DE10049587A1 - Vektorsystem für Pflanzen - Google Patents
Vektorsystem für PflanzenInfo
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Abstract
Diese Erfindung beschreibt Amplifikationsvektoren für Pflanzen, die zusätzliche pflanzenspezifische internal ribosome entry site (IRES)-Elemente enthalten, welche die polycistronische und CAP-unabhängige Translation erlauben von a) heterologen Genen, b) gesamten viralen Genomen und c) viralen subgenomischen RNAs. Die beschriebenen IRES-Elemente sind pflanzenviralen Ursprungs, werden aus anderen Organismen isoliert, oder sie werden mittele Engineering unter Verwendung verschiedener synthetischer Methoden erhalten. Diese IRES-Elemente und diese heterologen Gene werden in Amplifikationsvektoren insertiert und erlauben die Expression der heterologen Gene in Abwesenheit zusätzlicher viraler Promotoren. Insbesondere wird die Expression durch CAP-unabhängige Translation erreicht.
Description
Diese Erfindung betrifft einen Vektor, der zur Amplifikation, zur Expression und/oder
zur Suppression eines Gens in einer Pflanze fähig ist. Die Erfindung beinhaltet die
Verwendung des Vektors sowie dessen Herstellungsmethode und einen Vor-Vektor, der
zur Herstellung des besagten Vektors benötigt wird.
Vektoren, die zur gentechnologischen Veränderung von Pflanzen verwendet werden,
eignen sich ausgezeichnet zur Produktion von Proteinen in Pflanzen, zur Veränderung
von Pflanzeneigenschaften sowie zur Unterdrückung (Suppression) von Genen der
Wirtspflanze. Darüber hinaus ist die Bestimmung von Genfunktionen möglich. Das gilt
insbesondere für Gene, die mit Hilfe der Methoden der Genomforschung (Genomics)
identifiziert wurden.
Vektoren, die zur gentechnologischen Veränderung von Pflanzen verwendet werden
können, sind seit längerem bekannt. Dazu gehören insbesondere virale Vektoren. Diese
müssen die Fähigkeit besitzen, die Wirtspflanze zu infizieren sowie sich in ihr zu
vermehren und auszubreiten. Man unterscheidet zwischen der Bewegung der Viren von
Zelle zu Zelle sowie über weitere Distanzen (long distant movement). Die Viren müssen
zudem mindestens eine Sequenz zur Genexpression oder zur Gensuppression besitzen.
Bereits vorhandene Vektoren basierten auf der Verwendung subgenomischer Promotoren
als Elemente der Transkription. Der Effekt eines subgenomischen Promotors besteht
darin, daß ein Teil von ihm als Startpunkt der Transkription die Generierung kürzerer
RNS-Fragmente bewirkt. Somit wird die Translation eines Gens, das sich abwärts
(downstream) des genomischen Promotors befindet, durch die pflanzliche Tranlations
maschinerie ermöglicht. Die Translation wird ggf. CAP-abhängig fortgesetzt. Diese Art
der multiplen Transkription ist allerdings kinetisch unvorteilhaft, da ein Teil der
Replikaseaktivität (für Produktion zusätzlicher subgenomischer RNSs) verschwendet
wird.
Die genannten Vektoren haben weitere Nachteile. Durch die Einführung eines
subgenomischen, viralen Promotors in eine Vektorsequenz wird diese verlängert. Dies
führt zu einer Verringerung der Effizienz des Systems. Darüber hinaus führt die
Anwesenheit mehrerer identischer oder ähnlicher, subgenomischer Promotoren, die dem
pflanzlichen Transkriptionsysstem angepaßt sind, regelmäßig zu Rekombinations
ereignissen, aufgrund derer es zu Sequenzinstabilität und zum Verlust von Sequenz
bereichen kommen kann. Die Verwendung von Promotoren, die sich in ihrer Sequenz
signifikant unterscheiden, führt zu einer Verringerung der Rekombinationshäufigkeit.
Indes werden solche Promotoren nicht effektiv vom Transkriptionssystem erkannt, was
ebenfalls die Effizienz des Systems verringert. Zudem sind (diese) Vektoren im
allgemeinen hochkomplexe Einheiten, die mehrere unabhängige Funktionselemente
sowie eine hohe Gendichte beinhalten. Aufgrund dessen erwies sich die Verwendung
(dieser) Vektoren bei Benutzung heterologer Gene oder ähnlicher Sequenzen als
unvorteilhaft und führte regelmäßig zu unerwünschten Resultaten. Dies machte sich
sowohl bei der Fähigkeit zur Pflanzeninfektion als auch bei der Effizienz der
Genexpression bemerkbar. Darüber hinaus muß der verfügbare Raum für die Promotoren
üblicherweise "erzwungen" werden, wenn es zu Sequenzüberlappungen mit weiter
aufwärts (upstream) gelegenen Genen kommt.
Aus den genannten Gründen wurde ein Vektor zur gentechnologischen Manipulation von
Pflanzen erzeugt, der seine Funktionen in Wirtspflanzen stabil und effektiv ausüben kann.
Ein weiteres Ziel besteht darin, einen Vektor zur Verfügung zu stellen, der zur hohen
Expression eines Gens in einer Pflanze in der Lage ist.
Entgegen den Erwartungen konnten diese Ziele mit einem Vektor erreicht werden, der
einerseits in der Lage ist, sich in einer Pflanze zu vermehren und andererseits ein Gen
exprimiert, dessen Nukleinsäuresequenz mindestens ein nichtvirales Gen beinhaltet.
Darüber hinaus besitzt der Vektor eine IRES-Sequenz oder kodiert für eine solche, die
zur Translation eines Gens, das abwärts (downstream) von ihr liegt, notwendig ist.
Es wurde kürzlich vorgeschlagen (WO 98/54342), ein Pflanzen-IRES-Element in einem
rekombinanten DNS-Molekül zu verwenden, das (nach Integration in das Wirtsgenom)
ausschließlich die Funktion der Genexpression ausübt. Die Expressionshöhe erwies sich
jedoch als gering. Die genauen Gründe für diese niedrige Expression sind unklar. Auf
jeden Fall ist die Expression auf die Zahl der transformierten Zellen beschränkt. Daraus
folgt eine extrem geringe Expressionseffizienz in der gesamten Pflanze.
Entgegen den Erwartungen konnte gezeigt werden, daß es möglich ist, einen Pflanzen
vektor zu konstruieren, der nach Einführung in eine Pflanzenzelle nicht nur die Fähigkeit
der Genexpression besitzt, sondern auch noch andere Fähigkeiten vereint, die zur
Vermehrung sowie zur Ausbreitung des Virus in der Pflanze benötigt werden. Die
resultierende Gesamteffizienz ist extrem hoch. Die Funktionen beinhalten den Infektions
grad des Virus und die Bewegung von einer Zelle zu einer anderen oder über eine größere
Entfernung (long distance movement). Es ist erstaunlich, daß die große Komplexität der
funktionalen und strukturellen Elemente des Vektors dessen Genexpression nicht
beeinflußt.
Das IRES-Element des genannten Vektors kann aufwärts (upstream) des erwähnten
nichtviralen Gens liegen, um dessen Translation direkt zu beeinflussen. Alternativ kann
dieses IRES-Element indirekt die Translation des Gens unterstützen. Dies könnte durch
die Stimulation der Translation einer Gruppe anderer Gene erfolgen, die für die
Expression des erstgenannten Gens wichtig sind. Es könnte sich dabei um Gene handeln,
die den Funktionen Infektionsgrad, Vermehrung oder Fortbewegung von Zelle zu Zelle
oder über eine große Distanz (long distance movement) zuzuordnen sind.
Ein weiteres Ziel besteht darin, einen Vektor herzustellen, der in der Lage ist, ein Gen in
einer Pflanze effektiv zu inaktivieren (supprimieren). Dies kann durch die Verwendung
einer Nukleinsäuresequenz erreicht werden, die mindestens eine IRES-Sequenz besitzt
bzw. für eine solche kodiert und in einem Vektor kloniert ist, in dem sie für die
Translation eines Gens, welches für die Vermehrung des Vektors benötigt wird,
verantwortlich ist. Besagter Vektor besitzt darüber hinaus mindestens einen Teil einer
Sequenz des Pflanzengenoms in Gegensinn(antisense)-Orientierung, um ein Gen der
Wirtspflanze zu inaktivieren (supprimieren).
Weitere, bevorzugte Eigenschaften sind in den Unteranträgen/Ansprüchen definiert.
An dieser Stelle werden erstmals Vektoren beschrieben, die auf IRES-Elementen
beruhen, welche in Pflanzen aktiv sind. Bereits vorhandene IRES-Sequenzen, die aus
tierischen Viren isoliert wurden, unterstützen die Translation in Pflanzenzellen nicht. Das
Wissen, das über tierische Expressionssysteme angesammelt wurde, kann somit nicht auf
Pflanzen übertragen werden. Tierische IRES-Sequenzen wurden nie auf funktionale
Eigenschaften, wie verbliebene/überschüssige Promotoraktivität, getestet. Diese Erfindung
beinhaltet somit die ersten klaren Beispiele für die Genexpression in Pflanzen, die
ausschließlich auf der Translation beruhen. Die Expression ist somit nicht von der
Transkription, ausgehend von einem subgenomischen Promotor, welcher für die Ex
pression eines abwärts (downstream) gelegenen Gens nötig ist, abhängig.
Die in dieser Erfindung beschriebenen Vektoren erlauben in Pflanzen bevorzugt die
Regulation und die Expression eines Gens von Interesse, wobei die CAP-abhängige
Translation unterdrückt wird. In einem anderen Ansatz werden sehr kurze oder künstliche
IRES-Sequenzen verwendet, um die Stabilität der resultierenden Vektoren zu erhöhen.
Ein deutlicher Vorteil des Systems besteht darin, daß die IRES-Sequenzen aufwärts
(upstream) oder abwärts (downstream) von einem viralen Gen bzw. von viralen Genen
(z. B. des Gens für das Hüllprotein des Tabakmosaikvirus) inseriert werden können.
Daher kann ggf. sowohl die Translation eines abwärts (downstream) gelegenen Fremd
gens (oder mehrerer Fremdgene) als auch die Translation eines viralen Gens (oder
mehrerer viraler Fremdgene) über einen Reaktionsweg verlaufen, der durch einen CAP-
unabhängigen Eintritt der Ribosomen eingeleitet wird. Daher wird die besagte CAP-
unabhängige Translation eines Fremdgens (oder von Fremdgenen) von bicistronischen
und/oder polycistronischen RNSs ausgehen.
Im Anschluß an die Infektion einer Pflanze mit einem Virus kommt es zunächst zu den
frühen Stadien der viralen Infektion. Es handelt sich dabei um den Eintritt des Virus in
die Zelle und die Enthüllung des Genoms. Anschließend muß der Virus Aktivitäten
entwickeln, die ihn zur Expression des Genoms sowie zur Replikation befähigen. Das
virale Genom besteht entweder aus einem (monopartite) oder mehreren (multipartite)
RNS- bzw. DNS-Segment(en). Jedes dieser Segmente kann unter bestimmten Voraus
setzungen zur Replikation in der infizierten Zelle fähig sein. Ein virales Replikon wurde
als "Polynucleotid einer viralen Sequenz, die in Wirtszellen während des viralen
Replikationszyklus repliziert wird" definiert (Huisman et al., 1992, "Genetic engineering
with Plant viruses", T. M. A. Wilson und J. W. Davies Hrsg., 1992, CRC Press, Inc.). Im
Rahmen dieser Erfindung verwenden wir den Terminus "auf Vermehrung basierendes
Expressionssystem" (amplification based expression system), um entweder ein voll
ständig vorliegendes, virales Genom oder ein beliebiges Fragment der viralen RNS oder
DNS zu bezeichnen, das folgende Eigenschaften besitzt: zum einen muß es Fremd
sequenzen besitzen, die für den parentalen Wildtyp-Virus nicht-nativ sind und die
exprimiert werden. Zum anderen muß es in der Lage sein, sich eigenständig oder über
eine Komplementation mit einem Helfervirus bzw. einem Produkt der transgenen
Wirtspflanze zu replizieren. Die Termini "auf Vermehrung basierendes Expressions
system" (amplification-based-expression-system) und "rekombinanter, viraler Vektor"
ähneln sich sehr. Diese Systeme repräsentieren rekombinante Nukleinsäuren, die
zusätzliche Sequenzen enthalten. Diese können im Verhältnis zum Wirtsgenom homolog
(nativ) bzw. heterolog (fremd, nicht nativ) sein. Die Bezeichnung "nicht nativ" bedeutet,
daß diese Nukleinsäure nicht natürlicherweise im Genom des Wildtypvirus vorhanden ist,
sondern von einem andern Virus abstammt. Alternativ kann es sich um eine synthetisch
hergestellte Nukleinsäure handeln. Ein solches, auf Vermehrung beruhendes System, das
von viralen Elementen abstammt, ist zur Replikation fähig. In vielen Fällen ist es zudem
in der Lage, sich in normalen und/oder gentechnologisch modifizierten Pflanzen von
einer Zelle zu einer anderen oder über eine größere Distanz (long distance movement) zu
bewegen. In letzterem Fall sollte die transgene Pflanze funktionsdefiziente Komponenten
des Vektors komplementieren. Das Produkt bzw. die Produkte eines Transgens, das bzw.
die zur Vektorreplikation und/oder der Expression von Vektorgenen oder zum Transport
über größere Distanzen nötig ist bzw. sind, sollte somit von der transgenen Pflanze zur
Verfügung gestellt werden.
Pflanzenviren, die auf Vermehrung beruhen und deren Grundlage ein einfaches Genom
(monopartite, z. B. das des Tabakmosaikvirus, TMV) oder ein doppeltes Genom
(bipartite, z. B. das von Mitgliedern der Bromoviridae-Familie) ist, zeigten die Expression
von Fremdgenen in Wirtspflanzen (Zusammenfassung in "Genetic engineering in plant
viruses" T. M. A. Wilson and J. W. Davies Hrsg., 1992, CRC Press, Inc.).
Die Genome der meisten (ca. 80%) der bekannten Pflanzenviren bestehen aus plus-
sense-einzelsträngiger RNS (ssRNS). Diese ist infektiös, wenn sie aus den Virionen in
Form von freier RNS isoliert wird. Daraus folgt, daß als erster Schritt des viralen
Replikationskreislaufes die genomische RNS translatiert werden muß, um die virus
spezifische, RNS-abhängige RNS-Polymerase (Replikase) zu erzeugen. Sie ist nicht in
uninfizierten Pflanzenzellen vorhanden und daher für die virale Replikation unentbehrlich
(Zusammenfassung in: Y. Okada, 1999, Philosoph. Transact. of Royal Soc., B, 354, 569 -
582). Es sollte erwähnt werden, daß sich die plus-sense-ssRNS-Viren in den von ihnen
verwendeten Translationsstrategien zur Expression des Genoms unterscheiden: Die
Genome der sogenannten Picorna-ähnlichen Viren stellen ein einzelnes, durchlaufendes,
offenes Leseraster (ORF) dar, das von den Ribosomen in ein großes Polyprotein
translatiert wird. Dieses wird proteolytisch in aktive Virus-kodierte Proteine prozessiert.
Die virusspezifischen Protease(n) sind an der Polyprotein-Prozessierung beteiligt. Eine
zweite, besondere Eigenschaft der Picorna-ähnlichen Viren besteht darin, daß deren
genomische RNS anstatt einer Schutzgruppe (CAP-Strukur) ein kleines, virales Protein
enthält, das kovalent an das 5'-Ende des Genoms gebunden ist.
In dieser Erfindung konzentrieren wir uns hauptsächlich auf Viren, die der sogenannten
Sindbis-ähnlichen Superfamilie zuzuordnen sind. Diese beinhaltet viele Pflanzenviren,
insbesondere mehr als ein Dutzend Viren, die zum Genus der Tobamoviren gehören
(Zusammenfassung in A. Gibbs, 1999, Philosoph. Transact. of Royal Soc., B, 354, 593 -
602). Die Technologie ermöglicht die Expression von Fremdgenen, die von der CAP-
Struktur und von dem viralen Promotor unabhängig ist. Das Genom der Tobamoviren
(TMV U1 ist ein typischer Vertreter dieser Gruppe) beinhaltet vier große, offene
Leseraster (ORFs). Die beiden Komponenten der Replikase - das 130-kDa-Protein sowie
das durch Durchlesen (readthrough) entstehende 183-kDa-Protein - werden von der 5'-
angrenzenden Region der genomischen RNS kodiert. Sie werden direkt von der
genomischen RNS translatiert. Die fünfzehn 3'-endständigen Nukleotide des 180-kDa-
Proteins von TMV U1 überlappen mit dem offenen Leseraster des 30-kDa-Proteins, das
für die Ausbreitung der TMV-Infektion von einer Zelle zu einer anderen verantwortlich
ist (movement protein, MP). Im TMV-U1-Virus endet dieses Gen zwei Nukleotide vor
dem Initiationskodon des letzten Gens, welches für das 17-kDa-Hüllprotein (coat protein,
CP) kodiert. Diese Region ist aufwärts (upstream) der (bei TMV U1) 204 Nukleotid
großen, 3'-endständigen, nichttranslatierten Region (3'-NTR) gelegen. Die Translation der
RNS des Tobamovirus erfolgt durch einen ribosomalen Absuchungsmechanismus, der für
die Mehrzahl der eukaryotischen mRNSs zutrifft (zusammengefaßt in Kozak, 1989, J.
