DE10049587A1 - Vektorsystem für Pflanzen - Google Patents

Abstract

Diese Erfindung beschreibt Amplifikationsvektoren für Pflanzen, die zusätzliche pflanzenspezifische internal ribosome entry site (IRES)-Elemente enthalten, welche die polycistronische und CAP-unabhängige Translation erlauben von a) heterologen Genen, b) gesamten viralen Genomen und c) viralen subgenomischen RNAs. Die beschriebenen IRES-Elemente sind pflanzenviralen Ursprungs, werden aus anderen Organismen isoliert, oder sie werden mittele Engineering unter Verwendung verschiedener synthetischer Methoden erhalten. Diese IRES-Elemente und diese heterologen Gene werden in Amplifikationsvektoren insertiert und erlauben die Expression der heterologen Gene in Abwesenheit zusätzlicher viraler Promotoren. Insbesondere wird die Expression durch CAP-unabhängige Translation erreicht.

Description

ALLGEMEINES GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft einen Vektor, der zur Amplifikation, zur Expression und/oder zur Suppression eines Gens in einer Pflanze fähig ist. Die Erfindung beinhaltet die Verwendung des Vektors sowie dessen Herstellungsmethode und einen Vor-Vektor, der zur Herstellung des besagten Vektors benötigt wird.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Vektoren, die zur gentechnologischen Veränderung von Pflanzen verwendet werden, eignen sich ausgezeichnet zur Produktion von Proteinen in Pflanzen, zur Veränderung von Pflanzeneigenschaften sowie zur Unterdrückung (Suppression) von Genen der Wirtspflanze. Darüber hinaus ist die Bestimmung von Genfunktionen möglich. Das gilt insbesondere für Gene, die mit Hilfe der Methoden der Genomforschung (Genomics) identifiziert wurden.

Vektoren, die zur gentechnologischen Veränderung von Pflanzen verwendet werden können, sind seit längerem bekannt. Dazu gehören insbesondere virale Vektoren. Diese müssen die Fähigkeit besitzen, die Wirtspflanze zu infizieren sowie sich in ihr zu vermehren und auszubreiten. Man unterscheidet zwischen der Bewegung der Viren von Zelle zu Zelle sowie über weitere Distanzen (long distant movement). Die Viren müssen zudem mindestens eine Sequenz zur Genexpression oder zur Gensuppression besitzen. Bereits vorhandene Vektoren basierten auf der Verwendung subgenomischer Promotoren als Elemente der Transkription. Der Effekt eines subgenomischen Promotors besteht darin, daß ein Teil von ihm als Startpunkt der Transkription die Generierung kürzerer RNS-Fragmente bewirkt. Somit wird die Translation eines Gens, das sich abwärts (downstream) des genomischen Promotors befindet, durch die pflanzliche Tranlations­ maschinerie ermöglicht. Die Translation wird ggf. CAP-abhängig fortgesetzt. Diese Art der multiplen Transkription ist allerdings kinetisch unvorteilhaft, da ein Teil der Replikaseaktivität (für Produktion zusätzlicher subgenomischer RNSs) verschwendet wird.

Die genannten Vektoren haben weitere Nachteile. Durch die Einführung eines subgenomischen, viralen Promotors in eine Vektorsequenz wird diese verlängert. Dies führt zu einer Verringerung der Effizienz des Systems. Darüber hinaus führt die Anwesenheit mehrerer identischer oder ähnlicher, subgenomischer Promotoren, die dem pflanzlichen Transkriptionsysstem angepaßt sind, regelmäßig zu Rekombinations­ ereignissen, aufgrund derer es zu Sequenzinstabilität und zum Verlust von Sequenz­ bereichen kommen kann. Die Verwendung von Promotoren, die sich in ihrer Sequenz signifikant unterscheiden, führt zu einer Verringerung der Rekombinationshäufigkeit. Indes werden solche Promotoren nicht effektiv vom Transkriptionssystem erkannt, was ebenfalls die Effizienz des Systems verringert. Zudem sind (diese) Vektoren im allgemeinen hochkomplexe Einheiten, die mehrere unabhängige Funktionselemente sowie eine hohe Gendichte beinhalten. Aufgrund dessen erwies sich die Verwendung (dieser) Vektoren bei Benutzung heterologer Gene oder ähnlicher Sequenzen als unvorteilhaft und führte regelmäßig zu unerwünschten Resultaten. Dies machte sich sowohl bei der Fähigkeit zur Pflanzeninfektion als auch bei der Effizienz der Genexpression bemerkbar. Darüber hinaus muß der verfügbare Raum für die Promotoren üblicherweise "erzwungen" werden, wenn es zu Sequenzüberlappungen mit weiter aufwärts (upstream) gelegenen Genen kommt.

Aus den genannten Gründen wurde ein Vektor zur gentechnologischen Manipulation von Pflanzen erzeugt, der seine Funktionen in Wirtspflanzen stabil und effektiv ausüben kann. Ein weiteres Ziel besteht darin, einen Vektor zur Verfügung zu stellen, der zur hohen Expression eines Gens in einer Pflanze in der Lage ist.

Entgegen den Erwartungen konnten diese Ziele mit einem Vektor erreicht werden, der einerseits in der Lage ist, sich in einer Pflanze zu vermehren und andererseits ein Gen exprimiert, dessen Nukleinsäuresequenz mindestens ein nichtvirales Gen beinhaltet. Darüber hinaus besitzt der Vektor eine IRES-Sequenz oder kodiert für eine solche, die zur Translation eines Gens, das abwärts (downstream) von ihr liegt, notwendig ist.

Es wurde kürzlich vorgeschlagen (WO 98/54342), ein Pflanzen-IRES-Element in einem rekombinanten DNS-Molekül zu verwenden, das (nach Integration in das Wirtsgenom) ausschließlich die Funktion der Genexpression ausübt. Die Expressionshöhe erwies sich jedoch als gering. Die genauen Gründe für diese niedrige Expression sind unklar. Auf jeden Fall ist die Expression auf die Zahl der transformierten Zellen beschränkt. Daraus folgt eine extrem geringe Expressionseffizienz in der gesamten Pflanze.

Entgegen den Erwartungen konnte gezeigt werden, daß es möglich ist, einen Pflanzen­ vektor zu konstruieren, der nach Einführung in eine Pflanzenzelle nicht nur die Fähigkeit der Genexpression besitzt, sondern auch noch andere Fähigkeiten vereint, die zur Vermehrung sowie zur Ausbreitung des Virus in der Pflanze benötigt werden. Die resultierende Gesamteffizienz ist extrem hoch. Die Funktionen beinhalten den Infektions­ grad des Virus und die Bewegung von einer Zelle zu einer anderen oder über eine größere Entfernung (long distance movement). Es ist erstaunlich, daß die große Komplexität der funktionalen und strukturellen Elemente des Vektors dessen Genexpression nicht beeinflußt.

Das IRES-Element des genannten Vektors kann aufwärts (upstream) des erwähnten nichtviralen Gens liegen, um dessen Translation direkt zu beeinflussen. Alternativ kann dieses IRES-Element indirekt die Translation des Gens unterstützen. Dies könnte durch die Stimulation der Translation einer Gruppe anderer Gene erfolgen, die für die Expression des erstgenannten Gens wichtig sind. Es könnte sich dabei um Gene handeln, die den Funktionen Infektionsgrad, Vermehrung oder Fortbewegung von Zelle zu Zelle oder über eine große Distanz (long distance movement) zuzuordnen sind.

Ein weiteres Ziel besteht darin, einen Vektor herzustellen, der in der Lage ist, ein Gen in einer Pflanze effektiv zu inaktivieren (supprimieren). Dies kann durch die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz erreicht werden, die mindestens eine IRES-Sequenz besitzt bzw. für eine solche kodiert und in einem Vektor kloniert ist, in dem sie für die Translation eines Gens, welches für die Vermehrung des Vektors benötigt wird, verantwortlich ist. Besagter Vektor besitzt darüber hinaus mindestens einen Teil einer Sequenz des Pflanzengenoms in Gegensinn(antisense)-Orientierung, um ein Gen der Wirtspflanze zu inaktivieren (supprimieren).

Weitere, bevorzugte Eigenschaften sind in den Unteranträgen/Ansprüchen definiert.

An dieser Stelle werden erstmals Vektoren beschrieben, die auf IRES-Elementen beruhen, welche in Pflanzen aktiv sind. Bereits vorhandene IRES-Sequenzen, die aus tierischen Viren isoliert wurden, unterstützen die Translation in Pflanzenzellen nicht. Das Wissen, das über tierische Expressionssysteme angesammelt wurde, kann somit nicht auf Pflanzen übertragen werden. Tierische IRES-Sequenzen wurden nie auf funktionale Eigenschaften, wie verbliebene/überschüssige Promotoraktivität, getestet. Diese Erfindung beinhaltet somit die ersten klaren Beispiele für die Genexpression in Pflanzen, die ausschließlich auf der Translation beruhen. Die Expression ist somit nicht von der Transkription, ausgehend von einem subgenomischen Promotor, welcher für die Ex­ pression eines abwärts (downstream) gelegenen Gens nötig ist, abhängig.

Die in dieser Erfindung beschriebenen Vektoren erlauben in Pflanzen bevorzugt die Regulation und die Expression eines Gens von Interesse, wobei die CAP-abhängige Translation unterdrückt wird. In einem anderen Ansatz werden sehr kurze oder künstliche IRES-Sequenzen verwendet, um die Stabilität der resultierenden Vektoren zu erhöhen.

Ein deutlicher Vorteil des Systems besteht darin, daß die IRES-Sequenzen aufwärts (upstream) oder abwärts (downstream) von einem viralen Gen bzw. von viralen Genen (z. B. des Gens für das Hüllprotein des Tabakmosaikvirus) inseriert werden können.

Daher kann ggf. sowohl die Translation eines abwärts (downstream) gelegenen Fremd­ gens (oder mehrerer Fremdgene) als auch die Translation eines viralen Gens (oder mehrerer viraler Fremdgene) über einen Reaktionsweg verlaufen, der durch einen CAP- unabhängigen Eintritt der Ribosomen eingeleitet wird. Daher wird die besagte CAP- unabhängige Translation eines Fremdgens (oder von Fremdgenen) von bicistronischen und/oder polycistronischen RNSs ausgehen.

ALLGEMEINE PROBLEME UND DEFINITIONEN

Im Anschluß an die Infektion einer Pflanze mit einem Virus kommt es zunächst zu den frühen Stadien der viralen Infektion. Es handelt sich dabei um den Eintritt des Virus in die Zelle und die Enthüllung des Genoms. Anschließend muß der Virus Aktivitäten entwickeln, die ihn zur Expression des Genoms sowie zur Replikation befähigen. Das virale Genom besteht entweder aus einem (monopartite) oder mehreren (multipartite) RNS- bzw. DNS-Segment(en). Jedes dieser Segmente kann unter bestimmten Voraus­ setzungen zur Replikation in der infizierten Zelle fähig sein. Ein virales Replikon wurde als "Polynucleotid einer viralen Sequenz, die in Wirtszellen während des viralen Replikationszyklus repliziert wird" definiert (Huisman et al., 1992, "Genetic engineering with Plant viruses", T. M. A. Wilson und J. W. Davies Hrsg., 1992, CRC Press, Inc.). Im Rahmen dieser Erfindung verwenden wir den Terminus "auf Vermehrung basierendes Expressionssystem" (amplification based expression system), um entweder ein voll­ ständig vorliegendes, virales Genom oder ein beliebiges Fragment der viralen RNS oder DNS zu bezeichnen, das folgende Eigenschaften besitzt: zum einen muß es Fremd­ sequenzen besitzen, die für den parentalen Wildtyp-Virus nicht-nativ sind und die exprimiert werden. Zum anderen muß es in der Lage sein, sich eigenständig oder über eine Komplementation mit einem Helfervirus bzw. einem Produkt der transgenen Wirtspflanze zu replizieren. Die Termini "auf Vermehrung basierendes Expressions­ system" (amplification-based-expression-system) und "rekombinanter, viraler Vektor" ähneln sich sehr. Diese Systeme repräsentieren rekombinante Nukleinsäuren, die zusätzliche Sequenzen enthalten. Diese können im Verhältnis zum Wirtsgenom homolog (nativ) bzw. heterolog (fremd, nicht nativ) sein. Die Bezeichnung "nicht nativ" bedeutet, daß diese Nukleinsäure nicht natürlicherweise im Genom des Wildtypvirus vorhanden ist, sondern von einem andern Virus abstammt. Alternativ kann es sich um eine synthetisch hergestellte Nukleinsäure handeln. Ein solches, auf Vermehrung beruhendes System, das von viralen Elementen abstammt, ist zur Replikation fähig. In vielen Fällen ist es zudem in der Lage, sich in normalen und/oder gentechnologisch modifizierten Pflanzen von einer Zelle zu einer anderen oder über eine größere Distanz (long distance movement) zu bewegen. In letzterem Fall sollte die transgene Pflanze funktionsdefiziente Komponenten des Vektors komplementieren. Das Produkt bzw. die Produkte eines Transgens, das bzw. die zur Vektorreplikation und/oder der Expression von Vektorgenen oder zum Transport über größere Distanzen nötig ist bzw. sind, sollte somit von der transgenen Pflanze zur Verfügung gestellt werden.

Pflanzenviren, die auf Vermehrung beruhen und deren Grundlage ein einfaches Genom (monopartite, z. B. das des Tabakmosaikvirus, TMV) oder ein doppeltes Genom (bipartite, z. B. das von Mitgliedern der Bromoviridae-Familie) ist, zeigten die Expression von Fremdgenen in Wirtspflanzen (Zusammenfassung in "Genetic engineering in plant viruses" T. M. A. Wilson and J. W. Davies Hrsg., 1992, CRC Press, Inc.).

Die Genome der meisten (ca. 80%) der bekannten Pflanzenviren bestehen aus plus- sense-einzelsträngiger RNS (ssRNS). Diese ist infektiös, wenn sie aus den Virionen in Form von freier RNS isoliert wird. Daraus folgt, daß als erster Schritt des viralen Replikationskreislaufes die genomische RNS translatiert werden muß, um die virus­ spezifische, RNS-abhängige RNS-Polymerase (Replikase) zu erzeugen. Sie ist nicht in uninfizierten Pflanzenzellen vorhanden und daher für die virale Replikation unentbehrlich (Zusammenfassung in: Y. Okada, 1999, Philosoph. Transact. of Royal Soc., B, 354, 569 - 582). Es sollte erwähnt werden, daß sich die plus-sense-ssRNS-Viren in den von ihnen verwendeten Translationsstrategien zur Expression des Genoms unterscheiden: Die Genome der sogenannten Picorna-ähnlichen Viren stellen ein einzelnes, durchlaufendes, offenes Leseraster (ORF) dar, das von den Ribosomen in ein großes Polyprotein translatiert wird. Dieses wird proteolytisch in aktive Virus-kodierte Proteine prozessiert. Die virusspezifischen Protease(n) sind an der Polyprotein-Prozessierung beteiligt. Eine zweite, besondere Eigenschaft der Picorna-ähnlichen Viren besteht darin, daß deren genomische RNS anstatt einer Schutzgruppe (CAP-Strukur) ein kleines, virales Protein enthält, das kovalent an das 5'-Ende des Genoms gebunden ist.

