CN113302308A - 植物载体、组合物和与其相关的用途 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及适于将治疗剂，比如肽、蛋白质或小RNA引入宿主植物中的单链RNA载体。该载体不编码任何移动蛋白或外壳蛋白，但能够在宿主植物内进行系统的和韧皮部限制的移动和复制。

Description

植物载体、组合物和与其相关的用途
相关申请的交叉引用:
本申请基于2018年11月13日提交的题为“Vectors Useful for Treating PlantDiseases and Method of Using the Same”的美国临时专利申请序列号62/760,098，该申请通过引用将其整体并入本文，并要求其优先权。
序列表的参考:
本申请包括一个或多个根据37C.F.R.1.821et seq的序列表，其以计算机可读介质(文件名：2105_0071PCT_ST25，创建于2019年11月12日，大小为37,755字节)中公开，该文件通过引用将其整体并入本文。
关于联邦资助的研究和开发的声明:
本发明是在美国农业部(USDA)授予的拨款号AP17PPQS和T00C118以及美国国家科学基金会(NSF)授予的拨款号1411836的政府支持下完成的。美国政府对本发明享有一定的权利。
技术领域:
本公开内容涉及一种单链RNA载体，其适于将比如肽、蛋白质或小RNA的治疗剂引入宿主植物中，其中其移动基本上限于韧皮部并靶向控制或管理植物疾病或病况。
背景技术：
已经为动物(例如人)开发了通用的和高度靶向的抗微生物试剂，其循环系统提供了用于在整个动物中广泛应用的递送系统。相反，为非转基因植物开发通用或靶向治疗剂的研究要少得多，因为缺乏简化的循环系统会使整个宿主植物的递送复杂化。这在大而长寿的树(例如，柑桔)中尤其成问题，其中注射的抗微生物剂可能会被快速稀释。结果，除了外用杀虫剂外，几乎没有治疗系统性植物感染或病况的解决方案，例如在生长季节控制靶向插入物或其他载体，叶面施用以加强植物的整体健康，或昂贵的、短期的注射靶向病原体或载体的试剂。
特别令人担忧的是影响柑桔产业的疾病和病况。黄龙病(HLB)，又称柑桔绿色化，是全球最严重的柑桔疾病之一。HLB与三种细菌柑桔黄龙病菌(Candidatus Liberibacter)物种(亚洲种(asiaticus)、非洲种(africanus)和美洲种(americanus))相关并由两种木虱传播，即亚洲柑桔木虱(ACP)(Diaphorina citri，Kuwayama)和非洲柑桔木虱(Triozaerytreae，Del Guercio)。当含细菌的木虱以柑桔树为食并将致病细菌沉积到细菌繁殖的韧皮部时，HLB是嫁接可传播的并自然地扩散。一旦树被感染，就无法治愈。虽然患病的水果对人没有健康威胁，但HLB已经摧毁了全世界数百万英亩的柑桔作物。仅在美国，ACP和CL亚洲种(CLas)摧毁了佛罗里达柑桔产业，在很短的时间内造成了数十亿美元的作物损失。此外，HLB已经扩散到美国的每一个柑桔产区。大多数受感染的树在感染后几年内死亡，果实发育畸形和变味，因此不适合食用。根据美国农业部(USDA)的说法，整个柑桔产业都面临着巨大的风险。
植物生理学的考虑有助于开发和实施管理植物疾病和病况的策略。植物的维管系统是糖和氨基酸以及信号传导分子(如小核糖核酸(RNA)、蛋白质、肽和激素)的关键通道，它们是大量发育过程和对生物和非生物胁迫的应答所必需的(图1)(Lee,JY和Frank,M.(2018)，Plasmodesmata in phloem:different gateways for different cargoes,CurrOpin Plant Biol 43:119-124；Tugeon,R.和Wolf,S.(2009),Phloem Transport:CellularPathways and Molecular Trafficking,Ann Rev Plant Biol 60:207-221)。信使RNA(mRNA)包括这些信号传导分子的一部分，并且数以千计的伴细胞mRNA可以从相邻的去核筛管成分中分离出来，在那里它们通过渗透压产生的静水压力从来源(糖生成)组织下沉(糖利用)组织进行双向运输，例如根和芽尖(Folimonova,S.Y.和Tilsner,J.(2018),Hitchhikers,highway tools and roadworks:the interactions of plant viruseswith the phloem,Curr Opin Plant Biol 43:82-88；Ham,B.K.和Lucas,W.J.(2017),Phloem-Mobile RNAs as Systemic Signaling Agents,Annual Rev Plant Biol 68:173-195)。据信，多达50％的伴细胞转录组参与移动(Kim,G.et al.(2014),Genomic-scaleexchange of mRNA between a parasitic plant and its hosts,Science 345:808-811；Thieme,C.J.et al.(2015),Endogenous Arabidopsis messenger RNAs transported todistant tissues,Nature Plants 1(4):15025；Yang,Y.et al.(2015),Messenger RNAexchange between scions and rootstocks in grafted grapevines,BMC Plant Biol15,251)，其提出了关于如此大量的mRNA子集如何以及为何长距离移动的各种问题。例如，RNA移动过程的选择性如何？如果有选择，如何得到促进？转运RNA是否被修饰(例如，甲基化)？在离开并进入SE之前，是否在任何特定的亚细胞位置发现了转运RNA？是否有转运RNA的“邮政编码”？转运RNA是否与特定的蛋白质结合，并是否存在特定的相互作用序列？多少mRNA流具有生物学意义，并多少是非选择性的，因为库细胞(sink cell)可能能够转录相同的mRNA？
在mRNA移动文献中的困惑是普遍的。一些研究表明，RNA移动性的主要决定因素是它们在伴细胞(Kim,G.et al.(2014),Genomic-scale exchange of mRNA between aparasitic plant and its hosts,Science 345:808-811；Thieme,C.J.et al.(2015),Endogenous Arabidopsis messenger RNAs transported to distant tissues,NaturePlants 1(4):15025；Yang,Y.et al.(2015),Messenger RNA exchange between scionsand rootstocks in grafted grapevines,BMC Plant Biol 15,251)中的丰度。数学模型已用于提出用于mRNA移动的非选择性的布朗扩散模型，主要基于其丰度、半衰期和转录本长度也起作用(Calderwood,A.et al.(2016),Transcript Abundance Explains mRNAMobility Data in Arabidopsis thaliana,Plant Cell 28:610-615)。然而，其他研究得出了相反的结论，发现伴细胞中的mRNA丰度与移动无关(Xia,C.et al.(2018),Elucidation of the Mechanisms of Long-Distance mRNA Movement in a Nicotianabenthamiana/Tomato Heterograft System,Plant Physiol 177:745-758)。此外，虽然通常假设韧皮部不含靶向转运RNA的RNase(Morris,R.J.(2018),On the selectivity,specificity and signaling potential of the long-distance movement ofmessenger RNA,Curr Opin Plant Biol 43:1-7)，Xia等人还发现大多数移动的mRNA被降解，并永远不会到达根或上茎。其他研究发现，预测的tRNA样结构的存在与超过11％的可移动mRNA相关(Zhang,W.N.et al.(2016),tRNA-Related Sequences Trigger SystemicmRNA Transport in Plants,Plant Cell 28:1237-1249)，表明可移动mRNA可能携带特定的“邮政编码”。然而，包含类似tRNA样基序的其他丰富的mRNA是不可移动的(Xia,C.et al.(2018),Elucidation of the Mechanisms of Long-Distance mRNA Movement in aNicotiana benthamiana/Tomato Heterograft System,Plant Physiol 177:745-758)。因此，先前的研究未能鉴定和开发由高度丰富的可移动RNA组成的模型系统，其在不同细胞病况下的活组织中的移动是可追踪的。
植物病毒，其中许多作为核糖核蛋白复合物(vRNP)在植物中移动，已经进化为使用与内源性RNA移动所使用的相同途径。植物病毒可以大量积聚，并且大多数在表皮或叶肉细胞中引发感染，然后通过称为胞间连丝的高度选择性细胞间连接器在细胞间移动，从而使相邻细胞的细胞质之间保持连续性(图1；另见Lee,J.Y.and Frank,M.(2018),Plasmodesmata in phloem:different gateways for different cargoes,Curr OpinPlant Biol 43:119-124；Schoelz,J.E.et al.(2011),Intracellular transport ofplant viruses:finding the door out of the cell,Mol Plant 4:813-831)。长距离系统移动(叶到叶)要求病毒进入伴细胞，在那里进行复制，然后子代通过连接伴细胞和筛元件的专用的分支胞间连丝进入筛管成分。一旦到达管状筛管成分，病毒就会与韧皮部光同化流一起被动移动并在退出时建立系统感染(Folimonova,S.Y.and Tilsner,J.(2018),Hitchhikers,highway tolls and roadworks:the interactions of plant viruseswith the phloem,Curr Opin Plant Biol 43:82-88)。
对于作为vRNP穿过韧皮部的病毒，移动类似于宿主mRNA的移动。所有植物病毒都编码至少一种移动所必需的移动蛋白，该蛋白与病毒RNA结合并扩张胞间连丝。因此，宿主mRNA移动也可能需要类似的宿主-编码移动蛋白。移动蛋白是非特异性RNA结合蛋白。然而，关于vRNP如何加载到韧皮部和在远端组织中卸载的问题仍然存在，尽管可能需要重编程伴细胞基因表达(Collum,T.D.et al.(2016),Tobacco mosaic virus-directedreprogramming of auxin/indole acetic acid protein转录al responses enhancesvirus phloem loading,Proc Natl Acad Sci USA 113:E2740-E2749)。如果mRNA运输如此普遍和非特异性，那么RNA病毒为何需要它们自己的编码移动蛋白仍不清楚。一些研究人员提出，如果RNA病毒作为包括大RNA依赖性RNA聚合酶的预制复制复合物移动(Heinlein,M.(2015),Plant virus replication and movement,Virology 479:657-671)，则需要移动蛋白，这是超出伴细胞胞间连丝的尺寸排阻极限(～70kDa)。一些病毒为何以及如何受到韧皮部限制也仍然不清楚。例如，韧皮部限制的长线性病毒(Closteroviruses)至少有5种移动蛋白，并且韧皮部限制可以通过过度表达沉默抑制子和下调宿主防御来缓解(Folimonova,S.Y.and Tilsner,J.(2018),Hitchhikers,highway tolls and roadworks:the interactions of plant viruses with the phloem,Curr Opin Plant Biol 43:82-88)，表明韧皮部限制对于一些病毒来说是一个复杂的过程。韧皮部限制也可以是一个活跃的过程(与缺乏细胞间移动蛋白相反)。例如，改变马铃薯叶作用病毒移动蛋白的结构域赋予了离开韧皮部的能力(Bendix,C.,and Lewis,J.D.(2018),The enemy within:phloem-limited pathogens,Mo Plant Path 19:238-254)。
当解决了植物病毒移动蛋白的起源时，就建立了mRNA的宿主移动和vRNP移动之间的直接连接。发现与黄瓜花叶病毒移动蛋白相关的南瓜蛋白(RPB50)能够将其自身的mRNA以及其他mRNA传输至韧皮部(Xoconostle-Cazares,B.et al.(1999),Plant paralog toviral movement protein that potentiates transport of mRNA into the phloem,Science(New York,NY)283:94-98；Ham,B.K.et al.(2009),A polypyrimidine tractbinding protein,pumpkin RBP50,forms the basis of a phloem-mobileribonucleoprotein complex,Plant Cell 21:197-215)。这些内源性移动蛋白的复杂群体，称为非细胞自主蛋白(NCAP)，已被提议负责mRNA的长距离韧皮部运输(Gaupels,F.etal.(2008),Nitric oxide generation in Vicia faba phloem cells reveals them tobe sensitive detectors as well as possible systemic transducers of stresssignals,New Phytol 178:634-646；Gomez,G.et al.(2005),Identification oftranslocatable RNA-binding phloem proteins from melon,potential components ofthe long-distance RNA transport system,Plant J 41:107-116；Kim,M.et al.(2001),Developmental changes due to long-distance movement of a homeobox fusiontranscript in tomato,Science(New York,NY)293:287-289；Pallas,V.and Gomez,G.(2013),Phloem RNA-binding proteins as potential components of the long-distance RNA transport system,Front Plant Sci 4:130；Yoo,B.C.et al.(2004),Asystemic small RNA signaling system in plants,Plant Cell 16:1979-2000)。
自从他们的发现(Deom,C.M.et al.(1987),The 30-kilodalton gene productof tobacco mosaic virus potentiates virus movement,Science(New York,NY)237:389-394)，已经确定了许多病毒移动蛋白，它们负责将vRNP细胞内运输到胞间连丝，以及细胞间和长距离移动(Tilsner,J.(2014),Techniques for RNA in vivo imaging inplant,J Microscopy 258(1)：1-5)。对于一些病毒(例如，幽影病毒(umbraviruses))，细胞间和长距离移动与多种移动蛋白相关联(Ryabov,E.V.et al.(2001),Umbravirus-encodedproteins both stabilize heterologous viral RNA and mediate its systemicmovement in some plant species,Virology 288:391-400)。例如，柑桔衰退病毒(Citrustristeza virus)的长线性病毒含有三种移动蛋白。然而，对于大多数病毒，所有移动活性都被认为与单个移动蛋白有关。
使用病毒载体将工程化治疗剂递送到植物中以对抗疾病、昆虫或其他不利病况(例如，比如HLB和/或载体昆虫)是将诸如对病原体的抗性或其他期望特性等性状引入植物以用于研究目的的已建立方法。向植物提供载体的各种方法是本领域已知的。这通常是通过由根癌农杆菌介导的“农杆菌渗入”将病毒载体递送到植物细胞核中实现的，这可能导致该细胞基因组的修饰，或者通过将病毒载体直接递送到细胞的细胞质中，从而导致无需基因组修饰即可感染。在农杆菌渗入的情况下，病毒基因组的cDNA被引入T-DNA，然后提供给植物。这样的T-DNA包括允许基因组转录的另外的调节DNA组分。将DNA插入物附接至能够感染靶向植物的病毒cDNA载体上。如果病毒是RNA病毒，则病毒和插入物在植物细胞内转录成RNA，之后病毒会像正常的RNA病毒一样表现(扩增和移动)。因此，为了充当有效的载体，病毒应该被工程化为接受插入物而不破坏其功能，并确保工程化的病毒能够在宿主中系统性地积累到足以递送和在一些情况下表达插入物的水平。这些插入物，无论是将被翻译成蛋白质或RNA以发挥有益功能的开放阅读框(ORF)，都应以对宿主或者宿主或环境的任何下游消耗有效且足够无毒的方式递送到靶向组织中。然而，满足上述标准的病毒载体数量有限，并且仅适用于某些植物(例如烟草的烟草脆裂病毒)。不幸的是，对于大多数植物，尤其是长寿的树和藤蔓，没有已知的适当的病毒载体，或者只有次优的病毒载体。
因此，在广泛的基础上实施RNA或DNA疗法的能力基本上受到现有技术的限制。已在许多受多种病毒感染的植物中鉴定出超过1,000种植物病毒。例如，柑桔树受到柑桔叶斑病病毒、柑桔叶皱纹病毒、柑桔麻风病毒C、柑桔鳞病病毒、柑桔猝死相关病毒、柑桔衰退病毒(CTV)、柑桔杂色病毒、柑桔脉突病毒和柑桔黄色花叶病毒等。然而，CTV是柑桔类灾难性病害(如快速衰退和茎凹陷)的病原体，它是目前唯一被开发作为将试剂输送到柑桔韧皮部的载体的病毒。
CTV是长线性病毒的成员。它有弯曲的杆状病毒粒子，由两种外壳蛋白组成，尺寸为长2000nm，直径12nm。CTV(和其他长线性病毒)的基因组超过19kb，是已知最大的感染植物的RNA病毒。它是一种毒性病原体，负责杀伤全世界数百万棵柑桔树或使其变得无用，尽管工程化的载体的形式来自毒性较低的菌株，至少对于佛罗里达柑桔树而言(在加利福尼亚树中仍然具有高毒性)。先前的研究据称已证明基于CTV的载体可在植物细胞中表达工程化的插入物(US 8389804；US 20100017911A1)。然而，由于其在植物中积累并实现其靶向有益结果的能力不一致，因此尚未商业化。人们认为CTV无法复制到足够高的水平并热敏感性限制了它产生足够数量的RNA用于治疗的能力。
因此，基于CTV的载体在需要时递送有效有益载荷的能力非常有限。此外，CTV由于其庞大的尺寸而难以操作。CTV也受到超感染排除，其中基于CTV的载体无法感染已经感染CTV的树。CTV还可以通过几种蚜虫物种在植物之间高度可传播，调节剂不喜欢这种性质，因为调节剂担心不受控制地逃逸到环境中，在那里它可能会发生变异或以不良方式与其他宿主相互作用。此外，适合一个区域(例如佛罗里达州)的菌株不适合另一个区域(例如加利福尼亚州)的树品种。尽管存在这些问题，但CTV是唯一可用于柑桔树的病毒载体平台。
因此，需要一种感染剂，其解决一些或所有上述问题，并且能够将期望的特性引入植物中和/或将治疗剂递送到植物中，特别是长寿的植物，如树或藤蔓。
概述：
本公开涉及能够将外源插入物递送到植物中的新的感染剂，包括被所公开的试剂感染的植物的组合物以及与其相关的方法和用途。所公开的试剂在本文中有时被称为“独立可移动的RNA”或“iRNA”。尽管是感染性单链RNA，但iRNA不是病毒，因为它们不编码任何移动蛋白或RNA沉默抑制子，这是所有已知植物病毒的关键特征。此外，与几乎所有植物RNA病毒不同，除了幽影病毒(umbraviruses)外，iRNA也不编码外壳蛋白，用于将RNA包裹在病毒粒子中，这是病毒从植物到植物的载体移动所需要的。尽管缺乏移动蛋白表达，但iRNA能够在宿主植物的韧皮部内进行系统性移动。与病毒相比，iRNA具有另外有利的特性，例如：积聚到超过大多数已知植物病毒的水平的能力；相对较小的尺寸，例如，仅约为最小植物RNA病毒尺寸的三分之二，并因此与此类常规植物RNA病毒相比更易于操作；并且无法自行扩散到其他植物(鉴于它们无法编码任何外壳蛋白)。
