DE10109354A9

DE10109354A9 - Rekombinante virale schaltersysteme

Info

Publication number: DE10109354A9
Application number: DE2001109354
Authority: DE
Inventors: Victor 06114 Halle Klimyuk; Gregor 06114 Halle Benning; Yuri 06114 Halle Gleba
Original assignee: Icon Genetics AG, 80539 München
Filing date: 2001-02-27

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zur Kontrolle eines biochemischen Prozesses oder einer biochemischen Kaskade in Pflanzen, die einen Interaktionsprozess zwischen zwei heterologen DNS-Sequenzen in einer transgenen Pflanze auf der einen Seite und einer heterologen DNS-Sequenz in einem pflanzenviralen Transfektionsvektor auf der anderen Seite benutzt. Optional schließt dieser Interaktionsprozess weiterhin eine niedermolekulare Verbindung ein. Der Interaktionsprozess stellt mittels einer Infektion mit einem viralen Transfektionsvektor einen "Gen-Schalter" dar, der einen gewünschten biochemischen Prozess oder eine biochemische Kaskade mit Hilfe von verschiedenen Reaktionen wie der Nukleinsäurekombination, der Replikation, der Transkription, der Restriktion, der Translation, der Proteinfaltung, dem Proteinaufbau (assembly), dem Proteintransport innerhalb der Zelle (targeting), der posttranslationalen Prozessierung oder einer enzymatischen Reaktion einschaltet. Weiterhin wird ein Verfahren zur Erzeugung eines Produktes in einer transgenen Pflanze und ein Kit für solch ein Verfahren zur Verfügung gestellt.

Description

Beschreibung
ALLGEMEINES FORSCHUNGSGEBIET DER ERFINDUNG

[0001] Die vorgelegte Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren, das einen gewünschten biochemischen Prozess oder eine biochemische Kaskade in einer Pflanze gemäß der Präambel des Anspruches 1 kontrolliert. Darüber hinaus bezieht sich die vorgelegte Erfindung auf ein Verfahren zur Herstellung eines Produktes in einer transgenen Pflanze, bei dem der Prozess benutzt wird, der einen gewünschten biochemischen Prozess oder eine biochemische Kaskade in einer Pflanze gemäß der Erfindung kontrolliert. Schließlich betrifft diese Erfindung einen Kit zur Durchführung des erfindungsgemä-Ben Verfahrens. Das Verfahren der Erfindung erlaubt die selektive Expressionskontrolle eines Transgens in einer transgenen Pflanze, wobei ein gewünschter biochemischer Prozess oder eine biochemische Kaskade, die zunächst nicht in der Pflanze funktionell sind, selektiv zu einem vorher bestimmten Zeitpunkt angeschaltet werden können.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Kontrollierbare Expressionssysteme von Transgenen in Pflanzen

[0002] Das Erreichen einer verlässlich kontrollierten Expression eines Transgens ist eines der Hauptprobleme in der Pflanzenbiotechnologie. Die genaue Kontrolle der Genexpression ist essentiell in Pflanzen, wenn ein nachfolgendes transgenes Expressionsprodukt das Wachstum inhibiert oder toxisch wirkt. Als Beispiel hierfür können zum einen bioabbaubare Polymere (Nawrath, Poirier & Somerville, 1994, Proc. Natl. Acad. Sei., 91, 12760-12764; John & Keller, 1996, Proc. Natl. Acad. Sei. 93, 12768-12773; US 6103956; US 5660555) oder Proteintoxine (US 6140075) angeführt werden.
[0003] Die existierenden Technologien zur Kontrolle der Genexpression in Pflanzen basieren normaler Weise auf gewebespezifischen oder induzierbaren Promotoren, welche alle unter einer basalen Expressionsaktivität leiden, selbst wenn die Promotoraktivität nicht induziert ist. Dementsprechend werden die Promotoren auch als "undicht" bezeichnet. Gewebespezifische Promotoren (US 05955361; WO 09828431) stellen ein schlagkräftiges Werkzeug dar, wobei deren Anwendung auf sehr spezielle Gebiete limitiert ist. Als Beispiele für diese Anwendungen sind die Erzeugung von sterilen Pflanzen (WO 9839462) oder die Expression von interessanten Genen in Samen (WO 00068388; US 05608152) zu nennen. Induzierbare Promotoren können in zwei Kategorien in bezug auf ihre Induktionsbedingungen eingeteilt werden. Zum einen gibt es Promotoren, die durch abiotische Faktoren wie Temperatur, Licht oder chemische Substanzen induziert werden und zum anderen gibt es Promotoren, die durch biotische Faktoren wie zum Beispiel Pathogenbefall induziert werden. Beispiele für die erste Kategorie stellen Hitze bzw. Kälte induzierbare Promotoren oder Promotoren, die durch chemische Substanzen wie Kupfer (Mett et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei., 90, 4567—4571), Steroidhormone (Aoyama & Chua, 1997, Plant J., 11, 605-612; McNellis et al, 1998, Plant J., 14, 247-257; US 06063985), Ethanol (Caddick et al, 1997, Nature Biotech 16, 177-180; WO 09321334) oder Tetracyclin (Weinmann et al, 1994, Plant J., 5, 559-569) induziert werden. Eine der letzten Entwicklungen auf dem Gebiet der chemisch induzierbaren Systeme für Pflanzen ist ein chimärer Promotor, der auf der einen Seite mit Glucocorticoid Dexamethason eingeschaltet und auf der anderen Seite mit Tetracyclin ausgeschaltet werden kann (Bohner et al, 1999, Plant J., 19, 87-95). Eine Übersicht über das Gebiet der chemisch induzierbaren Systeme bietet ein Artikel von Zuo & Chua (2000, Current Opin. BiotechnoL, 11, 146-151). Andere Beispiele für induzierbare Promotoren sind Promotoren, welche die Expression von PR-Genen (pathogenesis-related genes) in Pflanzen kontrollieren. Diese Promotoren können nach der Behandlung der Pflanzen mit Salicylsäure induziert werden, wobei die Salicylsäure eine wichtige Komponente des pflanzlichen Signalweges für die Pathogenabwehr darstellt. Ebenso können aber auch andere chemische Verbindungen wie Benzo-1,2,3-thiadiazol oder Isonikotinsäure die PR-Genexpression induzieren (US 05942662).

[0004] In weiteren Artikeln wird von einer Kontrolle der Transgenexpression mit Hilfe von viralen, RNS-abhängigen RNS-Polymerasen berichtet, die mittels viraler Infektionen zur Verfügung gestellt werden (z. B. US 6093554; US 5919705). In diesen Systemen besitzt eine rekombinante Pflanzen-DNS-Sequenz eine Nukleotidsequenz aus einem viralen Genom, die von einer viralen, RNS-abhängigen RNS-Polymerase erkannt wird. Die Leistungsfähigkeit dieser Systeme ist begrenzt, weil virale Polymerasen nur eine geringe Fähigkeit besitzen in trans ihrer Funktion auszuüben, die zudem nur auf die Kontrolle der RNS-Amplifikation beschränkt ist.

[0005] Die zuvor beschriebenen Systeme sind von wesentlichem Interesse, um gewünschte Expressionsmuster des Transgens zu erzielen. Sie erlauben aber keine strikte Kontrolle des Expressionsmusters, weil die induzierenden Agenzien wie Kupfer oder in Steroid kontrollierten Systeme analog wirkende Agenzien wie die Brassino-steroide in pflanzlichen Geweben in bestimmten Konzentrationen vorliegen, die ausreichen, um eine Grundexpression zu verursachen. Zusätzlich ist der Gebrauch von Antibiotika und Steroiden als chemische Induktoren in großem Maßstab nicht erwünscht. In dem Fall, dass Promotoren von PR-Genen oder virale RNS-abhängige RNS-Polymerasen als Mittel der Kontrolle für Transgene eingesetzt werden, ist ebenfalls die Forderung nach einer strikten Kontrolle der Expression des Transgens nicht erfüllt, weil zufällige Pathogeninfektionen oder Stress die Expression des Transgens verursachen können. Gewebe oder organspezifische Promotoren sind auf sehr enge Anwendungsgebiete begrenzt, weil sie die Expression auf spezifische Organe oder Entwicklungsstadien der Pflanze einschränken, so dass die Expression des Transgens nicht zu jedem vorher bestimmten Zeitpunkt eingeschaltet werden kann.

Pflanzenvirus-Vektoren und ihr Einsatz in dem Gebiet der angewandten Pflanzenvirologie
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[0006] Zur Zeit werden drei verschiedene Hauptfelder auf dem Gebiet der angewandten Pflanzen Virologie bearbeitet: a) der Einsatz von Viren als Vektoren zur Überexprimierung eines Transgens, b) der Einsatz von Viren als Vektoren für die funktionell Genomforschung (Genomics) in Pflanzen und c) der Einsatz von viralen Komponenten auf dem Gebiet

der Phythopathologie zur Erzeugung transgener Pflanzen, die resistent gegen Viren sind.

[0007] Pflanzenviren können als effiziente Werkzeuge für eine quantitativ hohe Transgenexpression in Wirtspflanzen dienen. Der Einsatz von transgenen Pflanzenviren im Freiland scheint dabei keinen Aspekt der biologischen Sicherheit zu gefährden. So konnte zum Beispiel der Animal and Plant Health Inspection Service (USDA) keine signifikante Auswirkung von Feldversuchen mit genetisch modifizierten tobacco mosaic virus (TMV) und tobacco etch virus (TEV) finden, die heterologe Gene von pharmakologischem Interesse enthielten. Demzufolge wurden 1996 und 1998 zwei Genehmigungen für Freisetzungen ausgestellt. Es wurden virale Vektoren zum Transfer von fremdem, genetischem Material in Pflanzenwirte entwickelt, um entsprechende Gene zu exprimieren (US 4885248; US 5173410). Es gibt mehrere Patente, in denen die ersten viralen Vektoren beschieben sind, die für eine systemische Expression von genetischem Material geeignet sind (US 5316931; US 5589367; US 5866785). Im Allgemeinen können diese Vektoren Fremdgene mittels eines zusätzlichen, subgenomischen Promotors (US 5466788; US 5670353; US 5866785) in Form einer translationalen Fusion mit viralen Proteinen (US 5491076; US 5977438) oder ausgehend von einer polycitronischen RNS exprimieren. Im Fall der polycistronischen RNS werden für die unabhängige Proteintranslation IRES-Elemente gemäß dem Anhang A der Anmeldung des Deutschen Patentes Nr. 100 49 587.7 verwendet. Carrington et al. (US 5491076) beschreiben den Gebrauch einer endogenen, viralen Protease, um heterologe Proteine von den viralen Polyproteinen abzuspalten. Ein anderes Gebiet, in dem virale Vektoren Verwendung finden, ist die funktionelle Genomanalyse (Genomics). Della-Cioppa et al. (WO 993651) beschreiben den Gebrauch von auf dem TMV-Virus basierende, virale Vektoren, um cDNS-Bibliotheken aus Pflanzen zu exprimieren, wobei die entsprechenden endogenen Gene stillgelegt werden (Silencing).
[0008] Angell & Baulcombe (1997, EMBO J., 16, 3675-3684; WO 9836083) beschreiben ein auf dem PVX-Virus basierendes System das sogenannte "Amplicon™", das für die Herunterregulierung bestimmter Zielgene in Pflanzen entwickelt wurde. Das gleiche System kombiniert mit dem HC-Pro-Gen, das die Stillegung von Transgenen in Pflanzen unterdrückt (Pruss et al., 1997, Plant Cell, 9, 859-868; US 5939541), wird für die Überexprimierung von Transgenen eingesetzt. In dem US-Patent 5939541 wird ein Ansatz beschrieben, der die dem 5'-Ende nächst gelegene Region des Potyvirus (Verstärkersequenz einschließlich des Hc-Pro-Gens) nutzt, um die Expression eines beliebigen Gens in Pflanzen zu verstärken. Diese Sequenz kann stabil in dem Pflanzengenom integriert werden oder mit Hilfe eines Virus eingebracht werden. Es sollte daraufhingewiesen werden, dass das Hc-Pro-Gen einen ausgeprägten, pleiotropen Effekt hat und die Expression sowohl des Transgens als auch der endogenen Gene in der Pflanze verstärkt. Auf diese Weise bieten diese Systeme am besten die quantitative Verbesserung der gesamten Proteinexpression gegenüber bereits bestehenden Prozessen. Diese Systeme erreichen dies, in dem viele Komponenten der Proteinexpressionsmaschinerie mit Hilfe unbekannter Mechanismen beeinflusst werden, die nur schwer kontrolliert werden können.

[0009] In der Literatur findet man zahlreiche Artikel und Patentanmeldungen, welche die Erzeugung von virusresistenten Pflanzen beschreiben. Dieses Ziel wird dabei zumeist mittels der Überexpression von viralen Genen oder mutierten Formen der viralen RNS erreicht (z. B. US 5792926; US 6040496). Es sollte in diesem Zusammenhang darauf ingewiesen werden, dass ein Umweltrisiko mit dem Gebrauch solcher Pflanzen verbunden ist, weil neue Viren durch die Rekombination des Virus mit der transgenen, viralen RNS oder DNS entstehen können (Adair & Kearney, 2000, Arch. Virol, 145, 1867-1883).

[0010] Aus diesem Grund ist ein Ziel dieser vorliegenden Erfindung, einen für die Umwelt sicheres Verfahren zur Verfügung zu stellen, das einen biochemischen Prozess oder eine biochemische Kaskade von Interesse in einer Pflanze kontrolliert, wobei dieser Prozess oder diese Kaskade selektiv zu jeder vorher bestimmten Zeit eingeschaltet werden kann. [0011] Ein weiteres Ziel dieser Erfindung ist es, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, mit dessen Hilfe ein Produkt in einer transgenen Pflanze hergestellt wird, wobei die Herstellung dieses Produktes selektiv eingeschaltet werden kann, nachdem die Pflanze bis zu einem gewünschten Stadium herangewachsen ist. Gleichzeitig ist dieses Verfahren in bezug auf die Umwelt sicher, weil es zu keiner Verbreitung von potentiell gefährlichen, funktionellen Transgenen in der Umwelt kommt.

[0012] Ein anderes Ziel dieser Erfindung ist es, einen Kit zur Verfügung zu stellen, um solch ein Verfahren durchzuführen.

ALLGEMEINE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

[0013] Die oben genannten Ziele werden mittels eines Verfahrens zur Kontrolle eines gewünschten biochemischen Prozesses (Π) oder einer gewünschten biochemischen Kaskade (ΙΠ) in einer Pflanze erreicht, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einführen von einer oder mehreren ersten heterologen DNA Sequenzen nicht pflanzenviralen Ursprungs in das Kerngenom der Pflanze,

(b) Infizieren der Pflanze mit mindestens einem viralen Transfektionsvektor, der in seinem Genom eine oder mehrere zweite heterologe DNA Sequenzen enthält, wodurch in der Pflanze ein Interaktionsprozess (I) getriggert wird zwischen

(i) einer oder mehreren ersten heterologen DNA Sequenzen des Kerngenoms und/oder Expressionsprodukten der ersten heterologen DNA Sequenzen und (ii) einer oder mehreren zweiten heterologen DNA Sequenzen des Transfektionsvektors und/oder Expressionsprodukten der zweiten heterologen DNA Sequenzen und,

(iii) wahlweise, einer oder mehreren von außen zugegebenen Komponenten von niederem Molekulargewicht, wodurch der gewünschte biochemische Prozess (Π) oder die gewünschte biochemische Kaskade (ΠΙ), der/die vor der Interaktion nicht funktionsfähig war, angeschaltet wird.

[0014] Diese Erfindung stellt weiterhin ein Verfahren zur Verfügung, mit dem ein Produkt in einer transgenen Pflanze erzeugt werden kann, wobei dieses Verfahren einen gewünschten biochemischen Prozess oder eine biochemische Kas-

kade in einer Pflanze gemäß der Erfindung kontrolliert. Insbesondere umfasst dieses Verfahren die folgenden Schritte:

(a) Heranziehen der transgenen Pflanze bis zu einer gewünschten Größe gefolgt von

(b) Infizieren der Pflanze mit einem oder mehreren viralen Transfektionsvektoren und wahlweise Behandeln der Pflanze mit einer oder mehreren niedermolekularen Komponenten, so dass der zur Herstellung des Erzeugnisses nötige biochemische Prozess oder die biochemische Kaskade angeschaltet wird, wobei der Prozess oder die Kaskade vor der Interaktion nicht funktionsfähig ist, und

(c) Herstellen des Erzeugnisses in der Pflanze.

[0015] Weiterhin wird ein Kit für das oben erwähnte Verfahren zur Verfügung gestellt, der eine transgene Pflanze oder Samen von dieser und einen auf einem Virus basierenden Vektor umfasst.

[0016] Gemäß der Erfindung ist es möglich, selektiv einen biochemischen Prozess oder eine biochemische Kaskade in einer transgenen Pflanzen durch die Infektion der transgenen Pflanzen mit einem oder mehreren viralen Transfektionsvektoren einzuschalten. Der biochemische Prozess oder die biochemische Kaskade ist vor der Infektion mit dem viralen Vektor in der transgenen Pflanze nicht operativ (funktionsfähig), weil essentielle Elemente oder Funktionen, die zum Ablauf des biochemischen Prozesses oder der biochemischen Kaskade notwendig sind, fehlen. Essentielle Elemente können zum Beispiel Promotoren, eine RNS-Polymerase, ein Transkriptionsfaktor oder dergleichen sein. Essentielle Funktionen können die Transkription, die Translation oder eine Enzymaktivität sein, die nicht operativ sind, weil zum Beispiel eine funktionelle Kopplung eines Promoters mit einer Sequenz fehlt, die exprimiert werden soll, die aber unterhalb des Promoters liegt. Der biochemische Prozess oder die biochemische Kaskade wird durch einen Interaktionsprozess operativ, der mit Hilfe einer Infektion ausgelöst wird. Interaktionsprozess in der Pflanze benötigt die erste oder mehrere erste heterologe DNS (DNA)-Sequenzen des nuklearen Genoms und/oder die Expressionsprodukte der ersten heterologen DNS-Sequenzen, die zweite oder mehrere zweite heterologe DNS-Sequenzen des Transfektionsvektors und/oder die Expressionsprodukte der zweiten heterologen DNS-Sequenzen und optional (wahlweise) eine oder mehrere extern hinzugefügte niedermolekulare Komponenten. Bevorzugt benötigt der Interaktionsprozess, der einen gewünschten biochemischen Prozess oder eine biochemische Kaskade einschaltet, die erste heterologe DNS-Sequenz des nuklearen Genoms und/oder die Expressionsprodukte der ersten heterologen DNS-Sequenz und die zweite heterologe DNS-Sequenz des Transfektionsvektors und/oder die Expressionsprodukte der zweiten heterologen DNS-Sequenz.
[0017] Ist eine der beiden heterologen DNS-Sequenzen (die erste oder die zweite) oder das Expressionsprodukt der ersten und der zweiten heterologen DNS-Sequenz, die für den Interaktionsprozess benötigt werden, nicht vorhanden, ist keine der vorhandenen ersten oder zweiten heterologen DNS-Sequenzen oder die extern hinzugesetzten, niedermolekularen Komponenten allein oder in Kombination in der Lage, den gewünschten biochemischen Prozess oder die biochemische Kaskade einzuschalten. Darüber hinaus ist der gewünschte biochemische Prozess oder die biochemische Kaskade kein Prozess, der Mechanismen wie dem posttranskriptionellen Gene-Silencing unterworfen ist, obwohl Silencing-Effekte noch auf niedrigem Niveau auftreten können. Der gewünschte biochemische Prozess oder die biochemische Kaskade ist vor der Infektion mit dem entsprechenden viralen Transfektionsvektor und vor der optionalen Zugabe einer niedermolekularen Komponente nicht operativ in der transgenen Pflanze. Darüber hinaus ist ein viraler Transfektionsvektor gemäß der Erfindung nicht in der Lage, einen gewünschten biochemischen Prozess oder eine biochemische Kaskade in einer Pflanze einzuschalten, wenn diese nicht die entsprechende erste heterologe DNS-Sequenz besitzt, die gemäß der Erfindung erforderlich ist. Abschließend kann der gewünschte biochemische Prozess oder die biochemische Kaskade in einer Pflanze durch den Kontakt der Pflanze mit einer niedermolekularen Komponente nicht eingeschaltet werden, wenn die erste und die zweite heterologe DNS-Sequenz oder deren Expressionsprodukte nicht vorhanden sind, weil sie für das Einschalten des Prozesses oder der Kaskade von Bedeutung erforderlich sind.
[0018] Das Verfahren der Erfindung bietet die Kontrolle über einen gewünschten biochemischen Prozess oder eine Kaskade mit einer bisher unerreichten Präzision und Sicherheit für die Umwelt. Auf diese Weise sind neue Anwendungen in der Pflanzenbiotechnologie zugänglich, die Probleme lösen, die mit konventionellen Technologien wie einer basalen Expressionaktivität des Transgens in der Pflanze nicht gelöst werden können. Dies trifft insbesondere in bezug auf die Produktion von toxischen Substanzen oder bioabbaubaren Polymeren zu.
[0019] Darüberhinaus ist es mit Hilfe der genauen Kontrolle gemäß der Erfindung möglich, eine transgene Pflanze bis zu einem gewünschten Stadium wachsen zu lassen, in dem die Pflanze am besten geeignet ist, den biochemischen Prozess oder die biochemische Kaskade durchzuführen, ohne dass die Pflanze mit einer basalen Expressionsaktivität belastet wird, die wiederum das Wachstum der Pflanze verlangsamt. Wenn die Pflanze einmal für eine effiziente Durchführung des biochemischen Prozesses oder Kaskade geeignet ist, kann der gewünschte Prozess oder die Kaskade eingeschaltet werden und mit einer hohen Effizienz durchgeführt werden. Dementsprechend erlaubt das Verfahren der Erfindung, die sichere Entkoppelung der Wachstumsphase und der Produktionsphase einer transgenen Pflanze.

[0020] Ferner ist es möglich, Multikomponenten-Systerne für multiple, gewünschte biochemische Prozesse oder Kaskaden zu entwerfen, wobei ein oder mehrere Prozesse oder Kaskaden selektiv eingeschaltet werden können.
[0021] In einer ersten Anwendungsform umfasst das System eine transgene Pflanze mit einer heterologen DNS-Sequenz, die ein Expressionsprodukt zur Verfügung stellt. Dieses wiederum ist notwendig, um die Expression eines gewünschten Produktes zu kontrollieren, das von dem viralen Transfektionsvektor kodiert wird. Das System umfasst ferner verschiedene virale Vektoren, die jeweils verschiedene Produkte kodieren, um sie in der transgenen Pflanze zu exprimieren. Dadurch ist der sichere Gebrauch der gleichen Pflanze für die Erzeugung verschiedener Produkte in Abhängigkeit des verwendeten viralen Vektors möglich. Der Vorteil dieses Systems ist offensichtlich, wenn man bedenkt, dass es Jahre dauern kann, bis man eine stabil transformierte, transgene Pflanze zur Verfügung hat. Dem steht die Präparierung eines viralen Vektors, die in einigen Wochen durchgeführt werden kann, gegenüber.

[0022] In einer zweiten Ausführungsform enthält die transgene Pflanze multiple, heterologe DNS-Sequenzen, die für verschiedene gewünschte Genprodukte kodieren können. Jede dieser heterologen DNS-Sequenzen kann von verschiedenen viralen Vektoren kontrolliert werden. Dadurch ist es möglich, selektiv die heterologen DNS-Sequenzen der transge-

nen Pflanze durch die Wahl des entsprechenden viralen Vektors zu kontrollieren.

[0023] Außerdem ist es in einer dritten Ausführungssform möglich, ein System zu gestalten, in dem der Interaktionsprozess, der den gewünschten biochemischen Prozess oder die Kaskade einschaltet, die Infektion mit mehr als einem viralen Vektor und optional die Anwendung von einem oder mehreren extern zugesetzten niedermolekularen Komponenten erforderlich macht, wodurch die derzeitige Technologie noch sicherer in ihrer Anwendung ist. [0024] Ein biochemischer Prozess oder eine biochemische Kaskade, die gemäß der Erfindung kontrolliert werden, kann irgendein Prozess oder irgendeine Kaskade sein, die in einem lebenden Pflanzensystem stattfindet. Bevorzugte biochemische Prozesse oder Kaskaden führen zur Erzeugung eines Produktes in der Pflanze. Folgende gewünschte Produkte können beispielsweise mit Hilfe des Verfahrens dieser Erfindung erzeugt werden: Polypeptide oder Proteine als primäre Produkte, (post-transkriptionell) modifizierte oder auf eine andere Art und Weise prozessierte Proteine wie Enzyme, Proteine, die ein gewünschtes Glycosylierungsmuster aufweisen. Ferner können nicht proteinogene, niedermolekulare Produkte und Oligomerisierungsprodukte wie Zucker oder bioabbaubare Polymere etc. erzeugt werden. Am bevorzugtesten sind pharmazeutische Polypeptide.

[0025] Das Verfahren zur Kontrolle eines biochemischen Prozesses oder einer biochemischen Kaskade umfasst wenigstens die beiden folgenden Komponenten:

(1) eine transgene Pflanze, die eine erste heterologe DNS-Sequenz nicht pflanzenviralen Ursprungs enthält und

(2) einen viralen Transfektionsvektor, der eine zweite heterologe DNS-Sequenz enthält.