In dieser Erfindung konzentrieren wir uns hauptsächlich auf Viren, die der sogenannten Sindbis-ähnlichen Superfamilie zuzuordnen sind. Diese beinhaltet viele Pflanzenviren, insbesondere mehr als ein Dutzend Viren, die zum Genus der Tobamoviren gehören (Zusammenfassung in A. Gibbs, 1999, Philosoph. Transact. of Royal Soc., B, 354, 593 - 602). Die Technologie ermöglicht die Expression von Fremdgenen, die von der CAP- Struktur und von dem viralen Promotor unabhängig ist. Das Genom der Tobamoviren (TMV U1 ist ein typischer Vertreter dieser Gruppe) beinhaltet vier große, offene Leseraster (ORFs). Die beiden Komponenten der Replikase - das 130-kDa-Protein sowie das durch Durchlesen (readthrough) entstehende 183-kDa-Protein - werden von der 5'- angrenzenden Region der genomischen RNS kodiert. Sie werden direkt von der genomischen RNS translatiert. Die fünfzehn 3'-endständigen Nukleotide des 180-kDa- Proteins von TMV U1 überlappen mit dem offenen Leseraster des 30-kDa-Proteins, das für die Ausbreitung der TMV-Infektion von einer Zelle zu einer anderen verantwortlich ist (movement protein, MP). Im TMV-U1-Virus endet dieses Gen zwei Nukleotide vor dem Initiationskodon des letzten Gens, welches für das 17-kDa-Hüllprotein (coat protein, CP) kodiert. Diese Region ist aufwärts (upstream) der (bei TMV U1) 204 Nukleotid großen, 3'-endständigen, nichttranslatierten Region (3'-NTR) gelegen. Die Translation der RNS des Tobamovirus erfolgt durch einen ribosomalen Absuchungsmechanismus, der für die Mehrzahl der eukaryotischen mRNSs zutrifft (zusammengefaßt in Kozak, 1989, J. Mol. Biol. 108, 229 - 241; Pain, 1996, Merrick und Hershey, 1996, in "Translational control", Hrsg. Hershey, Matthews and Sonenberg, Cold Spring Habour Press, S. 31 - 69, Sachs und Varanini, 2000, Nature Structural Biology 7, 356 - 360). In Übereinstimmung mit diesem Mechanismus ist die strukturell polycistronische Tobamovirus-RNS funktional monocistronisch, d. h. lediglich das 5'-gelegene, offene Leseraster, das die Replikationsproteine (130-kDa-Protein und Produkt des Durchlesemechanismus) kodiert, kann von der vollständigen (fullength) genomischen RNS translatiert werden (zusammengefaßt in Palukaitis und Zaitlin, 1986, in "The Plant Viruses", von Regermortel und Fraenkel-Conrat Hrsg., Vol. 2, S. 105 - 131, Plenum Press, NY). Es sollte betont werden, daß der 68 Nukleotid große, 5'-terminale, nichttranslatierte Bereich (leader sequence) von TMV U1, der als Omega(Ω)-Leader bezeichnet wird, die Rolle eines effizienten Translationsverstärkers besitzt, indem er die Translation des 5' proximal liegenden, offenen Leserasters stimuliert. Die 5' distal liegenden Gene für MP und CP sind in der Vollängen-TMV U1 RNS translational inaktiviert. Sie werden von separaten mRNSs, die als subgenomische RNS (sgRNS) bezeichnet werden, translatiert. Offenbar werden die subgenomische RNSs von in negativer Orientierung vorliegender, genomischer RNS transkribiert und besitzen übereinstimmende 3'-Enden. Die Expression der TMV-Gene, die von sgRNSs translatiert werden, ist sowohl zeitlich als auch quantitativ voneinander unabhängig reguliert: das MP wird durchgehend während der frühen Schritte der Infektion exprimiert und akkumuliert zu einer relativ geringen Proteinmenge, deren Gesamtanteil bei etwa 1% des gesamten Pflanzenproteins liegt. Im Gegensatz dazu beträgt der Anteil der Synthese des Hüllproteins bis zu 70% der gesamten, pflanzlichen Proteinsynthese. Der Anteil des Hüllproteins an der Gesamt­ proteinmenge in der Pflanze kann bis zu 10% betragen (Fraser, 1987, in: Biochemistry of virus-infected plants", S. 1-7, Research studies Press Ltd., Letchworth, England). Es ist offensichtlich, daß die Erzeugung jeder sgRNS von verschiedenen, in cis wirkenden Elementen kontrolliert wird. Diese werden als "subgenomische mRNS-Promotoren" (sgPR) bezeichnet. Im allgemeinen bezeichnet dieser Terminus die Region des viralen Genoms (vermutlich innerhalb einer Minus-Sinn-RNS-Kopie), das von dem Replikase- Komplex erkannt wird, um die Transkription von einem intern lokalisierten sgPR zu initiieren. Damit kommt es zur Erzeugung der sgRNS. Zur Vereinfachung bezeichnen wir gewöhnlich mit dem Terminus "subgenomischer Promotor" eine Nukleotidsequenz einer plus sense, viralen RNS, die in der Regel aufwärts (upstream) der kodierenden Sequenz und des Startpunktes der sgRNS liegt und die bei der Initiation der sgRNS-Synthese eine funktionelle Rolle spielt. Es sollte allerdings in Betracht gezogen werden, daß einige, virale sgPRs nicht ausschließlich aufwärts (upstream) von dem kontrollierten, viralen Gen liegen, sondern sogar mit diesen Genen überlappen können (Balmori et al., 1993, Biochimie (Paris) 75, 517 - 521).

Jeder subgenomische Promotor besetzt eine unterschiedliche Position im TMV-Genom. Keiner der subgenomischen Promotoren des TMV konnte bisher exakt kartiert werden. Es konnte aber gezeigt werden, daß die 250 Nukleotid große Region aufwärts (upstream) des CP-Gens die Synthese der CP-sgRNS unterstützen kann (Dawson et al., 1989, Virology 172, 285 - 292).

Lehto et al. inserierten 253 und 49 Nukleotide lange Sequenzen in das TMV-Genom (vor das MP-Gen; 1990, Virology 174, 145-157), die dem CP vorausgingen. Das Ziel war, die Größe der subgenomischen Promotoren (sgPR) abzuschätzen. Die Insertion zerstörte zwar nicht den ursprünglichen, subgenomischen Promotor des MP-Gens, sondern entfernte ihn von dem offenen Leseraster des MP-Gens. Dieser mutierte Virus (genannt KK6), der eine 253 Nukleotid große Insertion in der Promotorregion besitzt, repliziert stabil und bewegt sich systemisch über die infizierte Pflanze. Es entspricht den Erwartungen, daß die in der Mutante KK6 vorliegende Insertion die Länge der subgenomischen Leader-Sequenz des MP ändert (Lehto et al., Virology 174, 145 - 157. s. Abb. 9). Die subgenomische RNS der KK6-MP-Leader-RNS hat eine Größe von 24 Nukleotiden. Verglichen dazu beträgt die Größe der subgenomischen RNS des Hüll­ proteins lediglich 9 Nukleotide. Im Gegensatz dazu repliziert die Mutante mit einem eingefügten, 49 Nukleotid großen Fragment in der Promotorregion nur kurzzeitig. Nach dieser Phase überwiegen die Nachkommen von Wildtyp-Viren, die die Insertion deletiert haben. Zusätzlich konnte gezeigt werden (Meshi et al., 1987, EMBO 6, 2557 - 2563), daß die Produktion der subgenomischen Hüllprotein-RNS dann reduziert wurde, wenn eine 96 Nukleotid große Region verwendet wurde, die von der Hüllprotein-RNS abstammte. Es wurde daraus geschlossen, daß die 49 bis 96 Nukleotid großen Sequenzen, die sich aufwärts (upstream) des Gens für das Hüllprotein befinden, nicht die gesamte Region des subgenomischen Promotors des TMV-U1-Hüllproteingens beinhalten. Die 250 bp große Nukleotid-Sequenz beinhaltet hingegen den kompletten, subgenomischen Promotor.

Es liegen nur wenig Informationen über die Struktur und Lage des subgenomischen Promotors vor, der die Expression des MP des TMV kontrolliert. Weil die mutmaßliche Sequenz des subgenomischen Promotors des MP mit der Sequenz des 183-kDa-Replikase- Proteins überlappt, gestaltet sich die Analyse der Region mittels Mutationen als kompliziert. Vorläufige Ergebnisse, die von W. Dawson und Mitarbeitern kürzlich erbracht wurden, skizzieren die Grenzen des minimalen und kompletten, subgenomischen Promotors des MP von TMV U1 (Grdzelishvili et al. 2000, Virology 276, im Druck). Durch computerunterstützte Strukturanalysen der Region, die sich aufwärts (upstream) des MP-Gens befindet, konnten zwei stem-loop-Strukturen identifiziert werden, die 5' proximal zur 75-Nukleotid-Region des MP-Gens liegen und dem AUG-Codon des MP- Gens vorausgehen.

Es wird angenommen, daß die subgenomische RNS des MP im Gegensatz zur genomischen RNS und subgenomischen RNS des Hüllproteins (der sogenannten I₂sgRNS) nicht geschützt ist (uncapped, zusammengefaßt in: Okada, 1999, Philosoph. Transact. Of Royal Soc., 354, 569 - 582). Die vorliegende Erfindung unterstützt diese Ergebnisse. Demnach ist die I₂sgRNS sowohl in TMV U1 als auch in crTMV ungeschützt (uncapped, Abb. 7).

Von W. Dawson und Mitarbeitern konnte gezeigt werden, daß ein wichtiger Faktor, der die Expression eines Fremdgens in einem viralen Vektor beeinflußt, dessen relative Position zum 3'-Terminus des viralen Genoms ist: Die Effizienz der Expression steigt mit zunehmender Nähe des Fremdgens zum 3'-Terminus dramatisch an (Culver et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 90, 2055 - 2059). Das am stärksten exprimierte Gen ist das Hüllprotein, das sich benachbart zur 3'-nichttranslatierten Region befindet. Diese besteht (in der TMV U1 RNS) aus drei Pseudoknoten, auf die eine tRNS-ähnliche Struktur folgt. Es wurde vorgeschlagen (Shivprasad et al., 1999, Virology 355, 312 - 323), daß die Nähe eines Gens zu den Pseudoknoten die Expression eines Fremdgens eher anhebt, als dessen Nähe zum 3'-Terminus des Genoms. Viele wichtige Aspekte der Struktur des sub­ genomischen Promotors des TMV wurden durch die Arbeit von W. Dawson und seiner Arbeitsgruppe geklärt. Die allgemeine Schlußfolgerung dieser Autoren lautete, daß sich die Forschung auf diesem Gebiet immer noch auf dem "empirischen Stand der Vektor- Herstellung" befindet (Shivprasad et al., 1999, Virology 335, 312 - 323).

Die bisherigen Ausführungen machen deutlich, daß die Synthese der subgenomischen RNS essentiell für die Synthese der 5'-endständigen Gene des TMV-Genoms ist. Diese Gene sind in Voll-Länge-RNS stillgelegt. Der Mechanismus der unabhängigen Ex­ pression eines Gens durch "Subgenomisierung" kann als eine Strategie des TMV angesehen werden, die Unfähigkeit eukaryotischer Ribsomen zur Translationsinitiation von 5'-endständigen Genen von polycistronischer, eukaryotischer mRNS zu überwinden. Nach dem traditionellen "Ribosomen-Scanning-Modell" (Kozak, 1999, Gene 234, 187 - 208) sind die internen Gene von polycistronischer, eukaryotischer mRNS für Ribosomen nicht zugänglich.

Kürzlich gelang es uns, aus Oleracia officinalis einen Tobamovirus zu isolieren, der in der Lage ist, Kreuzblüter zu infizieren (crucifer infecting tobamovirus, crTMV). Ein hervorstechendes Merkmal von crTMV ist seine Fähigkeit, Mitglieder der Familie der Brassicaceae systemisch zu infizieren. Zusätzlich ist der Virus in der Lage, Pflanzen der Solanaceae-Familie und andere Pflanzen, die mit TMV U1-infizierbar sind, systemisch zu infizieren. Das Genom von crTMV (6312 Nukleotide) wurde sequenziert (Dorokhov et al., 1994, FEBS-Letters 350, 5 - 8). Es konnte gezeigt werde, daß es vier traditionelle, durch offene Leseraster kodierte Gene beinhaltet. Es handelt sich dabei um ein 122-kDa- Protein (ORF1), ein 178-kDa-Protein (ORF2), das Durchlese-(readthrough)-Produkt des 122-kDa-Proteins, ein 30-kDa-MP (ORF3) sowie ein 17-kDa-Hüllprotein (ORF4). Eine einheitlich strukturelle Eigenschaft der crTMV-RNS ist, daß - anders als bei anderen Tobamoviren - die kodierenden Regionen des MP und des Hüllproteins eine Überlappung von 75 Nukleotiden ausweisen, d. h. der 5'-endständige Teil des Hüllproteins kodiert gleichzeitig den C-terminalen Teil des MP.

Um ein klares und stimmiges Verständnis der Aufzählungen und Anträge einschließlich der Abbildungen zu gewährleisten, werden die folgenden Definitionen gegeben:
Benachbart: Eine Position in einer Nukleinsäuresequenz unmittelbar 5' oder 3' einer definierten Sequenz gelegen.
Amplifikationsvektor: Ein Typ von Genvektor, der, nach Einführung in eine Wirtszelle, zur Replikation in dieser Wirtszelle fähig ist.
Gegensinn-Mechanismus: Eine Art der Genregulation, die darauf basiert, daß die Rate der Translation der mRNS zum Protein durch die Anwesenheit einer RNS in der Zelle kontrolliert wird, die zumindest in Teilen komplementär zur translatierten RNS ist.
Chimäre Sequenzen oder Gene: Eine Nukleotidsequenz, die aus mindestens zwei heterologen Bereichen gebildet wurde. Die Sequenz kann DNS oder RNS beinhalten.
Kodierende Sequenz: Eine Desoxyribonukleotidsequenz die, wenn sie transkribiert und translatiert wird, zur Bildung eines zellulären Polypeptids führt oder eine Ribo­ nukleotidsequenz die, wenn sie transkribiert wird, zur Bildung eines zellulären Polypeptids führt.
Kompatibilität: Die Fähigkeit, mit anderen Komponenten eines Systems zu funktionieren. Ein Vektor oder die Nukleinsäure eines Pflanzenvektors, der kompatibel mit einem Wirt ist, kann sich in diesem Wirt replizieren. Ein Hüllprotein, das kompatibel mit einer viralen Nukleinsäure ist, ist in der Lage, diese Nukleinsäure einzukapseln.
Gen: Eine abgegrenzte Nukleinsäuresequenz, die für ein bestimmtes, zelluläres Produkt verantwortlich ist.
Ein Gen, das exprimiert werden soll: Ein Gen, deren Expression von technologischem Interesse ist.
Wirt: Eine Zelle, ein Gewebe oder ein Organismus, in dem sich ein Vektor oder Pflanzenvirus replizieren kann. Ein Wirt ist in der Lage, von einem Virus, der einen viralen Vektor oder Sequenzen von Pflanzenvektoren besitzt, infiziert zu werden. Der Terminus soll prokaryotische und eukaryotische Zellen, Organe, Gewebe oder Organismen einschließen.
Wirtspflanzengenom: Mit diesem Begriff wird v. a. das Kerngenom einer Wirtspflanze bezeichnet. Er beinhaltet aber daneben ggf. auch mitochondriale und Chloroplasten-DNS.
Infektion: Die Fähigkeit eines Virus oder eines auf Vermehrung basierenden Virus, seine Nukleinsäuren in einen Wirt zu übertragen oder, seine Nukleinsäuren in einen Wirt zu übertragen, indem die virale Nukleinsäure oder ein Vektor repliziert wird, virale Proteine synthetisiert werden und neue Viruspartikel zusammengesetzt werden. In diesem Zusammenhang werden die Begriffe "übertragbar" und "infektiös" gleichwertig verwendet.
Interne, ribosomale Eintrittsstellen (IRES, Internal Ribosomal Entry Sites) oder IRES: Eine Nukleotidsequenz viralen, zellulären oder synthetischen Ursprungs, die auf der Ebene der Translation für die interne Initiation verantwortlich ist.
IRES-Elemente, die für die Translation eines abwärts (downstream) gelegenen Gens verantwortlich sind: IRES-Elemente, die in dem Sinne für die Translation eines obigen Gens wirksam sind, daß ohne sie keine Expression des Gens auftritt, die in techno­ logischem Sinne interessant ist.
Nichtvirales Gen: Ein Gen, das im Lebenszyklus eines Virus keine Rolle spielt.
Phänotypisches Merkmal: Eine zu beobachtende Eigenschaft, die durch die Expression eines Gens hervorgerufen wird.
Pflanzenzelle: Die strukturelle und physiologische Einheit einer Pflanze, bestehend aus dem Protoplasten und der Zellwand.
Pflanzenorgan: Ein abgegrenzter und sichtbar zu differenzierender Teil einer Pflanze, wie z. B. Wurzel, Sproß, Blatt oder Embryo.
Pflanzengewebe: Jedes Gewebe einer Pflanze im Pflanzenkörper oder in Gewebekultur. Mit diesem Terminus soll die gesamte Pflanze, die Pflanzenzelle, Pflanzenorgane, Protoplasten, Zellkulturen oder jede andere Gruppe von Pflanzenzellen bezeichnet werden, die in einer strukturellen oder funktionellen Einheit organisiert sind.
Produktionszelle: Eine Zelle eines Gewebes oder eines Organs, die in der Lage ist, einen Vektor oder einen viralen Vektor zu replizieren, aber die nicht notwendigerweise ein Wirt des Virus ist. Mit diesem Begriff sollen prokaryotische und eukaryotische Zellen, Gewebe oder Organe, wie Bakterien, Hefe, Pilze und Pflanzengewebe eingeschlossen werden.
Promotor: Der 5'-nichtkodierende Bereich der aufwärts (upstream) einer kodierenden Sequenz gelegen und funktionell mit dieser verbunden ist. Sie ist an der Initiation der Transkription der kodierenden Sequenz beteiligt.
Protoplast: Eine isolierte Pflanzenzelle ohne Zellwand. Sie besitzt die Fähigkeit, sich in Gewebekultur oder in einer ganzen Pflanze fortzupflanzen.
Rekombinante Pflanzenvirus-Nukleinsäure: Die Nukleinsäure eines Pflanzenvirus, die durch die Einführung von nichtviralen Nukleinsäuresequenzen modifiziert wurde.
Rekombinanter Pflanzenvirus: Ein Pflanzenvirus, der die rekombinante Pflanzenvirus- Nukleinsäure trägt.
Reportergen: Ein Gen, dessen Produkt einfach nachgewiesen werden kann.
Subgenomischer Promotor (sgPR): Ein Promotor einer subgenomischen mRNS eines Vektors oder einer Nukleinsäure.
Aussagekräftige Nukleinsäurehomologie: Bezeichnet Nukleotid-Sequenzen, die so homolog sind, daß auf eine funktionelle Übereinstimmung geschlossen werden kann. Unterschiede in den Nukleinsäuresequenzen von Sequenzen, die signifikante Homologie aufweisen, sind bezüglich der Funktion der Genprodukte oder der von einer solchen Sequenz kodierten RNS unbedeutend.
Transkription: Produktion eines RNS-Moleküls durch die RNS-Polymerase als komplementäre Kopie einer DNS-Sequenz.
Translation: Erzeugung eines Polypeptids durch ein Ribosom (häufig im Sinne des Abtastens (scanning) einer RNS gemeint).
Vektor: Eine selbstreplizierende (sich selbst vermehrende) Nukleinsäure, die in der Lage ist, eine Wirtszelle genetisch zu modifizieren. Der Vektor kann einzelsträngig (ss) (+), ss (-) oder doppelsträngig (ds) sein.
Virus: Eine infektiöse Substanz, die aus einer Nukleinsäure besteht, welche in ein Protein eingehüllt ist. Ein Virus kann ein-, zwei-, drei- oder mehrteilig sein.