根据公开的实施方式，感染剂包括含有工程化的插入物的基于iRNA的载体，其在植物中触发靶向肽、蛋白质的表达和/或产生靶向小RNA，这些小RNA从载体上切割下来用于有益应用。本公开内容的方面包括：基于iRNA的载体，用于递送靶向抗病原体剂；抗细菌酶抗生素，靶向感染植物的细菌或昆虫载体所需的细菌；由TEV IRES产生的酶抗生素；将siRNA并入iRNA基因组中；将插入物并入锁定和对接结构中，以稳定支撑插入物的支架的基础；从iRNA基因组中并入siRNA，该基因组经过修饰以增强局部区域的稳定性，以精确对抗插入物的不稳定效应；并入破坏或杀伤靶向昆虫载体的siRNA；并入缓解对树胼胝质产生的负面影响的siRNA；并入缓解植物对病原体识别的siRNA；以及并入触发特定植物性状(例如，矮小)的插入物。因此，与常规技术相比，本文公开的感染剂和组合物具有优势和有利的特性。
本公开内容的基于iRNA的载体适合用作表达各种蛋白质和/或将小RNA递送到柑桔和其他宿主植物的韧皮部中的通用平台。在一些实施方式中，提供了基于CYVaV的载体，其在伴细胞和韧皮部薄壁组织细胞中积累到大量水平。本公开内容的载体可用于检查在树的韧皮部中沉默特定基因表达的效果。此外，CYVaV可以开发成模型系统，用于检查mRNA通过筛管成分的长距离移动。由于CYVaV能够感染几乎所有品种的柑桔，在受感染的植物中几乎不会产生任何症状，因此可以很容易地检查木本植物中RNA的移动。
按照公开的实施方案，本公开内容涉及包括复制元件和异源区段的正义链单链核糖核酸(RNA)载体，其中所述RNA载体缺乏功能性外壳蛋白质开放阅读框(ORF)和功能性移动蛋白质ORF。在一些实施方式中，RNA载体包括包含SEQ ID NO：4和/或SEQ ID NO：5的核酸序列的3'帽独立翻译增强子(3'CITE)。在一些实施方式中，3'CITE包括SEQID NO:3的核酸序列。
在一些实施方案中，RNA载体的复制元件包括具有以下核酸序列的一个或多个保守的多核苷酸序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQID NO:12、SEQ ID NO：13和/或SEQID NO：14。在一些实施方式中，复制元件另外地或可替代地包括具有以下核酸序列的更保守的多核苷酸序列之一：SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16。
在一些实施方案中，RNA载体源自柑桔黄脉病毒(SEQ ID NO:1)或其iRNA亲属。本公开内容的RNA载体能够在宿主植物内进行系统的和韧皮部限制的移动和复制。本公开内容的RNA载体在其感染后至少一个月对于在宿主植物内的复制、移动和/或翻译在功能上是稳定的。
在一些实施方案中，本公开内容的RNA载体的异源区段包括编码至少一种多肽的多核苷酸，该多肽选自由下述组成的组中：报告分子、肽和蛋白质。在一些实施方式中，多肽为杀昆虫剂、抗细菌剂、抗病毒剂或抗真菌剂。在一些实施方式中，抗细菌剂是酶抗生素。在一些实施方式中，抗细菌剂靶向细菌柑桔黄龙病菌(Candidatus Liberibacter)物种，例如，柑桔黄龙病菌亚洲种(Candidatus Liberibacter asiaticus)(CLas)。
在一些实施方案中，本公开内容的RNA载体的异源区段包括小的非编码RNA分子和/或RNA干扰分子。在一些实施方式中，小的非编码RNA分子和/或RNA干扰分子靶向昆虫载体、病毒或真菌。在一些实施方式中，小的非编码RNA分子和/或RNA干扰分子靶向昆虫载体、病毒或所述真菌的核酸。在一些实施方式中，靶向病毒选自由下述组成的组中：柑桔脉突病毒(CVEV)和柑桔衰退病毒(CTV)。
应理解，RNA载体可以包括多个异源区段，每个提供相同或不同的功能。在一些实施方式中，异源区段是第一异源区段，其中RNA载体进一步包括第二异源区段，其中复制元件位于第一和第二异源区段之间。
在一些实施方案中，本公开内容的RNA载体的异源区段包括编码改变表型性状的蛋白质或肽的多核苷酸。在一些实施方式中，表型性状选自由下述组成的组中：杀虫剂耐受性、除草剂耐受性、昆虫抗性、减少的胼胝质产生、增加的生长速率和矮小。
本公开内容还涉及包括本公开内容的RNA载体的宿主植物。宿主植物可以是整个植物、植物器官、植物组织或植物细胞。在一些实施方式中，宿主植物属于选自由下述组成的组中的属：柑桔属、葡萄属、榕属和木犀属。在一些实施方式中，宿主植物为柑桔树或柑桔树嫁接物。
本公开内容还涉及包括用本公开内容的RNA载体感染的植物、植物器官、植物组织或植物细胞的组合物。在一些实施方式中，植物属于选自由下述组成的组中的属：柑桔属、葡萄属、榕属和木犀属。在一些实施方式中，植物为柑桔树或柑桔树嫁接物。
本公开内容还涉及将异源区段引入宿主植物中的方法，包括将本公开内容的RNA载体引入宿主植物。在一些实施方式中，将异源区段引入宿主植物中的步骤包括将包含本公开内容的RNA载体的植物的植物器官或植物组织嫁接到在所述引入之前不包含RNA载体的另一植物的植物器官或植物组织。本公开内容的RNA载体能够系统地感染宿主植物。
本公开内容还涉及在植物、植物器官、植物组织或植物细胞中产生异源区段的方法，包括将本公开内容的RNA载体引入所述植物、所述植物组织或所述植物细胞。在一些实施方式中，所述植物属于选自由下述组成的组中的属：柑桔属、葡萄属、榕属和木犀属。
本公开内容还涉及包括本公开内容的RNA载体的试剂盒。
本公开内容还涉及本公开内容的RNA载体用于将异源区段引入植物、植物器官、植物组织或植物细胞中的用途。本公开内容还涉及本公开内容的宿主植物的用途或本公开内容的组合物的用途，用于将RNA载体引入在所述引入之前不包含RNA载体的植物器官或植物组织中。在一些实施方式中，引入RNA载体的步骤包括将包含RNA载体的植物的植物器官或植物组织嫁接到不包含RNA载体的另一植物的植物器官或植物组织。
本公开内容还涉及一种制备用于植物的载体的方法，包括将一个或多个异源区段插入到RNA中的步骤，其中所述RNA选自由下述组成的组中：CYVaV；CYVaV的亲属；与CYVaV具有至少70％RdRp同一性的其他RNA载体；和另一种iRNA。本公开内容还涉及通过公开的方法产生的载体。
本公开内容还涉及RNA分子作为载体的用途，其中所述RNA选自由下述组成的组中：CYVaV；CYVaV的亲属；与CYVaV具有至少70％RdRp同一性的其他RNA载体；以及，另一种iRNA。在一些实施方式中，RNA用于治疗植物，例如治疗植物的病毒或细菌感染，例如治疗柑桔植物中的CTV感染或柑桔绿色化。RNA被一个或多个插入的异源区段，例如酶抗生素修饰。
本公开内容还涉及特征在于制备用于治疗植物疾病或病况的药物的RNA分子的用途，其中所述RNA选自由下述组成的组中：CYVaV；CYVaV的亲属；与CYVaV具有至少70％RdRp同一性的其他RNA载体；以及，另一种iRNA。在一些实施方式中，疾病或病况为植物的病毒或细菌感染，例如柑桔植物中的CTV或柑桔绿色化。
本公开内容还涉及用作药物或用于治疗植物的疾病或病况的RNA分子，其中所述RNA选自由下述组成的组中：CYVaV；CYVaV的亲属；与CYVaV具有至少70％RdRp同一性的其他RNA载体；以及，另一种iRNA。
附图说明：
图1示意性地说明了通过植物维管系统的移动途径(Lee,J.Y.and Frank,M.(2018),Plasmodesmata in phloem:different gateways for different cargoes,CurrOpin Plant Biol 43:119-124)。
图2为显示CYVaV与番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)中的一些病毒的相关性的系统发育树。
图3示意性地显示了CYVaV和类似RNA分子的基因组组织(图A)。编码参与复制的蛋白质的ORF以深灰色标识(PEMV2为p33和p94；CYVaV为p21和p81；PMeV2-ES为p35和p86；PUV为p31和p85；TBTVa为p29和p89)。幽影病毒PEMV2还具有编码参与移动的蛋白质p26和p27的ORF(在浅灰色框中标识)。还鉴定了移码核糖体记录位点(FS)和通读核糖体记录位点(RT)。显示了渗入的本氏烟草叶(图B，顶部)和系统性叶(图B，底部)中CYVaV正(+)链的水平。显示了在全长CYVaV和PEMV2的小麦胚芽提取物中通过体外移码合成的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的水平(图C)。与CYVaV产生的p81聚合酶相比，来自PEMV2的p94水平的差异是显著的。CYVaV的移码位点是病毒学中已知最强的位点之一，并据信是其异常高积聚的原因。
图4示意性地显示了在仙人掌、无花果树和埃塞俄比亚玉米中鉴定的CYVaV的其他iRNA和近亲的基因组组织。iRNA亲属在3'UTR和其他核苷酸变化中都有插入物，导致产生编码未知功能的蛋白质(p21.2)的ORF。
图5显示了来自本氏烟草(Nicotiana bethamiana)的农杆菌渗入叶的RNA水平。本氏烟草叶子中的CVEV(第1-2道)、CVEV+CYVaV(第3-5道)和CYVaV(第5-8道)。在假定的辅助病毒CVEV存在的情况下，CYVaV的积聚显著增加。正链如上所示。rRNA加载对照显示在下方。p14沉默抑制子在所有叶子中共同渗入。
图6显示了来自本氏烟草农杆菌渗入叶的另一个实验的RNA水平。CYVaV或CVEV或CYVaV+CVEV农杆菌渗入本氏烟草的叶子中。CYVaV被包裹在CVEV的病毒粒子中，一周后分离病毒粒子，并对包裹的RNA进行PCR分析。
图7显示了CYVaV(图A)和CYVaV+CVEV(图B)的泛黄症状，其仅限于香橼(citron)(如图)、柠檬和酸橙。
图8显示了CYVaV在本氏烟草中的系统的和韧皮部限制的移动，其中CYVaV被限制在植物的传输组织中。荧光原位杂交(FISH)成像检测CYVaV的正链被染成粉红色(此处一般用白色虚线和圆圈显示的区域)显示在图A-G中，包括叶柄(图A-D)和根组织(图E-G)的纵向和横截面视图。组织被DAPI染色。标识了伴细胞(CC)、韧皮部薄壁组织细胞(PPC)和筛管成分(SE)以及木质部(XL)。请注意，iRNA完全限于SE、CC和PPC。蓝色(此处显示为深灰色或黑色区域)来自内源性DNA的DAPI染色。CYVaV在几乎所有测试过的柑桔中都没有症状。
图9示意性地显示了CYVaV的全长二级结构，如通过与仙人掌、无花果和玉米中的CYVaV亲属的SHAPE结构探测和系统发育比较确定的。重新编码移码位点(见图10)由加单实线框区域标识，并且ISS样(I形结构)3'CITE(见图11)由加虚线框区域标识。例如，用于容纳插入的发夹的区域由加框的双线区域显示。
图10示意性地显示了CYVaV和PEMV2中的重新编码移码位点的结构(图A)。CYVaV在该区域具有多种结构构象(见图9)，仅显示了一种。滑点(slippery site)由加虚线框标识，终止密码子碱基在黑色圆圈中。由加框实线标识的碱基与3'末端参与(engage)长距离相互作用。
图11示意性地显示了CYVaV的ISS样3’帽独立翻译增强子(3’CITE)。显示了CYVaV的3'末端的结构。3'CITE示意性地显示在所示的最左侧部分并且碱基圈起来。由加框实线标识的序列参与与重新编码位点的长距离RNA:RNA相互作用。
图12示意性地显示了反式抑制测定法的结果。在存在10倍摩尔过量的截短形式的ISS(ISSS)或全尺寸ISS(ISSL)的情况下，在体外翻译全长CYVaV。
图13表明CYVaV不编码沉默抑制子。参考图A和B，本氏烟草16C植物用表达GFP的构建体(在这些植物中沉默)和表达CYVaVp21或p81的构建体，或者表达已知沉默抑制子p19(来自TBSV)或p38(来自TCV)的构建体进行农杆菌渗入。只有p19和p38抑制GFP的沉默，允许表达绿色荧光(图B中由圆圈虚线标识的渗入区域)。参考图C，用GFP寡核苷酸探测的northern印迹表明GFP RNA在p21或p81存在下仍然沉默。
图14表明了CYVaV在拟南芥原生质体中的复制。产生了CYVaV的感染性克隆。将野生型RNA转录本(CYVaV)或在重新编码滑点中含有突变的转录本接种到拟南芥原生质体上，所述突变消除了RdRp(CYVaV-fsm)的合成并因此不会复制。提取RNA并在30小时后进行Northern印迹。请注意，CYVaV-fsm的接种转录本在30小时后仍存在于原生质体中(而在传统病毒中，它们在4小时后检测不到)。正链显示在图A中，负链复制中间体显示在图B中。
图15表明了CYVaV在本氏烟草中的复制。参考图A，显示了通过Northern印迹确定的在本氏烟草的渗入的叶中积聚的CYVaV水平。参考图B，被CYVaV渗入的植物偶尔显示出系统症状(见图16)。这些植物积聚了高水平的CYVaV。参考图C，显示了系统感染植物的单个叶子中的CYVaV水平。叶4和5用CYVaV进行农杆菌渗入。注意CYVaV在最年轻的叶子中的大量积累。
图16显示了用CYVaV系统感染的本氏烟草的症状。叶4和5用CYVaV进行农杆菌渗入。系统感染的植物的第一个迹象是“杯状”叶(图A)，几乎总是第9片。在接下来的几周内，在植物的顶端分生组织和每个节上出现叶瘿(图B)。显示了相同年龄的未感染植物(图C，左)和受感染的植物(图C，右)。系统感染的植物也有根瘿(图D)，含有大量CYVaV，如Northern植物印迹(图E)所证明的。
图17为番茄植物在感染后53天(左)与同龄植物(右)的图像，并表明了CYVaV的特殊宿主范围。将系统感染的本氏烟草植物的汁液注入番茄植物的叶柄中。四株植物中的一株表现出非常强烈的症状，并且PCR分析结果显示CYVaV呈阳性。
图18表明CYVaV与从黄瓜韧皮部提取的高丰度的蛋白质结合。参考图A，标记的全长CYVaV在northwestern印迹中与突出的蛋白质结合。蛋白质在SDS凝胶电泳后复性。这种蛋白质被认为是一种已知的、高度保守的RNA结合蛋白，它包含RRM基序，已知该基序可以将伴细胞中的RNA作为伴侣蛋白到黄瓜韧皮部的筛管成分中。参照图B，当电泳后蛋白质保持变性时，未观察到结合。
图19表明CYVaV能够使用TEV IRES从其3'UTR表达额外的蛋白质。显示了烟草蚀刻病毒(TEV)内部核糖体进入位点(IRES)下游纳米荧光素酶的三个单独插入物(在三个单独构建体中)的位置(图A)。在小麦胚芽提取物中测量了三种构建体的体外翻译(图B)。请注意纳米荧光素酶蛋白(Nluc)的位置靠近凝胶底部。在体内原生质体中测量纳米荧光素酶的表达(图C)。构建体的全长RNA转录本(图A)被转化为原生质体；18小时后，提取总蛋白并在光度计中测量纳米荧光素酶活性。
图20阐释了位置2250处的稳定发夹插入物。CY2250sfPDS60的示意图示于图A中。插入物在CYVaV二级结构中的位置示于图B中，该位置对应于容纳插入的发夹的区域，如图9中的双线框所示。来自CYVaV-wt的T7转录本的小麦胚芽提取物体外翻译测定的数据，以及在位置2250处含有不同数量序列的CYVaV VIGS载体的数据显示在图C中。例如，构建体sfPDS60在植物中表现出卓越的系统移动。从被CYVaV wt和CYVaV VIGS载体感染的拟南芥原生质体中分离的总RNA的Northern印迹分析。CYVaV-GDD阴性对照显示在图D中。(+)代表正链，(-)是负链复制中间体。被CY2250sfPDS60感染的本氏烟草的图像显示在图E中。来自局部叶和系统叶的RT-PCR产物显示在图F中。引物组扩增CYVaV3'区域中的位置1963-2654。从系统叶收集的载体的插入区域(下划线)的序列显示在图G中，加虚线框的序列位于插入物的两侧之一，形成发夹的茎。
图21阐释了位置2301处的稳定发夹插入物。CY2301sfPDS60的示意图示于图A中。插入物在CYVaV的二级结构中的位置示于图B中，并且对应于用于容纳插入的发夹的区域，如图9中的双线框所示。来自CYVaV-wt的T7转录本的小麦胚芽提取物体外翻译测定的数据，以及在位置2301和2319处包含不同数量序列的CYVaV VIGS载体的数据显示在图C。例如，构建体PDS60在植物中表现出卓越的系统移动。从被CYVaV wt和CYVaV VIGS载体感染的拟南芥原生质体中分离的总RNA的Northern印迹分析。CYVaV-GDD和阴性对照。如图D所示。(+)代表正链，(-)是负链复制中间体。图E中显示了被CY2301sfPDS60感染的本氏烟草的图像。图F中显示了来自局部叶和系统叶的RT-PCR产物。引物组扩增了CYVaV的3'区域中的位置1963-2654。从系统叶收集的病毒载体插入区域的序列显示在图G中，加虚线框的序列形成发夹的茎。
图22阐释了位置2319处的稳定发夹插入物。CY2319sfPDS60的示意图示于图A中。CYVaV二级结构中插入物的位置如图B所示，对应于图9中双线框所示的容纳插入的发夹的区域。来自CYVaV-wt的T7转录本的小麦胚芽提取物体外翻译测定的数据，以及在位置2301和2319处包含不同数量序列的CYVaV VIGS载体的数据显示在图21的图C中。从被CYVaV wt和CYVaV VIGS载体感染的拟南芥原生质体中分离的总RNA的Northern印迹分析。CYVaV-GDD和阴性对照也显示在图21的图D中。CY2319sfPDS60感染的本氏烟草的图像显示在图C中。来自局部叶和系统叶的RT-PCR产物显示在图D中。引物组扩增在CYVaV的3'区域中的位置1963-2654。
图23阐释了60nt插入(非发夹)到CYVaV的RdRp的ORF上的位置(图A)。插入物的位置由黑色箭头指示。黑色六边形指示的终止密码子被设计在插入物的上游以截短RdRp。拟南芥原生质体中正链RNA水平的Northern印迹如图B所示。CYVaV-GDD是非复制对照。
图24阐释了用于稳定插入物基部的锁定和对接序列。参考图A，四环GNRA(GAAA)与其对接序列对接产生极其稳定的结构，并代表基本的锁定和对接序列。参考图B，显示了使用由对接四环组成的支架作为晶体学支架。参考图C，显示了独特的锁和对接结构。插入物(发夹或非发夹序列)可以添加到限制酶切位点(如虚线框所标识)。序列中带圆圈的碱基是GAAA四环的对接序列。
图25阐释了稳定局部3'UTR结构是非常有害的，但在附近插入不稳定插入物恢复活力。参考图A，CYVaV-wt的示意图。CYVaV-wt 3’stb是亲本稳定构建体，包含6nt变化，将G:U对转换为G:C对。在位置2319和2330处将60个核苷酸的两个插入物添加到稳定的亲本构建体中，形成CY2319PDS60_3'stb CY2330PDS60_3'stb。为稳定结构和产生CYVaV-wt 3’stb所做的核苷酸改变在图B中圈出。插入位点由每个构建体的箭头表示：图A中的左箭头表示构建体CY2319PDS60_3’stb的插入位点；图A中的右箭头表示构建体CY2330PDS60_3’stb的插入位点。参考图C，数据显示为来自图A所示构建体的T7转录本的小麦胚芽提取物体外翻译测定。注意p81水平(移码产物)受稳定该区域的强烈影响。参考图D，显示了从被CYVaV-wt、CYVaV-wt 3'stb、CY2319PDS60_3'stb、CY2330PDS60_3'stb和CYVaV-GDD(非复制对照)感染的拟南芥原生质体中分离的总RNA的Northern印迹分析。+)代表正链，(-)是负链复制中间体。
具体实施方式：
本公开内容涉及用作植物载体的新型感染剂，包括被公开的试剂感染的植物的组合物，以及与其相关的用途和方法。本公开内容的感染剂有时在本文中被称为“独立可移动的RNA”或“iRNA”并且与常规病毒载体相比展示出优异的特点。按照公开的实施方式，iRNA是能够感染植物并编码RNA聚合酶以维持其自身复制但缺乏编码任何移动蛋白或外壳蛋白的能力的RNA分子。此外，iRNA不编码任何RNA沉默抑制子。
如本文所用，“宿主”是指能够被核酸感染并能够复制核酸的细胞、组织或生物体。宿主可包括整个植物、植物器官、植物组织、植物原生质体和植物细胞。植物器官是指植物的独特且明显分化的部分，例如根、茎、叶、种子、嫁接物或接穗。植物组织是指植物的整个或部分组织。原生质体是指没有细胞壁的分离细胞，具有再生成细胞培养物、组织或整个植物的能力。植物细胞是指植物的结构和生理单位，由原生质体和细胞壁组成。
如本文所用，“核酸序列”、“多核苷酸”、“核苷酸”和“寡核苷酸”可互换使用并且指任何长度的核苷酸的聚合形式。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何功能。“基因”是指含有至少一种能够编码特定多肽序列的开放阅读框的多核苷酸。“表达”是指多核苷酸转录成mRNA的过程和/或转录的mRNA翻译成肽、多肽或蛋白质的过程。
“源自”特定分子的载体意思是该载体含有来自该分子的遗传元件或序列部分。在一些实施方式中，载体包括来自此类分子(例如，iRNA)的复制酶开放阅读框(ORF)。一个或多个异源区段可以作为附加序列添加到本公开内容的载体中。在一些实施方式中，添加所述异源区段以实现高水平表达(例如，特定蛋白质或小RNA的)。所得载体能够通过使用RNA载体作为模板的RNA依赖性RNA聚合形成进一步的RNA载体分子，从而在植物细胞中复制。iRNA载体可由其来源的RNA分子(例如CYVaV)构建。
