CN115052979A - 植物载体、组合物及其相关用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及单链RNA载体，其适合于将治疗剂如肽、蛋白或小RNA引入宿主植物。所述载体不编码任何移动蛋白或外壳蛋白，但能够在宿主植物内进行全身和韧皮部限制的移动和复制。

Description

植物载体、组合物及其相关用途
相关申请的交叉引用
本申请基于2019年11月12日提交的国际申请PCT/US2019/060945，该申请通过引用整体并入本文并且本申请要求其优先权。本申请还基于2020年5月12日提交的美国临时申请63/023,712，该申请通过引用整体并入本文并且本申请要求其优先权和益处。
序列表的参考
本申请包括一个或多个根据37C.F.R.1.821et seq.的序列表，其以计算机可读介质的形式公开(文件名：2105_0071PCT2_ST25，创建于2020年11月12日，大小为44,170字节)，在此通过引用整体并入本文。
关于联邦资助的研究或开发的声明
本发明是在美国农业部(USDA)授予的批准号AP17PPQS和T00C118以及美国国家科学基金会(NSF)授予的批准号1411836在政府的支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
技术领域
本公开涉及适合于将治疗剂如肽、蛋白或小RNA引入宿主的RNA载体。在一些示例中，宿主是植物，其中其移动可主要限于韧皮部，并且目的是控制或操控植物疾病或病症。
背景技术
一般的和高度靶向的抗微生物剂已经被开发用于动物(例如人类)，所述动物的循环系统为遍及动物的广泛应用提供了递送系统。相比之下，针对非基因修饰的植物开发一般或靶向治疗剂而进行的研究则少得多，因为缺乏简化的循环系统使遍及宿主植物的输送变得复杂。这在大型、长寿的树木(如柑橘)中尤其是个问题，在这些树木中注射的抗微生物剂可迅速稀释。因此，除外部应用农药，例如以在生长季节期间控制病原体的载体(vector)，一般叶面应用以加强植物健康，或昂贵的、短期注射针对病原体或载体的剂以外，很少有治疗全身植物感染或病症的方案。
尤其令人关切的是影响柑橘产业的疾病和病症。黄龙病(HLB)，又称柑橘黄龙病(Citrus Greening)，是全球最严重的柑橘疾病。HLB与三种细菌韧皮杆菌(CandidatusLiberibacter spp.)(亚洲种、非洲种和美洲种)有关，并由两种木虱种类，亚洲柑橘木虱(ACP)(Diaphorina citri,Kuwayama)和非洲柑橘木虱(Trioza erytreae,Del Guercio)传播。当含有细菌的木虱以柑橘树为食，并将病原细菌沉积至细菌繁殖的韧皮部时，HLB便可嫁接传播或自然传播。一旦树木被感染，就无法治愈。虽然这种带病的水果对人类没有健康威胁，但HLB已经摧毁了遍及全世界数百万英亩的柑橘园。仅在美国，ACP和CL亚洲种(asiaticus)(CLas)就摧毁了佛罗里达州的柑橘产业，在很短的时间范围内造成了数十亿美元的作物损失。此外，HLB已传播至美国的每个柑橘产区。大多数受感染的树木在感染后几年内就会死亡，并且果实变得畸形，而且没有味道，并且因此不适合食用。根据美国农业部(USDA)，整个柑橘产业处于巨大的风险下。
考虑植物生理学有助于发展和实施操控植物疾病和病症的策略。植物的维管系统是糖和氨基酸，以及信号分子如小核糖核酸(RNA)、蛋白、肽和激素(其被需要用于大量的发育过程和对生物和非生物胁迫的响应)的主要通道(conduit)(图1)(Lee J.Y.和Frank,M.(2018)，Plasmodesmata in phloem:different gateways for different cargoes，CurrOpin Plant Biol，43:119-124；Tugeon,R.和Wolf,S.(2009)，Phloem Transport:CellularPathways and Molecular Trafficking，Ann Rev Plant Biol，60:207-221)。信使RNA(mRNA)包括这些信号分子的一部分，并且数以千计的伴生细胞mRNA可以从邻近的去筛分子(enucleated sieve element)中分离出来，在那里，它们通过从源(产糖)组织到库(sink)(利用糖)组织(如根和茎尖)渗入产生的静水压力进行双向运输(Folimonova,S.Y.和Tilsner,J.(2018)，Hitchhikers,highway tools and roadworks:the interactions ofplant viruses with the phloem,Curr Opin Plant Biol 43:82-88；Ham,B.K.和Lucas,W.J.(2017),Phloem-Mobile RNAs as Systemic Signaling Agents,Annual Rev PlantBiol68:173-195)。多达50％的伴生细胞转录组被认为参与了移动(Kim,G.等(2014)，Genomic-scale exchange of mRNA between a parasitic plant and its hosts,Science 345:808-811；Thieme,C.J.et al.(2015),Endogenous Arabidopsis messengerRNAs transported to distant tissues,Nature Plants 1(4):15025；Yang,Y.et al.(2015),Messenger RNA exchange between scions and rootstocks in graftedgrapevines,BMC Plant Biol 15,251)，这关于如何以及为什么这种大量的mRNA子集移动长的距离提出了各种问题。例如，RNA移动的过程是怎样选择的？如果有选择，其是如何促进的？转运RNA(transiting RNA)是否被修饰(例如甲基化)？在进入SE之前，在任何特定的亚细胞位置是否发现转运RNA？转运RNA有“邮政编码(zip code)”吗？转运RNA是否与特定的蛋白结合，并且是否有特定的相互作用序列？因为推测库细胞能够转录相同的mRNA，因此有多少mRNA的流动是有生物学意义的，并且有多少是非选择性的？
关于mRNA移动的文献中的困惑是普遍存在的。一些研究表明，RNA移动性的主要决定因素是它们在伴生细胞中的丰度(Kim,G.等(2014)，Genomic-scale exchange of mRNAbetween a parasitic plant and its hosts,Science 345:808-811；Thieme,C.J.等(2015),Endogenous Arabidopsis messenger RNAs transported to distant tissues,Nature Plants 1(4):15025；Yang,Y.等(2015),Messenger RNA exchange betweenscions and rootstocks in grafted grapevines,BMC Plant Biol 15,251)。主要基于mRNA的丰度、半衰期以及也发挥作用的转录物长度，已将数学模型用来提出mRNA移动的非选择性的、布朗扩散模型(Calderwood,A.等(2016),Transcript Abundance ExplainsmRNA Mobility Data in Arabidopsis thaliana,Plant Cell 28:610-615)。然而，其它研究得出了相反的结论，发现伴生细胞中的mRNA丰度与移动无关(Xia,C.等(2018),Elucidation of the Mechanisms of Long-Distance mRNA Movement in a Nicotianabenthamiana/Tomato Heterograft System,Plant Physiol 177:745-758)。此外，虽然一般认为韧皮部不包含靶向转运RNA的核酸酶(Morris,R.J.(2018),On the selectivity,specificity and signaling potential of the long-distance movement ofmessenger RNA,Curr Opin Plant Biol 43:1-7)，Xia等人也发现，大多数可移动的mRNA被降解，并且无法到达根或上茎。其它研究发现，预测的tRNA样结构的存在与超过11％的可移动mRNA相关(Zhang,W.N.等(2016),tRNA-Related Sequences Trigger Systemic mRNATransport in Plants,Plant Cell 28:1237-1249)，表明可移动mRNA可能含有特定的“邮政编码”。然而，其它大量含有类似tRNA样基序的mRNA不可移动的(Xia,C.等(2018),Elucidation of the Mechanisms of Long-Distance mRNA Movement in a Nicotianabenthamiana/Tomato Heterograft System,Plant Physiol 177:745-758)。因此，先前的研究未能识别和开发由高丰度的、可移动的RNA组成的模型系统，该RNA在不同细胞条件下的移动在活组织中是可追踪的。
植物病毒，其中许多作为核糖核蛋白复合体(vRNP)移动通过植物，植物病毒已经进化为使用与可移动的内源性RNA相同的途径。植物病毒可以大量积累，并且大多数在表皮或叶肉细胞中开始感染，然后通过被称为胞间连丝的高度选择性细胞间连接物细胞-至-细胞(cell-to-cell)移动，这种连接物允许相邻细胞的细胞质之间的连续性(图1；也参见Lee,J.Y.和Frank,M.(2018)，Plasmodesmata in phloem:different gateways fordifferent cargoes,Curr Opin Plant Biol 43:119-124；Schoelz,J.E.等(2011),Intracellular transport of plant viruses:finding the door out of the cell,MolPlant 4:813-831)。长距离的全身移动(叶至叶(leaf-to-leaf))要求病毒进入伴生细胞，并在那里进行复制，随后后代通过连接伴生细胞和筛分子的特化的、分支的胞间连丝运输而离开进入筛分子。一旦到达筛分子，病毒就会被动地随韧皮部光合物质流移动，并在离开时建立全身感染(Folimonova,S.Y.和Tilsner,J.(2018),Hitchhikers,highway tollsand roadworks:the interactions of plant viruses with the phloem,Curr OpinPlant Biol 43:82-88)。
对于作为vRNPs传输通过韧皮部的病毒，其移动与宿主mRNA相似。所有植物病毒编码至少一种用于移动所需的移动蛋白，这种蛋白与病毒RNA结合，并还扩大胞间连丝。因此，宿主mRNA的移动也可能需要类似的宿主编码的移动蛋白。病毒移动蛋白是非特异性RNA结合蛋白。然而，尽管可能需要对伴生细胞的基因表达进行重编程，但关于vRNPs如何加载至韧皮部并卸载至远端组织仍然存在疑问(Collum,T.D.等(2016),Tobacco mosaic virus-directed reprogramming of auxin/indole acetic acid protein transcriptionalresponses enhances virus phloem loading,Proc Natl Acad Sci USA 113:E2740-E2749)。如果mRNA运输如此广泛且是非特异的，那么仍不清楚RNA病毒为什么需要它们自己编码的移动蛋白。一些研究人员已提出，如果RNA病毒作为预先形成的包括大的RNA依赖的RNA聚合酶的复制复合体(超出了伴生细胞胞间连丝的尺寸外排限制(～70kDa))移动(Heinlein,M.(2015),Plant virus replication and movement,Virology 479:657-671)，则RNA病毒需要移动蛋白。一些病毒为什么以及如何受到韧皮部限制也仍然不清楚。例如，韧皮部限制的黄化丝状病毒(closteroviruses)具有至少3种移动蛋白，并且韧皮部限制可以通过过度表达沉默抑制子和下调宿主防御来缓解(Folimonova,S.Y.和Tilsner,J.(2018),Hitchhikers,highway tolls and roadworks:the interactions of plantviruses with the phloem,Curr Opin Plant Biol 43:82-88)，这表明韧皮部限制对某些病毒来说是复杂的过程。韧皮部限制也可以是活跃的过程(与缺乏细胞间移动蛋白相反)。例如，改变马铃薯叶片作用病毒移动蛋白的结构域赋予离开韧皮部的能力(Bendix,C.和Lewis,J.D.(2018),The enemy within:phloem-limited pathogens,Mol Plant Path 19:238-254)。
当植物病毒移动蛋白的来源解决时，宿主mRNA移动与vRNP移动之间的直接联系也建立了。与黄瓜花叶病毒移动蛋白相关的南瓜蛋白(RPB50)被发现能够运送其自己的mRNA以及其它mRNA到韧皮部(Xoconostle-Cazares,B.等(1999),Plant paralog to viralmovement protein that potentiates transport of mRNA into the phloem,Science(New York,NY)283:94-98；Ham,B.K.等(2009),A polypyrimidine tract bindingprotein,pumpkin RBP50,forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoproteincomplex,Plant Cell 21:197-215)。称为非细胞自主蛋白(NCAP)的这些内源性移动蛋白的复杂群体已被认为是负责mRNA的长距离韧皮部运输(Gaupels,F.等(2008),Nitric oxidegeneration in Vicia faba phloem cells reveals them to be sensitive detectorsas well as possible systemic transducers of stress signals,New Phytol 178:634-646；Gomez,G.等(2005),Identification of translocatable RNA-binding phloemproteins from melon,potential components of the long-distance RNA transportsystem,Plant J 41:107-116；Kim,M.等(2001),Developmental changes due to long-distance movement of a homeobox fusion transcript in tomato,Science(New York,NY)293:287-289；Pallas,V.和Gomez,G.(2013),Phloem RNA-binding proteins aspotential components of the long-distance RNA transport system,Front PlantSci 4:130；Yoo,B.C.等(2004),A systemic small RNA signaling system in plants,Plant Cell 16:1979-2000)。
自从他们的发现(Deom,C.M.等(1987),The 30-kilodalton gene product oftobacco mosaic virus potentiates virus movement,Science(New York,NY)237:389-394)，许多负责vRNP向胞间连丝的细胞内运输，以及负责细胞间和长距离移动的病毒移动蛋白已经被确定(Tilsner,J.(2014),Techniques for RNA in vivo imaging in plants,J Microscopy 258(1):1-5)。对于某些病毒(如伞病毒)，细胞间和长距离移动与多种移动蛋白相关(Ryabov,E.V.等(2001),Umbravirus-encoded proteins both stabilizeheterologous viral RNA and mediate its systemic movement in some plantspecies,Virology 288:391-400)。例如，黄化丝状病毒如柑橘衰退病毒(Citrus tristezavirus)包含三种移动蛋白。然而，对于许多病毒来说，所有的移动活动都被认为与单一的移动蛋白有关。
利用病毒载体将工程化治疗剂递送至植物用于与疾病、昆虫(insect)或其它不利条件(例如，HLB和/或载体昆虫(carrier insect))斗争，是为研究目的而将特性如对病原体的抗性或其它所需性质引入植物的既定方法。向植物中提供载体的各种方法在本领域是已知的。这通常是通过根癌农杆菌(Agrobacteria tumefaction)-介导的“农杆菌渗入法(agroinfiltration)”(可导致细胞基因组修饰)将病毒载体递送至植物细胞核，或通过直接将病毒载体递送至细胞的细胞质(这导致无需基因组修饰的感染)来实现。在RNA病毒的农杆菌渗入法的情况下，病毒基因组的cDNA被并入到T-DNA中，其农杆菌递送至植物内。这种T-DNA包括进一步的DNA组分(例如，RNA聚合酶的启动子)，其允许植物细胞内的病毒基因组转录。含有治疗性DNA插入物的并入的病毒被在植物细胞中转录为RNA，之后病毒的行为就像正常的RNA病毒一样(扩增和移动)。因此，为了担当有效的载体，病毒应该被工程化以在不丧失其功能性的情况下接受插入物，并确保工程化的病毒能够在宿主内全身地积累至足以递送和在某些情况下表达插入物的水平。这些插入物，无论开放阅读框(ORF)是否会被翻译成用于有益功能的蛋白或非编码RNA，应该以对宿主或对宿主或环境的任何下游消耗(consumption)有效和充分无毒的方式递送至靶组织。然而，只有有限数量的满足上述标准的病毒载体仅对某些植物(例如用于烟草的烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus))可用。遗憾的是，对于大多数植物，特别是长寿的树木和藤本植物，要么没有已知的合适的病毒载体，要么只有次优的病毒载体。
因此，实施RNA或DNA疗法的能力在很大程度上受到现有技术的限制。已有1000多种植物病毒被鉴定，许多植物受到多种病毒的感染。例如，柑橘树受到柑橘叶斑病病毒(Citrus leaf blotch virus)、柑橘叶皱纹病毒(Citrus leaf rugose virus)、柑橘麻风病病毒C(Citrus leprosis virus C)、柑橘银屑病病毒(Citrus psorosis virus)、柑橘猝死相关病毒(Citrus sudden death-associated virus)、柑橘衰退病毒(Citrus tristezavirus)(CTV)、柑橘杂色病毒(Citrus variegation virus)、柑橘脉突病毒(Citrus veinenation virus)和柑橘黄色花叶病毒(Citrus yellow mosaic virus)的侵害。然而，CTV(是灾难性柑橘疾病如快速衰败和茎纹病的病原)是目前唯一被开发为向柑橘韧皮部递送试剂的载体。
CTV是黄化丝状病毒属的成员。其具有弯曲的杆状病毒粒子，包括两种衣壳蛋白，长2000nm和直径12nm。CTV(以及其它黄化丝状病毒)是已知感染植物的最大RNA病毒，基因组超过19kb。尽管这种工程化载体形式来自至少对佛罗里达州的柑橘树毒性较低的菌株(在加州的树木中仍然是高度毒性的)，其是致命的病原体，导致全球数百万柑橘树死亡或无用。先前的研究据称已经证明基于CTV的载体可以在植物细胞中表达工程化插入物(US8389804；US 20100017911 A1)。然而，由于其在植物内积累的能力不一致而仍未被商业化，并未能实现其目标有益结果。据认为，CTV无法复制至足够高的水平并且热敏性限制了其产生足够数量的RNA用于治疗的能力。
因此，在需要的情况下，基于CTV的载体具有提供有效的有益载荷的非常有限的能力。此外，由于CTV的尺寸大，它很难发挥作用。CTV也可以经历重复感染排除，其中基于CTV的载体不能感染已经感染了CTV的树。CTV还可以通过几种蚜虫种类在植物间高度传播，这种特性不受管理者的欢迎，其与不受控制地逃逸至环境中有关，在所述环境中其可能以不期望的方式发生突变或与其它宿主相互作用。此外，适合一个区域(如佛罗里达)的菌株不适合另一地区(如加利福尼亚)的各种各样的树木。尽管存在这些问题，CTV是柑橘树唯一可用的病毒载体平台。
因此，需要解决上述部分或全部问题，并能够将理想的特性和/或治疗剂递送入植物，特别是像树或藤本植物这样的长寿植物的传染剂。
发明内容
本公开涉及能够将外源插入物递送至植物的新型传染剂、包含被所公开的剂感染的植物的组合物，以及与之相关的方法和用途。所公开的剂有时被称为“独立移动的RNA”或“iRNA”。尽管是具有传染性的单链RNA，但iRNA不是病毒，因为它们不编码任何移动蛋白或RNA沉默抑制子，而这些是植物病毒的关键特征。此外，与几乎所有的植物RNA病毒不同，除了伞病毒外，iRNA也不编码将RNA包装成病毒粒子的外壳蛋白，而这是病毒在植物间的载体移动的必要条件。尽管缺少移动蛋白表达，iRNA仍能在宿主植物韧皮部内全身地移动。与病毒相比，iRNA具有另外的优势特性，例如：积累至超过大多数已知植物病毒水平的能力；相对较小的尺寸，例如，只有最小的植物RNA病毒的尺寸的约三分之二，并且因此比这种传统的植物RNA病毒更容易发挥作用；以及不能独立地传播至其它植物(因为它们无法编码任何外壳蛋白)。
根据公开的实施方式，传染剂包括基于RNA的载体，例如iRNA，其可包含一个或多个工程化插入物，本文有时称为异源片段，例如，其在植物中触发靶肽、蛋白的表达，和/或产生靶向的小干扰或其它非编码RNA(其从载体上切割下来以用于有益的应用)，和/或将治疗剂递送至植物中，和/或通过这种靶向或递送实现或促进有益的或期望的结果。本公开的各个方面包括：用于递送靶向抗致病剂的基于iRNA的载体；针对感染植物的细菌或昆虫载体所需的细菌的抗菌抗生酶(enzybiotic)；产生自TEV IRES的抗生酶；siRNA并入至iRNA基因组；将插入物并入锁定和对接结构中，以稳定支撑该插入物的支架的碱基；将siRNA并入至经过修饰的iRNA基因组中，以增强局部区域的稳定性，从而抵消插入物的不稳定效应；并入干扰或杀死靶昆虫载体的siRNA；并入减弱树木胼胝质产生的负面影响的siRNA；并入减弱植物对病原体的识别的siRNA；并入靶向细菌、病毒或真菌病原体的siRNA或其它剂；并入引起了特定的植物性状(例如矮小)的插入物。因此，与传统技术相比，本文所公开的传染剂和组合物具有优越的和有利的性质。
本公开的基于iRNA的载体适合用作表达各种蛋白和/或将小RNA递送至柑橘和其它宿主植物韧皮部的通用平台。在一些实施方式中，提供了基于柑橘黄脉相关病毒(Citrusyellow vein associated virus)(CYVaV)的载体，其在伴生细胞和韧皮部薄壁细胞中积累至大规模水平。本公开的载体可用于检测沉默特定基因表达的影响，例如，在树的韧皮部(以及超出其范围)。此外，CYVaV可发展为用于检测mRNA通过筛分子的长距离移动的模型系统。由于CYVaV几乎能够感染所有柑橘品种，极少在被感染的植物中产生任何症状，因此可以很容易地检测木本植物中RNA的移动。
根据公开的实施方式，本公开涉及包含复制元件和异源片段的正义单链核糖核酸(RNA)载体，其中所述RNA载体缺少功能性外壳蛋白开放阅读框(ORF)和功能性移动蛋白开放阅读框(ORF)。RNA载体能够在宿主植物中移动，例如全身移动、通过韧皮部的移动、长距离移动和/或从一叶片移动至另一叶片的移动。在一些实施中，RNA载体也缺少沉默抑制子ORF。在一些实施中，RNA载体包括3'帽独立翻译增强子(3'CITE)，其包含SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的核酸序列。在一些实施方式中，3'CITE包括SEQ ID NO:3的核酸序列。
在一些实施方式中，RNA载体的复制元件包括一个或多个保守的多核苷酸序列，其具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14的核酸序列。在一些实施中，复制元件额外地或可选地包含具有SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16的核酸序列的更保守的多核苷酸序列之一。
在一些实施方式中，RNA载体来源于柑橘黄脉相关病毒(SEQ ID NO:1)或与其相关的iRNA。本公开披露的RNA载体能够在宿主植物内进行全身和韧皮部限制的移动和复制。本公开的RNA载体在感染宿主植物后，在宿主植物内功能上可以稳定地复制、移动和/或翻译至少一个月。
在一些实施方式中，本公开的RNA载体的异源片段包括多核苷酸，该多核苷酸编码选自由报告分子、肽和蛋白质组成的组中的至少一种多肽，或该多核苷酸是干扰RNA。在一些实施中，所述多肽是杀虫剂或控虫剂(insect control agent)、抗菌剂、抗病毒剂或抗真菌剂。在一些实施中，抗菌剂是抗生酶。在一些实施中，抗菌剂靶向柑橘黄龙病菌物种，如柑橘黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus(CLas))。
在一些实施方式中，本公开的RNA载体的异源片段包括小的非编码RNA分子和/或RNA干扰分子。在一些实施中，小的非编码RNA分子和/或RNA干扰分子靶向昆虫、细菌、病毒或真菌。在一些实施方式中，小的非编码RNA分子和/或RNA干扰分子靶向昆虫、细菌、病毒或所述真菌的核酸。在一些实施中，小的非编码RNA分子和/或RNA干扰分子靶向病毒，例如选自由柑橘脉突病毒(CVEV)和柑橘衰退病毒(CTV)组成的组中的病毒。在一些实施中，靶细菌是柑橘黄龙病菌亚洲种(CLas)。在一些实施中，iRNA包含siRNA发夹，其靶向靶细菌并使靶细菌具有非致病性。
需要了解的是，RNA载体可包括多个异源片段，每个片段提供相同或不同的功能性。在一些实施方式中，所述异源片段为第一异源片段，其中所述RNA载体进一步包含第二异源片段，其中所述复制元件位于第一和第二异源片段之间。
在一些实施方式中，本公开的RNA载体的异源片段包括编码改变表型性状的蛋白质或肽的多核苷酸。在一些实施中，表型性状选自由杀虫剂耐性、除草剂耐性、昆虫耐性、胼胝质产生减少、生长速度增加和矮小等组成的组。
本公开还涉及包含本公开的RNA载体的宿主植物。所述宿主植物可以是整株植物、植物器官、植物组织或植物细胞。在一些实施中，宿主植物是选自由柑橘属、葡萄属、榕树属和木犀榄属组成的组的属。在一些实施中，宿主植物是柑橘树或柑橘树嫁接物。
本公开还涉及组合物，其包括由本公开的RNA载体感染的植物、植物器官、植物组织或植物细胞。在一些实施方式中，所述植物是选自柑橘属、葡萄属、榕树属和木犀榄属组成的组的属。在一些实施方式中，所述植物是柑橘树或柑橘树嫁接物。