VORTEILE DER ERFINDUNG

Diese Erfindung liefert eine neue Strategie zur Herstellung eines auf Vermehrung basierenden Vektors zur Expression von Fremdgenen (heterolog, nicht nativ). Die Translation dieser Gene kann über einen durch eine IRES-Sequenz vermittelten Mechanismus des internen Ribosomeneintritts vermittelt werden. Dies erfolgt entweder von einer polycistronischen RNS oder/und von bi- und multicistronischer sgRNS, die von dem Vektor in der infizierten Zelle erzeugt, werden. In jedem Fall ist die IRES-Sequenz zur Translation eines Gens nötig. Ein Vorteil dieses Systems ist, daß es keine spezifischen Manipulationen der sgRNS erfordert: Die einzige Sequenz, die in den Vektor eingefügt werden sollte, ist die IRES-Sequenz bzw. sind die IRES-Sequenzen, die aufwärts (upstream) des zu translatierenden Gens liegen. Die IRES-Sequenzen können nativ oder nicht-nativ sein. Die Translation der abwärts (downstream) gelegenen Gene wird durch die insertierten IRES-Sequenzen gefördert, d. h. es handelt sich um einen CAP-unabhängigen Mechanismus. Der Sequenzbereich, der die IRES-Sequenz bein­ haltet, besitzt keine Eigenschaft eines subgenomischen Promotors, die technisch eine Rolle spielen könnte. Dies kann bedeuteten, daß der Sequenzbereich keine nachweisbare Produktion korrespondierender, subgenomischer RNS bewirkt. Alternativ kann die Translation subgenomischer RNS ein Ergebnis von restlicher, subgenomischer Promotor­ aktivität der IRES-Sequenz sein. Das IRES-Element wird in diesem Falle aber immer noch für die Translation eines abwärts (downstream) gelegenen Gens benötigt. Folglich besitzt die primäre, rekombinante RNS, die vom Vektor produziert wird, folgende Bestandteile: ein oder mehrere Strukturgene (vorzugsweise viralen Ursprungs), besagte IRES-Sequenz, das (Fremd-)Gen von Interesse, das sich abwärts (downstream) der IRES-Sequenz befindet und die 3'-nichttranslatierte Region (3'-NTR). Es ist wichtig, daß diese Strategie die gleichzeitige Expression mehrerer Fremdgene ermöglicht. Dies wird durch die tandemartige Insertion von zwei oder mehreren Fremdgenen ermöglicht, die alle von unterschiedlichen IRES-Sequenzen kontrolliert werden. Die vorliegende Erfindung ist vorzugsweise auf Nukleinsäuren und rekombinante Viren ausgerichtet, die durch die CAP-unabhängige Expression des viralen Genoms oder der viralen sgRNS oder nicht-nativer (Fremd-)Nukleinsäuren charakterisiert werden. Diese sind in der Lage, über weitere, pflanzenspezifische IRES-Elemente solche Fremdsequenzen systemisch zu exprimieren.

In einer ersten Anwendungsform wird die Nukleinsäure eines Pflanzenvirus bereit­ gestellt, in der die kodierende Sequenz für das native Hüllprotein und der native subgenomische Promotor deletiert sind. Statt dessen wird ein nicht-natives Hüllprotein aus einem Pflanzenvirus mit einem aufwärts (upstream) gelegenen, viralen IRES- Element inseriert. Dies erlaubt CAP-unabhängige Expression in der Wirtspflanze. Die Verpackung der rekombinanten, viralen Nukleinsäuren und die anschließende, systemische Infektion des Wirts durch die rekombinante Nukleinsäure des Pflanzenvirus bleiben erhalten.

Die rekombinante Pflanzenvirus-Nukleinsäure kann ein oder mehrere native oder nicht- native IRES-Elemente beinhalten, die als Translationselemente funktionieren und die keine transkriptionelle Aktivität besitzen, d. h. sie sind unfähig, als subgenomischer Promotor zu fungieren. Jedes native oder nicht native IRES-Element ist in der Lage, CAP-unabhängige Expression von benachbarten Genen oder Nukleinsäuresequenzen in der Wirtspflanze zu fördern.

In einer zweiten Anwendungsform wird ein Amplifikations- und Expressionsvektor zur Verfügung gestellt, in dem mehrere native oder nicht native, pflanzenvirale IRES- Elemente oder ein natives oder nicht-natives, pflanzenvirales IRES-Element, das aufwärts (upstream) von Fremdnukleinsäuresequenzen liegt, abwärts eines nativen Hüllproteins inseriert sind bzw. ist. Das inserierte Pflanzenvirus-IRES-Element kann die CAP- unabhängige Expression von benachbarten Genen in Wirtspflanzen leiten. Nicht-native Nukleinsäuresequenzen können benachbart zu den IRES-Elementen inseriert werden, so daß besagte Sequenzen in der Wirtspflanze unter der translationalen Kontrolle der IRES- Elemente exprimiert werden und das gewünschte Produkt synthetisiert werden kann.

In einer dritten Anwendungsform wird ein rekombinanter Vektor wie im zweiten Ansatz zur Verfügung gestellt. Der Unterschied besteht darin, daß das native oder nicht native, pflanzenvirale IRES-Element (oder die IRES-Elemente) mit den abwärts gelegenen Fremdnukleinsäuresequenzen aufwärts (upstream) des Hüllproteins und dessen nativen, subgenomischen Promotors gelegen ist bzw. sind. In einer vierten Anwendungsform wird eine rekombinante, virale Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, in der ein natives oder nicht-natives, pflanzenvirales IRES-Element (oder IRES-Elemente) am 5'-Ende des viralen Genoms oder in der viralen, subgenomischen RNS verwendet wird bzw. werden, so daß ein abwärts (downstream) gelegenes Gen CAP-unabhängig translatiert wird.

In einer fünften Anwendungsform wird die Inhibition der CAP-abhängigen Translation ausgenutzt, um das Niveau der CAP-unabhängigen Translation in den besagten Vektoren zu erhöhen. Die auf Viren basierenden Amplifikationsvektoren werden vom Hüllprotein eingeschlossen. Das Hüllprotein wird von der rekombinanten, pflanzenviralen Nukleinsäure kodiert. Die rekombinante, pflanzenvirale Nukleinsäure ist zur Replikation im Wirt fähig. Darüber hinaus kann es zur systemischen Ausbreitung im Wirt kommen. Ein Fremdgen oder Fremdgene können CAP-unabhängig exprimiert werden. Zusätzlich kann das gesamte Genom oder subgenomische RNSs CAP-unabhängig im Wirt produziert werden, um ein gewünschtes Produkt zu erzeugen. Solche Produkte schließen therapeutische und andere nützliche Polypeptide ein. Dazu gehören u. a. Enzyme, komplexe Biomoleküle oder Polypeptide oder Merkmale oder Produkte, die durch die Produktion von Gegensinn-RNS (antisense-RNS) erzeugt werden. Beispiele für erwünschte, eingeführte (input-)Eigenschaften sind Resistenzen gegenüber Viren, Bakterien, abiotischem Stress sowie eine verbesserte Energie- und Materialverwertung. Beispiele für erwünschte output-Eigenschaften sind modifizierte Kohlenhydrate, modifizierte Polysaccharide, modifiziere Fette, eine modifizierte Aminosäurezusammen­ setzung bzw. -Ausbeute, modifizierte sekundäre Metaboliten und pharmazeutische Proteine, einschließlich Enzyme, Antikörper, Antigene u. ä.. Beispiele für Regulationsmechanismen, die Merkmale kontrollieren, sind Gen-Umschaltungen (Gene-switches), Kontrolle der Expression, Kontrolle der hybriden Samenproduktion und Kontrolle von Apomixis.

Die vorliegende Erfindung zielt zudem direkt auf die Herstellung künstlicher, nicht- natürlicher IRES-Elemente (im Gegensatz zu IRES-Elementen, die aus lebenden Organismen isoliert werden). Diese ermöglichen eine CAP-unabhängige und Promotor- unabhängige Expression eines Gens von Interesse in Pflanzen (und evtl. zusätzlich in Hefe- oder Tierzellen). Beispiele für lebende Organismen, aus denen die IRES-Elemente evtl. isoliert werden können, sind der Hepatitus-C-Virus, infektiöse Bronchitis-Viren, Picornaviren wie Poliovirus und Encephalomiocarditisvirus sowie Retroviren, wie Moloney Murine Leukemia-Virus und Harvey Murine Sarcoma-Virus. Beispiele für Pflanzenviren sind der Kartoffelvirus X, Potyviren wie der Kartoffelvirus Y und Rübenmosaikvirus, Tobamoviren wie z. B. solche, die Kruziferen infizieren und Comoviren, wie z. B. der Cowpea Mosaik-Virus. Alternativ können natürliche IRES- Sequenzen aus zellulärer Boten-RNS isoliert werden. Dazu gehören RNSs wie die des homöotischen ANTENNAPEDIA-Gens oder des menschlichen Fibroblastenwachstums­ faktors 2 und des Translationsinitiationsfaktors eIF-4G.

In einer sechsten Anwendungsform werden künstliche, nicht natürliche IRES-Elemente auf der Basis der Komplementarität zur 18S rRNS von eukaryotischen Zellen, ein­ schließlich Hefe, Tieren und Pflanzenzellen gebildet.

In einer siebten Anwendungsform werden künstliche, nicht natürliche IRES-Elemente auf der Grundlage von kurzen Sequenzabfolgen von Adenosin/Guanosin-Basen gebildet. In einer achten Anwendungsform dieser Erfindung wird eine Methode zur Herstellung und Verwendung von auf Viren basierenden Amplifikationsvektoren präsentiert, in der die Expression des viralen Genoms in Pflanzenzellen unter der Kontrolle eines pflanzenspezifischen Transkriptionspromotors auftritt.

In einer neunten Anwendungsform der vorgelegten Erfindung wird eine Methode zur Herstellung und Verwendung von auf Viren basierenden Amplifikationsvektoren vorgestellt, die es erlaubt, eine vektorielle Expression von Replikons durchzuführen, die in der Pflanzenzelle als ein Ergebnis eines primären, nukleären Transkriptionsprozesses gebildet werden.

In einer zehnten Anwendungsform dieser Erfindung wird ein Produkt beschrieben, mit dessen Hilfe ringförmige, einzelsträngige, auf Viren basierende Amplifikationsvektoren zur CAP-unabhängigen Expression von Fremdgenen in Pflanzen verwendet werden können.

In einer elften Anwendungsmöglichkeit dieser Erfindung werden Methoden präsentiert, die die Expression eines Gens von Interesse unter Bedingungen in Zellen ermöglicht, die eine CAP-unabhängige Expression bevorzugt. In einem Beispiel werden Zellen, die mit einem Amplifikationsvektor infiziert wurden, mit einer Komponente behandelt, die die CAP-abhängige Translation verhindert. In einem weiteren Beispiel beinhaltet der Vektor selber ein Gen, dessen Produkt einen inhibierenden Effekt auf die CAP-abhängige Translation im Wirt bewirkt. Alternativ kann der Vektor auch eine Gegensinn­ (antisense)-Sequenz mit gleicher Funktion besitzen.

In einer elften Anwendungsmöglichkeit dieser Erfindung ist eine Methode beschrieben, die es erlaubt, mittels in-vivo-genetischer Selektion eine IRES-Sequenz zu identifizieren, die die CAP-unabhängige Expression eines Gens von Interesse oder eines Reportergens in einem Vektor vermittelt.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das vorrangige Ziel dieser Erfindung ist die Etablierung neuer Strategien zur Konstruktion von Vektoren für die Expression von fremden (heterologen, nicht nativen) Genen, wobei diese Vektoren auf der Amplifizierung basieren. Die Translation dieser Gene wird dabei durch IRES-vermittelte, CAP-unabhängige Mechanismen, des internen Ribosomeneintritts an polycistronische, genomische Virus-RNSs und/oder bi- und multicistronische sgRNSs, die von amplifizierenden Vektoren produziert werden, erreicht. Vorzugsweise sollen diese von viralen Vektoren in einer Pflanzenzelle erzeugt werden.

Die Konstruktion von rekombinanten, pflanzlichen Virus-RNSs und die Etablierung von amplifizierenden Vektoren für die Einführung und Expression von fremden Genen in Pflanzen wurde bereits von zahlreichen Autoren gezeigt, die zu diesem Zweck die Genome von verschiedenen, taxonomischen Virus-Gruppen verwendeten (Review, siehe "Genetic Engineering With Plant Viruses", 1992, eds. Wilson and Davies, CRC Press, Inc.). Als geeignete Gruppe für die Konstruktion von viralen Vektoren wurden dabei die Tobamoviren angesehen. Donson et al. (U.S. Patents Nos. 5,316,931; 5,589,367 und 5,866,785) erfanden TMV-basierende Vektoren, mit deren Hilfe man verschiedene, fremde Gene in einer Wirtspflanze exprimieren konnte. So wurden auf diese Weise das Neomycin-Phosphotransferase-Gen, das α-Trichosantin-Gen und mehrere andere, fremde Gene angrenzend zu dem subgenomischen Promotor (sgPR) des TMV-Hüllprotein-Gens inseriert. Donson et al. (1993, PCT WO 93/03161) entwickelten auf der Basis eines Tobamovirus "eine rekombinante Pflanzenvirus-Nukleinsäure, die einen nativen, subgenomischen Pflanzenvirus-Promotor, wenigstens einen nicht nativen, subgeno­ mischen Pflanzenvirus-Promotor und die kodierende Sequenz eines Pflanzenvirus- Hüllproteins umfaßte. Der erwähnte, nicht native, subgenomische Pflanzenvirus-Promotor ist dabei in der Lage, die Transkription der angrenzenden Nukleinsäuresequenz in einer Wirtspflanze zu initiieren, wobei er nicht mit subgenomischen Promotoren der rekombinanten Pflanzenvirus-Nukleinsäure rekombiniert. Die erwähnte Pflanzenvirus- Nukleinsäure kann eine systemische Infektion einer Wirtspflanze hervorrufen".

Im Gegensatz zu der Technologie von Donson et al. bezieht sich die vorgelegte Erfindung nicht auf subgenomische Promotoren (sgPRs), mit deren Hilfe auf viralen Replikons basierende Pflanzenexpressionssysteme konstruiert werden. Statt sgPRs benutzt unsere Technologie IRES-Sequenzen (für den Virus native oder nicht native) verschiedensten Ursprungs, die effektiv keine sgPR-Aktivität aufweisen, d. h. sie sind effektiv nicht in der Lage, die Produktion von sgRNSs zu initiieren. Deshalb sollten diese IRES-Squenzen nicht als sgPRs angesehen werden, obwohl sie in manchen Fällen nichtfunktionale Segmente von sgPRs darstellen.

Es wird im allgemeinen angenommen, daß nach in-vitro-Transkription erhaltene, voll- Länge-Virus-RNS, die nicht mit einer CAP-Gruppe versehen ist, nicht infektiös für intakte Pflanzen und Protoplasten ist. Aus diesem Grund wird die Modifizierung eines RNS-Transkripts mit einer CAP-Gruppe, ausgehend von einem viralen Vektor generell als Voraussetzung dafür angesehen, daß ein in-vitro-Transkript infektiös ist. Geschützte (capped) RNS-Transkripte werden normalerweise benutzt, um virale Vektor-RNS in Pflanzen einzubringen. Es ist wichtig, darauf hinzuweisen, daß in einigen Fällen virale RNS mit Hilfe einer einfachen Prozedur in vitro durch Hüllproteine verpackt werden kann. Auf diese Weise können ausgehend von Hüllpropteinen und in-vitro-Transkripten oder von aufgereinigter, authentischer, viraler RNS sowohl TMV-Virione als auch Pseudovirione, die Vektor-RNS enthalten, sehr schnell hergestellt werden. Vor fünfzehn Jahren konnte von Meshi et al. (1986, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5043 - 5047) gezeigt werden, daß in einem in-vitro-Ansatz ohne CAP-Analoge hergestellte, ungeschützte (uncapped) Transkripte der voll-Länge-TMV-RNS infektiös waren, wobei deren spezifischer Infektionsgrad sehr gering war.