[0026] Zum Zwecke der Erfindung ist die heterologe DNS-Sequenz eine Sequenz, die weder in der verwendeten Pflanzenspezies noch in dem Wildtyp-Virus, auf dem der virale Vektor basiert, natürlicherweise vorkommt. Nichts desto weniger kann solch eine Sequenz Sequenzbereiche umfassen, die der gewünschten nativen Pflanzen- und/oder der Virussequenz entsprechen. Davon ausgenommen sind heterologe Bereiche. Diese heterologen DNS-Sequenzen können mehr als ein funktionelles Element umfassen. Beispiele für diese funktionellen Elemente sind Promotoren, Enhancer-Elemente, Transkriptionsterminationsregionen, kodierende Regionen, nicht translatierte Spacer Regionen, Translationinitiationsregionen, IRES (internal ribosome entry site), Stop-Kodons etc. oder Teile von diesen.

[0027] Die Infektion einer transgenen Pflanze (1) mit einem viralen Vektor (2) löst einen Interaktionsprozess zwischen zumindest einer der besagten ersten und einer der zweiten heterologen DNS-Sequenz oder den Expressionsprodukten von diesen aus, so dass auf diese Weise ein gewünschter biochemischer Prozess oder eine biochemische Kaskade eingeschaltet wird. Die Tatsache, dass zumindest zwei Komponenten (1) und (2) benötigt werden, bedeutet, dass die Interaktion der besagten Komponenten eine notwendige Bedingung ist, um den biochemischen Prozess oder die biochemische Kaskade einzuschalten. Vor dieser Interaktion ist der biochemische Prozess nicht operativ, wobei eine geringe Expression (leaky expression) des Transgens nicht auftreten kann. In Systemen, die den Stand der heutigen Technik wiederspiegeln, kann die Expression des Transgens lediglich durch die quantitative Erhöhung oder die Verstärkung eines schon vorhandenen Expressionsniveaus induziert werden, wobei dieses Niveau sehr niedrig sein kann. Die vorgelegte Erfindung stellt nicht nur eine quantitative Erhöhung, sondern auch eine qualitative Veränderung in der Art zur Verfügung, dass ein zuvor nicht operativer Prozess oder Kaskade operativ wird. Dieser Vorteil der vorliegenden Erfindung ist von besonderer Wichtigkeit, wenn mit Hilfe eines gewünschten biochemischen Prozesses oder einer biochemischen Kaskade ein toxisches und somit ein Wachstum hemmendes Produkt erzeugt wird. Gemäß der Erfindung ist es möglich, das Pflanzenwachstum vollständig von der Produktion des besagten Produktes zu trennen. Es wird dadurch die Beeinträchtigung oder die Verzögerung des Pflanzenwachstums durch die Anwesenheit des gewünschten Produktes in der wachsenden Pflanze vermieden. Aus diesem Grund können die Stadien, in denen die Biomasse akkumuliert wird, von denen der Erzeugung des Produktes von Bedeutung entkoppelt werden.

[0028] Die transgene Pflanze und der transgene Vektor dieser Erfindung können keinen biochemischen Prozess oder keine biochemische Kaskade in Viren oder Pflanzen, die nicht die entsprechenden heterologen DNS-Sequenzen besitzen, kontrollieren. Infolgedessen repräsentiert diese Erfindung einen signifikanten Fortschritt in bezug auf die biologische Sicherheit in der Pflanzenbiotechnologie.

[0029] Die besagten Interaktionsprozesse, die ausgelöst werden, wenn die transgene Pflanze mit einem viralen Vektor infiziert wird und die zum Einschalten eines biochemischen Prozesses führen, schließen die DNS-Rekombination, die DNS-Replikation, die Transkription, die Restriktion, die RNS-Replikation, die reverse Transkription, die RNS-Prozessierung, die Translation, die Proteinfaltung, den Proteinaufbau (assembly), den Proteintransport innerhalb der Zelle (targeting), die post-translationale Prozessierung und die Enzymaktivität ein.

[0030] Diese Erfindung bezieht sich bevorzugt auf multizelluäre Pflanzen. Als Beispiele für Pflanzenspezies von Bedeutung sind monokotyle Pflanzen wie Weizen, Mais, Reis, Gerste, Hafer, Hirse und dergleichen oder dikotyle Pflanzen wie Raps, Kanola, Zuckerrübe, Sojabohne, Erbse, Luzerne, Baumwolle, Sonnenblume, Kartoffel, Tomate, Tabak und dergleichen zu nennen. Die Tatsache, dass es spezifische Viren für jede einzelne Pflanze gibt, trägt zu der breiten Vielseitigkeit und Anwendbarkeit dieser Erfindung bei. Der virale Transfektionsvektor, der in dieser Erfindung verwendet wird, kann von einem beliebigen pflanzenspezifischen Virus abgeleitet werden. Der virale Vektor kann dabei auf einem RNS- oder einem doppelsträngigen oder einzelsträngigen DNS-Virus basieren. Spezifische Beispiele von viralen Transfektionsvektoren sind im folgenden, im Anhang A und Anhang B aufgeführt.

[0031] In Schritt (a) kann die Pflanze eine natürliche Pflanze oder eine genetisch veränderte Pflanze sein. Die genetische Veränderung kann entweder in dem nuklearen Genom einer Pflanze oder in einem Genom eines Organells wie den Piastiden oder den Mitochondrien sein. In dem Schritt (a) wird eine heterologe Sequenz in das nukleare Genom eingeführt, wobei bevorzugt eine stabile Genomveränderung durchgeführt wird. Der Schritt (a) kann mehr als einmal durchgeführt werden, um mehr als eine heterologe DNS-Sequenz einzuführen. Auf diese Weise können mehrere heterologe Funktionen z. B. zur gezielten Modifizierung eines ganzen Biosyntheseweges in die Zielpflanze eingebracht werden. Die erste heterologe DNS-Sequenz stammt nicht von einem Pflanzenvirus. Somit liegt die genetische Rekonstituierung (reassembly) eines funktionellen z. B. infektiösen viralen Vektors nicht im Anwendungsbereich dieser Erfindung.

[0032] In Schritt (b) wird die gemäß Schritt (a) erhaltene transgene Pflanze mit einem viralen Transfektionsvektor infiziert. Die Infektion kann mit Hilfe von rekonstituierten Viruspartikeln oder mit infektiösen, viralen Nukleinsäuren oder durch die Aktivierung des Transfektionsprozesses durch die Freisetzung von viralen Nukleinsäuren, die zuvor in das Pflanzengenom eingebracht wurden, erreicht werden. Mehr als ein Vektor kann verwendet werden, um den gewünschten biochemischen Prozess oder die biochemische Kaskade zu kontrollieren. Bevorzugt wird nur ein Vektor, der die gewünschte heterologe(n) Sequenze(n) enthält, verwendet, um den Prozess reproduzierbar zu machen. Die Infektion kann auch mit Hilfe des direkten Kontaktes des viralen Vektors mit der besagten, transgenen Pflanze erreicht werden. Bevorzugt wird die mechanische Stimulierung wie dem Einreiben oder dem Einkratzen von Blättern oder anderen Pflanzengeweben verwendet, um die Infektion auszulösen. Die Infektion kann auch durch die Aktivierung des viralen Vektors, der zuvor in das Genom der Wirtspflanze integriert wurde, erreicht werden. Es werden virale Vektoren bevorzugt, die in der Lage sind, eine Pflanze systemisch zu infizieren.

[0033] Die Schritte (a) und (b) des Prozesses dieser Erfindung können mit dergleichen Pflanze durchgeführt werden. Es ist jedoch bevorzugt, dass eine stabile Pflanzenlinie gemäß konventioneller Methodne erzeugt wird, wobei in eine Pflanze wenigstens eine der ersten heterologen DNS-Sequenzen von Bedeutung gemäß des Schrittes (a) eingeführt wird.

Transgene Pflanzen können dann von Samen einer stabil transformierten Pflanze aufgezogen werden, und die Infektion kann gemäß Schritt (b) durchgeführt werden, wenn die Initiierung des biochemischen Prozesses gewünscht wird. Schritt (b) wird bevorzugt in einem Gewächshaus durchgeführt.

[0034] In einer ersten spezifischen Ausführungsform dieser Erfindung ist der gewünschte biochemische Prozess die Expression einer gewünschten heterologen DNS-Sequenz. Dieser Prozess kann als primärer, biochemischer Prozess bezeichnet werden. Dieser primäre Prozess resultiert in der Erzeugung eines RNS- oder Polypeptidmoleküls. Im einfachsten Fall ist entweder das RNS- oder das Polypeptid-molekül das Produkt von Bedeutung. In einer biochemischen Kaskade kann das Produkt eines solchen Prozesses einen zweiten biochemischen Prozess auslösen. Dies kann zum Beispiel durch seine katalytische Aktivität oder durch die Regulierung des anderen biochemischen Prozesses erreicht werden. In einer biochemischen Kaskade laufen mehr als ein biochemischer Prozess ab, wobei jeder dieser Prozesse von dem vorherigen biochemischen Prozess abhängt. Die Kontrolle oder das Einschalten wird bevorzugt bei den primären biochemischen Prozessen in dieser Ausführungssform eingreifen.

[0035] In der ersten spezifischen Ausführungssform kann die gewünschte heterologe DNS-Sequenz, die exprimiert werden soll, entweder eine erste heterologe DNS-Sequenz des nuklearen Pflanzengenoms oder eine zweite heterologe DNS-Sequenz des viralen Transfektionsvektors sein.

[0036] In einer zweiten spezifischen Ausführungssform dieser Erfindung ist der gewünschte biochemische Prozess die Produktion einer gewünschten nicht proteinogenen Verbindung durch die Pflanze.

KURZE BESCHREIBUNG DER HGUREN

[0037] Fig. IA ist eine schematische Darstellung des Prozesses gemäß der Erfindung.

[0038] Fig. 1 B ist eine schematische Darstellung der möglichen Klassen der Prozess-Interaktionen in einer infizierten Pflanzenzelle.

[0039] Fig. 2 zeigt den auf dem crTMV-Virus basierenden Vektor pICllll und pIC1123 mit dem Konstrukt IRES_cPii48^CR-Ac Transposase bzw. IRES_mPi75^CR-Ac Transposase. Es ist ebenfalls die T-DNS-Region des binären Vektors pSLJ744 mit dem Konstrukt p35S::Ds::GUS-3'OCS dargestellt.

[0040] Fig. 3 zeigt den auf dem crTMV-Virus basierenden Vektor pIC2541 und pIC2531 mit dem Konstrukt IRES_cPji48^CR-Cre Recombinase bzw. IRES_mPj75^CR-Cre Recombinase. Es ist ebenfalls die T-DNS-Region des binären Vektors pIC2561 mit dem GUS-Gen, das von zwei LoxP-Rekombinationsstellen flankiert wird, dargestellt. Die LoxP-Sequenzen sind dabei in identischer Orientierung angeordnet.

[0041] Fig. 4 zeigt den auf dem crTMV-Virus basierenden Vektor pIC2541 und pIC2531 (siehe Fig. 3) in Kombination mit der T-DNS-Region des binären Vektors pIC1641. In diesem Fall wird das GUS-Gen von zwei LoxP-Rekombinations-stellen in invertierter Orientierung flankiert.

[0042] Fig. 5 zeigt die T-DNS Region des binären Vektors pIC2691 mit dem GUS-Gen unter der Kontrolle des T7-Promotors und den auf dem crTMV-Virus basierenden Vektor pIC2631 mit der T7 Polymerase.

[0043] Fig. 6 zeigt X-Gluc gefärbte Blätter von transgenen Arabidopsis-Pflanzen, die mit dem Konstrukt pSLF744 transformiert sind. Die Transkription des GUS-Gens wird in diesem Konstrukt durch die Insertion des Ds-Elementes verhindert.

A - die Blätter wurden mit dem Transkript des Vektors pIC1123 inokuliert.
B - die Blätter wurden mit dem Transkript des Vektors pICllll inokuliert.

C- die Blätter wurden mit Wasser inokuliert.

DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

[0044] Wie in der Fig. IA dargestellt ist, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Kontrolle eines gewünschten biochemischen Prozesses oder einer biochemischen Kaskade in einer Pflanze zur Verfügung. Dieses Verfahren umfasst dabei einen Interaktionprozess (I), das Einschalten eines gewünschten biochemischen Prozesse (Π), wobei dieser wiederum für eine gewünschte biochemische Kaskade ursächlich sein kann (ΙΠ). Der Interaktionsprozess kann eine der folgenden Reaktionen oder Kombination von Reaktionen von DNS, RNS und Proteinen umfassen. Als DNS-Reaktionen wird die Restriktion, die Rekombination, die Replikation, die Transposition, die Amplifikation und die Transkription angesehen. RNS-Reaktionen sind die RNS-Prozessierung, die Replikation, die reverse Transkription, die Hybridisierung und die Translation. Proteinreaktionen sind die Proteinprozessierung, die Proteinfaltung, der Proteinaufbau (assembly), post-transkriptionelle Modifikationen, die Aktivierung, der Proteintransport innerhalb der Zelle (targeting), Modifizierung von Bindungsaktivitäten und die Signaltransduktion. Der Prozess (ΠΙ) kann vorhanden sein oder nicht. Die Erzeu-

gung eines Produktes ist das bevorzugte Resultat des Verfahrens der Erfindung.

[0045] Wie in der Fig. IB dargestellt ist, kann der mögliche Interaktionsprozess zu einer oder mehreren Klassen der Interaktionen gehören. In der Figur ist eine transgene Pflanzenzelle, die mit einem viralen Transfektionsvektor infiziert ist, schematisch gezeigt. Das rekombinante Pflanzengenom enthält eine oder mehrere, heterologe DNS-Sequenzen, die zu einem oder mehreren Expressionsprodukten führen können. Das Genom des viralen Transfektionsvektors enthält eine oder mehrere heterologe DNS-Sequenzen, die zu einem oder mehreren Expressionsprodukten führen können. Die transgene Pflanzenzelle kann mit einer oder mehreren niedermolekularen Komponenten in Kontakt gebracht werden, wobei diese in die Zelle aufgenommen werden. In dem Interaktionsprozess, der den gewünschten biochemischen Prozess oder die biochemische Kaskade in der Pflanzenzelle einschaltet, können die folgenden Interaktionen wie sie in Fig. IB durch Pfeile aufgezeigt sind, auftreten. Eine oder mehrere heterologe DNS-Sequenzen des rekombinanten Pflanzengenoms können mit einer oder mehreren heterologen DNS-Sequenzen des viralen Transfektionsvektors interagieren. Eine oder mehere heterologe DNS-Sequenzen des rekombinanten Pflanzengenoms können mit einem oder mehreren Expressionsprodukten der heterologen DNS-Sequenzen des viralen Transfektionsvektors interagieren. Ein oder mehrere Expressionsprodukte der heterologen DNS-Sequenzen des rekombinanten Pflanzengenoms können mit einem oder mehreren Expressionsprodukten der heterologen DNS-Sequenzen des viralen Transfektionsvektors interagieren. Das Expressionsprodukt kann eine RNS oder ein Polypeptid sein. Eine von diesen Interaktionen kann ebenfalls die Anwesenheit von einer oder mehreren niedermolekularen Komponenten, die extern der infizierten, transgenen Pflanzezelle zugesetzt werden, einschließen oder sogar erfordern. Die niedermolekularen Komponenten können für das Einschalten oder die Förderung des biochemischen Prozesses oder der biochemische Kaskade von Bedeutung notwendig oder gewünscht sein. Die niedermolekularen Komponenten sind nicht in der Lage, die gewünschten Prozesse oder die Kaskaden ohne den viralen Transvektionsvektor oder den heterologen DNS-Sequenzen des nuklearen Pflanzengenoms einzuschalten.
[0046] Gemäß der ersten spezifischen Ausführungsform dieser Erfindung wird ein neues Verfahren zur Verfügung gestellt, mit dem eine verlässliche Kontrolle entweder über die Expression eines stabil in einer Pflanze integrierten Transgens oder über die Expression eines heterologen Gens eines viralen Vektors innerhalb eines transgenen Pflanzenwirtes erreicht wird, wobei dieses Verfahren auf einer Transfektion basiert. Dieses Verfahren macht dabei Gebrauch von einer Interaktion von wenigstens zwei heterologen DNS-Sequenzen bzw. von deren Expressionsprodukten, die nur dann ausgelöst wird, wenn der Infektionsprozess des viralen Vektor initiiert wird. Eine dieser Sequenzen kann stabil in das nukleare Pflanzengenom inkorporiert sein, während die andere von dem besagten viralen Vektor zur Verfügung gestellt wird. Solch ein einschaltbares Zweikomponenten-Expressionssystem kann für die Kontrolle eines biochemischen Prozesses oder Kaskade verwendet werden, die auf verschiedenen Ebenen kontrolliert werden können. Diese Kontrollpunkte schließen das Auslösen durch Interaktionsreaktionen wie die DNS-Rekombination, die Replikation, die Transkription, die Restriktion, die RNS-Replikation, die reverse Replikation, die Prozessierung, die Translation, die Proteinfaltung, den Proteinaufbau (assembly), den Proteintransport innerhalb der Zelle (targeting), die post-transkriptionelle Prozessierung, die Enzymaktivität etc. ein, wobei diese aber nicht auf die aufgelisteten Reaktion begrenzt sind.
[0047] Dieses Verfahren benötigt wenigstens eine heterologe DNS in einer transgenen Pflanze und einen rekombinanten, viralen Vektor, der eine heterologe DNS- oder RNS-Sequenz umfasst. Das generelle Schema dieses Prozesses ist in Fig. 1 dargestellt. Eine transgene Pflanze, die in ihrem nuklearen Genom eine oder mehrere stabil integrierte, heterologe DNS-Sequenzen von Bedeutung enthält, kann mit Hilfe von Standard Transkriptions- oder Translationsvektoren und Standard Transformations-protokollen verändert werden. Die Konstruktion von transkriptioneilen Vektoren für die stabile Pflanzentransformation ist von zahlreichen Autoren beschrieben worden (für Übersichstartikel siehe, Hansen & Wright, 1999, Trends in Plant Science, 4, 226-231; Gelvin, S. B., 1998, Gurr. Opin. Biotech., 9, 227-232). Das Basisprinzip all dieser Konstrukte ist identisch: eine voll funktionsfähige Transkriptionseinheit, die in 5'-3' Richtung aus einem pflanzenspezifischen Promotor, dem strukturellen Teil des Gens von Bedeutung und einem transkriptionellen Terminator besteht, muß in die Pflanzenzelle eingeführt und stabil in das Genom integriert werden, um die Expression des Gens von Bedeutung zu erreichen. Die Konstruktion von translationellen Pflanzen vektoren ist in der deutschen Patentanmeldung Nr. 100 49 587.7 und 100 61 150.8 (Anhang A und Anhang B) beschrieben. Der prinzipielle Unterschied gegenüber transkriptionellen Vektoren liegt darin, das ein translationeller Vektor keinen transkriptionellen Promotor für die Expression des Gens von Bedeutung braucht. Die translationellen Vektoren hängen aber von der zellulären Transkriptionsmaschinerie nach ihrer Integration in dem Pflanzengenom ab.

[0048] Verschiedene Methoden können für das Einbringen des Expressionsvektors in eine Pflanzenzelle verwendet werden. Dazu gehören die direkte Einführung des besagten Vektors in die Zelle mit Hilfe des Mikroprojektilbeschusses, die Elektroporation oder die PEG-vermittelete Transformation von Protoplasten. Die Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation stellt ebenfalls eine effiziente Methode dar, den Vektor einzubringen. Somit kann die DNS mittels verschiedener geeigneter Technologien in die Pflanzenzelle transformiert werden. Dazu gehört der Ti-Plasmidvektor, der von Agrobakterien propagiert wird (US 5,591,616; US 4,940,838; US 5,464,763), der Partikel- oder Mikroprojektilbeschuß (US 05100792; EP 00444882 Bl; EP 00434616 Bl). Prinzipiell können auch andere Pflanzentransformationsmethoden wie die Mikroinjektion (WO 09209696; WO 09400583 Al; EP175966 Bl), die Elektroporation (EP 00564595 Bl; EP 00290395 Bl; WO 08706614 Al) etc. verwendet werden. Die Wahl der Transformationsmethode hängt von der Pflanzenspezies ab, die transformiert werden soll. Zum Beispiel wird bevorzugt der Mikroprojektilbeschuß für die Transformation von monkotylen Pflanzen eingesetzt, während die Agrobakterium vermittelte Transformation für dikotyle Pflanzen generell bessere Resultate erzielt.

[0049] Die Konstruktion von Pflanzenviren für die Expression eines nicht viralen Gens in Pflanzen wurde in mehreren Artikeln beschrieben (Dawson et al, 1989, Virology, 172, 285-293; Brisson et al., 1986, Methods in Enzymology, 118, 659; MacFarlane & Popovich, 2000, Virology, 267, 29-35; Gopinath et al., 2000 Virology, 267,159-173; Voinnet et al, 1999, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 96, 14147-14152) und kann leicht gemäß dieser Fachliteratur durchgeführt werden. [0050] In einer spezifischen Ausführungsform unserer Erfindung ist das Transgen in dem Pflanzengenom von seinem Promoter durch eine DNS-Insertion getrennt, die ausreichend lang ist, um die Transkription des besagten Transgens zu verhindern (Fig. 2 und 3). Das besagte DNS-Fragment, das inseriert ist, kann zum Beispiel ein nicht autonomes, trans-

posables Element oder irgendein DNS-Fragment sein, das von gleichgerichteten Rekombinationsstellen flankiert wird, die wiederum von einer spezifischen Rekombinase erkannt werden. Die entsprechende Transposase oder sequenzspezifische DNS-Rekombinase kann mit Hilfe eines viralen Vektors zur Verfügung gestellt werden, der dann als Vektorenschalter fungiert (Fig. 2 und 3). Nach der Expression der besagten Vektor kodierten Transposase oder Rekombinase führt die katalytische Aktivität des Enzyms zu der Excision der inserierten DNS oder des Fragmentes, das den Promotor von dem Transgen trennt, so dass die Expression des Transgens eingeschaltet wird (Fig. 6).

[0051] Sequenzspezifische Rekombinasen bzw. Integrasen von Bakteriophagen und Hefen werden häufig eingesetzt, um DNS in vitro oder in Pflanzen zu manipulieren. Bevorzugte Rekombinationsstellen von spezifischen Rekombinasen sind im Folgenden für den Einsatz in dieser Erfindung aufgelistet: Cre Rekombinase-LoxP Rekombinations-stelle, FLP Rekombinase-FRT Rekombinationsstelle, R Rekombinase-RS Rekom-binationsstelle etc.. Transposons werden häufig für das Auffinden von Genfunktionen in Pflanzen eingesetzt. Bevorzugt werden das Ac/Ds und das En/Spm-System, die zu der Familie der "Mariner" Transposon-Systerne gehören, für den Gebrauch in der vorgelegten Erfindung verwendet. [0052] In einer anderen Ausführungsform dieser Erfindung kann die transgene Pflanze eine promotorlose, transgene Sequenz tragen, die von zwei invertierten LoxP-Stellen flankiert wird (Fig. 4). Solch eine Orientierung der Rekombinationsstellen kann zur Inversion der flankierten DNS-Sequenz führen, wenn die Cre Rekombinase angeboten wird. Als eine Konsequenz dieser Inversion wird ein promotorloses Gen mit dem NOS-Terminator von der antisense in die sense Orientierung bezogen auf den konstitutiven Promotor platziert. BEISPIEL 4 exemplifiziert diese Vorgehensweise, indem ein promotorloses GUS-Gen mit einem NOS-Terminator verwendet wird.
[0053] Heterologe Transkriptionsfaktoren und RNS-Polymerasen können auch als transgene Schalter eingesetzt werden. Diese Methode ist in dem BEISPIEL 5 gezeigt. In diesem Fall trägt eine transgene Pflanze das GUS-Gen unter der Kontrolle des Bakteriophagen-T7-Promotors (siehe Fig. 5). Da RNS-Polymerasen aus Pflanzen keine prokaryotischen Promotoren erkennen, kann in transgenen Arabidopsis-Pflanzen, die ein solches Konstrukt tragen, die GUS-Aktivität nicht detektiert werden. Erst das Einbringen der Bakteriophagen T7 RNS-Polymerase mit Hilfe eines viralen Vektors löst die Expression des GUS-Gens aus (Fig. 5).

[0054] Die Expression eines pflanzlichen Transgens, das unter der Kontrolle eines Bakteriophagenpromotors (z. B T3, T7, SP6, KIl) steht, kann ein anderer effizienter Ansatz für die Entwicklung eines transgenen Schalters sein, der in dieser Erfindung betrachtet wird. In diesem Fall wird wiederum mit Hilfe der entsprechenden DNS/RNS-Polymerase, die mittels des viralen Vektors eingebracht wird, die Expression des Transgens ausgelöst. Ein anderer wertvoller Ansatz kann die Verwendung von heterologen, chimären oder anderen künstlichen Promotoren sein, die heterologe oder veränderte Transkriptionsfaktoren für ihre Aktivierung benötigen. In einigen Fällen können die bereits bestehenden, induzierbaren Systeme für die Expression der Transgene herangezogen werden. Beispiele hierfür sind die Kupfer kontrollierten (Mett et al, 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 90,4567^-571) und die Ethanol induzierten Genexpressionssysteme (Caddik et al., 1998, Nature Biotech., 16, 177-180), die in der Art modifiziert werden, dass die Transkriptionsfaktoren (ACEl für Kupfer induzierte oder ALCR für Ethanol induzierte Systeme) in trans mittels viraler Vektoren zur Verfügung gestellt werden. Somit wird die geringe basale Expression (leakiness) der Expressionssysteme weiter reduziert. Alternativ können heterologe Transkriptionsfaktoren in der Art verändert werden, dass keine aktivierende Liganden-Inducer benötigt werden, um den Transkriptionsfaktor in den aktiven Zustand zu versetzen.