本公开还涉及将异源片段引入宿主植物的方法，包括将本公开的RNA载体引入宿主植物。在一些实施方式中，向宿主植物中引入异源片段的步骤包括在所述引入之前将包含本公开的RNA载体的植物的植物器官或植物组织嫁接至不包含RNA载体的另一植物的植物器官或植物组织。本公开的RNA载体能够全身性地感染宿主植物。
本公开还涉及在植物、植物器官、植物组织或植物细胞中产生异源片段的方法，包括将本公开的RNA载体引入至所述植物、所述植物器官、所述植物组织或所述植物细胞。在一些实施方式中，所述植物在选自由柑橘属、葡萄属、榕树属和木犀榄属组成的组的属中。
本公开还涉及包含本公开的RNA载体的试剂盒。
本公开还涉及使用本公开的RNA载体将异源片段引入植物、植物器官、植物组织或植物细胞。本公开还涉及本公开的宿主植物的用途或本公开的组合物的用途，其用于将RNA载体引入植物器官或植物组织中，而在所述引入之前，该植物器官或植物组织不包含RNA载体。在一些实施中，引入RNA载体的步骤包括将包含RNA载体的植物器官或植物组织嫁接至不包含RNA载体的另一植物的植物器官或植物组织。
本公开还涉及制备用于与植物一起使用的载体的方法，所述载体包括将一个或多个异源片段插入RNA的步骤，其中所述RNA选自由CYVaV、CYVaV的亲缘序列(relative)、与CYVaV具有至少50％或至少70％RdRp同一性的其它RNA载体以及另一iRNA组成的组。本公开还涉及由所公开的方法产生的载体。
本公开还涉及使用RNA分子作为载体，其中所述RNA选自由CYVaV、CYVaV的亲缘序列、与CYVaV具有至少50％或至少70％RdRp同一性的其它RNA载体以及另外的iRNA组成的组。在一些实施中，所述RNA用于治疗植物，例如治疗植物的病毒或细菌感染，例如治疗柑橘植物中CTV的感染或柑橘黄龙病；或控制作为载体的昆虫和/或以植物为食的昆虫。所述RNA被一个或多个插入的异源片段修饰，例如抗生酶或siRNA。
本公开还涉及RNA分子的使用，其特征是用于制造用于治疗植物疾病或病症的药物，其中所述RNA选自由CYVaV、CYVaV的亲缘序列、与CYVaV具有至少50％或至少70％RdRp同一性的其它RNA载体以及另一iRNA组成的组。在一些实施中，所述疾病或病症是植物的病毒或细菌感染，例如柑橘植物中的CTV或柑橘黄龙病。
本公开还涉及用作药物或用于治疗植物疾病或病症的RNA分子，其中所述RNA选自由CYVaV、CYVaV的亲缘序列与CYVaV具有至少50％或至少70％RdRp同一性的其它RNA载体以及另外的iRNA组成的组。
本公开还涉及核糖核酸(RNA)载体，例如正义单链核糖核酸(RNA)载体，其包含一个或多个异源片段，其中所述异源片段通过锁定和对接结构连接至RNA载体的主结构上，任选的连接至分支结构上，所述分支结构包含异源片段的插入位点以及不参与异源片段或RNA载体主结构的折叠的相对稳定的和/或锁定的结构。在一些实施中，RNA载体是基于iRNA的载体或基于病毒的载体。在一些实施中，锁定和对接结构的锁定部分包括通常用于结晶学的支架。在一些实施中，锁定和对接结构包括分支元件，其中分支元件的茎和分支位于形成锁定的相对稳定的结构内，例如四环-四环对接，例如，对接至它的对接序列中的GNRA四环，并且所述分支元件的另一分支包括异源元件的插入位点。在一些实施中，异源元件是发夹或非结构化序列。
本公开还涉及基于iRNA的载体，所述载体具有一个或多个异源片段，所述异源片段具有对植物病原细菌有效的siRNA。在一些实施方式中，siRNA靶向柑橘黄龙病菌物种例如柑橘黄龙病菌亚洲种(CLas)。
本公开还涉及基于iRNA的载体，该载体具有异源片段，该异源片段包括发夹，其具有在一侧上与柑橘衰退病毒(CTV)中的序列互补的序列，或与CTV的正链或负链互补的非结构化序列。在一些实施中，CTV中的序列在多种CTV株中是保守的。在一些实施中，尽管CTV序列存在差异，发夹一侧上的序列1与多种CTV株或所有已知CTV株中的序列互补。本公开还涉及一种植物，其具有酸橙根茎和具有靶向柑橘衰退病毒的异源元件的基于iRNA的载体。
本公开还涉及将异源片段引入宿主植物的方法，所述方法包括a)将iRNA载体包装在除CVEV的衣壳蛋白之外的衣壳蛋白中之后；或b)通过用柑橘黄单胞菌柑橘亚种(Xanthomonas citri subsp.citri)(Xcc)接种农杆菌渗入位点后，通过农杆菌渗入法；或c)通过来自从黄瓜、柑橘或其它植物提取的汁液的韧皮部蛋白2(PP2)涂覆iRNA，将基于iRNA的载体引入所述宿主植物。
本公开还涉及基于iRNA的载体，该载体在基于CYVaV的RNA的位置2250、2301、2319、2330、2331、2336、2375和2083的一个或多个处包含一个或多个插入物。在一些实施中，基于iRNA的载体是稳定化的，例如通过将3'UTR结构中的G:U对转换为G:C对。
本公开还涉及制备核糖核酸(RNA)载体的方法，所述方法包括稳定化亲本构建体的3'UTR结构，以及将一个或多个不稳定的异源片段插入稳定化的亲本构建体中。
本公开描述了许多基于CYVaV的载体，但在一些实施中，类似的载体是使用另外的iRNA或病毒作为起始物质或序列产生的。在这些实施中，可以相应地修改与CYVaV有关的描述。例如，为CYVaV所描述的位置可被另外类型的iRNA或RNA或病毒的相应位置所取代。
在一些实施中，基于iRNA的载体或基于病毒的载体是使用从野生型获得的起始材料(即iRNA或病毒)构建，或由从野生型获得的起始材料经过复制克隆或以其它方式繁殖。对起始材料进行修饰，例如更改、删除和/或替换野生型结构的一个或多个元件，和/或添加一个或多个插入物。在其它实施中，基于iRNA的载体或基于病毒的载体是合成的。例如，基于iRNA的载体或基于病毒的载体可以通过创建野生型RNA的合成副本然后修饰所述合成副本，或直接创建修饰的RNA的合成副本来制备。
本公开还涉及制备核糖核酸(RNA)载体的方法，所述方法包括截断亲本构建体中的发夹，以及将一个或多个异源片段插入截断的亲本构建体中。
本公开还涉及包括本文所述的一个或多个其它组合物或方法的组合或子组合的组合物和方法，涉及由本文所述方法产生的组合物，涉及制备本文所述组合物的方法，以及涉及利用本文所述组合物处理植物的方法。
附图说明
图1示意性地示出了通过植物维管系统的移动路径(Lee,J.Y.和Frank,M.(2018),Plasmodesmata in phloem:different gateways for different cargoes,Curr OpinPlant Biol 43:119-124)。
图2是显示CYVaV与番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)家族中的一些病毒的亲缘关系的系统进化树。
图3示意性示出了CYVaV和类似RNA分子的基因组结构(图A)。编码参与复制的蛋白的ORF以深灰色表明(PEMV2的p33和p94；CYVaV的p21和p81；PMeV2-ES的p35和p86；PUV的p31和p85；TBTVa的p29和p89)。伞病毒PEMV2也具有编码参与移动的蛋白p26和p27的ORF(以浅灰色框表明)。也表明了移码核糖体重编码位点(Frameshifting ribosome recordingsite)(FS)和通读核糖体重编码位点(readthrough ribosome recoding site)(RT)。显示了渗入的本生烟(N.benthamiana)叶片(图B，顶部)和全身叶片(图B，底部)中CYVaV正(+)链的水平显示。显示了在体外通过移码合成的依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)在全长CYVaV和PEMV2的小麦胚芽提取物中的水平(图C)。来自PEMV2的p94的水平与CYVaV产生的p81聚合酶相比差异显著。CYVaV的移码位点是病毒学中已知的最强的之一，并被认为是其异常高积累的原因。
图4示意性地示出了在仙人掌、无花果树和埃塞俄比亚玉米中识别的CYVaV的其它iRNA和近亲缘序列的基因组结构。iRNA亲缘序列在3'UTR中都有插入物以及其它核苷酸的改变，这导致产生编码功能未知的蛋白(p21.2)的ORF。
图5显示了本生烟(Nicotiana benthamiana)的经农杆菌渗入法的叶片的RNA水平。本生烟的叶片中的CVEV(泳道1-2)、CVEV+CYVaV(泳道3-5)和CYVaV(泳道5-8)。在假定的辅助病毒CVEV存在的情况下，CYVaV的积累显著增加。正链如上图所示。rRNA装载控制如下所示。p14沉默抑制子在所有叶片中共渗入。
图6显示了来自另一实验中以本生烟的经农杆菌渗入法的叶片的RNA水平。CYVaV或CVEV或CYVaV+CVEV经农杆菌渗入法渗入至本生烟的叶片中。将CYVaV包封在CVEV的病毒粒子中，并且一周后分离出病毒粒子，并且对包封的RNA进行PCR分析。
图7显示了CYVaV(图A)和CYVaV+CVEV(图B)的发黄症状，限于香木缘(citron)(图示)、柠檬和酸橙。
图8显示了CYVaV在本生烟中的全身和韧皮部限制的移动，其中CYVaV局限于植物的运输组织。图A-G显示荧光原位杂交(FISH)成像，其检测被染成粉色的CYVaV的正链(此处用白色虚线和圆圈大体上表示的区域)，包括叶柄(图A-D)和根组织(图E-G)的纵视图和横截面图。组织用DAPI染色。鉴定出伴生细胞(CC)、韧皮部薄壁细胞(PPC)、筛分子(SE)和木质部(XL)。注意iRNA完全局限于SE、CC和PPC。蓝色(此处显示为深灰色或黑色区域)来自内源性DNA的DAPI染色。CYVaV在几乎所有测试的柑橘中是无症状的。
图9示意性示出了CYVaV的全长二级结构，如通过SHAPE结构探测和与仙人掌、无花果和玉米中CYVaV亲缘序列的系统发生比较来确定。重编码移码位点(见图10)以单实线加框区域表示，而ISS样(I-型结构)的3'CITE(见图11)由虚线加框区域表示。例如，用于容纳插入的发夹的区域以加框双线区域显示。
图10示意性示出了CYVaV和PEMV2中重编码移码位点的结构(图A)。CYVaV具有该区域结构的多种构象(见图9)，其中只显示了一种构象。滑动位点以虚线加框表示，并且终止密码子碱基在黑圈中。由实线加框表示的碱基参与与3'端的长距离相互作用。
图11示意性示出了CYVaV的ISS样3'帽独立翻译增强子(3'CITE)。显示了CYVaV的3'端的结构。3'CITE在最左边部分显示，且碱基被圈起来。由实线加框显示的序列参与与重编码位点的长距离RNA:RNA相互作用。
图12示出了反式抑制试验(trans-inhibition assay)的结果。在存在10倍摩尔浓度超过ISS的截断版本(ISSs)或全长尺寸的ISS(ISSL)的情况下，在体外翻译全长CYVaV。
图13证实了CYVaV不编码沉默抑制子。参照图A和图B，以表达GFP(在这些植物中沉默)的构建体，和或是表达CYVaV p21或p81的构建体，或是表达已知的沉默抑制子p19(来自TBSV)或p38(来自TCV)的构建体通过农杆菌渗入法渗入本生烟16C植物中。只有p19和p38抑制GFP的沉默，让绿色荧光被表达(图B中渗透区域以虚线圆圈表示)。参照图C，使用GFP寡核苷酸探测的RNA印迹(northern blot)表明GFP RNA在p21或p81存在时仍然沉默。
图14证实了CYVaV在拟南芥原生质体中的复制。产生了CYVaV的感染性克隆。将野生型RNA转录物(CYVaV)或包含重编码滑动位点中的突变的转录物(CYVaV-fsm)接种至拟南芥原生质体上，该重编码滑动位点中的突变消除了RdRp的合成，因此无法复制。提取RNA，并且30小时后进行RNA印迹。值得注意的是，接种的CYVaV-fsm转录物在30小时时仍然存在于原生质体中(而在传统病毒中，它们在4小时后将无法被检测到)。正链如图A所示，并且负链复制中间体如图B所示。
图15证实了CYVaV在本生烟中的复制。参照图A，显示了通过RNA印迹确定的本生烟的渗入叶片中积累的CYVaV水平。参照图B，渗入CYVaV的植物偶有显示全身症状(见图16)。这些植物积累了高水平的CYVaV。参照图C，显示了全身感染的植物的各个叶片中CYVaV的水平。叶片4和叶片5通过农杆菌渗入法渗入了CYVaV。注意CYVaV在幼嫩叶片中的大量积累。
图16显示全身感染CYVaV的本生烟的症状。叶片4和叶片5通过农杆菌渗入法渗入了CYVaV。全身感染的植物的第一迹象是“杯状”叶片(图A)，其几乎总是叶片9。在接下来的几周内，叶瘿(leaf gall)出现在植物的顶端分生组织和每个节点(图B)。显示了年龄相同的未感染植物(图C，左)和感染的植物(图C，右)。全身感染的植物也具有根瘿(图D)，根瘿含有大量的CYVaV，通过植物RNA印迹(图E)证实的。
图17是感染后53天时的番茄植物(左)与同龄植物(右)的图像，并且证实了CYVaV的特殊宿主范围。将全身感染的本生烟植物的汁液注入番茄植物的叶柄。4株植物中的1株表现出很强的症状，并且PCR分析为CYVaV阳性。
图18证实了CYVaV与从黄瓜韧皮部提取的高丰度蛋白结合。参见图A，在该RNA印迹中标记的全长CYVaV与突出的蛋白质结合。蛋白质在SDS凝胶电泳后复性。该蛋白质被认为是已知的高度保守的RNA结合蛋白，其包含RRM基序，已知该基序可以在黄瓜韧皮部陪同RNA从伴生细胞进入筛分子。参见图B，电泳后蛋白保持变性时，未见结合。
图19证实了CYVaV能够使用TEV IRES从其3'UTR表达额外的蛋白质。显示了烟草蚀纹病毒(TEV)内部核糖体进入位点(IRES)的下游纳米荧光素酶的三个独立的插入的位置(在三种独立的构建体中)(图A)。在小麦胚芽提取物中测量三种构建体的体外翻译(图B)。注意纳米荧光素酶蛋白(Nluc)的位置靠近凝胶的底部。在体内在原生质体中测量纳米荧光素酶的表达(图C)。构建体的全长RNA转录物(图A)被转化至原生质体中；18小时后，提取总蛋白，并且用荧光仪测量纳米荧光素酶活性。
图20示出了在位置2250的稳定的发夹插入物。CY2250sfPDS60的示意性的代表显示在图A中。在CYVaV的二级结构中的插入的位置显示在图B中，该位置对应于容纳插入的发夹的区域，如图9中的双线框显示的。来自CYVaV-wt以及在位置2250包含不同数量的序列的CYVaV VIGS载体的T7转录物的小麦胚芽提取物体外翻译测定的数据显示在图C中。例如，构建体sfPDS60证明了在植物中优秀的全身移动。分离自由CYVaV wt和CYVaV VIGS载体、CYVaV-GDD阴性对照感染的拟南芥原生质体的总RNA的RNA印迹分析显示在图D中。(+)代表正链并且(-)是负链复制中间体。由CY2250sfPDS60感染的本生烟的图像显示在图E中。来自局部叶片和全身叶片的RT-PCR产物显示在图F中。引物组扩增在CYVaV的3’区域的位置1963-2654。从全身叶片收集的载体的插入区域的序列(下划线)显示在图G中，在形成发夹的茎的插入的任一侧的序列用虚线加框框出。
图21示出了在位置2301的稳定的发夹插入。CY2301sfPDS60的示意性的代表显示在图A中。在CYVaV的二级结构中的插入的位置显示在图B中，并且对应于容纳插入的发夹的区域，如在图9中的被双线框显示的。来自CYVaV-wt以及在位置2301和2319含有不同数量的序列的CYVaV VIGS载体的T7转录物的小麦胚芽提取物体外翻译测定的数据显示在图C中。例如，构建体PDS60证明了在植物中优秀的全身移动。分离自由CYVaV wt和CYVaV VIGS载体、CYVaV-GDD阴性对照感染的拟南芥原生质体的总RNA的RNA印迹分析显示在图D中。(+)代表正链并且(-)代表负链复制中间体。由CY2301sfPDS60感染的本生烟的图像显示在图E中。来自局部叶片和全身叶片的RT-PCR产物显示在图F中。引物组扩增在CYVaV的3’区域中的位置1963-2654。从全身叶片收集的病毒载体的插入区域的序列显示在图G中，形成发夹的茎的序列用虚线加框框出。
图22示出了在位置2319的稳定的发夹插入。CY2319sfPDS60的示意性的代表显示在图A中。在CYVaV的二级结构中的插入的位置显示在图B中，并且对应于图9中被双线加框显示的用于容纳插入的发夹的区域。来自CYVaV-wt以及在位置2301和2319包含不同数量的序列的CYVaV VIGS载体的T7转录物的小麦胚芽提取物体外翻译测定的数据显示在图21图C中。分离自由CYVaV wt和CYVaV VIGS载体、CYVaV-GDD阴性对照感染的拟南芥原生质体的总RNA的RNA印迹分析也显示在图21图D中。由CY2301sfPDS60感染的本生烟的图像显示在图C中。来自局部叶片和全身叶片的RT-PCR产物显示在图D中。引物组扩增在CYVaV的3’区域的位置1963-2654。
图23示出了在CYVaV的RdRp的ORF上的60nt插入物(非发夹)的位置(图A)。插入的位置由黑色箭头表示。由黑色六边形表示的终止密码子在插入的上游被工程化，以截断RdRp。在拟南芥原生质体中的正链RNA水平的RNA印迹显示在图B中。CYVaV-GDD是非复制性对照。
图24示出了用于稳定插入物的碱基的锁定和对接序列。参照图A，四环GNRA(GAAA)与其对接序列的对接产生非常稳定的结构，并且代表基本的锁定和对接序列。参照图B，显示了由对接的四环组成的支架(类似于有时用作晶体学支架的类似结构)的使用。参照图C，显示了独特的锁定和对接结构。插入物(发夹或非发夹序列)可添加至限制性位点(如由虚线框标识的)。在序列中圈出的碱基是用于GAAA四环的对接序列。
图25示出了稳定局部3'UTR结构是非常不利的，但在附近插入不稳定的插入物恢复活力。参照图A，CYVaV-wt的示意性的代表。CYVaV-wt 3'stb是亲本稳定的构建体，其包含转换G:U对至G:C对的6nt变化。将两种60个核苷酸的插入物在位置2319和2330添加至稳定的亲本构建体，形成CY2319PDS60_3'stb和CY2330PDS60_3'stb。为稳定结构并生成CYVaV-wt3'stb而进行的核苷酸变化在图B中被圈出。每种构建体的插入位点由箭头表示：图A中的左箭头指示对于构建体CY2319PDS60_3'stb的插入位点，图A中的右箭头指示对于构建体CY2330PDS60_3'的插入位置。参照图C，显示了来自显示在图A中的构建体的T7转录物的小麦胚芽提取物体外翻译测定的数据。注意p81水平(移码产物)通过稳定该区域被强烈影响。参照图D，显示了分离自由CYVaV-wt、CYVaV-wt 3'stb、CY2319PDS60_3'stb、CY2330PDS60_3'stb和CYVaV-GDD(非复制性对照)感染的拟南芥原生质体的总RNA的RNA印迹分析。(+)代表正链，并且(-)代表负链复制中间体。
图26示出了靶向宿主基因表达的CYVaV VIGS构建体。没有用于GFP的基因的正常的、未受感染的叶片显示在图A中，其中当在紫外光下观察时叶绿体发出亮红色荧光(在图A中显示为深灰色)。表达GFP的叶片显示在图B中，并且在紫外灯下在颜色上呈现暗橙色带绿色的茎(如在图B中显示为浅灰色)。表达GFP和用示例性的VIGS构建体感染的叶片显示在图C中，其中感染的叶片证明了在叶片脉管系统中经由韧皮部用siRNA靶向和沉默GFP mRNA的有效的基因沉默。如在图D中所示的，14天后，VIGS构建体遍及宿主植物迁移(包括在图C中所示的叶片，由箭头标示的)，其中负责GFP基因沉默的siRNA遍及叶片和植物分布。
图27示出了靶向CTV的CYVaV VIGS载体。用CTV-GFP(表达GFP的CTV)感染的本生烟用作嫁接至野生型CYVaV(CYVaVwt)或CYVaV-GFPhp2301接穗的根茎(root stock)(图A)。靶向GFP的发夹(图B)被插入在构建体CYVaV-GFPhp2301中。CYVaVwt接穗对感染新出现的根茎叶片的CTV-GFP没有影响(图A，中间的图)。然而，当CYVaV-GFPhp2301存在于接穗中时，绿色斑点不存在于托叶中(图A，右图)，证明CYVaV-GFPhp2301向下至根茎的移动抑制了CTV感染的进展。当CYVaVwt存在于根茎中时，来自CTV-GFP接穗的新的叶片在紫外光下发绿色荧光，证明广泛的CTV感染持续不减(图C，中间的图)。当CYVaV-GFPhp2301在根茎中时，所有CTV-GFP-感染的接穗中的上部叶片部分或者几乎全部没有GFP斑点(图C，右图)。在没有GFP斑点的叶片中的红色区域(图C，右图，圈出的A)和绿色区域(圈出的B)的RT-PCR表明CYVaV-GFPhp2301的高水平与红色荧光有关(A区)，其中相较于绿色区域(区域B)，这样的组织具有少3,000-倍和440,000-倍的CTV，如在图D中以图表形式显示的。用携带有靶向CTV基因组中的保守序列的发夹的CYVaV(图F)通过农杆菌渗入法渗入完全感染的本生烟。四天后，与用CYVaV野生型渗入的组织相比，在渗入的组织中的CTV水平低约10倍(图E)。用CTV-GFP和CYVaV野生型或具有不同的CTV基因组-靶向的发夹的CYVaV(图H)共渗入的叶片显示了渗入后6天时CTV-GFP显著减少(图G)。
图28示出了用CYVaV对黄瓜(图A)和黄瓜(图B)植物的感染。图A最左图显示了未感染的黄瓜子叶(模拟(mock))和用CYVaV经农杆菌渗入法的黄瓜子叶；该图像在感染后约2个月拍摄，两种植物都在类似的条件下生长。图A右上方图和右下方图显示了左侧图像中加框区域的放大视图。图B显示了未感染的番茄植物(模拟)和用CYVaV感染的番茄植物；该图像在感染后约50天拍摄，两种植物都在类似的条件下生长。
图29示出了根据本公开的锁定和对接结构1和2(分别为L&D1和L&D2)的结构和序列(图A)。RT-PCR结果的凝胶图像显示在图B中：第一/左侧泳道：来自包含CYVaV和锁定和对接1的全身感染的植物的RT-PCR；第二/右侧泳道：用质粒构建体作为模板的PCR。测序条带显示了L&D1和L&D2支架结构的高稳定性。测序证实了在一个月后在植物中没有RNA的任何变化的迹象。
图30示出了CYVaV结合至黄瓜和本生烟韧皮部中的韧皮部蛋白质2(PP2)。参照图A，收集未感染的(模拟)和2种CYVaV-感染的黄瓜(CYVaV1和2)的韧皮部渗出液，与甲醛交联(输入(Input))，并且然后用于使用具有或不具有连接的5′-生物素化的CYVaV探针(分别为探针和无探针)的链霉亲和素珠进行下拉试验(pull down assay)。用考马斯蓝对SDS-PAGE凝胶染色。参照图B，来自A的样品进行电泳，并且然后转移至硝化纤维膜上，并且通过使用黄瓜PP2(CsPP2)的多克隆抗体的蛋白质印迹(Western Blot)分析(上图)。图B下图为Ponceau S染色的膜。参照图C，将RNase处理前的下拉试验中回收的总RNA进行RT-PCR，以验证CYVaV的存在。(+)，来自CYVaV-感染的本生烟的RNA；(-)，来自未受感染的黄瓜植物的RNA。使用用CYVaV或PEMV2感染的本生烟进行了类似分析(图D、E和F)。对于PEMV2下拉试验，将PEMV2-特异性探针连接于珠上。
图31示出了来自位置号1889-2341的CYVaV的结构和序列。显示了在2250、2301、2319、2330和2336的潜在插入位置，每个具有在浅蓝色圆圈中的相邻的碱基对。根据本公开的锁定和对接1以及锁定和对接2(图29)和/或另外的锁定和对接结构的结构和序列可以插入在例如2250、2301、2319、2330和/或2336五个位置(用箭头标识)中的任何一个。
图32示出了用在位置2301具有GFP 30 nt发夹插入物的CYVaV感染的本生烟16C植物，以及用在位置2301具有L&D1+GFP 30 nt发夹插入物的CYVaV感染的本生烟16C植物。仅由CY2301GFP30s(无锁定和对接结构)感染的本生烟16C植物显示在图A中。未检测到病毒-诱导的基因沉默(VIGS)效应。输入CYVaV(CY2301GFP30)和在全身组织中积累的CYVaV之间的测序比对显示在图B中。后一CYVaV包含在感染期间所需的19nt缺失，表明该构建体不稳定。用CY2301 LD1GPF30s(其中30nt序列插入在位置2301的L&D1中)感染的本生烟16C植物显示在图C中。观察到由VIGS引起的明显的GFP沉默(植物荧光红色；如在图C中深灰色所示)。在CY2301LD1GFP30s感染的植物和原始构建体之间的序列比对(图D)显示了L&D1增强了30nt插入的稳定性。30nt的发夹GFP序列(正义方向)显示在图E中。
图33示出了锁定和对接1(L&D1)(CYm2250LD1)以及靶向胼胝质合酶(CYm2250LD1Cal_30as)并在截断前在指定为位置2250的位置用截断的发夹插入CYVaV的L&D1+30nt非结构序列的稳定性。由CYm2250LD1感染的本生烟植物显示在图33图A中，其在截断的发夹的末端包含L&D1。在野生型分子中存在的完整的发夹的末端添加该插入物未发现是稳定的。在感染的组织中的CYm2250LD1(RT-PCR)与原始构建体之间的测序比对(图33，图B)显示完全的稳定性。由CYm2250LD1asCal7_30as(包含具有靶向胼胝质合酶7mRNA表达的30 nt siRNA插入物的L&D1的CYVaV)感染的本生烟16C植物显示在图33图C中。在感染的植物中积累的CYm2250LD1Cal730as(RT-PCR)与原始构建体之间的序列比对(图33、图D)显示30 nt插入物在L&D1内是稳定的。靶向在韧皮部活跃的胼胝质合酶的30nt胼胝质合酶7siRNA序列(反义方向)显示在图33图E中。
图34示出了包括两种插入(CY2301LD2/2330CTV6sh)的构建体的二级结构。一种插入物是靶向CTV6的发夹，另一种是在2301的空的L&D2(图A)。用CY2301LD2/2330CTV6sh感染的本生烟显示在图B中。来自CY2301LD2/2330CTV6sh感染的植物的RT-PCR结果显示在图C中。上部条带含有两种插入物，并且与原始渗入的构建体是一样的。下部条带具有L&D2中的缺失。数据显示，这两种插入物是耐受的。
图35示出了另外的具有增强的稳定性的锁定和对接结构及其感染的植物。在所公开的锁定和对接结构的底部扩展碱基对提高了较大非结构化插入物的稳定性。在L&D1中碱基对被扩展(图C)从而产生了第三锁定和对接结构(L&D3)。用在位置2301的L&D3(CY2301LD3)感染的本生烟植物显示在图A中。显示单一条带(没有明显的缺失)的感染的植物的有症状的叶片的RT-PCR显示在图B中。在位置2301具有L&D1的CYVaV与来自感染的植物的CY2301LD3的RT-PCR测序的序列比对显示在图C中。检测到无不稳定性。
图36示出了在CYVaV中在位置2375的稳定的发夹插入物。由CY2375LD1(L&D1插入在位置2375的CYVaV)感染的本生烟植物显示在图A中。感染的植物的有症状的叶片的RT-PCR显示在图B中。较大条带的测序结果与原始序列一致。然而，短的条带的序列显示L&D1的部分缺失。新插入位点的二级结构显示在图C中。
具体实施方式的详细描述
本公开涉及用作植物载体的新型传染剂，包含被所公开的剂感染的植物的组合物，以及与之相关的用途和方法。本公开的传染剂有时被称为“独立移动的RNA”或“iRNA”，并且表现出与传统病毒载体相比更优越的特性。根据公开的实施方式，所述iRNA是这样的RNA分子，其能够感染植物并编码RNA聚合酶以维持其自身复制，但缺乏编码任何移动蛋白或外壳蛋白的能力。此外，iRNA不编码任何RNA沉默抑制子。
如本文所用，“宿主”是指能够被核酸感染并能够复制核酸的细胞、组织或有机体。宿主可以包括整株植物、植物器官、植物组织、植物原生质体和植物细胞。植物器官指的是植物的明显的和看得见的分化部分，如根、茎、叶、种子、嫁接物或接穗。植物组织是指植物的任何全部或部分组织。原生质体是指没有细胞壁的分离的细胞，其具有再生为细胞培养物、组织或整株植物的能力。植物细胞是指植物的结构和生理单位，由原生质体和细胞壁组成。
如本文所用，“核酸序列”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可以互换使用，并且指任何长度的核苷酸的聚合形式。多核苷酸可以有任何三维结构，并且可以表现出任何功能。“基因”是指包含至少一个开放阅读框的多核苷酸，该阅读框能够编码特定的多肽序列。“表达”是指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录后的mRNA被翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。