如本文所用，“感染”或“能够感染”包括载体将其核酸转移或引入宿主，使得核酸或其部分被复制和/或蛋白质或其他试剂在宿主中合成或递送的能力。感染还包括选择的核酸序列整合到靶向宿主基因组中的能力。
如本文所用，“表型性状”是指由一个或多个基因的表达或抑制引起的可观察的、可测量的或可检测的特点或性质。表型包括可观察的性状以及生物化学方法。
如本文所用，“内源的”是指由宿主表达的多肽、核酸或基因。“异源的”是指不是由宿主天然表达的多肽、核酸或基因。“功能性异源ORF”是指不存在于相应未修饰或天然分子中并且可以表达以产生特定试剂例如肽、蛋白质或小RNA的开放阅读框(ORF)。为了可在植物、植物组织或植物细胞中从载体表达，包括功能性异源ORF的载体包括一个或多个亚基因组启动子或表达所需的其他序列。
本领域已知用于确定特定产物的表达的各种测定，包括但不限于：杂交试验(例如Northern印迹分析)、扩增程序(例如RT-PCR)和基于阵列的技术。还可以使用本领域已知的用于检查蛋白质产物的技术来确定表达，包括但不限于：放射免疫测定、ELISA(酶联免疫放射测定)、夹心免疫测定、免疫放射测定、原位免疫测定、蛋白质印迹分析、免疫沉淀试验、免疫荧光测定、GC-质谱和SDS-PAGE。
“外源RNA区段”是指插入天然分子中的RNA区段，由此外源RNA区段的来源不同于天然分子。来源可以是其他病毒、活生物体例如植物、动物、细菌、病毒或真菌、化学合成材料或其组合。外源RNA区段可以提供适用于特定应用的任何功能，包括但不限于：非编码功能RNA，其中RNA充当信使RNA编码由宿主细胞翻译的序列的编码功能，导致具有有用或期望特性的肽(例如，包括约2至50个氨基酸的分子)或蛋白质(例如，包括50个或更多个氨基酸的分子)的合成。
如本文所用，“移动蛋白质”是指细胞到细胞和/或长距离移动所需的蛋白质。“外壳蛋白”是指包括或构建病毒外壳的蛋白质。
类似于幽影病毒(umbraviruses)，iRNA不具有功能性外壳蛋白ORF和/或以其他方式编码任何外壳蛋白。此外，iRNA的RNA聚合酶类似于幽影病毒。然而，与幽影病毒不同，iRNA不具有功能性移动蛋白ORF和/或以其他方式编码任何细胞间移动蛋白或任何长距离移动蛋白作为稳定蛋白用于对抗无义介导的衰退。
缺乏外壳蛋白的常规病毒在植物细胞内通常不太稳定，因为它们的基因组易受宿主RNA沉默防御系统的影响。然而，iRNA在细胞内环境中出奇地稳定，这是有效载体的一个重要特点。在没有特定辅助病毒的情况下，iRNA也仅限于接种的宿主植物，因为没有相关的病毒粒子，它们不能被昆虫载体传播。据信，只有在存在特定辅助病毒时，iRNA才会被包裹在病毒粒子中，例如，包括柑桔脉突病毒(CVEV)，这是一种在美国很少见的病毒。
在公开的实施方案中，提供了包括复制元件和异源区段的重组正义单链RNA载体。本公开内容的RNA载体能够在韧皮部中积聚到高水平，并且能够将治疗剂例如蛋白质、肽、抗细菌剂和/或杀昆虫剂(例如siRNAs)直接递送到植物组织。在某些实施方式中，RNA载体源自缺乏编码任何外壳蛋白或移动蛋白的能力的iRNA分子。例如，载体源自和/或包括被称为柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)的iRNA分子的结构元件，CYVaV是与柑桔黄脉病相关的未分类分子。
因此，公开的实施方式提供了使用来自iRNA分子例如CYVaV的遗传组分构建在正义链单链RNA分子上或衍生自正链单链RNA分子的基于iRNA的载体。另外，本公开内容涉及包括基于iRNA(例如基于CYVaV)的载体的试剂盒和/或混合物。这种混合物可以是固体形式，例如干燥或冷冻干燥的固体，或者是液体，例如作为水溶液、悬浮液或分散液，或作为凝胶。此类混合物可用于感染植物、植物组织或植物细胞。此类试剂盒和混合物可用于用本公开内容的基于iRNA的载体成功感染植物或植物细胞和/或用于表达异源蛋白质或将其他治疗剂递送至此类植物或植物细胞。
本公开内容还涉及包括如本文公开的所述基于iRNA的载体的植物、植物组织或植物细胞，和/或包括由所述载体编码或递送的治疗剂或异源多肽的植物、植物组织或植物细胞。本公开还提供了从植物、植物组织或植物细胞中分离这种异源多肽的方法。从植物、植物组织或植物细胞中分离蛋白质的方法是本领域普通技术人员众所周知的。
CYVaV在1950年代的四棵酸橙树中被发现，与任何辅助病毒无关(Weathers,L.(1957),A vein-yellowing disease of citrus caused by a graft-transmissiblevirus,Plant Disease Reporter 41:741-742；Weathers,L.G.(1960),Yellow-veindisease of citrus and studies of interactions between yellow-vein and otherviruses of citrus,Virology 11:753-764；Weathers,L.G.(1963),Use of synergy inidentification of strain of Citrus yellow vein virus,Nature 200:812-813)，几年后，Georgios Vidalakis(加州大学戴维斯分校；GenBank：JX101610)对CYVaV进行了进一步的分析和测序。Vidalakis博士的实验室对从先前建立的树来源收集的样本进行了分析(Weathers,L.G.(1963),Use of synergy in identification of strain of Citrusyellow vein virus,Nature 200:812-813)并维持在柑桔克隆保护程序(CCPP)的疾病库中。Vidalakis实验室对CYVaV进行表征的研究尚无定论。然而，许多含有CYVaV的感染样本也含有突起镶嵌病毒属(enamovirus)柑桔脉突病毒(CVEV)；在1950年代到1980年代，CCPP人员将感染植物与黄脉和叶脉形成混合以增强症状的情况相对普遍。
CYVaV为小(～2.7kb)iRNA分子，由RNA的单个正义链组成。它复制到极高的水平，非常稳定，仅限于韧皮部，并且没有已知的自然扩散机制。正因如此，CYVaV是理想的载体平台，用于将试剂引入植物宿主，例如小RNA(例如长度约50至约250nt的非编码RNA分子)和/或用于疾病和/或害虫管理的蛋白质。加强(或沉默)防御的蛋白质、靶向细菌的抗微生物肽和/或靶向植物基因表达的小RNA或疾病病原体的昆虫载体的产生提供了有效的管理策略。为了有效、蛋白质和小RNA应该以足够的量产生并在韧皮部中积累到足够的水平，特别是设计为被靶向昆虫或真菌病原体吸收的小RNA。
CYVaV只能通过嫁接在树与树之间传播，但已显示感染几乎所有柑桔品种，除了香橙，包括但不限于感染香橼、粗柠檬、加利蒙地亚橘、甜橙、酸橙、葡萄柚、朗布尔和西印度酸橙、柠檬、柑桔品种、桔柚品种和金桔。它使指示香橼树的叶脉泛黄，并且在甜橙和其他柑桔中没有或非常轻微的黄脉症状，没有报告对水果质量产生影响，或以其他方式对树造成伤害。
CYVaV的多核苷酸序列(碱基1至2692)如下(SEQ ID NO:1)：
Figure BDA0003153558490000211
Figure BDA0003153558490000221
CYVaV与其他病毒(包括番茄丛矮病毒科病毒)的相关性如图2所示。CYVaV和类似RNA分子的基因组组织如图3中的图A所示，包括PEMV2、PMeV2-ES(GenBank：KT921785)、PUV(GenBank：KP165407.1)和TBTVa(GenBank：EF529625.1)。CYVaV的RdRp与幽影病毒豌豆耳突花叶病毒RNA2(PEMV2)的关系最为密切。检查CYVaV的5'和3'序列显示与幽影病毒的序列相当相似，确认CYVaV确实是一种完整的感染剂。CYVaV有正义链单链RNA基因组，它只编码两种参与复制的蛋白质：p21，相关分子中的复制酶相关蛋白；和p81，依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)，由核糖体重新编码(移码)事件合成(图3，图A)。显示了PEMV2和CYVaV的通过体外移码合成的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的水平。与来自CYVaV的p81相比，来自PEMV2的p94(RdRp)水平的差异是显著的(图3，图C)。CYVaV的移码位点是病毒学中已知最强的位点之一，据信是其异常高积聚的原因。
CYVaV 3'末端的多核苷酸序列(碱基2468至2692)如下所示(SEQ ID NO:2)：
Figure BDA0003153558490000222
CYVaV(碱基2468至2551)的3'帽独立翻译增强子(3'CITE)的多核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO:3):
Figure BDA0003153558490000223
CYVaV的3'末端(和3'CITE)包括以下保守的多核苷酸序列(上面加粗和下划线)：
auagcacug(SEQ ID NO：4)；和/或
gauuuguga(SEQ ID NO：5)。
编码蛋白质p21(碱基9至578)的CYVaV的多核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO:6):
Figure BDA0003153558490000224
Figure BDA0003153558490000231
蛋白质p21的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO:7):MDPSSLPRACWHHARQVFRASTSFSREVVRAARRWVTMPTSRHAYDFSTSLGIVIAEPAARLRRRLPSVRKCAEKLVVHKQVDTLVDEWCSGIPNPDIVEVGWALRLRDRFGLPPASEPTRLSGERWVLKQLNGVDPESWNADLGRSVHIQGDYAPGRNAHIAQVAATLWLTRTLHDKALARHQGFRDLQ
编码蛋白质p81(碱基752至2158)的CYVaV的多核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO:8):
Figure BDA0003153558490000232
蛋白质p81的氨基酸序列如下所示(SEQ ID NO:9):
MTTRVLQYKGRDPILPSSEALHRLNLRIAELYRSRPSTVYPLSYEGFLNCYEGRQRTRYAQAVEQLMRSTLEPKDARVETFIKNEKFDWALKGEEADPRAIQPRKPKYLAEVGRWFKPLERIIYKDLSKRLYGEGAEPCIAKGLNALESGATLRRKWEKFSSPVCVSLDASRFDLHVSVGMLKFTHKLYDYYCKSPTLQRYLKWTLRNHGVASCKELSYEYEVVGRRMSGDMDTALGNCVIMSILTWFMLSELGIKHELFDNGDDCLFICESHDVPSPEVITNWFSDFGFVVRLEGVTSVFERIEFCQTSPVWTERGWLMCRNIKSLSKDLTNVNSCTGSTIEYTHWLKAVGKCGSILNAGVPIFQSFHNMLERLGTNSRIDRGVFFKSGLVNLIRGMDRQPDVDITTSARLSFEVAFGITPGMQLAIERYYDSVMGSLSKIETTKWPIELRKEYEHGSEWYEDLGVLG
CYVaV的复制元件(例如，编码蛋白质p81的复制元件)包括以下保守的多核苷酸序列(如上突出显示并加下划线的)：
cguuc(SEQ ID NO：10)；
gaacg(SEQ ID NO：11)；
gguuca(SEQ ID NO：12)；
ggag(SEQ ID NO：13)；和/或
aaauggga(SEQ ID NO：14)。
另外，CYVaV还可以另外包括以下保守的多核苷酸序列(如上突出显示并加下划线的)：
ucgacg(SEQ ID NO：15)；和/或
cuccga(SEQ ID NO：16)。
CYVaV的重新编码移码位点的多核苷酸序列(也参见图10)如下所示：
ucgcucaggucgcggcgaccuugugguuaacuaggaccuugcaugacaaggccuuggcucgccaccaggguuuucgcgauuugcagugauuggggucgacgggcuagaggcaaaagcagugccucuagcuucuggacuccgacugcuuccgguuccgcgacccgga(SEQ ID NO:17)
caaagucgacgacugucucagaccu(SEQ ID NO:18)
aggucuuggacagucugcgggcuugggaacgacg(SEQ ID NO:19)
在仙人掌(GenBank:MH579715)、无花果树和埃塞俄比亚玉米(图4)中也发现了高度类似的iRNA，表明本文公开的RNA载体的宿主范围异常大或甚至可能是无限的。
在无花果树中鉴定的类似iRNA(有时在本文中称为“iRNA亲属1”或“iRNA rl”)的多核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO:20):
Figure BDA0003153558490000241
Figure BDA0003153558490000251
Figure BDA0003153558490000261
在另一棵无花果树中鉴定的iRNA(有时在本文中称为“iRNA亲属2”或“iRNA r2”)的多核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO:21):
Figure BDA0003153558490000262
Figure BDA0003153558490000271
在玉米中鉴定的iRNA(有时在本文中称为“iRNA亲属3”或“iRNAr3”)的多核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO:22):
Figure BDA0003153558490000272
Figure BDA0003153558490000281
注意，iRNA亲属(例如，iRNA rl、iRNA r2和iRNA r3)可包括保守的多核苷酸序列(如上加粗和下划线的)：auagcacug(SEQ ID NO:4)；和/或gauuuguga(SEQ ID NO:5)。例如，iRNA分子包括两个保守的多核苷酸序列：auagcacug(SEQ ID NO：4)；和gauuuguga(SEQ IDNO:5)。
另外，iRNA亲属(例如，iRNA r1、iRNA r2和iRNA r3)可以包括保守的多核苷酸序列(如上加粗和下划线的)：cguuc(SEQ ID NO：10)；gaacg(SEQ ID NO:11)；gguuca(SEQ IDNO:12)；ggag(SEQ ID NO:13)；和/或aaauggga(SEQ ID NO:14)。例如，iRNA分子包括所有保守的多核苷酸序列：cguuc(SEQ ID NO：10)；gaacg(SEQ ID NO:11)；gguuca(SEQ ID NO:12)；ggag(SEQ ID NO:13)；和aaauggga(SEQ ID NO:14)。
此外，iRNA亲属(例如，iRNA rl、iRNA r2和iRNA r3)可包括保守的多核苷酸序列(如上加粗和下划线的)：ucgacg(SEQ ID NO:15)；和/或cuccga(SEQ ID NO:16)。iRNA分子可以包括两个保守的多核苷酸序列：ucgacg(SEQ ID NO：15)；和cuccga(SEQ ID NO:16)。在一些实施方式中，iRNA分子与CYVaV(或iRNA r1、iRNA r2或iRNA r3)高度相关，并且包括与其合成RdRp的再编码位点具有70％或更多同一性的多核苷酸序列，例如，CYVaV(或iRNAr1、iRNA r2或iRNA r3)的RdRp的75％或85％或90％或95％或98％同一性。
因此，根据公开的实施方式，RNA载体(例如，源自iRNA分子)包括用于合成RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的移码核糖体重新编码位点。此外，RNA载体可包括包含以三个胞苷酸(…CCC)终止的多核苷酸序列的3'末端。倒数第二个3'末端发夹也可能在末端环(...GGG...)中包含三个鸟苷酸。此外，3'CITE包括与真核翻译起始因子4G(eIF4G)和/或真核起始因子4F(eIF4F)结合的扩展发夹或其部分。
在某些实施方式中，RNA载体包括包含保守序列auagcacug(SEQID NO:4)和gauuuguga(SEQ ID NO:5)的3'CITE。RNA载体还可以包括一种或多种以下多核苷酸序列(已鉴定的iRNA分子的保守序列)：cguuc(SEQ ID NO：10)和gaacg(SEQ ID NO：11)；和/或gguuca(SEQ ID NO:12)和ggag(SEQ ID NO:13)；和/或aaauggga(SEQ ID NO:14)。可替代地，或另外，RNA载体可包括以下多核苷酸序列(经鉴定的iRNA分子的保守序列)中的一或两种：ucgacg(SEQ ID NO：15)和cuccga(SEQ ID NO：16)。
已鉴定的iRNA亲属都具有在3'UTR中的插入物和其他核苷酸改变，导致产生编码未知功能蛋白质(p21.2)的ORF。iRNA(例如CYVaV)与任何植物病毒的一个不同特点(图2)是iRNA不编码任何移动蛋白，这是包括幽影病毒在内的所有已知植物病毒的特点。CYVaV等iRNA也不需要任何辅助病毒在植物中进行系统移动，包括经过测试的柑桔和本氏烟草(一种实验室模型植物)。
相反，PEMV2与所有幽影病毒一样，编码两种移动蛋白：p26(长距离移动)和p27(细胞间移动)(图3，图A)。p26也是一种稳定蛋白，可保护基因组免受无义介导的衰退，并且是单细胞原生质体中可检测水平的PEMV2积聚所必需的(Gao,F.and Simon,A.E.(2017),Differential use of 3'CITEs by the subgenomic RNA of Pea enation mosaicvirus2,Virology 510:194-2044)。幽影病毒是不寻常的病毒，因为它们不编码外壳蛋白或RNA沉默抑制子，而是依靠辅助病毒来实现这些功能。对于PEMV2，辅助病毒是肠病毒PEMV1。
PEMV2的多核苷酸序列如下所示(SEQ ID NO:23):
Figure BDA0003153558490000301
Figure BDA0003153558490000311
PEMV2的基因间正区的多核苷酸序列(如上加粗和下划线的)如下所示(SEQ IDNO:24)：
Figure BDA0003153558490000312
PEMV2的重新编码移码位点的多核苷酸序列(碱基881至1019；也参见图10)如下所示(SEQ ID NO:25):
gaccgucgucgaccuggccuguggccggcgagcggcggauuuuugguaggggcugugcugccucggcugggggaagacaccagugugcgguuugacaaccugcaccccagcaucgagguaaucaaggcggcuaggcccc
CYVaV出乎意料地在拟南芥原生质体中非常有效地复制，尽管不编码p26(或任何其他移动蛋白)，p26是PEMV2积聚所必需的，因为它也具有对抗NMD的能力。的确，CYVaV异常稳定，比大多数传统病毒稳定得多。CYVaV还在小麦胚芽提取物中产生了惊人的高水平p81，比来自PEMV2的p94直向同源物至少50倍高(图3，图C)。当CYVaV被农杆菌渗入到本氏烟草的叶子中时，它在渗入组织中复制，但积累相对较弱(图3，图B，顶部；图5，第6-8道)。手动接种未实现复制。然而，当CYVaV与突起镶嵌病毒属柑桔脉突病毒(CVEV)共同渗入时，这些细胞中的积聚显著改善(图5，第3-5道；也参见图6)。然而，CYVaV+CVEV的泛黄症状(图7，图B)与单独的CYVaV展示出的症状(图7，图A)相比更加明显。
CYVaV与测试的柑桔病毒的任何其他组合没有协同作用。另外，其他研究显示，CVEV可用作CYVaV的辅助病毒，以便在树间传播。CVEV可能是原始柠檬树中存在CYVaV的原因；然而，众所周知，CVEV对热非常敏感，因此很可能在炎热的夏季从来檬金柑(limequet)树中流失。
CYVaV偶尔移动到上部未接种的叶子中并以极高水平积聚，有时通过凝胶上的乙锭染色可见。主要螺旋的第九片叶片开始出现的症状包括发育迟缓、缩叶病和花组织变形。大约在相同时间，腋茎中的叶子也开始出现类似的症状。这一惊人的结果表明，CYVaV在没有任何编码移动蛋白的情况下进行系统移动，这是通过传统植物病毒无法实现的。实验显示，CYVaV在本氏烟草中系统移动，并严格限制在韧皮部，仅在伴细胞和韧皮部薄壁细胞中复制。在柑桔中，CYVaV是100％嫁接可传播的，但很难以其他形式传播。