Mol. Biol. 108, 229 - 241; Pain, 1996, Merrick und Hershey, 1996, in "Translational
control", Hrsg. Hershey, Matthews and Sonenberg, Cold Spring Habour Press, S. 31 - 69,
Sachs und Varanini, 2000, Nature Structural Biology 7, 356 - 360). In Übereinstimmung
mit diesem Mechanismus ist die strukturell polycistronische Tobamovirus-RNS
funktional monocistronisch, d. h. lediglich das 5'-gelegene, offene Leseraster, das die
Replikationsproteine (130-kDa-Protein und Produkt des Durchlesemechanismus) kodiert,
kann von der vollständigen (fullength) genomischen RNS translatiert werden
(zusammengefaßt in Palukaitis und Zaitlin, 1986, in "The Plant Viruses", von
Regermortel und Fraenkel-Conrat Hrsg., Vol. 2, S. 105 - 131, Plenum Press, NY). Es sollte
betont werden, daß der 68 Nukleotid große, 5'-terminale, nichttranslatierte Bereich
(leader sequence) von TMV U1, der als Omega(Ω)-Leader bezeichnet wird, die Rolle
eines effizienten Translationsverstärkers besitzt, indem er die Translation des 5' proximal
liegenden, offenen Leserasters stimuliert. Die 5' distal liegenden Gene für MP und CP
sind in der Vollängen-TMV U1 RNS translational inaktiviert. Sie werden von separaten
mRNSs, die als subgenomische RNS (sgRNS) bezeichnet werden, translatiert. Offenbar
werden die subgenomische RNSs von in negativer Orientierung vorliegender,
genomischer RNS transkribiert und besitzen übereinstimmende 3'-Enden. Die
Expression der TMV-Gene, die von sgRNSs translatiert werden, ist sowohl zeitlich als
auch quantitativ voneinander unabhängig reguliert: das MP wird durchgehend während
der frühen Schritte der Infektion exprimiert und akkumuliert zu einer relativ geringen
Proteinmenge, deren Gesamtanteil bei etwa 1% des gesamten Pflanzenproteins liegt. Im
Gegensatz dazu beträgt der Anteil der Synthese des Hüllproteins bis zu 70% der
gesamten, pflanzlichen Proteinsynthese. Der Anteil des Hüllproteins an der Gesamt
proteinmenge in der Pflanze kann bis zu 10% betragen (Fraser, 1987, in: Biochemistry of
virus-infected plants", S. 1-7, Research studies Press Ltd., Letchworth, England). Es ist
offensichtlich, daß die Erzeugung jeder sgRNS von verschiedenen, in cis wirkenden
Elementen kontrolliert wird. Diese werden als "subgenomische mRNS-Promotoren"
(sgPR) bezeichnet. Im allgemeinen bezeichnet dieser Terminus die Region des viralen
Genoms (vermutlich innerhalb einer Minus-Sinn-RNS-Kopie), das von dem Replikase-
Komplex erkannt wird, um die Transkription von einem intern lokalisierten sgPR zu
initiieren. Damit kommt es zur Erzeugung der sgRNS. Zur Vereinfachung bezeichnen wir
gewöhnlich mit dem Terminus "subgenomischer Promotor" eine Nukleotidsequenz einer
plus sense, viralen RNS, die in der Regel aufwärts (upstream) der kodierenden Sequenz
und des Startpunktes der sgRNS liegt und die bei der Initiation der sgRNS-Synthese eine
funktionelle Rolle spielt. Es sollte allerdings in Betracht gezogen werden, daß einige,
virale sgPRs nicht ausschließlich aufwärts (upstream) von dem kontrollierten, viralen
Gen liegen, sondern sogar mit diesen Genen überlappen können (Balmori et al., 1993,
Biochimie (Paris) 75, 517 - 521).
Jeder subgenomische Promotor besetzt eine unterschiedliche Position im TMV-Genom.
Keiner der subgenomischen Promotoren des TMV konnte bisher exakt kartiert werden.
Es konnte aber gezeigt werden, daß die 250 Nukleotid große Region aufwärts (upstream)
des CP-Gens die Synthese der CP-sgRNS unterstützen kann (Dawson et al., 1989,
Virology 172, 285 - 292).
Lehto et al. inserierten 253 und 49 Nukleotide lange Sequenzen in das TMV-Genom (vor
das MP-Gen; 1990, Virology 174, 145-157), die dem CP vorausgingen. Das Ziel war, die
Größe der subgenomischen Promotoren (sgPR) abzuschätzen. Die Insertion zerstörte
zwar nicht den ursprünglichen, subgenomischen Promotor des MP-Gens, sondern
entfernte ihn von dem offenen Leseraster des MP-Gens. Dieser mutierte Virus (genannt
KK6), der eine 253 Nukleotid große Insertion in der Promotorregion besitzt, repliziert
stabil und bewegt sich systemisch über die infizierte Pflanze. Es entspricht den
Erwartungen, daß die in der Mutante KK6 vorliegende Insertion die Länge der
subgenomischen Leader-Sequenz des MP ändert (Lehto et al., Virology 174, 145 - 157. s.
Abb. 9). Die subgenomische RNS der KK6-MP-Leader-RNS hat eine Größe von
24 Nukleotiden. Verglichen dazu beträgt die Größe der subgenomischen RNS des Hüll
proteins lediglich 9 Nukleotide. Im Gegensatz dazu repliziert die Mutante mit einem
eingefügten, 49 Nukleotid großen Fragment in der Promotorregion nur kurzzeitig. Nach
dieser Phase überwiegen die Nachkommen von Wildtyp-Viren, die die Insertion deletiert
haben. Zusätzlich konnte gezeigt werden (Meshi et al., 1987, EMBO 6, 2557 - 2563), daß
die Produktion der subgenomischen Hüllprotein-RNS dann reduziert wurde, wenn eine
96 Nukleotid große Region verwendet wurde, die von der Hüllprotein-RNS abstammte.
Es wurde daraus geschlossen, daß die 49 bis 96 Nukleotid großen Sequenzen, die sich
aufwärts (upstream) des Gens für das Hüllprotein befinden, nicht die gesamte Region des
subgenomischen Promotors des TMV-U1-Hüllproteingens beinhalten. Die 250 bp große
Nukleotid-Sequenz beinhaltet hingegen den kompletten, subgenomischen Promotor.
Es liegen nur wenig Informationen über die Struktur und Lage des subgenomischen
Promotors vor, der die Expression des MP des TMV kontrolliert. Weil die mutmaßliche
Sequenz des subgenomischen Promotors des MP mit der Sequenz des 183-kDa-Replikase-
Proteins überlappt, gestaltet sich die Analyse der Region mittels Mutationen als
kompliziert. Vorläufige Ergebnisse, die von W. Dawson und Mitarbeitern kürzlich
erbracht wurden, skizzieren die Grenzen des minimalen und kompletten, subgenomischen
Promotors des MP von TMV U1 (Grdzelishvili et al. 2000, Virology 276, im Druck).
Durch computerunterstützte Strukturanalysen der Region, die sich aufwärts (upstream)
des MP-Gens befindet, konnten zwei stem-loop-Strukturen identifiziert werden, die 5'
proximal zur 75-Nukleotid-Region des MP-Gens liegen und dem AUG-Codon des MP-
Gens vorausgehen.
Es wird angenommen, daß die subgenomische RNS des MP im Gegensatz zur
genomischen RNS und subgenomischen RNS des Hüllproteins (der sogenannten
I2sgRNS) nicht geschützt ist (uncapped, zusammengefaßt in: Okada, 1999, Philosoph.
Transact. Of Royal Soc., 354, 569 - 582). Die vorliegende Erfindung unterstützt diese
Ergebnisse. Demnach ist die I2sgRNS sowohl in TMV U1 als auch in crTMV
ungeschützt (uncapped, Abb. 7).
Von W. Dawson und Mitarbeitern konnte gezeigt werden, daß ein wichtiger Faktor, der
die Expression eines Fremdgens in einem viralen Vektor beeinflußt, dessen relative
Position zum 3'-Terminus des viralen Genoms ist: Die Effizienz der Expression steigt mit
zunehmender Nähe des Fremdgens zum 3'-Terminus dramatisch an (Culver et al., 1993,
Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90, 2055 - 2059). Das am stärksten exprimierte Gen ist das
Hüllprotein, das sich benachbart zur 3'-nichttranslatierten Region befindet. Diese besteht
(in der TMV U1 RNS) aus drei Pseudoknoten, auf die eine tRNS-ähnliche Struktur folgt.
Es wurde vorgeschlagen (Shivprasad et al., 1999, Virology 355, 312 - 323), daß die Nähe
eines Gens zu den Pseudoknoten die Expression eines Fremdgens eher anhebt, als dessen
Nähe zum 3'-Terminus des Genoms. Viele wichtige Aspekte der Struktur des sub
genomischen Promotors des TMV wurden durch die Arbeit von W. Dawson und seiner
Arbeitsgruppe geklärt. Die allgemeine Schlußfolgerung dieser Autoren lautete, daß sich
die Forschung auf diesem Gebiet immer noch auf dem "empirischen Stand der Vektor-
Herstellung" befindet (Shivprasad et al., 1999, Virology 335, 312 - 323).
Die bisherigen Ausführungen machen deutlich, daß die Synthese der subgenomischen
RNS essentiell für die Synthese der 5'-endständigen Gene des TMV-Genoms ist. Diese
Gene sind in Voll-Länge-RNS stillgelegt. Der Mechanismus der unabhängigen Ex
pression eines Gens durch "Subgenomisierung" kann als eine Strategie des TMV
angesehen werden, die Unfähigkeit eukaryotischer Ribsomen zur Translationsinitiation
von 5'-endständigen Genen von polycistronischer, eukaryotischer mRNS zu überwinden.
Nach dem traditionellen "Ribosomen-Scanning-Modell" (Kozak, 1999, Gene 234, 187 -
208) sind die internen Gene von polycistronischer, eukaryotischer mRNS für Ribosomen
nicht zugänglich.
Kürzlich gelang es uns, aus Oleracia officinalis einen Tobamovirus zu isolieren, der in
der Lage ist, Kreuzblüter zu infizieren (crucifer infecting tobamovirus, crTMV). Ein
hervorstechendes Merkmal von crTMV ist seine Fähigkeit, Mitglieder der Familie der
Brassicaceae systemisch zu infizieren. Zusätzlich ist der Virus in der Lage, Pflanzen der
Solanaceae-Familie und andere Pflanzen, die mit TMV U1-infizierbar sind, systemisch
zu infizieren. Das Genom von crTMV (6312 Nukleotide) wurde sequenziert (Dorokhov
et al., 1994, FEBS-Letters 350, 5 - 8). Es konnte gezeigt werde, daß es vier traditionelle,
durch offene Leseraster kodierte Gene beinhaltet. Es handelt sich dabei um ein 122-kDa-
Protein (ORF1), ein 178-kDa-Protein (ORF2), das Durchlese-(readthrough)-Produkt des
122-kDa-Proteins, ein 30-kDa-MP (ORF3) sowie ein 17-kDa-Hüllprotein (ORF4). Eine
einheitlich strukturelle Eigenschaft der crTMV-RNS ist, daß - anders als bei anderen
Tobamoviren - die kodierenden Regionen des MP und des Hüllproteins eine Überlappung
von 75 Nukleotiden ausweisen, d. h. der 5'-endständige Teil des Hüllproteins kodiert
gleichzeitig den C-terminalen Teil des MP.
Um ein klares und stimmiges Verständnis der Aufzählungen und Anträge einschließlich
der Abbildungen zu gewährleisten, werden die folgenden Definitionen gegeben:
Benachbart: Eine Position in einer Nukleinsäuresequenz unmittelbar 5' oder 3' einer definierten Sequenz gelegen.
Amplifikationsvektor: Ein Typ von Genvektor, der, nach Einführung in eine Wirtszelle, zur Replikation in dieser Wirtszelle fähig ist.
Gegensinn-Mechanismus: Eine Art der Genregulation, die darauf basiert, daß die Rate der Translation der mRNS zum Protein durch die Anwesenheit einer RNS in der Zelle kontrolliert wird, die zumindest in Teilen komplementär zur translatierten RNS ist.
Chimäre Sequenzen oder Gene: Eine Nukleotidsequenz, die aus mindestens zwei heterologen Bereichen gebildet wurde. Die Sequenz kann DNS oder RNS beinhalten.
Kodierende Sequenz: Eine Desoxyribonukleotidsequenz die, wenn sie transkribiert und translatiert wird, zur Bildung eines zellulären Polypeptids führt oder eine Ribo nukleotidsequenz die, wenn sie transkribiert wird, zur Bildung eines zellulären Polypeptids führt.
Kompatibilität: Die Fähigkeit, mit anderen Komponenten eines Systems zu funktionieren. Ein Vektor oder die Nukleinsäure eines Pflanzenvektors, der kompatibel mit einem Wirt ist, kann sich in diesem Wirt replizieren. Ein Hüllprotein, das kompatibel mit einer viralen Nukleinsäure ist, ist in der Lage, diese Nukleinsäure einzukapseln.
Gen: Eine abgegrenzte Nukleinsäuresequenz, die für ein bestimmtes, zelluläres Produkt verantwortlich ist.
Ein Gen, das exprimiert werden soll: Ein Gen, deren Expression von technologischem Interesse ist.
Wirt: Eine Zelle, ein Gewebe oder ein Organismus, in dem sich ein Vektor oder Pflanzenvirus replizieren kann. Ein Wirt ist in der Lage, von einem Virus, der einen viralen Vektor oder Sequenzen von Pflanzenvektoren besitzt, infiziert zu werden. Der Terminus soll prokaryotische und eukaryotische Zellen, Organe, Gewebe oder Organismen einschließen.
Wirtspflanzengenom: Mit diesem Begriff wird v. a. das Kerngenom einer Wirtspflanze bezeichnet. Er beinhaltet aber daneben ggf. auch mitochondriale und Chloroplasten-DNS.
Infektion: Die Fähigkeit eines Virus oder eines auf Vermehrung basierenden Virus, seine Nukleinsäuren in einen Wirt zu übertragen oder, seine Nukleinsäuren in einen Wirt zu übertragen, indem die virale Nukleinsäure oder ein Vektor repliziert wird, virale Proteine synthetisiert werden und neue Viruspartikel zusammengesetzt werden. In diesem Zusammenhang werden die Begriffe "übertragbar" und "infektiös" gleichwertig verwendet.
Interne, ribosomale Eintrittsstellen (IRES, Internal Ribosomal Entry Sites) oder IRES: Eine Nukleotidsequenz viralen, zellulären oder synthetischen Ursprungs, die auf der Ebene der Translation für die interne Initiation verantwortlich ist.
IRES-Elemente, die für die Translation eines abwärts (downstream) gelegenen Gens verantwortlich sind: IRES-Elemente, die in dem Sinne für die Translation eines obigen Gens wirksam sind, daß ohne sie keine Expression des Gens auftritt, die in techno logischem Sinne interessant ist.
Nichtvirales Gen: Ein Gen, das im Lebenszyklus eines Virus keine Rolle spielt.
Phänotypisches Merkmal: Eine zu beobachtende Eigenschaft, die durch die Expression eines Gens hervorgerufen wird.
Pflanzenzelle: Die strukturelle und physiologische Einheit einer Pflanze, bestehend aus dem Protoplasten und der Zellwand.
Pflanzenorgan: Ein abgegrenzter und sichtbar zu differenzierender Teil einer Pflanze, wie z. B. Wurzel, Sproß, Blatt oder Embryo.
Pflanzengewebe: Jedes Gewebe einer Pflanze im Pflanzenkörper oder in Gewebekultur. Mit diesem Terminus soll die gesamte Pflanze, die Pflanzenzelle, Pflanzenorgane, Protoplasten, Zellkulturen oder jede andere Gruppe von Pflanzenzellen bezeichnet werden, die in einer strukturellen oder funktionellen Einheit organisiert sind.
Produktionszelle: Eine Zelle eines Gewebes oder eines Organs, die in der Lage ist, einen Vektor oder einen viralen Vektor zu replizieren, aber die nicht notwendigerweise ein Wirt des Virus ist. Mit diesem Begriff sollen prokaryotische und eukaryotische Zellen, Gewebe oder Organe, wie Bakterien, Hefe, Pilze und Pflanzengewebe eingeschlossen werden.
Promotor: Der 5'-nichtkodierende Bereich der aufwärts (upstream) einer kodierenden Sequenz gelegen und funktionell mit dieser verbunden ist. Sie ist an der Initiation der Transkription der kodierenden Sequenz beteiligt.
Protoplast: Eine isolierte Pflanzenzelle ohne Zellwand. Sie besitzt die Fähigkeit, sich in Gewebekultur oder in einer ganzen Pflanze fortzupflanzen.
Rekombinante Pflanzenvirus-Nukleinsäure: Die Nukleinsäure eines Pflanzenvirus, die durch die Einführung von nichtviralen Nukleinsäuresequenzen modifiziert wurde.
Rekombinanter Pflanzenvirus: Ein Pflanzenvirus, der die rekombinante Pflanzenvirus- Nukleinsäure trägt.
Reportergen: Ein Gen, dessen Produkt einfach nachgewiesen werden kann.
Subgenomischer Promotor (sgPR): Ein Promotor einer subgenomischen mRNS eines Vektors oder einer Nukleinsäure.
Aussagekräftige Nukleinsäurehomologie: Bezeichnet Nukleotid-Sequenzen, die so homolog sind, daß auf eine funktionelle Übereinstimmung geschlossen werden kann. Unterschiede in den Nukleinsäuresequenzen von Sequenzen, die signifikante Homologie aufweisen, sind bezüglich der Funktion der Genprodukte oder der von einer solchen Sequenz kodierten RNS unbedeutend.
Transkription: Produktion eines RNS-Moleküls durch die RNS-Polymerase als komplementäre Kopie einer DNS-Sequenz.
Translation: Erzeugung eines Polypeptids durch ein Ribosom (häufig im Sinne des Abtastens (scanning) einer RNS gemeint).