[0055] Die DNS-Restriktion oder die DNS-Replikation sind andere Anwendungsformen dieser Erfindung. Ein Beispiel einer biochemischen Kaskade, die mit Hilfe einer Restriktion ausgelöst werden kann, ist ein Zweikomponenten-Systern, worin eine DNS-Sequenz einen Replikationsursprung (origin of replication) enthält, der in dem nuklearen Genom integriert spezifisch herausgeschnitten wird und in ein autosomal replizierendes Plasmid mit Hilfe eines selten schneidenden Enzym konvertiert werden kann, das von dem viralen Vektor geliefert wird. Auf diese Weise wird die Kaskade ausgelöst. Alternativ kann eine DNS eines viralen Vektor mit einem modifiziertem System zur Replikationsinitiierung nur in Anwesenheit eines Faktors in einem transgenem Wirt operativ gemacht werden, der eine effiziente Replikation des besagten, modifizierten viralen Vektors erlaubt.

[0056] Es gibt zahlreiche Reaktionen, die sich auf RNS-Moleküle auswirken und die als effiziente Vorrichtungen zum Auslösen einer Kaskade gemäß der vorgelegten Erfindung herangezogen werden können. Diese schließt u. a. Reaktionen wie die RNS-Replikation, die reverse Transkription, das Editing, das Silencing oder die Translation ein. Zum Beispiel kann eine DNS, die von einem viralen RNS-Vektor stammt, durch einen transgenen Wirt in eine DNS reverse transkribiert werden, die dann an einem Prozess wie der DNS-Integration in das nukleare Genom oder der DNS-vermittelten Mutagenese teilnimmt.

[0057] Ein anderer rekombinanter viraler Schalter, der unter diese Erfindung fällt, ist ein Prozess, der sich auf die posttranskriptionelle Modifikation eines oder mehrerer transgener Expressionsprodukte stützt. Es gibt viele mögliche Implementierungen von solchen Schaltern, die in Kontrollschritten wie der Polypeptidfaltung, der Oligomer-bildung, dem Entfernen des Targeting-Signals, der Umwandlung eines pro-Enzyms in ein Enzym, der Blockade einer Enzymaktivität etc. agieren. Zum Beispiel kann die Expression eines Polypeptids von einem viralem Expressionsvektor einen gewünschten biochemischen Prozess nur dann auslösen, wenn ein genetisch modifizierter Wirt spezifisch ein pro-Enzym spaltet, wodurch ein aktives Enzym erhalten wird oder wenn ein Produkt zu einem bestimmten Kompartiment innerhalb der Zelle transportiert wird oder wenn ein Produkt spezifisch mobilisiert wird. Die Prozesse hängen von der Fähigkeit des Wirtes ab, Proteine zu spalten, ein Targeting-Motiv zu modifizieren oder ein Produkt spezifisch auf Grund des Entfernens einer spezifischen Bindungssequenz zu mobilisieren.

[0058] Das Verfahren dieser Erfindung stützt sich auf die Interaktion von wenigstens zwei Komponenten. Es fallen aber auch Multikomponentensysteme, die auf den Interaktionen zwischen mehr als einer heterologer DNS in dem nuklearen Genom des Wirtes oder mehr als einem viralen Transfektionsvektor basieren, unter diese Erfindung. Das gleiche gilt für Multikomponentensysteme, die zusätzlich zu den oben genannten zwei Komponenten (heterologe DNS oder ihr Produkt in einer Wirtspflanze und eine heterologe DNS oder ihre Produkte in einem viralen Vektor) weitere Elemente wie die niedermolekularen Effektoren oder Nukleinsäuren oder Proteine, die nicht in einem Pflanzenchromosom integriert sind, umfassen. Solch eine niedermolekulare Verbindung ist definiert als nicht proteinogenes Molekül oder Ion, das

ein molekulares Gewicht von weniger als 5 kDa hat. Der ultimative Zweck von rekombinanten Schaltersystemen, die hier betrachtet werden, ist eine operative Kontrolle eines Prozesses in einem Pflanzenproduktionsprozess, wie einem gewünschten biochemischen Syntheseweg oder einer Kaskade von biochemischen Reaktionen. Ein Syntheseweg oder eine biochemische Kaskade ist eine Kette von biochemischen Reaktionen in dem Produktionssystem eines Wirtes, das nach Abschluss ein Produkt, einen Effekt oder eine Eigenschaft hervorbringt. [0059] Die Ansätze, die hier beschrieben sind, stellen effiziente Produktionskontrollmethoden zur Verfügung. Daneben sind sie zusätzlich vielseitig einsetzbar und stellen Genschalter dar, von denen gezeigt werden konnte, dass sie keine Restexpression zulassen. Der Zweikomponenten-Prozess, der oben beschrieben wurde, ist im wesentlichen ein "Schlüssel-Sperre"-System, wodurch eine Firma effizient den Zugang zur Produktion kontrollieren kann, indem die Transfektionsschalter-Komponente verkauft wird.

BEISPIELE

[0060] Im Hinblick auf die Offenlegung von spezifischen Vektoren und Konstrukten, die in den folgenden Beispielen verwendet werden, wird auf den Anhang A und B verwiesen.

BEISPIEL 1

Konstruktion eines viralen Vektors zur Pflanzeninfektion, der die Gene trägt, die an der DNS-Rekombination beteiligt

sind: Ac Transposase und Cre Rekombinase

[0061] Serien von viralen Expressiosnvektoren, die auf dem crTMV basieren und die Gene tragen, die an der DNS-Rekombination beteiligt sind, wurden gemäß molekular-biologischer Standardprotokolle konstruiert (Maniatis et al, 1982, Molecular cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Genaue Informationen bezüglich der üblicherweise verwendeter Vektoren, Gene und Genfragmente, die in diesem und den folgenden Beispielen eingesetzt wurden, können in öffentlich zugänglichen Datenbanken gefunden werden. Eine zwei-Schritt Klonierungsstrategie wurde für sämtliche Konstrukte verwendet. Erst wurde ein intermediäres Konstrukt kloniert, mit dessen Hilfe das Gen von Bedeutung (GUS) mit der entsprechenden IRES-Sequenz und der 3'-nicht translatierten Region (NTR) des crTMV-Genoms (pseudoknots und t-RNS ähnliche Strukturen) fusioniert wurde. Für die rRES_mp75^CR- und die rRES_cpi48^CR-Fusionen (Skulachev et al., 1999, Virology, 263, 139-154) wurde das Gen von Bedeutung (GUS) in das Plasmid pIC766 (rRES_mp75^CR-GUS-3'-NTR in pBS(+)) bzw. in das Plasmid pIC751 (IRES_cpi4₈ ^CR-GUS-3'-NTR in pBS(+)) subkloniert. Geeignete Restriktionsstellen für das Subklonieren wie einer Ncol-Restriktionstelle am 5'-Ende und einer BamHI- oder Xbal-Restriktionsstelle am 3'-Ende des Gens von Bedeutung wurden mittels PCR, wenn es nötig war, eingeführt. Sämtliche PCR-amplifizierten Teile der Konstrukte wurden sequenziert, um deren Sequenz zu bestätigen.

[0062] Im letzten Schritt der Klonierung wurde das IRES/GUS/3'-NTR-Fragment weiter in den viralen Expressionsvektor pIC797 - T7 Promotor-crTMV cDNS mit dem GUS-Gen, dem das virale Coat-Protein (CP) folgt (RdRp-MP-CP-HindIE-rRES_mp228^CR-CiUS-3'NTR)-NotI-XbaI-SpeI-BamHI in pUC19) - als HindHI/Notl-Fragment kloniert. Für diesen Zweck wurde das Plasmid pIC797 mit SacII und Notl verdaut, das große Fragment Gel gereinigt und mit dem 1.3 kb SacII/Hindll-Fragment desselben Plasmids und dem HindHI/Notl-Fragment des intermediären Konstruktes (pIC2251 im Fall der Cre Rekombinase) ligiert. Im Fall der Ac-Transposase war eine vier Fragmentligation notwendig, weil innerhalb der kodierenden Sequenz des Ac-Transposase-Gens eine HindHI-Restriktionsstelle vorhanden ist. Die endgültigen Konstrukte (pICllll und pIC1123 für die Ac-Transposase; pIC2541 und pIC2531 für die Cre Rekombinase) sind in Fig. 2 bzw. 4 dargestellt.

BEISPIEL 2

In vitro Transkription der viralen Vektorkonstrukte

[0063] Die Plasmide pICllll, pIC1123, pIC2541 und pIC2531 (Fig. 2 bzw. 4) wurden durch einen Verdau mit der Restriktionsendonuklease Notl linearisiert. Die linearisierten Plasmide wurden wie bei Dawson et all (1986, Proc. NatL Acd. ScL USA, 83, 1832-1836) beschrieben in vitro transkribiert. Qualität und Quantität der Voll-Langen RNS-Transkripte wurden mittels der Agarosegelelektrophorese bestimmt (Maniatis et al, 1982, Molecular cloning: a Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York).

BEISPIEL 3

Aktivierung eines in einem Pflanzengenom stabil integriertem Transgens durch das Einbringen der Ac-Transposase mit

Hilfe eines viralen Vektors

[0064] Die T-DNS des Plasmids pSLJ744 (zur Verfügung gestellt von J. Jones, Sainbury Laboratory, JIC, Norwich, UK, Fig. 2) wurde in Arabidopsis thaliana (Col-0) wie bei Bent et al. (1994, Science, 285, 1856-1860) beschrieben eingeführt. Die Tg-Samen wurden drei Wochen nach der Vakuuminfiltration geerntet, sterilisiert und auf Wachstumsmedium mit 1% Glukose (Valvekens et al, 1988, Proc. NatL Acad. USA, 5536-5540) und 50 mg/1, Kanamycin nach Transformanden selektiert.

[0065] Rosettenblätter von fünf Wochen alten Arabidopsis-Transformanden wurden mit der Voll-Langen Transkript-RNS, die wie in Beispiel 2 beschrieben erzeugt wurde, mittels mechanischer Verwundung inokuliert. Zu diesem Zweck wurde die RNS mit dem 3x GKP-Puffer (50 mM Glycin, 30 mM K₂HPO₄, 3% Celit, 3% Benthonit) gemischt und vorsichtig auf der oberen Seite der Blätter eingekratzt. Die T-DNS des Plasmids SLJ744 enthielt ein nicht autonomes Ds-

Element, das zwischen dem CaMV 35S-Promotor und dem GUS inseriert wurde (Fig. 2). Excision des Ds-Elementes nach dem Einbringen der Ac-Transposase mittels des viralen Transfektionsvektors führte zu der Expression des GUS-Gens. Die Expression des GUS-Gens konnte leicht mit Hilfe histologischer Färbungen der inokulierten Blätter nachgewiesen werden (Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Reporter, 5, 387-405). Inokulierte Blätter wurden 9-14 Tage nach der Transfektion mit der Voll-Langen Transkript-RNS geerntet. Proben wurden mit einer X-Gluc-Lösung (Jefferson, 1987, Plant Mol. BioL Reporter, 5, 387^05) infiltriert. Nach der Inkubation bei 37°C über Nacht wurden die Blätter in 70%igem Ethanol entfärbt und unter dem Lichtmikroskop untersucht. Grosse Sektoren, die durch die GUS-Expression blau gefärbt waren, wurden in den primär inokulierten Blättern beobachtet. Kein GUS-Färbung wurde in den Kontrollpflanzen, die ebenfalls das Transgen hatten, aber mit bidistilliertem Wasser inokuliert wurden, detektiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt. Die Sektoren der GUS-Färbung waren übereinstimmend mit den Sektoren der viralen Infektionen in den primär inokulierten Blätter. Dies ist ein Beleg für die hohe Effizienz dieser Methode: die Ds-Excision und als eine Konsequenz daraus die GUS-Färbung fand in allen infizierten Blättern statt. Im Vergleich dazu führt die konstante Anwesenheit der Ac-Transposase in Pflanzen, die eine stabil in dem Genom integrierte Kopie des Ac-Transposase Gens tragen, nur in einem geringen Teil des Pflanzengewebes zu Ds-Excisionssektoren (Resultate nicht gezeigt).

BEISPIEL 4

Aktivierung eines Transgens, das stabil in dem Pflanzengenom integriert ist durch das Einbringen der Cre-Rekombinase

mit Hilfe eines viralen Vektors

[0066] Zwei verschiedene Konstrukte pIC2561 und pIC1641 (Fig. 3 bzw. 4) wurden mit LoxP-Rekominationsstellen als Angriffspunkte für die Cre-vermittelte Rekombination gestaltet. In dem Konstrukt pIC2561 ist das GUS-Gen mit dem 3'-NOS-Transkriptionsterminatorsignal von zwei gleichgerichteten LoxP-Rekombinationsstellen flankiert. Dieses Fragment wurde zwischen den CaMV 35S-Promotor und dem synthetischen GFP-Gen (sGFP) inseriert. Eine Rekombination zwischen den zwei LoxP-Rekombinationstellen führt zu der Excision des GUS-Gens, falls dieses Konstrukt der Cre Rekombinase ausgesetzt wird, die wiederum von dem viralen Vektor geliefert wird. Dieses Ereignis kann leicht durch die Expression des GFP-Gens in den inokulierten Blättern verfolgt werden, wobei gleichzeitig in diesen Blättern keine GUS-Aktivität nachzuweisen ist.
[0067] Für die Konstruktion des Plasmids p2561 wurde das GUS-Gen aus dem Plasmid SLJ4K1 (Jones et al., 1992, Transgenic Research, 1, 285-292) mit Primern, die die LoxP-Rekombinationsstellen und eine CIaI-Restriktionsstelle am 5'-Ende (5'- CCG ATC GAT ATA ACT TCG TAT AGC ATA CAT TAT ACG AAG TTA TAT GTT ACG TCC TGT AGA AAC CC-3') bzw. eine Ncol-Restriktionsstelle am 3'-Ende (5'-GGC CAT GGA TAA CTT CGT ATA ATG TAT GCT ATA CGA AGT TAT TGC ATG CCT GCA GGT CGA TCT AGT AAC-3') tragen, amplifiziert. Dieses besagte PCR-Produkt wurde mit den Restriktionsenzymen CIaI und Ncol verdaut und in die Ncol bzw. Clal-Restriktionsstellen des Plasmids pIC591 subkloniert (pHBT: CIaI/NcoI-sGFp-3'NOS). Der HBT-Promotor (Sheen, J., 1995, EMBO J., 12, 3497-3505) dieses intermediären Konstruktes wurde durch den CaMV 35S-Promotor ersetzt, weil der HBT-Promotor in Arabidopsis nicht funktionell ist. Dazu wurde das Gel aufgereinigte, große Hindin/Klenow-CIal Fragment des intermediären Konstruktes mit dem 1.4 kb EcoRI/Klenow-CIal-Fragment des 35S-Promotors aus dem SLJ4K1-Plasmid ligiert und kloniert. Funktionelle Klone wurden in Mikroprojektilbeschußexperimenten selektiert, wobei die Plasmid-DNS von verschiedenen Klonen jeweils mit der DNS des Plasmids pIC2721 (Cre Rekombinase unter der Kontrolle des HBT-Promotoprs) zusammen in die Zellen geschossen wurde. Für die weitere Klonierung dieses Konstruktes in den binären Vektor pICBVl (Entwicklungseigentum der Icon Genetics AG, München, Deutschland, andere binären Vektoren sind ebenfalls geeignet) wurde die pBVl-DNS mit dem Restriktionsenzym EcoRI und EcI136II verdaut, Gel gereinigt und mit dem großen XhoI/Klenow-EcoRI-Fragment (pSSS^LoxP-GUS-S'OCS-LoxP-sGFP-S'NOS) des besagten, funktionellen Intermediärklons ligiert. Die T-DNS-Region des endgültigen Konstruktes pIC2561 ist in Fig. 3 dargestellt.

[0068] Das zweite Konstrukt mit einem GUS-Gen, das von zwei invertierten LoxP-Rekombinationsstellen flankiert ist, ist in Fig. 4 dargestellt. Für die Klonierung dieses Konstruktes wurden folgende PCR-Primern 5'-CTG AAG CTT ATA ACT TCG TAT AGC ATA CAT TAT ACG AAG TTA TAC CAT GGC TGC AGA TAA CTT CGT AT-3' und 5'-GCC TCG AGA TAA CTT CGT ATA ATG TAT GCT ATA CGA AGT TAT TCT GCA GCC ATG GTA TAA CTT CGT A-3' mit einem 18 bp großen, überlappenden Bereich am 3'-Ende ausgewählt. Nach der Hybridisierung dieser Primer (Annealing) konnten die Enden mit dem Klenow-Fragment der DNS-Polymerase I aufgefüllt werden.

[0069] Das endgültige DNS-Fragment enthielt zwei invertierte LoxP-Rekombinations-stellen, die von einer Pstl- bzw. Ncol-Restriktionsstelle getrennt und von einer Xhol (von der Pstl-Restriktionsstelle aus gesehen) bzw. einer HindII-Restriktionsstelle flankiert wurden. Nach dem Xhol/Hindlll-Verdau wurde das Fragment mit dem großen XhoI/HindHI-Fragment aus dem pSLJ4D4-Plasmid (Jones et al, 1992, Transgenic Research, 1, 285-292) ligiert. Das resultierende Plasmid wurde mit Pstl/Ncol verdaut, Gel gereinigt und mit dem 2.6 kb Ncol/Pstl-Fragment aus dem Plasmid pSLJ4D4 ligiert.

[0070] In dem letzten Klonierungsschritt wurde die ganze Kassette (CaMV pSSS-LoxP-S'NOS-GUS-LoxP) in den binären Vektor pBIN19 (Bevan, M., 1984, Nucl. Acid. Research, 12, 8711-8721) als HindlU/EcoRI-Fragment kloniert.

Die T-DNS dieses Konstruktes (pIC1641) ist in Fig. 4 dargestellt. Transgene Arabidopsis-Linien wurden mittels der Agrobacterium tumefaciens vermittelten Transformation gemäß dem modifizierten Vakuuminfiltrationsprotokoll von Bent et at. (1994, Science, 285, 1856-1860) erzeugt. Die Anwesenheit des Transgens in der segregierenden Tl-Population wurde mit Hilfe von PCR-Analysen bestätigt.
[0071] Die Transkription des viralen cDNS-Klons (pIC2531) und die Inokulation der transgenen Arabidopsis-Linien mit viraler RNS wurde wie in dem Beispiel 2 bzw. 3 beschrieben durchgeführt.

GFP- und GUS-Detektion

[0072] Ein LEICA-Stereofluoreszensmikroskop-System wurde verwendet, um die GFP-Expression zu verfolgen (Excitation bei 450^-90 nm, Emission bei 500-550 nm). Das in unseren Experimenten verwendete sGFP kann mit Blau- und UV-Licht angeregt werden. Die GUS-Detektion wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt.

BEISPIEL 5

Aktivierung eines Transgens, das stabil in dem Pflanzengenom integriert ist durch das Einbringen der T7-Polymerase mit

Hilfe eines viralen Vektors

Konstruktion des Vektors

[0073] Der binäre Vektor für die Pflanzentransformation, der ein Konstrukt mit dem GUS-Gen unter der Kontrolle des T7-Promotors enthält, wurde wie folgt konstruiert. Das Gel gereinigte 2.0 kb BssHII/T4 Polymerase aufgefüllte - Sau-Fragment von dem Plasmid pIC057 mit dem T7-Promotor-GUS-Gen-Konstrukt wurde mit dem Smal/Sall verdauten Expressionsvektor pIC056 ligiert, um das BSS-Transkriptionsterminations-signal an das 3'-Ende des GUS-Gens anzufügen. Das resultierende Konstrukt pIC2641 wurde mit dem Restriktionsenzym Sacl und Xhol verdaut, Gel aufgereinigt, um den Vektoranteil zu entfernen, und mit dem Sacl/Sall verdauten ρΒΙΝΙΘ-Vektor ligiert. Das endgültige Konstrukt pIC2651 (Fig. 5) wurde für die Transformation von Arabidopsis thaliana wie zuvor beschrieben eingesetzt. [0074] Der virale Vektor mit der T7-Polymerase wurde wie folgt konstruiert. Das Plasmid pIC2603 wurde mit dem Restriktionsenzym Sahl und SpII verdaut. Anschließend wurde das 2.8 kb große Fragment mit der T7-Polymerase Gel aufgereinigt und mit dem großen NcoI/SpII-Fragment des Plasmids pIC1018 ligiert. Das resultierende Plasmid pIC2621 trägt das T7-Polymerase-Gen, wobei es auf seiner 5'-Seite von dem IRES_mp75^CR-Element und auf seiner 3'-Seite von der S'-nichttranslatierten Region des crTMV (NTR) flankiert wird. Der letzte Klonierungsschritt umfasste die Ligation des kleinen Hindlll/Notl-Fragmentes von dem Plasmid pIC2621 mit dem großen SacII/Notl-Fragment und dem kleinem SacII/Hindlll-Fragment desselben Plasmids pIC1087. Das endgültige Konstrukt pIC2631 (Fig. 5), welches das T7-Polymerase-Gen in einem viralen Vektor des crTMV-Virus enthält, wurde für die Transkription und die Pflanzentransfektion wie in Beispiel 2 bzw. 3 beschrieben eingesetzt.

30 ANHANG A

Vektorsystem für Pflanzen
ALLGEMEINES GEBIET DER ERFINDUNG

[0075] Diese Erfindung betrifft einen Vektor, der zur Amplification, zur Expression und/oder zur Suppression eines Gens in einer Pflanze fähig ist. Die Erfindung beinhaltet die Verwendung des Vektors sowie dessen Herstellungsmethode und einen Vor-Vektor, der zur Herstellung des besagten Vektors benötigt wird.

40 HINTERGRUND DER ERFINDUNG

[0076] Vektoren, die zur gentechnologischen Veränderung von Pflanzen verwendet werden, eignen sich ausgezeichnet zur Produktion von Proteinen in Pflanzen, zur Veränderung von Pflanzeneigenschaften sowie zur Unterdrückung (Suppression) von Genen der Wirtspflanze. Darüber hinaus ist die Bestimmung von Genfunktionen möglich. Das gilt insbesondere für Gene, die mit Hilfe der Methoden der Genomforschung (Genomics) identifiziert wurden.
[0077] Vektoren, die zur gentechnologischen Veränderung von Pflanzen verwendet werden können, sind seit längerem bekannt. Dazu gehören insbesondere virale Vektoren. Diese müssen die Fähigkeit besitzen, die Wirtspflanze zu infizieren sowie sich in ihr zu vermehren und auszubreiten. Man unterscheidet zwischen der Bewegung der Viren von Zelle zu Zelle sowie über weitere Distanzen (long distant movement). Die Viren müssen zudem mindestens eine Sequenz zur Genexpression oder zur Gensuppression besitzen. Bereits vorhandene Vektoren basierten auf der Verwendung subgenomischer Promotoren als Elemente der Transkription. Der Effekt eines subgenomischen Promotors besteht darin, daß ein Teil von ihm als Startpunkt der Transkription die Generierung kürzerer RNS-Fragmente bewirkt. Somit wird die Translation eines Gens, das sich abwärts (downstream) des genomischen Promotors befindet, durch die pflanzliche Tranlations-maschinerie ermöglicht. Die Translation wird ggf. CAP-abhängig fortgesetzt. Diese Art der multiplen Transkription ist allerdings kinetisch unvorteilhaft, da ein Teil der Replikaseaktivität (für Produktion zusätzlicher subgenomischer RNSs) verschwendet wird.

[0078] Die genannten Vektoren haben weitere Nachteile. Durch die Einführung eines subgenomischen, viralen Promotors in eine Vektorsequenz wird diese verlängert. Dies führt zu einer Verringerung der Effizienz des Systems. Darüber hinaus führt die Anwesenheit mehrerer identischer oder ähnlicher, subgenomischer Promotoren, die dem pflanzlichen Transkriptionsysstem angepaßt sind, regelmäßig zu Rekombinations-ereignissen, aufgrund derer es zu Sequenzinstabilität und zum Verlust von Sequenzbereichen kommen kann. Die Verwendung von Promotoren, die sich in ihrer Sequenz signifikant unterscheiden, führt zu einer Verringerung der Rekombinationshäufigkeit. Indes werden solche Promotoren nicht effektiv vom Transkriptionssystem erkannt, was ebenfalls die Effizienz des Systems verringert. Zudem sind (diese) Vektoren im allgemeinen hochkomplexe Einheiten, die mehrere unabhängige Funktionselemente sowie eine hohe Gendichte beinhalten. Aufgrund dessen erwies sich die Verwendung (dieser) Vektoren bei Benutzung heterologer Gene oder ähnlicher Sequenzen als unvorteilhaft und führte regelmäßig zu unerwünschten Resultaten. Dies machte sich sowohl bei der Fähigkeit zur Pflanzeninfektion als auch bei der Effizienz der Genexpression bemerkbar. Darüber hinaus muß der

verfügbare Raum für die Promotoren üblicherweise "erzwungen" werden, wenn es zu Sequenzüberlappungen mit weiter aufwärts (upstream) gelegenen Genen kommt.

[0079] Aus den genannten Gründen wurde ein Vektor zur gentechnologischen Manipulation von Pflanzen erzeugt, der seine Funktionen in Wirtspflanzen stabil und effektiv ausüben kann. Ein weiteres Ziel besteht darin, einen Vektor zur Verfügung zu stellen, der zur hohen Expression eines Gens in einer Pflanze in der Lage ist.