有症状的叶组织和根的荧光原位杂交(FISH)确认CYVaV局限于韧皮部薄壁组织细胞、伴细胞和筛管成分(图8，图A-G)，这是韧皮部限制性病毒的特点。CYVaV水平在有症状组织的叶柄中极高，有时在总RNA的乙锭染色凝胶中可见。尽管本氏烟草的症状更严重，但已发现CYVaV在所有测试的柑桔品种中几乎没有症状。的确，最严重的症状是在柑桔病毒的指示树香橼上发现的，包括散射在整棵树上的叶子上非常小的金色斑点。
CYVaV的韧皮部限制移动解释了为什么它是易于嫁接可传播的，但不能通过任何其他方式传播。如上所述，CYVaV缺少任何编码的移动蛋白。相反，CYVaV利用宿主植物的内源性移动蛋白和途径在伴细胞、韧皮部薄壁组织细胞和筛管成分之间进行转运。另外，由于认为宿主范围涉及病毒移动蛋白和宿主胞间连丝相关蛋白之间的相容相互作用，因此相信CYVaV能够利用此类宿主的内源移动蛋白穿过许多其他木本和非木本宿主植物的韧皮部。正因如此，CYVaV提供了一个特殊的模型系统，用于检查RNA移动(例如，在本氏烟草和/或柑桔中)并用作许多应用的载体。实验确认，CYVaV在宿主植物中系统性地移动并且限于韧皮部，并且是易于嫁接可传播的但不以其他形式传播。
由于品种之间的无融合生殖和性不相容性，柑桔树具有复杂的生殖生物学。再加上长达六年以上的幼年期，通过传统育种方法进行遗传改良既复杂又耗时。本公开内容通过提供基于iRNA(例如，基于CYVaV)的载体克服了这些问题，该载体被工程化成包括使用RNAi和CRISPR/Cas9的治疗性插入物。像CYVaV这样的iRNA在感染剂中是独特的，因为它们编码聚合酶，但使用宿主移动蛋白像类病毒一样移动，因此能够在柑桔之外的植物中传播。因此，除了柑橘，本公开内容的基于iRNA的载体可以开发用于其他木本植物(例如，树和豆科植物)，特别是橄榄树和葡萄藤。
根据公开的实施方式，CYVaV用于开发用于将小RNA和蛋白质递送到柑桔秧苗和本氏烟草中的载体。用于CYVaV载体开发的程序类似于本发明人用于工程化β-香石竹斑驳病毒(β-carmovirus)TCV以产生小RNA的程序(参见Aguado,L.C.et al.(2017),RNase IIInucleases from diverse kingdoms serve as antiviral effectors,Nature 547:114-117)。鉴定了用于添加一个、两个、三个或更多个设计为被核糖核酸酶III型外切核酸酶切除的小RNA插入物的示例性和有利位点。小的报告RNA直接从靶向八氢番茄红素去饱和酶的基因组中表达，使靶向组织变白。
根据公开的实施方式，本文公开的载体可包括具有各种功能的小RNA，包括：靶向重要真菌mRNA的小RNA；靶向昆虫载体导致死亡或不育的小RNA；和靶向CVEV的小RNA(因为这种病毒与CYVaV一起会导致黄脉症状增强)。另外，所公开的载体可以包括本领域已知的其他小RNA和/或治疗剂。因此，韧皮部限制的基于iRNA的载体可以被工程化为产生具有抗真菌和/或抗昆虫和/或抗病毒特性的小RNA，与当前的方法相比，这提供了优异的治疗和管理策略。
CYVaV载体可以通过切入韧皮部并将载体作为RNA或通过农杆菌渗入，或包裹在CVEV的外壳蛋白中后，按照本领域技术人员熟知的柑桔接种程序，例如根据柑桔克隆保护程序(CCPP)开发和常规使用的程序，手动应用于受感染或未受感染的树。此类程序是接种CTV和柑桔的其他嫁接可传播的病原体的常规程序。由于CYVaV不编码衣壳蛋白，不会产生病毒粒子并因此CYVaV不可能进行自然的树之间传播。当CYVaV被包裹在CVEV外壳蛋白中时，不存在CVEV的其他成分。
如上所述，CYVaV只有两个ORF：一个5’近端ORF，编码复制需要的蛋白质p21；以及一个移码、核糖体重新编码元件，它允许核糖体继续翻译，延伸p21以产生p81，即RNA依赖性RNA聚合酶。这两个ORF的组织类似于番茄丛矮病毒科(Tombusviridae)和黄症病毒科(Luteoviridae)病毒中类似ORF的组织。然而，这些科中的所有病毒，实际上在所有已知的植物RNA病毒中，都编码移动蛋白或与编码移动蛋白的第二病毒相关联。编码移动蛋白的能力，或与编码移动蛋白的第二病毒相关联的能力，长期以来一直被认为是细胞间移动以及穿过韧皮部以建立系统感染的必要条件。正因如此，尚未提议使用iRNA作为载体，实际上iRNA分子先前被认为不适合用作独立载体，因为缺少任何编码的移动蛋白，并且认为它们不能独立移动。
正因如此，尽管不编码或依赖于任何外源移动蛋白，但iRNA在整个植物韧皮部的独立系统移动能力是相当令人吃惊的。本公开内容的基于CYVaV的载体明确且重复地证明(通过荧光原位杂交和其他技术)在没有任何辅助病毒帮助的情况下系统移动。年轻的、未渗入的(系统)组织在本氏烟草上显示出高度明显的症状，包括叶瘿和根瘿。本公开内容的载体利用内源性宿主移动蛋白进行移动。就此而言，已知宿主韧皮部蛋白(25kDa韧皮部蛋白2(PP2)和/或26kDa黄瓜韧皮部蛋白2样)将宿主RNA运输到筛管成分中(参见Balachandran,S.et al.(1997),Phloem sap proteins from Cucurbita maxima andRicinus communis have the capacity to traffic cell to cell throughplasmodesmata,PNAS 94(25):14150-14155；Gómez,G.and Pallás,V.(2004),A long-distance translocatable phloem protein from cucumber forms aribonucleoprotein complex in vivo with Hop stunt viroid RNA,J Virol 78(18):10104-10110)可能使用Northwestern印迹显示与CYVaV相互作用。因此，由于已知的植物病毒编码(或取决于)移动蛋白，iRNA在结构和功能上与传统植物病毒有很大不同。
除了CYVaV，其他大小类似并编码聚合酶的RNA可用于开发类似结构的基于iRNA的载体(参见，例如Chin,L.S.et al.(1993).The beet western yellows virus ST9-associated RNA shares structural and nucleotide sequence homology withTombusviruses.Virology 192(2):473-482；Passmore,B.K.et al.(1993).Beet westernyellows virus-associated RNA:an independently replicating RNA that stimulatesvirus accumulation.PNAS 90(31):10168-10172)。如上所述，其他iRNA亲属(例如，分别在仙人掌、无花果树和埃塞俄比亚玉米中鉴定的iRNA r1、iRNA r2和iRNA r3)以及编码蛋白p21和p81(图4)的那些可用于载体开发。
尽管CYVaV存在于GenBank数据库(GenBank:JX101610)中，但iRNA不属于任何已知的病毒分类，因为它们缺乏编码移动蛋白的顺反子。iRNA也不依赖辅助病毒在宿主内进行系统移动。而且，iRNA缺少编码外壳蛋白的顺反子。iRNA也与类病毒不同，尽管两者都能够在没有编码移动蛋白的情况下进行系统移动。类病毒是环状单链RNA，没有编码能力，并使用宿主DNA依赖性RNA聚合酶在细胞核或叶绿体中复制。类病毒不寻常的存在需要绝大多数微小的类病毒基因组，通常包括大约300到400个核苷酸(nt)。另外，类病毒不编码任何蛋白质，这使得它们不适合用作载体。相反，iRNA编码它们自己的依赖于RNA的RNA聚合酶(RdRp)。
iRNA可以分为两类：第一类的特征在于要求移码以产生组装幽影病毒的那些的接近3'末端的RdRp和RNA结构。第二类的特征是需要通读来产生组装番茄丛矮病毒(Tombusviruse)的那些的RdRp和3'RNA结构。CYVaV是第一类的构件，具有类似于幽影病毒的特性，包括移码重新编码位点和在3'末端的类似结构，以及在5'末端的类似序列。第二类的iRNA构件一直被发现与辅助病毒有关。
与常规病毒载体相比，iRNA提供了许多益处。例如，iRNA相对较小，使其更容易在结构和功能上进行定位和遗传操作。相反，例如CTV的病毒是8倍大，这使得它们作为载体使用起来更加麻烦。iRNA可以复制和积聚到出人意料的高水平(例如，凝胶上的乙锭染色可见，RNAseq读取的读数为4％)，这对于载体将足够量的治疗剂递送到靶向植物中的能力至关重要。另外，尽管iRNA不编码外壳蛋白或沉默抑制子(图13)，但它比许多病毒更稳定(图13)，这使得宿主植物的寿命更长，从而在更长的时间内提供好处。
iRNA也仅限于宿主的韧皮部，这对于靶向存在于韧皮部中或其携带者从韧皮部为食或症状在韧皮部中积聚的病原体特别有用，因为有效载荷将靶向于最需要它的地方。通过独立于移动蛋白(其与特定宿主蛋白的相互作用是确定宿主范围的主要因素)移动，iRNA能够在更广泛的宿主范围内转运，从而增加单个载体平台的适用性。鉴于缺少外壳蛋白表达和辅助病毒对系统性植物感染的可分配性，iRNA不能从植物到植物以载体进行，而是必须通过嫁接直接引入韧皮部。缺少外壳蛋白可防止感染颗粒的形成，从而防止意外返回到环境中的野生型感染剂。这对于简化监管审批特别有益，因为监管机构通常关注引入的生物制剂可能不受控制的传播。
iRNA对它们的宿主实际上也是良性的，不像病毒如CTV，其分离物可以是高致病性的。使用常见病毒作为载体，例如CTV，存在超感染排除的风险，其中先前感染和/或暴露于该病毒的树不能被充当载体的相同病毒另外地感染(例如，美国大多数柑桔树都感染了CTV)。因此，避免超感染排除至少需要另外的步骤，这使得它更加昂贵和繁琐。
本公开内容还提供了新的治疗性、预防性或性状增强插入物，其被工程化到iRNA载体中。提供了多种插入物，包括靶向特定病原体、昆虫载体或疾病表现的插入物。可选地，或另外，提供加强或提高植物健康和/或增强植物所期望的特点的插入物。
所公开的感染剂能够在整个宿主植物中积聚和系统移动，因此可以在相当长的时间段内在整个宿主中递送治疗。因此，所公开试剂的特点对于治疗多种特定疾病非常有益。使用由RNA或DNA组成的感染剂具有另外的优势，即能够编码将在受感染细胞内表达的治疗性蛋白质或肽和/或通过工程化感染剂使其含有特定序列或其遗传材料的可切割部分用作基于RNA的治疗剂。
对植物病原体具有抗微生物特性的产品可以采用多种形式，并且通过核糖体(防御素和小细菌素)或非核糖体合成(peptaibols、环肽和假肽)产生。最著名的是超过900种阳离子抗微生物肽(CAP)，例如乳铁蛋白或防卫蛋白，它们一般少于50个氨基酸并且其抗微生物特性是本领域众所周知的。CAP是非特异性试剂，通常靶向细胞壁，据报道对细菌和真菌有效果。经工程化具有设计表达防卫蛋白的插入物的CTV已获得美国农业部在佛罗里达州分布的批准，但其广泛的效力尚不清楚。而且，用于载体的CTV分离株使其不适合生长在一些地区(例如加利福尼亚)的树。
靶向病毒病原体的RNA疗法也在植物中广泛开发。这些疗法使用非编码小干扰RNA(siRNA)，它们是从植物基因组中产生的，并因此包括对宿主的遗传修饰。除了一些种植者和消费者对柑桔树基因改造的负面看法外，产生基因修饰树的时间长度以几十年为单位，最终可能与几十年开发的品种不具有相同的属性(质地/颜色/味道)，因此除了开发成本非常高并且可能影响水果质量之外，这不是解决当前时间敏感的农业疾病的方法。
最近，高度靶向的抗菌酶已被开发用于动物和人类，作为目前抗生素的替代品。这些酶由噬菌体裂解蛋白工程化而成，并被称为酶抗生素。与亲本噬菌体蛋白一样，酶抗生素可以在接触时溶解细菌细胞壁，但设计用于革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌两者的外部。酶抗生素被工程化为仅裂解靶向的细菌，而微生物组的其他构件不受影响。在一些实施方式中，提供了包括非编码RNA插入物的iRNA载体，该非编码RNA插入物可被翻译成抗菌蛋白如酶抗生素。
在一些实施方式中，提供了具有干扰所讨论的昆虫载体功能的RNA插入物的iRNA载体。昆虫具有类似于植物的RNA沉默系统；昆虫摄取的小RNA被吸收到细胞中，并靶向关键mRNA以降解或阻断昆虫内的翻译。在一些实施方案中，提供了能够沉默昆虫载体的关键生殖功能的靶向插入物，导致昆虫的绝育。特别相关的是韧皮部进食昆虫，它们传播韧皮部限制的病原体，其中非编码RNA插入韧皮部限制的载体很容易被进食昆虫吸收。
在一些实施方式中，提供了iRNA载体，其包括靶向植物对病原体应答的非编码RNA插入物。在一些情况下，昆虫载体插入的细菌不会直接损伤树。然而，宿主树的韧皮部会产生过多的胼胝质以隔离细菌，这最终会限制光同化物的流动并杀死树。因此，RNA插入物沉默和/或抑制这种胼胝质的产生。
通过参考以下附加实施例和讨论将进一步理解本公开内容的附加特征和特征，这些附加实施例和讨论以进一步阐释的方式提供并且不旨在限制本公开。
CYVaV结构。CYVaV的全长结构是通过SHAPE结构探测和与仙人掌、无花果和玉米中的CYVaV亲属的系统发育比较而确定的(图9)。坚定了重新编码位点(见图10)和ISS样(I形结构)3'CITE(见图11)，以及用于容纳插入物的区域，例如，由加双框线区域显示的，并就插入物的示例性位置进行了更详细的讨论。
CYVaV的基因组组织展示出与其他RNA分子，特别是PEMV2的一些相似性(图3，图A)。然而，幽影病毒PEMV2也具有编码参与移动的蛋白质p26和p27的ORF。图3中图B显示了渗入的本氏烟草叶片和系统叶片中CYVaV正(+)链的水平。还显示了在全长CYVaV和PEMV2的小麦胚芽提取物中通过体外移码合成的RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)的水平(图3，图C)。请注意与CYVaV产生的p81聚合酶相比，PEMV2中p94的水平存在显著差异。CYVaV的移码位点是病毒学中已知最强的位点之一，据信是其异常高积聚的原因。
CYVaV被包裹在CVEV的病毒粒子中。CYVaV或CVEV或CYVaV+CVEV农杆菌渗入本氏烟草的叶子中。CYVaV被包裹在CVEV的病毒粒子中，一周后分离病毒粒子，并对包裹的RNA进行PCR分析(见图5和6)。在假定的辅助病毒CVEV存在的情况下，CYVaV的积聚显著增加。rRNA加载控制如下所示。p14沉默抑制子在所有叶子中共同渗入。具有CYVaV+CVEV的叶子的泛黄症状稍微更严重(图7，图B)。
CYVaV是韧皮部受限的。荧光原位杂交(FISH)成像清楚地检测到CYVaV的正链，完全限于SE、CC和PPC(图8)。
CYVaV不编码沉默抑制子。本氏烟草16C植物用表达GFP的构建体(在这些植物中沉默)和表达CYVaVp21或p81的构建体或者表达已知沉默抑制子p19(来自TBSV)或p38(来自TCV)的构建体进行农杆菌渗入(图13，图A)。只有p19和p38抑制GFP的沉默，允许表达绿色荧光(图13，图B)。用GFP寡核苷酸探测的Northern印迹表明，在p21或p81存在的情况下，GFPRNA仍然沉默(图13，图C)。
CYVaV在拟南芥原生质体中的复制。产生了CYVaV的感染性克隆。将野生型RNA转录本(CYVaV)或在重新编码滑点中含有突变的转录本(该突变消除了RdRp(CYVaV-fsm)的合成，因此不会复制)接种到拟南芥原生质体上。提取RNA并在30小时后进行Northern印迹。请注意，CYVaV-fsm的接种转录本在30小时仍存在于原生质体中(而在传统病毒中，它们在4小时后检测不到)。
CYVaV在本氏烟草中的复制。通过Northern印迹确定在本氏烟草渗入的叶子中积聚的CYVaV水平(图15，图A)。用CYVaV渗入的植物偶尔显示出系统症状(图15，图B；也参见图16)。这些植物积聚了高水平的CYVaV。确定系统感染植物的单个叶子中CYVaV的水平(图15，图C)。叶子4和5用CYVaV进行农杆菌渗入。注意CYVaV在最年轻的叶子中的大量积聚。
本氏烟草系统感染CYVaV的症状。叶子4和5用CYVaV进行农杆菌渗入。系统感染植物的第一个迹象是“杯状”叶子(图16)，它几乎总是叶子9。在接下来的几周内，在植物的顶端分生组织和每个节上出现了叶瘿。系统感染的植物也具有含有大量CYVaV的根瘿，如Northern植物印迹所证明的。
CYVaV表明了特殊的宿主范围。将来自系统感染的本氏烟草植物的汁液注入番茄的叶柄中(图17)。四株植物中的一株表现出非常强烈的症状，并且通过PCR对CYVaV呈阳性。显示的植物是在感染同龄植物后53天。
CYVaV与从黄瓜韧皮部提取的高丰度的蛋白质结合。如Northwestern印迹所示，标记的全长CYVaV与主要蛋白质结合(图18)。蛋白质在SDS凝胶电泳后复性。这种蛋白质被认为是一种已知的、高度保守的RNA结合蛋白，它包含RRM基序，已知该基序可以将伴细胞中的RNA作为分子伴侣蛋白到黄瓜韧皮部中的筛管成分中。当电泳后蛋白质保持变性时，未观察到结合。
CYVaV可以使用TEV IRES从其3'UTR表达额外的蛋白质。鉴定了烟草蚀刻病毒(TEV)内部核糖体进入位点(IRES)下游的纳米荧光素酶的三个单独插入物的位置(图19)。评估了三种构建体在小麦胚芽提取物中的体外翻译。纳米荧光素酶蛋白(Nluc)的位置靠近凝胶底部。研究了纳米荧光素酶在体内原生质体中的表达(图19，图C)。将(A)中所显示构建体的全长RNA转录本转化入原生质体。18小时后，提取总蛋白并在光度计中测量纳米荧光素酶活性。
评估了位置2250、2301和2319处的稳定发夹插入物的示例性位置。每个插入物的位置落在上述示例性区域内(见图9)。进行了来自CYVaV-wt和CYVaV VIGS载体的T7转录本的小麦胚芽提取物体外翻译测定，该载体在位置2250处含有不同数量的序列(图20)。例如，构建体sfPDS60在植物中表现出卓越的系统移动。进行了来自CYVaV-wt的T7转录本和CYVaVVIGS载体的小麦胚芽提取物的体外翻译测定，该CYVaV VIGS载体在位置2301和2319处含有不同数量的序列(图21)。从被CYVaV wt和CYVaV VIGS载体感染的拟南芥原生质体中分离的总RNA的Northern印迹分析。进行CYVaV-GDD和阴性对照(图20，图D)。从被CYVaV wt和CYVaVVIGS载体感染的拟南芥原生质体中分离的总RNA的Northern印迹分析。进行了CYVaV-GDD和阴性对照(图21，图D)。构建体CY2250sfPDS60、CY2301PDS60、CY2301sfPDS60、CY2319sfPDS60(包括分别在位置2250、2301、2319处的插入物)均表现出因插入的卓越的系统移动。另外，构建体CY2331PDS60(包括在位置2331处的插入物)也证明了在整个宿主中系统性移动的能力。另一个构建体，CY2083TAAPDS60，包括在位置2083处的插入物，该位置在RdRpORF中(前面是插入的终止密码子)。
从系统叶收集的载体的插入区域序列(如下加下划线并如图20的图G和图21的图G所示)如下所示：
taggcctcgacacgggaaggtagctgtcccggcactgggttgcacatattccgtgccgacgccac(SEQID NO：26)
ccggcctcgacacgggaaggtagctattccgtgccgacgccgt(SEQ ID NO:27)
基于iRNA的载体平台
在一个实施方案中，提供了一种基于iRNA的载体，用于治疗柑橘产业中由CLas细菌(HLB)引起的疾病。将CYVaV的分离物用作载体以靶向细菌和将细菌输送到树中的木虱昆虫。如上所述，CYVaV仅限于韧皮部，在那里它复制和积聚到与最好的植物病毒相当的极高水平。此外，其相对较小的尺寸使其异常容易进行基因工程。因此，考虑CYVaV的结构和生物学有助于开发这种新的感染剂作为韧皮部转运的载体和模型系统。
CYVaV的3'UTR的结构是基于SHAPE RNA结构作图而确定的(图9)。另外，基于生化测定以及它们的序列和/或结构和位置的系统发育保守性(对于幽影病毒)，鉴定了许多复制和翻译元件(图19，图A)。还鉴定了I形元件，它用作独立于帽的翻译增强子(3'CITE)。还鉴定了一系列长距离吻环相互作用(双箭头)，据信其参与稳定RNA和在没有沉默抑制子的情况下积聚。基于这种结构，确定了许多区域作为序列插入的合适位置，这些区域不应干扰周围的结构。
已经鉴定了3'UTR和RdRp ORF中的潜在插入物的某些位点，这些位点可以容纳RNA发夹，例如，用于产生靶向摄食昆虫的siRNA，容纳报告基因ORF并仍允许在农杆菌渗入的本氏烟草中复制工程化的CYVaV的位点，以及在体外触发报告蛋白高水平翻译的位点。将并入添加的ORF和siRNA的工程化的CYVaV引入储存宿主树，然后其片段可用于通过嫁接直接引入田间树。鉴于CYVaV的稀有性(迄今为止，Weathers在1950年代仅在四棵柠檬树中发现了它)，超感染排除的风险很小。
鉴定了各种插入位置，其中载体的复制或翻译特特性没有明显降低或消除。没有进一步研究对这些特性产生不利影响的插入位置(可能是由于破坏了CYVaV载体的RNA结构或其他重要方面)。在位置2250、2301、2319和2331处鉴定了基于CYVaV的载体上的四个示例性插入位置。在这些位置成功部署了50nt发夹插入物，没有破坏体外翻译或原生质体中的复制，并且CYVaV能够在本氏烟草中系统移动。