Vektor: Eine selbstreplizierende (sich selbst vermehrende) Nukleinsäure, die in der Lage ist, eine Wirtszelle genetisch zu modifizieren. Der Vektor kann einzelsträngig (ss) (+), ss (-) oder doppelsträngig (ds) sein.
Virus: Eine infektiöse Substanz, die aus einer Nukleinsäure besteht, welche in ein Protein eingehüllt ist. Ein Virus kann ein-, zwei-, drei- oder mehrteilig sein.
Benachbart: Eine Position in einer Nukleinsäuresequenz unmittelbar 5' oder 3' einer definierten Sequenz gelegen.
Amplifikationsvektor: Ein Typ von Genvektor, der, nach Einführung in eine Wirtszelle, zur Replikation in dieser Wirtszelle fähig ist.
Gegensinn-Mechanismus: Eine Art der Genregulation, die darauf basiert, daß die Rate der Translation der mRNS zum Protein durch die Anwesenheit einer RNS in der Zelle kontrolliert wird, die zumindest in Teilen komplementär zur translatierten RNS ist.
Chimäre Sequenzen oder Gene: Eine Nukleotidsequenz, die aus mindestens zwei heterologen Bereichen gebildet wurde. Die Sequenz kann DNS oder RNS beinhalten.
Kodierende Sequenz: Eine Desoxyribonukleotidsequenz die, wenn sie transkribiert und translatiert wird, zur Bildung eines zellulären Polypeptids führt oder eine Ribo nukleotidsequenz die, wenn sie transkribiert wird, zur Bildung eines zellulären Polypeptids führt.
Kompatibilität: Die Fähigkeit, mit anderen Komponenten eines Systems zu funktionieren. Ein Vektor oder die Nukleinsäure eines Pflanzenvektors, der kompatibel mit einem Wirt ist, kann sich in diesem Wirt replizieren. Ein Hüllprotein, das kompatibel mit einer viralen Nukleinsäure ist, ist in der Lage, diese Nukleinsäure einzukapseln.
Gen: Eine abgegrenzte Nukleinsäuresequenz, die für ein bestimmtes, zelluläres Produkt verantwortlich ist.
Ein Gen, das exprimiert werden soll: Ein Gen, deren Expression von technologischem Interesse ist.
Wirt: Eine Zelle, ein Gewebe oder ein Organismus, in dem sich ein Vektor oder Pflanzenvirus replizieren kann. Ein Wirt ist in der Lage, von einem Virus, der einen viralen Vektor oder Sequenzen von Pflanzenvektoren besitzt, infiziert zu werden. Der Terminus soll prokaryotische und eukaryotische Zellen, Organe, Gewebe oder Organismen einschließen.
Wirtspflanzengenom: Mit diesem Begriff wird v. a. das Kerngenom einer Wirtspflanze bezeichnet. Er beinhaltet aber daneben ggf. auch mitochondriale und Chloroplasten-DNS.
Infektion: Die Fähigkeit eines Virus oder eines auf Vermehrung basierenden Virus, seine Nukleinsäuren in einen Wirt zu übertragen oder, seine Nukleinsäuren in einen Wirt zu übertragen, indem die virale Nukleinsäure oder ein Vektor repliziert wird, virale Proteine synthetisiert werden und neue Viruspartikel zusammengesetzt werden. In diesem Zusammenhang werden die Begriffe "übertragbar" und "infektiös" gleichwertig verwendet.
Interne, ribosomale Eintrittsstellen (IRES, Internal Ribosomal Entry Sites) oder IRES: Eine Nukleotidsequenz viralen, zellulären oder synthetischen Ursprungs, die auf der Ebene der Translation für die interne Initiation verantwortlich ist.
IRES-Elemente, die für die Translation eines abwärts (downstream) gelegenen Gens verantwortlich sind: IRES-Elemente, die in dem Sinne für die Translation eines obigen Gens wirksam sind, daß ohne sie keine Expression des Gens auftritt, die in techno logischem Sinne interessant ist.
Nichtvirales Gen: Ein Gen, das im Lebenszyklus eines Virus keine Rolle spielt.
Phänotypisches Merkmal: Eine zu beobachtende Eigenschaft, die durch die Expression eines Gens hervorgerufen wird.
Pflanzenzelle: Die strukturelle und physiologische Einheit einer Pflanze, bestehend aus dem Protoplasten und der Zellwand.
Pflanzenorgan: Ein abgegrenzter und sichtbar zu differenzierender Teil einer Pflanze, wie z. B. Wurzel, Sproß, Blatt oder Embryo.
Pflanzengewebe: Jedes Gewebe einer Pflanze im Pflanzenkörper oder in Gewebekultur. Mit diesem Terminus soll die gesamte Pflanze, die Pflanzenzelle, Pflanzenorgane, Protoplasten, Zellkulturen oder jede andere Gruppe von Pflanzenzellen bezeichnet werden, die in einer strukturellen oder funktionellen Einheit organisiert sind.
Produktionszelle: Eine Zelle eines Gewebes oder eines Organs, die in der Lage ist, einen Vektor oder einen viralen Vektor zu replizieren, aber die nicht notwendigerweise ein Wirt des Virus ist. Mit diesem Begriff sollen prokaryotische und eukaryotische Zellen, Gewebe oder Organe, wie Bakterien, Hefe, Pilze und Pflanzengewebe eingeschlossen werden.
Promotor: Der 5'-nichtkodierende Bereich der aufwärts (upstream) einer kodierenden Sequenz gelegen und funktionell mit dieser verbunden ist. Sie ist an der Initiation der Transkription der kodierenden Sequenz beteiligt.
Protoplast: Eine isolierte Pflanzenzelle ohne Zellwand. Sie besitzt die Fähigkeit, sich in Gewebekultur oder in einer ganzen Pflanze fortzupflanzen.
Rekombinante Pflanzenvirus-Nukleinsäure: Die Nukleinsäure eines Pflanzenvirus, die durch die Einführung von nichtviralen Nukleinsäuresequenzen modifiziert wurde.
Rekombinanter Pflanzenvirus: Ein Pflanzenvirus, der die rekombinante Pflanzenvirus- Nukleinsäure trägt.
Reportergen: Ein Gen, dessen Produkt einfach nachgewiesen werden kann.
Subgenomischer Promotor (sgPR): Ein Promotor einer subgenomischen mRNS eines Vektors oder einer Nukleinsäure.
Aussagekräftige Nukleinsäurehomologie: Bezeichnet Nukleotid-Sequenzen, die so homolog sind, daß auf eine funktionelle Übereinstimmung geschlossen werden kann. Unterschiede in den Nukleinsäuresequenzen von Sequenzen, die signifikante Homologie aufweisen, sind bezüglich der Funktion der Genprodukte oder der von einer solchen Sequenz kodierten RNS unbedeutend.
Transkription: Produktion eines RNS-Moleküls durch die RNS-Polymerase als komplementäre Kopie einer DNS-Sequenz.
Translation: Erzeugung eines Polypeptids durch ein Ribosom (häufig im Sinne des Abtastens (scanning) einer RNS gemeint).
Vektor: Eine selbstreplizierende (sich selbst vermehrende) Nukleinsäure, die in der Lage ist, eine Wirtszelle genetisch zu modifizieren. Der Vektor kann einzelsträngig (ss) (+), ss (-) oder doppelsträngig (ds) sein.
Virus: Eine infektiöse Substanz, die aus einer Nukleinsäure besteht, welche in ein Protein eingehüllt ist. Ein Virus kann ein-, zwei-, drei- oder mehrteilig sein.
Diese Erfindung liefert eine neue Strategie zur Herstellung eines auf Vermehrung
basierenden Vektors zur Expression von Fremdgenen (heterolog, nicht nativ). Die
Translation dieser Gene kann über einen durch eine IRES-Sequenz vermittelten
Mechanismus des internen Ribosomeneintritts vermittelt werden. Dies erfolgt entweder
von einer polycistronischen RNS oder/und von bi- und multicistronischer sgRNS, die von
dem Vektor in der infizierten Zelle erzeugt, werden. In jedem Fall ist die IRES-Sequenz
zur Translation eines Gens nötig. Ein Vorteil dieses Systems ist, daß es keine
spezifischen Manipulationen der sgRNS erfordert: Die einzige Sequenz, die in den
Vektor eingefügt werden sollte, ist die IRES-Sequenz bzw. sind die IRES-Sequenzen, die
aufwärts (upstream) des zu translatierenden Gens liegen. Die IRES-Sequenzen können
nativ oder nicht-nativ sein. Die Translation der abwärts (downstream) gelegenen Gene
wird durch die insertierten IRES-Sequenzen gefördert, d. h. es handelt sich um einen
CAP-unabhängigen Mechanismus. Der Sequenzbereich, der die IRES-Sequenz bein
haltet, besitzt keine Eigenschaft eines subgenomischen Promotors, die technisch eine
Rolle spielen könnte. Dies kann bedeuteten, daß der Sequenzbereich keine nachweisbare
Produktion korrespondierender, subgenomischer RNS bewirkt. Alternativ kann die
Translation subgenomischer RNS ein Ergebnis von restlicher, subgenomischer Promotor
aktivität der IRES-Sequenz sein. Das IRES-Element wird in diesem Falle aber immer
noch für die Translation eines abwärts (downstream) gelegenen Gens benötigt. Folglich
besitzt die primäre, rekombinante RNS, die vom Vektor produziert wird, folgende
Bestandteile: ein oder mehrere Strukturgene (vorzugsweise viralen Ursprungs), besagte
IRES-Sequenz, das (Fremd-)Gen von Interesse, das sich abwärts (downstream) der
IRES-Sequenz befindet und die 3'-nichttranslatierte Region (3'-NTR). Es ist wichtig, daß
diese Strategie die gleichzeitige Expression mehrerer Fremdgene ermöglicht. Dies wird
durch die tandemartige Insertion von zwei oder mehreren Fremdgenen ermöglicht, die
alle von unterschiedlichen IRES-Sequenzen kontrolliert werden. Die vorliegende
Erfindung ist vorzugsweise auf Nukleinsäuren und rekombinante Viren ausgerichtet, die
durch die CAP-unabhängige Expression des viralen Genoms oder der viralen sgRNS oder
nicht-nativer (Fremd-)Nukleinsäuren charakterisiert werden. Diese sind in der Lage, über
weitere, pflanzenspezifische IRES-Elemente solche Fremdsequenzen systemisch zu
exprimieren.
In einer ersten Anwendungsform wird die Nukleinsäure eines Pflanzenvirus bereit
gestellt, in der die kodierende Sequenz für das native Hüllprotein und der native
subgenomische Promotor deletiert sind. Statt dessen wird ein nicht-natives Hüllprotein
aus einem Pflanzenvirus mit einem aufwärts (upstream) gelegenen, viralen IRES-
Element inseriert. Dies erlaubt CAP-unabhängige Expression in der Wirtspflanze. Die
Verpackung der rekombinanten, viralen Nukleinsäuren und die anschließende, systemische
Infektion des Wirts durch die rekombinante Nukleinsäure des Pflanzenvirus bleiben
erhalten.
Die rekombinante Pflanzenvirus-Nukleinsäure kann ein oder mehrere native oder nicht-
native IRES-Elemente beinhalten, die als Translationselemente funktionieren und die
keine transkriptionelle Aktivität besitzen, d. h. sie sind unfähig, als subgenomischer
Promotor zu fungieren. Jedes native oder nicht native IRES-Element ist in der Lage,
CAP-unabhängige Expression von benachbarten Genen oder Nukleinsäuresequenzen in
der Wirtspflanze zu fördern.
In einer zweiten Anwendungsform wird ein Amplifikations- und Expressionsvektor zur
Verfügung gestellt, in dem mehrere native oder nicht native, pflanzenvirale IRES-
Elemente oder ein natives oder nicht-natives, pflanzenvirales IRES-Element, das aufwärts
(upstream) von Fremdnukleinsäuresequenzen liegt, abwärts eines nativen Hüllproteins
inseriert sind bzw. ist. Das inserierte Pflanzenvirus-IRES-Element kann die CAP-
unabhängige Expression von benachbarten Genen in Wirtspflanzen leiten. Nicht-native
Nukleinsäuresequenzen können benachbart zu den IRES-Elementen inseriert werden, so
daß besagte Sequenzen in der Wirtspflanze unter der translationalen Kontrolle der IRES-
Elemente exprimiert werden und das gewünschte Produkt synthetisiert werden kann.
In einer dritten Anwendungsform wird ein rekombinanter Vektor wie im zweiten Ansatz
zur Verfügung gestellt. Der Unterschied besteht darin, daß das native oder nicht native,
pflanzenvirale IRES-Element (oder die IRES-Elemente) mit den abwärts gelegenen
Fremdnukleinsäuresequenzen aufwärts (upstream) des Hüllproteins und dessen nativen,
subgenomischen Promotors gelegen ist bzw. sind. In einer vierten Anwendungsform wird
eine rekombinante, virale Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, in der ein natives oder
nicht-natives, pflanzenvirales IRES-Element (oder IRES-Elemente) am 5'-Ende des
viralen Genoms oder in der viralen, subgenomischen RNS verwendet wird bzw. werden,
so daß ein abwärts (downstream) gelegenes Gen CAP-unabhängig translatiert wird.
In einer fünften Anwendungsform wird die Inhibition der CAP-abhängigen Translation
ausgenutzt, um das Niveau der CAP-unabhängigen Translation in den besagten Vektoren
zu erhöhen. Die auf Viren basierenden Amplifikationsvektoren werden vom Hüllprotein
eingeschlossen. Das Hüllprotein wird von der rekombinanten, pflanzenviralen
Nukleinsäure kodiert. Die rekombinante, pflanzenvirale Nukleinsäure ist zur Replikation
im Wirt fähig. Darüber hinaus kann es zur systemischen Ausbreitung im Wirt kommen.
Ein Fremdgen oder Fremdgene können CAP-unabhängig exprimiert werden. Zusätzlich
kann das gesamte Genom oder subgenomische RNSs CAP-unabhängig im Wirt
produziert werden, um ein gewünschtes Produkt zu erzeugen. Solche Produkte schließen
therapeutische und andere nützliche Polypeptide ein. Dazu gehören u. a. Enzyme,
komplexe Biomoleküle oder Polypeptide oder Merkmale oder Produkte, die durch die
Produktion von Gegensinn-RNS (antisense-RNS) erzeugt werden. Beispiele für
erwünschte, eingeführte (input-)Eigenschaften sind Resistenzen gegenüber Viren,
Bakterien, abiotischem Stress sowie eine verbesserte Energie- und Materialverwertung.
Beispiele für erwünschte output-Eigenschaften sind modifizierte Kohlenhydrate,
modifizierte Polysaccharide, modifiziere Fette, eine modifizierte Aminosäurezusammen
setzung bzw. -Ausbeute, modifizierte sekundäre Metaboliten und pharmazeutische
Proteine, einschließlich Enzyme, Antikörper, Antigene u. ä.. Beispiele für Regulationsmechanismen,
die Merkmale kontrollieren, sind Gen-Umschaltungen (Gene-switches),
Kontrolle der Expression, Kontrolle der hybriden Samenproduktion und Kontrolle von
Apomixis.
Die vorliegende Erfindung zielt zudem direkt auf die Herstellung künstlicher, nicht-
natürlicher IRES-Elemente (im Gegensatz zu IRES-Elementen, die aus lebenden
Organismen isoliert werden). Diese ermöglichen eine CAP-unabhängige und Promotor-
unabhängige Expression eines Gens von Interesse in Pflanzen (und evtl. zusätzlich in
Hefe- oder Tierzellen). Beispiele für lebende Organismen, aus denen die IRES-Elemente
evtl. isoliert werden können, sind der Hepatitus-C-Virus, infektiöse Bronchitis-Viren,
Picornaviren wie Poliovirus und Encephalomiocarditisvirus sowie Retroviren, wie
Moloney Murine Leukemia-Virus und Harvey Murine Sarcoma-Virus. Beispiele für
Pflanzenviren sind der Kartoffelvirus X, Potyviren wie der Kartoffelvirus Y und
Rübenmosaikvirus, Tobamoviren wie z. B. solche, die Kruziferen infizieren und
Comoviren, wie z. B. der Cowpea Mosaik-Virus. Alternativ können natürliche IRES-
Sequenzen aus zellulärer Boten-RNS isoliert werden. Dazu gehören RNSs wie die des
homöotischen ANTENNAPEDIA-Gens oder des menschlichen Fibroblastenwachstums
faktors 2 und des Translationsinitiationsfaktors eIF-4G.
In einer sechsten Anwendungsform werden künstliche, nicht natürliche IRES-Elemente
auf der Basis der Komplementarität zur 18S rRNS von eukaryotischen Zellen, ein
schließlich Hefe, Tieren und Pflanzenzellen gebildet.
In einer siebten Anwendungsform werden künstliche, nicht natürliche IRES-Elemente
auf der Grundlage von kurzen Sequenzabfolgen von Adenosin/Guanosin-Basen gebildet.
In einer achten Anwendungsform dieser Erfindung wird eine Methode zur Herstellung
und Verwendung von auf Viren basierenden Amplifikationsvektoren präsentiert, in der
die Expression des viralen Genoms in Pflanzenzellen unter der Kontrolle eines
pflanzenspezifischen Transkriptionspromotors auftritt.
In einer neunten Anwendungsform der vorgelegten Erfindung wird eine Methode zur
Herstellung und Verwendung von auf Viren basierenden Amplifikationsvektoren
vorgestellt, die es erlaubt, eine vektorielle Expression von Replikons durchzuführen, die
in der Pflanzenzelle als ein Ergebnis eines primären, nukleären Transkriptionsprozesses
gebildet werden.
In einer zehnten Anwendungsform dieser Erfindung wird ein Produkt beschrieben, mit
dessen Hilfe ringförmige, einzelsträngige, auf Viren basierende Amplifikationsvektoren
zur CAP-unabhängigen Expression von Fremdgenen in Pflanzen verwendet werden
können.