从特定分子“衍生”的载体意指该载体包含来自该分子的遗传元件或序列部分。在一些实施方式中，载体包括来自该分子(例如，iRNA)的复制酶开放阅读框(ORF)。一个或多个异源片段可以作为附加序列添加至本公开的载体中。在一些实施中，添加所述异源片段使得实现高水平表达(例如，特定蛋白或小RNA的表达)。利用RNA载体作为模板，通过RNA依赖的RNA聚合作用形成进一步的RNA载体分子，获得的载体能够在植物细胞中复制。iRNA载体可以由其衍生的RNA分子构建(例如，CYVaV)。
如本文所用，“感染”或“能够感染”包括载体将其核酸转移或引入宿主的能力，从而使核酸或其部分在宿主中复制和/或使蛋白或其它剂在宿主中合成或递送。感染还包括将选定的核酸序列整合至靶宿主的基因组的能力。
如本文所用，“表型性状”是指一个或多个基因的表达或抑制所产生的可观察的、可测量的或可检测的特征或特性。表型包括可观察到的性状以及生化过程。
如本文所用，“内源”指的是由宿主表达的多肽、核酸或基因。“异源”是指并非由宿主自然表达的多肽、核酸或基因。“功能性异源ORF”是指不存在于相应的未修饰或天然分子中并且可以被表达以产生特定的剂，如肽、蛋白质或小RNA的开放阅读框(ORF)。为使载体在植物、植物组织或植物细胞中可表达，含有功能性异源ORF的载体包括一个或多个表达所需的亚基因组启动子或其它序列。
本领域中已知多种测定用于确定特定产物的表达，包括但不限于：杂交测定(如RNA印迹分析)、扩增程序(如RT-PCR)和基于阵列的技术。也可以使用本领域中已知的技术来测定表达，以检测蛋白质产物，包括但不限于：放射免疫分析、ELISA(酶联免疫放射分析)、三明治免疫分析、免疫放射分析、原位免疫分析、蛋白质印迹分析、免疫沉淀分析、免疫荧光分析、气相色谱-质谱和SDS-PAGE。
“外源RNA片段”是指插入到天然分子的RNA片段，因此外源RNA片段的来源与天然分子不同。来源可以是另外的病毒，活的生物体如植物、动物、细菌、病毒或真菌，化学合成材料或它们的组合。外源RNA片段可提供适合特定应用的任何功能，包括但不限于：非编码功能RNA、编码功能的RNA，其中RNA的编码功能充当由宿主细胞翻译的信使RNA编码序列，这导致具有有用的或期望的性质的肽(例如，包含约2个和50个之间的氨基酸的分子)或蛋白(如包含50或更多个氨基酸的分子)的合成。
如本文所用，“移动蛋白”是指细胞间和/或长距离移动所需的蛋白质。“外壳蛋白”是指组成或构建病毒外壳的蛋白质。
与伞病毒类似，iRNA不具有功能外壳蛋白ORF和/或以其它方式编码任何外壳蛋白。此外，iRNA的RNA聚合酶类似于伞病毒的。然而，与伞病毒不同，iRNA不具有功能性移动蛋白ORF和/或不以其他方式编码任何细胞间移动蛋白或任何长距离移动蛋白，这些蛋白作为对抗无义介导的衰变的稳定化蛋白。
缺乏外壳蛋白的传统病毒在植物细胞内通常不太稳定，因为它们的基因组容易受到宿主RNA沉默防御系统的攻击。然而，iRNA在细胞内环境中惊人地稳定，这是有效载体的重要特征。在没有特定辅助病毒的情况下，iRNA也受限于接种的宿主植物，因为没有相关病毒粒子，它们就不能通过昆虫载体可传播。人们认为，只有在特定的辅助病毒存在时，iRNA才会被包装在病毒粒子中，例如，包括是在美国罕见的病毒的柑橘脉突病毒(CVEV)在内的耳突花叶病毒属(enamovirus)。
在公开的实施方式中，提供了一种重组正义单链RNA载体，该载体包括复制元件(例如，负责复制的载体分子的一个或多个部分)和异源片段。本公开的RNA载体能够在韧皮部中积累至高水平，并能够将治疗剂，如蛋白、肽、抗菌剂和/或杀虫剂(例如，siRNA)直接递送入植物组织。在一些实施中，RNA载体来源于iRNA分子，其缺乏编码任何外壳蛋白或移动蛋白的能力。例如，该载体来源于和/或包含称为柑橘黄脉相关病毒(CYVaV)的iRNA分子的结构元件，该iRNA分子是与柑橘的黄脉病相关的未分类的分子。
因此，公开的实施方式提供了基于iRNA的载体，该载体构建在使用来自iRNA分子(例如CYVaV)的遗传组分的正义单链RNA分子上，或由该正义单链RNA分子衍生得到。此外，本公开涉及包含基于iRNA(例如基于CYVaV)的载体的试剂盒和/或混合物。该混合物可以是固体形式如干燥的或冷冻干燥的固体，也可以是液体形式如水溶液、悬浮液或分散体，或凝胶。该混合物可用于感染植物、植物组织或植物细胞。该试剂盒和混合物可用于使用本公开所述的基于iRNA的载体成功地感染植物或植物细胞，和/或用于外源蛋白的表达或将其它治疗剂递送至这种植物或植物细胞。
本公开还涉及包括在本公开的所述基于iRNA的载体的植物、植物组织或植物细胞，和/或包含由所述载体编码或递送的治疗剂或外源多肽的植物、植物组织或植物细胞。本公开还提供了从植物、植物组织或植物细胞中分离此类外源多肽的方法。从植物、植物组织或植物细胞中分离蛋白质的方法对于本领域普通技术人员来说是众所周知的。
20世纪50年代在四种莱姆(limequat)树中发现了独立于任何辅助病毒的CYVaV(Weathers,L.(1957),A vein-yellowing disease of citrus caused by agraft-transmissible virus,Plant Disease Reporter 41:741-742；Weathers,L.G.(1960),Yellow-vein disease of citrus and studies of interactions between yellow-veinand other viruses of citrus,Virology 11:753-764；Weathers,L.G.(1963),Use ofsynergy in identification of strain of Citrus yellow vein virus,Nature 200:812-813)。数年后，Georgios Vidalakis对CYVaV进行了进一步的分析和测序(Universityof California,Davis,CA；GeneBank:JX101610)。Vidalakis博士实验室对从以前建立的树木资源收集的样本进行了分析(Weathers,L.G.(1963),Use of synergy inidentification of strain of Citrus yellow vein virus,Nature 200:812-813)，并保存在柑橘无性系保护计划(CCPP)的疾病库中。Vidalakis实验室对表征CYVaV的研究是不确定的。然而，许多包含CYVaV的感染样本也含有耳突花叶病毒属柑橘脉突病毒(CVEV)；20世纪50～80年代，CCPP的工作人员相对普遍地将感染植物与黄脉病和脉突病(yellow-veinand vein enation)混合以增强症状。
CYVaV是小的(～2.7kb)iRNA分子，包括单一的正义RNA链。其复制至极高的水平，可以非常稳定，其局限于韧皮部，并没有已知的自然扩散传播机制。因此，CYVaV是理想的载体平台，用于将剂引入植物宿主，例如，用于疾病和/或病虫害管理的小RNA(例如，长度为约50至约250nt的非编码RNA分子)和/或蛋白质。增强(或沉默)防御的蛋白、靶向细菌的抗菌肽和/或靶向植物基因表达或病原体的昆虫载体的小RNA的产生提供了有效的管理策略。为了是有效的，蛋白和小RNA应该在韧皮部中产生足够的数量并积累至足够的水平，特别是设计为被靶昆虫或真菌病原体吸收的小RNA。
事实上，CYVaV只与辅助病毒一起传播，但可能通过嫁接在树与树之间移动，并已显示感染几乎所有种类的柑橘除了丰盛的橙(orange)，包括但不限于感染香木缘、粗皮柠檬、四季橘、甜橙、酸橙、葡萄柚、兰卜莱檬(Rangpur)和西印度酸橙、柠檬、各种柑橘(mandarin)、各种橘柚和金橘。其在指示物种(indicator)柑橘树中产生叶脉黄化，并且在甜橙和其它柑橘中没有或只有非常轻微的黄脉症状，没有报告对果实质量造成影响，或以其它方式对树木造成伤害。
CYVaV的多核苷酸序列(碱基1至2692)如下所示(SEQ ID NO:1)：
Figure BDA0003747217710000271
Figure BDA0003747217710000281
CYVaV与包括番茄丛矮病毒科病毒在内的其它病毒的亲缘关系如图2所示。CYVaV和类似的RNA分子的基因组结构如图3中图A所示，包括PEMV2、PMeV2-ES(GenBank:KT921785)、PUV(GenBank:KP165407.1)和TBTVa(GenBank:EF529625.1)。CYVaV的RdRp与伞状病毒豌豆耳突花叶病毒(umbravirus Pea enation mosaic virus)RNA2(PEMV2)关系最为密切。对CYVaV的5'和3'序列的检测显示，其与伞病毒相当相似，证实CYVaV确实是完整的传染剂。CYVaV具有正义单链RNA基因组，其只编码两种参与复制的蛋白：p21，相关分子中的复制酶相关蛋白；和p81，由核糖体编码(移码)事件合成的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)(图3，图A)。显示了PEMV2和CYVaV在体外通过移码合成的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)的水平。与来自CYVaV的p81相比，来自PEMV2的p94(RdRp)的水平差异显著(图3，图C)。CYVaV的移码位点是病毒学中已知的最强的位点之一，其被认为是其异常高积累的原因。
CYVaV的3'端(碱基2468至2692)的多核苷酸序列如下呈现(SEQ ID NO:2)：
Figure BDA0003747217710000282
CYVaV的3'帽独立翻译增强子(3'CITE)(碱基2468至2551)的多核苷酸序列如下呈现(SEQ ID NO:3)：
Figure BDA0003747217710000291
CYVaV的3'端(和3'CITE)包括以下保守的多核苷酸序列(上文粗体和下划线部分)：
auagcacug(SEQ ID NO:4)；和/或
gauuuguga(SEQ ID NO:5)。
CYVaV编码蛋白p21(碱基9至578)的多核苷酸序列如下呈现(SEQ ID NO:6)：
Figure BDA0003747217710000292
蛋白p21的氨基酸序列如下呈现(SEQ ID NO:7)：
MDPSSLPRACWHHARQVFRASTSFSREVVRAARRWVTMPTSRHAYDFSTSLGIVIAEPAARLRRRLPSVRKCAEKLVVHKQVDTLVDEWCSGIPNPDIVEVGWALRLRDRFGLPPASEPTRLSGERWVLKQLNGVDPESWNADLGRSVHIQGDYAPGRNAHIAQVAATLWLTRTLHDKALARHQGFRDLQ
CYVaV编码蛋白p81(752至2158碱基)的多核苷酸序列如下呈现(SEQ ID NO:8):
Figure BDA0003747217710000293
Figure BDA0003747217710000301
蛋白p81的氨基酸序列如下呈现(SEQ ID NO:9)：
MTTRVLQYKGRDPILPSSEALHRLNLRIAELYRSRPSTVYPLSYEGFLNCYEGRQRTRYAQAVEQLMRSTLEPKDARVETFIKNEKFDWALKGEEADPRAIQPRKPKYLAEVGRWFKPLERIIYKDLSKRLYGEGAEPCIAKGLNALESGATLRRKWEKFSSPVCVSLDASRFDLHVSVGMLKFTHKLYDYYCKSPTLQRYLKWTLRNHGVASCKELSYEYEVVGRRMSGDMDTALGNCVIMSILTWFMLSELGIKHELFDNGDDCLFICESHDVPSPEVITNWFSDFGFVVRLEGVTSVFERIEFCQTSPVWTERGWLMCRNIKSLSKDLTNVNSCTGSTIEYTHWLKAVGKCGSILNAGVPIFQSFHNMLERLGTNSRIDRGVFFKSGLVNLIRGMDRQPDVDITTSARLSFEVAFGITPGMQLAIERYYDSVMGSLSKIETTKWPIELRKEYEHGSEWYEDLGVLG
CYVaV的复制元件(例如，编码蛋白p81的复制元件)包括以下保守的多核苷酸序列(上文突出显示和带下划线的部分)：
cguuc(SEQ ID NO:10)；
gaacg(SEQ ID NO:11)；
gguuca(SEQ ID NO:12)；
ggag(SEQ ID NO:13)；和/或
aaauggga(SEQ ID NO:14)。
此外，CYVaV还可包括以下保守的多核苷酸序列(上文突出显示和带下划线的部分)：
ucgacg(SEQ ID NO:15)；和/或
cuccga(SEQ ID NO:16)。
CYVaV的重编码移码位点的多核苷酸序列(见图10)如下所示:
ucgcucaggucgcggcgaccuugugguuaacuaggaccuugcaugacaaggccuuggcucgccaccaggguuuucgcgauuugcagugauuggggucgacgggcuagaggcaaaagcagugccucuagcuucuggacuccgacugcuuccgguuccgcgacccgga(SEQ ID NO:17)
caaagucgacgacugucucagaccu(SEQ ID NO:18)
aggucuuggacagucugcgggcuugggaacgacg(SEQ ID NO:19)
在仙人掌(GenBank:MH579715)、无花果树和埃塞俄比亚玉米中也发现了高度相似的iRNA(图4)，这表明本文公开的RNA载体的宿主范围异常大，甚至可能是无限的。
在无花果树上鉴别的类似iRNA(本文有时称为“iRNA亲缘序列1”或“iRNA r1”)的多核苷酸序列如下呈现(SEQ ID NO:20):
Figure BDA0003747217710000311
Figure BDA0003747217710000321
在另一无花果树中鉴别的iRNA(本文有时称为“iRNA亲缘序列2”或“iRNA r2”)的多核苷酸序列如下呈现(SEQ ID NO:21):
Figure BDA0003747217710000322
Figure BDA0003747217710000331
在玉米中鉴定的iRNA(本文有时称为“iRNA亲缘序列3”或“iRNA r3”)的多核苷酸序列如下呈现(SEQ ID NO:22):
Figure BDA0003747217710000341
Figure BDA0003747217710000351
需注意的是，iRNA亲缘序列(例如iRNA r1、iRNA r2和iRNA r3)可包含保守的多核苷酸序列(上文加粗和下划线表示)：auagcacug(SEQ ID NO:4)；和/或gauuuguga(SEQ IDNO:5)。例如，iRNA分子包含两个保守的多核苷酸序列：auagcacug(SEQ ID NO:4)；和gauuuguga(SEQ ID NO:5)。
此外，iRNA亲缘序列(如iRNA r1、iRNA r2和iRNA r3)可包含保守的多核苷酸序列(上文粗体和下划线显示)：cguuc(SEQ ID NO:10)；gaacg(SEQ ID NO:11)；gguuca(SEQ IDNO:12)；ggag(SEQ ID NO:13)；和/或aaauggga(SEQ ID NO:14)。例如，iRNA分子包含所有保守的多核苷酸序列：cguuc(SEQ ID NO:10)；gaacg(SEQ ID NO:11)；gguuca(SEQ ID NO:12)；ggag(SEQ ID NO:13)；和aaauggga(SEQ ID NO:14)。
此外，iRNA亲缘序列(例如iRNA r1、iRNA r2和iRNA r3)可包含保守的多核苷酸序列(上文粗体和下划线表示)：ucgacg(SEQ ID NO:15)；和/或cuccga(SEQ ID NO:16)。iRNA分子可包含两个保守的多核苷酸序列：ucgacg(SEQ ID NO:15)；和cuccga(SEQ ID NO:16)。在一些实施方式中，iRNA分子与CYVaV(或与iRNA r1、iRNA r2或iRNA r3)高度相关，且包含与合成其RdRp的重编码位点具有50％、60％、70％或更多的同一性的多核苷酸序列，例如，与CYVaV的(或iRNA r1、iRNA r2或iRNA r3的)RdRp具有75％或85％或90％或95％或98％同一性。
因此，根据本公开的实施方式，RNA载体(例如，从iRNA分子衍生而来)包括用于合成RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)的移码核糖体编码位点。此外，RNA载体可包括3'端，其包含末端为3个胞嘧啶核苷酸(…CCC)的多核苷酸序列。倒数第二个3'端发夹在末端环中也可含有三个鸟苷酸(…GGG…)。此外，3'CITE包括扩展的发夹或其部分，其与真核翻译起始因子4G(eIF4G)和/或真核起始因子4F(eIF4F)结合。
在某些实施方式中，RNA载体包括3’CITE，其包含保守序列auagcacug(SEQ ID NO:4)和gauuuguga(SEQ ID NO:5)。RNA载体也可包含一个或多个以下的多核苷酸序列(鉴定的iRNA分子的保守序列)：cguuc(SEQ ID NO:10)和gaacg(SEQ ID NO:11)；和/或gguuca(SEQID NO:12)和ggag(SEQ ID NO:13)；和/或aaauggga(SEQ ID NO:14)。可选地，或另外，RNA载体可包含以下一种或两种多核苷酸序列(鉴定的iRNA分子的保守序列)：ucgacg(SEQ IDNO:15)和cuccga(SEQ ID NO:16)。
已鉴定的iRNA亲缘序列在3'UTR中都有插入物和其它核苷酸变化，其导致编码功能未知的蛋白(p21.2)的ORF的产生。iRNA例如CYVaV与任何植物病毒的一个区别特征(图2)在于iRNA不编码任何移动蛋白，这是所有已知植物病毒包括伞病毒的特征。iRNA例如CYVaV也不需要任何辅助病毒用于全身移动通过植物，包括经过测试的柑橘和本生烟(实验室模型植物)。
相比之下，PEMV2与所有伞病毒一样，编码两种移动蛋白：p26(长距离移动)和p27(细胞间移动)(图3，图A)。p26也是稳定化蛋白，可以保护基因组免受无义介导的衰变(NMD)，并且是在单细胞原生质体中在PEMV2的可检测水平积累所需的(Gao,F.和Simon,A.E.(2017),Differential use of 3'CITEs by the subgenomic RNA of Pea enationmosaic virus 2,Virology 510:194-204)。伞病毒是不寻常的病毒，因为它们不编码外壳蛋白或RNA沉默抑制子，而是依赖辅助病毒来实现这些功能。对于PEMV2，辅助病毒是耳突花叶病毒属PEMV1。
PEMV2的多核苷酸序列如下呈现(SEQ ID NO:23)：
Figure BDA0003747217710000361
Figure BDA0003747217710000371
Figure BDA0003747217710000381
PEMV2基因间隔正区(intergenic plus region)的多核苷酸序列(上文粗体下划线部分)如下呈现(SEQ ID NO:24)：
Figure BDA0003747217710000382
PEMV2的重编码移码位点的多核苷酸序列(碱基881至1019；也见图10)如下所示(SEQ ID NO:25)：
gaccgucgucgaccuggccuguggccggcgagcggcggauuuuugguaggggcugugcugccucggcugggggaagacaccagugugcgguuugacaaccugcaccccagcaucgagguaaucaaggcggcuaggcccc
尽管CYVaV不编码p26(或任何其它移动蛋白)，但其在拟南芥原生质体中意外地非常高效地复制，而p26是PEMV2积累所必需的，因为其也具有对抗NMD的能力(参见，例如May等，(2020)“The Multifunctional Long-Distance Movement Protein of Pea EnationMosaic Virus 2Protects Viral and Host Transcripts from Nonsense-MediatedDecay,”mBio 11:300204-20；https://doi.org/10.1128/mBio.00204-20)。事实上，CYVaV异常稳定，比大多数传统病毒稳定得多。CYVaV在小麦胚芽提取物中也产生了惊人的高水平的p81，与来自PEMV2的p94同源基因序列相比多至少50倍(图3，图C)。当CYVaV通过农杆菌渗入法渗入至本生烟的叶片时，其在所渗入的组织中复制，但积累相对较弱(图3，图B，上图；图5，泳道6-8)。人工接种未实现复制。然而，当CYVaV与耳突花叶病毒属柑橘脉突病毒(CVEV)共渗入时，这些细胞中的积累显著提高(图5，泳道3-5；以及图6)。在柑橘中，CYVaV+CVEV的黄化症状(图7，图B)比单独CYVaV表现的症状更明显(图7，图A)。
CYVaV与测试的任何其它柑橘病毒的组合没有协同效应。其它研究表明，CVEV可被用作CYVaV的辅助病毒，以便在树与树之间传播。CVEV可能是导致原始莱姆树中存在CYVaV的原因；然而，CVEV已知是非常热敏感的，因此很可能在炎热的夏天从莱姆树中丢失。
CYVaV偶有移动至上部未接种叶片，并在极高的水平积累，有时通过凝胶上的乙锭染色可见。开始于主要结实过早(bolt)的第9叶片的症状包括发育不良(stunting)、叶片卷曲和花组织变形。大约在同一时间，腋生茎的叶片也开始出现类似症状。这一惊人的结果表明，CYVaV在没有任何编码的移动蛋白的情况下可以进行全身移动，而这是传统植物病毒所不能做到的。实验表明，CYVaV在本生烟内全身移动，并严格限制在韧皮部，仅在伴生细胞和韧皮部薄壁细胞中进行复制。在柑橘中，CYVaV是100％的嫁接传播的，但很难以其它形式传播。
对有症状的叶片组织和根的荧光原位杂交(FISH)证实，CYVaV局限于韧皮部薄壁细胞、伴生细胞和筛分子(图8，图A-G)，其具有韧皮部限制的病毒特征。CYVaV在有症状的组织的叶柄中的水平极高，并且有时在总RNA的乙锭染色的凝胶中可见。虽然本生烟中的症状更严重，但已发现CYVaV在所有测试的柑橘品种中几乎没有症状。事实上，在柑橘病毒的指示树的香木缘上发现了最严重的症状，并且其由遍及树散布的叶子上的非常小的金色斑点组成。
CYVaV的韧皮部限制的移动解释了CYVaV为什么是容易嫁接传播的，但不容易通过任何方式传播。如上所述，CYVaV缺乏任何编码的移动蛋白。相反，CYVaV利用宿主植物内源性移动蛋白韧皮部蛋白2(PP2)，以及在伴生细胞、韧皮部薄壁细胞和筛分子之间的转运途径。此外，由于宿主范围被认为涉及病毒移动蛋白和宿主胞间连丝相关蛋白之间的兼容相互作用，所以由于PP2是非常保守的宿主内源性移动蛋白，相信CYVaV能够利用PP2在许多其它的木本和非木本宿主植物的韧皮部运输通过。因此，CYVaV提供了用于检测RNA移动(例如，在本生菌和/或柑橘中)的特殊的模型系统，以及用于多种应用的载体。实验证实，CYVaV在宿主植物内全身移动，且局限于韧皮部，并且易于嫁接传播，但不易在植物间以其它形式传播。
在番茄、黄瓜和甜瓜中也观察到CYVaV的全身感染。参照图28，图A显示了未感染的黄瓜植物(模拟)和在两个月前通过农杆菌渗入法感染了CYVaV的植物，两者在相同的条件下生长。感染的植物表现出CYVaV感染的效应，表明CYVaV的全身移动和黄瓜植物的全身感染。在被感染的植物中，节间的茎距大大减少，以至于多个花簇中。这种感染的迹象也在本生烟中观察到，且表现出一些快速生长的植物感染CYVaV的特征。图28图B显示了未感染的番茄植物和在大约53天前感染了CYVaV的番茄植物，两株植物在相同的条件下生长。将感染了CYVaV的本生烟植物的汁液注入番茄植物的脉管系统，以感染番茄植物。被感染的植物没有生长，表明番茄植物的CYVaV全身移动和全身感染。本文提及的本生烟、黄瓜、番茄和其它植物种类的感染，以及CYVaV和iRNA亲缘序列的自然存在，表明iRNA具有广泛的宿主范围。由于PP2在极其大量植物物种中被发现，本文所述的CYVaV结合韧皮部蛋白2(PP2)的能力也表明广泛的宿主范围，并可提供了CYVaV和其它iRNA全身移动通过许多植物类型的方法。
由于不同品种间无性生殖和有性生殖的不相容性，柑橘树有复杂的生殖生物学。再加上幼年期很长，可以超过6年，传统育种方法的遗传改良是复杂和耗时的。本公开通过提供工程化以包含治疗性siRNA插入物的基于iRNA(例如，基于CYVaV)的载体，从而克服了这些问题。iRNA例如CYVaV在传染剂中是独一无二的，因为它们编码聚合酶，但仍像类病毒(小的环状非编码RNA，其也使用PP2作为移动蛋白)一样移动，因此能够在柑橘以外的植物中运输。因此，除了柑橘，本公开的基于iRNA的载体可被开发用于其它木本植物(如树木和豆科植物)，特别是橄榄树和葡萄藤。
根据本公开的实施方式，CYVaV被用于开发将小RNA和蛋白递送至柑橘幼苗和本生烟中的载体。用于CYVaV载体开发的程序与本发明人用于工程化β香石竹斑驳病毒TCV以产生小RNA的程序类似(见Aguado,L.C.等(2017),RNase III nucleases from diversekingdoms serve as antiviral effectors,Nature 547:114-117)。确定了添加一个、两个、三个或更多个小RNA插入物的示例性和有利的位点，所述小RNA插入物被设计为由RNaseIII型外切酶切除。示例性位点包括位置2250、2301、2319、2330、2336、2083和2375。小发夹直接从靶向沉默GFP的本生烟植物16C中表达的GFP的基因组中表达。
根据公开的实施方式，本文公开的iRNA载体可以包含具有各种功能性的小RNA插入物，包括：靶向重要真菌mRNA的小RNA；以靶向昆虫以使其死亡、不育或其它功能丧失的小RNA；在宿主植物中靶向基因表达的小RNA；靶向植物病原细菌的小RNA；靶向CTV的小RNA；以及靶向CVEV(因为这种病毒与CYVaV一起导致增强的黄脉症状)或其它病毒病原体的小RNA。此外，所公开的载体可包括其它本领域已知的小RNA和/或治疗剂。因此，韧皮部限制的基于iRNA的载体可以被工程化以产生具有抗细菌和/或抗真菌和/或抗昆虫和/或抗病毒特性的小RNA，与目前的方法相比，这提供了更好的治疗和管理策略。
根据本领域技术人员众所周知的柑橘接种程序，例如在柑橘无性系保护计划(CCPP)下常规开发和使用的程序，通过切入韧皮部并沉淀载体作为RNA或通过农杆菌渗入法，或在在CVEV或另一病毒的衣壳蛋白中壳体化之后，CYVaV载体可人工用于感染的或未感染的树木。这些程序常规用于接种CTV和柑橘的其它嫁接可传播的病原体。由于CYVaV不编码衣壳蛋白，因此不会制备病毒粒子，因此CYVaV不可能在树与树间自然传播。当CYVaV被包装在CVEV或其它病毒的衣壳蛋白中时，不存在CVEV或其它病毒的其它成分。