尽管CYVaV没有额外的ORF，但是使用对于正链和负链的探针可检测到约500nt的基因组(g)RNA和亚基因组(sg)RNA。对应该包含sgRNA启动子的区域的调查揭示了与幽影病毒的高度保守的sgRNA启动子和香石竹斑驳病毒TCV的最小但功能强大的sgRNA启动子具有显著相似性的元件。此外，同样只表达RdRp且与番茄丛矮病毒相关的相似RNA都产生相似大小的亚基因组RNA，并可能简化肽和蛋白质的表达。
为了确定CYVaV中sgRNA启动子下游哪里是插入物耐受的，对CYVaV的3'UTR中存在关键元件的位置进行了评估，以便在插入异源序列时避免此类元件。如上所述，鉴定了CYVaV的3'CITE，以及几个额外的3'近端发夹，其在幽影病毒中高度保守并且已知对复制和翻译至关重要。使用缺失/点突变，对假定sgRNA启动子下游和CAS上游(～120nt)的序列研究了不影响本氏烟草中原生质体积聚或系统移动的区域。本发明人先前利用类似的策略来鉴定TCV的3'UTR中可以容纳被RNase III型酶靶向的发夹的区域(Aguado,L.C.et al.(2017).RNase III nucleases from diverse kingdoms serve as antiviraleffectors.Nature 547:114-117)。
在鉴定了用于容纳缺失/突变的适当区域(例如，不涉及关键功能的区域)后，将不同长度的异源序列插入其中以评估具有延伸3'UTR的CYVaV功能性。此类研究有助于确定最大插入长度，以确保基于CYVaV的载体可以耐受此类插入，同时仍积聚到强力的水平并参与系统移动。据信，基于CYVaV的载体可以能够容纳大小高达2kb的插入物。就此而言，最相关的病毒(类似于CYVaV的木瓜幽影样病毒，仅编码复制酶相关蛋白和RdRp)更大1到2kb，所有额外的序列长度都扩展了它们的3'UTR(Quito-Avila,D.F.et al.(2015).Detection andpartial genome sequence of a new umbra-like virus of papaya discovered inEcuador.Eur J Plant Pathol 143:199-204)。评估了各种大小的序列片段，从50nt(用于产生小RNA的插入发夹的大小)开始，直至约600nt(酶抗生素ORF的大小)。最初的小RNA片段包括报告子，用于敲除八氢番茄红素去饱和酶，其使组织变白。大小更长的片段包括纳米荧光素酶和GFP ORF，它们也可用作检测表达水平的报告子。在包含野生型(WT)sgRNA启动子和增强型sgRNA启动子的构建体中制备插入物。
用于稳定插入物基部的锁定和对接序列。参考图24，图A，显示了锁定和对接序列的基本结构。四碱基环(Tetraloop)GNRA(GAAA)与其对接序列对接产生极其稳定的结构。图24，图A中显示的序列如下所示：
gaaa(SEQ ID NO：28)
gauauggau(SEQ ID NO：29)
guccuaaguc(SEQ ID NO：30)
caggggaaacuuug(SEQ ID NO：31)
提供了包括对接的四碱基环的支架作为晶体学支架的用途(图24，图B)。图24，图B中的序列如下所示：
cauuagcuaaggaugaaagucuaugcuaaug(SEQ ID NO：32)
根据所公开的实施方式的锁定和对接结构显示在图24，图C中。插入物(发夹或非发夹序列)可以被添加到所鉴定的额外插入位置处的限制性位点。带圆圈的碱基是四碱基环的对接序列。图24，图C中显示的序列如下所示：
gcaccuaaggcgucagggucuagacccugcucaggggaaacuuugucgcuauggugc(SEQ ID NO：33)
稳定局部3'UTR结构是有害的；然而，在附近插入不稳定的插入物恢复活力。参考图25，图A，显示了CYVaV-wt的表示。CYVaV-wt3’stb是亲本稳定的构建体，含有6nt改变，将G:U对转换为G:C对。在位置2319和2330处将两个60个核苷酸的插入添加到稳定的亲本构建体中，形成CY2319PDS60_3'stb和CY2330PDS60_3'stb。为稳定结构和产生CYVaV-wt 3’stb而进行的核苷酸改变在图B中圈出。图25，图B中所示的序列如下所示：
ggcuaguuaaucucauucgugggauggacaggcagccugacguugac(SEQ ID NO：34)
guuaauguaggugucuuuccguaucuaguc(SEQ ID NO：35)(未更改的G:U对)
Figure BDA0003153558490000441
(转换的G:C对)
治疗和管理的靶标
提供了用于由所公开的载体递送的抗生素插入物，其包括经工程化以破坏CLas细菌的酶抗生素或小肽。酶抗生素更喜欢富含糖的室温环境，例如在植物韧皮部中发现的环境。在工程化的CYVaV感染周期中，酶抗生素在伴细胞中被翻译。在韧皮部的细胞质中产生的蛋白质自然地能够离开并进入筛管成分(翻译的蛋白质的默认途径)，CLas和其他植物致病菌在那里驻留。在筛管成分中，酶分子随着光同化物在树干上下移动，并在接触时裂解任何细菌。由于酶抗生素靶向特定类别的细菌，因此它们优选不干扰宿主树的微生物组。已经开发了靶向Clas的各种试剂(例如，Hailing Jin，加州大学河滨分校，CA)。因此，靶向CLas细菌的许多插入物是本领域已知的并且可以与本公开内容的CYVaV载体一起使用。
作为进一步的实施方案，靶向多种途径来破坏疾病和疾病木虱载体可能是有益的。因此，在某些实施方式中，所公开的载体包括上述酶抗生素和/或肽，以及触发干扰树或携带疾病木虱的基因表达的siRNA产生的插入物。在ACP的情况下，RNA可以杀死载体或使其无翼，从而无害。
胼胝质合酶的基于CYVaV的载体靶向表达。
提供了包含RNA插入物的载体，其触发宿主树中胼胝质产生和积聚的减少。通过插入被植物切除的siRNA序列，在韧皮部产生胼胝质以响应细菌的足够大量基因被沉默。
基于CYVaV的载体可用作病毒诱导的基因沉默(VIGS)载体以下调韧皮部中胼胝质合酶的表达。VIGS已被广泛用于下调成熟植物中的基因表达以检查植物功能基因组学(Senthil-Kumar等人(2008).Virus-induced gene silencing and its application incharacterizing genes involved in water-deficit-stress tolerance.J PlantPhysiol 165(13):1404-1421)。将互补序列插入到CYVaV中如上所述的适当位置(反义或RNase III可切割发夹)。该基因的柑桔版本是已知的(Enrique等人(2011).Noveldemonstration of RNAi in citrus reveals importance of citrus callose synthasein defense against Xanthomonas citri subsp.citri.Plant Biotech J 9:394-407)。
胼胝质是在发育和生物和非生物胁迫期间在各种组织中合成的β1，3-葡聚糖(Chen，XY和Kim,J.Y.(2009).Callose synthesis in higher plants.Plant Sig Behav 4(6):489-492)。筛管成分的筛板中胼胝质的沉积抑制韧皮部中的光同化物流动，导致叶绿体中胼胝质的过度积聚，从而导致树在如HLB的细菌感染期间死亡(Koh,H.等人(2012).Silent Information Regulator 2(Sir2)and Forkhead Box O(FOXO)ComplementMitochondrial Dysfunction and Dopaminergic Neuron Loss in Drosophila PTEN-induced Kinase 1(PINK1)Null Mutant.J Biol Chem 287(16):12750-12758)。所有植物都含有12-14种胼胝质合酶基因；该基因家族的一个成员CalS7(拟南芥命名法)主要负责响应创伤和各种病原体在韧皮部的筛孔中快速沉积胼胝质(Xie等(2011).CalS7 encodes acallose synthase responsible for callose deposition in the phloem.Plant J 65(1):1-14)。GSL7的完全抑制影响了拟南芥中的正常韧皮部传输和花序发育(Barratt等人(2011).Callose Synthase GSL7 Is Necessary for Normal Phloem Transport andInflorescence Growth in Arabidopsis.Plant Physiol 155(1):328-341)。基于CYVaV的载体用于下调成熟植物中CalS7的本氏烟草和橙子树直系同源物，以研究减少(但未消除)的筛板胼胝质沉积的结果。可替代地，或另外，载体提供表达胼胝质降解酶的插入物。
在一些实施方案中，提供靶向一种或多种病毒和/或真菌病原体的插入物。在一些实施方案中，提供了发夹插入物，其产生直接靶向CVEV的siRNA，因为已知CVEV轻微增强CYVaV的泛黄影响并且能够在树之间传输CYVaV。在一些实施方案中，提供靶向CTV的发夹插入物，因为CTV是柑桔的高度破坏性病毒病原体(仅次于CLas)。在其他实施方案中，提供靶向另一种柑桔(或其他)病毒的插入物。在一些实施方案中，提供靶向真菌病原体的插入物，假定此类病原体能够从韧皮部摄取siRNA。
在一些实施方案中，基于CYVaV(或其他iRNA)的载体包括插入物，该插入物经工程化以修饰源自伴细胞中基因表达的植物的表型性质。在一个实施方式中，提供了触发矮小的插入物，从而使果实更容易收获并减少生长空间要求。还可以根据需要靶向附加和/或其他性状。包括1、2、3或更多个插入物的本公开内容的iRNA载体展示稳定性和功能性。
本说明书中提及的所有指示的出版物和参考文献通过引用并入本文，程度如同每个单独的出版物被具体地和单独地指示为通过引用将其整体并入一样。虽然已经结合其示例性实施方案描述了本发明，但应当理解，它能够进行进一步的修改，并且本申请旨在涵盖通常遵循本发明的原理的本发明的任何变化、使用或修改，并包括在已知或本发明所属领域内的惯常做法范围内与本公开内容的偏离，并且可以应用于上文所述的特征。
序列表
<110> 马里兰大学派克分院
加利福尼亚大学董事会
A•E•西蒙
J•刘
G•维达拉基斯
S•金侑权
S•博达吉
<120> 植物载体、组合物和与其相关的用途
<130> 2105.0071PCT
<150> US 62/760,098
<151> 2018-11-13
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2692
<212> RNA
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<400> 1
ggguaaauau ggauccuuca ucuuugcccc gugccuguug gcaucaugcc agacaggugu 60
uucgagcauc aacuagcuuc ucaagagagg ugguucgcgc ugcucguaga uggguuacca 120
ugcccaccag ucgccaugca uaugacuuuu caacgagucu aggcauugug auugcugagc 180
cugcagcucg uuuacgacgc cgucugcccu cuguacgaaa gugcgcagag aaguuaguag 240
uccacaagca agucgacacu uugguggacg aauggugcuc uggaauuccc aacccugaua 300
ucguagaagu ugguugggca cuccgucuga gggaccguuu cggucuuccu cccgcuucug 360
agccuacccg gcucaguggu gagagauggg ugcucaaaca acucaauggg guagauccug 420
agucauggaa ugcugaucuu gguaggucag uucauaucca aggagacuac gccccaggga 480
ggaaugccca uaucgcucag gucgcggcga ccuugugguu aacuaggacc uugcaugaca 540
aggccuuggc ucgccaccag gguuuucgcg auuugcagug auuggggucg acgggcuaga 600
ggcaaaagca gugccucuag cuucuggacu ccgacugcuu ccgguuccgc gacccggaca 660
aagucgacga cugucucaga ccuuguuacu uccaacaccu cgugcucaau ucgugaauca 720
cgcgugcucg gcuaacaacc uuggacgugu gaugaccaca cguguguugc aguacaaggg 780
ccgagauccg auccuucccu cuucugaagc ccuucaccga cuuaaccuuc ggauagcuga 840
gcuauauagg ucuagaccuu cuaccgucua uccauuaagu uaugaagggu uucucaauug 900
cuaugaaggc cgacagcgua cucguuacgc ccaagccguc gagcaguuga ugcgguccac 960
ucuugagccg aaagaugcgc gaguugaaac guucauuaag aacgagaaau uugacugggc 1020
guugaaaggg gaggaggcug auccucgagc aauccaacca aggaagccga aauauuuggc 1080
ugagguugga cggugguuca aaccuuugga gcgaaucauc uacaaggauc ucaguaaaag 1140
guuguauggu gagggugcug agccguguau cgccaaaggc cuaaaugcau uagaaucugg 1200
agcgacuuug aggcgcaaau gggagaaguu uucuucucca guuugcguuu cucucgacgc 1260
uuccagguuc gaccugcaug uaagcguugg caugcuaaag uucacacaca agcuauauga 1320
cuauuacugu aagucuccca cucuccagcg cuaucucaaa uggacacucc gcaaccaugg 1380
cgucgccucc ugcaaagaau ugucauauga guaugagguu guuggccgga gaaugagugg 1440
ugacauggac acugcauugg gcaacugcgu cauuaugucg auacuuacau gguuuaugcu 1500
uagugaacuu ggcauuaagc augaauuauu cgauaauggu gacgauuguu uguucauuug 1560
cgagucucac gacgucccca gccccgaggu aauuacaaac ugguuuucgg acuuuggguu 1620
ugugguuagg uuggaaggcg ucacguccgu guuugagcgu auugaguuuu gccaaacuuc 1680
cccaguaugg acugagaggg guuggcugau guguaggaau auuaagucau ugaguaaaga 1740
ccuuacgaau guuaauucgu gcacgggcuc cacgauugaa uauacccacu gguugaaagc 1800
agugggaaag ugcgggucaa uacucaaugc ugguguaccu auauuucagu ccuuucacaa 1860
caugcuggaa aggcuuggca cuaacucucg uauugaucga gggguuuucu ucaaaucagg 1920
gcuaguuaau cucauucgug ggauggacag gcagccugac guugacauca cuacuuccgc 1980
ucggcuuucu uucgaagugg cauucgggau aacacccggg augcaauugg cuauugaacg 2040
guacuaugac ucugucaugg gcucgcugag uaaaauagaa acaacuaagu ggccaauuga 2100
acuaagaaag gaauacgaac acggaaguga gugguacgag gacuuaggcg uccuaggaug 2160
aauaggguca uugguuuacc gaugauaccu guucagaaua ggauugcucg agcuucguug 2220
guuaggguaa cucacauacc uucuuccaua acuggaaaag gucgugugag caaccuaacc 2280
aguuaaugua ggugucuuuc cguaucuagu cacgauggua agcaacccgu uuaucuguac 2340
ggcgcucacc cguggguagg aaggugaagg uuuugugucc uuuaggucuu ggacagucug 2400
cgggcuuggg aacgacgccc cgcuagcaac guacugcucu ccuaccggac ugguagcuua 2460
auugucaucu uggagcgaua gcacuguggg ccucacccuu cgcgcguugg acguguugcg 2520
ugccccccac agauuuguga aacucuaugg agcaguuccg cgagccagaa gggaggaugg 2580
ccgccuggcg uaauccagga gcucuggggg gcuuguacuc agaguagcau ucugcuuuag 2640
acuguuaacu uuaugaacca cgcgugucac guggggagag uuaacagcgc cc 2692
<210> 2
<211> 225
<212> RNA
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(225)
<223> 3' End of CYVaV
<400> 2
ucuuggagcg auagcacugu gggccucacc cuucgcgcgu uggacguguu gcgugccccc 60
cacagauuug ugaaacucua uggagcaguu ccgcgagcca gaagggagga uggccgccug 120
gcguaaucca ggagcucugg ggggcuugua cucagaguag cauucugcuu uagacuguua 180
acuuuaugaa ccacgcgugu cacgugggga gaguuaacag cgccc 225
<210> 3
<211> 84
<212> RNA
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(84)
<223> CYVaV(碱基2468至2551)的3'帽独立翻译增强子(3'CITE)
<400> 3
ucuuggagcg auagcacugu gggccucacc cuucgcgcgu uggacguguu gcgugccccc 60
cacagauuug ugaaacucua ugga 84
<210> 4
<400> 4
000
<210> 5
<400> 5
000
<210> 6
<211> 570
<212> RNA
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(570)
<223> CYVaV编码蛋白p21的多核苷酸序列(碱基9-578)
<400> 6
auggauccuu caucuuugcc ccgugccugu uggcaucaug ccagacaggu guuucgagca 60
ucaacuagcu ucucaagaga ggugguucgc gcugcucgua gauggguuac caugcccacc 120
agucgccaug cauaugacuu uucaacgagu cuaggcauug ugauugcuga gccugcagcu 180
cguuuacgac gccgucugcc cucuguacga aagugcgcag agaaguuagu aguccacaag 240
caagucgaca cuuuggugga cgaauggugc ucuggaauuc ccaacccuga uaucguagaa 300
guugguuggg cacuccgucu gagggaccgu uucggucuuc cucccgcuuc ugagccuacc 360
cggcucagug gugagagaug ggugcucaaa caacucaaug ggguagaucc ugagucaugg 420