In einer elften Anwendungsmöglichkeit dieser Erfindung werden Methoden präsentiert,
die die Expression eines Gens von Interesse unter Bedingungen in Zellen ermöglicht, die
eine CAP-unabhängige Expression bevorzugt. In einem Beispiel werden Zellen, die mit
einem Amplifikationsvektor infiziert wurden, mit einer Komponente behandelt, die die
CAP-abhängige Translation verhindert. In einem weiteren Beispiel beinhaltet der Vektor
selber ein Gen, dessen Produkt einen inhibierenden Effekt auf die CAP-abhängige
Translation im Wirt bewirkt. Alternativ kann der Vektor auch eine Gegensinn
(antisense)-Sequenz mit gleicher Funktion besitzen.
In einer elften Anwendungsmöglichkeit dieser Erfindung ist eine Methode beschrieben,
die es erlaubt, mittels in-vivo-genetischer Selektion eine IRES-Sequenz zu identifizieren,
die die CAP-unabhängige Expression eines Gens von Interesse oder eines Reportergens
in einem Vektor vermittelt.
Das vorrangige Ziel dieser Erfindung ist die Etablierung neuer Strategien zur
Konstruktion von Vektoren für die Expression von fremden (heterologen, nicht nativen)
Genen, wobei diese Vektoren auf der Amplifizierung basieren. Die Translation dieser
Gene wird dabei durch IRES-vermittelte, CAP-unabhängige Mechanismen, des internen
Ribosomeneintritts an polycistronische, genomische Virus-RNSs und/oder bi- und
multicistronische sgRNSs, die von amplifizierenden Vektoren produziert werden,
erreicht. Vorzugsweise sollen diese von viralen Vektoren in einer Pflanzenzelle erzeugt
werden.
Die Konstruktion von rekombinanten, pflanzlichen Virus-RNSs und die Etablierung von
amplifizierenden Vektoren für die Einführung und Expression von fremden Genen in
Pflanzen wurde bereits von zahlreichen Autoren gezeigt, die zu diesem Zweck die
Genome von verschiedenen, taxonomischen Virus-Gruppen verwendeten (Review, siehe
"Genetic Engineering With Plant Viruses", 1992, eds. Wilson and Davies, CRC Press,
Inc.). Als geeignete Gruppe für die Konstruktion von viralen Vektoren wurden dabei die
Tobamoviren angesehen. Donson et al. (U.S. Patents Nos. 5,316,931; 5,589,367 und
5,866,785) erfanden TMV-basierende Vektoren, mit deren Hilfe man verschiedene,
fremde Gene in einer Wirtspflanze exprimieren konnte. So wurden auf diese Weise das
Neomycin-Phosphotransferase-Gen, das α-Trichosantin-Gen und mehrere andere, fremde
Gene angrenzend zu dem subgenomischen Promotor (sgPR) des TMV-Hüllprotein-Gens
inseriert. Donson et al. (1993, PCT WO 93/03161) entwickelten auf der Basis eines
Tobamovirus "eine rekombinante Pflanzenvirus-Nukleinsäure, die einen nativen,
subgenomischen Pflanzenvirus-Promotor, wenigstens einen nicht nativen, subgeno
mischen Pflanzenvirus-Promotor und die kodierende Sequenz eines Pflanzenvirus-
Hüllproteins umfaßte. Der erwähnte, nicht native, subgenomische Pflanzenvirus-Promotor
ist dabei in der Lage, die Transkription der angrenzenden Nukleinsäuresequenz in einer
Wirtspflanze zu initiieren, wobei er nicht mit subgenomischen Promotoren der
rekombinanten Pflanzenvirus-Nukleinsäure rekombiniert. Die erwähnte Pflanzenvirus-
Nukleinsäure kann eine systemische Infektion einer Wirtspflanze hervorrufen".
Im Gegensatz zu der Technologie von Donson et al. bezieht sich die vorgelegte
Erfindung nicht auf subgenomische Promotoren (sgPRs), mit deren Hilfe auf viralen
Replikons basierende Pflanzenexpressionssysteme konstruiert werden. Statt sgPRs
benutzt unsere Technologie IRES-Sequenzen (für den Virus native oder nicht native)
verschiedensten Ursprungs, die effektiv keine sgPR-Aktivität aufweisen, d. h. sie sind
effektiv nicht in der Lage, die Produktion von sgRNSs zu initiieren. Deshalb sollten diese
IRES-Squenzen nicht als sgPRs angesehen werden, obwohl sie in manchen Fällen
nichtfunktionale Segmente von sgPRs darstellen.
Es wird im allgemeinen angenommen, daß nach in-vitro-Transkription erhaltene, voll-
Länge-Virus-RNS, die nicht mit einer CAP-Gruppe versehen ist, nicht infektiös für
intakte Pflanzen und Protoplasten ist. Aus diesem Grund wird die Modifizierung eines
RNS-Transkripts mit einer CAP-Gruppe, ausgehend von einem viralen Vektor generell
als Voraussetzung dafür angesehen, daß ein in-vitro-Transkript infektiös ist. Geschützte
(capped) RNS-Transkripte werden normalerweise benutzt, um virale Vektor-RNS in
Pflanzen einzubringen. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, daß in einigen Fällen virale
RNS mit Hilfe einer einfachen Prozedur in vitro durch Hüllproteine verpackt werden
kann. Auf diese Weise können ausgehend von Hüllpropteinen und in-vitro-Transkripten
oder von aufgereinigter, authentischer, viraler RNS sowohl TMV-Virione als auch
Pseudovirione, die Vektor-RNS enthalten, sehr schnell hergestellt werden. Vor fünfzehn
Jahren konnte von Meshi et al. (1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5043 - 5047) gezeigt
werden, daß in einem in-vitro-Ansatz ohne CAP-Analoge hergestellte, ungeschützte
(uncapped) Transkripte der voll-Länge-TMV-RNS infektiös waren, wobei deren
spezifischer Infektionsgrad sehr gering war.
In der vorliegenden Erfindung kann ungeschützte (uncapped) Expressionsvektor-RNS,
die mit TMV-Hüllprotein verpackt ist, für Pflanzeninokulierungen benutzt werden, um
den geringen Infektionsgrad zu kompensieren. Wenigstens eine der zusätzlichen
Strategien, die in dieser Erfindung beschrieben werden, eröffnet eine technische
Möglichkeit für Pflanzeninfektionen mit einem CAP-unabhängigen, viralen Pflanzen-
Vektor. Diese ist die Methode der Insertion einer voll-Länge-Einzelstrang-(ss)DNS-
Kopie eines viralen Vektors unter der Kontrolle eines geeigneten DNS-Promotors. Nach
der Inokulation einer Wirtspflanze mit einer rekombinanten Virus-DNS wird die
infektiöse voll-Länge-RNS des viralen Pflanzenvektors produziert. Diese ist wiederum in
der Lage, sich zu replizieren und sich in der Pflanze auszubreiten.
Die Tatsache der CAP-unabhängigen Expression von fremden Genen mit Hilfe der IRES-
Sequenzen sowie die genannten Prozeduren machen somit die Prozesse der Pflanzen
inokulation und der Expression eines fremden Gens CAP-unabhängig.
Ein wichtiges und bevorzugtes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung einer
Serie von viralen Vektoren, die auf dem crTMV-Genom basieren und in denen der
"IRES-Fremdgen"-Block zwischen dem Hüllprotein und dem 3'-NTR inseriert ist.
Zahlreiche IRES- und Kontrollsequenzen wurden in Kombination mit zwei
verschiedenen Reportergenen (GUS und GFP) verwendet (siehe Abb. 2). Ein
einzigartiger Aspekt dieser Erfindung liegt darin, daß fremde Gene, die ausserhalb der
viralen sgPR-Sequenzen liegen, in infizierten Pflanzen CAP-unabhängig von der dem 3'-
Ende nächsten Position der genomischen RNSs und sgRNSs, die ihrerseits wiederum von
dem Vektor produziert werden, exprimiert werden. Insbesondere die IRESMP, 75 CR-
Sequenz, die den 3'-terminalen Teil der 5'-nicht translatierten Präsequenz (leader
sequence) der crTMV-I2 sgRNS repräsentiert, vermittelte in Pflanzen, die mit dem
viralen Vektor infiziert wurden, effizient die CAP-unbhängige Expression des dem 3'-
Ende nächsten Fremdgens. Es sollte darauf hingewiesen werden, daß erwähnte, auf dem
crTMV basierende, virale Vektoren drei verschiedene Arten der viralen, plus-sense-
ssRNSs in infizierten Pflanzen prodzieren: i) voll-Länge genomische RNS, ii)
tricistronische I2 sgRNS (unsere Daten zeigen, daß die spätere sgRNS im Gegensatz zu
der Voll-Länge-RNS nicht geschützt (uncapped) ist) und iii) bicistronische sgRNS, die
das erste Hüllprotein-Gen und das zweite Fremdgen enthält. Aus diesem Grund sind all
diese RNSs 3'-coterminal. Gleichzeitig wird die CAP-unabhängige Translation des dem
3'-Ende nächstgelegenen Gens mit Hilfe der vorangestellten IRES-Sequenz vermittelt.
Dabei liegt diese RNSs entweder als geschützte (capped, voll-Länge oder bicistronisch)
oder nicht geschützte (uncapped, tricistronisch) RNS vor.
Eine wichtige charakteristische Eigenschaft der viralen Vektoren ist deren Stabilität. Die
auf dem TMV-basierenden Vektoren, die Fremdgene enthalten, verbreiten sich jedoch
gewöhnlich nicht effizient innerhalb des Phloems von Pflanzen, die normalerweise
systemisch von Wildtyp-Viren infiziert werden. Dies kann zum einen durch die
Verlängerung der rekombinanten, viralen RNS und/oder durch die Anwesenheit von sich
wiederholenden Sequenzen, die zu Rekombinationen bzw. Deletionen führen, woraus
letztendlich eine Reversion zum Wildtyp-Virus resultiert, erklärt werden. Die Um
wandlung der nachfolgenden Population zu Wildtyp-Viren tritt dann in systemisch
infizierten Blättern auf.
Ein weiterer, wichtiger und charakteristischer Aspekt der viralen Vektoren ist das Niveau
der Genexpression der Fremdgene und die Akkumulation des entsprechenden Proteins.
Die Proteinmengen, die mit Hilfe der Vektoren erzielt werden, sind so hoch, daß sie z. B.
im Fall des GUS-Proteins ohne weiteres mit Hilfe einer SDS-PAGE detektiert werden
können.
Die Technologien, die sich für die Konstruktion von amplifizierenden Vektoren für die
Expression von fremden Sequenzen in Wirtspflanzen als geeignet auszeichneten, sind auf
der Basis von verschiedenen, viralen Genomen entwickelt worden (z. B. siehe G. Della-
Cioppa et al., 1999, PCT WO 99/36516).
Die zentrale Eigenschaft von solchen Erfindungen war, daß die rekombinante, virale
Pflanzennukleinsäure "eine oder mehrere, nicht native, subgenomische Promotoren
enthält, die in der Lage sind, die angrenzenden Nukleinsäuresequenzen in Wirtspflanzen
zu transkribieren bzw. zu exprimieren. Die rekombinanten, viralen Pflanzennuklein
säuren können eventuell weiter modifiziert werden, um die gesamte oder Teile der
kodierenden Sequenz des nativen Hüllproteins zu deletieren, so daß man eine nicht-nativ
kodierende Hüllproteinsequenz unter der Kontrolle eines nativen Promotors oder eines
der nicht nativen pflanzlichen, viralen, subgenomischen Promotoren erhält. Oder die
native Hüllproteinsequenz wird unter die Kontrolle eines nicht nativen pflanzlichen,
viralen, subgenomischen Promotors gestellt". In anderen Worten ausgedrückt, stellt oder
stellen die nativen und nicht nativen sgPR-Sequenzen, die für die Herstellung von
künstlichen sgRNSs mit Hilfe der viralen Vektoren benutzt wurden, die wichtigsten
Element(e) dieser Erfindung dar. Eine wichtige Eigenschaft, die die Erfindung, die von
unserer Gruppe präsentiert wird, von anderen unterscheidbar macht, ist, daß gemäß WO 99/36516
das fremde Gene zwangsläufig unterhalb (downstream) der sgPR-Sequenzen
lokalisiert sein muß. Zum Beispiel sollte sie an der dem 5'-Ende nächsten Position der
chimären sgRNS, die von dem viralen Vektor in den Wirtspflanzen produziert wird,
lokalisiert sein. Im Gegensatz dazu schlägt unsere Erfindung vor, daß das fremde Gen
von einem sgPR (wenn vorhanden) wenigstens durch ein (oder mehrere) virale Gen(e)
getrennt ist, so daß das besagte, fremde Gen an der dem 3'-Ende nächsten Position oder
innerhalb der aktiven, chimären sgRNS, die von dem Vektor produziert wird, lokalisiert
ist. So wird auf diese Weise die Genexpression entweder durch eine native oder nicht
native IRES-Sequenz vermittelt.
Das nächste, bevorzugte Ziel dieser Erfindung ist die Konstruktion eines neuen Typus der
nicht nativen IRES-Sequenzen, der sogenannten künstlichen, nicht natürlichen,
synthetischen IRES-Sequenzen, die in der Lage sind, eine CAP-unabhängige Translation
des 5'-distalen Gens von eukaryotischen, polycistronischen mRNSs zu vermitteln. Wir
zeigen, daß intercistronische Spacer, die komplementär zu der 18S rRNS verschiedener
Länge und Komposition sind, in der Lage sind, die CAP-unabhängige Translation des 3'-
proximalen GUS-Gens in einer bicistronischen H-GFP-IRES-GUS mRNS zu vermitteln
(Abb. 13).
Abschließend stellt die Möglichkeit der Kombination von Wiederholungen von zwei oder
mehreren fremden Genen, denen jeweils eine native oder nicht native IRES-Sequenz in
dem auf der Amplifikation basierenden Vektorgenom voran geht, einen Vorteil der
vorliegenden Erfindung dar. Die Expression einer solchen Kassette eines "IRES-
Fremdgens" wird die gleichzeitige Produktion von zwei oder mehreren fremden
Proteinen mit Hilfe des Vektors ermöglichen.
Viren, die zu verschiedenen taxonomischen Gruppen gehören, können zur Konstruktion
von viralen Vektoren gemäß der Prinzipien dieser Erfindung genutzt werden. Das gilt
sowohl für RNS- als auch für DNS-enthaltene Viren, für die im folgenden Beispiele
gegeben werden (durchlaufend ist in diesem Dokument bei jedem Artspeziesnamen der
Name der Ordnung, der Familie und der Gattung, zu dem dieser gehört, vorangestellt.
Namen der Ordnungen, Familien und Gattungen sind in kursiv gesetzt, wenn sie von der
ICTV bestätigt sind. Namen der Taxa in Anführungszeichen (und nicht in kursiv gesetzt)
zeigen an, daß dieses Taxon keinen von der ICTV international bestätigten Namen hat.
Trivialnamen der Spezies sind in normaler Schreibweise aufgeführt. Viren mit keiner
formalen Zuordnung zu einer Gattung oder Familie sind angezeigt):
Familie: Caulimoviridae, Gattung: Badnavirus, Artspezies: commelina yellow mottle
virus, Gattung: Caulimovirus, Artspezies: cauliflower mosaic virus, Gattung: "SbCMV-
like vires", Artspezies: Soybean chloroticmottle virus, Gattung: "CsVMV-like vires",
Artspezies: Cassava vein mosaicvirus, Gattung: "RTBV-Like vires", Artspezies: Rice
tungro bacilliformvirus, Gattung: "Petunia vein clearing-like vires", Artspezies: Petunia
vein clearing virus.
Familie: Geminiviridae, Gattung: Mastrevirus (Untergruppe I Geminivirus), Artspezies:
maize streak virus, Gattung: Curtovirus (Untergruppe II Geminivirus), Artspezies: beet
curly top virus, Gattung: Begomovirus (Untergruppe III Geminivirus, Artspezies: bean
golden mosaic virus.
Familie: Bromoviridae, Gattung: Alfamovirus, Artspezies: alfalfa mosaic virus, Gattung:
Ilarvirus, Artspezies: tobacco streak virus, Gattung: Bromovirus, Artspezies: brome
mosaic virus, Gattung: Cucumovirus, Artspezies: cucumber mosaic virus.
Familie: Closeroviridae, Gattung: Closterovirus, Artspezies: beet yellow virus, Gattung: Crinivirus, Artspezies: Lettuce infectious yellows virus.
Familie: Comoviridae, Gattung: Comovirus, Artspezies: cowpea mosaic virus, Gattung: Fabavirus, Artspezies: broad bean wilt virus 1, Gattung: Nepovirus, Artspezies: tobacco ringspot virus.
Familie: Potyvirdae, Gattung: Potyvirus, Artspezies: potato virus Y, Gattung: Rymovirus, Artspezies: ryegrass mosaic virus, Gattung: Bymovirus, Artspezies: barley yellow mosaic virus.
Familie: Sequiviridae, Gattung: Sequivirus, Artspezies: parsnip yellow fleck virus, Gattung: Waikavirus, Artspezies: rice tungro spherical virus.
Familie: Tombusviridae, Gattung: carmovirus, Artspezies: carnation mottle virus.
Gattung: Dianthosvirus, Artspezies: carnation ringspot virus, Gattung: Machlomovirus, Artspezies: maize chlorotic mottle virus, Gattung: Necrovirus, Artspezies: tobacco necrosis virus, Gattung: Tombusvirus, Artspezies: tomato bushy stunt virus.
Familie: Closeroviridae, Gattung: Closterovirus, Artspezies: beet yellow virus, Gattung: Crinivirus, Artspezies: Lettuce infectious yellows virus.
