sitios de recombinación LOX no
idénticos, en donde dicha célula de planta es de una
monocotiledónea.
28. Una célula de planta dicotiledónea de acuerdo
con la reivindicación 27, célula que es de una planta de canola,
Brassica, soja, girasol o algodón.
29. Una célula de planta monocotiledónea de
acuerdo con la reivindicación 27, célula que es de una planta de
maíz.
30. Una célula de planta de acuerdo con la
reivindicación 27, que tiene establemente incorporado en su genoma
al menos un primer y un segundo casete de transferencia según se
define en la parte (b), en donde al menos uno de dichos sitios de
recombinación no idénticos es un sitio FRT, un sitio FRT mutante, un
sitio LOX o un sitio LOX mutante.
31. Una célula de planta de acuerdo con la
reivindicación 30, en la que al menos uno de dichos sitios FRT
mutantes es FRT5 (ID SEC Nº 3), FRT 6 (ID SEC Nº 4) o FRT7 ((ID SEC
Nº 5).
32. Una planta transformada que comprende una
célula de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 27 a
31.
33. Una semilla transformada de la planta de
acuerdo con la reivindicación 32.
34. Un método de acuerdo con una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 26, que comprende además hacer crecer la
célula hasta una planta.
35. Un método de acuerdo con la reivindicación
34, que comprende además polinizar la planta con polen de una planta
de la misma cepa o una cepa diferente e identificar plantas
resultantes con la característica fenotípica deseada.
36. Un método de acuerdo con la reivindicación 34
ó 35, que comprende hacer crecer dos o más generaciones de
plantas.
37. Un método de acuerdo con la reivindicación 35
ó 36, que comprende además recoger semillas de dichas plantas.
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