In der vorliegenden Erfindung kann ungeschützte (uncapped) Expressionsvektor-RNS, die mit TMV-Hüllprotein verpackt ist, für Pflanzeninokulierungen benutzt werden, um den geringen Infektionsgrad zu kompensieren. Wenigstens eine der zusätzlichen Strategien, die in dieser Erfindung beschrieben werden, eröffnet eine technische Möglichkeit für Pflanzeninfektionen mit einem CAP-unabhängigen, viralen Pflanzen- Vektor. Diese ist die Methode der Insertion einer voll-Länge-Einzelstrang-(ss)DNS- Kopie eines viralen Vektors unter der Kontrolle eines geeigneten DNS-Promotors. Nach der Inokulation einer Wirtspflanze mit einer rekombinanten Virus-DNS wird die infektiöse voll-Länge-RNS des viralen Pflanzenvektors produziert. Diese ist wiederum in der Lage, sich zu replizieren und sich in der Pflanze auszubreiten.

Die Tatsache der CAP-unabhängigen Expression von fremden Genen mit Hilfe der IRES- Sequenzen sowie die genannten Prozeduren machen somit die Prozesse der Pflanzen­ inokulation und der Expression eines fremden Gens CAP-unabhängig.

Ein wichtiges und bevorzugtes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung einer Serie von viralen Vektoren, die auf dem crTMV-Genom basieren und in denen der "IRES-Fremdgen"-Block zwischen dem Hüllprotein und dem 3'-NTR inseriert ist.

Zahlreiche IRES- und Kontrollsequenzen wurden in Kombination mit zwei verschiedenen Reportergenen (GUS und GFP) verwendet (siehe Abb. 2). Ein einzigartiger Aspekt dieser Erfindung liegt darin, daß fremde Gene, die ausserhalb der viralen sgPR-Sequenzen liegen, in infizierten Pflanzen CAP-unabhängig von der dem 3'- Ende nächsten Position der genomischen RNSs und sgRNSs, die ihrerseits wiederum von dem Vektor produziert werden, exprimiert werden. Insbesondere die IRES_{MP, 75} ^CR- Sequenz, die den 3'-terminalen Teil der 5'-nicht translatierten Präsequenz (leader sequence) der crTMV-I₂ sgRNS repräsentiert, vermittelte in Pflanzen, die mit dem viralen Vektor infiziert wurden, effizient die CAP-unbhängige Expression des dem 3'- Ende nächsten Fremdgens. Es sollte darauf hingewiesen werden, daß erwähnte, auf dem crTMV basierende, virale Vektoren drei verschiedene Arten der viralen, plus-sense- ssRNSs in infizierten Pflanzen prodzieren: i) voll-Länge genomische RNS, ii) tricistronische I₂ sgRNS (unsere Daten zeigen, daß die spätere sgRNS im Gegensatz zu der Voll-Länge-RNS nicht geschützt (uncapped) ist) und iii) bicistronische sgRNS, die das erste Hüllprotein-Gen und das zweite Fremdgen enthält. Aus diesem Grund sind all diese RNSs 3'-coterminal. Gleichzeitig wird die CAP-unabhängige Translation des dem 3'-Ende nächstgelegenen Gens mit Hilfe der vorangestellten IRES-Sequenz vermittelt. Dabei liegt diese RNSs entweder als geschützte (capped, voll-Länge oder bicistronisch) oder nicht geschützte (uncapped, tricistronisch) RNS vor.

Eine wichtige charakteristische Eigenschaft der viralen Vektoren ist deren Stabilität. Die auf dem TMV-basierenden Vektoren, die Fremdgene enthalten, verbreiten sich jedoch gewöhnlich nicht effizient innerhalb des Phloems von Pflanzen, die normalerweise systemisch von Wildtyp-Viren infiziert werden. Dies kann zum einen durch die Verlängerung der rekombinanten, viralen RNS und/oder durch die Anwesenheit von sich wiederholenden Sequenzen, die zu Rekombinationen bzw. Deletionen führen, woraus letztendlich eine Reversion zum Wildtyp-Virus resultiert, erklärt werden. Die Um­ wandlung der nachfolgenden Population zu Wildtyp-Viren tritt dann in systemisch infizierten Blättern auf.

Ein weiterer, wichtiger und charakteristischer Aspekt der viralen Vektoren ist das Niveau der Genexpression der Fremdgene und die Akkumulation des entsprechenden Proteins. Die Proteinmengen, die mit Hilfe der Vektoren erzielt werden, sind so hoch, daß sie z. B. im Fall des GUS-Proteins ohne weiteres mit Hilfe einer SDS-PAGE detektiert werden können.

Die Technologien, die sich für die Konstruktion von amplifizierenden Vektoren für die Expression von fremden Sequenzen in Wirtspflanzen als geeignet auszeichneten, sind auf der Basis von verschiedenen, viralen Genomen entwickelt worden (z. B. siehe G. Della- Cioppa et al., 1999, PCT WO 99/36516).

Die zentrale Eigenschaft von solchen Erfindungen war, daß die rekombinante, virale Pflanzennukleinsäure "eine oder mehrere, nicht native, subgenomische Promotoren enthält, die in der Lage sind, die angrenzenden Nukleinsäuresequenzen in Wirtspflanzen zu transkribieren bzw. zu exprimieren. Die rekombinanten, viralen Pflanzennuklein­ säuren können eventuell weiter modifiziert werden, um die gesamte oder Teile der kodierenden Sequenz des nativen Hüllproteins zu deletieren, so daß man eine nicht-nativ kodierende Hüllproteinsequenz unter der Kontrolle eines nativen Promotors oder eines der nicht nativen pflanzlichen, viralen, subgenomischen Promotoren erhält. Oder die native Hüllproteinsequenz wird unter die Kontrolle eines nicht nativen pflanzlichen, viralen, subgenomischen Promotors gestellt". In anderen Worten ausgedrückt, stellt oder stellen die nativen und nicht nativen sgPR-Sequenzen, die für die Herstellung von künstlichen sgRNSs mit Hilfe der viralen Vektoren benutzt wurden, die wichtigsten Element(e) dieser Erfindung dar. Eine wichtige Eigenschaft, die die Erfindung, die von unserer Gruppe präsentiert wird, von anderen unterscheidbar macht, ist, daß gemäß WO 99/36516 das fremde Gene zwangsläufig unterhalb (downstream) der sgPR-Sequenzen lokalisiert sein muß. Zum Beispiel sollte sie an der dem 5'-Ende nächsten Position der chimären sgRNS, die von dem viralen Vektor in den Wirtspflanzen produziert wird, lokalisiert sein. Im Gegensatz dazu schlägt unsere Erfindung vor, daß das fremde Gen von einem sgPR (wenn vorhanden) wenigstens durch ein (oder mehrere) virale Gen(e) getrennt ist, so daß das besagte, fremde Gen an der dem 3'-Ende nächsten Position oder innerhalb der aktiven, chimären sgRNS, die von dem Vektor produziert wird, lokalisiert ist. So wird auf diese Weise die Genexpression entweder durch eine native oder nicht native IRES-Sequenz vermittelt.

Das nächste, bevorzugte Ziel dieser Erfindung ist die Konstruktion eines neuen Typus der nicht nativen IRES-Sequenzen, der sogenannten künstlichen, nicht natürlichen, synthetischen IRES-Sequenzen, die in der Lage sind, eine CAP-unabhängige Translation des 5'-distalen Gens von eukaryotischen, polycistronischen mRNSs zu vermitteln. Wir zeigen, daß intercistronische Spacer, die komplementär zu der 18S rRNS verschiedener Länge und Komposition sind, in der Lage sind, die CAP-unabhängige Translation des 3'- proximalen GUS-Gens in einer bicistronischen H-GFP-IRES-GUS mRNS zu vermitteln (Abb. 13).

Abschließend stellt die Möglichkeit der Kombination von Wiederholungen von zwei oder mehreren fremden Genen, denen jeweils eine native oder nicht native IRES-Sequenz in dem auf der Amplifikation basierenden Vektorgenom voran geht, einen Vorteil der vorliegenden Erfindung dar. Die Expression einer solchen Kassette eines "IRES- Fremdgens" wird die gleichzeitige Produktion von zwei oder mehreren fremden Proteinen mit Hilfe des Vektors ermöglichen.

Viren, die zu verschiedenen taxonomischen Gruppen gehören, können zur Konstruktion von viralen Vektoren gemäß der Prinzipien dieser Erfindung genutzt werden. Das gilt sowohl für RNS- als auch für DNS-enthaltene Viren, für die im folgenden Beispiele gegeben werden (durchlaufend ist in diesem Dokument bei jedem Artspeziesnamen der Name der Ordnung, der Familie und der Gattung, zu dem dieser gehört, vorangestellt. Namen der Ordnungen, Familien und Gattungen sind in kursiv gesetzt, wenn sie von der ICTV bestätigt sind. Namen der Taxa in Anführungszeichen (und nicht in kursiv gesetzt) zeigen an, daß dieses Taxon keinen von der ICTV international bestätigten Namen hat. Trivialnamen der Spezies sind in normaler Schreibweise aufgeführt. Viren mit keiner formalen Zuordnung zu einer Gattung oder Familie sind angezeigt):

DNS-Viren Zirkuläre dsDNS-Viren

Familie: Caulimoviridae, Gattung: Badnavirus, Artspezies: commelina yellow mottle virus, Gattung: Caulimovirus, Artspezies: cauliflower mosaic virus, Gattung: "SbCMV- like vires", Artspezies: Soybean chloroticmottle virus, Gattung: "CsVMV-like vires", Artspezies: Cassava vein mosaicvirus, Gattung: "RTBV-Like vires", Artspezies: Rice tungro bacilliformvirus, Gattung: "Petunia vein clearing-like vires", Artspezies: Petunia vein clearing virus.

Zirkuläre ssDNS-Viren

Familie: Geminiviridae, Gattung: Mastrevirus (Untergruppe I Geminivirus), Artspezies: maize streak virus, Gattung: Curtovirus (Untergruppe II Geminivirus), Artspezies: beet curly top virus, Gattung: Begomovirus (Untergruppe III Geminivirus, Artspezies: bean golden mosaic virus.

RNS-Viren ssRNS-Viren

Familie: Bromoviridae, Gattung: Alfamovirus, Artspezies: alfalfa mosaic virus, Gattung: Ilarvirus, Artspezies: tobacco streak virus, Gattung: Bromovirus, Artspezies: brome mosaic virus, Gattung: Cucumovirus, Artspezies: cucumber mosaic virus.
Familie: Closeroviridae, Gattung: Closterovirus, Artspezies: beet yellow virus, Gattung: Crinivirus, Artspezies: Lettuce infectious yellows virus.
Familie: Comoviridae, Gattung: Comovirus, Artspezies: cowpea mosaic virus, Gattung: Fabavirus, Artspezies: broad bean wilt virus 1, Gattung: Nepovirus, Artspezies: tobacco ringspot virus.
Familie: Potyvirdae, Gattung: Potyvirus, Artspezies: potato virus Y, Gattung: Rymovirus, Artspezies: ryegrass mosaic virus, Gattung: Bymovirus, Artspezies: barley yellow mosaic virus.
Familie: Sequiviridae, Gattung: Sequivirus, Artspezies: parsnip yellow fleck virus, Gattung: Waikavirus, Artspezies: rice tungro spherical virus.
Familie: Tombusviridae, Gattung: carmovirus, Artspezies: carnation mottle virus.
Gattung: Dianthosvirus, Artspezies: carnation ringspot virus, Gattung: Machlomovirus, Artspezies: maize chlorotic mottle virus, Gattung: Necrovirus, Artspezies: tobacco necrosis virus, Gattung: Tombusvirus, Artspezies: tomato bushy stunt virus.

Nicht zugeordnete Genera der ssRNS-Viren

Gattung: Capillovirus, Artspezies: apple stern grooving virus, Gattung: Carlavirus, Artspezies: carnation latent virus, Gattung: Enamovirus, Artspezies: pea enation mosaic virus, Gattung: Furovirus, Artspezies: soil-borne wheat mosaic virus, Gattung: Hordeivirus, Artspezies: barley stripe mosaic virus, Gattung: Idaeovirus, Artspezies: raspberry bushy dwarf virus, Gattung: Luteovirus, Artspezies: barley yellow dwarf virus, Gattung: Marafivirus, Artspezies: maize rayado fino virus, Gattung: Potexvirus, Artspezies: potato virus X, Gattung: Sobemovirus, Artspezies: Southern bean mosaic virus, Gattung: Tenuivirus, Artspezies: rice stripe virus, Gattung: Tobamovirus, Artspezies: tobacco mosaic virus, Gattung: Tobravirus, Artspezies: tobacco rattle virus, Gattung: Trichovirus, Artspezies: apple chlorotic leaf spot virus, Gattung: Tymovirus, Artspezies: turnip yellow mosaic virus, Gattung: Umbravirus, Artspezies: carrot mottle virus.

Negative ssRNS-Viren

Ordnung: Mononegavirales, Familie: Rhabdoviridae, Gattung: Cytorhabdovirus, Artspezies: lettuce necrotie yellows virus, Gattung: Nucleorhabdovirus, Artspezies: potato yellow dwarf virus.
Familie: Bunyaviridae, Gattung: Tospovirus, Artspezies: tomato spotted wilt virus.

DsRNS-Viren

Familie: Partitiviridae, Gattung: Alphacryptovirus, Artspezies: white clover cryptic virus 1, Gattung: Betacryptovirus, Artspezies: white clover cryptic virus 2.
Familie: Reoviridae, Gattung: Fijivirus, Artspezies: Fiji disease virus, Gattung: Phytoreovirus, Artspezies: wound tumor virus, Gattung: Oryzavirus, Artspezies: rice ragged stunt virus.

Nicht zugeordnete Viren

Genom ssDNS: Spezies banana bunchy top virus, Spezies coconut foliar decay virus, Spezies subterranean clover stunt virus,
Genom dsDNS: Spezies cucumber vein yellowing virus,
Genom dsRNS: Spezies tobacco stunt virus,
Genom ssRNS, Spezies Garlic viruses A, B, C, D, Spezies grapevine fleck virus, Spezies maize white line mosaic virus, Spezies olive latent virus 2, Spezies ourmia melon virus, Spezies Pelargonium zonate spot virus.

Satelliten und Viroide

Satelliten: ssRNS Satelliten Viren: Untergruppe 2 Satelliten Viren, Artspezies: tobacco necrosis satellite,
Satelliten RNS, Untergruppe 2 B Typus mRNS Satelliten, Untergruppe 3 C Typus lineare RNS Satelliten, Untergruppe 4 D Typus zirkuläre RNS Satelliten, Viroide, Artspezies: potato spindle tuber viroide.

Insbesondere können die Methoden der vorliegenden Erfindung vorzugsweise für die Konstruktion von viralen, auf einem Replikon basierende Vektoren angewendet werden, indem die rekombinanten Genome der plus-sense-ssRNS-Viren, die vorzugsweise zu der Gattung Tobamovirus oder zu der Familie Bromoviridae oder Potyviridae aber auch zu den DNS-enthaltenen Viren gehören, eingesetzt werden. Im letzteren Fall sollte das fremde Gen möglichst abwärts (downstream) eines viralen Gens lokalisiert sein, so daß dessen Expression mit Hilfe der IRES-Sequenz von einer bicistronischen oder polycistronischen mRNS, die von einer DNS-abhängigen RNS-Polymerase mit Hilfe eines genomischen Promotors transkribiert wurde, vermittelt werden kann.