植物可以通过农杆菌渗入法感染基于iRNA的载体，而不切割到韧皮部上，例如通过农杆菌渗入法进入植物的叶片。基于iRNA的载体不仅仅是复制子，一旦注入植物细胞，就预期不会离开植物细胞。农杆菌渗入法将基于iRNA的载体渗入到例如植物的叶片的目标，不是在农杆菌渗入位点附近在植物细胞中建立基于iRNA的载体，而是至少有一些基于iRNA的载体达到植物的脉管系统，然后全身移动通过植物。通常情况下，当通过农杆菌渗入法渗入植物的叶片时，只有一部分农杆菌渗入法渗入的基于iRNA的载体将到达植物的脉管系统，并有效地感染植物。在对农杆菌渗入法抵抗的植物的情况中，可以先在对农杆菌渗入法更易受影响的相关物种中进行农杆菌渗入法，然后将更易受影响的物种嫁接至靶物种上。例如，柠檬(Citrus limon)可能比各种种类的柑橘树物种更容易受农杆菌渗入法的影响。可选地或额外地，可以对农杆菌渗入法抵抗的物种进行预处理，使其对农杆菌渗入法更易受影响。例如，如在Jia和Wang(2014)中所描述的，可以通过首先将意欲进行农杆菌渗入法的位点用悬浮于水中的生长活跃的柑橘黄单胞菌柑橘亚种(Xanthomonas citrisubsp.citri)(Xcc)的培养物接种，以促进农杆菌渗入柑橘植物。Xcc促进的农杆菌渗入的柑橘叶片：用于在柑橘叶片中转基因的快速功能分析的工具。Plant Cell Rep.33:1993-2001。
当直接感染植物的脉管系统时，例如通过接触韧皮部的切口，基于iRNA的载体可被另一类型的病毒的衣壳蛋白稳定。在一些示例中，基于iRNA的载体被包裹有CVEV的外壳蛋白，其被认为是能够在本质上包装CYVaV的辅助病毒。在一些示例中，一个或多个基于iRNA的载体分子被包裹在与CYVaV不是天然相关的自组装衣壳蛋白中。例如，Cadena-Nava等(2012)中描述了来自豇豆褪绿斑纹病毒的衣壳蛋白与不同大小的RNA分子组装的方法。病毒衣壳蛋白与不同大小的RNA分子的自组装：需要特定的高蛋白/RNA质量比。J.Virol.86:3318-3326。
一旦第一植物已经感染了基于iRNA的载体，另一植物可以通过以下方法感染：将第一植物的一部分嫁接至另一植物，或将来自第一植物的汁液注入另一植物，或通过寄生菟丝子植物连接两个植物的韧皮部。嫁接尤其允许将基于iRNA的载体长距离和从第一植物切下嫁接物至将嫁接物添加至第二植物的长时间段(例如，一天或更长时间)的转移。在一些示例中，基于iRNA的载体通过从一品种或物种的植物中获得的汁液，并注入至另一不同品种或物种的植物的脉管系统中，而在品种或物种之间转移。在一些示例中，基于iRNA的载体通过来自一品种或物种的植物获得的嫁接物并且嫁接至另一不同的品种或物种的植物的方式在品种或物种之间转移。
感染了工程化的基于iRNA的载体的第一植物(在某些情况下任选地称为母亲树)可用于生产嫁接物，以将基于iRNA的载体传输给其它植物，以预防或治疗已经存在于其它植物中的感染。第一植物也可用来生产幼苗(例如，通过从第一树木嫁接到第一植物或另一植物的幼苗)，这些幼苗被用来繁殖具有基于iRNA的载体的植物。一旦存在于幼苗中，基于iRNA的载体在植物生长过程中进行复制和移动通过植物。
如上所述，CYVaV只有两个ORF：编码复制所需蛋白p21的5'近端ORF；以及p21的移框延伸产物(extension)，其中核糖体编码元件允许核糖体继续翻译，使p21延伸产生p81，即RNA依赖的RNA聚合酶。这两个ORF的结构类似于番茄丛矮病毒科和黄症病毒科中的病毒相似的ORF结构。然而，这些科中以及实际上所有已知的植物RNA病毒中的所有病毒都编码移动蛋白或与编码移动蛋白的二级病毒相关。编码移动蛋白的能力，或与编码移动蛋白的第二病毒相关的能力，长期以来被认为是细胞间移动的必要条件，也被认为是通过韧皮部建立全身感染的必要条件。因此，没有人提出使用iRNA作为载体，并且因为任何编码的移动蛋白的缺乏以及不能独立移动的观念，事实上，iRNA分子以前被认为不适合用作独立载体。
因此，尽管不编码或依赖任何外源移动蛋白，iRNA遍及植物韧皮部独立的全身移动的能力是相当令人惊讶的。本公开的基于CYVaV的载体明确且反复地证明了(通过荧光原位杂交和其它技术)在不借助任何辅助病毒的情况下的全身移动。幼嫩的、未渗入的(全身)组织在本生烟上表现出高度明显的症状，包括叶瘿和根瘿。所公开的载体利用内源性宿主移动蛋白进行移动。关于这一方面，已知运输宿主RNA至筛分子的宿主韧皮部蛋白(25kDa韧皮部蛋白2(PP2)和/或26kDa黄瓜韧皮部蛋白2样)(见Balachandran,S.等(1997),Phloemsap proteins from Cucurbita maxima and Ricinus communis have the capacity totraffic cell to cell through plasmodesmata,PNAS 94(25):14150-14155；Gómez,G.和Pallás,V.(2004),A long-distance translocatable phloem protein from cucumberforms a ribonucleoprotein complex in vivo with Hop stunt viroid RNA,J Virol78(18):10104-10110))有可能使用体外RNA印迹显示与CYVaV的相互作用，以及从体内感染的韧皮部汁液RNA下拉。因此，由于已知的植物病毒编码(或依赖)移动蛋白，iRNA在结构和功能上与传统的植物病毒有很大的不同。
除CYVaV外，其它大小相似并且编码聚合酶的RNA也可用于开发结构相似的基于iRNA的载体(见，例如Chin,L.S.等(1993).The beet western yellows virus ST9-associated RNA shares structural and nucleotide sequence homology withTombusviruses.Virology 192(2):473-482；Passmore,B.K.等(1993).Beet westernyellows virus-associated RNA:an independently replicating RNA that stimulatesvirus accumulation.PNAS 90(31):10168-10172)。如上所述，编码蛋白p21和p81的其它iRNA亲缘序列的iRNA(如iRNA r1、iRNA r2和iRNA r3，分别在仙人掌、无花果树和埃塞俄比亚玉米中发现)(图4)可被用于载体开发。
虽然CYVaV存在于GenBank数据库(GenBank:JX101610)，但iRNA不属于任何已知的病毒分类，因为它们缺乏编码移动蛋白的顺反子。iRNA在宿主内也不依赖于辅助病毒进行全身移动。此外，iRNA缺乏编码外壳蛋白的顺反子。iRNA也不同于类病毒，尽管两者都能在没有编码的移动蛋白的情况下进行全身移动。类病毒是没有编码能力的环状单链RNA，其利用宿主DNA依赖的RNA聚合酶在细胞核或叶绿体中进行复制。绝大多数通常包括约300至400个核苷酸(nt)的微小类病毒基因组是类病毒不寻常的存在所必需的。此外，类病毒不编码任何蛋白，这使它们不适合用作载体。相反，iRNA编码它们自身的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)。
iRNA可分为两类：第一类的特征是产生类似于伞病毒的RdRp和靠近3'端的RNA结构的移码要求。第二类的特征是生成类似于番茄丛矮病毒的RdRp和3'RNA结构的读码要求。CYVaV是第一类的成员，其具有类似于伞病毒的特性，包括移码重编码位点和3'端类似结构，以及5'端类似序列。第二类的iRNA的成员总是与辅助病毒一起被发现。
与传统的病毒载体相比，iRNA提供了许多好处。例如，iRNA相对较小，这使得它们更容易在结构和功能上进行定位和进行遗传操作。相比之下，像CTV这样的病毒要大8倍，这使得它们作为载体使用更加繁琐。iRNA可以复制和积累到出乎意料的高水平(例如，通过凝胶上的乙锭染色可见和4％的RNAseq读数)，这对于载体将足够量的治疗剂递送至靶植物的能力至关重要。此外，尽管iRNA不编码外壳蛋白或沉默抑制子，但其比许多病毒更稳定(图13)，这使得其在宿主植物中有更长的寿命，从而在更长的时间内提供益处。
iRNA也局限于宿主的韧皮部，这对于靶向寄生在韧皮部的病原体，或其携带者以韧皮部为食的病原体，或其症状积累在韧皮部的病原体尤其有用，因为有效载荷将针对最需要它的地方。通过独立于移动蛋白(其与特定宿主蛋白的相互作用是决定宿主范围的主要因素)的移动，iRNA能够在更广泛的宿主范围内转运，从而增加单一载体平台的适用性。考虑到外壳蛋白表达的缺乏和辅助病毒对全身植物感染的可分配性(dispensability)，iRNA不能作为从植物至植物的载体，而必须通过嫁接直接引入韧皮部。外壳蛋白的缺乏阻止了感染性颗粒的形成，从而无意地转化为野生型传染剂进入环境。因为管理人员经常担心引入的生物剂可能不受控制地传播，这对简化管理审批尤其有益。
iRNA在柑橘中实际上也是良性的，不像CTV这样的病毒，其分离株可以是高致病性的。使用普通病毒作为载体，如CTV，执行排除重复感染的风险，其中先前感染病毒和/或暴露于病毒的树木不能另外被用作载体的同样病毒感染(例如，美国大多数柑橘树感染CTV)。因此，避免排除重复感染，至少需要额外的过程，这使其更昂贵和繁琐。
本公开还提供了新的治疗性的、预防性的或性状增强的插入物，所述插入物被设计至iRNA载体中。提供了各种插入物，包括靶向特定病原体、昆虫或病候(manifestationof the disease)的插入物。可选择地或额外地，提供加强或改善植物健康和/或增强植物所需特性的插入物。
所公开的传染剂能够遍及宿主植物积累并全身移动，因此可以在可观的时间段内遍及宿主递送治疗剂。因此，所公开的剂的特性非常有利于治疗多种特定疾病。使用包括RNA或DNA的传染剂具有能够编码在感染的细胞中被表达的治疗性蛋白或肽，和/或，通过工程化传染剂以包含其遗传物质的特定序列或可裂解的部分以用作基于RNA的治疗剂的额外优势。
具有抗植物病原体的抗菌特性的产品可以采取多种形式，并通过核糖体(防御素和小细菌素)或非核糖体合成(peptaibol、环肽和假肽)产生。最著名的是超过900阳离子抗菌肽(CAP)，如乳铁蛋白或防御素，其通常小于50个氨基酸，且其抗菌特性在本领域中众所周知。CAP是非特异性的剂，其通常靶向细胞壁，据报道其对细菌和真菌有作用。以被设计以表达防御素的插入物工程化的CTV已在佛罗里达州获得USDA的批准用于发行，但其广泛的功效尚不清楚。此外，用于载体的CTV的分离株使其不适合在一些地区(如加利福尼亚)用于树木生长。
靶向病毒病原体的RNA疗法也在植物中广泛开发。这些疗法使用来自植物基因组产生的非编码小干扰RNA(siRNA)，因此包括宿主的基因修饰。除了一些种植者和消费者对基因修饰的柑橘树的负面观点，产生基因修饰的树木的时间长度以几十年计，且因品种发展了几十年最终可能没有相同的属性(材质/颜色/味道)，因此，除了开发非常昂贵和潜在的对水果质量的影响外，其并不是目前对时间敏感的农业疾病的解决方案。
siRNA可用于靶向植物中的细菌，例如柑橘黄龙病菌亚洲种(CLas)细菌。植物病原细菌可以使用植物中产生的、由细菌吸收的并直接在细菌体内重编程基因表达的siRNA进行靶向，，如例如由Singla-Rastogi等(2019)，Plant small RNA species direct genesilencing in pathogenic bacteria as well as disease protection中描述的，该预印本于2019年12月3日发布在bioRxiv，https://www.biorxiv.org/content/10.1101/863902v1。在一些实施中，提供了CYVaV或另一基于iRNA的载体，其包含靶向细菌(如柑橘黄龙病菌亚洲种)并使所述细菌非致病性的siRNA发夹。例如，由基于iRNA的载体提供给植物的siRNA发夹可被植物中的CLas或另一细菌吸收，并控制细菌中的基因表达，从而杀死细菌和/或抑制细菌种群的增加。与可能具有例如大约500个碱基的抗生酶相比，发夹形式的siRNA要小得多(<60个碱基)，而且在基于iRNA的载体中更可能是稳定的。
最近，高度靶向的抗菌酶已经被开发出来用于动物和人类，作为目前抗生素的替代品。这些酶是由噬菌体裂解蛋白工程化而成的，并且被称为抗生酶(enzybiotics)。与亲本噬菌体蛋白一样，抗生酶可以在接触时裂解细菌细胞壁，但其设计用于革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的外部。抗生酶被工程化为只裂解靶细菌，而不影响微生物群系的其它成员。在一些实施中，提供了包括非编码RNA插入物的iRNA载体，该插入物可以像抗生酶一样被翻译成抗菌蛋白。
在一些实施中，提供了iRNA载体，其包括干扰待解决的昆虫载体功能性的RNA插入物。昆虫具有类似于植物的RNA沉默系统；被昆虫摄取的小RNA被吸收进入细胞，并靶向关键的mRNA进行降解或阻断昆虫内的翻译。在一些实施方式中，提供了能够使昆虫载体的关键生殖功能沉默的靶插入物，从而导致昆虫不孕。特别相关的是韧皮部食用型昆虫，其传播韧皮部限制的病原体，其中在韧皮部限制的载体中的非编码RNA插入物很容易被食用型昆虫所吸收。
在一些实施中，提供了iRNA载体，其包括将植物应答靶向病原体的非编码RNA插入物。在某些情况下，通过昆虫载体沉积在树木中的细菌不会直接破坏树木。然而，宿主树木为了隔离细菌，在它们的韧皮部产生过多的胼胝质，这最终会限制光合物质的流动，并杀死树木。因此，RNA插入物沉默和/或抑制这种胼胝质的产生。
在一些实施中，提供了iRNA载体，其包括靶向病毒，例如CTV的非编码的RNA插入物。在一些实施中，提供了iRNA载体，其包括非编码RNA插入物，其被病原细菌或真菌吸收，使得可获得非编码RNA以沉默病原体中的关键功能，其可以终止或减少该病原体对宿主的毒性。
在一些实施中，基于iRNA的载体(例如，包括非编码RNA插入物的iRNA载体)，被嫁接至根茎或幼苗中，以提供对病原体的保护或使该根茎或幼苗更健壮。例如，在酸橙根茎上种植柑橘树可以是有利的，因为生长在酸橙根茎上的树木，除了其它方面，比生长在许多其它根茎上的树木受HLB的影响更小。酸橙根茎也能适应广泛的生长条件。然而，酸橙根茎也高度易受CTV的影响，并且许多柑橘种植者在CTV爆发后放弃了酸橙根茎。在酸橙根茎中引入适应于靶向CTV的基于iRNA的载体，从而获得对CTV和HLB都具有耐受性的根茎。基于iRNA的载体可以被引入至酸橙根茎中，例如，通过将含有基于iRNA的载体的接穗嫁接至根茎上，或通过将含有基于iRNA的载体的植物的一部分嫁接至根茎或嫁接至嫁接于根茎上的接穗。在一些示例中，产生具有酸橙根茎、酸橙或另一柑橘物种的接穗和含有靶向CTV的异源元件的基于iRNA的载体的幼苗。在一些实施中，异源元件是发夹或单链序列，其包括与在一个或多个CTV菌株中保守的序列互补的序列(尽管不一定完全相同)。
在一些实施中，稳定的RNA载体的亲本结构(例如RNA病毒)连同加入异源元件一起修饰。在一些实施方式中，所述修饰可包括结构上稳定化修饰和/或结构上不稳定化修饰(例如，将亲本结构中的G:U对转换为G:C对)。在一些示例中，所述修饰可包括截断亲本结构的发夹。在一些示例中，所述修饰可包括在亲本结构中插入支架。这些示例中的一个或多个可组合在一起。不受理论的限制，相比缺失异源元件的时候，添加异源元件的时候，这些修饰产生的结构更适于感染周期中的一个或多个过程。因此，具有完整异源元件的RNA载体比任何缺失异源元件的拷贝以更大的数量复制。虽然本文描述的是关于用于治疗植物的基于iRNA的载体，但可以预期的是这些技术可应用于其它RNA载体，并用于治疗植物或其它生物体，如动物。
本公开的另外特征和特点将通过参考下列另外的示例和讨论进一步理解，这些示例和讨论是通过进一步说明而提供的，而非用于限制本公开。
CYVaV结构。CYVaV的全长结构是由SHAPE结构探测(probing)和与在仙人掌、无花果和玉米中的CYVaV亲缘序列的系统发生比较来确定的(图9)。重编码位点(见图10)和ISS样(I型结构)3'CITE(见图11)被确定，连同容纳插入物的区域，例如,以双线加框区域显示，并就插入物的示例性位置进行了进一步的详细讨论。
CYVaV的基因组结构与其它RNA分子尤其是PEMV2有一些相似性(图3，图A)。然而，伞病毒PEMV2也具有编码参与移动的蛋白p26和p27的ORF。渗入的本生烟叶片和全身叶片中的CYVaV正(+)链的水平如图3，图B所示。在全长CYVaV和PEMV2的小麦胚芽提取物中的通过体外移码合成的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp)的水平如图3，图C所示。需注意的是，与CYVaV产生的p81聚合酶相比，PEMV2产生的p94的水平存在显著差异。CYVaV的移码位点是病毒学中已知最强的，并被认为是其异常高积累的原因。
CYVaV被包装在CVEV的病毒粒子中。CYVaV或CVEV或CYVaV+CVEV渗入至本生烟的叶片中。将CYVaV包装在CVEV的病毒粒子中，并且一周后分离出病毒粒子，并对包装后的RNA进行PCR分析(见图5和图6)。在推断的辅助病毒CVEV的存在下，CYVaV的积累显著增加。rRNA加载对照如下文所示。P14沉默抑制子在所有叶片中共渗入。在具有CYVaV+CVEV的柑橘叶片中，黄化症状略严重(图7，图B)。
CYVaV是韧皮部限制的。荧光原位杂交(FISH)成像清晰地检测到CYVaV的正链，其完全局限于筛分子、伴生细胞和韧皮部薄壁细胞(图8)。
CYVaV不编码沉默抑制子。本生烟16c植物通过农杆菌渗入法渗入表达GFP的构建体(其在这些植物中是沉默的)，以及表达CYVaV p21或p81的构建体、或表达已知的沉默抑制子p19(来自TBSV)或p38(来自TCV)的构建体(图13，图A)。只有p19和p38抑制GFP的沉默，允许绿色荧光表达(图13，图B)。采用GFP寡核苷酸探测的RNA印迹显示，在p21或p81存在的情况下，GFP RNA仍然沉默(图13，图C)。
拟南芥原生质体中CYVaV的复制。产生了CYVaV的感染性克隆。将野生型RNA转录物(CYVaV)或在重编码滑动位点包含突变(该突变位点消除了RdRp的合成，因此无法复制)的转录物(CYVaV-fsm)接种至拟南芥原生质体上。提取RNA，30小时后进行RNA印迹检测。值得注意的是，接种后的CYVaV-fsm转录物在30小时的时候仍然存在于原生质体中(而在传统病毒中，它们在4小时后将无法检测到)。
CYVaV在本生烟中的复制。通过RNA印迹测定了经渗入的本生烟的叶片中积累的CYVaV的水平(图15，图A)。用CYVaV渗入的植物偶尔会出现全身症状(图15，图B；还参见图16)。这些植物中积累了高水平的CYVaV。测定了全身感染的植物的单个叶片中CYVaV的水平(图15，图C)。叶片4和叶片5通过农杆菌渗入法渗入CYVaV。需注意的是，CYVaV在最幼嫩的叶片中的大量积累。
全身感染CYVaV的本生烟的症状。叶片4和叶片5通过农杆菌渗入法渗入了CYVaV。全身感染的植物的第一迹象是“杯状(cupped)”叶片(图16)，这几乎总是叶片9。在接下来的几周，叶瘿出现在植物的顶端分生组织和每个节。全身感染的植物的根瘿也含有大量的CYVaV，这是通过对植物的RNA印迹证明的。
CYVaV显示了不寻常的宿主范围。将全身感染的本生烟植物的汁液注入番茄的叶柄(图17)。4株植物中的1株表现出很强的症状，并且PCR检测为CYVaV阳性。显示的植物是以同龄植物在感染后的53天时。
CYVaV结合从黄瓜韧皮部提取的高丰富蛋白。RNA-蛋白质印迹显示，标记的全长CYVaV与显著的蛋白结合(图18)。蛋白经SDS凝胶电泳复性。该蛋白被认为是已知的、高度保守的RNA结合蛋白，其包含已知伴随来自伴生细胞中的RNA进入黄瓜韧皮部中的筛分子内的RRM基序。电泳后蛋白仍保持变性时，未见结合。
参照图30，CYVaV与韧皮部蛋白2(PP2)结合。图A、B和C涉及参与模拟(未感染的)黄瓜植物和两个感染CYVaV的黄瓜植物的实验。图A中，收集未感染的(模拟)和两株CYVaV感染的(CYVaV 1和2)植物的韧皮部渗出物，与甲醛交联(输入)，然后在使用和不使用连接的5′-生物素化的CYVaV探针(探针和无探针)的情况下，使用链霉亲和素珠进行下拉试验。用考马斯蓝对SDS PAGE凝胶进行染色。如三个输入泳道所示，对汁液中存在的所有蛋白的分析包括分子量为约25kDa的大量蛋白，这与常见的PP2的分子量一致。在中间三条泳道中，基本上没有发现蛋白，这说明PP2没有与链霉亲和素珠结合。在右边三条泳道中，又发现了大量分子量为约25kDa的蛋白，这表明PP2与连接至探针(其连接在珠上)上的CYVaV结合，然后从珠上被冲刷下来。图B中，来自A的右边三条泳道的样品金鑫电泳，然后转移至硝化纤维膜上，并使用针对黄瓜PP2(CsPP2)的多克隆抗体进行蛋白质印迹分析(上图)。图B下图为丽春红S染色的膜。图C中，将RNase处理前的下拉试验中回收的总RNA进行RT-PCR，以验证CYVaV的存在。另外的对照为：(+)，感染CYVaV的本生烟的RNA；和(-)，未感染的黄瓜植物的RNA。试验指出，CYVaV与黄瓜植物的汁液中的CsPP2结合。图30图D、E和F显示了用CYVaV或PEMV2感染的本生烟进行的类似试验。对于PEMV2下拉，将PEMV2特异性的探针连接至珠上。该试验中的PEMV2作为进一步对照。结果表明，CYVaV通过PEMV2与本生烟植物汁液中的PP2结合，其不与本生烟植物汁液中的PP2结合。
PP2被认为参与了类病毒的移动，但没有报道其参与任何病毒的包装或移动。同样地，在上述结果中，PP2不与植物汁液中的PEMV2结合。不受理论的限制，我们认为与植物汁液中的CYVaV结合的PP2也可能负责CYVaV的移动。尽管早期关于CYVaV的报道表明，没有提供移动蛋白的辅助病毒(CVEV)的情况下，CYVaV就不能在植物内移动，但是我们已经证明，在没有辅助病毒的情况下，CYVaV可以在植物内全身移动。然而，事实上，本质上可能仍然需要辅助病毒来进行包装，以允许CYVaV离开宿主植物的韧皮部并运行至另一植物。在与上文描述相似的其它实验中，CYVaV似乎与番茄和甜瓜植物汁液中的PP2结合。PP2基本上存在于所有植物中，并可允许基于iRNA的载体进入并全身感染广泛的宿主植物。
CYVaV可以使用TEV IRES从其3'UTR表达额外的蛋白。确定了烟草蚀纹病毒(TEV)内部核糖体进入位点(IRES)下游三个独立的纳米荧光素酶插入物的位置(图19)。对这三个构建体的小麦胚芽提取物中的体外翻译进行了评估。纳米荧光素酶蛋白(Nluc)的位置位于凝胶底部附近。研究了纳米荧光素酶在原生质体中的体内表达(图19，图C)。(A)中所示的构建体的全长RNA转录物被转化至原生质体中。18小时后，提取总蛋白，并用荧光仪测量纳米荧光素酶活性。
评估了位置2250、2301和2319处的稳定发夹插入物的示例性位置。每个插入物的位置都位于上述示例性区域内(见图9)。对CYVaV-wt和位置2250处含有不同量的序列的CYVaV VIGS载体的T7转录物进行了小麦胚芽提取物体外翻译试验(见图20)。例如，构建体sfPDS60在植物中表现出良好的全身移动。本公开对CYVaV-wt、以及2301和2319位上含有不同数量序列的CYVaV VIGS载体的T7转录物进行了小麦胚芽提取物体外翻译实验(见图21)。从CYVaV wt和CYVaV VIGS载体、CYVaV-GDD阴性对照感染的拟南芥原生质体分离的总RNA进行RNA印迹分析(图20，图D)。对从感染CYVaV wt和CYVaV VIGS载体、CYVaV-GDD阴性对照的拟南芥原生质体分离的总RNA进行RNA印迹分析(图21，图D)。构建体CY2250sfPDS60、CY2301PDS60、CY2301sfPDS60、CY2319sfPDS60(分别包括位置2250、2301、2319处的插入物)均表现出出色带有插入的的全身移动。此外，构建体CY2331PDS60(包括位置2331的插入物)也显示了遍及宿主的全身移动的能力。进一步的构建体CY2083TAAPDS60包含在位置2083的插入物，该位置在RdRp ORF中(前面是插入的终止密码子)。
从全身叶片收集的载体插入区域(以下下划线，并且如图20图G和图21图G所示)的序列呈现如下：
taggcctcgacacgggaaggtagctgtcccggcactgggttgcacatattccgtgccgacgccac(SEQID NO:26)
ccggcctcgacacgggaaggtagctattccgtgccgacgccgt(SEQ ID NO:27)
基于iRNA的载体平台
在一个实施方式中，提供了基于iRNA的载体，其用于治疗柑橘行业中由CLas细菌(HLB)引起的疾病。利用CYVaV分离株作为载体，以靶向细菌和将细菌运至树木的木虱虫。如上文所讨论的，CYVaV限制于韧皮部，在那里其复制和积累至极高的水平，这可与最高的植物病毒相当。此外，其相对较小的尺寸使其非常容易进行基因工程化。因此，考虑CYVaV的结构和生物学有助于开发这种作为韧皮部运输的载体和模型系统的新型传染剂。
根据SHAPE RNA结构图谱确定了CYVaV的3'UTR的结构(图9)。此外，根据生化试验，以及它们的序列和/或结构和位置的系统发生保守性(与伞病毒)，确定了许多复制和翻译元件(图19，图A)。还确定了作为帽独立翻译增强子(3'CITE)的I型元件。也确定了一系列远距离吻式发夹相互作用(long-distance kissing-loop interactions)(双箭头)，其被认为是在沉默抑制子不存在的情况下参与稳定化RNA和积累。基于该结构，许多区域被确定为不应该干扰周围结构的序列插入的适合位置。
已经确定了3'UTR和RdRp ORF中可以容纳RNA发夹(例如用于产生摄食型昆虫的siRNA)的可能插入物的某些位点，可以容纳报告元件ORF并且仍然允许在农杆菌渗入法渗入的本生烟中工程化的CYVaV的复制的位点，以及在体外触发报告蛋白高水平翻译的位点。包含添加的ORF和siRNA的工程化CYVaV被引入至存储宿主树中，然后其片段可以通过嫁接直接引入至田间树木中。考虑到CYVaV的罕见性(至今为止，其只被Weathers在20世纪50年代在四棵莱姆树中发现)，几乎没有排除重复感染的风险。
确定了各种插入位置，其中载体的复制或翻译特性没有显著减少或消除。没有进一步研究对这些特性(可能是由于干扰了CYVaV载体的RNA结构或其它重要方面)产生不利影响的插入位置。在位置2250、2301、2319和2331确定基于CYVaV的载体上的4个示例性插入位点。可选地或额外地，插入物可以位于位置2330、2336和/或2375位。在这些位置中成功地部署了50nt发夹插入物，而不干扰体外翻译和在原生质体中的复制，且CYVaV能够在本生烟中全身移动。
虽然CYVaV没有额外的ORF，但是大约500nt的基因组(g)RNA和亚基因组(sg)RNA都是对正链和负链使用探针可以检测到。对应该包含sgRNA启动子的区域的研究显示了，与伞病毒高度保守的sgRNA启动子和香石竹斑驳病毒属(carmovirus)TCV的极小的但高度功能化的sgRNA启动子具有显著相似性的元件。此外，仅表达RdRp且与番茄丛矮病毒相关的类似RNA都能产生类似大小的亚基因组RNA，并可简化多肽和蛋白的表达。
为了确定插入物在CYVaV中sgRNA启动子下游的哪些位置是耐受的，对CYVaV的3'UTR中存在关键元件的位置进行了评估，以便在插入异源序列时避免这种元件。如上文所述，确定了用于CYVaV的3'CITE，以及几个另外的3'近端发夹，这些发夹在伞病毒中高度保守并已知对复制和翻译至关重要。利用缺失/点突变，研究了推定的sgRNA启动子下游和CAS(～120nt)上游的序列的既不影响在本生烟原生质体中的积累，也不影响在本生烟中的全身移动的区域。本发明人先前使用了类似的策略来确定TCV的可以容纳RNase III型酶靶向的发夹的3'UTR中的区域(Aguado,L.C.等(2017).RNase III nucleases from diversekingdoms serve as antiviral effectors.Nature 547:114-117)。