[0080] Entgegen den Erwartungen konnten diese Ziele mit einem Vektor erreicht werden, der einerseits in der Lage ist, sich in einer Pflanze zu vermehren und andererseits ein Gen exprimiert, dessen Nukleinsäuresequenz mindestens ein nichtvirales Gen beinhaltet. Darüber hinaus besitzt der Vektor eine IRES-Sequenz oder kodiert für eine solche, die zur Translation eines Gen, das abwärts (downstream) von ihr liegt, notwendig ist.

[0081] Es wurde kürzlich vorgeschlagen (WO 98/54342), ein Pflanzen-IRES-Element in einem rekombinanten DNS-Molekül zu verwenden, das (nach Integration in das Wirtsgenom) ausschließlich die Funktion der Genexpression ausübt. Die Expressionshöhe erwies sich jedoch als gering. Die genauen Gründe für diese niedrige Expression sind unklar. Auf jeden Fall ist die Expression auf die Zahl der transformierten Zellen beschränkt. Daraus folgt eine extrem geringe Expressionseffizienz in der gesamten Pflanze.

[0082] Entgegen den Erwartungen konnte gezeigt werden, daß es möglich ist, einen Pflanzen-vektor zu konstruieren, der nach Einführung in eine Pflanzenzelle nicht nur die Fähigkeit der Genexpression besitzt, sondern auch noch andere Fähigkeiten vereint, die zur Vermehrung sowie zur Ausbreitung des Virus in der Pflanze benötigt werden. Die resultierende Gesamteffizienz ist extrem hoch. Die Funktionen beinhalten den Infektions-grad des Virus und die Bewegung von einer Zelle zu einer anderen oder über eine größere Entfernung (long distance movement). Es ist erstaunlich, daß die große Komplexität der funktionalen und strukturellen Elemente des Vektors dessen Genexpression nicht beeinflußt.

[0083] Das IRES-Element des genannten Vektors kann aufwärts (upstream) des erwähnten nichtviralen Gens liegen, um dessen Translation direkt zu beeinflussen. Alternativ kann dieses IRES-Element indirekt die Translation des Gens unterstützen. Dies könnte durch die Stimulation der Translation einer Gruppe anderer Gene erfolgen, die für die Expression des erstgenannten Gens wichtig sind. Es könnte sich dabei um Gene handeln, die den Funktionen Infektionsgrad, Vermehrung oder Fortbewegung von Zelle zu Zelle oder über eine große Distanz (long distance movement) zuzuordnen sind.

[0084] Ein weiteres Ziel besteht darin, einen Vektor herzustellen, der in der Lage ist, ein Gen in einer Pflanze effektiv zu inaktivieren (supprimieren). Dies kann durch die Verwendung einer Nukleinsäuresequenz erreicht werden, die mindestens eine IRES-Sequenz besitzt bzw. für eine solche kodiert und in einem Vektor kloniert ist, in dem sie für die Translation eines Gens, welches für die Vermehrung des Vektors benötigt wird, verantwortlich ist. Besagter Vektor besitzt darüber hinaus mindestens einen Teil einer Sequenz des Pflanzengenoms in Gegensinn (antisense) Orientierung, um ein Gen der Wirtspflanze zu inaktivieren (supprimieren).

[0085] An dieser Stelle werden erstmals Vektoren beschrieben, die auf IRES-Elementen beruhen, welche in Pflanzen aktiv sind. Bereits vorhandene IRES-Sequenzen, die aus tierischen Viren isoliert wurden, unterstützen die Translation in Pflanzenzellen nicht. Das Wissen, das über tierische Expressionssysteme angesammelt wurde, kann somit nicht auf Pflanzen übertragen werden. Tierische IRES-Sequenzen wurden nie auf funktionale Eigenschaften wie verbliebene/ überschüssige Promotoraktivität getestet. Diese Erfindung beinhaltet somit die ersten klaren Beispiele für die Genexpression in Pflanzen, die ausschließlich auf der Translation beruhen. Die Expression ist somit nicht von der Transkription ausgehend von einem subgenomischen Promotor, welcher für die Ex-pression eines abwärts (downstream) gelegenen Gens nötig ist, abhängig.

[0086] Die in dieser Erfindung beschriebenen Vektoren erlauben in Pflanzen bevorzugt die Regulation und die Expression eines Gens von Interesse, wobei die CAP-abhängige Translation unterdrückt wird. In einem anderen Ansatz werden sehr kurze oder künstliche IRES-Sequenzen verwendet, um die Stabilität der resultierenden Vektoren zu erhöhen.
[0087] Ein deutlicher Vorteil des Systems besteht darin, daß die IRES-Sequenzen aufwärts (upstream) oder abwärts (downstream) von einem viralen Gen bzw. von viralen Genen (z. B. des Gens für das Hüllprotein des Tabakmosaikvirus) inseriert werden können. Daher kann ggf. sowohl die Translation eines abwärts (downstream) gelegenen Fremdgens (oder mehrerer Fremdgene) als auch die Translation eines viralen Gens (oder mehrerer viraler Fremdgene) über einen Reaktionsweg verlaufen, der durch einen CAP-unabhängigen Eintritt der Ribosomen eingeleitet wird. Daher wird die besagte CAP-unabhängige Translation eines Fremdgens (oder von Fremdgenen) von bicistronischen und/oder polycistronischen RNSs ausgehen.

ALLGEMEINE PROBLEME UND DEFINITIONEN

[0088] Im Anschluß an die Infektion einer Pflanze mit einem Virus kommt es zunächst zu den frühen Stadien der viralen Infektion. Es handelt sich dabei um den Eintritt des Virus in die Zelle und die Enthüllung des Genoms. Anschließend muß der Virus Aktivitäten entwickeln, die ihn zur Expression des Genoms sowie zur Replikation befähigen. Das virale Genom besteht entweder aus einem (monopartite) oder mehreren (multipartite) RNS- bzw. DNS-Segment(en). Jedes dieser Segmente kann unter bestimmten Voraussetzungen zur Replikation in der infizierten Zelle fähig sein. Ein virales Replikon wurde als "Polynucleotid einer viralen Sequenz, die in Wirtszellen während des viralen Replikationszyklus repliziert wird" definiert (Huisman et al., 1992, "Genetic engineering with Plant viruses", T. M. A. Wilson und J. W. Davies Hrsg., 1992, CRC Press, Inc.). Im Rahmen dieser Erfindung verwenden wir den Terminus "auf Vermehrung basierendes Expressionssystem" (amplification based expression system), um entweder ein vollständig vorliegendes virales Genom oder ein beliebiges Fragment der viralen RNS oder DNS zu bezeichnen, das folgende Eigenschaften besitzt: zum einen muß es Fremdsequenzen besitzen, die für den parentalen Wildtyp-Virus nicht nativ sind und die exprimiert werden. Zum anderen muß es in der Lage sein, sich eigenständig oder über eine Komplementation mit einem Helfervirus bzw. einem Produkt der transgenen Wirtspflanze zu replizieren. Die Termini "auf Vermehrung basierendes Expressionssystem" (amplification-based-expression-system) und "rekombinanter viraler Vektor" ähneln sich sehr. Diese Systeme repräsentieren rekombinante Nukleinsäuren, die zusätzliche Sequenzen enthalten. Diese können im Verhältnis zum Wirtsgenom homo-

log (nativ) bzw. heterolog (fremd, nicht nativ) sein. Die Bezeichnung "nicht nativ" bedeutet, daß diese Nukleinsäure nicht natürlicherweise im Genom des Wildtypvirus vorhanden ist, sondern von einem andern Virus abstammt. Alternativ kann es sich um eine synthetisch hergestellte Nukleinsäure handeln. Ein solches, auf Vermehrung beruhendes System, das von viralen Elementen abstammt, ist zur Replikation fähig. In vielen Fällen ist es zudem in der Lage, sich in normalen und/oder gentechnologisch modifizierten Pflanzen von einer Zelle zu einer anderen oder über eine größere Distanz (long distance movement) zu bewegen. In letzterem Fall sollte die transgene Pflanze funktionsdefiziente Komponenten des Vektors komplementieren. Das Produkt bzw. die Produkte eines Transgens, das bzw. die zur Vektorreplikation und/ oder der Expression von Vektorgenen oder zum Transport über größere Distanzen nötig ist bzw. sind, sollte somit von der transgenen Pflanze zur Verfügung gestellt werden.

[0089] Pflanzenviren, die auf Vermehrung beruhen und deren Grundlage ein einfaches Genom (monopartite, z. B. das des Tabakmosaikvirus, TMV) oder ein doppeltes Genom (bipartite, ζ. B. das von Mitgliedern der Bromoviridae Familie) ist, zeigten die Expression von Fremdgenen in Wirtspflanzen (Zusammenfassung in "Genetic engineering in plant viruses" T. M. A. Wilson and J. W. Davies Hrsg., 1992, CRC Press, Inc.).

[0090] Die Genome der meisten (ca. 80%) der bekannten Pflanzenviren bestehen aus plus-senseeinzelsträngiger RNS (ssRNS). Diese ist infektiös, wenn sie aus den Virionen in Form von freier RNS isoliert wird. Daraus folgt, daß als erster Schritt des viralen Replikationskreislaufes die genomische RNS translatiert werden muß, um die virus-spezifische, RNS-abhängige RNS-Polymerase (Replikase) zu erzeugen. Sie ist nicht in uninfizierten Pflanzenzellen vorhanden und daher für die virale Replikation unentbehrlich (Zusammenfassung in: Y. Okada, 1999, Philosoph. Transact, of Royal Soc, B, 354, 569-582). Es sollte erwähnt werden, daß sich die plus sensessRNS-Viren in den von ihnen verwendeten Translationsstrategien zur Expression des Genoms unterscheiden: Die Genome der sogenannten Picorna-ähnlichen Viren stellen ein einzelnes durchlaufendes offenes Leseraster (ORF) dar, das von den Ribosomen in ein großes Polyprotein translatiert wird. Dieses wird proteolytisch in aktive Virus-kodierte Proteine prozessiert. Die virusspezifischen Protease(n) sind an der Polyprotein-Prozessierung beteiligt. Eine zweite besondere Eigenschaft der Picorna-ähnichen Viren besteht darin, daß deren genomische RNS anstatt einer Schutzgruppe (CAP-Strukur) ein kleines virales Protein enthält, das kovalent an das 5'-Ende des Genoms gebunden ist.

[0091] In dieser Erfindung konzentrieren wir uns hauptsächlich auf Viren, die der sogenannten Sindbisähnlichen Superfamilie zuzuordnen sind. Diese beinhaltet viele Pflanzenviren, insbesondere mehr als ein Dutzend Viren, die zum Genus der Tobamoviren gehören (Zusammenfassung in A. Gibbs, 1999, Philosoph. Transact, of Royal Soc, B, 354, 593-602). Die Technologie ermöglicht die Expression von Fremdgenen, die von der CAP-Struktur und von dem viralen Promotor unabhängig ist. Das Genom der Tobamoviren (TMV Ul ist ein typischer Vertreter dieser Gruppe) beinhaltet vier große offene Leseraster (ORFs). Die beiden Komponenten der Replikase - das 130-kDa Protein sowie das durch Durchlesen (readthrough) entstehende 183 kDa Protein - werden von der 5' angrenzenden Region der genomischen RNS kodiert. Sie werden direkt von der genomischen RNS translatiert. Die fünfzehn 3'-endständigen Nukleotide des 180 kDa Proteins von TMV Ul überlappen mit dem offenen Leseraster des 30 kDa Proteins, das für die Ausbreitung der TMV-Infektion von einer Zelle zu einer anderen verantwortlich ist (movement protein, MP). Im TMV Ul-Virus endet dieses Gen zwei Nukleotide vor dem Initiationskodon des letzten Gens, welches für das 17-kDa Hüllprotein (coat protein, CP) kodiert. Diese Region ist aufwärts (upstream) der (bei TMV Ul) 204 Nukleotid großen 3' endständigen nichttranslatierten Region (3'-NTR) gelegen. Die Translation der RNS des Tobamovirus erfolgt durch einen ribosomalen Absuchungsmechanismus, der für die Mehrzahl der eukaryotischen mRNSs zutrifft (zusammengefaßt in Kozak, 1989, J. Mol. Biol. 108, 229-241; Pain, 1996, Merrick und Hershey, 1996, in "Translational control", Hrsg. Hershey, Matthews and Sonenberg, Cold Spring Habour Press, S. 31-69, Sachs und Varanini, 2000, Nature Structural Biology 7, 356-360). In Übereinstimmung mit diesem Mechanismus ist die strukturell polycistronische Tobamovirus-RNS funktional monocistronisch, d. h. lediglich das 5' gelegene offene Leseraster, das die Replikationsproteine (130 kDa-Protein und Produkt des Durchlesemechanismus) kodiert, kann von der vollständigen (fullength) genomischen RNS translatiert werden (zusammengefaßt in Palukaitis und Zaitlin, 1986, in "The Plant Viruses", von Regermortel und Fraenkel-Conrat Hrsg., Vol. 2, S. 105-131, Plenum Press, NY). Es sollte betont werden, daß der 68 Nukleotid große, 5'-terminale, nichttranslatierte Bereich (leader sequence) von TMV Ul, der als Omega (Q)-Leader bezeichnet wird, die Rolle eines effizienten Translations Verstärkers besitzt, indem er die Translation des 5' proximal liegenden offenen Leserasters stimuliert. Die 5' distal liegenden Gene für MP und CP sind in der Vollängen-TMV Ul RNS translational inaktiviert. Sie werden von separaten mRNSs, die als subgenomische RNS (sgRNS) bezeichnet werden, translatiert. Offenbar werden die subgenomische RNSs von in negativer Orientierung vorliegender genomischer RNS transkribiert und besitzen übereinstimmende 3'-Enden. Die Expression der TMV Gene, die von sgRNSs translatiert werden, ist sowohl zeitlich als auch quantitativ voneinander unabhängig reguliert: das MP wird durchgehend während den frühen Schlitten der Infektion exprimiert und akkumuliert zu einer relativ geringen Proteinmenge, deren Gesamtanteil bei etwa 1% des gesamten Pflanzenproteins liegt. Im Gegensatz dazu beträgt der Anteil der Synthese des Hüllproteins bis zu 70% der gesamten pflanzlichen Proteinsynthese. Der Anteil des Hüllproteins an der Gesamt-proteinmenge in der Pflanze kann bis zu 10% betragen (Fräser, 1987, in: Biochemistry of virus-infected plants", S. 1-7, Research studies Press Ltd., Letchworth, England). Es ist offensichtlich, daß die Erzeugung jeder sgRNS von verschiedenen in eis wirkenden Elementen kontrolliert wird. Diese werden als "subgenomische mRNS-Promotoren" (sgPR) bezeichnet. Im allgemeinen bezeichnet dieser Terminus die Region des viralen Genoms (vermutlich innerhalb einer Minus-Sinn RNS-Kopie), das von dem Replikase-Komplex erkannt wird, um die Transkription von einem intern lokalisierten sgPR zu initiieren. Damit kommt es zur Erzeugung der sgRNS. Zur Vereinfachung bezeichnen wir gewöhnlich mit dem Terminus "subgenomischer Promotor" eine Nukleotidsequenz einer plus sense, viralen RNS, die in der Regel aufwärts (upstream) der kodierenden Sequenz und des Startpunktes der sgRNS liegt und die bei der Initiation der sgRNS-Synthese eine funktionelle Rolle spielt. Es sollte allerdings in Betracht gezogen werden, daß einige virale sgPRs nicht ausschließlich aufwärts (upstream) von dem kontrollierten, viralen Gen liegen, sondern sogar mit diesen Genen überlappen können (Balmori et al., 1993, Biochimie (Paris) 75, 517-521).

[0092] Jeder subgenomische Promotor besetzt eine unterschiedliche Position im TMV-Genom. Keiner der subgenomischen Promotoren des TMV konnte bisher exakt kartiert werden. Es konnte aber gezeigt werden, daß die 250 Nukleotid

große Region aufwärts (upstream) des CP-Gens die Synthese der CP-sgRNS unterstützen kann (Dawson et al., 1989, Virology 172, 285-292).

[0093] Lehto et al. inserierten 253 und 49 Nukleotide lange Sequenzen in das TMV Genom (vor das MP-Gen; 1990, Virology 174,145-157), die dem CP vorausgingen. Das Ziel war, die Größe der subgenomischen Promotoren (sgPR) abzuschätzen. Die Insertion zerstörte zwar nicht den ursprünglichen subgenomischen Promotor des MP-Gens, sondern entfernte ihn von dem offenen Leseraster des MP-Gens. Dieser mutierte Virus (genannt KK6), der eine 253 Nukleotid große Insertion in der Promotorregion besitzt, repliziert stabil und bewegt sich systemisch über die infizierte Pflanze. Es entspricht den Erwartungen, daß die in der Mutante KK6 vorliegende Insertion die Länge der subgenomischen Leader-Sequenz des MP ändert. (Lehto et al., Virology 174, 145-157. s. Fig. 15). Die subgenomische RNS der KK6 MP-Leader-RNS hat eine Größe von 24 Nukleotiden. Verglichen dazu beträgt die Größe der subgenomischen RNS des Hüllproteins lediglich 9 Nukleotide. Im Gegensatz dazu repliziert die Mutante mit einem eingefügten 49 Nukleotid großem Fragment in der Promotorregion nur kurzzeitig. Nach dieser Phase überwiegen die Nachkommen von Wildtyp-Viren, die die Insertion deletiert haben. Zusätzlich konnte gezeigt werden (Meshi et al., 1987, EMBO 6, 2557-2563), daß die Produktion der subgenomischen Hüllprotein-RNS dann reduziert wurde, wenn eine 96 Nukleotid große Region verwendet wurde, die von der Hüllprotein-RNS abstammte. Es wurde daraus geschlossen, daß die 49 bis 96 Nukleotid großen Sequenzen, die sich aufwärts (upstream) des Gens für das Hüllprotein befinden, nicht die gesamte Region des subgenomischen Promotors des TMV Ul Hüllproteingens beinhalten. Die 250 bp große Nukleotid-Sequenz beinhaltet hingegen den kompletten subgenomischen Promotor.
[0094] Es liegen nur wenig Informationen über die Struktur und Lage des subgenomischen Promoters vor, der die Expression des MP des TMV kontrolliert. Weil die mutmaßliche Sequenz des subgenomischen Promotors des MP mit der Sequenz des 183-kDa Replikase Proteins überlappt, gestaltet sich die Analyse der Region mittels Mutationen als kompliziert. Vorläufige Ergebnisse, die von W Dawson und Mitarbeitern kürzlich erbracht wurden, skizzieren die Grenzen des minimalen und kompletten subgenomischen Promoters des MP von TMV Ul (Grdzelishvili et al. 2000, Virology 276, im Druck). Durch computerunterstützte Strukturanalysen der Region, die sich aufwärts (upstream) des MP-Gens befindet, konnten zwei stem-loop-Strukturen identifiziert werden, die 5' proximal zur 75-Nukleotid-Region des MP-Gens liegen und dem AUG-Codon des MP-Gens vorausgehen.

[0095] Es wird angenommen, daß die subgenomische RNS des MP im Gegensatz zur genomischen RNS und subgenomischen RNS des Hüllproteins (der sogenannten I₂ sgRNS) nicht geschützt ist (uncapped, zusammengefaßt in: Okada, 1999, Philosoph. Transact. Of Royal Soc, 354, 569-582). Die vorliegende Erfindung unterstützt diese Ergebnisse. Demnach ist die I₂SgRNS sowohl in TMV Ul als auch in crTMV ungeschützt (uncapped, Fig. 13).

[0096] Von W. Dawson und Mitarbeitern konnte gezeigt werden, daß ein wichtiger Faktor, der die Expression eines Fremdgens in einem viralen Vektor beeinflußt, dessen relative Position zum 3'-Terminus des viralen Genoms ist: Die Effizienz der Expression steigt mit zunehmender Nähe des Fremdgens zum 3'-Terminus dramatisch an (Culver et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90, 2055-2059). Das am stärksten exprimierte Gen ist das Hüllprotein, das sich benachbart zur 3'-nichttranslatierten Region befindet. Diese besteht (in der TMV Ul RNS) aus drei Pseudoknoten, auf die eine tRNS-ähnliche Struktur folgt. Es wurde vorgeschlagen (Shivprasad et al. 1999, Virology 355, 312-323), daß die Nähe eines Gens zu den Pseudoknoten die Expression eines Fremdgens eher anhebt als dessen Nähe zum 3'-Terminus des Genoms. Viele wichtige Aspekte der Struktur des subgenomischen Promotors des TMV wurden durch die Arbeit von W Dawson und seiner Arbeitsgruppe geklärt. Die allgemeine Schlußfolgerung dieser Autoren lautete, daß sich die Forschung auf diesem Gebiet immer noch auf dem "empirischen Stand der Vektor-Herstellung" befindet (Shivprasad et al. 1999, Virology 335, 312-323).

[0097] Die bisherigen Ausführungen machen deutlich, daß die Synthese der subgenomischen RNS essentiell für die Synthese der 5'-endständigen Gene des TMV-Genoms ist. Diese Gene sind in voll-Länge-RNS stillgelegt. Der Mechanismus der unabhängigen Ex-pression eines Gens durch "Subgenomisierung" kann als eine Strategie des TMV angesehen werden, die Unfähigkeit eukaryotischer Ribsomen zur Translationsinitiation von 5'-endständigen Genen von polycistronischer, eukaryotischer mRNS zu überwinden. Nach dem traditionellen "Ribosomen-Scanning-Modell" (Kozak, 1999, Gene 234, 187-208) sind die internen Gene von polycistronischer, eukaryotischer mRNS für Ribosomen nicht zugänglich.
[0098] Kürzlich gelang es uns, aus Oleracia officinalis einen Tobamovirus zu isolieren, der in der Lage ist, Kreuzblüter zu infizieren (crucifer infecting tobamovirus, crTMV). Ein hervorstechendes Merkmal von crTMV ist seine Fähigkeit, Mitglieder der Familie der Brassicaceae systemisch zu infizieren. Zusätzlich ist der Virus in der Lage, Pflanzen der Solanaceae-Familie und andere Pflanzen, die mit TMV Ul-infizierbar sind, systemisch zu infizieren. Das Genom von crTMV (6312 Nukleotide) wurde sequenziert (Dorokhov et al., 1994, FEBS Letters 350, 5-8). Es konnte gezeigt werde, daß es vier traditionelle, durch offene Leseraster kodierte Gene beinhaltet. Es handelt sich dabei um ein 122 kDa Protein (ORFl), ein 178 kDa Protein (ORF2), das Durchlese-(readthrough)-Produkt des 122 kDa-Proteins, ein 30 kDa MP (ORF3) sowie ein 17 kDa Hüllprotein (ORF4). Eine einheitlich strukturelle Eigenschaft der crTMV RNS ist, daß - anders als bei anderen Tobamoviren - die kodierenden Regionen des MP und des Hüllproteins eine Überlappung von 75 Nukleotiden ausweisen, d. h. der 5'-endständige Teil des Hüllproteins kodiert gleichzeitig den C-terminalen Teil des MP. [0099] Um ein klares und stimmiges Verständnis der Aufzählungen und Anträge einschließlich der Figuren zu gewährleisten, werden die folgenden Definitionen gegeben:

Benachbart: Eine Position in einer Nukleinsäuresequenz unmittelbar 5' oder 3' einer definierten Sequenz gelegen.
Amplifikationsvektor: Ein Typ von Genvektor, der, nach Einführung in eine Wirtszelle, zur Replikation in dieser Wirtszelle fähig ist.
Gegensinn-Mechanismus: Eine Art der Genregulation, die darauf basiert, daß die Rate der Translation der mRNS zum Protein durch die Anwesenheit einer RNS in der Zelle kontrolliert wird, die zumindest in Teilen komplementär zur translatierten RNS ist.

Chimäre Sequenzen oder Gene: Eine Nukleotidsequenz, die aus mindestens zwei heterologen Bereichen gebildet wurde. Die Sequenz kann DNS oder RNS beinhalten.

Kodierende Seauenz: Eine Desoxyribonukleotidsequenz die, wenn sie transkribiert und translatiert wird, zur Bildung eines zellulären Polypeptids führt oder eine Ribo-nukleotidsequenz die, wenn sie transkribiert wird, zur Bildung eines zellulären Polypeptids führt.

Kompatibilität: Die Fähigkeit, mit anderen Komponenten eines Systems zu funktionieren. Ein Vektor oder die Nukleinsäure eines Pflanzenvektors, der kompatibel mit einem Wirt ist, kann sich in diesem Wirt replizieren. Ein Hüllprotein, das kompatibel mit einer viralen Nukleinsäure ist, ist in der Lage, diese Nukleinsäure einzukapseln.
Gen: Eine abgegrenzte Nukleinsäuresequenz, die für ein bestimmtes zelluläres Produkt verantwortlich ist.
Ein Gen, das exprimiert werden soll: Ein Gen, deren Expression von technologischem Interesse ist.
Wirt: Eine Zelle, ein Gewebe oder ein Organismus, in dem sich ein Vektor oder Pflanzenvirus replizieren kann. Ein Wirt ist in der Lage, von einem Virus, der einen viralen Vektor oder Sequenzen von Pflanzenvektoren besitzt, infiziert zu werden. Der Terminus soll prokaryotische und eukaryotische Zellen, Organe, Gewebe oder Organismen einschließen.
Wirtspflanzengenom: Mit diesem Begriff wird v. a. das Kerngenom einer Wirtspflanze bezeichnet. Er beinhaltet aber daneben ggf. auch mitochondriale und Chloroplasten-DNS.