Ein gesonderter und bevorzugter Aspekt dieser Erfindung befaßt sich mit der Anwendung der Methoden dieser Erfindung für die Konstruktion von auf ssDNS-basierenden Vektoren. Die auf dem Geminivirus basierenden Vektoren, die das fremde Gen bzw. die fremden Gene unter der Kontrolle einer IRES-Sequenz exprimieren, können für diesen Aspekt als Beispiel dienen. Die Geminiviren repräsentieren eine Gruppe von Pflanzenviren mit einer einteiligen (monopartite) oder zweiteiligen (bipartite), zirkulären ssDNS, die gepaarte, quasi icosahedrale Partikel hat (Übersichtsartikel siehe Hull und Davies, 1983, Adv. Virus Res. 28, 1 - 45; Mullineaux et al., 1992, "Genetic engineering with plant viruses", Wilson und Davies, Hrsg., 1992, CRC Press, Inc.). Die zwei ssDNS- Komponenten des zweiteiligen (bipartite) Geminivirus werden als A und B bezeichnet und kodieren für 4 bzw. 2 Proteine. Die DNS A enthält das Hüllproteingen und drei weitere Gene, die an der Replikation der DNS beteiligt sind. Im Gegensatz dazu kodiert die DNS B für zwei Proteine, die für die Ausbreitung des Virus essentiel sind. Es konnte gezeigt werden, daß die Genome von zweiteiligen (bipartite) Geminiviren zu der Gattung Begomovirus gehören. So können der tomato golden mosaic-virus (TGMV) und der bean golden mosaic-virus (BGMV) replizieren und sich trotz einer Deletion im Hüllproteingen innerhalb einer bestimmten Wirtspflanze ausbreiten (Gardiner et al., 1988, EMBO J. 7, 899 - 904; Jeffrey et al., 1996, Virology 223, 208 - 218; Azzam et al., 1994, Virology 204, 289 - 296). Es ist bemerkenswert, daß einige Begomoviren einschließlich des BGMV eine Phloem-Limitierung aufweisen und auf die Zellen des vaskulären Systems beschränkt sind. Somit bleibt der BGMV-Phloem limitiert, während der TGMV in der Lage ist, in das Mesophyllgewebe von systemisch infizierten Blättern einzudringen (Petty und Morra, 2000, Abstracts of 19^th Annual meeting of American Society for Virology, S. 127). Die eingereichte Erfindung schlägt vor, das fremde Gen auf zwei Wegen in ein zweigeteiltes (bipartite) Geminivirus-Genom einzufügen: (i) abwärts (downstream) von einem der Gene (z. B. im Fall des BGMV), insbesondere abwärts (downstream) des Hüllproteingens, so daß das offene Leseraster des Hüllproteins intakt oder vom 3'-Ende verkürzt wird und die IRES-Sequenz aufwärts (upstream) des fremden Gens eingefügt werden kann. Folglich kann die mRNS-Transkription von dem nativen DNS-Promotor weitergehen, und es wird letztlich eine bizitronische, chimäre mRNS erzeugt, die die ersten, viralen Gene (oder einen Teil hiervon), die IRES-Sequenz und die 3'-proximalen, fremden Gene umfasst. Gleichzeitig wird die Expression des fremden Gens durch die IRES-Sequenz vermittelt. Alternativ (ii) kann die voll-Länge-DNS-Kopie des RNS-Genoms des viralen Vektors in die DNS eines Hüllprotein defizienten, zweiteiligen (bipartite) Geminivirus unter die Kontrolle des Hüllproteingen-Promotors inseriert werden. Das RNS-Genom des RNS-Vektor-Virus wird dann als Resultat der Transkription der DNS A in der Pflanzenzelle, die mit einer Mischung der rekombinanten DNS A und nicht modifizierter DNS B inokuliert wurde, erzeugt. Ein Vorteil dieser Methode liegt darin, daß der Geminivirus-Vektor nur als ein Vehikel benutzt wird, um den Vektor zu den primär inokulierten Zellen zu bringen. Alle anderen Schritte werden von dem Tobamovirus- Vektor selbst durchgeführt. Dies umfaßt die Erzeugung der IRES-tragenden Vektor-RNS, nachdem die Geminivirus-Vektor-DNS mit Hilfe einer zellulären RNS-Polymerase transkribiert wurde, ihre Replizierung, Translation, die systemische Verbreitung innerhalb der Wirtspflanze und die Fremdgenexpression.

Als eine zusätzliche Möglichkeit für die Herstellung eines ssDNS-Vektors kann die Klonierung der viralen cDNS und des fremden Gens in einen Phagemid-Vektor mit anschließender Erzeugung der ssDNS nach Standardmethoden angegeben werden. Wenn man in Betracht zieht, daß vom Tobamovirus abgeleitete IRES-Sequenzen auch in tierischen Zellen funktional aktiv sind (unsere vorhergehende Patentanmeldung), kann die Methode der vorliegenden Erfindung für die Herstellung von rekombinanter, viraler RNS und von viralen Vektoren auf der Basis von tierischen Viren, wie z. B. der Viren, die zu der Familie Togaviridae, Caliciviridae, Astroviridae, Picornaviridae, Flaviviridae gehören, benutzt werden. Auf diese Weise werden neue Vektoren erzeugt, die fremde Gene unter der Kontrolle von IRES-Sequenzen, die von Pflanzenviren abgeleitetet sind, exprimieren. Solche auf tierischen Viren basierenden Vektoren für Pflanzen und Tiere können nützlich in dem Bereich der Impfstoffherstellung oder der Gentherapie sein. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, daß die stabförmigen Virionen der Tobamoviren und besonders die flexiblen und langen Virionen der filamentösen Potexviren, Carlaviren, Potyviren und Closteroviren offensichtlich die besten Modelle für die Realisierung der Methoden dieser vorliegenden Erfindung darstellen.

Das nächste, bevorzugte Ziel dieser Erfindung ist der Gebrauch der IRES-Sequenzen in der Art, daß die viralen, auf der Amplifikation basierenden Vektoren innerhalb des 5'- NTR die IRES-Sequenz enthalten werden. Es wird dabei angenommen, daß diese Insertion einer IRES-Sequenz nicht die virale Replikation verhindert, sondern in der Lage ist, eine effiziente, CAP-unabhängige Translation der Transkripte der genomischen Vektor-RNS sicherzustellen. Deswegen könnte das besagte Konstrukt folgendes umfassen: (i) Ein IRES-Element innerhalb oder abwärts (downstream) der 5'- untranslatierten leader-Sequenz, die nativ oder nicht-nativ für diesen besagten Vektor ist und die eine CAP-unabhängige Translation der viralen 5'-proximalen Gene (RdRp-Gen) vermittelt; des weiteren (ii) wenigstens eine native oder nicht native IRES-Sequenz, die abwärts (downstream) von einem oder mehreren, viralen Strukturgenen und aufwärts (upstream) des fremden Gens bzw. der fremden Gene lokalisiert ist, um deren CAP- unabhängige Translation zu vermitteln. Gemäß dieser Methode wird der spezifische Infektionsgrad des ungeschützten (uncapped) voll-Länge-Vektor-Transkriptes auf Grund der effizienten 5'-IRES vermittelten Translation der elterlichen RNS-Moleküle in den ersten inokulierten Zellen erhöht.

Ein anderes bevorzugtes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Methode, ein oder mehrere Protein(e) von Bedeutung in Pflanzenzellen auf der Basis der Einführung und der ungeschützten (uncapped) Expression eines fremden Gens von einer mono- oder polycistronischen mRNS-Sequenz zu produzieren, die mit Hilfe einer spezifischen, pflanzlichen IRES-Sequenz, die wiederum aufwärts (upstream) der besagten Fremdgen- Sequenz lokalisiert ist, vermittelt wird. Eine besondere Eigenschaft dieser Methode liegt darin, daß die Technologie eine Prozedur beinhaltet, die die selektive Abschaltung der zellulären CAP-abhängigen mRNS-Translation mittels bestimmter chemischer Verbind­ ungen erlaubt. Diese Prozedur beeinflusst jedoch nicht die CAP-unabhängige, IRES- vermittelte Translation von mRNSs, die künstlich in die Pflanzenzellen eingeführt wurden. Auf diese Weise wird die Kontrolle und die Verstärkung der CAP-unabhängigen Expression erreicht.

Alternativ kann die Inhibierung der Translation der zellulären, geschützten (capped) RNS auf Pflanzen angewendet werden, die mit dem besagten Vektor selbst infiziert wurden, der das Fremdgen bzw. die Fremdgene in einer CAP-unabhängigen Weise exprimiert. Bedingungen, die die Translation der zellulären, geschützten (capped) RNS unterdrücken, ermöglichen die selektive Expression des(r) Fremdgens(e) mit Hilfe des besagten Virus-Vektors.

Der Vektor dieser Erfindung kann ein RNS- oder DNS-Vektor sein. Er kann ss(+), ss(-) oder ds sein. Er kann irgendeine Art der Amplifikation, die von Viren bekannt sind, zeigen. Dies beinhaltet die Multiplikation der Vektor-Nukleinsäure, optional die Erzeugung des Hüllproteins und optional die Erzeugung der Proteine, die für die Ausbreitung von einer Zelle zu der anderen Zelle oder für die Ferndistanzausbreitung (long distance movement) benötigt werden. Die Gene, die für die Replikation und/oder die Umhüllung und/oder für die Ausbreitung notwendig sind, können ganz oder teilweise in entsprechend veränderten Wirtspflanzen exprimiert werden. Auf diese Weise besteht dieses System aus einem Vektor und einer Wirtspflanze, die wechselseitig angepasst werden.

Der Vektor kann mit Modifizierungen von einem Virus abgeleitet oder de novo synthetisiert werden. Er kann nur IRES-Elemente enthalten, die keine subgenomische Aktivität mehr aufweisen. Der Vektor kann jedoch einen oder mehrere, subgenomische Promotoren mit einem oder mehreren IRES-Elementen, die effektiv keine subgenomische Promotoraktivität mehr aufweisen, verknüpfen, so daß die Anzahl der Cistrone größer als die Anzahl der Promotoren ist.

Wenn man den einfachsten Fall mit einem IRES-Element betrachtet, kann dieses besagte Element aufwärts (upstream) von dem (fremden) Gen mit Bedeutung lokalisiert sein, so daß es von dem besagten IRES-Element direkt exprimiert wird. Oder das IRES-Element wird optional abwärts (downstream) von einem (viralen) Gen lokalisiert, so daß es IRES- unabhängig exprimiert wird.

Als Alternative kann das Gen von Bedeutung auch aufwärts (upstream) von einem IRES- Element lokalisiert sein und IRES-unabhängig exprimiert werden. Das IRES-Element dient dann zur Expression der viralen Gene, die abwärts (downstream) davon lokalisiert sind. Diese einfachsten Kombinationen können natürlich einfach oder mehrmals in einen komplexeren Vektor verwirklicht werden.

Der Vektor kann eine Sequenz in antisense-Orientierung enthalten, um die Expression eines Wirtsgens zu unterdrücken. Diese Funktion der Suppression kann alleine oder in Kombination mit der Expression eines fremden Gens von Bedeutung existieren. Ein besonders bevorzugter Fall beinhaltet die Suppression eines Gens, das essentiell für die CAP-abhängige Translation ist. Als Beispiele können die Gene für die Translationsinitiationsfaktoren wie z. B. dem elF4-Initiationsfaktor angesehen werden, der mit der CAP-abhängigen Translation verknüpft ist. Letztendlich dient dann die Translations­ maschinerie in der Wirtspflanze nur noch der Vektortranslation. In diesem Fall muss die Translation der Vektor-RNS gänzlich CAP-unabhängig sein. Natürlich kann der Vektor auch in einer Pflanzenzelle von einem Vor-Vektor in Prozessierungsschritten, wie z. B. dem Intron-Splicing, erzeugt werden.

Das IRES-Element kann aus einem Pflanzenvirus stammen. Alternativ hierzu kann es auch aus irgendeinem Virus stammen, solange es den funktionalen Bedürfnissen in der Pflanzenzelle genügt. Weiterhin kann ein IRES-Element, das in einer Pflanzenzelle wirksam ist, synthetisch oder künstlich sein. Die Synthese kann sich hierbei an die Sequenz der 18S rRNS der Wirtspflanze anlehnen, um komplementäre Teilsequenzen dieser 18S rRNS als funktionale IRES-Elemente auszunutzen. Komplementär bezieht sich in diesem Zusammenhang auf die GC-, die AU- und im weiteren Sinne auf die GU- Basenpaarung. Weiter können solche IRES-Elemente Multimere von diesen komplemen­ tären Sequenzen sein, um die Effizienz in der Bindung der Ribosomen zu erhöhen. Das Multimer kann aus identischen bzw. unterschiedlichen, komplementären Sequenz­ einheiten, die essentiell für die Funktion als IRES-Element sind, aufgebaut sein. Darüber hinaus können künstliche IRES-Elemente mit hoher Translationseffizienz und effektiv keiner subgenomischen Promotoraktivität auch mit Hilfe des Prozesses der gezielten Evolution - wie in den Patenten US 6,096,548 oder US 6,117,679 beschrieben - erzeugt werden. Dieses kann mit einer Population von Vektoren, die willkürlich ausgewählte IRES-Sequenzen enthalten, in Zellkulturen umgesetzt werden. Die Klone, die ein Reportergen exprimieren, das funktional mit einem potentiellen IRES-Element verknüpft ist, können selektiert werden. Von diesen wiederum werden diejenigen eliminiert, die eine subgenomische Promotoraktivität ausfweisen. Weitere Runden der zufälligen Anordnung und Selektion können folgen.

Das IRES-Element des Vektors dieser Erfindung kann effektiv ohne Promotoraktivität sein. Das bedeutet, daß die Expression eines Gens, das funktional mit einem IRES- Element verknüpft ist, nicht bei einer restlichen, subgenomischen Promotoraktivität auftreten würde. Diese Wirkungsweise kann mit Hilfe von Standardmethoden der Molekularbiologie, wie dem Northern-Blot, der Primer-Verlängerung (Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. F. Ausubel et al., 1999, John Wiley & Sons), der 5'-RACE- Technologie (Gibco BRL, USA) und ähnlichen Methoden bestimmt werden. Es sollte hinzugefügt werden, daß IRES-Elemente, die detektierbare, subgenomische Promotor­ aktivität aufweisen aber zwingenderweise eher als translationale als als transkriptionale Elemente operieren, auch Gegenstand dieser Erfindung sind. Diese Unterscheidung könnte zum Beispiel mit Hilfe der quantitativen Messung der relativen Mengen von zwei Arten von mRNSs (der kurzen mRNS und der langen mRNS) in Northern-Analysen erreicht werden, wobei die kurze mRNS mit Hilfe von subgenomischer Promotoraktiviät und die lange mRNS ohne subgenomische Promotoraktiviät erzeugt wird. Wenn das IRES-Element tatsächlich als ein viraler, subgenomischer Promotor agiert, sollte die relative Menge der korrespondierenden, kurzen RNS kleiner als 20%, vorzugsweise kleiner als 10% und am besten kleiner als 5% der Summe der kurzen und langen mRNS sein.

Somit stellen wir einen Vektor bereit, der in der Lage ist, in einer Pflanze ein Gen zu amplifizieren. Der Vektor umfaßt dabei eine Nukleinsäuresequenz, die eine Sequenz für wenigstens ein nicht-virales Gen und ein IRES-Element aufweist, das für die Translation des besagten Gens in Pflanzen notwendig ist. Die Expression dieses besagten Gens leitet sich dabei aber mehr von den translationalen als von den transkriptionalen Eigenschaften dieses besagten IRES-Elementes ab, die mit Standard-Prozeduren der Molekularbiologie nachgewiesen werden können.

Die neuen Vektoren der Erfindung eröffnen neue Wege für die genetische Modifikation von Pflanzen. Als eine der ersten Möglichkeiten schlagen wir den Gebrauch dieser Vektoren für die Bestimmung der Funktion eines Strukturgens in Pflanzen vor. Dieses ist von beträchtlichem Interesse für die Genomforschung (Genomics). Deswegen ist eine Pflanze, deren Genom sequenziert wurde, von speziellem Interesse. Dies ist eine Anwendung in einem kleinem Maßstab (Pflanze für Pflanze). Der Vektor dieser Erfindung ist sehr wirkungsvoll für diese Applikation, weil er die Unterdrückung (Suppression) von Genen mit Bedeutung und/oder die Überexpression von Genen erlaubt, um die Genfunktionen, die zur Zeit im verstärkten Maße entdeckt werden, zu analysieren.

In einer Großanwendung kann der Vektor benutzt werden, um eine Eigenschaft oder ein Protein in einer Wirtspflanze zu erzeugen. Infektionen von Pflanzen mit dem Vektor können auf einer landwirtschaftlichen Fläche durchgeführt werden, auf der zuvor nicht modifizierte Pflanzen angezogen worden sind. Dieses erlaubt zum ersten Mal eine genetische Modifizierung von Feldpflanzen, wobei der Landwirt größte Freiheiten in der Selektion aus einer Vielfalt von Samen und Vektoren hat, um ein gewünschtes Protein oder Eigenschaft zu erzeugen.

Beispiele für Pflanzenspezies von Interesse für diese Anwendung sind monokotyle Pflanzen, wie Weizen, Mais, Reis, Gerste, Hafer, Hirse und ähnliche oder dikotyle Pflanzen, wie Rapssaat, Raps, Zuckerrübe, Sojabohne, Erbse, Luzern, Baumwolle, Sonnenblume, Kartoffel, Tomate, Tabak und ähnliche.

In dem Folgenden wird die Erfindung weitergehender mit der Hilfe spezifischer Beispiele beschrieben. Molekularbiologische Standardtechniken wurden gemäß Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) durchgeführt. Alle Plasmide, die in der Erfindung benutzt werden, können gemäß den Anweisungen der Spezifikationen von einer Person mit durchschnittlicher Qualifikation mit normalen, experimentellen Hilfsmitteln hergestellt werden.