Familie: Comoviridae, Gattung: Comovirus, Artspezies: cowpea mosaic virus, Gattung: Fabavirus, Artspezies: broad bean wilt virus 1, Gattung: Nepovirus, Artspezies: tobacco ringspot virus.
Familie: Potyvirdae, Gattung: Potyvirus, Artspezies: potato virus Y, Gattung: Rymovirus, Artspezies: ryegrass mosaic virus, Gattung: Bymovirus, Artspezies: barley yellow mosaic virus.
Familie: Sequiviridae, Gattung: Sequivirus, Artspezies: parsnip yellow fleck virus, Gattung: Waikavirus, Artspezies: rice tungro spherical virus.
Familie: Tombusviridae, Gattung: carmovirus, Artspezies: carnation mottle virus.
Gattung: Dianthosvirus, Artspezies: carnation ringspot virus, Gattung: Machlomovirus, Artspezies: maize chlorotic mottle virus, Gattung: Necrovirus, Artspezies: tobacco necrosis virus, Gattung: Tombusvirus, Artspezies: tomato bushy stunt virus.
Gattung: Capillovirus, Artspezies: apple stern grooving virus, Gattung: Carlavirus,
Artspezies: carnation latent virus, Gattung: Enamovirus, Artspezies: pea enation mosaic
virus, Gattung: Furovirus, Artspezies: soil-borne wheat mosaic virus, Gattung:
Hordeivirus, Artspezies: barley stripe mosaic virus, Gattung: Idaeovirus, Artspezies:
raspberry bushy dwarf virus, Gattung: Luteovirus, Artspezies: barley yellow dwarf virus,
Gattung: Marafivirus, Artspezies: maize rayado fino virus, Gattung: Potexvirus,
Artspezies: potato virus X, Gattung: Sobemovirus, Artspezies: Southern bean mosaic
virus, Gattung: Tenuivirus, Artspezies: rice stripe virus, Gattung: Tobamovirus,
Artspezies: tobacco mosaic virus, Gattung: Tobravirus, Artspezies: tobacco rattle virus,
Gattung: Trichovirus, Artspezies: apple chlorotic leaf spot virus, Gattung: Tymovirus,
Artspezies: turnip yellow mosaic virus, Gattung: Umbravirus, Artspezies: carrot mottle
virus.
Ordnung: Mononegavirales, Familie: Rhabdoviridae, Gattung: Cytorhabdovirus,
Artspezies: lettuce necrotie yellows virus, Gattung: Nucleorhabdovirus, Artspezies:
potato yellow dwarf virus.
Familie: Bunyaviridae, Gattung: Tospovirus, Artspezies: tomato spotted wilt virus.
Familie: Bunyaviridae, Gattung: Tospovirus, Artspezies: tomato spotted wilt virus.
Familie: Partitiviridae, Gattung: Alphacryptovirus, Artspezies: white clover cryptic
virus 1, Gattung: Betacryptovirus, Artspezies: white clover cryptic virus 2.
Familie: Reoviridae, Gattung: Fijivirus, Artspezies: Fiji disease virus, Gattung: Phytoreovirus, Artspezies: wound tumor virus, Gattung: Oryzavirus, Artspezies: rice ragged stunt virus.
Familie: Reoviridae, Gattung: Fijivirus, Artspezies: Fiji disease virus, Gattung: Phytoreovirus, Artspezies: wound tumor virus, Gattung: Oryzavirus, Artspezies: rice ragged stunt virus.
Genom ssDNS: Spezies banana bunchy top virus, Spezies coconut foliar decay virus,
Spezies subterranean clover stunt virus,
Genom dsDNS: Spezies cucumber vein yellowing virus,
Genom dsRNS: Spezies tobacco stunt virus,
Genom ssRNS, Spezies Garlic viruses A, B, C, D, Spezies grapevine fleck virus, Spezies maize white line mosaic virus, Spezies olive latent virus 2, Spezies ourmia melon virus, Spezies Pelargonium zonate spot virus.
Genom dsDNS: Spezies cucumber vein yellowing virus,
Genom dsRNS: Spezies tobacco stunt virus,
Genom ssRNS, Spezies Garlic viruses A, B, C, D, Spezies grapevine fleck virus, Spezies maize white line mosaic virus, Spezies olive latent virus 2, Spezies ourmia melon virus, Spezies Pelargonium zonate spot virus.
Satelliten: ssRNS Satelliten Viren: Untergruppe 2 Satelliten Viren, Artspezies: tobacco
necrosis satellite,
Satelliten RNS, Untergruppe 2 B Typus mRNS Satelliten, Untergruppe 3 C Typus lineare RNS Satelliten, Untergruppe 4 D Typus zirkuläre RNS Satelliten, Viroide, Artspezies: potato spindle tuber viroide.
Satelliten RNS, Untergruppe 2 B Typus mRNS Satelliten, Untergruppe 3 C Typus lineare RNS Satelliten, Untergruppe 4 D Typus zirkuläre RNS Satelliten, Viroide, Artspezies: potato spindle tuber viroide.
Insbesondere können die Methoden der vorliegenden Erfindung vorzugsweise für die
Konstruktion von viralen, auf einem Replikon basierende Vektoren angewendet werden,
indem die rekombinanten Genome der plus-sense-ssRNS-Viren, die vorzugsweise zu der
Gattung Tobamovirus oder zu der Familie Bromoviridae oder Potyviridae aber auch zu
den DNS-enthaltenen Viren gehören, eingesetzt werden. Im letzteren Fall sollte das
fremde Gen möglichst abwärts (downstream) eines viralen Gens lokalisiert sein, so daß
dessen Expression mit Hilfe der IRES-Sequenz von einer bicistronischen oder
polycistronischen mRNS, die von einer DNS-abhängigen RNS-Polymerase mit Hilfe
eines genomischen Promotors transkribiert wurde, vermittelt werden kann.
Ein gesonderter und bevorzugter Aspekt dieser Erfindung befaßt sich mit der Anwendung
der Methoden dieser Erfindung für die Konstruktion von auf ssDNS-basierenden
Vektoren. Die auf dem Geminivirus basierenden Vektoren, die das fremde Gen bzw. die
fremden Gene unter der Kontrolle einer IRES-Sequenz exprimieren, können für diesen
Aspekt als Beispiel dienen. Die Geminiviren repräsentieren eine Gruppe von
Pflanzenviren mit einer einteiligen (monopartite) oder zweiteiligen (bipartite), zirkulären
ssDNS, die gepaarte, quasi icosahedrale Partikel hat (Übersichtsartikel siehe Hull und
Davies, 1983, Adv. Virus Res. 28, 1 - 45; Mullineaux et al., 1992, "Genetic engineering
with plant viruses", Wilson und Davies, Hrsg., 1992, CRC Press, Inc.). Die zwei ssDNS-
Komponenten des zweiteiligen (bipartite) Geminivirus werden als A und B bezeichnet
und kodieren für 4 bzw. 2 Proteine. Die DNS A enthält das Hüllproteingen und drei
weitere Gene, die an der Replikation der DNS beteiligt sind. Im Gegensatz dazu kodiert
die DNS B für zwei Proteine, die für die Ausbreitung des Virus essentiel sind. Es konnte
gezeigt werden, daß die Genome von zweiteiligen (bipartite) Geminiviren zu der Gattung
Begomovirus gehören. So können der tomato golden mosaic-virus (TGMV) und der bean
golden mosaic-virus (BGMV) replizieren und sich trotz einer Deletion im Hüllproteingen
innerhalb einer bestimmten Wirtspflanze ausbreiten (Gardiner et al., 1988, EMBO J. 7,
899 - 904; Jeffrey et al., 1996, Virology 223, 208 - 218; Azzam et al., 1994, Virology 204,
289 - 296). Es ist bemerkenswert, daß einige Begomoviren einschließlich des BGMV eine
Phloem-Limitierung aufweisen und auf die Zellen des vaskulären Systems beschränkt
sind. Somit bleibt der BGMV-Phloem limitiert, während der TGMV in der Lage ist, in
das Mesophyllgewebe von systemisch infizierten Blättern einzudringen (Petty und Morra,
2000, Abstracts of 19th Annual meeting of American Society for Virology, S. 127). Die
eingereichte Erfindung schlägt vor, das fremde Gen auf zwei Wegen in ein zweigeteiltes
(bipartite) Geminivirus-Genom einzufügen: (i) abwärts (downstream) von einem der
Gene (z. B. im Fall des BGMV), insbesondere abwärts (downstream) des Hüllproteingens,
so daß das offene Leseraster des Hüllproteins intakt oder vom 3'-Ende verkürzt wird und
die IRES-Sequenz aufwärts (upstream) des fremden Gens eingefügt werden kann.
Folglich kann die mRNS-Transkription von dem nativen DNS-Promotor weitergehen, und
es wird letztlich eine bizitronische, chimäre mRNS erzeugt, die die ersten, viralen Gene
(oder einen Teil hiervon), die IRES-Sequenz und die 3'-proximalen, fremden Gene
umfasst. Gleichzeitig wird die Expression des fremden Gens durch die IRES-Sequenz
vermittelt. Alternativ (ii) kann die voll-Länge-DNS-Kopie des RNS-Genoms des viralen
Vektors in die DNS eines Hüllprotein defizienten, zweiteiligen (bipartite) Geminivirus
unter die Kontrolle des Hüllproteingen-Promotors inseriert werden. Das RNS-Genom des
RNS-Vektor-Virus wird dann als Resultat der Transkription der DNS A in der
Pflanzenzelle, die mit einer Mischung der rekombinanten DNS A und nicht modifizierter
DNS B inokuliert wurde, erzeugt. Ein Vorteil dieser Methode liegt darin, daß der
Geminivirus-Vektor nur als ein Vehikel benutzt wird, um den Vektor zu den primär
inokulierten Zellen zu bringen. Alle anderen Schritte werden von dem Tobamovirus-
Vektor selbst durchgeführt. Dies umfaßt die Erzeugung der IRES-tragenden Vektor-RNS,
nachdem die Geminivirus-Vektor-DNS mit Hilfe einer zellulären RNS-Polymerase
transkribiert wurde, ihre Replizierung, Translation, die systemische Verbreitung
innerhalb der Wirtspflanze und die Fremdgenexpression.
Als eine zusätzliche Möglichkeit für die Herstellung eines ssDNS-Vektors kann die
Klonierung der viralen cDNS und des fremden Gens in einen Phagemid-Vektor mit
anschließender Erzeugung der ssDNS nach Standardmethoden angegeben werden. Wenn
man in Betracht zieht, daß vom Tobamovirus abgeleitete IRES-Sequenzen auch in
tierischen Zellen funktional aktiv sind (unsere vorhergehende Patentanmeldung), kann
die Methode der vorliegenden Erfindung für die Herstellung von rekombinanter, viraler
RNS und von viralen Vektoren auf der Basis von tierischen Viren, wie z. B. der Viren, die
zu der Familie Togaviridae, Caliciviridae, Astroviridae, Picornaviridae, Flaviviridae
gehören, benutzt werden. Auf diese Weise werden neue Vektoren erzeugt, die fremde
Gene unter der Kontrolle von IRES-Sequenzen, die von Pflanzenviren abgeleitetet sind,
exprimieren. Solche auf tierischen Viren basierenden Vektoren für Pflanzen und Tiere
können nützlich in dem Bereich der Impfstoffherstellung oder der Gentherapie sein. Es
sollte jedoch darauf hingewiesen werden, daß die stabförmigen Virionen der
Tobamoviren und besonders die flexiblen und langen Virionen der filamentösen
Potexviren, Carlaviren, Potyviren und Closteroviren offensichtlich die besten Modelle für
die Realisierung der Methoden dieser vorliegenden Erfindung darstellen.
Das nächste, bevorzugte Ziel dieser Erfindung ist der Gebrauch der IRES-Sequenzen in
der Art, daß die viralen, auf der Amplifikation basierenden Vektoren innerhalb des 5'-
NTR die IRES-Sequenz enthalten werden. Es wird dabei angenommen, daß diese
Insertion einer IRES-Sequenz nicht die virale Replikation verhindert, sondern in der Lage
ist, eine effiziente, CAP-unabhängige Translation der Transkripte der genomischen
Vektor-RNS sicherzustellen. Deswegen könnte das besagte Konstrukt folgendes
umfassen: (i) Ein IRES-Element innerhalb oder abwärts (downstream) der 5'-
untranslatierten leader-Sequenz, die nativ oder nicht-nativ für diesen besagten Vektor ist
und die eine CAP-unabhängige Translation der viralen 5'-proximalen Gene (RdRp-Gen)
vermittelt; des weiteren (ii) wenigstens eine native oder nicht native IRES-Sequenz, die
abwärts (downstream) von einem oder mehreren, viralen Strukturgenen und aufwärts
(upstream) des fremden Gens bzw. der fremden Gene lokalisiert ist, um deren CAP-
unabhängige Translation zu vermitteln. Gemäß dieser Methode wird der spezifische
Infektionsgrad des ungeschützten (uncapped) voll-Länge-Vektor-Transkriptes auf Grund
der effizienten 5'-IRES vermittelten Translation der elterlichen RNS-Moleküle in den
ersten inokulierten Zellen erhöht.
Ein anderes bevorzugtes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Methode, ein oder
mehrere Protein(e) von Bedeutung in Pflanzenzellen auf der Basis der Einführung und
der ungeschützten (uncapped) Expression eines fremden Gens von einer mono- oder
polycistronischen mRNS-Sequenz zu produzieren, die mit Hilfe einer spezifischen,
pflanzlichen IRES-Sequenz, die wiederum aufwärts (upstream) der besagten Fremdgen-
Sequenz lokalisiert ist, vermittelt wird. Eine besondere Eigenschaft dieser Methode liegt
darin, daß die Technologie eine Prozedur beinhaltet, die die selektive Abschaltung der
zellulären CAP-abhängigen mRNS-Translation mittels bestimmter chemischer Verbind
ungen erlaubt. Diese Prozedur beeinflusst jedoch nicht die CAP-unabhängige, IRES-
vermittelte Translation von mRNSs, die künstlich in die Pflanzenzellen eingeführt
wurden. Auf diese Weise wird die Kontrolle und die Verstärkung der CAP-unabhängigen
Expression erreicht.
Alternativ kann die Inhibierung der Translation der zellulären, geschützten (capped) RNS
auf Pflanzen angewendet werden, die mit dem besagten Vektor selbst infiziert wurden,
der das Fremdgen bzw. die Fremdgene in einer CAP-unabhängigen Weise exprimiert.
Bedingungen, die die Translation der zellulären, geschützten (capped) RNS
unterdrücken, ermöglichen die selektive Expression des(r) Fremdgens(e) mit Hilfe des
besagten Virus-Vektors.
Der Vektor dieser Erfindung kann ein RNS- oder DNS-Vektor sein. Er kann ss(+), ss(-)
oder ds sein. Er kann irgendeine Art der Amplifikation, die von Viren bekannt sind,
zeigen. Dies beinhaltet die Multiplikation der Vektor-Nukleinsäure, optional die
Erzeugung des Hüllproteins und optional die Erzeugung der Proteine, die für die
Ausbreitung von einer Zelle zu der anderen Zelle oder für die Ferndistanzausbreitung
(long distance movement) benötigt werden. Die Gene, die für die Replikation und/oder
die Umhüllung und/oder für die Ausbreitung notwendig sind, können ganz oder teilweise
in entsprechend veränderten Wirtspflanzen exprimiert werden. Auf diese Weise besteht
dieses System aus einem Vektor und einer Wirtspflanze, die wechselseitig angepasst
werden.
Der Vektor kann mit Modifizierungen von einem Virus abgeleitet oder de novo
synthetisiert werden. Er kann nur IRES-Elemente enthalten, die keine subgenomische
Aktivität mehr aufweisen. Der Vektor kann jedoch einen oder mehrere, subgenomische
Promotoren mit einem oder mehreren IRES-Elementen, die effektiv keine subgenomische
Promotoraktivität mehr aufweisen, verknüpfen, so daß die Anzahl der Cistrone größer
als die Anzahl der Promotoren ist.
Wenn man den einfachsten Fall mit einem IRES-Element betrachtet, kann dieses besagte
Element aufwärts (upstream) von dem (fremden) Gen mit Bedeutung lokalisiert sein, so
daß es von dem besagten IRES-Element direkt exprimiert wird. Oder das IRES-Element
wird optional abwärts (downstream) von einem (viralen) Gen lokalisiert, so daß es IRES-
unabhängig exprimiert wird.
Als Alternative kann das Gen von Bedeutung auch aufwärts (upstream) von einem IRES-
Element lokalisiert sein und IRES-unabhängig exprimiert werden. Das IRES-Element
dient dann zur Expression der viralen Gene, die abwärts (downstream) davon lokalisiert
sind. Diese einfachsten Kombinationen können natürlich einfach oder mehrmals in einen
komplexeren Vektor verwirklicht werden.
Der Vektor kann eine Sequenz in antisense-Orientierung enthalten, um die Expression
eines Wirtsgens zu unterdrücken. Diese Funktion der Suppression kann alleine oder in
Kombination mit der Expression eines fremden Gens von Bedeutung existieren. Ein
besonders bevorzugter Fall beinhaltet die Suppression eines Gens, das essentiell für die
CAP-abhängige Translation ist. Als Beispiele können die Gene für die Translationsinitiationsfaktoren
wie z. B. dem elF4-Initiationsfaktor angesehen werden, der mit der
CAP-abhängigen Translation verknüpft ist. Letztendlich dient dann die Translations
maschinerie in der Wirtspflanze nur noch der Vektortranslation. In diesem Fall muss die
Translation der Vektor-RNS gänzlich CAP-unabhängig sein. Natürlich kann der Vektor
auch in einer Pflanzenzelle von einem Vor-Vektor in Prozessierungsschritten, wie z. B.
dem Intron-Splicing, erzeugt werden.