Infektion: Die Fähigkeit eines Virus oder eines auf Vermehrung basierenden Virus, seine Nukleinsäuren in einen Wirt zu übertragen oder, seine Nukleinsäuren in einen Wirt zu übertragen, indem die virale Nukleinsäure oder ein Vektor repliziert wird, virale Proteine synthetisiert werden und neue Viruspartickel zusammengesetzt werden. In diesem Zusammenhang werden die Begriffe "übertragbar" und "infektiös" gleichwertig verwendet.

Interne ribosomale Eintrittsstellen (IRES, Internal Ribosomal Entry Sites) oder IRES: Eine Nukleotidsequenz viralen, zellulären oder synthetischen Ursprungs, die auf der Ebene der Translation für die interne Initiation verantwortlich ist. IRES-Elemente, die für die Translation eines abwärts (downstream) pelegenen Gens verantwortlich sind: IRES-EIemente, die in dem Sinne für die Translation eines obigen Gens wirksam sind, daß ohne sie keine Expression des Gens auftritt, die im technologischem Sinne interessant ist.

Nichtvirales Gen: Ein Gen, das im Lebenszyklus eines Virus keine Rolle spielt.

Phänotypisches Merkmal: Eine zu beobachtende Eigenschaft, die durch die Expression eines Gens hervorgerufen wird. Pflanzenzelle: Die strukturelle und physiologische Einheit einer Pflanze, bestehend aus dem Protoplasten und der Zeilwand.

Pflanzenorgan: Ein abgegrenzter und sichtbar zu differenzierender Teil einer Pflanze, wie z. B. Wurzel, Sproß, Blatt oder Embryo.

Pflanzengewebe: Jedes Gewebe einer Pflanze im Pflanzenkörper oder in Gewebekultur. Mit diesem Terminus soll die gesamte Pflanze, die Pflanzenzelle, Pflanzenorgane, Protoplasten, Zellkulturen oder jede andere Gruppe von Pflanzenzellen bezeichnet werden, die in einer strukturellen oder funktionellen Einheit organisiert sind.

Produktionszelle: Eine Zelle eines Gewebes oder eines Organs, die in der Lage ist, einen Vektor oder einen viralen Vektor zu replizieren, aber die nicht notwendigerweise ein Wirt des Virus ist. Mit diesem Begriff sollen prokaryotische und eukaryotische Zellen, Gewebe oder Organe wie Bakterien, Hefe, Pilze und Pflanzengewebe eingeschlossen werden.
Promotor: Der 5'-nichtkodierende Bereich der aufwärts (upstream) einer kodierenden Sequenz gelegen und funktionell mit dieser verbunden ist. Sie ist an der Initiation der Transkription der kodierenden Sequenz beteiligt.
Protoplast: Eine isolierte Pflanzenzelle ohne Zellwand. Sie besitzt die Fähigkeit, sich in Gewebekultur oder in einer ganzen Pflanze fortzupflanzen.

Rekombinante Pflanzenvirus-Nukleinsäure: Die Nukleinsäure eines Pflanzenvirus, die durch die Einführung von nichtviralen Nukleinsäuresequenzen modifiziert wurde.

Rekombinanter Pflanzenvirus: Ein Pflanzenvirus, der die rekombinante Pflanzenvirus-Nukleinsäure trägt.
Reportergen: Ein Gen, dessen Produkt einfach nachgewiesen werden kann.

Subgenomischer Promotor (sgPR): Ein Promotor einer subgenomischen mRNS eines Vektors oder einer Nukleinsäure. Aussagekräftige Nukleinsäurehomologie: Bezeichnet Nukleotid-Sequenzen, die so homolog sind, daß auf eine funktionelle Übereinstimmung geschlossen werden kann. Unterschiede in den Nukleinsäuresequenzen von Sequenzen, die signifikante Homologie aufweisen, sind bezüglich der Funktion der Genprodukte oder der von einer solchen Sequenz kodierten RNS unbedeutend.

Transkription: Produktion eines RNS-Moleküls durch die RNS-Polymerase als komplementäre Kopie einer DNS-Sequenz.

Translation: Erzeugung eines Polypeptids durch ein Ribosom (häufig im Sinne des Abtastens (scanning) einer RNS gemeint).

Vektor: Eine selbstreplizierende (sich selbst vermehrende) Nukleinsäure, die in der Lage ist, eine Wirtszelle genetisch zu modifizieren. Der Vektor kann einzelsträngig (ss) (+), ss (-) oder doppelsträngig (ds) sein.

Virus: Eine infektiöse Substanz, die aus einer Nukleinsäure besteht, welche in ein Protein eingehüllt ist. Ein Virus kann ein-, zwei-, drei- oder mehrteilig sein.

VORTEILE DER ERFINDUNG

[0100] Diese Erfindung liefert eine neue Strategie zur Herstellung eines auf Vermehrung basierenden Vektors zur Expression von Fremdgenen (heterolog, nicht nativ). Die Translation dieser Gene kann über einen durch eine IRES-Sequenz vermittelten Mechanismus des internen Ribosomeneintritts vermittelt werden. Dies erfolgt entweder von einer polycistronischen RNS oder/und von bi- und multicistronischer sgRNS, die von dem Vektor in der infizierten Zelle erzeugt werden. In jedem Fall ist die IRES-Sequenz zur Translation eines Gens nötig. Ein Vorteil dieses Systems ist, daß es keine spezifischen Manipulationen der sgRNS erfordert: Die einzige Sequenz, die in den Vektor eingefügt werden sollte, ist die IRES-Sequenz bzw. sind die IRES-Sequenzen, die aufwärts (upstream) des zu translatierenden Gens liegen. Die IRES-Sequenzen können nativ oder nicht-nativ sein. Die Translation der abwärts (downstream) gelegenen Gene wird durch die insertierten IRES-Sequenzen gefördert, d. h. es handelt sich um einen CAP-unabhängigen Mechanismus. Der Sequenzbereich, der die IRES-Sequenz beinhaltet, besitzt keine Eigenschaft eines subgenomischen Promotors, die technisch eine

Rolle spielen könnte. Dies kann bedeuteten, daß der Sequenzbereich keine nachweisbare Produktion korrespondierender, subgenomischer RNS bewirkt. Alternativ kann die Translation subgenomischer RNS ein Ergebnis von restlicher subgenomischer Promotoraktivität der IRES-Sequenz sein. Das IRES-Element wird in diesem Falle aber immer noch für die Translation eines abwärts (downstream) gelegenen Gens benötigt. Folglich besitzt die primäre rekombinante RNS die vom Vektor produziert wird, folgende Bestandteile: ein oder mehrere Strukturgene (vorzugsweise viralen Ursprungs), besagte IRES-Sequenz, das (Fremd-) Gen von Interesse, das sich abwärts (downstream) der IRES-Sequenz befindet und die 3' nichttranslatierte Region (3'-NTR). Es ist wichtig, daß diese Strategie die gleichzeitige Expression mehrerer Fremdgene ermöglicht. Dies wird durch die tandemartige Insertion von zwei oder mehreren Fremdgenen ermöglicht, die alle von unterschiedlichen IRES-Sequenzen kontrolliert werden. Die vorliegende Erfindung ist vorzugsweise auf Nukleinsäuren und rekombinante Viren ausgerichtet, die durch die CAP-unabhängige Expression des viralen Genoms oder der viralen sgRNS oder nicht-nativer (Fremd-) Nukleinsäuren charakterisiert werden. Diese sind in der Lage, über weitere pflanzenspezifische IRES-Elemente solche Fremdsequenzen systemisch zu exprimieren.

[0101] In einer ersten Anwendungsform wird die Nukleinsäure eines Pflanzenvirus bereitgestellt, in der die kodierende Sequenz für das native Hüllprotein und der native subgenomische Promotor deletiert sind. Statt dessen wird ein nicht-natives Hüllprotein aus einem Pflanzenvirus mit einem aufwärts (upstream) gelegenem viralen IRES-Element inseriert. Dies erlaubt CAP-unabhängige Expression in der Wirtspflanze. Die Verpackung der rekombinanten viralen Nukleinsäuren und die anschließende systemische Infektion des Wirts durch die rekombinante Nukleinsäure des Pflanzenvirus bleiben erhalten.
[0102] Die rekombinante Pflanzenvirus-Nukleinsäure kann ein oder mehrere native oder nicht native IRES-Elemente beinhalten, die als Translationselemente funktionieren und die keine transkriptionelle Aktivität besitzen, d. h. sie sind unfähig, als subgenomischer Promotor zu fungieren. Jedes native oder nicht-native IRES-Element ist in der Lage, CAP-unabhängige Expression von benachbarten Genen oder Nukleinsäuresequenzen in der Wirtspflanze zu fördern. In einer zweiten Anwendungsform wird ein Amplifikations- und Expressionsvektor zur Verfügung gestellt, in dem mehrere native oder nicht native pflanzenvirale IRES-Elemente oder ein natives oder nicht-natives, pflanzenvirales IRES-Element, das aufwärts (upstream) von Fremdnukleinsäuresequenzen liegt, abwärts eines nativen Hüllproteins inseriert sind bzw. ist. Das inserierte Pflanzenvirus-IRES-Element kann die CAP-unabhängige Expression von benachbarten Genen in Wirtspflanzen leiten. Nicht-native Nukleinsäuresequenzen können benachbart zu den PRES-Elementen inseriert werden, so daß besagte Sequenzen in der Wirtspflanze unter der translationalen Kontrolle der IRES-Elemente exprimiert werden und das gewünschte Produkt synthetisiert werden kann.

[0103] In einer dritten Anwendungsform wird ein rekombinanter Vektor wie im zweiten Ansatz zur Verfügung gestellt. Der Unterschied besteht darin, daß das native oder nicht native, pflanzenvirale IRES-Element (oder die IRES-Elemente) mit den abwärts gelegenen Fremdnukleinsäuresequenzen aufwärts (upstream) des Hüllproteins und dessen nativen subgenomischen Promotors gelegen ist bzw. sind. In einer vierten Anwendungsform wird eine rekombinante virale Nukleinsäure zur Verfügung gestellt, in der ein natives oder nicht-natives, pflanzenvirales IRES-Element (oder IRES-EIemente) am 5'-Ende des viralen Genoms oder in der viralen subgenomischen RNS verwendet wird bzw. werden, so daß ein abwärts (downstream) gelegenes Gen CAP-unabhängig translatiert wird.

[0104] In einer fünften Anwendungsform wird die Inhibition der CAP-abhängigen Translation ausgenützt, um das Niveau der CAP-unabhängigen Translation in den besagten Vektoren zu erhöhen. Die auf Viren basierenden Amplifikationsvektoren werden vom Hüllprotein eingeschlossen. Das Hüllprotein wird von der rekombinanten, pflanzen viralen Nukleinsäure kodiert. Die rekombinante, pflanzenvirale Nukleinsäure ist zur Replikation im Wirt fähig. Darüber hinaus kann es zur systemischen Ausbreitung im Wirt kommen. Ein Fremdgen oder Fremdgene können CAP-unabhängig exprimiert werden. Zusätzlich kann das gesamte Genom oder subgenomische RNSs CAP-unabhängig im Wirt produziert werden, um ein gewünschtes Produkt zu erzeugen. Solche Produkte schließen therapeutische und aridere nützliche Polypeptide ein. Dazu gehören u. a. Enzyme, komplexe Biomoleküle oder Polypeptide oder Merkmale oder Produkte, die durch die Produktion von Gegensinn-RNS (antisense RNS) erzeugt werden. Beispiele für erwünschte eingeführte (input-)Eigenschaften sind Resistenzen gegenüber Viren, Bakterien, ablotischem Stress sowie eine verbesserte Energie- und Materialverwertung. Beispiele für erwünschte output-Eigenschaften sind modifizierte Kohlenhydrate, modifizierte Polysaccharide, modifiziere Fette, eine modifizierte Aminosäurezusammen-setzung bzw. -Ausbeute, modifizierte sekundäre Metaboliten und pharmazeutische Proteine, einschließlich Enzyme, Antikörper, Antigene u. ä.. Beispiele für Regulations-mechanismen, die Merkmale kontrollieren sind Gen-Umschaltungen (Gene-switches), Kontrolle der Expression, Kontrolle der hybriden Samenproduktion und Kontrolle von Apomixis.

[0105] Die vorliegende Erfindung zielt zudem direkt auf die Herstellung künstlicher, nicht-natürlicher IRES-Elemente (im Gegensatz zu IRES-Elementen, die aus lebenden Organismen isoliert werden). Diese ermöglichen eine CAP-unabhängige und Promotor-unabhängige Expression eines Gens von Interesse in Pflanzen (und evtl. zusätzlich in Hefe- oder Tierzellen). Beispiele für lebende Organismen, aus denen die IRES-Elemente evtl. isoliert werden können sind der Hepatitus C Virus, infektiöse Bronchitis-Viren, Picornaviren wie Poliovirus und Encephalomiocarditisvirus sowie Retroviren wie Moloney Murine Leukemia Virus und Harvey Murine Sarcoma Virus. Beispiele für Pflanzenviren sind der Kartoffelvirus X, Potyviren wie der Kartoffelvirus Y und Rübenmosaikvirus, Tobamoviren wie z. B. solche, die Kruziferen infizieren und Comoviren, wie z. B. der Cowpea Mosaik Virus. Alternativ können natürliche IRES-Sequenzen aus zellulärer Boten-RNS isoliert werden. Dazu gehören RNSs wie die des homöotischen ANTENNAPEDIA-Gen oder des menschlichen Fibroblastenwachstums-faktors 2 und des Translationsinitiationsfaktors eIF-4G.

[0106] In einer sechsten Anwendungsform werden künstliche, nicht natürliche IRES-Elemente auf der Basis der Komplementarität zur 18S rRNS von eukaryotischen Zellen, einschließlich Hefe, Tieren und Pflanzenzellen gebildet.
[0107] In einer siebten Anwendungsform werden künstliche, nicht natürliche IRES-Elemente auf der Grundlage von kurzen Sequenzabfolgen von Adenosin/Guanosin-Basen gebildet.

[0108] In einer achten Anwendungsform dieser Erfindung wird eine Methode zur Herstellung und Verwendung von auf Viren basierenden Amplifikationsvektoren präsentiert, in der die Expression des viralen Genoms in Pflanzenzellen unter der Kontrolle eines pflanzenspezifischen Transkriptionspromotors auftritt.

[0109] In einer neunten Anwendungsform der vorgelegten Erfindung wird eine Methode zur Herstellung und Verwendung von auf Viren basierenden Amplifikationsvektoren vorgestellt, die es erlaubt, eine vektorielle Expression von Replikons durchzuführen, die in der Pflanzenzelle als ein Ergebnis eines primären, nuklearen Transkriptionsprozesses gebildet werden.

[0110] In einer zehnten Anwendungsform dieser Erfindung wird ein Produkt beschrieben, mit dessen Hilfe ringför- 5 mige, einzelsträngige, auf Viren basierende Amplifikationsvektoren zur CAP-unabhängigen Expression von Fremdgenen in Pflanzen verwendet werden können.

[Olli] In einer elften Anwendungsmöglichkeit dieser Erfindung werden Methoden präsentiert, die die Expression eines Gens von Interesse unter Bedingungen in Zellen ermöglicht, die eine CAP-unabhängige Expression bevorzugt. In einem Beispiel werden Zellen, die mit einem Amplifikationsvektor infiziert wurden, mit einer Komponente behandelt, die 10 die CAP-abhängige Translation verhindert. In einem weiteren Beispiel beinhaltet der Vektor selber ein Gen, dessen Produkt einen inhibierenden Effekt auf die CAP-abhängige Translation im Wirt bewirkt. Alternativ kann der Vektor auch eine Gegensinn (antisense)-Sequenz mit gleicher Funktion besitzen.

[0112] In einer elften Anwendungsmöglichkeit dieser Erfindung ist eine Methode beschrieben, die es erlaubt, mittels in vivo-genetischer Selektion eine IRES-Sequenz zu identifizieren, die die CAP-unabhängige Expression eines Gens von 15 Interesse oder eines Reportergens in einem Vektor vermittelt.

KURZE BESCHREIBUNG DER HGUREN

Fig. 7

Darstellung der Vektoren T7/crTMV und SP6/crTMV.

Darstellung der Vektoren T7/crTMV/IRES_MP,₇₅ ^tK-GUS, T7/crTMV/IRES_MP,₇₅ ^ul-GUS, T7/crTMV/IRES_MP,228^CR-GUS, T7/crTMV/IRES_CP, ₁₄₈ ^CR-GUS, T7/crTMV/SPACER_CP, u₈ ^ul-GUS und T7/crTMV/PL-GUS.

Fig. 8

Fig. 9

Kartierung des 5' Endes der TMV I₂SgRNS durch Primer-Verlängerung und mutmaßliche Sekundärstruktur von I₂ sgRNS 5' NTR.

Fig. 10

Die crTMV I₂SgRNS 5' NTR beinhaltet eine die Translation inhibierende Haarnadelstruktur. (A) stellt die künstlichen Transkripte, die für die in vitro Translation mit Hilfe von Weizenkeimextrakten (WGE) verwendet wurden, dar; (B) zeigt die Translationsprodukte, die synthetisiert wurden.

Fig. 11

Tobamoviren beinhalten eine Haarnadelstruktur aufwärts (upstream) des MP-Gens, die vermutlich Translation inhibiert.

Fig. 12

Methode der spezifischen Detektion von geschützter (capped) RNS. A, B. Eine RNS-Markierung mit einer bekannten Sequenz wird spezifisch an die CAP-Struktur einer getesteten RNS ligiert. C. Reverse Transkription mit 3' spezifischen Primern und cDNS Erststrangsynthese. Die Endsequenz ist in der Sequenz der cDNS enthalten. D. PCR mit endspezifischen und 3'-spezifischen Primern. Das Auftreten der entsprechenden PCR-Bande deutet auf die Anwesenheit von CAP-Strukturen in der getesteten RNS hin. E. PCR mit 5'-spezifischen und 3'-spezifischen Primern. Das Auftreten der PCR-Bande dient als Kontrolle der PCR-Reaktion und deutet auf die Anwesenheit der spezifisch getesteten RNS in dieser Reaktion hin. F. Größenvergleich der erhaltenen PCR-Banden.

Fig. 13a
und 13b

Detektion der CAP-Strukturen am 5'-Ende der viralen RNS in einem 2% igem Agarosegel. Pfeile weisen auf die entsprechenden PCR-Fragmente hin.

Fig. 14

Fig. des auf KK6 basierenden TMV-Vektors

Fig. 15

Nukleotid-Sequenz der 5' NTR von KK6 und KK6- IRESmP₇₅ I₂SgRNS.

Fig. 16

Zeitverlauf der Hüllprotein und MP-Akkumulation in Blättern, die mit KK6- IRES_Mp,75^CR (K86), KK6 und TMV U1 infiziert wurden.

Akkumulation des Hüllproteins in Tabak der mit KK6, KK6-IRES_Mp,7₅ ^CK, KK6-IRES_MP.i25^CR und KK6-H-PL und KK6-PL infiziert wurde.

Fig. 17

Fig. 18

Dargestellt ist eine Multimerstruktur von crTMV IRESmp und die Homologie zur 18S rRNS aus Arabidopsis thaliana.

18

Dargestellt sind bicistronische Transkripte, die die IRESmp.t-s¹^ beinhalten, sowie die Tetramere von 18-nt Segmenten von IREScp.^B⁰'¹. 19-nt Segment von IRES_Mp_i75 ^CR, Polylinker (PL) als intercistronischer „Spacer" und Produkte ihrer Translation in RRL.

Fig. 19 Fig. 20

Stellt die Struktur von IRES_cp,i48 dar.

Zeigt Konstrukte, die zum Test von IRES_cPii48^CK-Sequenzelementen in vitro und in vivo

verwendet wurden.

Fig. 21

10 15 20 25 30 35 40

Fig. 22

GUS-Aktivitätstest in WGE nach der Translation der Transkripte, die in Fig. 27 dargestellt sind.

Fig. 23

GUS-Aktivitätstest in Tabak-Protoplasten, die mit 35S-Promotor-basierenden Konstrukten (analog zu den Konstrukten in Fig. 27) transfiziert wurden.

Fig. 24

Schematische Darstellung der Klonierung zweier infektiöser TMA-Vektoren die IRES_mp,75^CR in der 5' nichttranslatierten Region beinhalten.

Fig. 25

Darstellung von Vektor Act2/crTMV.

Fig. 26

Zeigt die auf pUC-basierende Vektoren Act2/crTMV/ IRES_mp,₇5 -GUS.

Fig. 27

Darstellung des zirkulären, einzelsträngigen Vektors KS/Act2/crTMV/ IRES_mp,7₅ ^CR GUS.

Fig. 28

Darstellung desVektors KS/Act2/crTMV/ IRES_mp,₇5 -GUS.

Fig. 29

Darstellung des Konstruktes 35S/CP/ IRES_mp,₇₅ -GUS.

Fig. 30

Darstellung des Konstruktes 35S/GUS/ !RES₁₁₇₅ -GUS.

ztr

Fig. 31

Darstellung des Konstruktes 35S/CP/-VPg/IRES_mp75 ^UK-GUS.

Fig. 32

Darstellung eines Konstruktes, das zur genetischen in wVo-Selektion verwendet werden kann. Es dient der Identifizierung eines viralen, subgenomischen Promotors oder einer IRES-Sequenz, die CAP-unabhängige Expression eines Gens von Interesse in einem Expressionsvektor bewirkt.

DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

[0113] Das vorrangige Ziel dieser Erfindung ist die Etablierung neuer Strategien zur Konstruktion von Vektoren für die Expression von fremden (heterologen, nicht nativen) Genen, wobei diese Vektoren auf der Amplifizierung basieren. Die Translation dieser Gene wird dabei durch IRES-vermittelte, CAP-unabhängige Mechanismen, des internen Ribosomeneintritts an polycistronische, genomische Virus-RNSs und/oder bi- und multicistronische sgRNSs, die von amplifizierenden Vektoren produziert werden, erreicht. Vorzugsweise sollen diese von viralen Vektoren in einer Pflanzenzelle erzeugt werden.

[0114] Die Konstruktion von rekombinanten, pflanzlichen Virus-RNSs und die Etablierung von amplifizierenden Vektoren für die Einführung und Expression von fremden Genen in Pflanzen wurde bereits von zahlreichen Autoren gezeigt, die zu diesem Zweck die Genome von verschiedenen taxonomischen Virus-Gruppen verwendeten (Review, siehe "Genetic Engineering With Plant Viruses", 1992, eds. Wilson and Davies, CRC Press, Inc.). Als geeignete Gruppe für die Konstruktion von viralen Vektoren wurden dabei die Tobamoviren angesehen. Donson et al. (U.S. Patents Nos. 5,316,931; 5,589,367 und 5,866,785) erfanden TMV-basierende Vektoren, mit deren Hilfe man verschiedene, fremde Gene in einer Wirtspflanze exprimieren konnte. So wurden auf diese Weise das Neomycin-Phosphotransferase-Gen, das a-Trichosantin-Gen und mehrere andere fremde Gene angrenzend zu dem subgenomischen Promotor (sgPR) des TMV-Hüllprotein-Gens inseriert. Donson et al, (1993, PCT WO 93/03161) entwickelten auf der Basis eines Tobamoviruses "eine rekombinante Pflanzenvirus-Nukleinsäure, die einen nativen, subgenomischen Pflanzenvirus-Promotor, wenigstens einen nicht nativen, subgenomischen Pflanzenvirus-Promotor und die kodierende Sequenz eines Pflanzenvirus-Hüllproteins umfaßte. Der erwähnte nicht native, subgenomische Pflanzenvirus-Promotor ist dabei in der Lage, die Transkription der angrenzenden Nukleinsäuresequenz in einer Wirtspflanze zu initiieren, wobei er nicht mit subgenomischen Promotoren der rekombinanten Pflanzenvirus-Nukleinsäure rekombiniert. Die erwähnte Pflanzenvirus-Nukleinsäure kann eine systemische Infektion einer Wirtspflanze hervorrufen".
[0115] Im Gegensatz zu der Technologie von Donson et al, bezieht sich die vorgelegte Erfindung nicht auf subgenom-

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19

ische Promotoren (sgPRs), mit deren Hilfe auf viralen Replikons basierende Pflanzenexpressionssysteme konstruiert werden. Statt sgPRs benutzt unsere Technologie IRES-Sequenzen (für den Virus native oder nicht native) verschiedensten Ursprungs, die effektiv keine sgPR-Aktivität aufweisen, d. h. sie sind effektiv nicht in der Lage, die Produktion von sgRNSs zu initiieren. Deshalb sollten diese IRES-Squenzen nicht als sgPRs angesehen werden, obwohl sie in manchen Fällen nichtfunktionale Segmente von sgPRs darstellen.

[0116] Es wird im allgemeinen angenommen, daß nach in vitro Transkription erhaltene voll-Lange Virus-RNS, die nicht mit einer CAP-Gruppe versehen ist, nicht infektiös für intakte Pflanzen und Protoplasten ist. Aus diesem Grund wird die Modifizierung eines RNS-Transkripts mit einer CAP-Gruppe ausgehend von einem viralem Vektor generell als Voraussetzung dafür angesehen, daß ein in vitro Transkript infektiös ist. Geschützte (capped) RNS-Transkripte werden normalerweise benutzt, um virale Vektor-RNS in Pflanzen einzubringen. Es ist wichtig darauf hinzuweisen, daß in einigen Fällen virale RNS mit Hilfe einer einfachen Prozedur in vitro durch Hüllproteine verpackt werden kann. Auf diese Weise können ausgehend von Hüllpropteinen und in vitro Transkripten oder von aufgereinigter, authentischer viraler RNS sowohl TMV-Virione als auch Pseudovirione, die Vektor-RNS enthalten, sehr schnell hergestellt werden. Vor fünfzehn Jahren konnte von Meshi et al. (1986, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85. 5043-5047) gezeigt werden, daß in einem in vitro Ansatz ohne CAP-Analoge hergestellte, ungeschützte (uncapped) Transkripte der voll-Lange TMV-RNS infektiös waren, wobei deren spezifischer Infektionsgrad sehr gering war.