BEISPIEL 1 Konstruktion eines Tobamovirus-Vektors zur Infektion von Pflanzen aus der Familie der Kruziferen

Virione eines bekannten Tombavirus, der Crucifer-Tombavirus (crTMV) genannt wird und der in der Lage ist, Kreuzblütler systemisch zu infizieren, wurden von Olearacia- officinalis-L.-Pflanzen, die Mosaik-Symptome auswiesen, isoliert. Die Resultate der Überprüfung der Wirtsspezifität sind in Tabelle 1 gezeigt.

Plasmid-Konstruktionen

crTMV-cDNS wurde mit Hilfe der Didesoxynukleotid-Sequenzierung charakterisiert (Dorokhov et al., 1994, FEBS-Letters 350, 5 - 8). Infektiöse voll-Länge-cDNS-Klone wurden mit Hilfe des T7-RNS-Polymerase-Promotors in einer RT-PCR-Reaktion mit crTMV-RNS als Template erzeugt. Folgende Oligonukleotide wurden dabei benutzt:

crTMV1-Kpn (upstream)

Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Kpn-I-Restriktionsstelle dar; unterstrichen und klein geschrieben sind die Nukleotide der T7-RNS-Polymerase- Promotorsequenz; die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 5'-Ende der crTMV-cDNS-Sequenz abgeleitet.

crTMV2 (downstream)

Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Not-I-Restriktionsstelle dar; die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 3'-Ende der crTMV-cDNS-Sequenz abgeleitet; dieses RT-PCR-Produkt wurde in den pUC19-Vektor zwischen die Kpn-I- und BamH-I-Restriktionstelle kloniert (Abb. 1).

Für infektiöse voll-Länge-cDNS-Klone, die mit Hilfe des SP6-RNS-Polymerase- Promotors in einer RT-PCR-Reaktion mit crTMV-RNS als Template erzeugt wurden, wurden folgende Oligonukleotide benutzt:

crTMV 1-SP6 (upstream)

Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Kpn-I-Restriktionsstelle dar; unterstrichen und klein geschrieben sind die Nukleotide der SP6-RNS-Polymerase- Promotorsequenz, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 5'-Ende der crTMV-cDNS-Sequenz abgeleitet.

crTMV2-SP6 (downstream)

Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Not-I-Restriktionsstelle dar; die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 3'-Ende der crTMV-cDNS-Sequenz abgeleitet; dieses RT-PCR-Produkt wurde in den pUC19-Vektor zwischen die Kpn-I- und BamH-I-Restriktionstelle kloniert (Abb. 1).

Die voll-Länge-crTMV-cDNS-Klone wurden mit Hilfe der Didesoxynukleotid- Sequenzierung charakterisiert. Die Fähigkeit von infektiösen crTMV-Transkripten systemisch Nicotiana- und Kreuzblütler-Arten zu infizieren, konnte in Infektions­ experimenten mit Nicotiana tabacum var. Samsun bzw. Arabidopsis thaliana bestätigt werden.

Tabelle 1

Virus-Detektion und Virus-Symptome, die nach mechanischer Infektion mit crTMV verursacht wurden

BEISPIEL 2 Konstruktion eines Tobamovirus-Vektors für die Expression des GUS-Gens in Pflanzen der Gattung Nicotiana und der Familie der Kruziferen

Eine Serie von IRES-vermittelten Expressionsvektoren T7/crTMV/GUS wurden wie folgt konstruiert. Erstens, Hind-III- und Xba-I-Restriktionsstellen wurden in das CP-Gen des Sac II/Not-I-Fragment des T7/crTMV-Vektors (Abb. 1) mit Hilfe einer Polymerase- Kettenreaktion (PCR) und zwei Paaren von spezifischen Primern inseriert. Zweitens IRES_MP,75 ^CR-GUS-, IRES_MP,75 ^UI-GUS-, IRES_MP,228 ^CR-GUS-, IRES_CP,148 ^CR-GUS-, IRES_CP,148 ^UI-GUS-, PL-GUS-cDNS, die in Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139 - 154) beschrieben sind, wurden in die Hind-III- und Xba-I-Restriktionsstellen des Sac- II/Not-I-Fragmentes des T7/crTMV-Vektors inseriert, so daß eine Sac I-IRES_MP,75 ^CR- GUS-Not-I-, Sac-II-IRES_MP,75 ^UI-GUS-Not-I-, Sac-II-IRES_MP,228 ^CR-GUS-Not-I-, Sac-II- IRES_CP,148 ^CR-GUS-Not-I-, Sac-II-IRES_CP,148 ^UI-GUS-Not-I- bzw. Sac-II-PL-GUS-Not-I- cDNS erhalten wurde.

Drittens ein Sac-II-Not-I-cDNS-Fragment des T7/crTMV-Vektors wurde durch ein Sac-I- IRES_MP,75 ^CR-GUS-Not-I- oder ein Sac-II-IRES_MP,75 ^UI-GUS-Not-I- oder ein Sac-II- IRES_MP,228 ^CR-GUS-Not-I oder ein Sac-II-IRES_CP,148 ^CR-GUS-Not-I- oder ein Sac-II- IRES_CP,148 ^UI-GUS-Not-I- oder ein Sac-II-PL-GUS-Not-I-cDNS-Fragment ersetzt, um die Vektoren T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS (Abb. 2), T7/crTMV/ IRES_MP,75 ^UI-GUS (Abb. 2), T7/crTMV/IRES_MP,228 ^CR-GUS (Abb. 2), T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GUS (Abb. 2), T7/crTMV/IRES_CP,148 ^UI-GUS (Abb. 2) bzw. T7/crTMV/PL-GUS (Abb. 2) zu erhalten.

BEISPIEL 3 Expression des GUS-Gens in transfizierten Pflanzen der Gattung Nicotiana und der Familie der Kruziferen

Dieses Beispiel demonstriert die Tobamovirus IRES-vermittelte Expression des GUS- Gens in Nicotiana benthamiana- und Arabidopsis-thaliana-Pflanzen, die mit den auf dem crTMV-basierenden Vektoren - Vektor T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS, (Abb. 2), Vektor T7/crTMV/IRES_MP,75 ^UI-GUS (Abb. 2), Vektor T7/crTMV/IRES_MP,228 ^CR-GUS (Abb. 2), Vektor T7/crTMV/IRES_CP,148 ^CR-GUS (Abb. 2), Vektor T7/crTMV/IRES_CP,148 ^UI-GUS (Abb. 2) bzw. Vektor T7/crTMV/PL-GUS (Abb. 2) - infiziert wurden. Die Plasmide T7/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS (Abb. 2), T7/crTMV/IRES_MP,75 ^UI-GUS (Abb. 2), T7/crTMV/IRES_MP,228 ^CR-GUS (Abb. 2), T7/crTMV/IRES_CP,₁₄₈ ^CR-GUS (Abb. 2), T7/crTMV/IRES_CP,148 ^UI-GUS (Abb. 2) bzw. T7/crTMV/PL-GUS (Abb. 2) wurden mit Not I linearisiert. Die rekombinanten Plasmide wurden gemäß Dawson et al. (1986 Proc. Natl. Acad. Sci., USA 83, 1832-1836) in vitro transkribiert. Agarosegelelektrophorese der RNS-Transkripte bestätigte, daß diese intakt waren. Die RNS-Konzentration wurde mittels Agarosegelelektrophorese und Spektrophotometrie quantifiziert.

GUS-Detektion

Inokulierte Blätter wurden 10-14 Tage nach der Transfektion mit geschützten (capped) voll-Länge-Transkripten geerntet. IRES-Aktivität wurde mittels histochemischer Detektion der GUS-Expression, wie bei Jefferson beschrieben, verfolgt (1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 387 - 405). Die Proben wurden mit dem kolorimetrischen GUS-Substrat infiltriert, wobei die Methode von De Block und Debrouwer (1992, Plant J. 2, 261 - 266) folgendermaßen modifiziert wurde, um die Diffusion der intermediären Produkte der Reaktion zu limitieren: 0,115 M Phosphatpuffer, pH 7,0 versetzt mit 5- bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide (x-Gluc) 600 µg/ml; 3 mM Kaliumhexa­ cyanoferrat; 10 mM EDTA. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Blätter mit 70% Ethanol entfärbt und unter dem Lichtmikroskop untersucht.

BEISPIEL 4 IRES_MP,75 ^CR ist nicht als subgenomischer Promotor des MP-Gens funktional, sondern vermittelt die MP-Gen-Expression über die CAP-unabhängige, interne Initiation der Translation in TMV-infizierten Pflanzen

Dieses Beispiel zeigt verschiedene Ansätze, um die Möglichkeit der Verwendung des IRES_MP,75 ^CR-Elementes in einem viralen Vektor für die CAP-unabhängige Expression eines Gens von Bedeutung zu untermauern.

CrTMV MP subgenomische RNS hat eine 125-nt lange 5'-untranslatierte Region (5'NTR) und enthält eine die Translation behindernde, sekundäre Struktur (stem-loop)

Um die Länge und die Nukleotidsequenz der 5'-untranslatierten Region des TMV UI und der crTMV MP subgenomischen RNS (I₂sgRNS) zu bestimmen, wurde das Protokoll für die Primer-Verlängerungsexperimente nach Letho et al. (1990, Virology 174, 145 - 157) auf folgende Art und Weise geändert: (i) AMV reverse Transkriptase (RT); (ii) RT- Reaktion bei 45°C; (iii) die GC-reichen Primer; (iv) erhöhte dNTP-Konzentration; (v) dITP um die Ausbildung von Sekundärstrukturen zu verhindern. Es wurde gezeigt (Abb. 3), daß die 5'-UTR-Sequenz der crTMV I₂ sgRNS aus 125 Nukleotiden besteht. Dieses Ergebnis wurde mittels direkter 5'-UTR-RT-Sequenzierung bestätigt. Abb. 3B zeigt, daß die crTMV 5'NTR eine stabile hairpin-loop-Struktur enthält. Wenn man diese in einem künstlichen Transkript aufwärts (upstream) von dem MP-Gen plaziert, wird die MP-Gen-Translation in vitro inhibiert (Abb. 4). Dieses wiederum bedeutet, daß das IRES_MP,75 ^CR-Element, das zwischen 5'HI₂ und dem MP-Gen lokalisiert ist, eine effiziente CAP-unabhängige, interne Inititiation der Translation vermitteln kann. Abb. 5 zeigt, daß auch in anderen Tobamoviren zu 5'HI₂ homologe, putative hairpin-loop-Strukturen, die die Translation inhibieren, in den 125-nt-Sequenzen aufwärts (upstream) des MP- Gens gefunden werden konnten.

CrTMV und TMV UI MP subgenomische RNS ist nicht geschützt (non-capped)

Um die Struktur des 5'-Terminus der subgenomischen RNS zu studieren, die für das 30K- Bewegungsprotein (MP) von crTMV kodiert, wurde die "Jump-Start"-Methode, die von Active Motif angeboten wird, benutzt. Jump-Start^TM ist die Methode der spezifischen, chemischen Ligation einer RNS-Markierung an das 5'-Ende von geschützter (capped) RNS. Während der reversen Transkription wird die Ribooligonukleotid-Markierung einer bekannten Sequenz in das 3'-Ende der Erststrang-cDNS eingebaut. Diese erzeugt eine bekannte Priming-Stelle, die für die PCR geeignet ist.

Anfänglich werden die 5'-terminalen 2'-3'-cis-Glykol-Gruppen der geschützten (capped) RNS in reaktive di-Aldehyde mittels Natriumperjodate-Oxidation umgewandelt. 1 - 2 µl einer getesteten RNS (1 µg/ml) wurde mit 14 µl reinem Wasser und 1 µl Natriumacetat- Puffer (pH 5,5) gemischt. Dann wurden 4 µl einer 0,1-M-Natriumperjodat-Lösung hinzugefügt und das Reaktionsgemisch für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurde eine 3'-Aminoalkyl-derivatisierte, synthetische Ribooligonukleotid-Markierung chemisch an die di-Aldehyd-Enden der oxidierten RNS mittles reduktiver Amination in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid ligiert. 5 µl Natriumhyphosphit wurde hinzugefügt und das Reaktionsgemisch für 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 23 µl Wasser, 1 µl Natriumacetat-Puffer (pH 4,5) und 2 µl der ribo-Oligonukleotid-Markierung 5'- CTAATACGACTCACTATAGGG (28,5 pmol/µl) zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt und 15 Minuten inkubiert. Dann wurden 10 µl Natriumcyanoborhydrid zugesetzt und 2 Stunden inkubiert. Anschließend wurden 400 µl einer 2% Lithiumperchlorat-Aceton-Lösung zugesetzt, 15 Minuten bei -20°C inkubiert und 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde mit Aceton zweimal gewaschen und in 20 µl Wasser aufgenommen.

Um überschüssige RNS-Markierung zu entfernen, wurde eine CTAB-Prezipitation in Gegenwart von 0,3 M NaCl durchgeführt. CTAB ist ein starkes, kationisches Detergens, das an Nukleinsäuren bindet und unlösliche Komplexe bildet. Die Komplexbildung ist von der Salzkonzentration abhängig: wenn die Salzkonzentration oberhalb von 1 M liegt, wird kein Komplex gebildet; im Gegensatz dazu werden bei einer Salzkonzentration unterhalb 0,2 M alle Nukleinsäuren effizient komplexiert. Bei einer Salzkonzentration zwischen 0,3 M und 0,4 M ist die Komplexierung von kleinen Einzelstrangnukleinsäuren sehr ineffizient (Belyavsky et al., 1989 Nucleic Acids Res. 25, 2919 - 2932; Bertiolo et al., 1994, BioTechniques 16, 1054 - 1058). 10 µl einer 1,2-M-NaCl-Lösung (bis zu einer Endkonzentration von 0,4 M) und 3 µl einer 10% CTAB-Lösung (bis zu einer Endkonzentration von 1%) wurden hinzugefügt, das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann für 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 µl einer 1,2-M-NaCl-Lösung resuspendiert, 20 µl Wasser und 3 µl einer 10- %igen CTAB-Lösung zugesetzt. Der Ansatz wurde anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 30 µl einer 1,2-M-NaCl-Lösung gelöst, 80 µl 96% Ethanol zugesetzt und der Ansatz über Nacht bei -20°C inkubiert. Darm wurde wiederum für 5 Minuten zentrifugiert und das Pellet mit 70% Ethanol gewaschen. Zuletzt wurde das Pellet der markierten RNS in 24 µl Wasser gelöst.

Am Ende resultierte die Transkription mit spezifischen Primern für das 3'-Gen in dem Einbau der 5'-Markierungssequenz am 3'-Terminus der Erststrang-cDNS. Für die reverse Transkription wurden 12 µl der markierten RNS, 1 µl der spezifischen Primer vom 3'- Ende, 4 µl des 5 × Puffers für die SuperScript^TMII (Gibco BRL Life Technologies, 250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂) gemischt, für 30 Sekunden bei 95°C inkubiert und auf Eis abgekühlt. Anschließend wurde zu dem Reaktionsgemisch 0,5 µl einer DTT-Lösung (Endkonzentration 1 mM), 2 µl einer 10-mM-dNTP-Lösung, 0,5 µl RNAsin, 0,5 µl SuperScript^TMII-Enzym zugesetzt und für 15 Minuten bei 42°C inkubiert. Die Anwesenheit von MgCl₂ in dem Reaktionsansatz erlaubt dem SuperScriptII^TM-Enzym, die CAP-Struktur während der reversen Transkription effizienter zu überwinden. Wenn 3 mM MgCl₂ und 2 mM MnCl₂ benutzt wurde, konnte in der reversen Transkription eine außergewöhnlich hohe CAP-abhängige Transferase-Aktivität nachgewiesen werden. Typischerweise fügte das Enzym vorzugsweise in der Anwesenheit von 5'-geschützter (capped) RNS als Template drei oder vier Cytosinreste an (Chenchik et al., 1998, Gene cloning and analysis by RT-PCR, herausgegeben von Paul Siebert und James Larrik, BioTechniques Books, Natick, MA; Schmidt und Mueller, 1999, Nucleic Acids Res. 27, 331).

Für die PCR-Reaktion wurden zwei Sätze von Primern für jede getestete RNS benutzt: 3'-spezifische/5'-spezifische Primer und 3'-spezifische/Markierung- spezifische Primer (Abb. 6).

Als positive Kontrolle für die Methode der spezifischen, chemischen Ligation einer Markierung mit bekannter Sequenz an die CAP-Struktur einer viralen RNS wurde die genomische RNS des Tabak-Mosaik-Virus (TMV, Stamm U1), von der man weiß, daß sie mit einer CAP-Struktur versehen ist (Dunigan und Zaitlin, 1990, J. Biol. Chem. 265, 7779-7786), eingesetzt. Die zugehörigen PCR-Banden wurden detektiert, wenn spezifische Primer, wie U1-Spn und der RNS-Markierung entsprechende Primer 779 in der PCR-Reaktion benutzt wurden (Tabelle 2, Abb. 7).