在确定容纳缺失/突变的适合区域(例如，不涉及关键功能的区域)后，将不同长度的异源序列插入其中，以评估具有扩展的3'UTR的CYVaV功能性。这种研究有助于确定最大插入长度，以确保这种插入物通过基于CYVaV的载体被耐受，同时仍积累至稳定水平并参与全身移动。相信，基于CYVaV的载体可能够容纳大小达至2kb的插入物。关于这一方面，最接近的相关病毒(木瓜伞样病毒，其与CYVaV一样，只编码复制酶相关蛋白和RdRp)为大到1到2kb，所有额外的序列长度都扩展了它们的3'UTR(Quito-Avila,D.F.等(2015),Detectionand partial genome sequence of a new umbra-like virus of papaya discovered inEcuador.Eur J Plant Pathol 143:199-204)。对各种大小的序列片段进行了评估，从50nt(用于产生小RNA的插入的发夹的大小)开始，达至600nt(抗生酶的ORF大小)。初始的小RNA片段包含用于八氢番茄红素去饱和酶(phytoene desaturase)敲除的报告基因，其使组织变白。较长尺寸的片段包括纳米荧光素酶和GFP ORF，其也可以用作检测表达水平的报告基因。在包含野生型(WT)sgRNA启动子和增强型sgRNA启动子的构建体中进行插入。
用于稳定插入物的碱基的锁定和对接序列。参见图24图A，显示了锁定和对接序列的基本结构。与其对接序列对接的四环GNRA序列(如GAAA)产生了极其稳定的结构。如图24图A中所示的序列如下呈现:
gaaa(SEQ ID NO:28)
gauauggau(SEQ ID NO:29)
guccuaaguc(SEQ ID NO:30)
caggggaaacuuug(SEQ ID NO:31)
提供了包含对接的四环的支架作为结晶学支架的用途(图24图B)。图24图B所示的序列如下所示:
cauuagcuaaggaugaaagucuaugcuaaug(SEQ ID NO:32)
图24图C显示了根据所公开的实施方式的锁定和对接结构。插入物(发夹或非发夹序列)可以添加至识别的另外的插入位置的限制性位点。圈出的碱基是用于四环的对接序列。图24图C所示的序列如下呈现：
gcaccuaaggcgucagggucuagacccugcucaggggaaacuuugucgcuauggugc(SEQ ID NO:33)
尽管存在发夹或其它插入物，但可以将锁定和对接元件插入至iRNA中以稳定所获得的载体。图29显示了锁定和对接结构的其它示例。将显示的两个锁定和对接结构L&D1(SEQ ID NO:42)和L&D2(SEQ ID NO:43)中的每个分别插入CYVaV中的位置2301，以制备两个基于CYVaV的载体的示例，其中一个具有L&D1，另一个具有L&D2。如图29图A所示的序列如下呈现：
gcgauauggauucagggacuagucccugcucaggggaaacuuuguguccuaagucgc(SEQ ID NO:42)
gcgauauggaucaggacuaguccugucacccucacuucgguguccaggggaaacuuugugggugaguccuaagucgc(SEQ ID NO:43)
通过用CYVaV-L&D1和CYVaV-L&d2全身感染本生烟植物，验证了这两种各自具有锁定和对接结构的基于CYVaV的载体的复制、移动和稳定性。在其它示例中，L&D1或L&D2可被插入在位置2250、2319、2330、2336和2375(见图31)。
术语“锁定和对接结构”用来表示具有适合添加一个或多个插入物的高度稳定的锁定的或可锁定的部分和对接部分的结构。在所示的示例中，高度稳定的部分是通过四环GNRA序列(其中N是A、C、G或U；R是A或G)例如GAAA和四环对接序列(可替选地，称为四环锁定序列)提供的。在使用过程中，该结构会随着四环GNRA与四环对接序列缔合(尽管不是形成沃森-克里克配对的意义上的结合)而折叠，从而产生极其稳定的结构，称为“锁定”。图中由片段插入侧或包括片段插入位点的锁定和对接的一部分表示的“对接”，通过锁定与iRNA骨架分离。添加至对接的一个或多个插入物通过锁定抑制干扰iRNA骨架的折叠。插入物(发夹或非发夹序列)可以添加至片段插入位点。在其它示例中，所示的双向茎被三向茎取代，以提供具有锁定和两个对接的锁定和对接结构。所示的示例包括分开的(例如双向或三向)茎，其碱基和一个臂位于四环或其它锁定结构内，并且分开的茎的另外的臂具有插入位点。
除了特定的iRNA构建体，所公开的支架以及锁定和对接结构可用于将异源片段连接至任何RNA载体和/或稳定任何RNA载体，包括植物或动物载体。基于RNA的载体可以通过添加一个或多个锁定和对接结构来修饰，例如四环GNRA对接结构。任选地，适合用作载体的亲本或野生型RNA分子可以通过截断位于特定位置的非特异性发夹序列来修饰。通常，通过移除发夹的上部或远端部分来截断发夹；然而，发夹的下部(例如，接近RNA分子的主要结构的3-5个碱基对)被保留在截断的发夹中。所产生的截断的发夹形成或限定插入位点。在一些实施方式中，然后可包括支架(如锁定和对接结构(例如，四环序列))的插入物连接至插入位点。所述锁定和对接结构可包括异源片段，从而连接至修饰后的RNA分子上。在一些实施方式中和在特定位置，异源片段可以直接连接至截断的发夹的插入位点，而不需要在插入位点和异源片段之间存在锁定和对接或其它支架结构。
在一个示例中，将30碱基的非发夹序列插入至L&D1中，其然后又插入至CYVaV中的位置2301，以制备基于CYVaV的载体。将CYVaV载体通过农杆菌渗入发渗入至本生烟植物中，并在植物内实现全身移动。
稳定局部3'UTR结构是有害的；然而，在附近插入不稳定的插入物恢复活力。参照图25图A，显示了CYVaV-wt的代表。CYVaV-wt 3'stb是亲本稳定化的构建体，其包含将G:U对转换为G:C对的6个nt的改变。将两个60个核苷酸的插入添加至稳定化的亲本构建体的位置2319和2330，形成CY2319PDS60_3'stb和CY2330PDS60_3'stb。为稳定化结构并生成CYVaV-wt 3'stb而进行的核苷酸改变在图B中圈出。图25图B所示的序列如下呈现：
ggcuaguuaaucucauucgugggauggacaggcagccugacguugac(SEQ ID NO:34)
guuaauguaggugucuuuccguaucuaguc(SEQ ID NO:35)(未修饰的G:U对)
Figure BDA0003747217710000561
(SEQ ID NO:36)(转换的G:C对)
治疗和管理目标
提供了通过所公开的载体递送的抗生素插入物，其包括抗生酶或小肽，其被工程化的以破坏CLas细菌。抗生酶喜好糖丰富的室温环境，如在植物韧皮部中发现的。在工程化的CYVaV感染周期中，抗生酶在伴生细胞中翻译。在韧皮部细胞质中产生的蛋白能够自然地离开进入CLas和其它植物病原菌定植的筛分子(翻译蛋白的默认途径)中。在筛分子中，酶分子随光合物质在树干上下移动，并在接触任何细菌时溶解细菌。由于抗生酶靶向特定种类的细菌，它们优选地不会干扰宿主树的微生物群系。针对CLas的各种剂已经开发出来(例如，Hailing Jin，University of California，Riverside，CA)。因此，靶向CLas细菌的许多插入物是本领域已知的，并且可以与本公开的CYVaV载体一起使用。
作为进一步的实施方式，靶向消灭疾病和疾病木虱载体的多种途径是有益的。因此，在一些实施方式中，所公开的载体包括上述抗生酶和/或肽，以及触发siRNA产生的插入物(其干扰树或携带疾病的木虱的基因表达)。在ACP的情况下，RNA可以杀死载体或使其无翅，从而是无害的。
靶向宿主基因表达的基于iRNA的载体
提供基于iRNA的病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体(尽管iRNA不一定是病毒，为方便，本文使用缩写VIGS)，其可以有效地靶向宿主基因表达。构建了基于CYVaV的载体，该载体包括发夹，其靶向在本生烟16C植物中表达的绿色荧光蛋白(GFP)mRNA。靶向GFP的发夹序列(SEQ ID NO:37；图27中图B)分别插入两个位置2301和2250中并进行测定。在本生烟16C植物中，GFP在每个细胞中都可以由可得的最强的植物启动子(带有双增强子的花椰菜花叶病毒35S(CaMV 35S)启动子)表达。需要靶向的mRNA比任何自然宿主mRNA都要多得多。
在没有GFP基因的正常、未受感染的叶片中(图26，图A)，在紫外光下观察到叶绿体发出亮红色的荧光(图A中显示为深灰色)。相比之下，表达相对高水平GFP的叶片(图26，图B)，在紫外光下呈暗橙色，茎干呈绿色(图B中显示为浅灰色)。
用构建的在位置2301含有抑制GFP的发夹的基于iRNA的VIGS载体(CYVaV-GFPhp2301)感染表达GFP的叶片。受感染的叶片显示了有效的基因沉默(图26，图C)。siRNA首先在韧皮部靶向和沉默GFP mRNA，这很容易从叶片脉管系统中看出(图26，图C)。随着VIGS构建体遍及植物移动(图26，图D)，随着时间的推移，负责GFP基因沉默的siRNA又遍及叶片和植物分布，并继续在所有细胞中沉默靶基因。GFP首先在韧皮部显著降低(叶脉在紫外光下可见鲜红色荧光；图C中显示为深灰色叶脉着色)。随着VIGS构建体在整个植物中持续迁移，基因抑制遍及整个叶片和植物结构持续(整个叶片可见为鲜红色荧光，以及幼叶和所有新生叶可见为鲜红色；如图D显示为深灰色)。需注意的是，在图C中，相同的叶片也在图D中被确定(图C和图D中白色箭头所示)，并且在紫外光下观察时几乎完全呈红色。
因此，随着时间的推移，基因沉默有效地遍及整个宿主植物传播(见图26，图D,CYVaV-GFPhp2301感染后14天拍摄的图像)。用在位置2250含有相同的抑制GFP的发夹(图27，图B)的VIGS构建体(CYVaV-GFPhp2250)感染表达GFP的叶片也得到了类似的结果)。
靶向胼胝质合酶表达的基于CYVaV的载体
提供了包含RNA插入物的载体，其能触发宿主树中胼胝质产生和积累的减少。在韧皮部中响应细菌产生胼胝质的足够大量的基因通过插入被植物切除的siRNA序列而沉默。
基于CYVaV的载体可以用作病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体，下调韧皮部中胼胝质合酶的表达。VIGS已被广泛用于下调成熟植物的基因表达，以检测植物功能基因组学(Senthil-Kumar等(2008)，Virus-induced gene silencing and its application incharacterizing genes involved in water-deficit-stress tolerance.J PlantPhysiol 165(13):1404-1421)。互补序列插入至如以上鉴定的CYVaV的合适位置(反义或RNase III可切割发夹)。已知该基因的柑橘版本(Enrique等(2011)，Novel demonstrationof RNAi in citrus reveals importance of citrus callose synthase in defenseagainst Xanthomonas citri subsp.citri.Plant Biotech J 9:394-407)。
胼胝质是β1,3-葡聚糖，其在发育和生物和非生物胁迫时会在各种组织中合成(Chen,X.Y.和Kim,J.Y.(2009)，Callose synthesis in higher plants.Plant Sig Behav4(6):489-492)。胼胝质沉积在筛分子的筛板上，抑制韧皮部的光合物质流动，导致源(幼)叶片中淀粉的过度积累，这有助于树木在细菌感染(如HLB)期间死亡。所有植物都含有12-14个胼胝体合酶基因；该基因家族的一个成员CalS7(拟南芥命名)主要负责响应伤害和各种病原体韧皮部筛孔中的胼胝质快速沉积(Xie等(2011)，CalS7 encodes acallosesynthase responsible for callose deposition in the phloem.Plant J 65(1):1-14))。完全抑制GSL7影响拟南芥中正常韧皮部运输和花序发育(Barratt等(2011)，CalloseSynthase GSL7 Is Necessary for Normal Phloem Transport and InflorescenceGrowth in Arabidopsis.Plant Physiol 155(1):328-341)。为了研究筛板胼胝质沉积减少(但不是消除)的后果，利用基于CYVaV的载体下调与成熟植物中的CalS7的在本生烟和桔树同源基因。可选地或额外地，载体提供表达胼胝质降解酶的插入物。
靶向CTV的基于iRNA的载体
构建了靶向CTV的基于iRNA的VIGS载体。正如数据所显示的，所公开的构建体可用于免疫和降低具有成熟感染的宿主植物的病毒水平。以CTV-GFP(表达GFP的CTV)感染的本生烟用作根茎，其被嫁接至野生型CYVaV(CYVaVwt)和CYVaV-gfphp2301接穗(图27，图A)。靶向GFP的发夹(图27，图B)被插入至构建体(CYVaV-GFPhp2301)中的位置2301。图27图B所示的序列如下呈现：
ugaagcggcacgacuucuucaagagcgccagaauucuggcgcucuugaagaagucgugccgcuuca(SEQ ID NO:37)
CYVaV-GFPhp2301发夹靶向CTV的GFP ORF，从而切割CTV。相比之下，CYVaVwt接穗对感染新生根茎叶片的CTV-GFP没有影响，这可以从幼嫩叶片在紫外光下可见的绿色荧光斑点得到证明(图27，图A，中间图)。但是，CYVaV-GFPhp2301在接穗中存在时，托叶中不出现绿色斑点(图27，图A，右图)，表明CYVaV-GFPhp2301向下至根茎的移动抑制了CTV感染的进展。
当WT CYVaV存在于根茎中时，来自CTV-GFP接穗的新叶片在紫外光下仍然发出绿色荧光，因此表明广泛的CTV感染持续不减(图27，图C，中间图)。但是，当CYVaV-GFPhp2301存在根茎中时，所有感染CTV-GFP的接穗中的上部叶片的部分或几乎完全没有GFP斑点(图27，图C，右图)。对叶片中没有GFP斑点的红色和绿色区域进行RT-PCR(图27，图C，圈出'A'区和'B'区)显示，CYVaV-GFPhp2301的高水平与红色荧光(A区)相关，该组织的CTV比绿色区域(B区)少3,000至440,000倍之间。特别是，A区的CTV的相对水平相较于B区的CTV水平低4.4x105倍。此外，A区的CYVaV-GFPhp2301的相对水平比B区的CYVaV-GFPhp2301高2.3倍(图27，图D)。
如上所述，CTV包括两种衣壳蛋白，基因组超过19kb。已经表征了76株CTV分离株，它们都含有保守的核苷酸区。CTV分离株的两个序列部分(18和6)在以下表1中确定，示出了完全保守的多核苷酸(以下下划线)以及较不保守的核苷酸(粗体)，其中一些分离珠中存在其它核苷酸(每个序列从左至右列出为鉴定的和加黑体的核苷酸)。例如，在表1所示的CTV18的序列部分中，3个非保守的核苷酸包括，从左至右：鸟嘌呤(G)，在10个CTV分离株中包括腺嘌呤(A)替代；胞嘧啶(C)，在大约一半的CTV分离株中包含尿嘧啶(U)替代；和G，在6个CTV分离株中包含A替代。在CTV6的序列部分，6个非保守的核苷酸从左至右包括：G，在1个CTV分离珠中包含A替代；G，在3个CTV分离株中包含A替代；U，在3个CTV分离株中包含C替代；A，在9个CTV分离株中，包含G替代；U，在1个CTV分离株中包含C替代；以及A，在1个CTV分离株中包含G替代。
表1.CTV分离株的序列部分。
Figure BDA0003747217710000601
Figure BDA0003747217710000611
用在位置2301携带的靶向CTV基因组中的保守序列的发夹的基于CYVaV的载体(SEQ ID NO:38；图27，图F)，通过农杆菌渗入法渗入被CTV完全感染的本生烟。CYVaV-CTV18发夹包含多核苷酸序列(SEQ ID NO:39；虚线框所示，图F)与CTV18所有变体的相应序列互补。图27图F中序列如下：
uccguggacgucauguguaaggguacccuuacacaugacguccacgga(SEQ ID NO:38)
cuuacacaugacguccacgga(SEQ ID NO:39)
4天后，与用CYVaV野生型渗入的组织相比，感染CYVaV-CTV18载体的植物中的CTV水平低约10倍(图27，图E)。
用CTV-GFP和CYVaV野生型或含有另一靶向CTV基因组的发夹的CYVaV-CTV6(SEQID NO:40；图27，图H)共渗入的叶片在渗入后6天也显示CTV-GFP的显著降低(图27，图G)。CYVaV-CTV6发夹包含与所有其变体中的CTV6的相应序列互补的多核苷酸序列(SEQ ID NO:41；虚线框所示，图H)。图27中图H所示的序列如下：
ggaagugauggacgaaauuaaugaccaaucauuaauuucguccaucacuuccag(SEQ ID NO:40)
ucauuaauuucguccaucacuucc(SEQ ID NO:41)
与利用CYVaV wt渗入的组织相比，用CYVaV-CTV6载体感染的植物中的CTV水平明显更低。
不包含和包含L&D的靶向GFP的发夹的稳定性
评估没有任何锁定和对接结构(CY2301GFP30)或有L&D1(CY2301LD1GPF30s)在位置2301插入时靶向GFP的30nt发夹(SEQ ID NO:49；图32，图E)的稳定性。
在图32图A中显示用在位置2301含有30nt发夹插入物的CYVaV(CY2301GFP30s)感染的本生菌16C植物。未检测到病毒诱导的基因沉默(VIGS)效应。在输入CYVaV(CY2301GFP30)和在全身组织中积累的CYVaV之间的序列比对在图32图B中所示。后者CYVaV包含在感染期间获得的19nt缺失，这表明该构建体是不稳定的。图32图B中所示的序列如下：
Agttaatgtaggtgtctttcctgaagcggcacgacttcttcaagagcgccagtatctagt(SEQ IDNO:44)
agttaatgtaggtgtctttcctgaagcggc(SEQ ID NO:45)
cagtatctagt(SEQ ID NO:46)
用在位置2301含有L&D1和30nt发夹插入物(SEQ ID NO:49)的CYVaV(CY2301LD1GFP30s)感染的本生烟16C植物在图32图C中所示。观察到VIGS载体导致的明显的GFP沉默(植物荧光红色，图C中以深灰色显示)。CY2301LD1GFP30s感染的植物与原始构建体之间的序列比对在图32图D中所示。如所示，L&D1大大增强了30nt发夹插入物的稳定性。图32中图D和E所示的序列如下所示：
agttaatgtaggtgtctttccgcgatatggattcagggacttgaagcggcacgacttcttcaagagcgccaagtccctgctcaggggaaactttgtgtcctaagtcgcgtatctagtcac(SEQ ID NO:47)
agttaatgtaggtgtctttccgcgatatggattcagggacttgaagcggcacgacttcttcaagagcgccaagtccctgctcaggggaaactttgtgtcctaagtcgcgtatctagtcac(SEQ ID NO:48)
ugaagcggcacgacuucuucaagagcgcca(SEQ ID NO:49)
49)
靶向胼胝体合酶的L&D1和L&D1+发夹的稳定性
对在位置2250插入的L&D1(CYm2250LD1)的稳定性，以及靶向胼胝质合酶的L&D1+30nt发夹(SEQ ID NO:59；图33，图E)(CYm2250LD1Cal_30as)的稳定性进行了评估。
被CYm2250LD1感染的本生烟植物显示于图33图A，其在截断的发夹末端含有L&D1。未发现在完整的野生型发夹末端(在位置2250)添加这些插入物是稳定的。感染的组织中CYm2250LD1(RT-PCR)与原始构建体之间的序列比对(图33，图B)显示完全稳定性。图33图B所示的序列如下：
tgatacctgttcagaataggattgctcgagcttcgttggttagggtaactca(SEQ ID NO:50)
gcgatatggattcagggactagtccctgctcaggggaaactttgtgtcctaagtcgcac(SEQ IDNO:51)
ctaaccagt(SEQ ID NO:52)
aatagggtcattggtttaccgatgatacctgttcagaataggattgctcgagcttcgttggttagggtaactcacataccttcttccatagcgatatggattcagggactagtccctgctcaggggaaactttgtgtcctaagtcgcactggaaaaggtcgtgtgagcaacctaaccagt(SEQ ID NO:53)
图33中图C显示了被CYm2250LD1asCal7_30as(CYVaV包含具有靶向胼胝质合酶的30nt插入物(SEQ ID NO:59)的L&D1)感染的本生烟16C植物。在感染的植物上积累的CYm2250LD1Cal730as(RT-PCR)与原始结构之间的序列比对(图33，图D)表明30nt插入物在L&D1内是稳定的。靶向在韧皮部中活跃的胼胝质合酶的30nt胼胝质合酶7siRNA序列(反义方向)显示在图33图E中。图33中图D和E所示的序列如下：
gatacctgttcagaataggattgctcgagcttcgttggttagggtaactca(SEQ ID NO:54)
gcgatatggattcagggacttgatgttggatccatcctatgagccttttcagtccctgctcaggggaaactttgtgtcctaagtcgcac(SEQ ID NO:55)
ctaaccagttaatgtaggtgtctttccgtatctagtcac(SEQ ID NO:56)
aatagggtcattggtttaccgatgatacctgttcagaataggattgctcgagcttcgttggttagggtaactcacataccttcttccatagcgatatggattcagggact(SEQ ID NO:57)
agtccctgctcaggggaaactttgtgtcctaagtcgcactggaaaaggtcgtgtgagcaacctaaccagttaatgtaggtgtctttccgtatctagtcac(SEQ ID NO:58)
ugauguuggauccauccuaugagccuuuuc(SEQ ID NO:59)
在一些示例中，具有截断的发夹(iRNA的)和插入物的iRNA在长的测试周期，例如超过40天是稳定。不受理论的限制，截断iRNA(例如，CYVaV)的发夹，例如结构上需要的发夹，连同添加插入物至iRNA的发夹，获得类似于其原始大小和/或保持其结构完整性的iRNA的发夹。然而，需要了解的是，插入的发夹或非结构化的短RNA序列不一定与截断的发夹大小相同或相似。
包含多个插入物的基于iRNA的载体
构建了基于iRNA的载体，其包括在位置2301的插入物和在位置2330的另一插入物(CY2301LD2/2330CTV6sh)。在位置2330的插入物是靶向CTV6(SEQ ID NO:60)的发夹，在位置2301的另一插入物是空的L&D2结构(SEQ ID NO:43；图34，图A)。图34中图A所示序列如下：
gcgauauggaucaggacuaguccugucacccucacuucgguguccaggggaaacuuugugggugaguccuaagucgc(SEQ ID NO:43)
ggaagugauggacgaaauuaaugaccaaucauuaauuucguccaucacuucc(SEQ ID NO:60)
用CY2301LD2/2330CTV6sh感染的本生烟显示在图34图B中。来自CY2301LD2/2330CTV6sh感染的植物的RT-PCR结果显示在图34图C中，上部条带含有两个插入物，并与原始渗入的构建体相同。下部条带具有L&D2缺失。数据显示，两种插入物是耐受的，并且构建体是有感染性的。
增强稳定性的锁定和对接结构
扩展所公开的锁定和对接结构的碱基处的碱基配对，提高了较大非结构化插入物的稳定性。碱基配对在L&D1中扩展以包含三个另外的碱基对(G-C、C-g、G-C)(图35，图C)，从而形成了第三个锁定和对接结构(L&D3)。L&D3的序列如下提供：
gcggcgauauggauucagggacuagucccugcucaggggaaacuuuguguccuaagucgccgc(SEQID NO:61)
用在位置2301的L&D3(CY2301LD3)感染的本生烟植物显示在图35图A中。图35图B显示了感染的植物的有症状的叶片的RT-PCR，显示为单一条带(无明显缺失)。显示了以在位置2301含有L&D1与以从感染的植物组织中获得的CY2301LD3的RT-PCR测序的CYVaV的序列比对(图35中图D)。未检测到不稳定性。图35图C所示的序列如下显示：
tgtaggtgtctttccgcgatatggattcagggactagtccctgctcaggggaaactttgtgtcctaagtcgcgtatctagtcacgatgg(SEQ ID NO:62)
ttccataactggaaaaggtcgtgtgagcaacctaaccagttaatgtaggtgtctttccgcggcgatatggattcagggactagtccctgctcaggggaaactttgtgtcctaagtcgccgcgtatctagtcacgatggtaagcaacccgtttatctgtacggcgctcacccgtgggtaga(SEQ ID NO:63)
在一些实施方式中，提供了靶向一种或多种病毒和/或真菌和/或细菌病原体的插入物。在一些实施方式中，提供了发夹或短RNA序列(约100nt或更少，例如约20nt和约80nt之间，或约30nt和约60nt之间，或约30nt)插入物，其产生直接靶向CVEV的siRNA，因为已知CVEV会轻微加剧CYVaV的黄化影响，并使CYVaV在树木间传播。在一些实施方式中，提供了靶向CTV的发夹插入物，因为CTV是柑橘的高度破坏性的病毒病原体(仅次于CLas)。在其它实施方式中，提供靶向另一柑橘(或其它)病毒的插入物。在一些实施方式中，提供了靶向真菌病原体的插入物，只要是这种病原体能够从韧皮部吸收siRNA。在一些实施方式中，提供了靶向细菌病原体的插入物，条件是这种病原体能够从韧皮部吸收siRNA。
在一些实施方式中，基于CYVaV(或其它iRNA)的载体包括被工程化以修饰出自伴生细胞中的基因表达的植物的的表型特性的插入物。在一个移植中，提供了触发侏儒症的插入物，以便果实更容易收获，并减少对生长空间的需求。另外的和/或其它性状也可以按照需要作为目标。本公开的包含1、2、3或更多插入物的iRNA载体显示了稳定性和功能性。
在一些实施方式中，RNA载体与通过本文所描述的方法产生的但是不同地制备的(例如通过合成制造方法，其可能或不可能通过野生型或亲本形式的等同物)的RNA载体相同、本质上相同或大体上类似。例如，不是实际截断或稳定化野生型RNA载体，而是可以人工制造具有与截断的或稳定化的野生型RNA载体相同的核酸序列的RNA。在这种情况下，可能不需要制造完整的野生型载体，然后将其截断或对其进行稳定化，而是可以直接制造截断的或稳定化的结构。类似地，也不需要生成RNA骨架，然后添加异源插入物至RNA骨架。相反，可以直接制造带有存在的插入物的RNA载体。因此，基于动词，如插入、截断、稳定化或涉及从亲本或野生型结构开始对行为或状态的描述，应从在理论上进行解释，以便包括所得到的核酸序列，无论该行为是否实际进行，以及无论指定的起始材料是否实际使用。例如，任选地截断的或稳定化的具有添加的外源元件的亲本结构可以通过确定其核酸序列代替制备，并且通过步骤或方法的一些其它顺序形成合成制造等同物或类似分子。
本说明书提到的所有确定的出版物和参考文献在此通过引用纳入本文，如每份独立的出版物被具体和单独地指明被完整引用一样。虽然本发明已结合其示例性实施方式进行了描述，但应理解，它能够进行进一步修改，并且本公开旨在涵盖大体上遵循本发明的原理的本发明的任何变化、使用或改造，以及包括与本公开的背离，只要在本发明所属领域的已知或惯常实践范围内且可应用于上文所述的特征。