aaugcugauc uugguagguc aguucauauc caaggagacu acgccccagg gaggaaugcc 480
cauaucgcuc aggucgcggc gaccuugugg uuaacuagga ccuugcauga caaggccuug 540
gcucgccacc aggguuuucg cgauuugcag 570
<210> 7
<211> 190
<212> PRT
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(190)
<223> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)蛋白p21
<400> 7
Met Asp Pro Ser Ser Leu Pro Arg Ala Cys Trp His His Ala Arg Gln
1 5 10 15
Val Phe Arg Ala Ser Thr Ser Phe Ser Arg Glu Val Val Arg Ala Ala
20 25 30
Arg Arg Trp Val Thr Met Pro Thr Ser Arg His Ala Tyr Asp Phe Ser
35 40 45
Thr Ser Leu Gly Ile Val Ile Ala Glu Pro Ala Ala Arg Leu Arg Arg
50 55 60
Arg Leu Pro Ser Val Arg Lys Cys Ala Glu Lys Leu Val Val His Lys
65 70 75 80
Gln Val Asp Thr Leu Val Asp Glu Trp Cys Ser Gly Ile Pro Asn Pro
85 90 95
Asp Ile Val Glu Val Gly Trp Ala Leu Arg Leu Arg Asp Arg Phe Gly
100 105 110
Leu Pro Pro Ala Ser Glu Pro Thr Arg Leu Ser Gly Glu Arg Trp Val
115 120 125
Leu Lys Gln Leu Asn Gly Val Asp Pro Glu Ser Trp Asn Ala Asp Leu
130 135 140
Gly Arg Ser Val His Ile Gln Gly Asp Tyr Ala Pro Gly Arg Asn Ala
145 150 155 160
His Ile Ala Gln Val Ala Ala Thr Leu Trp Leu Thr Arg Thr Leu His
165 170 175
Asp Lys Ala Leu Ala Arg His Gln Gly Phe Arg Asp Leu Gln
180 185 190
<210> 8
<211> 1407
<212> RNA
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1407)
<223> CYVaV 编码蛋白p81的多核苷酸序列(碱基752-2158)
<400> 8
augaccacac guguguugca guacaagggc cgagauccga uccuucccuc uucugaagcc 60
cuucaccgac uuaaccuucg gauagcugag cuauauaggu cuagaccuuc uaccgucuau 120
ccauuaaguu augaaggguu ucucaauugc uaugaaggcc gacagcguac ucguuacgcc 180
caagccgucg agcaguugau gcgguccacu cuugagccga aagaugcgcg aguugaaacg 240
uucauuaaga acgagaaauu ugacugggcg uugaaagggg aggaggcuga uccucgagca 300
auccaaccaa ggaagccgaa auauuuggcu gagguuggac ggugguucaa accuuuggag 360
cgaaucaucu acaaggaucu caguaaaagg uuguauggug agggugcuga gccguguauc 420
gccaaaggcc uaaaugcauu agaaucugga gcgacuuuga ggcgcaaaug ggagaaguuu 480
ucuucuccag uuugcguuuc ucucgacgcu uccagguucg accugcaugu aagcguuggc 540
augcuaaagu ucacacacaa gcuauaugac uauuacugua agucucccac ucuccagcgc 600
uaucucaaau ggacacuccg caaccauggc gucgccuccu gcaaagaauu gucauaugag 660
uaugagguug uuggccggag aaugaguggu gacauggaca cugcauuggg caacugcguc 720
auuaugucga uacuuacaug guuuaugcuu agugaacuug gcauuaagca ugaauuauuc 780
gauaauggug acgauuguuu guucauuugc gagucucacg acguccccag ccccgaggua 840
auuacaaacu gguuuucgga cuuuggguuu gugguuaggu uggaaggcgu cacguccgug 900
uuugagcgua uugaguuuug ccaaacuucc ccaguaugga cugagagggg uuggcugaug 960
uguaggaaua uuaagucauu gaguaaagac cuuacgaaug uuaauucgug cacgggcucc 1020
acgauugaau auacccacug guugaaagca gugggaaagu gcgggucaau acucaaugcu 1080
gguguaccua uauuucaguc cuuucacaac augcuggaaa ggcuuggcac uaacucucgu 1140
auugaucgag ggguuuucuu caaaucaggg cuaguuaauc ucauucgugg gauggacagg 1200
cagccugacg uugacaucac uacuuccgcu cggcuuucuu ucgaaguggc auucgggaua 1260
acacccggga ugcaauuggc uauugaacgg uacuaugacu cugucauggg cucgcugagu 1320
aaaauagaaa caacuaagug gccaauugaa cuaagaaagg aauacgaaca cggaagugag 1380
ugguacgagg acuuaggcgu ccuagga 1407
<210> 9
<211> 469
<212> PRT
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<400> 9
Met Thr Thr Arg Val Leu Gln Tyr Lys Gly Arg Asp Pro Ile Leu Pro
1 5 10 15
Ser Ser Glu Ala Leu His Arg Leu Asn Leu Arg Ile Ala Glu Leu Tyr
20 25 30
Arg Ser Arg Pro Ser Thr Val Tyr Pro Leu Ser Tyr Glu Gly Phe Leu
35 40 45
Asn Cys Tyr Glu Gly Arg Gln Arg Thr Arg Tyr Ala Gln Ala Val Glu
50 55 60
Gln Leu Met Arg Ser Thr Leu Glu Pro Lys Asp Ala Arg Val Glu Thr
65 70 75 80
Phe Ile Lys Asn Glu Lys Phe Asp Trp Ala Leu Lys Gly Glu Glu Ala
85 90 95
Asp Pro Arg Ala Ile Gln Pro Arg Lys Pro Lys Tyr Leu Ala Glu Val
100 105 110
Gly Arg Trp Phe Lys Pro Leu Glu Arg Ile Ile Tyr Lys Asp Leu Ser
115 120 125
Lys Arg Leu Tyr Gly Glu Gly Ala Glu Pro Cys Ile Ala Lys Gly Leu
130 135 140
Asn Ala Leu Glu Ser Gly Ala Thr Leu Arg Arg Lys Trp Glu Lys Phe
145 150 155 160
Ser Ser Pro Val Cys Val Ser Leu Asp Ala Ser Arg Phe Asp Leu His
165 170 175
Val Ser Val Gly Met Leu Lys Phe Thr His Lys Leu Tyr Asp Tyr Tyr
180 185 190
Cys Lys Ser Pro Thr Leu Gln Arg Tyr Leu Lys Trp Thr Leu Arg Asn
195 200 205
His Gly Val Ala Ser Cys Lys Glu Leu Ser Tyr Glu Tyr Glu Val Val
210 215 220
Gly Arg Arg Met Ser Gly Asp Met Asp Thr Ala Leu Gly Asn Cys Val
225 230 235 240
Ile Met Ser Ile Leu Thr Trp Phe Met Leu Ser Glu Leu Gly Ile Lys
245 250 255
His Glu Leu Phe Asp Asn Gly Asp Asp Cys Leu Phe Ile Cys Glu Ser
260 265 270
His Asp Val Pro Ser Pro Glu Val Ile Thr Asn Trp Phe Ser Asp Phe
275 280 285
Gly Phe Val Val Arg Leu Glu Gly Val Thr Ser Val Phe Glu Arg Ile
290 295 300
Glu Phe Cys Gln Thr Ser Pro Val Trp Thr Glu Arg Gly Trp Leu Met
305 310 315 320
Cys Arg Asn Ile Lys Ser Leu Ser Lys Asp Leu Thr Asn Val Asn Ser
325 330 335
Cys Thr Gly Ser Thr Ile Glu Tyr Thr His Trp Leu Lys Ala Val Gly
340 345 350
Lys Cys Gly Ser Ile Leu Asn Ala Gly Val Pro Ile Phe Gln Ser Phe
355 360 365
His Asn Met Leu Glu Arg Leu Gly Thr Asn Ser Arg Ile Asp Arg Gly
370 375 380
Val Phe Phe Lys Ser Gly Leu Val Asn Leu Ile Arg Gly Met Asp Arg
385 390 395 400
Gln Pro Asp Val Asp Ile Thr Thr Ser Ala Arg Leu Ser Phe Glu Val
405 410 415
Ala Phe Gly Ile Thr Pro Gly Met Gln Leu Ala Ile Glu Arg Tyr Tyr
420 425 430
Asp Ser Val Met Gly Ser Leu Ser Lys Ile Glu Thr Thr Lys Trp Pro
435 440 445
Ile Glu Leu Arg Lys Glu Tyr Glu His Gly Ser Glu Trp Tyr Glu Asp
450 455 460
Leu Gly Val Leu Gly
465
<210> 10
<400> 10
000
<210> 11
<400> 11
000
<210> 12
<400> 12
000
<210> 13
<400> 13
000
<210> 14
<400> 14
000
<210> 15
<400> 15
000
<210> 16
<400> 16
000
<210> 17
<211> 166
<212> RNA
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(166)
<223> 重新编码CYVaV移码位点的多核苷酸序列
<400> 17
ucgcucaggu cgcggcgacc uugugguuaa cuaggaccuu gcaugacaag gccuuggcuc 60
gccaccaggg uuuucgcgau uugcagugau uggggucgac gggcuagagg caaaagcagu 120
gccucuagcu ucuggacucc gacugcuucc gguuccgcga cccgga 166
<210> 18
<211> 25
<212> RNA
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(25)
<223> 重新编码CYVaV移码位点的多核苷酸序列
<400> 18
caaagucgac gacugucuca gaccu 25
<210> 19
<211> 34
<212> RNA
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(34)
<223> 重新编码CYVaV移码位点的多核苷酸序列
<400> 19
aggucuugga cagucugcgg gcuugggaac gacg 34
<210> 20
<211> 3132
<212> RNA
<213> 榕树
<220>
<221> misc_feature
<223> 无花果树iRNA的多核苷酸序列("iRNA亲属1"或"iRNA r1")
<400> 20
aaauauggau ucgauaucaa ugcccgucgc cugcugguca aaagccaggc aggucuugcg 60
uacaccagcu aacuuuucca aagggguagu gaaggcugcg uaccgguggg ucaacaugcc 120
cagagccaaa uaugucagag augucuccac gagucuuggc auaguugucg cugagccugu 180
ugcugccgug cgccguuaga ugccuucgau aagcagccuu gcggaggagu ugguaacacg 240
ccagagcguc gacacucugg uggacgauug gugucucgga cuuuccaacc cugacaacaa 300
cguggagguu gguugggcac uucgucugag ggaccgcuuu ggucuuccuc ccgccucuga 360
gcccacaagg cucaguggug agagaugggu gcuuaaacaa cucaaugggg uagacccgga 420
gucguggaau guugaucugc aaagcguuuu cgaagacgcu caggaugacu uccaucggga 480
cuacgcccca aggaggaaug cccaaaucgc ucaaauugcg gcaacccuau ggcuuacaaa 540
gaccuuaguc gauaaggcuu uagcacgcca ucaggauuuu cgcaguuugc agugauuggg 600
gucgacgggc uagaggcuaa agcagugccu cuggcugcug gacuccgacu gcuuccgguu 660
ccgcggcccg gacaaagccg acggcugucu caaaccuugc uacucccuac uccccgugcu 720
caauuuguca aucacgcuaa cucagguaau aauuuggggc guguuuugac cacacgggug 780
augcaauaca aaggccgaga cccgauacua cccucccagg aagcccugcg caaacuuaac 840
cuucggauag gacaguugua uaagucuaga ccauccacug ucuauccccu gaguuaugau 900
ggguuucuua auuguuauga uggccgacag cguacucgcu acgcucaugc cgucgagcaa 960
uugaugggug ccgcucugac cccaaaagau gcgcgaguug agacguucau uaagaacgag 1020
aaguuugauu gguuguugaa gggagacgag gcugauccuc gugcaaucca accuaggaag 1080
ccgaaauauu uggccgaggu uggucgaugg uucaaaccgu uggagcgaau caucuacaag 1140
gaucucaguu ugcguuugua cggugauaac gcugaaccuu gcauugccaa aggcuuaaau 1200
gcauuggaau caggggcuac guugagacgu aaaugggaaa aguucgcuaa uccuguuugu 1260
guuucauugg augcuucucg uuucgaccug cacguaagug uuggcuuguu aaaguucacg 1320
cauaaauugu acaacuauua cugcaagucu cccacucuuc aacgauaucu caaauggaca 1380
cuccgcaacu ccgguaucgc cuccuguaag gaaaaaucau augcguauga gguugaaggc 1440
cguagaauga guggcgacau ggacaccgca uuaggcaacu guaucaucau gagauuauua 1500
acuugguuua ugcuuagcga acuuggcgug cggcaugagc uuuucgauaa uggugaugac 1560
uguuuguuua uuugugaaaa agaagacguu ccuagugcug agguaaucac gaacugguuu 1620
acggauuuug gguuuguggu uaagcuagaa ggcgucacgu ccguguuuga gcgcauugag 1680
uucugucaga ccucaccagu auggacugcg aggggauggc ugauguguag aaacaucaag 1740
ucauugagua aagauuuaac gaauguuaau ucgugcacug guucugccgu ugaauacacu 1800
cauugguuga aggcgguggg caagugugga ucuauacuca augcuggugu gcccauauuu 1860
caguccuuuc acaacauguu ggucagguug ggcacgaauu cgcguauaga ucgcggggua 1920
uucuuuaggu guggacuugu uaaucucauu cugggaugga cagacaaccu gaaaguugag 1980
aucacuacuu ccgcucgucu uucuuuugaa guggcauucg ggaucacucc cggcaugcaa 2040
uuggcuauug agcaauuuua ugacucaguc gugggcccuc uggguaaaau aaaaucugua 2100
aaauggccaa uagaucuaag aaaggaauac gauuacggaa gcgcgugguu cgaagaccaa 2160
ggcguccuag ggugaacaag gaacucggau uaccgaugac accuguucaa acuagaaugg 2220
uucggucaac guugaccaag gagaccaaca uaccuucuac ugcaaauagc ggucgggagg 2280
cuguuugggc uuguuggcca aucaacuuua gugucuuucc gcaacuagcc ucacucguga 2340
auaaaccguu auacuggcgu guguccagug ugcaaguugc aauggagccg gcgaugucua 2400
cuuccaccca acauugugga guuggucuca guucuucugg ggccuucacu aacggugaug 2460
gguucgguaa cgucuuuaag cucuugcguu cuuguaacua uacgcggcgc ucucccgugg 2520
gaggaaacgu gauggucaaa uggcccaucu gcaugcccuu cauucuuaac gaugaugcgc 2580