Tabelle 2

Template und Primer, die in der PCR benutzt wurden

Als eine Kontrolle wurde das nichtgeschützte (non-capped) RNS-Transkript des kompletten cDNS-Klons von TMV (U1) eingesetzt. Wie erwartet, wurde keine CAP- Struktur gefunden (Tabelle 2, Abb. 7). Dann wurde die Anwesenheit einer CAP-Struktur am 5'-Ende der genomischen RNS von crTMV ausgetestet. Für diese Experiment wurden die spezifischen PCR-Primer K5, 2PM und der Primer 779, der der RNS-Markierung entspricht, verwendet (Tabelle 2, Abb. 7). Interessanterweise war die Mobilität der PCR- Bande, die mit den Primern 779 und 2PM beobachtet wurde, größer als erwartet (Fig. 7). Dieses könnte die Anwesenheit einer starken Sekundärstruktur am 5'-Ende der genomischen RNS von crTMV (Dorokhov et al., 1994, FEBS Letters 350, 5 - 8) reflektieren. Diese Sekundärstruktur fehlt an den 5'-terminalen Teilen von verwandten TMVs (Goelet et al., 1982, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 5818-5822). In Kontrollexperimenten mit nicht geschützten (non-capped) Transkripten des kompletten cDNS-Klons von crTMV wurde wie erwartet keine entsprechende PCR-Bande beobachtet.

Für subgenomische RNS, die für das TMV (U1) MP-Gen kodiert, wurde angenommen, das sie keine CAP-Struktur am 5'-Ende aufweist. Wir testeten die entsprechende sgRNS mit den spezifischen Primern 2211, UM50 - 54 und Primer 779, der der RNS-Markierung entspricht. Es wurde keine CAP-Struktur gefunden, Tabelle 2, Abb. 7).

Die gleichen Resultate wurden mit der entsprechenden, subgenomischen RNS von crTMV (Tabelle 2, Abb. 7) erhalten. Dies zeigt, daß auch im Fall dieser subgenomischen RNS des Tobamovirus keine CAP-Struktur am 5'-Ende vorhanden ist.

Insertion des IRES_MP,75 ^CR-Elementes in einen auf dem TMV U1 basierenden Vektor, der defizient für die MP-Genexpression ist; KK6 liefert eine effiziente, CAP-unabhängige MP-Genexpression

Der KK6-Vektor (Lehto et al., 1990, Virology 174, 145-157) enthält zwei sub­ genomische Promortoren (sgPr) für das CP-Gen. Der erste CP-sgPr-1 liegt aufwärts (upstream) des CP-Gens an einer passenden Stelle, während der zweite CP-sgPr-2 aufwärts (upstream) des MP-Gens angeordnet ist. Es konnte gezeigt werden, daß das MP-Gen mit Hilfe des CP-sgPr-2 anstelle des nativen MP-sgPr exprimiert wurde. Resultierend aus dieser Insertion verlor der KK6-Vektor seine Fähigkeit, sich effizient von einer Zelle zur anderen zu bewegen. Analysen zeigten, daß die I₂ sgRNS kein IRES_MP,75 ^CR-Element in der 5'-untranslatierten Region enthielt. Es wurde deswegen angenommen, daß von der I₂ sgRNS des KK6-Vektors das MP-Gen ohne IRES_MP,75 ^CR- Element nicht effizient exprimiert werden kann. Um diese Annahme zu überprüfen, wurde das IRES_MP,75 ^CR-Element zwischen den CP-sgPr-2 und dem MP-Gen in den KK6- Vektor inseriert, so daß ein KK6-IRES_MP,75-Vektor erzeugt 22844 00070 552 001000280000000200012000285912273300040 0002010049587 00004 22725 wurde, der in der Nachkommenschaft stabil propagiert werden konnte (Abb. 8). Es konnte gezeigt werden, daß der KK6-IRES_MP,75-Vektor für die Synthese einer I₂ sgRNS verantwortlich ist, die das crTMV-IRES_MP,75-Element enthält (Abb. 9). Es konnte ebenfalls gezeigt werden, daß der Transkriptionsstart der I₂ sgRNS aus dem KK6-IRES_MP,75-Vektor im Vergleich zum KK6-Vektor ohne IRES_MP,75 ^CR-Element nicht verändert ist. Dieses bedeutet, daß das IRES_MP,75 ^CR-Element nicht als sgPr für das MP-Gen dient.

Diese Insertion verbesserte drastisch die Verbreitung des Virus von Zelle zu Zelle. Der KK6-Vektor infizierte Nicotiana tabacum L. cv Samsun-Pflanzen systemisch. Die Pflanzen zeigten allerdings im Vergleich zum Wildtyp-TMV (TMV 304), bei dem ungefähr nach sieben Tagen die ersten Symptome sichtbar waren, erst nach 15 bis 17 Tagen erste Infektionssymptome. Die Symptome in den oberen Blättern der mit dem KK6-Vektor infizierten Pflanzen waren deutlich als gelbe Flecken sichtbar, während der Wildtyp-TMV Mosaik-Symptome erzeugte.

Die KK6-Virus-Nachkommenschaft erzeugte zahlreiche Verletzungen in N. glutinosa, die sich langsamer entwickelten als die Verletzungen des Wildtyp-TMV UI. Die durchschnittliche Größe der lokalen Verwundungen, die durch den KK6-Virus verursacht wurden, war 0,1 mm. Im Vergleich dazu erreichten die lokalen Verwundungen des Wildtyp-TMV UI eine Größe von 1,1 mm. Pflanzen, die mit dem KK6-IRES_MP,75-Vektor inokuliert wurden, sahen wie Pflanzen aus, die mit dem KK6-Vektor infiziert wurden. Sie unterschieden sich aber dahingehend, daß (i) sich die ersten systemischen Symptome schneller entwickelten (ungefähr nach 10 Tagen) und (ii) sie wesentlich heller in Bezug auf die gelben Flecken und das Mosaik waren. Im Gegensatz zu dem KK6-Vektor war die durchschnittliche Größe der lokalen Verwundungen, die durch K86 in N. glutinosa erzeugt wurden, auf 0,6-0,7 mm erhöht. Die Überprüfung des zeitlichen Verlaufs der MP- Akkumulation zeigte, daß das KK6-IRES_{MP 75}-MP früher als das KK6-MP in den inokulierten Blättern detektiert werden konnte (Abb. 10). Dieses Resultat erlaubte den Schluss, daß die Insertion des IRES_{MP 75} ^CR-Elementes aufwärts (upstream) des KK6-MP- Gens teilweise die Ausbreitungseigenschaften des KK6-Virus, der in dem Transport von Zelle zu Zelle und in dem Langdistanztransport Defekte zeigte, wiederherstellt. Um weitere Beweise für die essentielle Rolle der IRES-Elemente in der CAP-unabhängigen MP-Gen-Expression in den TMV-cDNS-Vektoren und in dem Lebenszyklus von Tobamoviren zu erhalten, wurden Serien von zusätzlichen, auf dem KK6-Vektor basierenden Vektoren konstruiert (Abb. 8). Der KK6-IRES_{MP 125}-Vektor enthält eine natürliche Hairpin-Loop-Struktur, die in der Lage ist, die Translation des MP-Gens in vitro in der Gegenwart der 5'-untranslatierten Region der I₂sgRNS von WTcrTMV zu inhibieren. Desweiteren enthält der IRES_{MP 75}-KK6-H-PL-Vektor eine natürliche Hairpin-Loop-Struktur und eine 72-nt lange, künstliche Polylinkersequenz. KK6-PL enthält nur die Polylinker-Region. Die Resultate der Infektionsexperimente mit Nicotiana tabacum cv. Samsun (systemischer Wirt) sind in Tabelle 3 gezeigt.

Abb. 11 zeigt die Resultate der Western-Analysen in bezug auf die CP- Akkumulation in den Tabak-Blättern, die mit den KK6-basierenden Vektoren infiziert wurden. Ersatz des IRES_MP,75 ^CR-Elementes durch eine nicht funktionale PL-Sequenz blockierte drastisch die Vektor-Multiplikation.

Tabelle 3

Virus-Akkumulation in Tabak, der systemisch mit KK6-basierenden Vektoren infiziert wurde

BEISPIEL 5 Die Herstellung eines künstlichen, nicht natürlichen IRES-Elementes ohne subgenomische Promotor-Aktivität erzeugt in eukaryotischen Zellen die CAP- unabhängige Expression von Genen mit Bedeutung

Das Ziel dieses Beispiels ist es, die Ansätze für die Herstellung von künstlichen, nicht natürlichen IRES-Elementen, die keine subgenomische Promotor-Aktivität aufweisen und die in eukaryotischen Zellen die CAP-unabhängige Expression von Genen mit Bedeutung ermöglichen, zu zeigen.

Konstruktion eines künstlichen, nicht natürlichen IRES-Elementes auf der Basis des 18-nt- Segmentes aus dem IRES_MP,75 ^CR-Element

Die Analyse der IRES_MP,75 ^CR-Nukleotidsequenz zeigt, daß dieses Element eine multimere Struktur hat und vier Nukleotidsequenz-Segmente mit einer Variation des Elementes (- 72)GUUUGCUUUUUG(-61) enthält, die komplementär zu der 18S rRNS aus Arabidopsis thaliana ist (Abb. 12).

Um ein künstliches, nicht natürliches IRES-Element zu gestalten, wurde die 18-nt- Sequenz CGUUUGCUUUUUGUAGUA ausgewählt. Vier Oligonukleotide wurden synthetisiert:

Primer MP1(+) und MP1(-) wurden mit einander hybridisiert, so daß das dsDNS- Fragment A enstand:

Primer MP2(+) und MP2(-) wurden mit einander hybridisiert, so daß das dsDNS- Fragment B enstand:

Beide Fragmente wurden mit Pst I verdaut und miteinander ligiert. Dann wurde das Ligationprodukt A + B mittels Agarosegelelektrophorese extrahiert und mit Hind III und EcoR I verdaut. Anschließend wurde dieses Fragment in den hGFP-GUS-Vektor, der bei Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139 - 154) beschrieben ist, mit Hilfe der Hind III- und EcoR-I-Klonierungstellen subkloniert (Abb. 13).

Resultate

Die Transkripte, die in Abb. 13 dargestellt sind, wurden in dem Lysat von Kaninchen-Reticulozyten (RRL), wie bei Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139-154) beschrieben, translatiert. Die Syntheseprodukte wurden mittels Gelelektrophorese analysiert. Die Resultate, die in Abb. 13 dargestellt sind, zeigen, daß eine künstliche, nicht natürliche Sequenz, die auf dem 18-nt-Segment des IRES_MP,75 ^CR- Elementes basiert, die Expression des 3'-proximal lokalisierten GUS-Gens vermittelt. Dies bedeutet, daß zwei Eigenschaften zum einen die zu der 18S rRNS komplementäre Sequenz und zum anderen die multimere Struktur notwendig für die IRES_MP,75 ^CR- Funktion ist. Ein Tetramer von 18-nt-Segmenten erreicht nicht das Aktivitätsniveau des IRES_MP,75 ^CR-Elementes. Es gibt aber einen Weg, die Aktivität des künstlichen, nicht natürlichen IRES-Elementes zu verbessern, indem man das 12-nt-Segment GCUUGCUUUGAG, das komplementär zu der 18S rRNS ist, verwendet.

Konstruktion eines künstlichen, nicht natürlichen IRES-Elementes auf der Basis des 12-nt- Segmentes aus dem IRES_MP,75 ^CR-Element

Analysen der Strukturelemente, die notwendig für die IRES_CP,148 ^CR-Element-Aktivität (Abb. 14 - 17) sind, zeigen, daß ein Polypurin (PP)-Segment entscheidend für die IRES_CP,148 ^CR-Funktion ist. Als ein markantes Element dieses PP-Segmentes wurde eine direkte Wiederholung einer 9-nt-Sequenz in der 19-nt-Sequenz gefunden:
AAAAGAAGGAAAAAGAAGG (direct repeat (DR)).

Diese Sequenz wurde für die Konstruktion eines künstlichen IRES-Elementes benutzt. Um ein Tetramer der DR-Sequenz zu erhalten, wurden folgende Primer benutzt:

Gemäß der zuvor beschriebenen Methode wurde folgendes IRES-Element als intercistronischer Spacer verwendet:

Resultate

Die Transkripte, die in Abb. 13 dargestellt sind, wurden in dem Lysat von Kaninchen-Reticulozyten (RRL), wie bei Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139-154) beschrieben, translatiert. Die Syntheseprodukte wurden mittels Gelelektrophorese analysiert. Die Resultate, die in Abb. 13 dargestellt sind, zeigen, daß eine künst­ liche, nicht natürliche Sequenz, die auf den sich wiederholenden 19-nt-Segmenten des IRES_CP,148 ^CR-Elementes basiert, die Expression des 3'-proximal lokalisierten GUS-Gens vermittelt.

Beispiel 6 Konstruktion eines TMV-cDNS-Transkriptionsvektors, der das Replikasegen in infizierten Zellen CAP-unabhängig exprimiert

Das Hauptziel dieses Beispiels war die Erzeugung von zwei neuen, auf dem TMV U1- basierenden Viren mit einer modifizierten 5'UTR, die die CAP-unabhängige Expression des Replikasegens erlaubt:

• 1. Omega-Leader des TMV wurde komplett durch das IRES_MP,75 ^CR-Element ersetzt:
  
• 2. Weil man davon ausgeht, daß die ersten 8 Nukleotide der TMV 5'UTR notwendig für die Virusreplikation sind (Watanabe et al., 1996, J. Gen. Virol. 77, 2353 - 2357), wurde das IRES_MP,75 ^CR-Element in die TMV 5'UTR inseriert, wobei die ersten 8 Nukleotide intakt gelassen wurden:
  

Die folgenden Primer wurden verwendet:

• a) SP6-IRES-1 (in dem Fall der ersten Variante)
  
• b) SP6-IRES-2 (in dem Fall der zweiten Variante)
  
• c) IRES-Nco I (reverse Primer, um IRES mit einer Nco-I-Restriktionsstelle am 3'- Ende zu erhalten)
  GGGCCATGGTCAAACAAAGAACAAATCTCTAAAC
• d) nTMV-Nco I (direkter Primer zur Gewinnung der TMV-Polymerase; Start: NCOI-Schnittstelle):
  
• e) TMV-Xho (reverser Primer zur Gewinnung des 5'-Bereiches der Replikase; vom AUG-Codon bis zur Sph-I-Schnittstelle)
  

Klonierungsstrategie

Das PCR-Fragment A wurde durch die Verwendung der Primer SP6-IRES1 und IRES-NcoI auf dem Vektor crTMV als Template hergestellt. Das PCR- Fragment B wurde durch die Verwendung der Oligonukleotide TMV-NcoI und TMV- XhoI sowie dem Klon TMV-304L erzeugt. Die Fragmente A und B wurden (unter Verwendung von Xba-I- und Xho-I-Schnittstellen) gleichzeitig in den Vektor pBlueskript SK+ kloniert. Die Ligation der Fragmente erfolgte durch eine Nco-I-Schnittstelle. Derselbe Ansatz wurde angewandt, um die zweite Variante des Virus durch die Ver­ wendung des Oligonukleotids SP6-IRES2 zu erhalten.

Im nächsten Schritt wurde die gesamte TMV cDNS in den erhaltenen Vektor kloniert. Sph-I- und Kpn-I-Schnittstellen wurden dazu verwendet, das virale Genom wieder­ herzustellen (Abb. 18).

Beispiel 7 Erzeugung der auf Actin-2-Transkriptionspromotoren basierenden, tobamoviralen Vektoren Act2/cRTMV und Act2/crTMV IRES_MP,75 ^CR-GUS

Das wichtigste Ziel dieses Beispiels ist es, die Klonierungsstrategie eines neuen crTMV- basierenden Vektors, mit dem virale Genexpression in Pflanzenzellen unter der Kontrolle eines effizienten Actin-2-Promotors auftritt, zu demonstrieren. Die Verwendung des Vektors Act2/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS zur Genexpression in Pflanzen wird damit möglich.

Die Klonierung von Act2 in pUC19

Der Act2-Transkriptionspromotor (ca. 1000 bp) wurde aus dem Plasmid pACRS029 durch Restriktion mit den Enzymen Kpn I und Pst I geschnitten.

Herstellung einer Pst-I-Schnittstelle im Plasmid T7/crTMV (Abb. 1) aufwärts (upstream) des Beginns des crTMV-Genoms

Ein 334-Nukleotid großes Fragment des 5'-endständigen Teils des crTMV-Genoms wurde durch PCR hergestellt. Dabei wurden der in direkter Orientierung vorliegende Primer ATGCTGCAGGTTTTAGTTTTATTGCAACAACAA (Pst-I-Schnittstelle ist unterstrichen) und der in reverser Orientierung vorliegende Primer ATGCGATCGAA GCCACCGGCCAAGGAG TGCA (Pvu-I-Schnittstelle ist unterstrichen) verwendet. Das Fragment wurde mit Pvu I und Pst I geschnitten und in pUC 19Act2 zusammen mit dem Teil des crTMV-Genoms eingefügt (Pvu-I-Spe-I-Fragment).