[0117] In der vorliegenden Erfindung kann ungeschützte (uncapped) Expressionsvektor-RNS, die mit TMV-Hüllprotein verpackt ist, für Pflanzeninokulierungen benutzt werden, um den geringen Infektionsgrad zu kompensieren. Wenigstens eine der zusätzlichen Strategien, die in dieser Erfindung beschrieben werden, eröffnet eine technische Möglichkeit für Pflanzeninfektionen mit einem CAP-unabhängigen viralen Pflanzen-Vektor. Diese ist die Methode der Insertion einer voll-Lange Einzelstrang-(ss)DNS-Kopie eines viralen Vektors unter der Kontrolle eines geeigneten DNS-Promotors. Nach der Inokulation einer Wirtspflanze mit einer rekombinanten Virus-DNS wird die infektiöse voll-Lange RNS des viralen Pflanzenvektors produziert. Diese ist wiederum in der Lage, sich zu replizieren und sich in der Pflanze auszubreiten.

[0118] Die Tatsache der CAP-unabhängigen Expression von fremden Genen mit Hilfe der IRES-Sequenzen, sowie die genannten Prozeduren machen somit die Prozesse der Pflanzeninokulation und der Expression eines fremden Gens CAP-unabhängig.

[0119] Ein wichtiges und bevorzugtes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung einer Serie von viralen Vektoren, die auf dem crTMV-Genom basieren und in denen der 'TRES-Fremdgen"-Block zwischen dem Hüllprotein und dem 3'-NTR inseriert ist. Zahlreiche IRES- und Kontrollsequenzen wurden in Kombination mit zwei verschiedenen Reportergenen (GUS und GFP) verwendet (siehe Fig. 8). Ein einzigartiger Aspekt dieser Erfindung liegt darin, daß fremde Gene, die ausserhalb der viralen sgPR-Sequenzen liegen, in infizierten Pflanzen CAP-unabhängig von der dem 3'-Ende nächsten Position der genomischen RNSs und sgRNSs, die ihrerseits wiederum von dem Vektor produziert werden, exprimiert werden. Insbesondere die IRESMP,75^CR-Sequenz, die den 3'-terminalen Teil der 5'-nicht translatierten Präsequenz (leader sequence) der crTMV-L; sgRNS repräsentiert, vermittelte in Pflanzen, die mit dem viralen Vektor infiziert wurden, effizient die CAP-unbhängige Expression des dem 3'-Ende nächsten Fremdgens. Es sollte daraufhingewiesen werden, daß erwähnte, auf dem crTMV basierende, virale Vektoren drei verschiedene Arten der viralen, plus sense ssRNSs in infizierten Pflanzen prodzieren: i) voll-Lange genomische RNS, ii) tricistronische L_ sgRNS (unsere Daten zeigen, daß die spätere sgRNS im Gegensatz zu der voll-Lange RNS nicht geschützt (uncapped) ist) und iii) bicistronische sgRNS, die das erste Hüllprotein-Gen und das zweite Fremdgen enthält. Aus diesem Grund sind all diese RNSs 3'-coterminal. Gleichzeitig wird die CAP-unabhängige Translation des dem 3'-Ende nächstgelegenen Gens mit Hilfe der vorangestellten IRES-Sequenz vermittelt. Dabei liegt diese RNSs entweder als geschützte (capped, voll-Lange oder bicistronisch) oder nicht geschützte (uncapped, tricistronisch) RNS vor.
[0120] Eine wichtige charakteristische Eigenschaft der viralen Vektoren ist deren Stabilität. Die auf dem TMV-basierenden Vektoren, die Fremdgene enthalten, verbreiten sich jedoch gewöhnlich nicht effizient innerhalb des Phloems von Pflanzen, die normalerweise systemisch von Wildtyp-Viren infiziert werden. Dies kann zum einen durch die Verlängerung der rekombinanten, viralen RNS und/oder durch die Anwesenheit von sich wiederholenden Sequenzen, die zu Rekombinationen bzw. Deletionen führen, woraus letztendlich eine Reversion zum Wildtyp-Virus resultiert, erklärt werden. Die Umwandlung der nachfolgenden Population zu Wildtyp-Viren tritt dann in systemisch infizierten Blättern auf.

[0121] Ein weiterer, wichtiger und charakteristischer Aspekt der viralen Vektoren ist das Niveau der Genexpression der Fremdgene und die Akkumulation des entsprechenden Proteins. Die Proteinmengen, die mit Hilfe der Vektoren erzielt werden, sind so hoch, daß sie z. B. im Fall des GUS-Proteins ohne weiteres mit Hilfe einer SDS-PAGE detektiert werden können.
[0122] Die Technologien, die sich für die Konstruktion von amplifizierenden Vektoren für die Expression von fremden Sequenzen in Wirtspflanzen als geeignet auszeichneten, sind auf der Basis von verschiedenen viralen Genomen entwikkelt worden (z. B. siehe G. Della-Cioppa et al, 1999, PCT WO 99/36516).

[0123] Die zentrale Eigenschaft von solchen Erfindungen war, daß die rekombinante, virale Pflanzennukleinsäure "eine oder mehrere nicht native subgenomische Promotoren enthält, die in der Lage sind, die angrenzenden Nukleinsäuresequenzen in Wirtspflanzen zu transkribieren bzw. zu exprimieren. Die rekombinanten, viralen Pflanzennuklein-säuren können eventuell weiter modifiziert werden, um die gesamte oder Teile der kodierenden Sequenz des nativen Hüllproteins zu deletieren, so daß man eine nicht nativ kodierende Hüllproteinsequenz unter der Kontrolle eines nativen Promotors oder eines der nicht nativen pflanzlichen, viralen, subgenomischen Promotoren erhält. Oder die native Hüllproteinsequenz wird unter die Kontrolle eines nicht nativen pflanzlichen, viralen, subgenomischen Promotors gestellt". In anderen Worten ausgedrückt, stellt oder stellen die nativen und nicht nativen sgPR-Sequenzen, die für die Herstellung von künstlichen sgRNSs mit Hilfe der viralen Vektoren benutzt wurden, die wichtigsten Element(e) dieser Erfindung dar. Eine wichtige Eigenschaft, die die Erfindung, die von unserer Gruppe präsentiert wird, von anderen unterscheidbar macht, ist, daß gemäß WO 99/36516 das fremde Gene zwangsläufig unterhalb (downstream) der sgPR-Sequenzen lokalisiert sein muß. Zum Beispiel sollte sie an der dem 5'-Ende nächsten Position der chimären sgRNS, die von dem viralen

Vektor in den Wirtspflanzen produziert wird, lokalisiert sein. Im Gegensatz dazu schlägt unsere Erfindung vor, daß das fremde Gen von einem sgPR (wenn vorhanden) wenigstens durch ein (oder mehrere) virale Gen(e) getrennt ist, so daß das besagte, fremde Gen an der dem 3'-Ende nächsten Position oder innerhalb der aktiven, chimären sgRNS, die von dem Vektor produziert wird, lokalisiert ist. So wird auf diese Weise die Genexpression entweder durch eine native oder nicht native IRES-Sequenz vermittelt. Das nächste bevorzugte Ziel dieser Erfindung ist die Konstruktion eines neuen Typus der nicht nativen IRES-Sequenzen, der sogenannten künstlichen, nicht natürlichen, synthetischen IRES-Sequenzen, die in der Lage sind, eine CAP-unabhängige Translation des 5'-distalen Gens von eukaryotischen, polycistronischen mRNSs zu vermitteln. Wir zeigen, daß intercistronische Spacer, die komplementär zu der 18S rRNS verschiedener Länge und Komposition sind, in der Lage sind, die CAP-unabhängige Translation des 3'-proximalen GUS-Gens in einer bicistronischen H-GFP-IRES-GUSmRNS zu vermitteln (Fig. 19).

[0124] Abschließend stellt die Möglichkeit der Kombination von Wiederholungen von zwei oder mehreren fremden Genen, denen jeweils eine native oder nicht native IRES-Sequenz in dem auf der Amplifikation basierenden Vektorgenom voran geht, einen Vorteil der vorliegenden Erfindung dar. Die Expression einer solchen Kassette eines 'TRES-Fremdgens" wird die gleichzeitige Produktion von zwei oder mehreren fremden Proteinen mit Hilfe des Vektors ermöglichen. [0125] Viren, die zu verschiedenen taxonomischen Gruppen gehören, können zur Konstruktion von viralen Vektoren gemäß der Prinzipien dieser Erfindung genutzt werden. Das gilt sowohl für RNS- als auch für DNS-enthaltene Viren, für die im folgenden Beispiele gegeben werden (durchlaufend ist in diesem Dokument bei jedem Artspeziesnamen der Name der Ordnung, der Familie und der Gattung, zu dem dieser gehört vorangestellt. Namen der Ordnungen, Familien und Gattungen sind in kursiv gesetzt, wenn sie von der ICTV bestätigt sind. Namen der Taxa in Anführungszeichen (und nicht in kursiv gesetzt) zeigen an, daß dieses Taxon keinen von der ICTV international bestätigten Namen hat. Trivialnamen der Spezies sind in normaler Schreibweise aufgeführt. Viren mit keiner formalen Zuordnung zu einer Gattung oder Familie sind angezeigt):

DNS-Viren

Zirkuläre dsDNS-Viren

Familie: Caullmoviridae, Gattung: Badnavirus, Artspezies: commelina yellow mottle virus, Gattung: Caulimovirus, Artspezies: cauliflower mosaic virus, Gattung: "SbCMV-like vires", Artspezies: Soybean chloroticmottle virus, Gattung: "CsVMV-like vires", Artspezies: Cassava vein mosaicvirus, Gattung: "RTBV-Like vires", Artspezies: Rice tungro bacilliformvirus, Gattung: "Petunia vein clearing-like vires", Artspezies: Petunia vein clearincz virus;

Zirkuläre ssDNS-Viren

Familie: Geminiviridae, Gattung: Mastrevirus (Untergruppe I Geminivirus), Artspezies: maize streak virus, Gattung: Curtovirus (Untergruppe 11 Geminivirus), Artspezies: beet curly top virus, Gattung: Begomovirus (Untergruppe ΙΠ Geminivirus, Artspezies: bean golden mosaic virus;

RNS-Viren

ssRNS-Viren

Familie: Bromoviridae, Gattung: Alfamovirus, Artspezies: alfalfa mosaic virus, Gattung: Ilarvirus, Artspezies: tobacco streak virus, Gattung: Bromovirus, Artspezies: brome mosaic virus, Gattung: Cucumovirus, Artspezies: cucumber mosaic virus;

Familie: Closeroviridae, Gattung: Closterovirus, Artspezies: beet yellow virus, Gattung: Crinivirus, Artspezies: Lettuce infectious yellows virus,

Familie: Comoviridae, Gattung: Comovirus, Artspezies: cowpea mosaic virus, Gattung: Fabavirus, Artspezies: broad bean wilt virus 1, Gattung: Nepovirus, Artspezies: tobacco ringspot virus; Familie: Potyviridae, Gattung: Potwirus, Artspezies: potato virus Y, Gattung: Rymovirus, Artspezies: ryegrass mosaic virus, Gattung: Bymovirus, Artspezies: barley yellow mosaic virus;

Familie: Seguiviridae, Gattung: Seguivirus, Artspezies: parsnip yellow fleck virus, Gattung: Waikavirus, Artspezies: rice tung ro spherical virus;

Familie: Tombusviridae, Gattung: carmovirus, Artspezies: carnation mottle virus, Gattung: Dianthosvirus, Artspezies:

carnation rinaspot virus, Gattung: Machlomovirus, Artspezies: maize chlorotic mottle virus, Gattung: Necrovirus, Artspezies: tobacco necrosis virus, Gattung: Tombusvirus, Artspezies: tomato bushy stunt virus;

Nicht zugeordnete Genera der ssRNS-Viren

Gattung: Capillovirus, Artspezies: apple stem grooving virus, Gattung: Carlavirus, Artspezies: carnation latent virus, Gattung: Enamovirus, Artspezies: pea enation mosaic virus, Gattung: Furovirus, Artspezies: soil-borne wheat mosaic virus, Gattung: Hordeivirus, Artspezies: barly stripe mosaic virus, Gattung: Idaeovirus, Artspezies: raspberry bushy dwarf virus, Gattung: Luteovirus, Artspezies: barlev yellow dwarf virus, Gattung: Marafivirus, Artspezies: maize rayado fino virus, Gattung: Potexvirus, Artspezies: potato virus X, Gattung: Sobemovirus, Artspezies: Southern bean mosaic virus, Gattung: Tenuivirus, Artspezies: rice stripe virus, Gattung: Tobamovirus, Artspezies: tobacco mosaic virus, Gattung: Tobravirus, Artspezies: tobacco rattle virus, Gattung: Trichovirus, Artspezies: apple chlorotic leaf spot virus, Gattung: Tymovirus Artspezies: turnip yellow mosaic virus, Gattung: Umbravirus, Artspezies: carrot mottle virus;

Negative ssRNS-Viren

Ordnung: Mononegavirales, Familie: Rhabdoviridae, Gattung: Cytorhabdovirus, Artspezies: lettuce necrotic yellows virus, Gattung: Nucleorhabdovirus, Artspezies: potato yellow dwarf virus;
Familie: Bunyaviridae, Gattung: Tospovirus, Artspezies: tomato spotted wilt virus;

DsRNS Viren

Familie: Partitiviridae, Gattung: Alphacryptovirus, Artspezies: white clover cryptic virus 1, Gattung: Betacryotovirus, Artspezies: white clover cryptic virus 2,

Familie: Reoviridae, Gattung: Filivirus, Artspezies: Fiji disease virus, Gattung: Phytoreovirus, Artspezies: wound tumor virus, Gattung: Oryzavirus, Artspezies: rice raaged stunt virus

Nicht zugeordnete Viren
15

Genom ssDNS: Spezies banana bunchy top virus, Spezies coconut foliar decay virus, Spezies subterranean clover stunt virus,

Genom dsDNS: Spezies cucumber vein yellowing virus,

Genom dsRNS: Spezies tobacco stunt virus,
Genom ssRNS, Spezies Garlic viruses A, B, C, D, Spezies grapevine fleck virus, Spezies maize white line mosaic virus, Spezies olive latent virus 2, Spezies ourmia melon virus, Spezies Pelarponium zonate spot virus;

Satelliten und Viroide

Satelliten: ssRNS Satelliten Viren: Untergruppe 2 Satelliten Viren, Artspezies: tobacco necrosis satellite,
Satelliten RNS, Untergruppe 2 B Typus mRNS Satelliten, Untergruppe 3 C Typus lineare RNS
Satelliten, Untergruppe 4 D Typus zirkuläre RNS Satelliten,
Viroide, Artspezies: potato spindle tuber viroide.
[0126] Insbesondere können die Methoden der vorliegenden Erfindung vorzugsweise für die Konstruktion von viralen, auf einem Replikon basierende Vektoren angewendet werden, indem die rekombinanten Genome der plus sense ssRNS-Viren, die vorzugsweise zu der Gattung Tobamovirus oder zu der Familie Bromoviridae oder Potyviridae aber auch zu den DNS-enthaltenen Viren gehören, eingesetzt werden. Im letzteren Fall sollte das fremde Gen möglichst abwärts (downstream) eines viralen Gens lokalisiert sein, so daß dessen Expression mit Hilfe der IRES-Sequenz von einer bicistronischen oder polycistronischen mRNS, die von einer DNS-abhängigen RNS-Polymerase mit Hilfe eines genomischen Promotors transkribiert wurde, vermittelt werden kann.

[0127] Ein gesonderter und bevorzugter Aspekt dieser Erfindung befaßt sich mit der Anwendung der Methoden dieser Erfindung für die Konstruktion von auf ssDNS-basierenden Vektoren. Die auf dem Geminivirus basierenden Vektoren, die das fremde Gen bzw. die fremden Gene unter der Kontrolle einer IRES-Sequenz exprimieren, können für diesen Aspekt als Beispiel dienen. Die Geminiviren repräsentieren eine Gruppe von Pflanzenviren mit einer einteiligen (monopartite) oder zweiteiligen (bipartite), zirkulären ssDNS, die gepaarte quasi icosahedrale Partikel hat (Übersichtsartikel siehe Hull und Davies, 1983, Adv. Virus Res 28,1-45; Mullineaux et al., 1992, "Genetic engineering with plant viruses", Wilson und Davies, Hrsg., 1992, CRC Press, Inc.). Die zwei ssDNS-Komponenten des zweiteiligen (bipartite) Geminivirus werden als A und B bezeichnet und kodieren für 4 bzw. 2 Proteine. Die DNS A enthält das Hüllproteingen und drei weitere Gene, die an der Replikation der DNS beteiligt sind. Im Gegensatz dazu kodiert die DNS B für zwei Proteine, die für die Ausbreitung des Virus essentiel sind. Es konnte gezeigt werden, daß die Genome von zweiteiligen (bipartite) Geminiviren zu der Gattung Begomovirus gehören. So können der tomato golden mosaic virus (TGMV) und der bean golden mosaic virus (BGMV) replizieren und sich trotz einer Deletion im Hüllproteingen innerhalb einer bestimmten Wirtspflanze ausbreiten (Gardiner et al, 1988, EMBO J. 7, 899-904; Jeffrey et al., 1996, Virology 223,208-218; Azzam et al., 1994, Virology 204, 289-296). Es ist bemerkenswert, daß einige Begomoviren einschließlich des BGMV eine Phloem-Limitierung aufweisen und auf die Zellen des vaskulären Systems beschränkt sind. Somit bleibt der BGMV Phloem limitiert, während der TGMV in der Lage ist, in das Mesophyllgewebe von systemisch infizierten Blättern einzudringen (Petty und Morra, 2000, Abstracts of 19^th Annual meeting of American Society for Virology, S. 127). Die eingereichte Erfindung schlägt vor, das fremde Gen auf zwei Wegen in ein zweigeteiltes (bipartite) Geminivirus-Genom einzufügen: (i) abwärts (downstream) von einem der Gene (z. B. im Fall des BGMV), insbesondere abwärts (downstream) des Hüllproteingens, so daß das offene Leseraster des Hüllproteins intakt oder vom 3'-Ende verkürzt wird und die IRES-Sequenz aufwärts (upstream) des fremden Gens eingefügt werden kann. Folglich kann die mRNS-Transkription von dem nativen DNS-Promotor weitergehen und es wird letztlich eine bizitronische, chimäre mRNS erzeugt, die die ersten, viralen Gene (oder einen Teil hiervon), die IRES-Sequenz und die 3'-proximalen, fremden Gene umfasst. Gleichzeitig wird die Expression des fremden Gens durch die IRES-Sequenz vermittelt. Alternativ (ii) kann die voll-Lange DNS-Kopie des RNS-Genoms des viralen Vektors in die DNS eines Hüllprotein defizienten, zweiteiligen (bipartite) Geminivirus unter die Kontrolle des Hüllproteingen-Promotors inseriert werden. Das RNS-Genom des RNS-Vektor-Viruses wird dann als Resultat der Transkription der DNS A in der Pflanzenzelle, die mit einer Mischung der rekombinanten DNS A und nicht modifizierter DNS B inokuliert wurde, erzeugt. Ein Vorteil dieser Methode liegt darin, daß der Geminivirus-Vektor nur als ein Vehikel benutzt wird, um den Vektor zu den primär inokulierten Zellen zu bringen. Alle anderen Schritte werden von dem Tobamovirus-Vektor selbst durchgeführt. Dies umfaßt die Erzeugung der IRES-tragenden Vektor-RNS, nachdem die Geminivirus-Vektor-DNS mit Hilfe einer zellulären RNS-Polymerase transkribiert wurde, ihre Replizierung, Translation, die systemische Verbreitung innerhalb der Wirtspflanze und die Fremdgenexpression.
[0128] Als eine zusätzliche Möglichkeit für die Herstellung eines ssDNS-Vektors kann die Klonierung der viralen

cDNS und des fremden Gens in einen Phagemid-Vektor mit anschließender Erzeugung der ssDNS nach Standardmethoden angegeben werden. Wenn man in Betracht zieht, daß vom Tobamovirus abgeleitete IRES-Sequenzen auch in tierischen Zellen funktional aktiv sind (unsere vorhergehende Patentanmeldung), kann die Methode der vorliegenden Erfindung für die Herstellung von rekombinanter, viraler RNS und von viralen Vektoren auf der Basis von tierischen Viren wie z. B. der Viren, die zu der Familie Togaviridae, Caliciviridae, Astroviridae, Picornaviridae, Flaviviridae gehören, benutzt werden. Auf diese Weise werden neue Vektoren erzeugt, die fremde Gene unter der Kontrolle von IRES-Sequenzen, die von Pflanzenviren abgeleitetet sind, exprimieren. Solche auf tierischen Viren basierende Vektoren für Pflanzen und Tiere können nützlich in dem Bereich der Impfstoffherstellung oder der Gentherapie sein. Es sollte jedoch darauf hingewiesen werden, daß die stabförmigen Virionen der Tobamoviren und besonders die flexiblen und langen Virionen der filamentösen Potexviren, Carlaviren, Potyviren und Closteroviren offensichtlich die besten Modelle für die Realisierung der Methoden dieser vorliegenden Erfindung darstellen.

[0129] Das nächste bevorzugte Ziel dieser Erfindung ist der Gebrauch der IRES-Sequenzen in der Art, daß die viralen, auf der Amplifikation basierenden Vektoren innerhalb des 5'-NTR die IRES-Sequenz enthalten werden. Es wird dabei angenommen, daß diese Insertion einer IRES-Sequenz nicht die virale Replikation verhindert, sondern in der Lage ist, eine effiziente, CAP-unabhängige Translation der Transkripte der genomischen Vektor-RNS sicherzustellen. Deswegen könnte das besagte Konstrukt folgendes umfassen: (i) Ein IRES-Element innerhalb oder abwärts (downstream) der 5'-untranslatierten leader-Sequenz, die nativ oder nicht nativ für diesen besagten Vektor ist und die eine CAP-unabhängige Translation der viralen 5'-proximalen Gene (RdRp-Gen) vermittelt; des weiteren (ii) wenigstens eine native oder nicht native IRES-Sequenz, die abwärts (downstream) von einem oder mehreren viralen Strukturgenen und aufwärts (upstream) des fremden Gens bzw. der fremden Gene lokalisiert ist, um deren CAP-unabhängige Translation zu vermitteln. Gemäß dieser Methode wird der spezifische Infektionsgrad des ungeschützten (uncapped) voll-Lange Vektor Transkriptes auf Grund der effizienten 5'-IRES vermittelten Translation der elterlichen RNS Moleküle in den ersten inokulierten Zellen erhöht.

[0130] Ein anderes bevorzugtes Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Methode, ein oder mehrere Protein(e) von Bedeutung in Pflanzenzellen auf der Basis der Einführung und der ungeschützten (uncapped) Expression eines fremden Gens von einer mono- oder polycistronischen mRNS Sequenz zu produzieren, die mit Hilfe einer spezifischen, pflanzlichen IRES-Sequenz, die wiederum aufwärts (upstream) der besagten Fremdgen-Sequenz lokalisiert ist, vermittelt wird. Eine besondere Eigenschaft dieser Methode liegt darin, daß die Technologie eine Prozedur beinhaltet, die die selektive Abschaltung der zellulären CAP-abhängigen mRNS-Translation mittels bestimmter chemischer Verbindungen erlaubt. Diese Prozedur beeinflusst jedoch nicht die CAP-unabhängige, IRES-vermittelte Translation von mRNSs, die künstlich in die Pflanzenzellen eingeführt wurden. Auf diese Weise wird die Kontrolle und die Verstärkung der CAP-unabhängigen Expression erreicht. Alternativ kann die Inhibierung der Translation der zellulären geschützten (capped) RNS auf Pflanzen angewendet werden, die mit dem besagten Vektor selbst infiziert wurden, der das Fremdgen bzw. die Fremdgene in einer CAP-unabhängigen Weise exprimiert. Bedingungen, die die Translation der zellulären, geschützten (capped) RNS unterdrücken, ermöglichen die selektive Expression des(r) Fremdgens(e) mit Hilfe des besagten Virus-Vektors.

[0131] Der Vektor dieser Erfindung kann ein RNS- oder DNS-Vektor sein. Er kann ss(+), ss(-) oder ds sein. Er kann irgendeine Art der Amplifikation, die von Viren bekannt sind, zeigen. Dies beinhaltet die Multiplikation der Vektor-Nukleinsäure, optional die Erzeugung des Hüllproteins und optional die Erzeugung der Proteine, die für die Ausbreitung von einer Zelle zu der anderen Zelle oder für die Ferndistanzausbreitung (long distance movement) benötigt werden. Die Gene, die für die Replikation und/oder die Umhüllung und/oder für die Ausbreitung notwendig sind, können ganz oder teilweise in entsprechend veränderten Wirtspflanzen exprimiert werden. Auf diese Weise besteht dieses System aus einem Vektor und einer Wirtspflanze, die wechselseitig angepasst werden.