Das IRES-Element kann aus einem Pflanzenvirus stammen. Alternativ hierzu kann es
auch aus irgendeinem Virus stammen, solange es den funktionalen Bedürfnissen in der
Pflanzenzelle genügt. Weiterhin kann ein IRES-Element, das in einer Pflanzenzelle
wirksam ist, synthetisch oder künstlich sein. Die Synthese kann sich hierbei an die
Sequenz der 18S rRNS der Wirtspflanze anlehnen, um komplementäre Teilsequenzen
dieser 18S rRNS als funktionale IRES-Elemente auszunutzen. Komplementär bezieht
sich in diesem Zusammenhang auf die GC-, die AU- und im weiteren Sinne auf die GU-
Basenpaarung. Weiter können solche IRES-Elemente Multimere von diesen komplemen
tären Sequenzen sein, um die Effizienz in der Bindung der Ribosomen zu erhöhen. Das
Multimer kann aus identischen bzw. unterschiedlichen, komplementären Sequenz
einheiten, die essentiell für die Funktion als IRES-Element sind, aufgebaut sein. Darüber
hinaus können künstliche IRES-Elemente mit hoher Translationseffizienz und effektiv
keiner subgenomischen Promotoraktivität auch mit Hilfe des Prozesses der gezielten
Evolution - wie in den Patenten US 6,096,548 oder US 6,117,679 beschrieben - erzeugt
werden. Dieses kann mit einer Population von Vektoren, die willkürlich ausgewählte
IRES-Sequenzen enthalten, in Zellkulturen umgesetzt werden. Die Klone, die ein
Reportergen exprimieren, das funktional mit einem potentiellen IRES-Element verknüpft
ist, können selektiert werden. Von diesen wiederum werden diejenigen eliminiert, die
eine subgenomische Promotoraktivität ausfweisen. Weitere Runden der zufälligen
Anordnung und Selektion können folgen.
Das IRES-Element des Vektors dieser Erfindung kann effektiv ohne Promotoraktivität
sein. Das bedeutet, daß die Expression eines Gens, das funktional mit einem IRES-
Element verknüpft ist, nicht bei einer restlichen, subgenomischen Promotoraktivität
auftreten würde. Diese Wirkungsweise kann mit Hilfe von Standardmethoden der
Molekularbiologie, wie dem Northern-Blot, der Primer-Verlängerung (Current Protocols
in Molecular Biology, Hrsg. F. Ausubel et al., 1999, John Wiley & Sons), der 5'-RACE-
Technologie (Gibco BRL, USA) und ähnlichen Methoden bestimmt werden. Es sollte
hinzugefügt werden, daß IRES-Elemente, die detektierbare, subgenomische Promotor
aktivität aufweisen aber zwingenderweise eher als translationale als als transkriptionale
Elemente operieren, auch Gegenstand dieser Erfindung sind. Diese Unterscheidung
könnte zum Beispiel mit Hilfe der quantitativen Messung der relativen Mengen von zwei
Arten von mRNSs (der kurzen mRNS und der langen mRNS) in Northern-Analysen
erreicht werden, wobei die kurze mRNS mit Hilfe von subgenomischer Promotoraktiviät
und die lange mRNS ohne subgenomische Promotoraktiviät erzeugt wird. Wenn das
IRES-Element tatsächlich als ein viraler, subgenomischer Promotor agiert, sollte die
relative Menge der korrespondierenden, kurzen RNS kleiner als 20%, vorzugsweise
kleiner als 10% und am besten kleiner als 5% der Summe der kurzen und langen mRNS
sein.
Somit stellen wir einen Vektor bereit, der in der Lage ist, in einer Pflanze ein Gen zu
amplifizieren. Der Vektor umfaßt dabei eine Nukleinsäuresequenz, die eine Sequenz für
wenigstens ein nicht-virales Gen und ein IRES-Element aufweist, das für die Translation
des besagten Gens in Pflanzen notwendig ist. Die Expression dieses besagten Gens leitet
sich dabei aber mehr von den translationalen als von den transkriptionalen Eigenschaften
dieses besagten IRES-Elementes ab, die mit Standard-Prozeduren der Molekularbiologie
nachgewiesen werden können.
Die neuen Vektoren der Erfindung eröffnen neue Wege für die genetische Modifikation
von Pflanzen. Als eine der ersten Möglichkeiten schlagen wir den Gebrauch dieser
Vektoren für die Bestimmung der Funktion eines Strukturgens in Pflanzen vor. Dieses ist
von beträchtlichem Interesse für die Genomforschung (Genomics). Deswegen ist eine
Pflanze, deren Genom sequenziert wurde, von speziellem Interesse. Dies ist eine
Anwendung in einem kleinem Maßstab (Pflanze für Pflanze). Der Vektor dieser
Erfindung ist sehr wirkungsvoll für diese Applikation, weil er die Unterdrückung
(Suppression) von Genen mit Bedeutung und/oder die Überexpression von Genen
erlaubt, um die Genfunktionen, die zur Zeit im verstärkten Maße entdeckt werden, zu
analysieren.
In einer Großanwendung kann der Vektor benutzt werden, um eine Eigenschaft oder ein
Protein in einer Wirtspflanze zu erzeugen. Infektionen von Pflanzen mit dem Vektor
können auf einer landwirtschaftlichen Fläche durchgeführt werden, auf der zuvor nicht
modifizierte Pflanzen angezogen worden sind. Dieses erlaubt zum ersten Mal eine
genetische Modifizierung von Feldpflanzen, wobei der Landwirt größte Freiheiten in der
Selektion aus einer Vielfalt von Samen und Vektoren hat, um ein gewünschtes Protein
oder Eigenschaft zu erzeugen.
Beispiele für Pflanzenspezies von Interesse für diese Anwendung sind monokotyle
Pflanzen, wie Weizen, Mais, Reis, Gerste, Hafer, Hirse und ähnliche oder dikotyle Pflanzen,
wie Rapssaat, Raps, Zuckerrübe, Sojabohne, Erbse, Luzern, Baumwolle, Sonnenblume,
Kartoffel, Tomate, Tabak und ähnliche.
In dem Folgenden wird die Erfindung weitergehender mit der Hilfe spezifischer Beispiele
beschrieben. Molekularbiologische Standardtechniken wurden gemäß Sambrook et al.
(1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) durchgeführt. Alle Plasmide, die in der
Erfindung benutzt werden, können gemäß den Anweisungen der Spezifikationen von
einer Person mit durchschnittlicher Qualifikation mit normalen, experimentellen
Hilfsmitteln hergestellt werden.
Virione eines bekannten Tombavirus, der Crucifer-Tombavirus (crTMV) genannt wird
und der in der Lage ist, Kreuzblütler systemisch zu infizieren, wurden von Olearacia-
officinalis-L.-Pflanzen, die Mosaik-Symptome auswiesen, isoliert. Die Resultate der
Überprüfung der Wirtsspezifität sind in Tabelle 1 gezeigt.
crTMV-cDNS wurde mit Hilfe der Didesoxynukleotid-Sequenzierung charakterisiert
(Dorokhov et al., 1994, FEBS-Letters 350, 5 - 8). Infektiöse voll-Länge-cDNS-Klone
wurden mit Hilfe des T7-RNS-Polymerase-Promotors in einer RT-PCR-Reaktion mit
crTMV-RNS als Template erzeugt. Folgende Oligonukleotide wurden dabei benutzt:
Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Kpn-I-Restriktionsstelle dar;
unterstrichen und klein geschrieben sind die Nukleotide der T7-RNS-Polymerase-
Promotorsequenz; die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 5'-Ende der
crTMV-cDNS-Sequenz abgeleitet.
Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Not-I-Restriktionsstelle dar; die groß
geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 3'-Ende der crTMV-cDNS-Sequenz
abgeleitet; dieses RT-PCR-Produkt wurde in den pUC19-Vektor zwischen die Kpn-I- und
BamH-I-Restriktionstelle kloniert (Abb. 1).
Für infektiöse voll-Länge-cDNS-Klone, die mit Hilfe des SP6-RNS-Polymerase-
Promotors in einer RT-PCR-Reaktion mit crTMV-RNS als Template erzeugt wurden,
wurden folgende Oligonukleotide benutzt:
Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Kpn-I-Restriktionsstelle dar;
unterstrichen und klein geschrieben sind die Nukleotide der SP6-RNS-Polymerase-
Promotorsequenz, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 5'-Ende der
crTMV-cDNS-Sequenz abgeleitet.
Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Not-I-Restriktionsstelle dar; die groß
geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 3'-Ende der crTMV-cDNS-Sequenz
abgeleitet; dieses RT-PCR-Produkt wurde in den pUC19-Vektor zwischen die Kpn-I- und
BamH-I-Restriktionstelle kloniert (Abb. 1).
Die voll-Länge-crTMV-cDNS-Klone wurden mit Hilfe der Didesoxynukleotid-
Sequenzierung charakterisiert. Die Fähigkeit von infektiösen crTMV-Transkripten
systemisch Nicotiana- und Kreuzblütler-Arten zu infizieren, konnte in Infektions
experimenten mit Nicotiana tabacum var. Samsun bzw. Arabidopsis thaliana bestätigt
werden.
Eine Serie von IRES-vermittelten Expressionsvektoren T7/crTMV/GUS wurden wie
folgt konstruiert. Erstens, Hind-III- und Xba-I-Restriktionsstellen wurden in das CP-Gen
des Sac II/Not-I-Fragment des T7/crTMV-Vektors (Abb. 1) mit Hilfe einer Polymerase-
Kettenreaktion (PCR) und zwei Paaren von spezifischen Primern inseriert. Zweitens
IRESMP,75 CR-GUS-, IRESMP,75 UI-GUS-, IRESMP,228 CR-GUS-, IRESCP,148 CR-GUS-,
IRESCP,148 UI-GUS-, PL-GUS-cDNS, die in Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139 -
154) beschrieben sind, wurden in die Hind-III- und Xba-I-Restriktionsstellen des Sac-
II/Not-I-Fragmentes des T7/crTMV-Vektors inseriert, so daß eine Sac I-IRESMP,75 CR-
GUS-Not-I-, Sac-II-IRESMP,75 UI-GUS-Not-I-, Sac-II-IRESMP,228 CR-GUS-Not-I-, Sac-II-
IRESCP,148 CR-GUS-Not-I-, Sac-II-IRESCP,148 UI-GUS-Not-I- bzw. Sac-II-PL-GUS-Not-I-
cDNS erhalten wurde.
Drittens ein Sac-II-Not-I-cDNS-Fragment des T7/crTMV-Vektors wurde durch ein Sac-I-
IRESMP,75 CR-GUS-Not-I- oder ein Sac-II-IRESMP,75 UI-GUS-Not-I- oder ein Sac-II-
IRESMP,228 CR-GUS-Not-I oder ein Sac-II-IRESCP,148 CR-GUS-Not-I- oder ein Sac-II-
IRESCP,148 UI-GUS-Not-I- oder ein Sac-II-PL-GUS-Not-I-cDNS-Fragment ersetzt, um die
Vektoren T7/crTMV/IRESMP,75 CR-GUS (Abb. 2), T7/crTMV/ IRESMP,75 UI-GUS (Abb. 2),
T7/crTMV/IRESMP,228 CR-GUS (Abb. 2), T7/crTMV/IRESCP,148 CR-GUS (Abb. 2),
T7/crTMV/IRESCP,148 UI-GUS (Abb. 2) bzw. T7/crTMV/PL-GUS (Abb. 2) zu erhalten.
Dieses Beispiel demonstriert die Tobamovirus IRES-vermittelte Expression des GUS-
Gens in Nicotiana benthamiana- und Arabidopsis-thaliana-Pflanzen, die mit den auf dem
crTMV-basierenden Vektoren - Vektor T7/crTMV/IRESMP,75 CR-GUS, (Abb. 2), Vektor
T7/crTMV/IRESMP,75 UI-GUS (Abb. 2), Vektor T7/crTMV/IRESMP,228 CR-GUS (Abb. 2),
Vektor T7/crTMV/IRESCP,148 CR-GUS (Abb. 2), Vektor T7/crTMV/IRESCP,148 UI-GUS
(Abb. 2) bzw. Vektor T7/crTMV/PL-GUS (Abb. 2) - infiziert wurden. Die Plasmide
T7/crTMV/IRESMP,75 CR-GUS (Abb. 2), T7/crTMV/IRESMP,75 UI-GUS (Abb. 2),
T7/crTMV/IRESMP,228 CR-GUS (Abb. 2), T7/crTMV/IRESCP,148 CR-GUS (Abb. 2),
T7/crTMV/IRESCP,148 UI-GUS (Abb. 2) bzw. T7/crTMV/PL-GUS (Abb. 2) wurden mit Not I
linearisiert. Die rekombinanten Plasmide wurden gemäß Dawson et al. (1986 Proc.
Natl. Acad. Sci., USA 83, 1832-1836) in vitro transkribiert. Agarosegelelektrophorese der
RNS-Transkripte bestätigte, daß diese intakt waren. Die RNS-Konzentration wurde
mittels Agarosegelelektrophorese und Spektrophotometrie quantifiziert.
Inokulierte Blätter wurden 10-14 Tage nach der Transfektion mit geschützten (capped)
voll-Länge-Transkripten geerntet. IRES-Aktivität wurde mittels histochemischer
Detektion der GUS-Expression, wie bei Jefferson beschrieben, verfolgt (1987, Plant
Molecular Biology Reporter 5, 387 - 405). Die Proben wurden mit dem kolorimetrischen
GUS-Substrat infiltriert, wobei die Methode von De Block und Debrouwer (1992, Plant J.
2, 261 - 266) folgendermaßen modifiziert wurde, um die Diffusion der intermediären
Produkte der Reaktion zu limitieren: 0,115 M Phosphatpuffer, pH 7,0 versetzt mit 5-
bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (x-Gluc) 600 µg/ml; 3 mM Kaliumhexa
cyanoferrat; 10 mM EDTA. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Blätter
mit 70% Ethanol entfärbt und unter dem Lichtmikroskop untersucht.
Dieses Beispiel zeigt verschiedene Ansätze, um die Möglichkeit der Verwendung des
IRESMP,75 CR-Elementes in einem viralen Vektor für die CAP-unabhängige Expression
eines Gens von Bedeutung zu untermauern.
Um die Länge und die Nukleotidsequenz der 5'-untranslatierten Region des TMV UI und
der crTMV MP subgenomischen RNS (I2sgRNS) zu bestimmen, wurde das Protokoll für
die Primer-Verlängerungsexperimente nach Letho et al. (1990, Virology 174, 145 - 157)
auf folgende Art und Weise geändert: (i) AMV reverse Transkriptase (RT); (ii) RT-
Reaktion bei 45°C; (iii) die GC-reichen Primer; (iv) erhöhte dNTP-Konzentration; (v)
dITP um die Ausbildung von Sekundärstrukturen zu verhindern. Es wurde gezeigt (Abb.
3), daß die 5'-UTR-Sequenz der crTMV I2 sgRNS aus 125 Nukleotiden besteht. Dieses
Ergebnis wurde mittels direkter 5'-UTR-RT-Sequenzierung bestätigt. Abb. 3B
zeigt, daß die crTMV 5'NTR eine stabile hairpin-loop-Struktur enthält. Wenn man diese
in einem künstlichen Transkript aufwärts (upstream) von dem MP-Gen plaziert, wird die
MP-Gen-Translation in vitro inhibiert (Abb. 4). Dieses wiederum bedeutet, daß das
IRESMP,75 CR-Element, das zwischen 5'HI2 und dem MP-Gen lokalisiert ist, eine effiziente
CAP-unabhängige, interne Inititiation der Translation vermitteln kann. Abb. 5 zeigt,
daß auch in anderen Tobamoviren zu 5'HI2 homologe, putative hairpin-loop-Strukturen,
die die Translation inhibieren, in den 125-nt-Sequenzen aufwärts (upstream) des MP-
Gens gefunden werden konnten.
Um die Struktur des 5'-Terminus der subgenomischen RNS zu studieren, die für das 30K-
Bewegungsprotein (MP) von crTMV kodiert, wurde die "Jump-Start"-Methode, die von
Active Motif angeboten wird, benutzt. Jump-StartTM ist die Methode der spezifischen,
chemischen Ligation einer RNS-Markierung an das 5'-Ende von geschützter (capped)
RNS. Während der reversen Transkription wird die Ribooligonukleotid-Markierung einer
bekannten Sequenz in das 3'-Ende der Erststrang-cDNS eingebaut. Diese erzeugt eine
bekannte Priming-Stelle, die für die PCR geeignet ist.
Anfänglich werden die 5'-terminalen 2'-3'-cis-Glykol-Gruppen der geschützten (capped)
RNS in reaktive di-Aldehyde mittels Natriumperjodate-Oxidation umgewandelt. 1 - 2 µl
einer getesteten RNS (1 µg/ml) wurde mit 14 µl reinem Wasser und 1 µl Natriumacetat-
Puffer (pH 5,5) gemischt. Dann wurden 4 µl einer 0,1-M-Natriumperjodat-Lösung
hinzugefügt und das Reaktionsgemisch für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurde
eine 3'-Aminoalkyl-derivatisierte, synthetische Ribooligonukleotid-Markierung chemisch
an die di-Aldehyd-Enden der oxidierten RNS mittles reduktiver Amination in Gegenwart
von Natriumcyanoborhydrid ligiert. 5 µl Natriumhyphosphit wurde hinzugefügt und das
Reaktionsgemisch für 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 23 µl Wasser, 1 µl
Natriumacetat-Puffer (pH 4,5) und 2 µl der ribo-Oligonukleotid-Markierung 5'-
CTAATACGACTCACTATAGGG (28,5 pmol/µl) zu dem Reaktionsgemisch
hinzugefügt und 15 Minuten inkubiert. Dann wurden 10 µl Natriumcyanoborhydrid
zugesetzt und 2 Stunden inkubiert. Anschließend wurden 400 µl einer 2%
Lithiumperchlorat-Aceton-Lösung zugesetzt, 15 Minuten bei -20°C inkubiert und
5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde mit Aceton zweimal gewaschen und in 20 µl
Wasser aufgenommen.