Klonierung des restlichen Teils des Genoms mit dem vorherigen Konstrukt

Das Act2 beinhaltende Konstrukt wurde in das Plasmid T7crTMV nach Restriktion mit KpnI/SpeI kloniert.

Fusion des 5'-Endes von crTMV an den Transkriptionsstart von Act2 ohne zusätzliche Sequenzen

Dieser Schritt wurde mittels ortsgerichteter (site-directed) Mutagenese ausgeführt. Dabei wurden Oligonucleotid-Primer verwendet, die spezifisch für Act2 und crTMV sind. Mit ihnen konnte das endgültige Konstrukt Act2/crTMV (Abb. 19) hergestellt werden. Um den Vektor Act2/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS zu erhalten (Abb. 20), wurde das Spe-I-Not-I- cDNS-Fragment des Plasmids Act2/crTMV (Abb. 19) durch das Spe-I-Not-I-DNS- Fragment aus T7crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS ersetzt (Abb. 2). Dieses beinhaltet das GUS- Gen unter der Kontrolle von IRES_MP,75 ^CR.

Beispiel 8 Herstellung eines zirkulären Einzelstrang-tobamoviralen Vektors KS/Act2/crTMV/­ IRES_MP,75 ^CR-GUS (Abb. 21)

Das wichtigste Ziel dieses Beispiels ist es, die Möglichkeit aufzuzeigen, unter Verwendung von DNS-Vektoren, die aus ringförmiger Einzelstrang-DNS bestehen, Fremdgene in Pflanzen zu exprimieren.

Um das Konstrukt KS/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS (Abb. 21) herzustellen, wurde ein 9,2 kb großes Kpn-I-Not-I-cDNS-Fragment des Vektors Act2/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS in das Plasmid pBluescipt II KS+ (Stratagene) inseriert. Der Zielvektor wurde mit Kpn I-Sal I gespalten und beinhaltet den Replikationsstartpunkt (origin) des Phagen f1. Einzelstrang- DNS des Vektors KS/Act2/crTMV/IRES_MP,75 ^CR-GUS wurde nach Sambrook et al., 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York) hergestellt.

Beispiel 9 Herstellung eines tobamoviralen Vektors KS/Act2/crTMV-Int/IRES_MP,75 ^CR-GUS, der ein Oleosin-Intron von Arabidopsis thaliana beinhaltet

Das wichtigste Ziel dieses Beispiels ist die Herstellung des Vektors KS/Act2/crTMV/­ IRES_MP,75 ^CR-GUS, der das Oleosingen-Intron aus Arabidopsis thaliana besitzt. Dieses Intron soll nach dem Trankriptionsprozess entfernt werden (Abb. 22). Die Klonierung setzt sich aus folgenden Schritten zusammen:

1. Klonierung des A.-thaliana-Oleosingen-Introns

Das Intron des Oleosin-Gens aus A. thaliana wurde mittels PCR amplifiziert. Hierzu wurden folgende spezifische Primer verwendet: A.th./Int (direct) ATGCTGCAGgttttagttCAGTAAGCACACATTTATCATC (Die Pst-I-Schnittstelle ist unterstrichen, kleine Buchstaben markieren die crTMV-5'-endständige Sequenz). Beim zweiten verwendeten Primer handelt es sich um A.th/Int (reverse): ATGAGGCCTGGTGCTCTCCCGTTGCGTACCTA (Stu-I-Schnittstelle ist unterstrichen).

2. Insertion des A.-thaliana-Oleosin-Introns in das 334-Nukleotid große 5'-terminale Fragment der crTMV cDNS

cDNS, die das Intron des Oleosin-Gens von A. thaliana besitzt, wurde mit Pst I/Stu I restringiert und mit einem PCR-Fragment ligiert, das über PCR-Amplifikation durch die Verwendung folgender Primer gewonnen wurde: Primer 1: atgAGGCCTTTATTG­ CAACAACAACAACAAATTA (Die Stu-I-Schnittstelle ist unterstrichen). Primer 2: ATGCGATCGAAGCCACC GGCCAAGGAGTGCA (Die Pvu-I-Schnittstelle ist unter­ strichen). Die Primer entsprechen den Positionen 10 - 334 des crTMV-Genoms. Die nächsten Schritte sind im Beispiel 7 beschrieben.

Beispiel 10 Einfluß von Rapamycin als Inhibitor der CAP-unabhängigen Initiation der Translation auf die GUS-Genexpression in Tabak-Protoplasten, die mit 35S/CP/IRES_MP,75 ^CR beinhaltenden, bicistronischen Transkriptionsvektoren 35S/CP/IRES_MP,75 ^CR/GUS (Abb. 23) und 35S/GUS/IRES_MP,75 ^CR/CP (Abb. 24) transfiziert wurden

Mit diesem Beispiel soll demonstriert werden, daß es grundsätzlich möglich ist, Inhibitoren der CAP-abhängigen Translation einzusetzen, um die Effizienz der IRES- vermittelten, CAP-unabhängigen Translation eines Gens von Interesse zu erhöhen.

Als Inhibitor der CAP-abhängigen Initiation der Translation wurde Rapamycin ausgewählt. Kürzlich wurde ein neuartiger Repressor der CAP-vermittelten Translation, der als 4E-BP1 (eIF-4E-bindendes Protein) oder PHAS-1 bezeichnet wurde, charakterisiert (Lin et al., 1994, Science 226, 653-656; Pause et al., Nature 371, 762 - 767). 4E-BP1 ist ein hitze- und säurestabiles Protein, dessen Aktivität durch Phosphorylierung reguliert wird (Lin et al. 1994 Science 226, 653-656; Pause et al., Nature 371, 762 - 767). Die Wechselwirkung von 4EBP1 mit eIF-4E führt zu einer spezifischen Inhibierung von CAP-abhängiger Translation, sowohl in vitro als auch in vivo; Pause et al., Nature 371, 762 - 767). Es wurde gezeigt, daß Rapamycin die Dephosphorylierung und damit die Aktivierung von 4E-BP1 (Beretta et al. 1996, EMBO J. 15, 658 - 664) induziert.

Die Herstellung eines Vektors 35S/CP/IRES_MP,75 ^CR/GUS (Abb. 23) bzw. 35S/GUS/­ IRES_MP,75 ^CR/CP (Abb. 24), die IRES- und GUS-Sequenzen beinhalten und eine Methode zur Transfektion von Protoplasten mit einer 35S-basierenden cDNS wurden von Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139-154) beschrieben. Der Vergleich der Expression der GUS-Gene in Tabak-Protoplasten, die mit Rapamycin behandelt wurden und mit bicistronischer cDNS transfiziert wurden, die ein GUS-Gen in 3'- und 5'- proximalen Positionen besitzen, verdeutlicht, daß es möglich ist, die IRES-vermittelte, CAP-unabhängige Translation zu erhöhen.

Beispiel 11 Einfluß des Potyvirus VPg als ein Inhibitor der CAP-abhängigen Initiation der Translation bei GUS-Genen in Tabak-Protoplasten, die mit 35S/CP/IRES_MP,75 ^CR beinhaltenden, bicistronischen Transkriptionsvektoren 35S/CP/IRES_MP,75 ^CR/GUS (Abb. 23) und 35S/CP-VPg/IRES_MP,75 ^CR/GUS transfiziert wurden

Dieses Beispiel verdeutlicht die grundsätzliche Möglichkeit der Verwendung eines Genproduktes zur Inhibierung der CAP-abhängigen Translation (Abb. 25). Kürzlich wurde über die Wechselwirkung zwischen dem viralen Protein, das an das Genom des Rübenmosaikvirus und dem eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor eIF (iso)4E von Arabidopsis thaliana gekoppelt ist, berichtet (Wittman et al., 1997, Virology 234, 84 - 92). Die Interaktions-Domäne von VPg wurde in einen Bereich von 35 Aminosäuren kartiert. Der Austausch von Asparaginsäureresten in dieser Region verhinderte den Prozeß vollständig. Das CAP-Analogon m⁷GTP, jedoch nicht GTP, inhibiert die Bildung des Komplexes aus VPg und eIF(iso)4E. Dies deutet darauf hin, daß VPg und die zellulären mRNSs um die Bindungen an eIF(iso)4E konkurrieren (Leonard et al., 2000, J. Virology 74, 7730 - 7737). Die Fähigkeit von VPg, an eIF(iso)4E zu binden, kann zur Inhibition der CAP-abhängigen Translation verwendet werden. Wir schlagen vor, den Vektor 35S/CP- VPg/IRES_MP,75 ^CR/GUS (Abb. 25) zu verwenden. In diesem Vektor ist das Hüllprotein mit VPg des Potyvirus Kartoffevirus A fusioniert. Der Vergleich der Expression des GUS- Gens in Protoplasten, die mit 35S/CP-VPg/IRES_MP,75 ^CR/GUS oder 35S/CP/IRES_MP,75 ^CR/GUS transfiziert wurden, erlaubt die Erhöhung der IRES-vermittelten und CAP- unabhängigen Expression des GUS-Gens.

Beispiel 12 Genetische in-vivo-Selektion einer IRES-Sequenz oder eines subgenomischen Promoters unter Verwendung des TMV-Vektors

In diesem Beispiel wird die Möglichkeit aufgezeigt, genetische in-vivo-Selektionen oder die systematische Entwicklung von Liganten durch exponentielle Anreicherung (SELEX, Systematic Evolution of Ligants by Exponential enrichment) eines subgenomischen Promoters oder einer IRES-Sequenz, die CAP-unabhängige Expression eines Gens von Interesse in einem Vektor gewährleistet, durchzuführen. In diesem Ansatz wird eine side- by-side-Selektion einer großen Anzahl von zufälligen Sequenzen ebenso wie die Erzeugung von Sequenzen angewandt (Ellington und Szostak, 1990, Nature 346, 818 - 822; Tuerk and Gold, 1990, Science 249, 505 - 510; Carpenter und Simon, 1998, Nucleic Acids Res. 26, 2426 - 2432).

Das Projekt schließt ein:

• 1. In-vitro-Synthese von crTMV-basierenden defective-interfering(DI)-Trans­ kripten, die folgende Elemente beinhalten (5'-3'-Richtung): (i) Ein T7- Transkriptionspromoter, (ii) ein 5'-endständiger Teil des crTMV-Genoms mit einer Sequenz, die für die Synthese des komplementären (minus-) Strang des viralen Genoms verantwortlich ist, (iii) eine Sequenz die für einen N- endständigen Teil der viralen Replikase kodiert, (iv) eine Sequenz, die 75 zufällige Basen beinhaltete, (v) ein Gen für die Neomycinphosphotransferase II (NPTII), (vi) ein crTMV-Startpunkt des viralen Zusammenbaus (origin of assembly, Oa), und (vii) ein 3'-endständiger Teil des crTMV-Genoms mit einer Promotorsequenz für den Minus-Strang (Abb. 26).
• 2. Kotransfektion von Tabak-Protoplasten mit einem Transkript und genomischer RNS von crTMV (Abb. 1). Die Protoplasten wachsen und regenerieren auf einem Kanamycinhaltigen Medium.
• 3. Selektion und Isolierung einer IRES-Sequenz oder eines subgenomischen Promotors, die es den Protoplasten ermöglicht, zu überleben und in Anwesenheit von Kanamycin zu regenerieren.

Claims (24)

1. Vektor, der sich in einer Pflanze amplifizieren und ein Gen exprimieren kann, der eine Nukleinsäure mit einer Sequenz für mindestens ein zu exprimierendes, nichtvirales Gen umfasst, und der mindestens ein IRES-Element besitzt oder dafür kodiert, welches für die Translation eines von ihm stromabwärts gelegenen Gens notwendig ist.

2. Der Vektor entsprechend Anspruch 1, wobei das IRES-Element stromaufwärts von dem zu exprimierenden, nichtviralen Gen liegt, um direkt seine Translation zu unterstützen.

3. Der Vektor entsprechend Anspruch 1 oder 2, wobei das IRES-Element indirekt die Translation des zu exprimierenden, nichtviralen Gens unterstützt, indem es direkt die Tranalation eines anderen Gens unterstützt, das stromabwärts von dem IRES-Element liegt und das für eine Funktion des Vektors essentiell ist, wobei die Funktion ausgewählt ist aus der Gruppe Infektion, Amplifikation und Ausbreitung des Vektors von Zelle zu Zelle oder über weite Distanzen (cell-to-cell or long distance movement).

4. Der Vektor entsprechend einem der Ansprüche 1-3, der zusätzlich mindestens den Teil einer Sequenz des Wirtsgenoms in Gegensinn(antisense)-Orientierung zur Suppression eines Gens in der Wirtspflanze besitzt.

5. Der Vektor entsprechend Anspruch 4, wobei die Sequenz in Gegensinn-Orientierung ein Gen supprimiert, das für die CAP-abhängige Translation in Pflanzen essentiell ist.

6. Vektor, der sich in einer Pflanze amplifizieren kann und eine Nukleinsäure umfasst, die für mindestens ein IRES-Element kodiert oder mindestens ein solches aufweist, das für die Translation eines Gens, das für die Amplifikation des Vektors notwendig ist und stromabwärts des IRES-Elements gelegen ist, wobei der Vektor weiterhin mindestens einen Teil einer Sequenz des Wirtspflanzengenoms in Gegensinn- Orientierung umfasst, um ein Gen der Wirtspflanze zu supprimieren.

7. Der Vektor entsprechend einem der Ansprüche 1-6, der von einem Pflanzenvirus abstammt.

8. Der Vektor entsprechend einem der Ansprüche 1-7, wobei der Vektor ein Gen umfasst, das für ein Protein kodiert, welches die Ausbreitung des Vektors von Zelle zu Zelle oder über weite Distanzen (cell-to-cell or long distance movement) vermittelt.

9. Der Vektor entsprechend einem der Ansprüche 1-8, der für ein Protein oder für Proteine kodiert, die eine Funktion bei der Amplifikation haben.

10. Der Vektor entsprechend einem der Ansprüche 1-9, bei dem das IRES-Element von einem Pflanzenvirus abstammt.

11. Der Vektor entsprechend einem der Ansprüche 1-9, wobei das IRES-Element synthetischen Ursprungs ist.

12. Der Vektor entsprechend Anspruch 11, wobei das IRES-Element ein Multimer eines Segments eines natürlichen IRES-Elementes ist oder ein solches Multimer umfasst.

13. Der Vektor entsprechend Anspruch 11, wobei das IRES-Element ein Multimer von mindestens einer Sequenz ist oder ein solches Multimer umfasst, wobei die Sequenz im wesentlichen komplementär zu einem IRES-bindenden Segment einer natürlichen 18S rRNA ist.

14. Der Vektor entsprechend einem der Ansprüche 1-13, wobei die Translation von einem oder mehreren Genen, die von besagtem Vektor kodiert werden, CAP- unabhängig ist.

15. Pro-Vektor mit einer Sequenz, die von der Nukleinsäure-prozessierenden Maschinerie der Wirtspflanze prozessiert wird, um einen Vektor gemäß den Anprüchen 1-14 zu erhalten.

16. Pro-Vektor, der mit Hilfe von Standardmethoden der Molekularbiologie in vitro oder in vivo zu einem Vektor gemäß einem der Ansprüche 1 - 15 umgewandelt werden kann.

17. Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 1-14 zur Bestimmung der Funktion eines Strukturgenes.

18. Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 1-14 zur Produktion eines Proteins.

19. Verwendung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 1-14 zur Erzeugung eines Merkmals in der Wirtspflanze.

20. Die Verwendung entsprechend einem der Ansprüche 17-19, wobei die Pflanze mit einem Mittel behandelt wird, das die CAP-abhängige Translation inhibiert.

21. Die Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18-20, wobei der Vektor auf Pflanzen oder Teile von Pflanzen auf einem landwirtschaftlichem Feld aufgebracht wird.

22. Genexpressionssystem, umfassend den Vektor oder Pro-Vektor, entsprechend einem der Ansprüche 1-16 und eine natürliche oder gentechnologisch modifizierte Pflanze, die die Amplifikation und Expression des Vektors unterstützt.

23. Das System entsprechend Anspruch 22, wobei das Pflanzengenom Gene umfasst, die für zumindest eine der Funktionen, ausgewählt aus Infektion, Amplifikation, und

24. Methode zur Erzeugung eines Vektors gemäß einem der Ansprüche 1-16, wobei das IRES-Element mittels gerichteter Evolution (directed evolution), ausgehend von einer randomisierten Nukleotidsequenz durch Auswahl von IRES-Elementen, die für die Translation eines stromabwärts des IRES-Elements gelegenen Reportergens nötig sind, hergestellt wird.