[0132] Der Vektor kann mit Modifizierungen von einem Virus abgeleitet oder de novo synthetisiert werden. Er kann nur IRES-Elemente enthalten, die keine subgenomsiche Aktivität mehr aufweisen. Der Vektor kann jedoch einen oder mehrere subgenomische Promotoren mit einem oder mehreren IRES-Elementen, die effektiv keine subgenomische Promotoraktivität mehr ausfweisen, verknüpfen, so daß die Anzahl der Cistrone größer als die Anzahl der Promotoren ist. Wenn man den einfachsten Fall mit einem IRES-Element betrachtet, kann dieses besagte Element aufwärts (upstream) von dem (fremden) Gen mit Bedeutung lokalisiert sein, so daß es von dem besagten IRES-Element direkt exprimiert wird. Oder das IRES-Element wird optional abwärts (downstream) von einem (viralen) Gen lokalisiert, so daß es IRES-unabhängig exprimiert wird. Als Alternative kann das Gen von Bedeutung auch aufwärts (upstream) von einem IRES-Element lokalisiert sein und IRES-unabhängig exprimiert werden. Das IRES-Element dient dann zur Expression der viralen Gene, die abwärts (downstream) davon lokalisiert sind. Diese einfachsten Kombinationen können natürlich einfach oder mehrmals in einen komplexeren Vektor verwirklicht werden.

[0133] Der Vektor kann eine Sequenz in antisense Orientierung enthalten, um die Expression eines Wirtsgens zu unterdrücken. Diese Funktion der Suppression kann alleine oder in Kombination mit der Expression eines fremden Gens von Bedeutung existieren. Ein besonders bevorzugter Fall beinhaltet die Suppression eines Gens, das essentiell für die CAP-abhängige Translation ist. Als Beispiele können die Gene für die Translations-initiationsfaktoren wie z. B. dem eIF4-Initiationsfaktor angesehen werden, der mit der CAP-abhängigen Translation verknüpft ist. Letztendlich dient dann die Translations-maschinerie in der Wirtspflanze nur noch der Vektortranslation. In diesem Fall muss die Translation der Vektor-RNS gänzlich CAP-unabhängig sein. Natürlich kann der Vektor auch in einer Pflanzenzelle von einem Vor-Vektor in Prozessierungsschritten, wie z. B. dem Intron-Splicing, erzeugt werden.

[0134] Das IRES-Element kann aus einem Pflanzenvirus stammen. Alternativ hierzu kann es auch aus irgendeinem Virus stammen, solange es den funktionalen Bedürfnissen in der Pflanzenzelle genügt. Weiterhin kann ein IRES-Element, das in einer Pflanzenzelle wirksam ist, synthetisch oder künstlich sein. Die Synthese kann sich hierbei an die Sequenz der 18S rRNS der Wirtspflanze anlehnen, um komplementäre Teilsequenzen dieser 18S rRNS als funktionale IRES-EIemente auszunutzen. Komplementär bezieht sich in diesem Zusammenhang auf die GC-, die AU- und im weiteren Sinne auf die GU-Basenpaarung. Weiter können solche IRES-Elemente Multimere von diesen komplementären Sequenzen sein, um die Effizienz in der Bindung der Ribosomen zu erhöhen. Das Multimer kann aus identischen bzw. unterschied-

lichen, komplementären Sequenzeinheiten, die essentiell für die Funktion als IRES-Element sind, aufgebaut sein. Darüber hinaus können künstliche IRES-Elemente mit hoher Translationseffizienz und effektiv keiner subgenomischen Promotoraktivität auch mit Hilfe des Prozesses der gezielten Evolution - wie in den Patenten US 6,096,548 oder US 6,117,679 beschrieben - erzeugt werden. Dieses kann mit einer Population von Vektoren, die willkürlich ausgewählte IRES-Sequenzen enthalten, in Zellkulturen umgesetzt werden. Die Klone, die ein Reportergen exprimieren, das funktional mit einem potentiellen IRES-Element verknüpft ist, können selektiert werden. Von diesen wiederum werden diejenigen eliminiert, die eine subgenomische Promotoraktivität ausfweisen. Weitere Runden der zufälligen Anordnung und Selektion können folgen.
[0135] Das IRES-Element des Vektors dieser Erfindung kann effektiv ohne Promotoraktivität sein. Das bedeutet, daß die Expression eines Gens, das funktional mit einem IRES-Element verknüpft ist, nicht bei einer restlichen, subgenomischen Promotoraktivität auftreten würde. Diese Wirkungsweise kann mit Hilfe von Standardmethode der Molekularbiologie wie dem Northern-Blot, der Primer-Verlängerung (Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. F. Ausubel et al., 1999, John Wiley & Sons), der 5' RACE-Technologie (Gibco BRL, USA) und ähnlichen Methoden bestimmt werden. Es sollte hinzugefügt werden, daß IRES-Elemente, die detektierbare, subgenomische Promotoraktivität aufweisen aber zwingenderweise eher als translationale als als transkriptionale Elemente operieren, auch Gegenstand dieser Erfindung sind. Diese Unterscheidung könnte zum Beispiel mit Hilfe der quantitativen Messung der relativen Mengen von zwei Arten von mRNSs (der kurzen mRNS und der langen mRNS) in Northern-Analysen erreicht werden, wobei die kurze mRNS mit Hilfe von subgenomischer Promotoraktiviät und die lange mRNS ohne subgenomische Promotoraktiviät erzeugt wird. Wenn das IRES-Element tatsächlich als ein viraler, subgenomischer Promotor agiert, sollte die relative Menge der korrespondierenden kurzen RNS kleiner als 20%, vorzugsweise kleiner als 10% und am besten kleiner als 5% der Summe der kurzen und langen mRNS sein.

[0136] Somit stellen wir einen Vektor bereit, der in der Lage ist, in einer Pflanze ein Gen zu amplifizieren. Der Vektor umfaßt dabei eine Nukleinsäuresequenz, die eine Sequenz für wenigstens ein nicht-virales Gen und ein IRES-Element aufweist, das für die Translation des besagten Gens in Pflanzen notwendig ist. Die Expression dieses besagten Gens leitet sich dabei aber mehr von den translationalen als von den transkriptionalen Eigenschaften dieses besagten IRES-Elementes ab, die mit Standard Prozeduren der Molekularbiologie nachgewiesen werden können.

[0137] Die neuen Vektoren der Erfindung eröffnen neue Wege für die genetische Modifikation von Pflanzen. Als eine der ersten Möglichkeiten schlagen wir den Gebrauch dieser Vektoren für die Bestimmung der Funktion eines Strukturgens in Pflanzen vor. Dieses ist von beträchtlichem Interesse für die Genomforschung (Genomics). Deswegen ist eine Pflanze, deren Genom sequenziert wurde, von speziellem Interesse. Dies ist eine Anwendung in einem kleinem Maßstab (Pflanze für Pflanze). Der Vektor dieser Erfindung ist sehr wirkungsvoll für diese Applikation, weil er die Unterdrückung (Suppression) von Genen mit Bedeutung und/oder die Überexpression von Genen erlaubt, um die Genfunktionen, die zur Zeit im verstärkten Maße entdeckt werden, zu analysieren.
[0138] In einer Großanwendung kann der Vektor benutzt werden, um eine Eigenschaft oder ein Protein in einer Wirtspflanze zu erzeugen. Infektionen von Pflanzen mit dem Vektor können auf einer landwirtschaftlichen Fläche durchgeführt werden, auf der zuvor nicht modifizierte Pflanzen angezogen worden sind. Dieses erlaubt zum ersten Mal eine genetische Modifizierung von Feldpflanzen, wobei der Landwirt größte Freiheiten in der Selektion aus einer Vielfalt von Samen und Vektoren hat, um eine gewünschtes Protein oder Eigenschaft zu erzeugen.
[0139] Beispiele für Pflanzenspezies von Interesse für diese Anwendung sind monokotyle Pflanze wie Weizen, Mais, Reis, Gerste, Hafer, Hirse und ähnliche oder dikotyle Pflanzen wie Rapssaat, Raps, Zuckerrübe, Sojabohne, Erbse, Luzern, Baumwolle, Sonnenblume, Kartoffel, Tomate, Tabak und ähnliche.

[0140] In dem Folgenden wird die Erfindung weitergehender mit der Hilfe spezifischer Beispiele beschrieben. Molekularbiologische Standardtechniken wurden gemäß Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: a Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) durchgeführt. Alle Plasmide, die in der Erfindung benutzt werden, können gemäß den Anweisungen der Spezifikationen von einer Person mit durchschnittlicher Qualifikation mit normalen, experimentellen Hilfsmitteln hergestellt werden.

BEISPIEL 1
Konstruktion eines Tobamovirus- Vektors zur Infektion von Pflanzen aus der Familie der Kruziferen

[0141] Virione eines bekannten Tombaviruses, der Crucifer-Tombavirus (crTMV) genannt wird und der in der Lage ist, Kreuzblütler systemisch zu infizieren, wurden von Olearacia officinalis L.-Pflanzen, die Mosaik-Symptome auswiesen, isoliert. Die Resultate der Überprüfung der Wirtsspezifität sind in Tabelle 1 gezeigt.
55

Plasmid-Konstruktionen

[0142] crTMV-cDNS wurde mit Hilfe der Didesoxynukleotid-Sequenzierung charakterisiert (Dorokhov et al., 1994 FEBS Letters 350, 5-8). Infektiöse voll-Lange cDNS-Klone wurden mit Hilfe des T7 RNS-Polymerase-Promotors in einer RT-PCR-Reaktion mit crTMV-RNS als Template erzeugt. Folgende Oligonukleotide wurden dabei benutzt:

crTMVl-Kpn (upstream)

S'-acataateccccttaatacqactcactataGTTTTAGTTTTATTGCAACAACAACAA

[0143] Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Kpn I-Restriktionsstelle dar, unterstrichen und klein geschrieben sind die Nukleotide der T7-RNS-Polymerase-Promotorsequenz, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 5'-Ende der crTMV-cDNS-Sequenz abgeleitet;

crTMV2 (downstream)

5'-gcatgcggccgcTGGGCCCCTACCCGGGGTTAGGG

[0144] Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Not I-Restriktionsstelle dar, die groß geschriebene Nukleo- 5 tidsequenz ist von dem 3'-Ende der crTMV-cDNS-Sequenz abgeleitet; dieses RT-PCR-Produkt wurde in den pUC19-Vektor zwischen die Kpn I- und BamH I-Restriktionstelle kloniert (Fig. 7). [0145] Für infektiöse voll-Lange cDNS-Klone, die mit Hilfe des SP6-RNS-Polymerase-Promotors in einer RT-PCR-Reaktion mit crTMV-RNS als Template erzeugt wurden, wurden folgende Oligonukleotide benutzt:

crTMVl-SP6 (upstream)

S'-acatoofaccatttaQqtqacactataqaactcGTTTTAGTTTTATTGCAACAACAACAA

[0146] Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Kpn I-Restriktionsstelle dar, unterstrichen und klein ge- 15 schrieben sind die Nukleotide der SP6-RNS-Polymerase-Promotorsequenz, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 5'-Ende der crTMV-cDNS-Sequenz abgeleitet;

crTMV2-SP6 (downstream)

S'-gcatgcggccgcTGGGCCCCTACCCGGGGTTAGGG ²°

[0147] Kursiv und fett geschriebene Nukleotide stellen die Not I-Restriktionsstelle dar, die groß geschriebene Nukleotidsequenz ist von dem 3'-Ende der crTMV-cDNS-Sequenz abgeleitet; dieses RT-PCR-Produkt wurde in den pUC19-Vektor zwischen die Kpn I- und BamH I-Restriktionstelle kloniert (Fig. 7). 25

[0148] Die voll-Lange crTMV-cDNS-Klone wurden mit Hilfe der Didesoxynukleotid-Sequenzierung charakterisiert. Die Fähigkeit von infektiösen crTMV-Transkripten systemisch Nicotiana- und Kreuzblütler-Arten zu infizieren, konnte in Infektionsexperimenten mit Nicotiana tabacum var. Samsun bzw. Arabidopsis thaliana bestätigt werden.

Tabelle Virus-Detektion und Virus-Symptome, die nach mechanischer Infektion mit crTMV verursacht wurden

Spezies	Inokulierte Blätter	Virus**	Nicht inokulierte obere Blätter	Virus**
Nicotiana tabacum L cv. Samsun cv. Samsun NN.	Symptome*	+ +	Symptome*	+
Nicotiana clevelandii L	C L	+	M S	+
Nicotiana glutinosa L	L+N	+	M
Nicotiana sylvestris L.	L+N	+	S	+
Nicotiana benthamiana L	L+N	+	S	+
Nicotiana rustica L	L+N	+	M	+
Lycopersicum esculentum L	C	+	M	_
Solanum tuberosum L	L+N		S	_
Capiscum frutescens L	S	+	S	+
Brassica chinensis L	L+N	+	M	+
Brassica rapa L.	C	+	M	+
Brassica napus L	C	+	M	+
Brassica oleracea L	C	+	M	_
Brassica compestris L.	L	+	S	+
Brassica cauliflora L	C	+	M
Arabidopsis thaliana L	C	+	S	+
Chenopodium amaranticolor L Coste und Reyn.	L+N	+	M	+
Chenopodium quinoa L. WiIId.	L+N	+	S
Chenopodium murale L	L+N	+	S	_
Datura stramonium L	L+N	+	S	_
Plantago major L	L+N	+	S	+
Tetragonia expansa L.	L+N	+	M	_
Beta vulgaris L	L+N	+	S
Petunia hybrida L	L+N	+	S	+
Cucumis saticvus L	C	+	M	-
Phaseolus vulgaris L	L+N	-	S	-
Raphanus sativus L.	S		S	+
Sinapis alba L.	S	+	M	+
C	M

*C, Chlorosis; L, lokale Verwundung; M, Mosaik; N, Nekrose; s ohne Symptome **Virus detektiert (+) oder nicht (-) mit ELISA

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BEISPIEL 2

Konstruktion eines Tobamovius-Vektors für die Expression des GUS-Gens in Pflanzen der Gattung Nicotiana und der

Familie der Kruziferen

[0149] Eine Serie von IRES-vermittelten Expressionsvektoren T7/crTMV/GUS wurden wie folgt konstruiert. Erstens, Hind ΠΙ- und Xba I-Restriktionsstellen wurden in das CP-Gen des Sac Π/Not I-Fragment des T7/crTMV- Vektors (Fig. 7) mit Hilfe einer Polymerase Kettenreaktion (PCR) und zwei Paaren von spezifischen Primern inseriert. Zweitens IRESmp,75^CR-GUS-, IRESmp,75^UI-OUS-, IRESmp,228^CR-GUS-, IREScp,i48^CR-CiUS-, IRES_Cp,i48^UI-CiUS-, PL-GUS-cDNS, die in Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139-154) beschrieben sind, wurden in die Hind HI- und Xba I-Restriktionsstellen des Sac II/Not I-Fragmentes des T7/crTMV-Vektors inseriert, so daß eine Sac I-IRESMP75^CR-GUS-Not I-, Sac II-IRES_Mp,75^UI-GUS-Not I-, Sac n-rRES_Mp,228^CR-GUS Not I-, Sac n-IREScp,i48^CR-GUS-Not I-, Sac n-IREScp,i48^UI-GUS-Not I- bzw. Sac Π-PL-GUS-Not I-cDNS erhalten wurde.

[0150] Drittens ein Sac II-Not I-cDNS-Fragment des T7/crTMV-Vektors wurde durch ein Sac I-rRES_Mp,75^CR-GUS-Not I- oder ein Sac II-IRES_Mp,75^UI-GUS-Not I- oder ein Sac n-rRES_Mp,228^CR-CiUS-Not I- oder ein Sac n-IREScp,i48^CR-CiUS-Not I- oder ein Sac II-IREScp i48^UI-GUS-Not I- oder ein Sac II-PL-GUS-Not I-cDNS-Fragment ersetzt, um die Vektoren T7/crTMV/IRESMP75^CR-CiUS (Fig. 8), T7/crTMV/IRESMP75^UI-CiUS (Fig. 8), T7/crTMV/TRES_MP228^CR-GUS (Fig. 8), T7/crTMV/IREScp,'i48^CR-GUS (Fig. 8), T7/crTMV/TRES_Cp,'i48^UI-GUS (Fig. 8) bzw. T7/crEVTv7PL-GUS (Fig. 8) zu erhalten.

BEISPIEL 3
Expression des GUS-Gens in transfizierten Pflanzen der Gattung Nicotiana und der Familie der Kruziferen

[0151] Dieses Beispiel demonstriert die Tobamovirus IRES-vermittelte Expression des GUS-Gens in Nicotiana benthamiana- und Arabidopsis thaliana-Pflanzen, die mit den auf dem crTMV-basierenden Vektoren - Vektor T7/crTMV/ IRES_Mp75^CR-GUS, (Fig. 8), Vektor T7/crTMV/IRESMP75^UI-GUS (Fig. 8), Vektor T7/crTMV/TRES_Mp228^CR-üUS (Fig. 8), Vektor T7/crTMV/IREScp i₄₈ ^CR-GUS (Fig. 8), Vektor T7/crTMV/TRES_CP i₄₈ ^UI-GUS (Fig. 8) bzw. Vektor T7/crEVTv7PL-GUS (Fig. 8) - infiziert wurden. Die Plasmide T7/crTMV/IRESMP75^CR-GUS (Fig. 8), T7/crTMV/ IRES_MP,75^UI-CiUS (Fig. 8), T7/crTMV/rRES_MP,228^CR-CiUS (Fig. 8), T7/crTMV/IREScp,i48^CR-CiUS (Fig. 8), T7/crTMV/ IREScp,'i48^UI-CiUS (Fig. 8) bzw. T7/crTMV/PL-GUS (Fig. 8) wurden mit Not I linearisiert. Die rekombinanten Plasmide wurden gemäß Dawson et al. (1986 Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83, 1832-1836) in vitro transkribiert. Agarosegelelektrophorese der RNS-Transkripte bestätigte, daß diese intakt waren. Die RNS-Konzentration wurde mittels Agarosegelelektrophorese und Spektrophotometrie quantifiziert.

35 GUS-Detektion

[0152] Inokulierte Blätter wurden 10-14 Tage nach der Transfektion mit geschützten (capped) voll-Länge-Transkripten geerntet. IRES-Aktivität wurde mittels histochemischer Detektion der GUS-Expression wie bei Jefferson beschrieben verfolgt (1987, Plant Molecular Biology Reporter 5, 387^-05). Die Proben wurden mit dem kolorimetrischen GUS-Substrat infiltriert, wobei die Methode von De Block und Debrouwer (1992, Plant J. 2, 261-266) folgendermaßen modifiziert wurde, um die Diffusion der intermediären Produkte der Reaktion zu limitieren: 0,115 M Phosphatpuffer, pH 7,0 versetzt mit 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-glucuronide (x-Gluc) 600 pg/ml; 3 mM Kaliumhexa-cyanoferrat; 10 mM EDTA. Nach der Inkubation über Nacht bei 37°C wurden die Blätter mit 70% Ethanol entfärbt und unter dem Lichtmikroskop untersucht.

BEISPIEL 4

IRESmp,75^CR ist nicht als subgenomischer Promotor des MP-Gens funktional, sondern vermittelt die MP-Gen-Expression über die CAP-unabhängige, interne Initiation der Translation in TMV-infizierten Pflanzen

[0153] Dieses Beispiel zeigt verschiedene Ansätze, um die Möglichkeit der Verwendung des IRESMP,75^CR-Elementes in einem viralen Vektor für die CAP-unabhängige Expression eines Gens von Bedeutung zu untermauern.

CrTMV MP subgenomische RNS hat eine 125-nt lange 5'-untranslatierte Region (5'NTR) und enthält eine die Transla-

tion behindernde sekundäre Struktur (stem-loop)

[0154] Um die Länge und die Nukleotidsequenz der 5'-untranslatierten Region des TMV UI und der crTMV MP subgenomischen RNS (L;sgRNS) zu bestimmen, wurde das Protokol für die Primer-Verlängerurgsexperimente nach Letho et al. (1990, Virology 174,145-157) auf folgende Art und Weise geändert: (i) AMV reverse Transkriptase (RT); (ii) RT-Reaktion bei 45°C; (iii) die GC-reichen Primer, (iv) erhöhte dNTP-Konzentration; (v) dITP um die Ausbildung von Sekundärstrukturen zu verhindern. Es wurde gezeigt (Fig. 9), daß die 5' UTR-Sequenz der crTMV 12 sgRNS aus 125 Nukleotiden besteht. Dieses Ergebnis wurde mittels direkter 5' UTR RT-Sequenzierung bestätigt. Fig. 9B zeigt, daß die crTMV 5'NTR eine stabile hairpin-loop-Struktur enthält. Wenn man diese in einem künstlichen Transkript aufwärts (upstream) von dem MP-Gen plaziert, wird die MP-Gen-Translation in vitro inhibiert (Fig. 10). Dieses wiederum bedeutet, daß das IRESmp,75^CR-Element, das zwischen 5'HL; und dem MP-Gen lokalisiert ist, eine effiziente CAP-unabhängige, interne Inititiation der Translation vermitteln kann. Fig. 11 zeigt, daß auch in anderen Tobamoviren zu 5'HL; homologe, putative hairpin-loop-Strukturen, die die Translation inhibieren, in den 125-nt Sequenzen aufwärts (upstream) des MP-Gens ge-

funden werden konnten.

CrTMV und TMV UIMP subcienomische RNS ist nicht geschützt (non-canned)

[0155] Um die Struktur des 5'-Terminus der subgenomischen RNS zu studieren, die für das 30K Bewegungsprotein (MP) von crTMV kodiert, wurde die "Jump-Start"-Methode, die von Active Motif angeboten wird, benutzt. Jump-StartTM ist die Methode der spezifischen, chemischen Ligation einer RNS-Markierung an das 5'-Ende von geschützter (capped) RNS. Während der reversen Transkription wird die Ribooligonukleotid-Markierung einer bekannten Sequenz in das 3'-Ende der Erststrang-cDNS eingebaut. Diese erzeugt eine bekannte Priming-Stelle, die für die PCR geeignet ist.

[0156] Anfänglich werden die 5'-terminalen 2'-3'-cis-Glykol-Gruppen der geschützten (capped) RNS in reaktive di-Aldehyde mittels Natriumperjodate-Oxidation umgewandelt. 1-2 μΐ einer getesteten RNS (1 pg/ml) wurde mit 14 μΐ reinem Wasser und 1 μΐ Natriumacetat-Puffer (pH 5,5) gemischt. Dann wurden 4 μΐ einer 0,1 M Natriumperjodat-Lösung hinzugefügt und das Reaktionsgemisch für eine Stunde inkubiert. Anschließend wurde ein 3'-Aminoalkyl derivatisierte, synthetische Ribooligonukleotid-Markierung chemisch an die di-Aldehyd-Enden der oxidierten RNS mittles reduktiver Amination in Gegenwart von Natriumcyanoborhydrid ligiert. 5 μΐ Natriumhyphosphit wurde hinzugefügt und das Reaktionsgemisch für 10 Minuten inkubiert. Anschließend wurden 23 μΐ Wasser, 1 μΐ Natriumacetat-Puffer (pH 4,5) und 2 μΐ der ribo-Oligonukleotid-Markierung 5'-CTAATACGACTCaCTATAGGG (28,5 μπιοΐ/μΐ) zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt und 15 Minuten inkubiert. Dann wurden 10 μΐ Natriumcyanoborhydrid zugesetzt und 2 Stunden inkubiert. Anschließend wurden 400 μΐ einer 2% Lithiumperchlorat-Aceton-Lösung zugesetzt, 15 Minuten bei -20⁰C inkubiert und 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde mit Aceton zweimal gewaschen und in 20 μΐ Wasser aufgenommen.

[0157] Um überschüssige RNS-Markierung zu entfernen, wurde eine CTAB-Prezipitation in Gegenwart von 0,3 M NaCl durchgeführt. CTAB ist ein starkes kationisches Detergens, das an Nukleinsäuren bindet und unlösliche Komplexe bildet. Die Komplexbildung ist von der Salzkonzentration abhängig: wenn die Salzkonzentration oberhalb von 1 M liegt, wird kein Komplex gebildet; im Gegensatz dazu werden bei einer Salzkonzentration unterhalb 0,2 M alle Nukleinsäuren effizient komplexiert. Bei einer Salzkonzentration zwischen 0,3 M und 0,4 M ist die Komplexierung von kleinen Einzelstrangnukleinsäuren sehr ineffizient (Belyavsky et al., 1989 Nucleic Acids Res. 25, 2919-2932; Bertiolo et al., 1994, BioTechniques 16, 1054-1058). 10 μΐ einer 1,2 M NaCl-Lösung (bis zu einer Endkonzentration von 0,4 M) und 3 μΐ einer 10% CTAB-Lösung (bis zu einer Endkonzentration von 1%) wurden hinzugefügt, das Reaktionsgemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann für 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 10 μΐ einer 1,2 M NaCl-Lösung resuspendiert, 20 μΐ Wasser und 3 μΐ einer 10%ige CTAB-Lösung zugesetzt. Der Ansatz wurde anschließend 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und dann 5 Minuten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 30 μΐ einer 1,2 M NaCl-Lösung gelöst, 80 μΐ 96% Ethanol zugesetzt und der Ansatz über Nacht bei -20⁰C inkubiert. Dann wurde wiederum für 5 Minuten zentrifugiert und das Pellet mit 70% Ethanol gewaschen. Zuletzt wurde das Pellet der markierten RNS in 24 μΐ Wasser gelöst.