Um überschüssige RNS-Markierung zu entfernen, wurde eine CTAB-Prezipitation in
Gegenwart von 0,3 M NaCl durchgeführt. CTAB ist ein starkes, kationisches Detergens,
das an Nukleinsäuren bindet und unlösliche Komplexe bildet. Die Komplexbildung ist
von der Salzkonzentration abhängig: wenn die Salzkonzentration oberhalb von 1 M liegt,
wird kein Komplex gebildet; im Gegensatz dazu werden bei einer Salzkonzentration
unterhalb 0,2 M alle Nukleinsäuren effizient komplexiert. Bei einer Salzkonzentration
zwischen 0,3 M und 0,4 M ist die Komplexierung von kleinen Einzelstrangnukleinsäuren
sehr ineffizient (Belyavsky et al., 1989 Nucleic Acids Res. 25, 2919 - 2932; Bertiolo et al.,
1994, BioTechniques 16, 1054 - 1058). 10 µl einer 1,2-M-NaCl-Lösung (bis zu einer
Endkonzentration von 0,4 M) und 3 µl einer 10% CTAB-Lösung (bis zu einer
Endkonzentration von 1%) wurden hinzugefügt, das Reaktionsgemisch wurde
15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann für 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet
wurde in 10 µl einer 1,2-M-NaCl-Lösung resuspendiert, 20 µl Wasser und 3 µl einer 10-
%igen CTAB-Lösung zugesetzt. Der Ansatz wurde anschließend 15 Minuten bei
Raumtemperatur inkubiert und dann 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 30 µl
einer 1,2-M-NaCl-Lösung gelöst, 80 µl 96% Ethanol zugesetzt und der Ansatz über
Nacht bei -20°C inkubiert. Darm wurde wiederum für 5 Minuten zentrifugiert und das
Pellet mit 70% Ethanol gewaschen. Zuletzt wurde das Pellet der markierten RNS in 24 µl
Wasser gelöst.
Am Ende resultierte die Transkription mit spezifischen Primern für das 3'-Gen in dem
Einbau der 5'-Markierungssequenz am 3'-Terminus der Erststrang-cDNS. Für die reverse
Transkription wurden 12 µl der markierten RNS, 1 µl der spezifischen Primer vom 3'-
Ende, 4 µl des 5 × Puffers für die SuperScriptTMII (Gibco BRL Life Technologies, 250 mM
Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl2) gemischt, für 30 Sekunden bei 95°C
inkubiert und auf Eis abgekühlt. Anschließend wurde zu dem Reaktionsgemisch 0,5 µl
einer DTT-Lösung (Endkonzentration 1 mM), 2 µl einer 10-mM-dNTP-Lösung, 0,5 µl
RNAsin, 0,5 µl SuperScriptTMII-Enzym zugesetzt und für 15 Minuten bei 42°C inkubiert.
Die Anwesenheit von MgCl2 in dem Reaktionsansatz erlaubt dem SuperScriptIITM-Enzym,
die CAP-Struktur während der reversen Transkription effizienter zu überwinden. Wenn 3 mM
MgCl2 und 2 mM MnCl2 benutzt wurde, konnte in der reversen Transkription eine
außergewöhnlich hohe CAP-abhängige Transferase-Aktivität nachgewiesen werden.
Typischerweise fügte das Enzym vorzugsweise in der Anwesenheit von 5'-geschützter
(capped) RNS als Template drei oder vier Cytosinreste an (Chenchik et al., 1998, Gene
cloning and analysis by RT-PCR, herausgegeben von Paul Siebert und James Larrik,
BioTechniques Books, Natick, MA; Schmidt und Mueller, 1999, Nucleic Acids Res. 27,
331).
Für die PCR-Reaktion wurden zwei Sätze von Primern für jede getestete RNS benutzt:
3'-spezifische/5'-spezifische Primer und 3'-spezifische/Markierung- spezifische Primer
(Abb. 6).
Als positive Kontrolle für die Methode der spezifischen, chemischen Ligation einer
Markierung mit bekannter Sequenz an die CAP-Struktur einer viralen RNS wurde die
genomische RNS des Tabak-Mosaik-Virus (TMV, Stamm U1), von der man weiß, daß
sie mit einer CAP-Struktur versehen ist (Dunigan und Zaitlin, 1990, J. Biol. Chem. 265,
7779-7786), eingesetzt. Die zugehörigen PCR-Banden wurden detektiert, wenn
spezifische Primer, wie U1-Spn und der RNS-Markierung entsprechende Primer 779 in der
PCR-Reaktion benutzt wurden (Tabelle 2, Abb. 7).
Als eine Kontrolle wurde das nichtgeschützte (non-capped) RNS-Transkript des
kompletten cDNS-Klons von TMV (U1) eingesetzt. Wie erwartet, wurde keine CAP-
Struktur gefunden (Tabelle 2, Abb. 7). Dann wurde die Anwesenheit einer CAP-Struktur
am 5'-Ende der genomischen RNS von crTMV ausgetestet. Für diese Experiment wurden
die spezifischen PCR-Primer K5, 2PM und der Primer 779, der der RNS-Markierung
entspricht, verwendet (Tabelle 2, Abb. 7). Interessanterweise war die Mobilität der PCR-
Bande, die mit den Primern 779 und 2PM beobachtet wurde, größer als erwartet (Fig. 7).
Dieses könnte die Anwesenheit einer starken Sekundärstruktur am 5'-Ende der
genomischen RNS von crTMV (Dorokhov et al., 1994, FEBS Letters 350, 5 - 8)
reflektieren. Diese Sekundärstruktur fehlt an den 5'-terminalen Teilen von verwandten
TMVs (Goelet et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5818-5822). In
Kontrollexperimenten mit nicht geschützten (non-capped) Transkripten des kompletten
cDNS-Klons von crTMV wurde wie erwartet keine entsprechende PCR-Bande
beobachtet.
Für subgenomische RNS, die für das TMV (U1) MP-Gen kodiert, wurde angenommen,
das sie keine CAP-Struktur am 5'-Ende aufweist. Wir testeten die entsprechende sgRNS
mit den spezifischen Primern 2211, UM50 - 54 und Primer 779, der der RNS-Markierung
entspricht. Es wurde keine CAP-Struktur gefunden, Tabelle 2, Abb. 7).
Die gleichen Resultate wurden mit der entsprechenden, subgenomischen RNS von crTMV
(Tabelle 2, Abb. 7) erhalten. Dies zeigt, daß auch im Fall dieser subgenomischen RNS
des Tobamovirus keine CAP-Struktur am 5'-Ende vorhanden ist.
Der KK6-Vektor (Lehto et al., 1990, Virology 174, 145-157) enthält zwei sub
genomische Promortoren (sgPr) für das CP-Gen. Der erste CP-sgPr-1 liegt aufwärts
(upstream) des CP-Gens an einer passenden Stelle, während der zweite CP-sgPr-2
aufwärts (upstream) des MP-Gens angeordnet ist. Es konnte gezeigt werden, daß das
MP-Gen mit Hilfe des CP-sgPr-2 anstelle des nativen MP-sgPr exprimiert wurde.
Resultierend aus dieser Insertion verlor der KK6-Vektor seine Fähigkeit, sich effizient
von einer Zelle zur anderen zu bewegen. Analysen zeigten, daß die I2 sgRNS kein
IRESMP,75 CR-Element in der 5'-untranslatierten Region enthielt. Es wurde deswegen
angenommen, daß von der I2 sgRNS des KK6-Vektors das MP-Gen ohne IRESMP,75 CR-
Element nicht effizient exprimiert werden kann. Um diese Annahme zu überprüfen,
wurde das IRESMP,75 CR-Element zwischen den CP-sgPr-2 und dem MP-Gen in den KK6-
Vektor inseriert, so daß ein KK6-IRESMP,75-Vektor erzeugt 22844 00070 552 001000280000000200012000285912273300040 0002010049587 00004 22725 wurde, der in der
Nachkommenschaft stabil propagiert werden konnte (Abb. 8). Es konnte gezeigt werden,
daß der KK6-IRESMP,75-Vektor für die Synthese einer I2 sgRNS verantwortlich ist, die
das crTMV-IRESMP,75-Element enthält (Abb. 9). Es konnte ebenfalls gezeigt werden,
daß der Transkriptionsstart der I2 sgRNS aus dem KK6-IRESMP,75-Vektor im Vergleich
zum KK6-Vektor ohne IRESMP,75 CR-Element nicht verändert ist. Dieses bedeutet, daß das
IRESMP,75 CR-Element nicht als sgPr für das MP-Gen dient.
Diese Insertion verbesserte drastisch die Verbreitung des Virus von Zelle zu Zelle. Der
KK6-Vektor infizierte Nicotiana tabacum L. cv Samsun-Pflanzen systemisch. Die
Pflanzen zeigten allerdings im Vergleich zum Wildtyp-TMV (TMV 304), bei dem
ungefähr nach sieben Tagen die ersten Symptome sichtbar waren, erst nach 15 bis
17 Tagen erste Infektionssymptome. Die Symptome in den oberen Blättern der mit dem
KK6-Vektor infizierten Pflanzen waren deutlich als gelbe Flecken sichtbar, während der
Wildtyp-TMV Mosaik-Symptome erzeugte.
Die KK6-Virus-Nachkommenschaft erzeugte zahlreiche Verletzungen in N. glutinosa, die
sich langsamer entwickelten als die Verletzungen des Wildtyp-TMV UI. Die
durchschnittliche Größe der lokalen Verwundungen, die durch den KK6-Virus verursacht
wurden, war 0,1 mm. Im Vergleich dazu erreichten die lokalen Verwundungen des
Wildtyp-TMV UI eine Größe von 1,1 mm. Pflanzen, die mit dem KK6-IRESMP,75-Vektor
inokuliert wurden, sahen wie Pflanzen aus, die mit dem KK6-Vektor infiziert wurden. Sie
unterschieden sich aber dahingehend, daß (i) sich die ersten systemischen Symptome
schneller entwickelten (ungefähr nach 10 Tagen) und (ii) sie wesentlich heller in Bezug
auf die gelben Flecken und das Mosaik waren. Im Gegensatz zu dem KK6-Vektor war
die durchschnittliche Größe der lokalen Verwundungen, die durch K86 in N. glutinosa
erzeugt wurden, auf 0,6-0,7 mm erhöht. Die Überprüfung des zeitlichen Verlaufs der MP-
Akkumulation zeigte, daß das KK6-IRESMP 75-MP früher als das KK6-MP in den
inokulierten Blättern detektiert werden konnte (Abb. 10). Dieses Resultat erlaubte den
Schluss, daß die Insertion des IRESMP 75 CR-Elementes aufwärts (upstream) des KK6-MP-
Gens teilweise die Ausbreitungseigenschaften des KK6-Virus, der in dem Transport von
Zelle zu Zelle und in dem Langdistanztransport Defekte zeigte, wiederherstellt. Um
weitere Beweise für die essentielle Rolle der IRES-Elemente in der CAP-unabhängigen
MP-Gen-Expression in den TMV-cDNS-Vektoren und in dem Lebenszyklus von
Tobamoviren zu erhalten, wurden Serien von zusätzlichen, auf dem KK6-Vektor
basierenden Vektoren konstruiert (Abb. 8). Der KK6-IRESMP 125-Vektor enthält eine
natürliche Hairpin-Loop-Struktur, die in der Lage ist, die Translation des MP-Gens in
vitro in der Gegenwart der 5'-untranslatierten Region der I2sgRNS von WTcrTMV zu
inhibieren. Desweiteren enthält der IRESMP 75-KK6-H-PL-Vektor eine natürliche
Hairpin-Loop-Struktur und eine 72-nt lange, künstliche Polylinkersequenz. KK6-PL
enthält nur die Polylinker-Region. Die Resultate der Infektionsexperimente mit Nicotiana
tabacum cv. Samsun (systemischer Wirt) sind in Tabelle 3 gezeigt.
Abb. 11 zeigt die Resultate der Western-Analysen in bezug auf die CP-
Akkumulation in den Tabak-Blättern, die mit den KK6-basierenden Vektoren infiziert
wurden. Ersatz des IRESMP,75 CR-Elementes durch eine nicht funktionale PL-Sequenz
blockierte drastisch die Vektor-Multiplikation.
Das Ziel dieses Beispiels ist es, die Ansätze für die Herstellung von künstlichen, nicht
natürlichen IRES-Elementen, die keine subgenomische Promotor-Aktivität aufweisen
und die in eukaryotischen Zellen die CAP-unabhängige Expression von Genen mit
Bedeutung ermöglichen, zu zeigen.
Die Analyse der IRESMP,75 CR-Nukleotidsequenz zeigt, daß dieses Element eine multimere
Struktur hat und vier Nukleotidsequenz-Segmente mit einer Variation des Elementes (-
72)GUUUGCUUUUUG(-61) enthält, die komplementär zu der 18S rRNS aus
Arabidopsis thaliana ist (Abb. 12).
Um ein künstliches, nicht natürliches IRES-Element zu gestalten, wurde die 18-nt-
Sequenz CGUUUGCUUUUUGUAGUA ausgewählt. Vier Oligonukleotide wurden
synthetisiert:
Primer MP1(+) und MP1(-) wurden mit einander hybridisiert, so daß das dsDNS-
Fragment A enstand:
Primer MP2(+) und MP2(-) wurden mit einander hybridisiert, so daß das dsDNS-
Fragment B enstand:
Beide Fragmente wurden mit Pst I verdaut und miteinander ligiert. Dann wurde das
Ligationprodukt A + B mittels Agarosegelelektrophorese extrahiert und mit Hind III und
EcoR I verdaut. Anschließend wurde dieses Fragment in den hGFP-GUS-Vektor, der bei
Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139 - 154) beschrieben ist, mit Hilfe der Hind III-
und EcoR-I-Klonierungstellen subkloniert (Abb. 13).
Die Transkripte, die in Abb. 13 dargestellt sind, wurden in dem Lysat von
Kaninchen-Reticulozyten (RRL), wie bei Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139-154)
beschrieben, translatiert. Die Syntheseprodukte wurden mittels Gelelektrophorese
analysiert. Die Resultate, die in Abb. 13 dargestellt sind, zeigen, daß eine
künstliche, nicht natürliche Sequenz, die auf dem 18-nt-Segment des IRESMP,75 CR-
Elementes basiert, die Expression des 3'-proximal lokalisierten GUS-Gens vermittelt.
Dies bedeutet, daß zwei Eigenschaften zum einen die zu der 18S rRNS komplementäre
Sequenz und zum anderen die multimere Struktur notwendig für die IRESMP,75 CR-
Funktion ist. Ein Tetramer von 18-nt-Segmenten erreicht nicht das Aktivitätsniveau des
IRESMP,75 CR-Elementes. Es gibt aber einen Weg, die Aktivität des künstlichen, nicht
natürlichen IRES-Elementes zu verbessern, indem man das 12-nt-Segment
GCUUGCUUUGAG, das komplementär zu der 18S rRNS ist, verwendet.
Analysen der Strukturelemente, die notwendig für die IRESCP,148 CR-Element-Aktivität
(Abb. 14 - 17) sind, zeigen, daß ein Polypurin (PP)-Segment entscheidend für die
IRESCP,148 CR-Funktion ist. Als ein markantes Element dieses PP-Segmentes wurde eine
direkte Wiederholung einer 9-nt-Sequenz in der 19-nt-Sequenz gefunden:
AAAAGAAGGAAAAAGAAGG (direct repeat (DR)).
AAAAGAAGGAAAAAGAAGG (direct repeat (DR)).
Diese Sequenz wurde für die Konstruktion eines künstlichen IRES-Elementes benutzt.
Um ein Tetramer der DR-Sequenz zu erhalten, wurden folgende Primer benutzt:
Gemäß der zuvor beschriebenen Methode wurde folgendes IRES-Element als
intercistronischer Spacer verwendet:
Die Transkripte, die in Abb. 13 dargestellt sind, wurden in dem Lysat von
Kaninchen-Reticulozyten (RRL), wie bei Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139-154)
beschrieben, translatiert. Die Syntheseprodukte wurden mittels Gelelektrophorese
analysiert. Die Resultate, die in Abb. 13 dargestellt sind, zeigen, daß eine künst
liche, nicht natürliche Sequenz, die auf den sich wiederholenden 19-nt-Segmenten des
IRESCP,148 CR-Elementes basiert, die Expression des 3'-proximal lokalisierten GUS-Gens
vermittelt.