acaagaacac aggauuaacc gccuguguga ucauugcagu caccaauacu ggugugcuaa 2640
cuggucaauc uuggacggag auucuuuuga auguggagua uguagugggu gcauagacag 2700
ucugcgggcu ugggaacgac gccccgcuag caacguacug cucuccuacc ggacugguag 2760
ccguuuaguu aucuuggagc gauagcacug ugagccucac ucaacgcgcg auggacgugg 2820
cgagugcccc ucagagauuu gugaaacucu auagagcuau uucgcgagcc agaagggagg 2880
auggccaccu gguguaagcc agguaucccc ggggggcuug uacucggggu cgcauuacug 2940
cuuagaccac aagguagggu ucgcaucuug gaacugaccc uaugaccuug ugggugcccu 3000
aaccggacug guagccguuu aauaucuugg agcgauuagc acgugugagc ccucacucaa 3060
cggcgcgauu ggacguggcg agugccccuc agaguaaucu gcagagcucc ggcagucgug 3120
ggaggcaagg ca 3132
<210> 21
<211> 3275
<212> RNA
<213> 榕树
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(3275)
<223> 无花果树iRNA的多核苷酸序列("iRNA亲属2"或"iRNA r2")
<400> 21
cucccacgac ugccggagcu cugcagaauu ccaccggggg uaccuggcuu acaccaggug 60
gccauccucc cuucuggcuc gcggaauagc ucuauagagu uucacaaauc ucugaggggc 120
acucgccacg uccaucgcgc guugagugag gcucacagug cuaucgcucc cagaauucgg 180
gauaaauaug gaagaaacuu cuuugcccaa agccugcugg aucaaaagcc aggcaggucu 240
ugcguacacc agcuaacuuu uccaaagggg uagugaaggc ugcguaccgg ugggucaaca 300
ugcccagagc caaauauguc agagaugucu ccacgagucu uggcauaguu gucgcugagc 360
cuguugcugc cgugcgccgu cagaugccuu cgauaagcag ccuugcggag gaguugguaa 420
cacgccagag cgucgacacu cugguggacg auuggugucu cggacuuucc aacccugaca 480
acaacgugga gguugguugg gcacuucguc ugagggaccg cuuuggucuc ccucccgccu 540
cugagcccac aaggcucagu ggugagagau gggugcuuaa acaacucaau ggaguagacc 600
cggaaucuug gaaugacgac uaugcguucg aagacgcuca ggaggauuuu caacgggaau 660
acgucccggg aaggaaugcc cauauugcug caacugcggc aacucuaugg cugacaaaga 720
ccuuguauga caaggcuuua guucgccauc aggguuuucg caguuugcag ugauuggggu 780
cgacgggcug gaggcuaaag cagugccucc agcugcugga cuccgacugc uuccgguucc 840
gcggcccgga caaagccgac ggcugucuca gaccuuacua cuuccuacuc cccgugcuac 900
uuuugucaau caugcaaauu caggcaauaa ucuugagcgu guuuugacca cacgggugau 960
gcaauacaaa ggccgagacc cgauacuacc cucccaggaa gcccugcgca aacuuaaccu 1020
ucggauagga caguuguaua agucuagacc auccacuguc uauccccuga guuaugaugg 1080
guuucuuaau uguuaugaug gccgacagcg uacucgcuac gcucaugccg ucgagcaauu 1140
gaugggugcc gcucugaccc caaaagaugc gcgaguugag acguucauua agaacgagaa 1200
guuugauugg uuguugaagg gagacgaggc ugauccucgu gcaauccaac cuaggaagcc 1260
gaaauauuug gccgagguug gucgaugguu caaaccguug gagcgaauca ucuacaagga 1320
ucucaguuug cguuuguacg gugauaacgc ugaaccuugc auugccaaag gcuuaaaugc 1380
auuggaauca ggggcuacgu ugagacguaa augggaaaag uucgcuaauc cuguuugugu 1440
uucauuggau gcuucucguu ucgaccugca cguaaguguu ggcuuguuaa aguucacgca 1500
uaaauuguac gacuauuacu gcaagucucc cacucuucaa cgauaucuca aauggacacu 1560
ccgcaacucc gguaucgccu ccuguaagga aaaaucauau gcguaugagg uugaaggccg 1620
uagaaugagu ggcgacaugg acaccgcauu aggcaacugu aucaucauga cgauauuaac 1680
uugguuuaug cuuagcgaac uuggcgugcg gcaugagcuu uucgauaaug gugaugauug 1740
uuuguucauu ugcgaagaaa aagacguacc uagccccgag acgaucauga acugguuugc 1800
ggauuuuggg uuugugguua gguuagaagg cgucgugucc guguuugagc gcauugaguu 1860
cugccaaaca ucgccuauau ggacugaucg agguuggcug auguguagaa acaucaaguc 1920
uuugaguaag gaucuuacga acguuaauuc gugcacuggc uccacuguug aauacaccca 1980
uugguugaaa gcaguuggaa aguguggauc ggugcucaau gcgggugugc cuauauuuca 2040
gucauuucac aacauguuga ugcgauuggg uacgaauucg cguauagauc gcgggguauu 2100
cuuuaggugu ggacuuguua aucucauucg ugggauggac agacaaccug aaguugagau 2160
cacuacuucc gcucgucuuu cuuuugaagu ggcauucggg aucacucccg gcaugcaauu 2220
ggcuauugag caauuuuaug acucagucgu gggcccucug gguaaaauaa aaucuguaaa 2280
auggccaaua gaucuaagaa aggaauacga uuacggaagc gcgugguucg aagaccaagg 2340
cguccuaggg ugaacaagga acucggauua ccgaugacac cuguucaaac uagaaugguu 2400
cggucaacgu ugaccaagga gaccaacaua ccuucuacug caaauagcgg ucgggaggcu 2460
guuugggcuu guuggccaau caacuuuagu gucuuuccgc aacuagccuc acucgugaau 2520
aaaccguuau acuggcgugu guccagugug caaguugcaa uggagccugc aaugucuucu 2580
uccacccaac auuguggugu uggucucagu ucuucugggg ccuucacaua acggugaugg 2640
guucgguaac gucuuuaagc ucuugcguuc uuguaacuau acgcggcgcu cucccguggg 2700
aggaaacgug auggucaaau ggccuaucug caugcccuuc auucuuaacg augaugcgca 2760
caagaacaca ggauuaaccg ccugugugau cauugcaguc accaauacug gugugcuaac 2820
uggucaaucu uggacggaga uucuguugaa uguggaguau acgccccgcu agcaucguac 2880
ugcucuccua ccggacuggu agccguuuag uuaucuugga gugauagcac uguggggcca 2940
cauuugacgc gcauuggacg cagacaaugu cccuccacag auuugugaau cucuauggag 3000
cuguaaccuc ggucucucua uagcuugucc gaacaggaaa uggacauaaa auaauugcug 3060
uuccaacacg uuguguuggu aaagaaguua uagauguggu gcgccagaca aguggauggc 3120
aaccuggagu aauccaggcg cucugggggg cuuauacucg gagugcauua cugcuuuaga 3180
ccguuaaucu caagaaccau gugugucgca uggggaggau uaacggcgcc caauucccuu 3240
guuaguuuag guacgccuug gucuucgaac cacgc 3275
<210> 22
<211> 2985
<212> RNA
<213> 无花果
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2985)
<223> 无花果树iRNA的多核苷酸序列("iRNA亲属3"或"iRNA r3")
<400> 22
gggguaaaua uggagaacca gcacacccau guuugcccac ggucguuccu gcgaaccugc 60
agggcgaucc ucgcggcucc agccaacuac ggucgugaug uggucaaaau cgccuacaaa 120
ugggcaucac gaaaccccgc caccgccccc cgaagugucc gagaauccau cggggucguu 180
gucggaagcg cuguggacuu cuugagcgcu ccucgcaagc guuuagaaga ccgcgcagag 240
caguuggugc aagacgaccg ggucgaccgg aucguccgcg agugggagcu aggaaccgcu 300
gacucccgaa uuccggaagu ugagugggca uaccgucugc gcgaccgcuu cggcgucgug 360
uccgccagcg agccugcuag gcaaacuggu gagagguggg ugcucaagca acuagaggga 420
uuggaggggg gggaguuccg cugcauaccc auugagccau ucuuugguga ugcaccggcc 480
cccguccaua gcccugggag caacagcgug auugcugcua uugcggcgac ccuuuggaug 540
acgccuaccc gccuugaccg ggcguugaga cgucaccagg guuuucgcaa cuagcgguga 600
ucggagucga cggagugucu gcuuuagcgg ugcaggcauc uucugaacuc cgaccgcuac 660
ggguugggcg accccgucaa agucgacguc guucgugguc ucugacuaug ccagcaccca 720
aguccuguuu cgugaaccac gcuaacucug accacaaucu caaaacgguc auggaaaaca 780
gggugcucaa guacaaaggc caagaacccg caaagccccg gguagaagcc uauaagcagc 840
ucuaugaaag gauacgaccg cgauaucguu cucuaccuga cacggucuau ccucuaucau 900
augauggcuu ccucaagugc uacuccggac guaggcgaac acgauacgaa caggccgucc 960
aggaguugag aaacgcgcca cucacacccg aagaugcugu cguuuccacg uucaucaaga 1020
acgagaaauu cgauuggcuc caaaagaaag aacuugcgga ucccagagcu auccaaccuc 1080
ggaaaccgaa auaccuggcc gaaguuggga ggugguucaa gccucuggag cacauaaugu 1140
auaaagacuu ggcaaaacgg uuguacgguc aggaugcguu gccuugcaua gcgaaagggc 1200
ugaacgcuag agaaacggcu gaagugcucc gagccaaaug ggacaaguuc gcuucucccg 1260
uuugcgucuc gcuggaugcc agucgguucg aucugcaugu aaguccugac gcauugcggu 1320
uuacgcaccg ccuguaccac aaguauugcc aaagucggca acuccgcaag uaccuagaau 1380
ggacgcugag aaacgcuggc gucgccucau guccugaaag cgcuuaucag uaugagguug 1440
aggggagacg caugaguggc gacauggaca ccgcacucgg caacugcgua cuuaugcucu 1500
gcuugacaug gaacuuccuc gaucaacaua acaucaagca ugagauaaug gacaacggag 1560
augacugcuu guucaucugu gaagcugccg augugccaac cgacaagcaa aucauggacu 1620
acuaccucga cuuuggguuc gugguucggu uggaaggaaa ggugucugug uucgagcgaa 1680
uagaguucug ucaaaccagu ccgguguuga cugcuaaugg auggcguaug guuagaaauu 1740
ugaaguccau ugcgaaggac cucugcaaug ugaacauggc gacuggguca cucagugaau 1800
acacugcgug gcuuaaagcc gugggaaucu gugguagaau ccugaacgau gggguuccaa 1860
ucuucuccgc cuuccacaac augcuggugc gacauggaac gaacucacga auagauagag 1920
cgguguucug ggaaugugga cugacaaacu ugaucaaagg caugaguuuc gagcaacugg 1980
aaaucacugu cgcugcgcgc gaguccuuuu aucuggcaua cgguaucaca ccggcgagac 2040
aacucgcgau ugaagaguau uacgacucac uccagggccc gguggguaaa auacaacuuc 2100
augaauggcc acuacaacuc aaagaggaau acgcgugcgg cgccgagugg uucgaaggag 2160
acggcgagcg ggcuugaggc ccgcuggcuu gcccuucgug cccggcagcu cucgcacggu 2220
ucggacugcg cucguccucg agaaccacuu gccgaugucc ucggcacagu ugggucaaga 2280
ggccguugcg uauucuaucc cgugcaaugu ucgaaacaug ccuacgaucc ugacucucgc 2340
caccacuccg cucuauuggc guaucaccgc caucacuguc gcgauggagc cugcaaaguc 2400
cacaucgacc caaauugccg guguggggaa ugcugauuca uuucagucug ccaccuacaa 2460
cgguuuuggg aacguguuua agaaaaugcg cgcuuugaau uucgugagac gcucggcgcc 2520
cggaggcaau cuucagguac gcuggccuau caauauggac uggaucuccg cauccgacac 2580
ggacaaggau agcacaaaag ugcccucgcu auucuuugcc gugaccaacc caggugugau 2640
cgaaaccaaa caaggggaca gugaggccug guuggaaugg gaguuggagc uggaguacau 2700
aguuggaggc uaggaacgac ugcccgcuug agaucgacuc ucccguggug agguaccacc 2760
cacucagcug ugucagccgg uuggagaaac ucuggugcga uagcacuguu ggccccugcc 2820
uagcgugugc ugugggaaag ccccaacaga uuugugaaac acuggaguug ucgacccgcg 2880
agacgugcgg cucgaguugu cgcuuccccg ugaggggggc ugccgggggg uagagaaaua 2940
uucccgguau uuauccgcua agaccuacgc gcgacgaaac uggcg 2985
<210> 23
<211> 4252
<212> RNA
<213> 豌豆耳突花叶病毒2(PEMV2)
<400> 23
ggguauuuau agagaucagu augaacugug ucgcuaggau caagcggugg uucacaccug 60
acuucacccc uggcgagggc gugaagucua gagcucaacu ggaaagagag cuggauccca 120
ccugggcgcu ucucgugugc caagaacgag cgcgucguga ugcugacagu auugcuaaug 180
agugguacga gggcagcaug gagugcaacc uccuuauccc ucggcccaca accgaggaug 240
uauuuggccc cuccaucgcc ccugagccug uggcucuagu ggaggaaacu acccguuccc 300
gcgcgccgug cguggauguc ccugccgagg aguccuguaa gucagcggag auugauccug 360
uugaucucgc caaguucgac ucccuccauc gucgccuguu ggcugaagcc aacccuugca 420
gggaaauggu ucugugggug ccuccuggcc uaccagcaga gcgcgacguc cugcccaggg 480
cacguggggu gauaaugauc cccgaagucc cugccucugc acauaccuug uccgugaagg 540
uuauggaggc ugugcgguug gcacaggaag ucuuggcauc ccuugccaag agggccuuag 600
agaaaagguc uacaccaacc cuuaccgccc aggcccagcc agaggcuacc cugucggggu 660
gcgacuaccc guaucaggag acuggagcag cagccgcgug gauaacgccu ggcugcauug 720