序列表
<110> 马里兰大学派克分院
加利福尼亚大学董事会
A·E·西蒙
J·刘
G·维达拉基斯
S·博达吉
<120> 植物载体、组合物及其相关用途
<130> 2105.0071PCT2
<150> US 62/760,098
<151> 2018-11-13
<150> PCT/US2019/060945
<151> 2019-11-12
<160> 67
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2692
<212> RNA
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<400> 1
ggguaaauau ggauccuuca ucuuugcccc gugccuguug gcaucaugcc agacaggugu 60
uucgagcauc aacuagcuuc ucaagagagg ugguucgcgc ugcucguaga uggguuacca 120
ugcccaccag ucgccaugca uaugacuuuu caacgagucu aggcauugug auugcugagc 180
cugcagcucg uuuacgacgc cgucugcccu cuguacgaaa gugcgcagag aaguuaguag 240
uccacaagca agucgacacu uugguggacg aauggugcuc uggaauuccc aacccugaua 300
ucguagaagu ugguugggca cuccgucuga gggaccguuu cggucuuccu cccgcuucug 360
agccuacccg gcucaguggu gagagauggg ugcucaaaca acucaauggg guagauccug 420
agucauggaa ugcugaucuu gguaggucag uucauaucca aggagacuac gccccaggga 480
ggaaugccca uaucgcucag gucgcggcga ccuugugguu aacuaggacc uugcaugaca 540
aggccuuggc ucgccaccag gguuuucgcg auuugcagug auuggggucg acgggcuaga 600
ggcaaaagca gugccucuag cuucuggacu ccgacugcuu ccgguuccgc gacccggaca 660
aagucgacga cugucucaga ccuuguuacu uccaacaccu cgugcucaau ucgugaauca 720
cgcgugcucg gcuaacaacc uuggacgugu gaugaccaca cguguguugc aguacaaggg 780
ccgagauccg auccuucccu cuucugaagc ccuucaccga cuuaaccuuc ggauagcuga 840
gcuauauagg ucuagaccuu cuaccgucua uccauuaagu uaugaagggu uucucaauug 900
cuaugaaggc cgacagcgua cucguuacgc ccaagccguc gagcaguuga ugcgguccac 960
ucuugagccg aaagaugcgc gaguugaaac guucauuaag aacgagaaau uugacugggc 1020
guugaaaggg gaggaggcug auccucgagc aauccaacca aggaagccga aauauuuggc 1080
ugagguugga cggugguuca aaccuuugga gcgaaucauc uacaaggauc ucaguaaaag 1140
guuguauggu gagggugcug agccguguau cgccaaaggc cuaaaugcau uagaaucugg 1200
agcgacuuug aggcgcaaau gggagaaguu uucuucucca guuugcguuu cucucgacgc 1260
uuccagguuc gaccugcaug uaagcguugg caugcuaaag uucacacaca agcuauauga 1320
cuauuacugu aagucuccca cucuccagcg cuaucucaaa uggacacucc gcaaccaugg 1380
cgucgccucc ugcaaagaau ugucauauga guaugagguu guuggccgga gaaugagugg 1440
ugacauggac acugcauugg gcaacugcgu cauuaugucg auacuuacau gguuuaugcu 1500
uagugaacuu ggcauuaagc augaauuauu cgauaauggu gacgauuguu uguucauuug 1560
cgagucucac gacgucccca gccccgaggu aauuacaaac ugguuuucgg acuuuggguu 1620
ugugguuagg uuggaaggcg ucacguccgu guuugagcgu auugaguuuu gccaaacuuc 1680
cccaguaugg acugagaggg guuggcugau guguaggaau auuaagucau ugaguaaaga 1740
ccuuacgaau guuaauucgu gcacgggcuc cacgauugaa uauacccacu gguugaaagc 1800
agugggaaag ugcgggucaa uacucaaugc ugguguaccu auauuucagu ccuuucacaa 1860
caugcuggaa aggcuuggca cuaacucucg uauugaucga gggguuuucu ucaaaucagg 1920
gcuaguuaau cucauucgug ggauggacag gcagccugac guugacauca cuacuuccgc 1980
ucggcuuucu uucgaagugg cauucgggau aacacccggg augcaauugg cuauugaacg 2040
guacuaugac ucugucaugg gcucgcugag uaaaauagaa acaacuaagu ggccaauuga 2100
acuaagaaag gaauacgaac acggaaguga gugguacgag gacuuaggcg uccuaggaug 2160
aauaggguca uugguuuacc gaugauaccu guucagaaua ggauugcucg agcuucguug 2220
guuaggguaa cucacauacc uucuuccaua acuggaaaag gucgugugag caaccuaacc 2280
aguuaaugua ggugucuuuc cguaucuagu cacgauggua agcaacccgu uuaucuguac 2340
ggcgcucacc cguggguagg aaggugaagg uuuugugucc uuuaggucuu ggacagucug 2400
cgggcuuggg aacgacgccc cgcuagcaac guacugcucu ccuaccggac ugguagcuua 2460
auugucaucu uggagcgaua gcacuguggg ccucacccuu cgcgcguugg acguguugcg 2520
ugccccccac agauuuguga aacucuaugg agcaguuccg cgagccagaa gggaggaugg 2580
ccgccuggcg uaauccagga gcucuggggg gcuuguacuc agaguagcau ucugcuuuag 2640
acuguuaacu uuaugaacca cgcgugucac guggggagag uuaacagcgc cc 2692
<210> 2
<211> 225
<212> RNA
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(225)
<223> CYVaV的3' 端
<400> 2
ucuuggagcg auagcacugu gggccucacc cuucgcgcgu uggacguguu gcgugccccc 60
cacagauuug ugaaacucua uggagcaguu ccgcgagcca gaagggagga uggccgccug 120
gcguaaucca ggagcucugg ggggcuugua cucagaguag cauucugcuu uagacuguua 180
acuuuaugaa ccacgcgugu cacgugggga gaguuaacag cgccc 225
<210> 3
<211> 84
<212> RNA
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(84)
<223> CYVaV的3' 帽独立翻译增强子(3' CITE)
<400> 3
ucuuggagcg auagcacugu gggccucacc cuucgcgcgu uggacguguu gcgugccccc 60
cacagauuug ugaaacucua ugga 84
<210> 4
<400> 4
000
<210> 5
<400> 5
000
<210> 6
<211> 570
<212> RNA
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(570)
<223> CYVaV编码蛋白p21的多核苷酸序列 (碱基 9 至
578)
<400> 6
auggauccuu caucuuugcc ccgugccugu uggcaucaug ccagacaggu guuucgagca 60
ucaacuagcu ucucaagaga ggugguucgc gcugcucgua gauggguuac caugcccacc 120
agucgccaug cauaugacuu uucaacgagu cuaggcauug ugauugcuga gccugcagcu 180
cguuuacgac gccgucugcc cucuguacga aagugcgcag agaaguuagu aguccacaag 240
caagucgaca cuuuggugga cgaauggugc ucuggaauuc ccaacccuga uaucguagaa 300
guugguuggg cacuccgucu gagggaccgu uucggucuuc cucccgcuuc ugagccuacc 360
cggcucagug gugagagaug ggugcucaaa caacucaaug ggguagaucc ugagucaugg 420
aaugcugauc uugguagguc aguucauauc caaggagacu acgccccagg gaggaaugcc 480
cauaucgcuc aggucgcggc gaccuugugg uuaacuagga ccuugcauga caaggccuug 540
gcucgccacc aggguuuucg cgauuugcag 570
<210> 7
<211> 190
<212> PRT
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(190)
<223> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV) 蛋白p21
<400> 7
Met Asp Pro Ser Ser Leu Pro Arg Ala Cys Trp His His Ala Arg Gln
1 5 10 15
Val Phe Arg Ala Ser Thr Ser Phe Ser Arg Glu Val Val Arg Ala Ala
20 25 30
Arg Arg Trp Val Thr Met Pro Thr Ser Arg His Ala Tyr Asp Phe Ser
35 40 45
Thr Ser Leu Gly Ile Val Ile Ala Glu Pro Ala Ala Arg Leu Arg Arg
50 55 60
Arg Leu Pro Ser Val Arg Lys Cys Ala Glu Lys Leu Val Val His Lys
65 70 75 80
Gln Val Asp Thr Leu Val Asp Glu Trp Cys Ser Gly Ile Pro Asn Pro
85 90 95
Asp Ile Val Glu Val Gly Trp Ala Leu Arg Leu Arg Asp Arg Phe Gly
100 105 110
Leu Pro Pro Ala Ser Glu Pro Thr Arg Leu Ser Gly Glu Arg Trp Val
115 120 125
Leu Lys Gln Leu Asn Gly Val Asp Pro Glu Ser Trp Asn Ala Asp Leu
130 135 140
Gly Arg Ser Val His Ile Gln Gly Asp Tyr Ala Pro Gly Arg Asn Ala
145 150 155 160
His Ile Ala Gln Val Ala Ala Thr Leu Trp Leu Thr Arg Thr Leu His
165 170 175
Asp Lys Ala Leu Ala Arg His Gln Gly Phe Arg Asp Leu Gln
180 185 190
<210> 8
<211> 1407
<212> RNA
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(1407)
<223> CYVaV 编码蛋白p81的多核苷酸序列 (碱基 752
至 2158)
<400> 8
augaccacac guguguugca guacaagggc cgagauccga uccuucccuc uucugaagcc 60
cuucaccgac uuaaccuucg gauagcugag cuauauaggu cuagaccuuc uaccgucuau 120
ccauuaaguu augaaggguu ucucaauugc uaugaaggcc gacagcguac ucguuacgcc 180
caagccgucg agcaguugau gcgguccacu cuugagccga aagaugcgcg aguugaaacg 240
uucauuaaga acgagaaauu ugacugggcg uugaaagggg aggaggcuga uccucgagca 300
auccaaccaa ggaagccgaa auauuuggcu gagguuggac ggugguucaa accuuuggag 360
cgaaucaucu acaaggaucu caguaaaagg uuguauggug agggugcuga gccguguauc 420
gccaaaggcc uaaaugcauu agaaucugga gcgacuuuga ggcgcaaaug ggagaaguuu 480
ucuucuccag uuugcguuuc ucucgacgcu uccagguucg accugcaugu aagcguuggc 540
augcuaaagu ucacacacaa gcuauaugac uauuacugua agucucccac ucuccagcgc 600
uaucucaaau ggacacuccg caaccauggc gucgccuccu gcaaagaauu gucauaugag 660
uaugagguug uuggccggag aaugaguggu gacauggaca cugcauuggg caacugcguc 720
auuaugucga uacuuacaug guuuaugcuu agugaacuug gcauuaagca ugaauuauuc 780
gauaauggug acgauuguuu guucauuugc gagucucacg acguccccag ccccgaggua 840
auuacaaacu gguuuucgga cuuuggguuu gugguuaggu uggaaggcgu cacguccgug 900
uuugagcgua uugaguuuug ccaaacuucc ccaguaugga cugagagggg uuggcugaug 960
uguaggaaua uuaagucauu gaguaaagac cuuacgaaug uuaauucgug cacgggcucc 1020
acgauugaau auacccacug guugaaagca gugggaaagu gcgggucaau acucaaugcu 1080
gguguaccua uauuucaguc cuuucacaac augcuggaaa ggcuuggcac uaacucucgu 1140
auugaucgag ggguuuucuu caaaucaggg cuaguuaauc ucauucgugg gauggacagg 1200
cagccugacg uugacaucac uacuuccgcu cggcuuucuu ucgaaguggc auucgggaua 1260
acacccggga ugcaauuggc uauugaacgg uacuaugacu cugucauggg cucgcugagu 1320
aaaauagaaa caacuaagug gccaauugaa cuaagaaagg aauacgaaca cggaagugag 1380
ugguacgagg acuuaggcgu ccuagga 1407
<210> 9
<211> 469
<212> PRT
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<400> 9
Met Thr Thr Arg Val Leu Gln Tyr Lys Gly Arg Asp Pro Ile Leu Pro
1 5 10 15
Ser Ser Glu Ala Leu His Arg Leu Asn Leu Arg Ile Ala Glu Leu Tyr
20 25 30
Arg Ser Arg Pro Ser Thr Val Tyr Pro Leu Ser Tyr Glu Gly Phe Leu
35 40 45
Asn Cys Tyr Glu Gly Arg Gln Arg Thr Arg Tyr Ala Gln Ala Val Glu
50 55 60
Gln Leu Met Arg Ser Thr Leu Glu Pro Lys Asp Ala Arg Val Glu Thr
65 70 75 80
Phe Ile Lys Asn Glu Lys Phe Asp Trp Ala Leu Lys Gly Glu Glu Ala
85 90 95
Asp Pro Arg Ala Ile Gln Pro Arg Lys Pro Lys Tyr Leu Ala Glu Val
100 105 110
Gly Arg Trp Phe Lys Pro Leu Glu Arg Ile Ile Tyr Lys Asp Leu Ser
115 120 125
Lys Arg Leu Tyr Gly Glu Gly Ala Glu Pro Cys Ile Ala Lys Gly Leu
130 135 140
Asn Ala Leu Glu Ser Gly Ala Thr Leu Arg Arg Lys Trp Glu Lys Phe
145 150 155 160
Ser Ser Pro Val Cys Val Ser Leu Asp Ala Ser Arg Phe Asp Leu His
165 170 175
Val Ser Val Gly Met Leu Lys Phe Thr His Lys Leu Tyr Asp Tyr Tyr
180 185 190
Cys Lys Ser Pro Thr Leu Gln Arg Tyr Leu Lys Trp Thr Leu Arg Asn
195 200 205
His Gly Val Ala Ser Cys Lys Glu Leu Ser Tyr Glu Tyr Glu Val Val
210 215 220
Gly Arg Arg Met Ser Gly Asp Met Asp Thr Ala Leu Gly Asn Cys Val
225 230 235 240
Ile Met Ser Ile Leu Thr Trp Phe Met Leu Ser Glu Leu Gly Ile Lys
245 250 255
His Glu Leu Phe Asp Asn Gly Asp Asp Cys Leu Phe Ile Cys Glu Ser
260 265 270
His Asp Val Pro Ser Pro Glu Val Ile Thr Asn Trp Phe Ser Asp Phe
275 280 285
Gly Phe Val Val Arg Leu Glu Gly Val Thr Ser Val Phe Glu Arg Ile
290 295 300
Glu Phe Cys Gln Thr Ser Pro Val Trp Thr Glu Arg Gly Trp Leu Met
305 310 315 320
Cys Arg Asn Ile Lys Ser Leu Ser Lys Asp Leu Thr Asn Val Asn Ser
325 330 335
Cys Thr Gly Ser Thr Ile Glu Tyr Thr His Trp Leu Lys Ala Val Gly
340 345 350
Lys Cys Gly Ser Ile Leu Asn Ala Gly Val Pro Ile Phe Gln Ser Phe
355 360 365
His Asn Met Leu Glu Arg Leu Gly Thr Asn Ser Arg Ile Asp Arg Gly
370 375 380
Val Phe Phe Lys Ser Gly Leu Val Asn Leu Ile Arg Gly Met Asp Arg
385 390 395 400
Gln Pro Asp Val Asp Ile Thr Thr Ser Ala Arg Leu Ser Phe Glu Val
405 410 415
Ala Phe Gly Ile Thr Pro Gly Met Gln Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Tyr
420 425 430
Asp Ser Val Met Gly Ser Leu Ser Lys Ile Glu Thr Thr Lys Trp Pro
435 440 445
Ile Glu Leu Arg Lys Glu Tyr Glu His Gly Ser Glu Trp Tyr Glu Asp
450 455 460
Leu Gly Val Leu Gly
465
<210> 10
<400> 10
000
<210> 11
<400> 11
000
<210> 12
<400> 12
000
<210> 13
<400> 13
000
<210> 14
<400> 14
000
<210> 15
<400> 15
000
<210> 16
<400> 16
000
<210> 17
<211> 166
<212> RNA
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(166)
<223> CYVaV的重编码移码位点的多核苷酸序列
<400> 17
ucgcucaggu cgcggcgacc uugugguuaa cuaggaccuu gcaugacaag gccuuggcuc 60
gccaccaggg uuuucgcgau uugcagugau uggggucgac gggcuagagg caaaagcagu 120
gccucuagcu ucuggacucc gacugcuucc gguuccgcga cccgga 166
<210> 18
<211> 25
<212> RNA
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(25)
<223> CYVaV的重编码移码位点的多核苷酸序列
<400> 18
caaagucgac gacugucuca gaccu 25
<210> 19
<211> 34
<212> RNA
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(34)
<223> CYVaV的重编码移码位点的多核苷酸序列
<400> 19
aggucuugga cagucugcgg gcuugggaac gacg 34
<210> 20
<211> 3132
<212> RNA
<213> 无花果
<220>
<221> 混合_特征
<223> 无花果树iRNA的多核苷酸序列 ("iRNA亲缘序列 1" 或
"iRNA r1")
<400> 20
aaauauggau ucgauaucaa ugcccgucgc cugcugguca aaagccaggc aggucuugcg 60
uacaccagcu aacuuuucca aagggguagu gaaggcugcg uaccgguggg ucaacaugcc 120
cagagccaaa uaugucagag augucuccac gagucuuggc auaguugucg cugagccugu 180
ugcugccgug cgccguuaga ugccuucgau aagcagccuu gcggaggagu ugguaacacg 240
ccagagcguc gacacucugg uggacgauug gugucucgga cuuuccaacc cugacaacaa 300
cguggagguu gguugggcac uucgucugag ggaccgcuuu ggucuuccuc ccgccucuga 360
gcccacaagg cucaguggug agagaugggu gcuuaaacaa cucaaugggg uagacccgga 420
gucguggaau guugaucugc aaagcguuuu cgaagacgcu caggaugacu uccaucggga 480
cuacgcccca aggaggaaug cccaaaucgc ucaaauugcg gcaacccuau ggcuuacaaa 540
gaccuuaguc gauaaggcuu uagcacgcca ucaggauuuu cgcaguuugc agugauuggg 600
gucgacgggc uagaggcuaa agcagugccu cuggcugcug gacuccgacu gcuuccgguu 660
ccgcggcccg gacaaagccg acggcugucu caaaccuugc uacucccuac uccccgugcu 720
caauuuguca aucacgcuaa cucagguaau aauuuggggc guguuuugac cacacgggug 780
augcaauaca aaggccgaga cccgauacua cccucccagg aagcccugcg caaacuuaac 840
cuucggauag gacaguugua uaagucuaga ccauccacug ucuauccccu gaguuaugau 900