Das Hauptziel dieses Beispiels war die Erzeugung von zwei neuen, auf dem TMV U1-
basierenden Viren mit einer modifizierten 5'UTR, die die CAP-unabhängige
Expression des Replikasegens erlaubt:
- 1. Omega-Leader des TMV wurde komplett durch das IRESMP,75 CR-Element ersetzt:
- 2. Weil man davon ausgeht, daß die ersten 8 Nukleotide der TMV 5'UTR notwendig
für die Virusreplikation sind (Watanabe et al., 1996, J. Gen. Virol. 77, 2353 -
2357), wurde das IRESMP,75 CR-Element in die TMV 5'UTR inseriert, wobei die
ersten 8 Nukleotide intakt gelassen wurden:
Die folgenden Primer wurden verwendet:
- a) SP6-IRES-1 (in dem Fall der ersten Variante)
- b) SP6-IRES-2 (in dem Fall der zweiten Variante)
- c) IRES-Nco I (reverse Primer, um IRES mit einer Nco-I-Restriktionsstelle am 3'-
Ende zu erhalten)
GGGCCATGGTCAAACAAAGAACAAATCTCTAAAC - d) nTMV-Nco I (direkter Primer zur Gewinnung der TMV-Polymerase; Start:
NCOI-Schnittstelle):
- e) TMV-Xho (reverser Primer zur Gewinnung des 5'-Bereiches der Replikase; vom
AUG-Codon bis zur Sph-I-Schnittstelle)
Das PCR-Fragment A wurde durch die Verwendung der Primer
SP6-IRES1 und IRES-NcoI auf dem Vektor crTMV als Template hergestellt. Das PCR-
Fragment B wurde durch die Verwendung der Oligonukleotide TMV-NcoI und TMV-
XhoI sowie dem Klon TMV-304L erzeugt. Die Fragmente A und B wurden (unter
Verwendung von Xba-I- und Xho-I-Schnittstellen) gleichzeitig in den Vektor pBlueskript
SK+ kloniert. Die Ligation der Fragmente erfolgte durch eine Nco-I-Schnittstelle.
Derselbe Ansatz wurde angewandt, um die zweite Variante des Virus durch die Ver
wendung des Oligonukleotids SP6-IRES2 zu erhalten.
Im nächsten Schritt wurde die gesamte TMV cDNS in den erhaltenen Vektor kloniert.
Sph-I- und Kpn-I-Schnittstellen wurden dazu verwendet, das virale Genom wieder
herzustellen (Abb. 18).
Das wichtigste Ziel dieses Beispiels ist es, die Klonierungsstrategie eines neuen crTMV-
basierenden Vektors, mit dem virale Genexpression in Pflanzenzellen unter der Kontrolle
eines effizienten Actin-2-Promotors auftritt, zu demonstrieren. Die Verwendung des
Vektors Act2/crTMV/IRESMP,75 CR-GUS zur Genexpression in Pflanzen wird damit
möglich.
Der Act2-Transkriptionspromotor (ca. 1000 bp) wurde aus dem Plasmid pACRS029
durch Restriktion mit den Enzymen Kpn I und Pst I geschnitten.
Ein 334-Nukleotid großes Fragment des 5'-endständigen Teils des crTMV-Genoms
wurde durch PCR hergestellt. Dabei wurden der in direkter Orientierung vorliegende
Primer ATGCTGCAGGTTTTAGTTTTATTGCAACAACAA (Pst-I-Schnittstelle ist
unterstrichen) und der in reverser Orientierung vorliegende Primer ATGCGATCGAA
GCCACCGGCCAAGGAG TGCA (Pvu-I-Schnittstelle ist unterstrichen) verwendet. Das
Fragment wurde mit Pvu I und Pst I geschnitten und in pUC 19Act2 zusammen mit dem
Teil des crTMV-Genoms eingefügt (Pvu-I-Spe-I-Fragment).
Das Act2 beinhaltende Konstrukt wurde in das Plasmid T7crTMV nach Restriktion mit
KpnI/SpeI kloniert.
Dieser Schritt wurde mittels ortsgerichteter (site-directed) Mutagenese ausgeführt. Dabei
wurden Oligonucleotid-Primer verwendet, die spezifisch für Act2 und crTMV sind. Mit
ihnen konnte das endgültige Konstrukt Act2/crTMV (Abb. 19) hergestellt werden. Um
den Vektor Act2/crTMV/IRESMP,75 CR-GUS zu erhalten (Abb. 20), wurde das Spe-I-Not-I-
cDNS-Fragment des Plasmids Act2/crTMV (Abb. 19) durch das Spe-I-Not-I-DNS-
Fragment aus T7crTMV/IRESMP,75 CR-GUS ersetzt (Abb. 2). Dieses beinhaltet das GUS-
Gen unter der Kontrolle von IRESMP,75 CR.
Das wichtigste Ziel dieses Beispiels ist es, die Möglichkeit aufzuzeigen, unter
Verwendung von DNS-Vektoren, die aus ringförmiger Einzelstrang-DNS bestehen,
Fremdgene in Pflanzen zu exprimieren.
Um das Konstrukt KS/crTMV/IRESMP,75 CR-GUS (Abb. 21) herzustellen, wurde ein 9,2 kb
großes Kpn-I-Not-I-cDNS-Fragment des Vektors Act2/crTMV/IRESMP,75 CR-GUS in das
Plasmid pBluescipt II KS+ (Stratagene) inseriert. Der Zielvektor wurde mit Kpn I-Sal I
gespalten und beinhaltet den Replikationsstartpunkt (origin) des Phagen f1. Einzelstrang-
DNS des Vektors KS/Act2/crTMV/IRESMP,75 CR-GUS wurde nach Sambrook et al., 1989
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Habor Laboratory,
Cold Spring Habor, New York) hergestellt.
Das wichtigste Ziel dieses Beispiels ist die Herstellung des Vektors KS/Act2/crTMV/
IRESMP,75 CR-GUS, der das Oleosingen-Intron aus Arabidopsis thaliana besitzt. Dieses
Intron soll nach dem Trankriptionsprozess entfernt werden (Abb. 22).
Die Klonierung setzt sich aus folgenden Schritten zusammen:
Das Intron des Oleosin-Gens aus A. thaliana wurde mittels PCR amplifiziert. Hierzu
wurden folgende spezifische Primer verwendet: A.th./Int (direct)
ATGCTGCAGgttttagttCAGTAAGCACACATTTATCATC (Die Pst-I-Schnittstelle ist
unterstrichen, kleine Buchstaben markieren die crTMV-5'-endständige Sequenz). Beim
zweiten verwendeten Primer handelt es sich um A.th/Int (reverse):
ATGAGGCCTGGTGCTCTCCCGTTGCGTACCTA (Stu-I-Schnittstelle ist unterstrichen).
cDNS, die das Intron des Oleosin-Gens von A. thaliana besitzt, wurde mit Pst I/Stu I
restringiert und mit einem PCR-Fragment ligiert, das über PCR-Amplifikation durch die
Verwendung folgender Primer gewonnen wurde: Primer 1: atgAGGCCTTTATTG
CAACAACAACAACAAATTA (Die Stu-I-Schnittstelle ist unterstrichen). Primer 2:
ATGCGATCGAAGCCACC GGCCAAGGAGTGCA (Die Pvu-I-Schnittstelle ist unter
strichen). Die Primer entsprechen den Positionen 10 - 334 des crTMV-Genoms.
Die nächsten Schritte sind im Beispiel 7 beschrieben.
Mit diesem Beispiel soll demonstriert werden, daß es grundsätzlich möglich ist,
Inhibitoren der CAP-abhängigen Translation einzusetzen, um die Effizienz der IRES-
vermittelten, CAP-unabhängigen Translation eines Gens von Interesse zu erhöhen.
Als Inhibitor der CAP-abhängigen Initiation der Translation wurde Rapamycin
ausgewählt. Kürzlich wurde ein neuartiger Repressor der CAP-vermittelten Translation,
der als 4E-BP1 (eIF-4E-bindendes Protein) oder PHAS-1 bezeichnet wurde,
charakterisiert (Lin et al., 1994, Science 226, 653-656; Pause et al., Nature 371, 762 -
767). 4E-BP1 ist ein hitze- und säurestabiles Protein, dessen Aktivität durch
Phosphorylierung reguliert wird (Lin et al. 1994 Science 226, 653-656; Pause et al.,
Nature 371, 762 - 767). Die Wechselwirkung von 4EBP1 mit eIF-4E führt zu einer
spezifischen Inhibierung von CAP-abhängiger Translation, sowohl in vitro als auch in
vivo; Pause et al., Nature 371, 762 - 767). Es wurde gezeigt, daß Rapamycin die
Dephosphorylierung und damit die Aktivierung von 4E-BP1 (Beretta et al. 1996, EMBO
J. 15, 658 - 664) induziert.
Die Herstellung eines Vektors 35S/CP/IRESMP,75 CR/GUS (Abb. 23) bzw. 35S/GUS/
IRESMP,75 CR/CP (Abb. 24), die IRES- und GUS-Sequenzen beinhalten und eine Methode
zur Transfektion von Protoplasten mit einer 35S-basierenden cDNS wurden von
Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139-154) beschrieben. Der Vergleich der
Expression der GUS-Gene in Tabak-Protoplasten, die mit Rapamycin behandelt wurden
und mit bicistronischer cDNS transfiziert wurden, die ein GUS-Gen in 3'- und 5'-
proximalen Positionen besitzen, verdeutlicht, daß es möglich ist, die IRES-vermittelte,
CAP-unabhängige Translation zu erhöhen.
Dieses Beispiel verdeutlicht die grundsätzliche Möglichkeit der Verwendung eines
Genproduktes zur Inhibierung der CAP-abhängigen Translation (Abb. 25). Kürzlich
wurde über die Wechselwirkung zwischen dem viralen Protein, das an das Genom des
Rübenmosaikvirus und dem eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor eIF (iso)4E von
Arabidopsis thaliana gekoppelt ist, berichtet (Wittman et al., 1997, Virology 234, 84 - 92).
Die Interaktions-Domäne von VPg wurde in einen Bereich von 35 Aminosäuren kartiert.
Der Austausch von Asparaginsäureresten in dieser Region verhinderte den Prozeß
vollständig. Das CAP-Analogon m7GTP, jedoch nicht GTP, inhibiert die Bildung des
Komplexes aus VPg und eIF(iso)4E. Dies deutet darauf hin, daß VPg und die zellulären
mRNSs um die Bindungen an eIF(iso)4E konkurrieren (Leonard et al., 2000, J. Virology
74, 7730 - 7737). Die Fähigkeit von VPg, an eIF(iso)4E zu binden, kann zur Inhibition der
CAP-abhängigen Translation verwendet werden. Wir schlagen vor, den Vektor 35S/CP-
VPg/IRESMP,75 CR/GUS (Abb. 25) zu verwenden. In diesem Vektor ist das Hüllprotein mit
VPg des Potyvirus Kartoffevirus A fusioniert. Der Vergleich der Expression des GUS-
Gens in Protoplasten, die mit 35S/CP-VPg/IRESMP,75 CR/GUS oder 35S/CP/IRESMP,75 CR/GUS
transfiziert wurden, erlaubt die Erhöhung der IRES-vermittelten und CAP-
unabhängigen Expression des GUS-Gens.
In diesem Beispiel wird die Möglichkeit aufgezeigt, genetische in-vivo-Selektionen oder
die systematische Entwicklung von Liganten durch exponentielle Anreicherung (SELEX,
Systematic Evolution of Ligants by Exponential enrichment) eines subgenomischen
Promoters oder einer IRES-Sequenz, die CAP-unabhängige Expression eines Gens von
Interesse in einem Vektor gewährleistet, durchzuführen. In diesem Ansatz wird eine side-
by-side-Selektion einer großen Anzahl von zufälligen Sequenzen ebenso wie die
Erzeugung von Sequenzen angewandt (Ellington und Szostak, 1990, Nature 346, 818 -
822; Tuerk and Gold, 1990, Science 249, 505 - 510; Carpenter und Simon, 1998, Nucleic
Acids Res. 26, 2426 - 2432).
Das Projekt schließt ein:
- 1. In-vitro-Synthese von crTMV-basierenden defective-interfering(DI)-Trans kripten, die folgende Elemente beinhalten (5'-3'-Richtung): (i) Ein T7- Transkriptionspromoter, (ii) ein 5'-endständiger Teil des crTMV-Genoms mit einer Sequenz, die für die Synthese des komplementären (minus-) Strang des viralen Genoms verantwortlich ist, (iii) eine Sequenz die für einen N- endständigen Teil der viralen Replikase kodiert, (iv) eine Sequenz, die 75 zufällige Basen beinhaltete, (v) ein Gen für die Neomycinphosphotransferase II (NPTII), (vi) ein crTMV-Startpunkt des viralen Zusammenbaus (origin of assembly, Oa), und (vii) ein 3'-endständiger Teil des crTMV-Genoms mit einer Promotorsequenz für den Minus-Strang (Abb. 26).
- 2. Kotransfektion von Tabak-Protoplasten mit einem Transkript und genomischer RNS von crTMV (Abb. 1). Die Protoplasten wachsen und regenerieren auf einem Kanamycinhaltigen Medium.
- 3. Selektion und Isolierung einer IRES-Sequenz oder eines subgenomischen Promotors, die es den Protoplasten ermöglicht, zu überleben und in Anwesenheit von Kanamycin zu regenerieren.
Claims (24)
1. Vektor, der sich in einer Pflanze amplifizieren und ein Gen exprimieren kann, der
eine Nukleinsäure mit einer Sequenz für mindestens ein zu exprimierendes,
nichtvirales Gen umfasst, und der mindestens ein IRES-Element besitzt oder dafür
kodiert, welches für die Translation eines von ihm stromabwärts gelegenen Gens
notwendig ist.
2. Der Vektor entsprechend Anspruch 1, wobei das IRES-Element stromaufwärts von
dem zu exprimierenden, nichtviralen Gen liegt, um direkt seine Translation zu
unterstützen.
3. Der Vektor entsprechend Anspruch 1 oder 2, wobei das IRES-Element indirekt die
Translation des zu exprimierenden, nichtviralen Gens unterstützt, indem es direkt die
Tranalation eines anderen Gens unterstützt, das stromabwärts von dem IRES-Element
liegt und das für eine Funktion des Vektors essentiell ist, wobei die Funktion
ausgewählt ist aus der Gruppe Infektion, Amplifikation und Ausbreitung des Vektors
von Zelle zu Zelle oder über weite Distanzen (cell-to-cell or long distance
movement).
4. Der Vektor entsprechend einem der Ansprüche 1-3, der zusätzlich mindestens den
Teil einer Sequenz des Wirtsgenoms in Gegensinn(antisense)-Orientierung zur
Suppression eines Gens in der Wirtspflanze besitzt.
5. Der Vektor entsprechend Anspruch 4, wobei die Sequenz in Gegensinn-Orientierung
ein Gen supprimiert, das für die CAP-abhängige Translation in Pflanzen essentiell ist.
6. Vektor, der sich in einer Pflanze amplifizieren kann und eine Nukleinsäure umfasst,
die für mindestens ein IRES-Element kodiert oder mindestens ein solches aufweist,
das für die Translation eines Gens, das für die Amplifikation des Vektors notwendig
ist und stromabwärts des IRES-Elements gelegen ist, wobei der Vektor weiterhin
mindestens einen Teil einer Sequenz des Wirtspflanzengenoms in Gegensinn-
Orientierung umfasst, um ein Gen der Wirtspflanze zu supprimieren.
7. Der Vektor entsprechend einem der Ansprüche 1-6, der von einem Pflanzenvirus
abstammt.
8. Der Vektor entsprechend einem der Ansprüche 1-7, wobei der Vektor ein Gen
umfasst, das für ein Protein kodiert, welches die Ausbreitung des Vektors von Zelle
zu Zelle oder über weite Distanzen (cell-to-cell or long distance movement)
vermittelt.
9. Der Vektor entsprechend einem der Ansprüche 1-8, der für ein Protein oder für
Proteine kodiert, die eine Funktion bei der Amplifikation haben.
10. Der Vektor entsprechend einem der Ansprüche 1-9, bei dem das IRES-Element von
einem Pflanzenvirus abstammt.
11. Der Vektor entsprechend einem der Ansprüche 1-9, wobei das IRES-Element
synthetischen Ursprungs ist.
12. Der Vektor entsprechend Anspruch 11, wobei das IRES-Element ein Multimer eines
Segments eines natürlichen IRES-Elementes ist oder ein solches Multimer umfasst.
13. Der Vektor entsprechend Anspruch 11, wobei das IRES-Element ein Multimer von
mindestens einer Sequenz ist oder ein solches Multimer umfasst, wobei die Sequenz
im wesentlichen komplementär zu einem IRES-bindenden Segment einer natürlichen
18S rRNA ist.
14. Der Vektor entsprechend einem der Ansprüche 1-13, wobei die Translation von
einem oder mehreren Genen, die von besagtem Vektor kodiert werden, CAP-
unabhängig ist.
15. Pro-Vektor mit einer Sequenz, die von der Nukleinsäure-prozessierenden Maschinerie
der Wirtspflanze prozessiert wird, um einen Vektor gemäß den Anprüchen 1-14 zu
erhalten.
16. Pro-Vektor, der mit Hilfe von Standardmethoden der Molekularbiologie in vitro oder
in vivo zu einem Vektor gemäß einem der Ansprüche 1 - 15 umgewandelt werden
kann.
17. Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 1-14 zur Bestimmung der
Funktion eines Strukturgenes.
18. Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 1-14 zur Produktion eines
Proteins.
19. Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 1-14 zur Erzeugung eines
Merkmals in der Wirtspflanze.
20. Die Verwendung entsprechend einem der Ansprüche 17-19, wobei die Pflanze mit
einem Mittel behandelt wird, das die CAP-abhängige Translation inhibiert.
21. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18-20, wobei der Vektor auf Pflanzen
oder Teile von Pflanzen auf einem landwirtschaftlichem Feld aufgebracht wird.
22. Genexpressionssystem, umfassend den Vektor oder Pro-Vektor, entsprechend einem
der Ansprüche 1-16 und eine natürliche oder gentechnologisch modifizierte Pflanze,
die die Amplifikation und Expression des Vektors unterstützt.
23. Das System entsprechend Anspruch 22, wobei das Pflanzengenom Gene umfasst, die
für zumindest eine der Funktionen, ausgewählt aus Infektion, Amplifikation, und
24. Methode zur Erzeugung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 1-16, wobei das
IRES-Element mittels gerichteter Evolution (directed evolution), ausgehend von einer
randomisierten Nukleotidsequenz durch Auswahl von IRES-Elementen, die für die
Translation eines stromabwärts des IRES-Elements gelegenen Reportergens nötig
sind, hergestellt wird.
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