ccauggagcu cagagccaaa uuuggcgucu gcaaacgcac ccccgcaaac uuagagaugg 780
ggagucgcgu cgcccgcgag cuccugcggg auaacugugu cacuugcagg gagaccacgu 840
gguacaccag ugccauugcu guggaccugu gguugacccc gaccgucguc gaccuggccu 900
guggccggcg agcggcggau uuuugguagg ggcugugcug ccucggcugg gggaagacac 960
cagugugcgg uuugacaacc ugcaccccag caucgaggua aucaaggcgg cuaggccccg 1020
cccaacccag aggaugucgu uccaaaucga cguugugcgu ccucuuggag auuuuggugu 1080
gcacaacaac ucccuuguua accuagccag gggaauuaau gaaagggugu ucuacacgga 1140
caaugcuagg acagaacccc uccagccuaa gguucccuuc cccucaucac gggagcuaaa 1200
aaccuucaga gucaccccuu ggaccaugga uaggguugug gagaguuaca caggguccca 1260
gcgcacucgc uaugcuaacg cgcgggacag cauauuaucc aacccucuga gucccaaaga 1320
ugcgcggguc aagacguuug ucaaagcuga aaagauaaau uucacagcca aaccugaccc 1380
cgccccucgu gugauacagc cuagggaucc acgauucaac auuguccugg cuaaauacau 1440
caagccuuug gagccaaugu uguacaaagc acuggggaaa cuuuacaagu accccgcagu 1500
ugcuaagggg uuuaacgcgg uugagacggg ggagaucauc gccggcaagu ggcggugcuu 1560
caaagauccu gucgucgugg gauuagacgc uucccgauuu gaucagcaug uaucugucga 1620
ggcguugcag uucacccacg cgguguacag aggguucauc aagucacggg aguuuaacaa 1680
ccuccuacag augauguaca ccaaccgugg ccuagggucc gcuaaggacg gauucguccg 1740
uuacaagguu aaagguagac gcaugagcgg ugacauggac accuccuugg gcaacugugu 1800
gcucauggug uugcucacca ggaaccuuug caagguucua ggcaucccgc acgagcucuu 1860
caacaauggu gaugauugca ucgucuuuuu cgaucguugc cacuuggaga aguucaacaa 1920
ugcugucaag acuuauuuug cggaccuagg guuuaagaug aagguggaac cgccgguuga 1980
cguguuggag aaaauagagu ucugccaaac gcagccuauc uaugacgggg agaaguggcg 2040
caccgugcgu ugcaucucga guaucggaaa agauugcuca uccguuauua guugggacca 2100
auuggagggg ugguggaaug ccaucgccca gaguggucug gcugugugug gcggaaugcc 2160
gauauacacg ucguucuacc gguggcuagc acgggccggu aagaguggga ccaaguguca 2220
gucacacccc uuguggaaaa acgagggguu gaauugguac aggaugggga uggaccuuuc 2280
ucaugagguu aauguuaccc cucaggcgcg ccugucuuuc uucgcggguu uugguauuuc 2340
ccccccgaug caggucgcca uugaggcgcu guaugacaag cugccuccac cgucccccca 2400
ccaugguccu ccgguuaagg cuguaacaca gcgaguguuc accaauuauu ucacgccgga 2460
aagcgccugu guuagcauga gcacgaauga agacaacaaa ucugacuuug cuguuuacgg 2520
cccugugccu acagugaugu cucuuugugc ucaguguuag gcucuuaaau uuuagcgaug 2580
gcgugacacg guuacacccu gaauugacag gguacagauc aagggaagcc ggggagucac 2640
caacccaccc ugaaucgaca gggcaaaaag ggaagccggg caccgcccac guggaaucga 2700
ccacgucacc uuuucgcguc gacuaugccg ucaacacccu uucggcccgc cagccuagga 2760
caauggcggu agggaaauau augacgauaa ucauuaaugu caauaacgac gagcgcaagc 2820
aaccagaagg agcuacuggc agcucuguac ggcgagguga caauaaaaga acucgaggaa 2880
acaaaccucg gagucaucac cccgguucgc gcgaacgaaa agguuacaau caccccucuc 2940
cuacccccaa aaacucaaag cagggucagc uccguacuga agcgguucag gagcacccga 3000
aacacggggg gacugcuuuc cguagagaaa guggugguag uguucacccc ucacaucccc 3060
gacgacgugc uaggagaggu ggagauaugg cuccacgaca gcauccuccc ccaccucggg 3120
agcgucggac caagacugaa acucaagcug agcgaagggc ccaagcucuu agcguucuac 3180
ccacccuacu cgauugcauu gggggacucg aucucgggcc agccgagguc cuucuccauu 3240
gucaccgagc uguucgaagg caacuucgca ccggggugca gcccauucag ccuguuccuc 3300
auguggaguc cacgcaucga agcagugacc cacaacuacu ugagucgucc accacgugcu 3360
cugccaauuu gcagaacgau ggugcgggac gcguuaucgg agguggcauc ccaacagcaa 3420
uaccugaagg gagcgauguc gaacagguau gccaugccuc ucacuacggg ugauggccag 3480
cauagagcca ugaagggggc ucccagugcc cuuccaccaa cgggggugug uacccaggcu 3540
ucuaagugag gcuucgcuuc ccgccggaag accgcggcgg uucuguuccu cccacaggag 3600
uacggcaaca acccaccuug ggaaaguggg gaccccagca cuaacuccuu uaacuaggcg 3660
ggcguguugg uuacaguagg aggggacagu gcgcaucgaa acugagcccc accacaacuc 3720
ucauccacgg ggugguuggg acgcaggugu cggagggauc gccagcccuc aggauaguga 3780
gcucccgcag agggauaagc uaucucccug cgacguagug guagaacacg ugggauaggg 3840
gaugaccuug ucgaccgguu aucggucccc ugcuccuucg agcuggcaag gcgcucacag 3900
guucuacacu gcuacuaaag uugguggugg augucucgcc caaaaagauc acaaacgcgc 3960
gggacaaggu cccuuccacc uucgccgggu aaggcuagag ucagcgcugc augacuauaa 4020
cuugcggccg auccaguugc acgacuggug gucccccuca gugucucggu ugucugccga 4080
gugggcggug gucggauucc accacacccu gccacgaggu gcguggagac uuggccaguc 4140
uaggcucguc guaauuaguu gcagcgacgu uaaucaaccc guccgggcau auaauaggac 4200
cgguugugcu ucuuccuccc uucuuagcca ggugguuacc ucccuggcgc cc 4252
<210> 24
<211> 313
<212> RNA
<213> 豌豆耳突花叶病毒2(PEMV2)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(313)
<223> PEMV2的基因间正向区域
<400> 24
guuagcauga gcacgaauga agacaacaaa ucugacuuug cuguuuacgg cccugugccu 60
acagugaugu cucuuugugc ucaguguuag gcucuuaaau uuuagcgaug gcgugacacg 120
guuacacccu gaauugacag gguacagauc aagggaagcc ggggagucac caacccaccc 180
ugaaucgaca gggcaaaaag ggaagccggg caccgcccac guggaaucga ccacgucacc 240
uuuucgcguc gacuaugccg ucaacacccu uucggcccgc cagccuagga caauggcggu 300
agggaaauau aug 313
<210> 25
<211> 139
<212> RNA
<213> 豌豆耳突花叶病毒2(PEMV2)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(139)
<223> 重新编码PEMV2移码位点的多核苷酸序列
<400> 25
gaccgucguc gaccuggccu guggccggcg agcggcggau uuuugguagg ggcugugcug 60
ccucggcugg gggaagacac cagugugcgg uuugacaacc ugcaccccag caucgaggua 120
aucaaggcgg cuaggcccc 139
<210> 26
<211> 65
<212> DNA
<213> 拟南芥
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(65)
<223> 插入区域的序列
<400> 26
taggcctcga cacgggaagg tagctgtccc ggcactgggt tgcacatatt ccgtgccgac 60
gccac 65
<210> 27
<211> 43
<212> DNA
<213> 拟南芥
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(43)
<223> 插入序列的区域
<400> 27
ccggcctcga cacgggaagg tagctattcc gtgccgacgc cgt 43
<210> 28
<400> 28
000
<210> 29
<400> 29
000
<210> 30
<211> 10
<212> RNA
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(10)
<223> 锁定和对接序列
<400> 30
guccuaaguc 10
<210> 31
<211> 14
<212> RNA
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(14)
<223> 锁定和对接序列
<400> 31
caggggaaac uuug 14
<210> 32
<211> 31
<212> RNA
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(31)
<223> 包括对接的四碱基环的支架
<400> 32
cauuagcuaa ggaugaaagu cuaugcuaau g 31
<210> 33
<211> 57
<212> RNA
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(57)
<223> 锁定和对接序列
<400> 33
gcaccuaagg cgucaggguc uagacccugc ucaggggaaa cuuugucgcu auggugc 57
<210> 34
<211> 47
<212> RNA
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(47)
<223> 插入CYVaV中的序列
<400> 34
ggcuaguuaa ucucauucgu gggauggaca ggcagccuga cguugac 47
<210> 35
<211> 30
<212> RNA
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> CYVaV插入的序列(未修饰; U在位置3、6、8、14、17和29)
<400> 35
guuaauguag gugucuuucc guaucuaguc 30
<210> 36
<211> 30
<212> RNA
<213> 柑桔黄脉相关病毒(CYVaV)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(30)
<223> CYVaV插入的序列(修饰；G在位置3、6、8、14、17和29)
<400> 36
gucaacgcag gugccugucc guaucuagcc 30

Claims (43)

1.一种包括复制元件和异源区段的正义链单链核糖核酸(RNA)载体，其中所述RNA载体缺少功能性外壳蛋白开放阅读框(ORF)和功能性移动蛋白ORF。
2.权利要求1的RNA载体，其包括包含SEQ ID NO:4和/或SEQ ID NO:5的核酸序列的3’帽独立翻译增强子(3’CITE)。
3.权利要求2的RNA载体，其中所述3’CITE包括SEQ ID NO：3的核酸序列。
4.权利要求1-3中任一项的RNA载体，其中所述复制元件包括具有以下核酸序列的一个或多个保守的多核苷酸序列：SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和/或SEQ ID NO:14。
5.权利要求1-4中任一项的RNA载体，其中所述复制元件进一步包括具有以下核酸序列的多个保守的多核苷酸序列之一：SEQ ID NO:15和/或SEQ ID NO:16。
6.权利要求1-5中任一项的RNA载体，其源自柑桔黄脉病毒(SEQ ID NO：1)或其iRNA亲属。
7.权利要求1-6中任一项的RNA载体，其能够在宿主植物内进行系统的和韧皮部限制的移动和复制。
8.权利要求7的RNA载体，其在其感染后至少一个月对于在宿主植物内的复制、移动和/或翻译在功能上是稳定的。
9.权利要求1-8中任一项的RNA载体，其中所述异源区段包括编码至少一种多肽的多核苷酸，所述多肽选自由下述组成的组中：报告分子、肽和蛋白质。
10.权利要求9的RNA载体，其中所述多肽为杀昆虫剂、抗细菌剂、抗病毒剂或抗真菌剂。
11.权利要求10的RNA载体，其中所述抗细菌剂是酶抗生素。
12.据权利要求10-11中任一项的RNA载体，其中所述抗细菌剂靶向细菌柑桔黄龙病菌物种。
13.权利要求12的RNA载体，其中所述柑桔黄龙病菌物种是柑桔黄龙病菌亚洲种(CLas)。
14.权利要求1-13中任一项的RNA载体，其中所述异源区段包括小的非编码RNA分子和/或RNA干扰分子。
15.权利要求14的RNA载体，其中所述小的非编码RNA分子和/或所述RNA干扰分子靶向昆虫载体、病毒或真菌。
16.权利要求15的RNA载体，其中所述小的非编码RNA分子和/或所述RNA干扰分子靶向所述昆虫载体、所述病毒或所述真菌的核酸。
17.权利要求15-16中任一项的RNA载体，其中所述病毒选自由下述组成的组中：柑桔脉突病毒(CVEV)和柑桔衰退病毒(CTV)。
18.权利要求1-17中任一项的RNA载体，其中所述异源区段是第一异源区段，进一步包括第二异源区段，其中所述复制元件位于所述第一和第二异源区段之间。
19.权利要求1-18中任一项的RNA载体，其中所述异源区段包括编码改变表型性状的蛋白质或肽的多核苷酸。
20.权利要求19的RNA载体，其中所述表型性状选自由下述组成的组中：杀虫剂耐受性、除草剂耐受性、昆虫抗性、减少的胼胝质产生、增加的生长速率和矮小。
21.一种包括权利要求1-20中任一项的RNA载体的宿主植物，其中所述宿主植物为整个植物、植物器官、植物组织或植物细胞。
22.权利要求21的宿主植物，其中所述宿主植物属于选自由下述组成的组中的属：柑橘属、葡萄属、榕属和木犀属。
23.权利要求22的宿主植物，其中所述宿主植物为柑桔树或柑桔树嫁接物。
24.一种组合物，其包括用权利要求1-20中任一项的RNA载体感染的植物、植物器官、植物组织或植物细胞。
25.权利要求24的组合物，其中所述植物属于选自由下述组成的组中的属：柑橘属、葡萄属、榕属和木犀属。
26.权利要求25的组合物，其中所述植物为柑桔树或柑桔树嫁接物。
27.一种将异源区段引入宿主植物中的方法，包括将权利要求1-20中任一项的RNA载体引入所述宿主植物。
28.权利要求27的方法，其中所述引入步骤包括将包含RNA载体的植物的植物器官或植物组织嫁接到在所述引入之前不包含RNA载体的另一植物的植物器官或植物组织。
29.权利要求27-28中任一项的方法，其中RNA载体系统性地感染宿主植物。
30.一种在植物、植物器官、植物组织或植物细胞中产生异源区段的方法，包括将权利要求1-20中任一项的RNA载体引入所述植物、所述植物组织或所述植物细胞中。
31.权利要求30的方法，其中所述植物属于选自由下述组成的组中的属：柑桔属、葡萄属、榕属和木犀属。
32.一种包含权利要求1-20中任一项的RNA载体的试剂盒。
33.权利要求1-20中任一项的RNA载体用于将异源区段引入植物、植物器官、植物组织或植物细胞的用途。
34.权利要求21-23中任一项的宿主植物或权利要求24-26中任一项的组合物的用途，用于将RNA载体引入在所述引入之前不包含RNA载体的植物器官或植物组织中。
35.权利要求34的用途，其中所述引入包括将包含RNA载体的植物的植物器官或植物组织嫁接到不包含RNA载体的另一植物的植物器官或植物组织。
36.一种制备用于植物的载体的方法，包括将一个或多个异源区段插入到RNA中的步骤，其中RNA选自由下述组成的组中：CYVaV；CYVaV的亲属；与CYVaV具有至少70％RdRp同一性的其他RNA载体；和另一种iRNA。
37.一种通过权利要求36的方法产生的载体。
38.RNA作为载体的用途，其中RNA选自由下述组成的组中：CYVaV；CYVaV的亲属；与CYVaV具有至少70％RdRp同一性的其他RNA载体；以及，另一种iRNA。
39.权利要求38的用途，其中RNA用于治疗植物，例如治疗植物的病毒或细菌感染，例如治疗柑桔植物中的CTV感染或柑桔绿色化。
40.权利要求38-39中任一项的用途，其中RNA用一个或多个插入的异源区段例如酶抗生素进行修饰。
41.特征在于制备用于治疗植物疾病或病况的药物的RNA的用途，其中RNA选自由下述组成的组中：CYVaV；CYVaV的亲属；与CYVaV具有至少70％RdRp同一性的其他RNA载体；以及，另一种iRNA。
42.权利要求41的用途，其中所述疾病或病况是植物的病毒或细菌感染，例如柑桔植物中的CTV或柑橘绿色化。
43.一种用作药物或用于治疗植物疾病或病况的RNA，其中所述RNA选自由下述组成的组中：CYVaV；CYVaV的亲属；与CYVaV具有至少70％RdRp同一性的其他RNA载体；以及，另一种iRNA。
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