ggguuucuua auuguuauga uggccgacag cguacucgcu acgcucaugc cgucgagcaa 960
uugaugggug ccgcucugac cccaaaagau gcgcgaguug agacguucau uaagaacgag 1020
aaguuugauu gguuguugaa gggagacgag gcugauccuc gugcaaucca accuaggaag 1080
ccgaaauauu uggccgaggu uggucgaugg uucaaaccgu uggagcgaau caucuacaag 1140
gaucucaguu ugcguuugua cggugauaac gcugaaccuu gcauugccaa aggcuuaaau 1200
gcauuggaau caggggcuac guugagacgu aaaugggaaa aguucgcuaa uccuguuugu 1260
guuucauugg augcuucucg uuucgaccug cacguaagug uuggcuuguu aaaguucacg 1320
cauaaauugu acaacuauua cugcaagucu cccacucuuc aacgauaucu caaauggaca 1380
cuccgcaacu ccgguaucgc cuccuguaag gaaaaaucau augcguauga gguugaaggc 1440
cguagaauga guggcgacau ggacaccgca uuaggcaacu guaucaucau gagauuauua 1500
acuugguuua ugcuuagcga acuuggcgug cggcaugagc uuuucgauaa uggugaugac 1560
uguuuguuua uuugugaaaa agaagacguu ccuagugcug agguaaucac gaacugguuu 1620
acggauuuug gguuuguggu uaagcuagaa ggcgucacgu ccguguuuga gcgcauugag 1680
uucugucaga ccucaccagu auggacugcg aggggauggc ugauguguag aaacaucaag 1740
ucauugagua aagauuuaac gaauguuaau ucgugcacug guucugccgu ugaauacacu 1800
cauugguuga aggcgguggg caagugugga ucuauacuca augcuggugu gcccauauuu 1860
caguccuuuc acaacauguu ggucagguug ggcacgaauu cgcguauaga ucgcggggua 1920
uucuuuaggu guggacuugu uaaucucauu cugggaugga cagacaaccu gaaaguugag 1980
aucacuacuu ccgcucgucu uucuuuugaa guggcauucg ggaucacucc cggcaugcaa 2040
uuggcuauug agcaauuuua ugacucaguc gugggcccuc uggguaaaau aaaaucugua 2100
aaauggccaa uagaucuaag aaaggaauac gauuacggaa gcgcgugguu cgaagaccaa 2160
ggcguccuag ggugaacaag gaacucggau uaccgaugac accuguucaa acuagaaugg 2220
uucggucaac guugaccaag gagaccaaca uaccuucuac ugcaaauagc ggucgggagg 2280
cuguuugggc uuguuggcca aucaacuuua gugucuuucc gcaacuagcc ucacucguga 2340
auaaaccguu auacuggcgu guguccagug ugcaaguugc aauggagccg gcgaugucua 2400
cuuccaccca acauugugga guuggucuca guucuucugg ggccuucacu aacggugaug 2460
gguucgguaa cgucuuuaag cucuugcguu cuuguaacua uacgcggcgc ucucccgugg 2520
gaggaaacgu gauggucaaa uggcccaucu gcaugcccuu cauucuuaac gaugaugcgc 2580
acaagaacac aggauuaacc gccuguguga ucauugcagu caccaauacu ggugugcuaa 2640
cuggucaauc uuggacggag auucuuuuga auguggagua uguagugggu gcauagacag 2700
ucugcgggcu ugggaacgac gccccgcuag caacguacug cucuccuacc ggacugguag 2760
ccguuuaguu aucuuggagc gauagcacug ugagccucac ucaacgcgcg auggacgugg 2820
cgagugcccc ucagagauuu gugaaacucu auagagcuau uucgcgagcc agaagggagg 2880
auggccaccu gguguaagcc agguaucccc ggggggcuug uacucggggu cgcauuacug 2940
cuuagaccac aagguagggu ucgcaucuug gaacugaccc uaugaccuug ugggugcccu 3000
aaccggacug guagccguuu aauaucuugg agcgauuagc acgugugagc ccucacucaa 3060
cggcgcgauu ggacguggcg agugccccuc agaguaaucu gcagagcucc ggcagucgug 3120
ggaggcaagg ca 3132
<210> 21
<211> 3275
<212> RNA
<213> 无花果
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(3275)
<223> 无花果树iRNA的多核苷酸序列 ("iRNA 亲缘序列 2" 或
"iRNA r2")
<400> 21
cucccacgac ugccggagcu cugcagaauu ccaccggggg uaccuggcuu acaccaggug 60
gccauccucc cuucuggcuc gcggaauagc ucuauagagu uucacaaauc ucugaggggc 120
acucgccacg uccaucgcgc guugagugag gcucacagug cuaucgcucc cagaauucgg 180
gauaaauaug gaagaaacuu cuuugcccaa agccugcugg aucaaaagcc aggcaggucu 240
ugcguacacc agcuaacuuu uccaaagggg uagugaaggc ugcguaccgg ugggucaaca 300
ugcccagagc caaauauguc agagaugucu ccacgagucu uggcauaguu gucgcugagc 360
cuguugcugc cgugcgccgu cagaugccuu cgauaagcag ccuugcggag gaguugguaa 420
cacgccagag cgucgacacu cugguggacg auuggugucu cggacuuucc aacccugaca 480
acaacgugga gguugguugg gcacuucguc ugagggaccg cuuuggucuc ccucccgccu 540
cugagcccac aaggcucagu ggugagagau gggugcuuaa acaacucaau ggaguagacc 600
cggaaucuug gaaugacgac uaugcguucg aagacgcuca ggaggauuuu caacgggaau 660
acgucccggg aaggaaugcc cauauugcug caacugcggc aacucuaugg cugacaaaga 720
ccuuguauga caaggcuuua guucgccauc aggguuuucg caguuugcag ugauuggggu 780
cgacgggcug gaggcuaaag cagugccucc agcugcugga cuccgacugc uuccgguucc 840
gcggcccgga caaagccgac ggcugucuca gaccuuacua cuuccuacuc cccgugcuac 900
uuuugucaau caugcaaauu caggcaauaa ucuugagcgu guuuugacca cacgggugau 960
gcaauacaaa ggccgagacc cgauacuacc cucccaggaa gcccugcgca aacuuaaccu 1020
ucggauagga caguuguaua agucuagacc auccacuguc uauccccuga guuaugaugg 1080
guuucuuaau uguuaugaug gccgacagcg uacucgcuac gcucaugccg ucgagcaauu 1140
gaugggugcc gcucugaccc caaaagaugc gcgaguugag acguucauua agaacgagaa 1200
guuugauugg uuguugaagg gagacgaggc ugauccucgu gcaauccaac cuaggaagcc 1260
gaaauauuug gccgagguug gucgaugguu caaaccguug gagcgaauca ucuacaagga 1320
ucucaguuug cguuuguacg gugauaacgc ugaaccuugc auugccaaag gcuuaaaugc 1380
auuggaauca ggggcuacgu ugagacguaa augggaaaag uucgcuaauc cuguuugugu 1440
uucauuggau gcuucucguu ucgaccugca cguaaguguu ggcuuguuaa aguucacgca 1500
uaaauuguac gacuauuacu gcaagucucc cacucuucaa cgauaucuca aauggacacu 1560
ccgcaacucc gguaucgccu ccuguaagga aaaaucauau gcguaugagg uugaaggccg 1620
uagaaugagu ggcgacaugg acaccgcauu aggcaacugu aucaucauga cgauauuaac 1680
uugguuuaug cuuagcgaac uuggcgugcg gcaugagcuu uucgauaaug gugaugauug 1740
uuuguucauu ugcgaagaaa aagacguacc uagccccgag acgaucauga acugguuugc 1800
ggauuuuggg uuugugguua gguuagaagg cgucgugucc guguuugagc gcauugaguu 1860
cugccaaaca ucgccuauau ggacugaucg agguuggcug auguguagaa acaucaaguc 1920
uuugaguaag gaucuuacga acguuaauuc gugcacuggc uccacuguug aauacaccca 1980
uugguugaaa gcaguuggaa aguguggauc ggugcucaau gcgggugugc cuauauuuca 2040
gucauuucac aacauguuga ugcgauuggg uacgaauucg cguauagauc gcgggguauu 2100
cuuuaggugu ggacuuguua aucucauucg ugggauggac agacaaccug aaguugagau 2160
cacuacuucc gcucgucuuu cuuuugaagu ggcauucggg aucacucccg gcaugcaauu 2220
ggcuauugag caauuuuaug acucagucgu gggcccucug gguaaaauaa aaucuguaaa 2280
auggccaaua gaucuaagaa aggaauacga uuacggaagc gcgugguucg aagaccaagg 2340
cguccuaggg ugaacaagga acucggauua ccgaugacac cuguucaaac uagaaugguu 2400
cggucaacgu ugaccaagga gaccaacaua ccuucuacug caaauagcgg ucgggaggcu 2460
guuugggcuu guuggccaau caacuuuagu gucuuuccgc aacuagccuc acucgugaau 2520
aaaccguuau acuggcgugu guccagugug caaguugcaa uggagccugc aaugucuucu 2580
uccacccaac auuguggugu uggucucagu ucuucugggg ccuucacaua acggugaugg 2640
guucgguaac gucuuuaagc ucuugcguuc uuguaacuau acgcggcgcu cucccguggg 2700
aggaaacgug auggucaaau ggccuaucug caugcccuuc auucuuaacg augaugcgca 2760
caagaacaca ggauuaaccg ccugugugau cauugcaguc accaauacug gugugcuaac 2820
uggucaaucu uggacggaga uucuguugaa uguggaguau acgccccgcu agcaucguac 2880
ugcucuccua ccggacuggu agccguuuag uuaucuugga gugauagcac uguggggcca 2940
cauuugacgc gcauuggacg cagacaaugu cccuccacag auuugugaau cucuauggag 3000
cuguaaccuc ggucucucua uagcuugucc gaacaggaaa uggacauaaa auaauugcug 3060
uuccaacacg uuguguuggu aaagaaguua uagauguggu gcgccagaca aguggauggc 3120
aaccuggagu aauccaggcg cucugggggg cuuauacucg gagugcauua cugcuuuaga 3180
ccguuaaucu caagaaccau gugugucgca uggggaggau uaacggcgcc caauucccuu 3240
guuaguuuag guacgccuug gucuucgaac cacgc 3275
<210> 22
<211> 2985
<212> RNA
<213> 无花果
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(2985)
<223> 无花果树iRNA的多核苷酸序列 ("iRNA 亲缘序列 3" 或
"iRNA r3")
<400> 22
gggguaaaua uggagaacca gcacacccau guuugcccac ggucguuccu gcgaaccugc 60
agggcgaucc ucgcggcucc agccaacuac ggucgugaug uggucaaaau cgccuacaaa 120
ugggcaucac gaaaccccgc caccgccccc cgaagugucc gagaauccau cggggucguu 180
gucggaagcg cuguggacuu cuugagcgcu ccucgcaagc guuuagaaga ccgcgcagag 240
caguuggugc aagacgaccg ggucgaccgg aucguccgcg agugggagcu aggaaccgcu 300
gacucccgaa uuccggaagu ugagugggca uaccgucugc gcgaccgcuu cggcgucgug 360
uccgccagcg agccugcuag gcaaacuggu gagagguggg ugcucaagca acuagaggga 420
uuggaggggg gggaguuccg cugcauaccc auugagccau ucuuugguga ugcaccggcc 480
cccguccaua gcccugggag caacagcgug auugcugcua uugcggcgac ccuuuggaug 540
acgccuaccc gccuugaccg ggcguugaga cgucaccagg guuuucgcaa cuagcgguga 600
ucggagucga cggagugucu gcuuuagcgg ugcaggcauc uucugaacuc cgaccgcuac 660
ggguugggcg accccgucaa agucgacguc guucgugguc ucugacuaug ccagcaccca 720
aguccuguuu cgugaaccac gcuaacucug accacaaucu caaaacgguc auggaaaaca 780
gggugcucaa guacaaaggc caagaacccg caaagccccg gguagaagcc uauaagcagc 840
ucuaugaaag gauacgaccg cgauaucguu cucuaccuga cacggucuau ccucuaucau 900
augauggcuu ccucaagugc uacuccggac guaggcgaac acgauacgaa caggccgucc 960
aggaguugag aaacgcgcca cucacacccg aagaugcugu cguuuccacg uucaucaaga 1020
acgagaaauu cgauuggcuc caaaagaaag aacuugcgga ucccagagcu auccaaccuc 1080
ggaaaccgaa auaccuggcc gaaguuggga ggugguucaa gccucuggag cacauaaugu 1140
auaaagacuu ggcaaaacgg uuguacgguc aggaugcguu gccuugcaua gcgaaagggc 1200
ugaacgcuag agaaacggcu gaagugcucc gagccaaaug ggacaaguuc gcuucucccg 1260
uuugcgucuc gcuggaugcc agucgguucg aucugcaugu aaguccugac gcauugcggu 1320
uuacgcaccg ccuguaccac aaguauugcc aaagucggca acuccgcaag uaccuagaau 1380
ggacgcugag aaacgcuggc gucgccucau guccugaaag cgcuuaucag uaugagguug 1440
aggggagacg caugaguggc gacauggaca ccgcacucgg caacugcgua cuuaugcucu 1500
gcuugacaug gaacuuccuc gaucaacaua acaucaagca ugagauaaug gacaacggag 1560
augacugcuu guucaucugu gaagcugccg augugccaac cgacaagcaa aucauggacu 1620
acuaccucga cuuuggguuc gugguucggu uggaaggaaa ggugucugug uucgagcgaa 1680
uagaguucug ucaaaccagu ccgguguuga cugcuaaugg auggcguaug guuagaaauu 1740
ugaaguccau ugcgaaggac cucugcaaug ugaacauggc gacuggguca cucagugaau 1800
acacugcgug gcuuaaagcc gugggaaucu gugguagaau ccugaacgau gggguuccaa 1860
ucuucuccgc cuuccacaac augcuggugc gacauggaac gaacucacga auagauagag 1920
cgguguucug ggaaugugga cugacaaacu ugaucaaagg caugaguuuc gagcaacugg 1980
aaaucacugu cgcugcgcgc gaguccuuuu aucuggcaua cgguaucaca ccggcgagac 2040
aacucgcgau ugaagaguau uacgacucac uccagggccc gguggguaaa auacaacuuc 2100
augaauggcc acuacaacuc aaagaggaau acgcgugcgg cgccgagugg uucgaaggag 2160
acggcgagcg ggcuugaggc ccgcuggcuu gcccuucgug cccggcagcu cucgcacggu 2220
ucggacugcg cucguccucg agaaccacuu gccgaugucc ucggcacagu ugggucaaga 2280
ggccguugcg uauucuaucc cgugcaaugu ucgaaacaug ccuacgaucc ugacucucgc 2340
caccacuccg cucuauuggc guaucaccgc caucacuguc gcgauggagc cugcaaaguc 2400
cacaucgacc caaauugccg guguggggaa ugcugauuca uuucagucug ccaccuacaa 2460
cgguuuuggg aacguguuua agaaaaugcg cgcuuugaau uucgugagac gcucggcgcc 2520
cggaggcaau cuucagguac gcuggccuau caauauggac uggaucuccg cauccgacac 2580
ggacaaggau agcacaaaag ugcccucgcu auucuuugcc gugaccaacc caggugugau 2640
cgaaaccaaa caaggggaca gugaggccug guuggaaugg gaguuggagc uggaguacau 2700
aguuggaggc uaggaacgac ugcccgcuug agaucgacuc ucccguggug agguaccacc 2760
cacucagcug ugucagccgg uuggagaaac ucuggugcga uagcacuguu ggccccugcc 2820
uagcgugugc ugugggaaag ccccaacaga uuugugaaac acuggaguug ucgacccgcg 2880
agacgugcgg cucgaguugu cgcuuccccg ugaggggggc ugccgggggg uagagaaaua 2940
uucccgguau uuauccgcua agaccuacgc gcgacgaaac uggcg 2985
<210> 23
<211> 4252
<212> RNA
<213> 豌豆耳突花叶病毒2 (PEMV2)
<400> 23
ggguauuuau agagaucagu augaacugug ucgcuaggau caagcggugg uucacaccug 60
acuucacccc uggcgagggc gugaagucua gagcucaacu ggaaagagag cuggauccca 120
ccugggcgcu ucucgugugc caagaacgag cgcgucguga ugcugacagu auugcuaaug 180
agugguacga gggcagcaug gagugcaacc uccuuauccc ucggcccaca accgaggaug 240
uauuuggccc cuccaucgcc ccugagccug uggcucuagu ggaggaaacu acccguuccc 300
gcgcgccgug cguggauguc ccugccgagg aguccuguaa gucagcggag auugauccug 360
uugaucucgc caaguucgac ucccuccauc gucgccuguu ggcugaagcc aacccuugca 420
gggaaauggu ucugugggug ccuccuggcc uaccagcaga gcgcgacguc cugcccaggg 480
cacguggggu gauaaugauc cccgaagucc cugccucugc acauaccuug uccgugaagg 540
uuauggaggc ugugcgguug gcacaggaag ucuuggcauc ccuugccaag agggccuuag 600
agaaaagguc uacaccaacc cuuaccgccc aggcccagcc agaggcuacc cugucggggu 660
gcgacuaccc guaucaggag acuggagcag cagccgcgug gauaacgccu ggcugcauug 720
ccauggagcu cagagccaaa uuuggcgucu gcaaacgcac ccccgcaaac uuagagaugg 780
ggagucgcgu cgcccgcgag cuccugcggg auaacugugu cacuugcagg gagaccacgu 840
gguacaccag ugccauugcu guggaccugu gguugacccc gaccgucguc gaccuggccu 900
guggccggcg agcggcggau uuuugguagg ggcugugcug ccucggcugg gggaagacac 960
cagugugcgg uuugacaacc ugcaccccag caucgaggua aucaaggcgg cuaggccccg 1020
cccaacccag aggaugucgu uccaaaucga cguugugcgu ccucuuggag auuuuggugu 1080
gcacaacaac ucccuuguua accuagccag gggaauuaau gaaagggugu ucuacacgga 1140
caaugcuagg acagaacccc uccagccuaa gguucccuuc cccucaucac gggagcuaaa 1200
aaccuucaga gucaccccuu ggaccaugga uaggguugug gagaguuaca caggguccca 1260
gcgcacucgc uaugcuaacg cgcgggacag cauauuaucc aacccucuga gucccaaaga 1320
ugcgcggguc aagacguuug ucaaagcuga aaagauaaau uucacagcca aaccugaccc 1380
cgccccucgu gugauacagc cuagggaucc acgauucaac auuguccugg cuaaauacau 1440
caagccuuug gagccaaugu uguacaaagc acuggggaaa cuuuacaagu accccgcagu 1500
ugcuaagggg uuuaacgcgg uugagacggg ggagaucauc gccggcaagu ggcggugcuu 1560
caaagauccu gucgucgugg gauuagacgc uucccgauuu gaucagcaug uaucugucga 1620
ggcguugcag uucacccacg cgguguacag aggguucauc aagucacggg aguuuaacaa 1680
ccuccuacag augauguaca ccaaccgugg ccuagggucc gcuaaggacg gauucguccg 1740
uuacaagguu aaagguagac gcaugagcgg ugacauggac accuccuugg gcaacugugu 1800
gcucauggug uugcucacca ggaaccuuug caagguucua ggcaucccgc acgagcucuu 1860
caacaauggu gaugauugca ucgucuuuuu cgaucguugc cacuuggaga aguucaacaa 1920
ugcugucaag acuuauuuug cggaccuagg guuuaagaug aagguggaac cgccgguuga 1980
cguguuggag aaaauagagu ucugccaaac gcagccuauc uaugacgggg agaaguggcg 2040
caccgugcgu ugcaucucga guaucggaaa agauugcuca uccguuauua guugggacca 2100
auuggagggg ugguggaaug ccaucgccca gaguggucug gcugugugug gcggaaugcc 2160
gauauacacg ucguucuacc gguggcuagc acgggccggu aagaguggga ccaaguguca 2220
gucacacccc uuguggaaaa acgagggguu gaauugguac aggaugggga uggaccuuuc 2280
ucaugagguu aauguuaccc cucaggcgcg ccugucuuuc uucgcggguu uugguauuuc 2340
ccccccgaug caggucgcca uugaggcgcu guaugacaag cugccuccac cgucccccca 2400
ccaugguccu ccgguuaagg cuguaacaca gcgaguguuc accaauuauu ucacgccgga 2460
aagcgccugu guuagcauga gcacgaauga agacaacaaa ucugacuuug cuguuuacgg 2520
cccugugccu acagugaugu cucuuugugc ucaguguuag gcucuuaaau uuuagcgaug 2580
gcgugacacg guuacacccu gaauugacag gguacagauc aagggaagcc ggggagucac 2640
caacccaccc ugaaucgaca gggcaaaaag ggaagccggg caccgcccac guggaaucga 2700
ccacgucacc uuuucgcguc gacuaugccg ucaacacccu uucggcccgc cagccuagga 2760
caauggcggu agggaaauau augacgauaa ucauuaaugu caauaacgac gagcgcaagc 2820
aaccagaagg agcuacuggc agcucuguac ggcgagguga caauaaaaga acucgaggaa 2880
acaaaccucg gagucaucac cccgguucgc gcgaacgaaa agguuacaau caccccucuc 2940
cuacccccaa aaacucaaag cagggucagc uccguacuga agcgguucag gagcacccga 3000
aacacggggg gacugcuuuc cguagagaaa guggugguag uguucacccc ucacaucccc 3060
gacgacgugc uaggagaggu ggagauaugg cuccacgaca gcauccuccc ccaccucggg 3120
agcgucggac caagacugaa acucaagcug agcgaagggc ccaagcucuu agcguucuac 3180
ccacccuacu cgauugcauu gggggacucg aucucgggcc agccgagguc cuucuccauu 3240
gucaccgagc uguucgaagg caacuucgca ccggggugca gcccauucag ccuguuccuc 3300
auguggaguc cacgcaucga agcagugacc cacaacuacu ugagucgucc accacgugcu 3360
cugccaauuu gcagaacgau ggugcgggac gcguuaucgg agguggcauc ccaacagcaa 3420
uaccugaagg gagcgauguc gaacagguau gccaugccuc ucacuacggg ugauggccag 3480
cauagagcca ugaagggggc ucccagugcc cuuccaccaa cgggggugug uacccaggcu 3540
ucuaagugag gcuucgcuuc ccgccggaag accgcggcgg uucuguuccu cccacaggag 3600
uacggcaaca acccaccuug ggaaaguggg gaccccagca cuaacuccuu uaacuaggcg 3660
ggcguguugg uuacaguagg aggggacagu gcgcaucgaa acugagcccc accacaacuc 3720
ucauccacgg ggugguuggg acgcaggugu cggagggauc gccagcccuc aggauaguga 3780
gcucccgcag agggauaagc uaucucccug cgacguagug guagaacacg ugggauaggg 3840
gaugaccuug ucgaccgguu aucggucccc ugcuccuucg agcuggcaag gcgcucacag 3900
guucuacacu gcuacuaaag uugguggugg augucucgcc caaaaagauc acaaacgcgc 3960
gggacaaggu cccuuccacc uucgccgggu aaggcuagag ucagcgcugc augacuauaa 4020
cuugcggccg auccaguugc acgacuggug gucccccuca gugucucggu ugucugccga 4080
gugggcggug gucggauucc accacacccu gccacgaggu gcguggagac uuggccaguc 4140
uaggcucguc guaauuaguu gcagcgacgu uaaucaaccc guccgggcau auaauaggac 4200
cgguugugcu ucuuccuccc uucuuagcca ggugguuacc ucccuggcgc cc 4252
<210> 24
<211> 313
<212> RNA
<213> 豌豆耳突花叶病毒 2 (PEMV2)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(313)
<223> PEMV2的基因间隔正区
<400> 24
guuagcauga gcacgaauga agacaacaaa ucugacuuug cuguuuacgg cccugugccu 60
acagugaugu cucuuugugc ucaguguuag gcucuuaaau uuuagcgaug gcgugacacg 120
guuacacccu gaauugacag gguacagauc aagggaagcc ggggagucac caacccaccc 180
ugaaucgaca gggcaaaaag ggaagccggg caccgcccac guggaaucga ccacgucacc 240
uuuucgcguc gacuaugccg ucaacacccu uucggcccgc cagccuagga caauggcggu 300
agggaaauau aug 313
<210> 25
<211> 139
<212> RNA
<213> 豌豆耳突花叶病毒 2 (PEMV2)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(139)
<223> PEMV2的重编码移码位点的多核苷酸序列
<400> 25
gaccgucguc gaccuggccu guggccggcg agcggcggau uuuugguagg ggcugugcug 60
ccucggcugg gggaagacac cagugugcgg uuugacaacc ugcaccccag caucgaggua 120
aucaaggcgg cuaggcccc 139
<210> 26
<211> 65
<212> DNA
<213> 拟南芥
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(65)
<223> 插入区域的序列
<400> 26
taggcctcga cacgggaagg tagctgtccc ggcactgggt tgcacatatt ccgtgccgac 60
gccac 65
<210> 27
<211> 43
<212> DNA
<213> 拟南芥
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(43)
<223> 插入序列区域
<400> 27
ccggcctcga cacgggaagg tagctattcc gtgccgacgc cgt 43
<210> 28
<400> 28
000
<210> 29
<400> 29
000
<210> 30
<211> 10
<212> RNA
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(10)
<223> 锁定和对接序列
<400> 30
guccuaaguc 10
<210> 31
<211> 14
<212> RNA
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(14)
<223> 锁定和对接序列
<400> 31
caggggaaac uuug 14
<210> 32
<211> 31
<212> RNA
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(31)
<223> 包含对接的四环的支架
<400> 32
cauuagcuaa ggaugaaagu cuaugcuaau g 31
<210> 33
<211> 57
<212> RNA
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(57)
<223> 锁定和对接序列
<400> 33
gcaccuaagg cgucaggguc uagacccugc ucaggggaaa cuuugucgcu auggugc 57
<210> 34
<211> 47
<212> RNA
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(47)
<223> 插入 CYVaV的序列
<400> 34
ggcuaguuaa ucucauucgu gggauggaca ggcagccuga cguugac 47
<210> 35
<211> 30
<212> RNA
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(30)
<223> CYVaV 插入的序列 (未修饰；U在位置 3、6、8、
14、17 和 29)
<400> 35
guuaauguag gugucuuucc guaucuaguc 30
<210> 36
<211> 30
<212> RNA
<213> 柑橘黄脉相关病毒 (CYVaV)
<220>
<221> 混合_特征
<222> (1)..(30)
<223> CYVaV插入的序列 (修饰的；G 在位置3、6、8、
14、17 和 29)
<400> 36
gucaacgcag gugccugucc guaucuagcc 30
<210> 37
<211> 66
<212> RNA
<213> 靶向GFP的多核苷酸序列
<400> 37
ugaagcggca cgacuucuuc aagagcgcca gaauucuggc gcucuugaag aagucgugcc 60
gcuuca 66
<210> 38
<211> 48
<212> RNA
<213> 靶向保守CTV序列的多核苷酸序列
<400> 38
uccguggacg ucauguguaa ggguacccuu acacaugacg uccacgga 48
<210> 39
<211> 21
<212> RNA
<213> 与CTV18序列互补的多核苷酸序列
<400> 39
cuuacacaug acguccacgg a 21
<210> 40
<211> 54
<212> RNA
<213> 靶向CTV的发夹的多核苷酸序列
<400> 40
ggaagugaug gacgaaauua augaccaauc auuaauuucg uccaucacuu ccag 54
<210> 41
<211> 24
<212> RNA
<213> 与CTV6和变体互补的多核苷酸序列
<400> 41
ucauuaauuu cguccaucac uucc 24
<210> 42
<211> 57
<212> RNA
<213> 锁定和对接1 (L&D1)的多核苷酸序列
<400> 42
gcgauaugga uucagggacu agucccugcu caggggaaac uuuguguccu aagucgc 57
<210> 43
<211> 77
<212> RNA
<213> 锁定和对接2 (L&D2)的多核苷酸序列
<400> 43
gcgauaugga ucaggacuag uccugucacc cucacuucgg uguccagggg aaacuuugug 60
ggugaguccu aagucgc 77
<210> 44
<211> 60
<212> DNA
<213> cDNA部分的多核苷酸序列
<400> 44
agttaatgta ggtgtctttc ctgaagcggc acgacttctt caagagcgcc agtatctagt 60
<210> 45
<211> 30
<212> DNA
<213> cDNA部分的多核苷酸序列
<400> 45
agttaatgta ggtgtctttc ctgaagcggc 30
<210> 46
<211> 11
<212> DNA
<213> cDNA部分的多核苷酸序列
<400> 46
cagtatctag t 11
<210> 47
<211> 120
<212> DNA
<213> cDNA部分的多核苷酸序列
<400> 47
agttaatgta ggtgtctttc cgcgatatgg attcagggac ttgaagcggc acgacttctt 60
caagagcgcc aagtccctgc tcaggggaaa ctttgtgtcc taagtcgcgt atctagtcac 120
<210> 48
<211> 120
<212> DNA
<213> 具有 L&D1和发夹插入物的cDNA部分的多核苷酸序列
<400> 48
agttaatgta ggtgtctttc cgcgatatgg attcagggac ttgaagcggc acgacttctt 60
caagagcgcc aagtccctgc tcaggggaaa ctttgtgtcc taagtcgcgt atctagtcac 120
<210> 49
<211> 30
<212> RNA
<213> 靶向GFP的发夹的多核苷酸序列
<400> 49
ugaagcggca cgacuucuuc aagagcgcca 30
<210> 50
<211> 52
<212> DNA
<213> cDNA部分的多核苷酸序列
<400> 50
tgatacctgt tcagaatagg attgctcgag cttcgttggt tagggtaact ca 52
<210> 51
<211> 59
<212> DNA
<213> cDNA部分的多核苷酸序列
<400> 51
gcgatatgga ttcagggact agtccctgct caggggaaac tttgtgtcct aagtcgcac 59
<210> 52
<400> 52
000
<210> 53
<211> 180
<212> DNA
<213> 具有锁定和对接构建体的cDNA部分的多核苷酸序列
<400> 53
aatagggtca ttggtttacc gatgatacct gttcagaata ggattgctcg agcttcgttg 60
gttagggtaa ctcacatacc ttcttccata gcgatatgga ttcagggact agtccctgct 120
caggggaaac tttgtgtcct aagtcgcact ggaaaaggtc gtgtgagcaa cctaaccagt 180
<210> 54
<211> 51
<212> DNA
<213> cDNA部分的多核苷酸序列
<400> 54
gatacctgtt cagaatagga ttgctcgagc ttcgttggtt agggtaactc a 51
<210> 55
<211> 89
<212> DNA
<213> cDNA部分的多核苷酸序列
<400> 55
gcgatatgga ttcagggact tgatgttgga tccatcctat gagccttttc agtccctgct 60
caggggaaac tttgtgtcct aagtcgcac 89
<210> 56
<211> 39
<212> DNA
<213> cDNA部分的多核苷酸序列
<400> 56
ctaaccagtt aatgtaggtg tctttccgta tctagtcac 39
<210> 57
<211> 110
<212> DNA
<213> 构建体部分的多核苷酸序列
<400> 57
aatagggtca ttggtttacc gatgatacct gttcagaata ggattgctcg agcttcgttg 60
gttagggtaa ctcacatacc ttcttccata gcgatatgga ttcagggact 110
<210> 58
<211> 100
<212> DNA
<213> 构建体部分的多核苷酸序列
<400> 58
agtccctgct caggggaaac tttgtgtcct aagtcgcact ggaaaaggtc gtgtgagcaa 60
cctaaccagt taatgtaggt gtctttccgt atctagtcac 100
<210> 59
<211> 30
<212> RNA
<213> 靶向胼胝体合酶的胼胝体合酶7 siRNA的多核苷酸序列
<400> 59
ugauguugga uccauccuau gagccuuuuc 30
<210> 60
<211> 52
<212> RNA
<213> 靶向CTV6的发夹的多核苷酸序列
<400> 60
ggaagugaug gacgaaauua augaccaauc auuaauuucg uccaucacuu cc 52
<210> 61
<211> 63
<212> RNA
<213> 锁定和对接3 (L&D3)的多核苷酸序列
<400> 61
gcggcgauau ggauucaggg acuagucccu gcucagggga aacuuugugu ccuaagucgc 60
cgc 63
<210> 62
<211> 89
<212> DNA
<213> 包含L&D1的 cDNA构建体的多核苷酸序列
<400> 62
tgtaggtgtc tttccgcgat atggattcag ggactagtcc ctgctcaggg gaaactttgt 60
gtcctaagtc gcgtatctag tcacgatgg 89
<210> 63
<211> 180
<212> DNA
<213> 具有L&D3的cDNA 构建体的多核苷酸序列
<400> 63
ttccataact ggaaaaggtc gtgtgagcaa cctaaccagt taatgtaggt gtctttccgc 60
ggcgatatgg attcagggac tagtccctgc tcaggggaaa ctttgtgtcc taagtcgccg 120
cgtatctagt cacgatggta agcaacccgt ttatctgtac ggcgctcacc cgtgggtaga 180
<210> 64
<211> 23
<212> RNA
<213> CYVaV部分的多核苷酸序列
<400> 64
cagaccuuug uuacuuccaa cac 23
<210> 65
<211> 29
<212> RNA
<213> CYVaV部分的多核苷酸序列
<400> 65
cuggauuucc uguguuuugg aaguggaag 29
<210> 66
<211> 21
<212> RNA
<213> CTV部分的多核苷酸序列
<400> 66
uccguggacg ucauguguaa g 21
<210> 67
<211> 24
<212> RNA
<213> CTV部分的多核苷酸序列
<400> 67
ggaagugaug gacgaaauua auga 24

Claims (38)

1.一种包含异源片段的核糖核酸(RNA)载体，其中所述异源片段通过支架结构连接至RNA载体。
2.如权利要求1所述的RNA载体，其是正义单链RNA载体。
3.如权利要求1或2所述的RNA载体，其中所述支架结构包括锁定和对接结构。
4.如权利要求1至3任一项所述的RNA载体，其中所述支架结构包括四环序列。
5.如权利要求4所述的RNA载体，其中所述四环序列是GNRA四环序列，如GAAA。
6.如权利要求1至5任一项所述的RNA载体，其中所述支架结构包括分支结构，其包括茎元件和连接至RNA载体的第一分支部分；和第二分支结构，其包括连接至所述异源片段的插入位点。
7.如权利要求1至6任一项所述的RNA载体，包括3'帽独立翻译增强子(3'CITE)，其包含SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的核酸序列。
8.如权利要求7所述的RNA载体，其中所述3'CITE包括SEQ ID NO:3的核酸序列。
9.如权利要求1至8任一项所述的RNA载体，其包括复制元件，所述复制元件包含一个或多个保守多核苷酸序列，所述保守多核苷酸序列具有SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ IDNO:12、SEQ IDNO:13和/或SEQ ID NO:14的核酸序列。
10.如权利要求9所述的RNA载体，其中所述复制元件进一步包含一个或多个保守多核苷酸序列，所述保守多核苷酸序列具有SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16的核酸序列。
11.如权利要求1至10任一项所述的RNA载体，其源自柑橘黄脉相关病毒(SEQ ID NO:1)或其iRNA亲缘序列。
12.如权利要求1至11任一项所述的RNA载体，其包含相对于相应的野生型RNA分子截断的发夹。
13.如权利要求12所述的RNA载体，其中所述支架连接至所述截断的发夹。
14.一种RNA载体，其包括相对于相应的野生型RNA分子截断的发夹，以及与所述截断的发夹相连的异源片段。
15.如权利要求14所述的RNA载体，其是正义单链RNA载体。
16.如权利要求14或15所述的RNA载体，其中所述异源片段是siRNA或其它对植物病原细菌有效的非编码RNA。
17.如权利要求16所述的RNA载体，其中所述siRNA靶向柑橘黄龙病菌物种。
18.如权利要求17所述的RNA载体，其中所述柑橘黄龙病菌物种是柑橘黄龙病菌亚洲种(CLas)。
19.如权利要求1至18任一项所述的RNA载体，其能够在宿主植物内进行全身和韧皮部限制的移动和复制。
20.如权利要求1至19任一项所述的RNA载体，源自柑橘黄脉相关病毒(CYVaV)，其具有SEQ ID NO:1的核酸序列。
21.如权利要求20所述的RNA载体，其包括位于基于CYVaV的RNA的位置2250、2301、2319、2330、2331、2336、2375和2083的一个或多个处的一个或多个所述异源片段。
22.一种源自柑橘黄脉相关病毒(CYVaV)的RNA载体，其具有SEQ IDNO:1的核酸序列，且包括位于其位置2250、2301、2319、2330、2331、2336、2375或2083处的异源片段。
23.如权利要求22所述的RNA载体，其中基于CYVaV的RNA包含稳定化的变化。
24.如权利要求23所述的RNA载体，其中基于CYVaV的RNA包含在3'UTR结构中将G:U对转换为G:C对的变化。
25.一种RNA载体，其包括异源片段，所述异源片段包含发夹，所述发夹在一侧具有与柑桔衰退病毒(CTV)中的序列互补的序列。
26.如权利要求25所述的RNA载体，其中CTV内的序列在多个CTV株中是保守的。
27.一种植物，其包括酸橙根茎和基于iRNA的载体，所述基于iRNA的载体包含靶向柑桔衰退病毒(CTV)的核酸的异源片段。
28.如权利要求27所述的植物，其中所述异源片段包含发夹，所述发夹在一侧具有与柑桔衰退病毒(CTV)内的序列互补的序列，任选的是在多个CTV株中保守的序列。
29.一种向宿主植物中引入异源片段的方法，其包括a)将RNA载体包装在CVEV的衣壳蛋白以外的衣壳蛋白中之后，向所述宿主植物引入基于RNA的载体；或b)在用柑橘黄单胞菌柑橘亚种(Xcc)接种农杆菌渗入位点后通过农杆菌渗入法向所述宿主植物引入基于RNA的载体。
30.一种制备核糖核酸(RNA)载体的方法，其包括稳定化亲本构建体的3'UTR结构，以及将一个或多个不稳定的异源片段插入稳定化的亲本构建体中。
31.一种制备基于RNA的载体的方法，其包括截断野生型RNA分子的发夹，从而形成插入位点，以及将异源片段连接至所述插入位点。
32.如权利要求31所述的方法，其中所述异源片段通过支架结构连接至截断的发夹。
33.一种基于iRNA的载体，其包括siRNA或其它对植物病原细菌有效的非编码RNA。
34.如权利要求33所述的基于iRNA的载体，其中所述siRNA靶向柑橘黄龙病菌物种。
35.如权利要求34所述的基于RNA的载体，其中所述柑橘黄龙病菌物种是柑橘黄龙病菌亚洲种(CLas)。
36.一种RNA载体，其包括核酸序列，所述核酸序列是根据权利要求30、31或32任一项所述的方法的产物。
37.一种RNA载体，其包括核酸序列，所述核酸序列与根据权利要求30、31或32任一项所述的方法的产物相同。
38.一种RNA载体，其包括核酸序列，所述核酸序列与根据权利要求30、31、32任一项所述的方法的产物本质上相同或实质上类似。
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