[0158] Am Ende resultierte die Transkription mit spezifischen Primern für das 3'-Gen in dem Einbau der 5'-Markierungssequenz am 3'-Terminus der Erststrang-cDNS. Für die reverse Transkription wurden 12 μΐ der markierten RNS, 1 μΐ der spezifischen Primer vom 3'-Ende, 4 μΐ des 5 X Puffers für die SuperScript™II (Gibco BRL Life Technologies, 250 mM Tris-HCl (pH 8.3), 375 mM KCl, 15 mM MgCl₂) gemischt, für 30 Sekunden bei 95°C inkubiert und auf Eis abgekühlt. Anschließend wurde zu dem Reaktionsgemisch 0,5 μΐ einer DTT-Lösung (Endkonzentration 1 mM), 2 μΐ einer 10 mM dNTP-Lösung, 0,5 μΐ RNAsin, 0,5 μΐ SuperScript™II-Enzym zugesetzt und für 15 Minuten bei 42°C inkubiert. Die Anwesenheit von MgCl₂ in dem Reaktionsansatz erlaubt dem SuperScriptll™-Enzym die CAP-Struktur während der reversen Transkription effizienter zu überwinden. Wenn 3 mM MgCl₂ und 2 mM MnCl₂ benutzt wurde, konnte in der reversen Transkription eine außergewöhnlich hohe CAP-abhängige Transferase-Aktivität nachgewiesen werden. Typischerweise fügte das Enzym vorzugsweise in der Anwesenheit von 5'-geschützter (cappecf) RNS als Template drei oder vier Cytosinreste an (Chenchik et al., 1998, Gene cloning and analysis by RT-PCR, herausgegeben von Paul Siebert und James Larrik, BioTechniques Books, Natick, MA; Schmidt und Mueller, 1999, Nucleic Acids Res 27, 331).
[0159] Für die PCR-Reaktion wurden zwei Sätze von Primern für jede getestete RNS benutzt: 3'-spezifische/5'-spezifische Primer und 3'-spezifische/Markierung- spezifische Primer (Fig. 12). Als positive Kontrolle für die Methode der spezifischen, chemischen Ligation einer Markierung mit bekannter Sequenz an die CAP-Struktur einer viralen RNS, wurde die genomische RNS des Tabak Mosaik-Viruses (TMV, Stamm Ul), von der man weiß, daß sie mit einer CAP-Struktur versehen ist (Dunigan und Zaitlin, 1990, J. Biol. Chem. 265, 7779-7786), eingesetzt. Die zugehörigen PCR-Banden wurden detektiert, wenn spezifische Primer wie Ul-Spn und der RNS-Makierung entsprechende Primer 779 in der PCR-Reaktion benutzt wurden (Tabelle 2, Fig. 13).

Tabelle 2
Template und Primer, die in der PCR benutzt wurden

Template	Forward Primer	Reverse Primer	entsprechende PCR- Bande und Erkennung der CAP-Struktur
genomische TMV (UI)-RNS		U1-Spn	+
genomische TMV (UI)-RNS	779	U1-Spn	+ (cap)
nicht-geschütztes (non-capped) RNS-Transkript von TMV		U1-Spn	+
nicht-geschütztes (non-capped) RNS-Transkript von TMV	779	U1-Spn	(non-capped)
kompletter cDNS-KIon von TMV (U1)		U1-Spn	+
genomische crTMV-RNS	K5	2PM	+
genomische crTMV-RNS	779	2PM	(?-cap?)
nicht-geschütztes (non-capped) RNS-Transkript von crTMV	K5	2PM	+
nicht-geschütztes (non-capped) RNS-Transkript von crTMV	779	2PM	(non-capped)
kompletter cDNS-KIon von crTMV	K5	2PM	+

29

subgenomische TMV (IM) RNS für MP	2211	UM50-54	+
subgenomische TMV (U 1) RNS für MP	779	UM50-54	(non-capped)
kompletter cDNS-Klon von TMV (U1)	2211	UM50-54	+
subgenomische crTMV RNS für MP	1038	CPF25	+
subgenomische crTMV RNS für MP	779	CPF25	(non-capped)
kompletter cDNS-Klon von crTMV	1038	CPF25	0

[0160] Als eine Kontrolle wurde das nichtgeschützte (non-capped) RNS-Transkript des kompletten cDNS-Klons von TMV (Ul) eingesetzt. Wie erwartet wurde keine CAP-Struktur gefunden (Tabelle 2, Fig. 13). Dann wurde die Anwesenheit einer CAP-Struktur am 5'-Ende der genomischen RNS von crTMV ausgetestet. Für diese Experiment wurden die spezifischen PCR-Primer K5, 2PM und der Primer 779, der der RNS-Makierung entspricht, verwendet (Tabelle 2, Fig. 13). Interessanterweise war die Mobilität der PCR-Bande, die mit den Primern 779 und 2PM beobachtet wurde, größer als erwartet (Fig. 13). Dieses könnte die Anwesenheit einer starken, Sekundärstruktur am 5'-Ende der genomischen RNS von crTMV (Dorokhov et al, 1994, FEBS Letters 350, 5-8) reflektieren. Diese Sekundär struktur fehlt an den 5'-terminalen Teilen von verwandten TMVs (Goelet et al, 1982, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79, 5818-5822). In Kontrolexperimenten mit nicht geschützten (non-capped) Transkripten des kompletten cDNS-Klons von crTMV wurde wie erwartet keine entsprechende PCR-Bande beobachtet.

[0161] Für subgenomische RNS, die für das TMV (Ul) MP-Gen kodiert, wurde angenommen, das sie keine CAP-Struktur am 5'-Ende aufweist. Wir testeten die entsprechende sgRNS mit den spezifischen Primern 2211, UM50-54 und Primer 779, der der RNS-Markierung entspricht. Es wurde keine CAP-Struktur gefunden Tabelle 2, Fig. 13).
[0162] Die gleichen Resultate wurden mit der entsprechenden subgenomischen RNS von crTMV (Tabelle 2, Fig. 13) erhalten. Dies zeigt, daß auch im Fall dieser subgenomischen RNS des Tobamovirus keine CAP-Struktur am 5'-Ende vorhanden ist.

Insertion des rRES_Mp,75^CR-Elementes in einen auf dem TMV Ul basierenden Vektor der defizient für die MP-Genexpression ist, KK6 liefert eine effiziente CAP-unabhängige MP-Genexpression

[0163] Der KK6-Vektor (Lehto et al, 1990, Virology 174, 145-157) enthält zwei subgenomische Promortoren (sgPr) für das CP-Gen. Der erste CP-sgPr-1 liegt aufwärts (upstream) des CP-Gen an einer passenden Stelle, während der zweite CP-sgPr-2 aufwärts (upstream) des MP-Gens angeordnet ist. Es konnte gezeigt werden, daß das MP-Gen mit Hilfe des CP-sgPr-2 anstelle des nativen MP-sgPr exprimiert wurde. Resultierend aus dieser Insertion verlor der KK6-Vektor seine Fähigkeit sich effizient von einer Zelle zur anderen zu bewegen. Analysen zeigten, daß die 12 sgRNS kein IRES_Mp,75^CR-Element in der 5'-untranslatierten Region enthielt. Es wurde deswegen angenommen, daß von der I₂ sgRNS des KK6-Vektors das MP-Gen ohne IRESMP,75^CR-Element nicht effizient exprimiert werden kann. Um diese Annahme zu überprüfen, wurde das rRES_Mp,75^CR-Element zwischen den CP sgPr-2 und dem MP-Gen in den KK6- Vektor inseriert, so daß ein KK6-IRESmp75-Vektor erzeugt wurde, der in der Nachkommenschaft stabil propagiert werden konnte (Fig. 14). Es konnte gezeigt werden, daß der KK6-IRES_Mp,75-Vektor für die Synthese einer 12 sgRNS verantwortlich ist, die das crTMV-rRES_Mp75-Element enthält (Fig. 15). Es'konnte ebenfalls gezeigt werden, daß der Transkriptionsstart der 12 sgRNS aus dem KK6-IRESmp,75-Vektor im Vergleich zum KK6- Vektor ohne rRES_Mp,75^CR-Element nicht verändert ist. Dieses bedeutet, daß das rRES_Mp,75^CR-Element nicht als sgPr für das MP-Gen dient.

[0164] Diese Insertion verbesserte drastisch die Verbreitung des Virus von Zelle zu Zelle. Der KK6-Vektor infizierte Nicotiana tabacum L. cv Samsun-Pflanzen systemisch. Die Pflanzen zeigten allerdings im Vergleich zum Wildtyp-TMV (TMV 304), bei dem ungefähr nach sieben Tagen die ersten Symptome sichtbar waren, erst nach 15 bis 17 Tagen erste Infektionssymptome. Die Symptome in den oberen Blättern der mit dem KK6- Vektor infizierten Pflanzen waren deutlich als gelbe Flecken sichtbar, während der Wildtyp-TMV Mosaik-Symptome erzeugte.

[0165] Die KK6-Virus Nachkommenschaft erzeugte zahlreiche Verletzungen in N. glutinosa, die sich langsamer entwickelten als die Verletzungen des Wildtyp-TMV UI. Die durchschnittliche Größe der lokalen Verwundungen, die durch den KK6-Virus verursacht wurden, war 0,1 mm. Im Vergleich dazu erreichten die lokalen Verwundungen des Wildtyp-TMV UI eine Größe von 1,1 mm. Pflanzen, die mit dem KK6-IRESmp,75- Vektor inokuliert wurden, sahen wie Pflanzen

aus, die mit dem KK6-Vektor infiziert wurden. Sie unterschieden sich aber dahingehend, daß (i) sich die ersten systemischen Symptome schneller entwickelten (ungefähr nach 10 Tagen) und (ii) sie wesentlich heller in Bezug auf die gelben Flecken und das Mosaik waren. Im Gegensatz zu dem KK6-Vektor war die durchschnittliche Größe der lokalen Verwundungen, die durch K86 in N. glutinosa erzeugt wurden, auf 0,6-0,7 mm erhöht. Die Überprüfung des zeitlichen Verlaufs der MP-Akkumulation zeigte, daß das KK6-IRESMP75-MP früher als das KK6-MP in den inokulierten Blättern detektiert werden konnte (Fig. 16). Dieses Resultat erlaubte den Schluss, daß die Insertion des IRESMP,75^CR-Elementes aufwärts (upstream) des KK6-MP-Gens teilweise die Ausbreitungseigenschaften des KK6- Virus, der in dem Transport von Zelle zu Zelle und in dem Langdistanztransport Defekte zeigte, wiederherstellt. Um weitere Beweise für die essentielle Rolle der IRES-Elemente in der CAP-unabhängigen MP-Gen Expression in den TMV cDNS-Vektoren und in dem Lebenszyklus von Tobamoviren zu erhalten, wurden Serien von zusätzlichen auf dem KK6- Vektor basierende Vektoren konstruiert (Fig. 14). Der KK6-IRESMP125-Vektor enthält eine natürliche Hairpin-Loop-Struktur, die in der Lage ist, die Translation des MP-Gens in vitro in der Gegenwart der 5' untranslatierten Region der I2 sgRNS von WTcrTMV zu inhibieren. Desweiteren enthält der IRES-MP75-KK6-H-PL-Vektor eine natürliche Hairpin-Loop-Struktur und eine 72-nt lange, künstliche Polylinkersequenz. KK6-PL enthält nur die Poly linker-Region. Die Resultate der Infektionsexperimente mit Nicotiana tabacum cv. Samsun (systemischer Wirt) sind in Tabelle 3 gezeigt.

[0166] Fig. 17 zeigt die Resultate der Western-Analysen in bezug auf die CP-Akkumulation in den Tabak-Blättern, die mit den KK6-basierenden Vektoren infiziert wurden. Ersatz des IRESmp,75^CR-Elementes durch eine nicht funktionale PL-Sequenz blockierte drastisch die Vektor-Multiplikation.

Tabelle 3
Virus-Akkumulation in Tabak, der systemisch mit KK6-basierenden Vektoren infiziert wurde

cDNS-Kopien	Virus-Akkumulation
TMV 304 (WT)	+++
KK6	+
KK6- IRES_MP,₇₅	++
KK6- IRESmp,125	++
KK6-H-PL	+/-
KK6-PL	+/-

BEISPIEL 5

Die Herstellung eines künstlichen, nicht natürlichen IRES-Elementes ohne subcienomische Promotor-Aktivität erzeugt in eukarvotischen Zellen die CAP-unabhängige Exoression von Genen mit Bedeutung

[0167] Das Ziel dieses Beispiels ist es, die Ansätze für die Herstellung von künstlichen, nicht natürlichen IRES-EIementen, die keine subgenomische Promotor-Aktivität aufweisen und die in eukaryotischen Zellen die CAP-unabhängige Expression von Genen mit Bedeutung ermöglichen, zu zeigen.

Konstruktion eines künstlichen, nicht natürlichen IRES-Elementes auf der Basis des 18-nt Segmentes aus dem

IRESMP,75^CR-Element

[0168] Die Analyse des IRESMP,75^CR-Nukleotidsequenz zeigt, daß dieses Element eine multimere Struktur hat und vier Nukleotidsequenz-Segmente mit einer Variation des Elementes (- 72)GUUUGCUUUUUG(-61) enthält, die komplementär zu der 18S rRNS aus Arabidopsis thaliana ist (Fig. 18).

[0169] Um ein künstliches, nicht natürliches IRES-Element zu gestalten, wurde die 18-nt Sequenz CGUUUG-CUUUUUGUAGUA ausgewählt. Vier Oligonukleotide wurden synthetisiert:

5'-GCG CAA GCT TTG CTTITT GTA GTA CGT TTG CTT TTT GTA GTA CTG CAG GCG GG-3'

MPl(-):

5'-CCC GCC TGC AGT ACT ACA AAA AGC AAA CGT ACT ACA AAA AGC AAA GCT TGC GCG -3'

MP2(+):

5'-GGC GGC TGC AGT TTG CTTITT GTA GTA CGT TTG CTTITT GTA GTA GAA TTC GGG C -3'

40 45

31

MP2(-):

5'-GCC CGA ATT CTA CTA CAA AAA GCA AAC GTA CTA CAA AAA GCA AAC TGC AGC CGC C-3'

[0170] Primer MPl (+) und MPl (-) wurden mit einander hybridisiert, so daß das dsDNS-Fragment A enstand:

CGCGCAAGCTTTGCI I I I IGTAGTACGTTTGCI I I I IGTAGTACTGCAGGCGGG

gcgcgttcgaaacgaaaaacatcatgcaaacgaaaaacatcatgacgtccgccc

Hind 111 Pst I

[0171] Primer MP2(+) und MP2(-) wurden mit einander hybridisiert, so daß das dsDNS-Fragment B enstand:

GGCGGCTGCAGTTTGCI I I I IGTAGTACGTTTGCI I I I IGTAGTAGAATTCGGGC
is CCGCCGACGTCAAACGAAAAACATCATGCAAACGAAAAACATCATCTTAAGCCCG
Hind III EcoR I

[0172] Beide Fragmente wurden mit Pst I verdaut und miteinander ligiert. Dann wurde das Ligationprodukt A + B mittels Agarosegelelektrophorese extrahiert und mit Hind ΠΙ und EcoR I verdaut. Anschließend wurde dieses Fragment in den hGFP-GUS Vektor, der bei Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139-154) beschrieben ist, mit Hilfe der Hind HI- und EcoR I-Klonierungstellen subkloniert (Fig. 19).

Resultate

[0173] Die Transkripte, die in Fig. 19 dargestellt sind, wurden in dem Lysat von Kaninchen Reticulozyten (RRL) wie bei Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139-154) beschrieben translatiert. Die Syntheseprodukte wurden mittels Gelelektrophorese analysiert. Die Resultate, die in Fig. 19 dargestellt sind, zeigen, daß eine künstliche, nicht natürliche Sequenz, die auf dem 18-nt Segment des IRESmp,75^CR-Elementes basiert, die Expression des 3-proximal lokalisierten GUS-Gens vermittelt. Dies bedeutet, daß zwei Eigenschaften zum einen die zu der 18S rRNS komplementäre Sequenz und zum anderen die multimere Struktur notwendig für die IRESMP,75^CR-Funktion ist. Ein Tetramer von 18-nt Segmenten erreicht nicht das Aktivitätsniveau des IRESMP,75^CR-Elementes. Es gibt aber einen Weg die Aktivität des künstlichen, nicht natürlichen IRES-Elementes zu verbessern, indem man das 12-nt Segment GCUUGCUUUGAG, das komplementär zu der 18S rRNS ist, verwendet.

Konstruktion eines künstlichen, nicht natürlichen IRES-Elementes auf der Basis des 12-nt Segmentes aus dem

IRES_Mp,75^CR-Element

[0174] Analysen der Strukturelemente, die notwendig für die IREScp,i48^CR-Element-Aktivität (Fig. 20-23) sind, zeigen, daß ein Polypurin (PP)-Segment entscheidend für die IREScp,i48^CR-Funktion ist. Als ein markantes Element dieses PP-Segmentes wurde eine direkte Wiederholung einer 9-nt-Sequenz in der 19-nt Sequenz gefunden: AAAAGAAG-GAAAAAGAAGG (direct repeat (DR)).

[0175] Diese Sequenz wurde für die Konstruktion eines künstlichen IRES-Elementes benutzt. Um ein Tetramer der DR-Sequenz zu erhalten, wurden folgende Primer benutzt:
CP1(+):

5'-CGC GCA AGC TTA AAA GAA GGA AAA AGA AGG AAA AGA AGG AAA AAG AAG GCT GCA GGC GGG

CPl(-):

5'-CCC GCC TGC AGC CTT CTTITT CCT TCTITT CCT TCT TTT TCC TTCITT TAA GCT TGC GCG -3'
CP2(+):

5'-GGC GGC TGC AGA AAA GAA GGA AAA AGA AGG AAA AGA AGG AAA AAG AAG GAA TTC GGG C-3' CP2(-):

5'-GCC CGA ATT CCT TCTITT TCC TTC TTT TCC TTCITT TTC CTT CTT TTC TGC AGC CGC C -3'

[0176] Gemäß der zuvor beschriebenen Methode wurde folgendes IRES-Element als intercistronischer Spacer verwendet:

5'-CGCGCAAGCUUAAAAGAAGGAAAAAGAAGGAAAAGAAGGAAAAAGAAGGCUg
CAGGGGGGAAGGAAAAAGAAGGAAAAGAAGGAAAAAGAAGGAAAUUCAUG-S'

Resultate

[0177] Die Transkripte, die in Fig. 19 dargestellt sind, wurden in dem Lysat von Kaninchen Reticulozyten (RRL) wie bei Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139-154) beschrieben translatiert. Die Syntheseprodukte wurden mittels Gelelektrophorese analysiert. Die Resultate, die in Fig. 19 dargestellt sind, zeigen, daß eine künstliche, nicht natürliche Sequenz, die auf den sich wiederholenden 19-nt Segmenten des rREScp,i48^CR-Elementes basiert, die Expression des 3'-proximal lokalisierten GUS-Gens vermittelt.

Beispiel 6

Konstruktion eines TMV cDNS-Transkriptionsvektors, der das Replikasegen in infizierten Zellen CAP-unabhängig ex-

primiert

[0178] Das Hauptziel dieses Beispiels war die Erzeugung von zwei neuen auf dem TMV Ul-basierende Viren mit einer modifizierten 5'UTR, die die CAP-unabhängige Expression des Replikasegens erlaubt:

1) Omega-Leader des TMV wurde komplett durch das IRES_Mp,75^CR-Element ersetzt:

guucguuucguuuuuguaguauaauuaaauauuugucagauaagagauugguuaga gauuuguucuuuguuugaccaugg.

2) Weil man davon ausgeht, daß die ersten 8 Nukleotide der TMV 5'UTR notwendig für die Virusreplikation sind (Watanabe et al, 1996, J. Gen. Virol. 77, 2353-2357), wurde das rRES_Mp,75^CR-Element in die TMV 5'UTR inseriert, wobei die ersten 8 Nukleotide intakt gelassen wurden:

GUAUUUUUGUAGUAUAAUUAAAUAUUUGUCAGAUAAGAGAUUGGUUAGAGAUUUGU UCUUUGUUUGACCAUGG.

[0179] Die folgenden Primer wurden verwendet:

a) SP6-IRES-1 (in dem Fall der ersten Variante)

Xba I SP6-Promotor IRES_Mp,7s^CR-Element

GGGTCTAGATTTAGGTGACACTATAGTTCGTTTCG I I I I IGTAGTA

b) SP6-IRES-2 (in dem Fall der zweiten Variante)

Xba I SP6-Promotor IRES_Mp,₇₅ ^c -Element

GGGTCTAGATTTAGGTGACACTATAGTAI I I I rGTAGTATAATTAAATATTTGTC

c) IRES-Nco I (reverse Primer, um IRES mit einer Nco I-Restriktionstelle am 3'-Ende zu erhalten) GGGCCATGGTCAAACAAAGAACAAATCTCTAAAC

d) nTMV-Nco I (direkter Primer zur Gewinnung der TMV-PoIymerase; Start: NCOI-Schnittstelle):

Nco I
GGGCCATGGCATACACACAGACAGCTAC

e) TMV-Xho (reverser Primer zur Gewinnung des 5'-Bereiches der Replikase; vom AUG-Codon bis zur Sph I-Schnittstelle)

Xho I

ATGTCTCGAGCGTCCAGGTTGGGC

[0180] Klonierungsstrategie: Das PCR-Fragment A wurde durch die Verwendung der Primer SP6-IRES1 und IRES-Ncol auf dem Vektor crTMV als Template hergestellt. Das PCR-Fragment B wurde durch die Verwendung der Oligonukleotide TMV-NcoI und TMV-XhoI sowie dem Klon TMV-304L erzeugt. Die Fragmente A und B wurden (unter Ver-Wendung von Xba I und Xho I-Schnittstellen) gleichzeitig in den Vektor pBlueskript SK+ kloniert. Die Ligation der Fragmente erfolgte durch eine Nco I-Schnittstelle. Derselbe Ansatz wurde angewandt, um die zweite Variante des Virus durch die Verwendung des Oligonukleotids SP6-IRES2 zu erhalten.

[0181] Im nächsten Schritt wurde die gesamte TMV cDNS in den erhaltenen Vektor kloniert. Sph I und Kpn I-Schnittstellen wurden dazu verwendet, das virale Genom wiederherzustellen (Fig. 24).

Beispiel 7

Erzeugung der auf Actin-2-Transkriptionspromotoren basierenden, tobamoviralen Vektoren Act2/cRTMV und

Act2/crTMV IRES_Mp,75^CR-GUS

[0182] Das wichtigste Ziel dieses Beispiels ist es, die Klonierungsstrategie eines neuen crTMV-basierenden Vektors, mit dem virale Genexpression in Pflanzenzellen unter der Kontrolle eines effizienten Actin 2 Promoters auftritt, zu demonstrieren. Die Verwendung des Vektors Act2/crTMV/rRES_Mp,75^CR-GUS zur Genexpression in Pflanzen wird damit möglich.

Die Klonierung von Act2 in pUC19

[0183] Der Act2 Transkriptionspromotor (ca. 1000 bp) wurde aus dem Plasmid pACRS029 durch Restriktion mit den Enzymen Kpn I und Pst I geschnitten.
5

Herstellung einer Pst I-Schnittstelle im Plasmid T7/crTMV (Fig. 7) aufwärts (unstream) des Beginns des crTMV-Ge-

noms

[0184] Ein 334-Nukleotid großes Fragment des 5'-endständigen Teils des crTMV-Genoms wurde durch PCR hergestellt. Dabei wurden der in direkter Orientierung vorliegende Primer ATGCTGCAGGTTTTAGTTTTATTGCAACAA-CAA (Pst I-Schnittstelle ist unterstrichen) und der in reverser Orientierung vorliegende Primer ATGCGATCGAA GCCACCGGCCAAGGAG TGCA (Pvu I-Schnittstelle ist unterstrichen) verwendet. Das Fragment wurde mit Pvu I und Pst I geschnitten und in pUC 19Act2 zusammen mit dem Teil des crTMV Genoms eingefügt (Pvu I-Spe I-Fragment).

Klonierung des restlichen Teils des Genoms mit dem vorherigen Konstrukt

[0185] Das Act2 beinhaltende Konstrukt wurde in das Plasmid T7crTMV nach Restriktion mit Kpnl/Spel kloniert.

Fusion des 5'-Endes von crTMV an den Transkriptionsstart von Act2 ohne zusätzliche Seguenzen

[0186] Dieser Schritt wurde mittels ortsgerichteter (site-directed) Mutagenese ausgeführt. Dabei wurden Oligonucleotid-Primer verwendet, die spezifisch für Act2 und crTMV sind. Mit ihnen konnte das endgültige Konstrukt Act2/crTMV (Fig. 25) hergestellt werden. Um den Vektor Act2/crTMV/TRES_Mp,75^CR-GUS zu erhalten (Fig. 26), wurde das Spe I-Not I cDNS-Fragment des Plasmids Act2/crTMV (Fig. 25) durch das Spe I-Not I DNS-Fragment aus T7crTMV/TRES_Mp,75^CR-GUS ersetzt (Fig. 8). Dieses beinhaltet das GUS-Gen unter der Kontrolle von IRESmp,75^CR·

Beispiel 8
Herstellung eines zirkulären Einzelstrang-tobamoviralen Vektors KS/Act2/crTMV/TRESMP,75^CR-GUS (Fig. 27)

[0187] Das wichtigste Ziel dieses Beispiels ist es, die Möglichkeit aufzuzeigen, unter Verwendung von DNS-Vektoren, die aus ringförmiger Einzelstrang DNS bestehen, Fremdgene in Pflanzen zu exprimieren.

[0188] Um das Konstrukt KS/crTMV/TRES_Mp,75^CR-GUS (Fig. 27) herzustellen, wurde ein 9,2 kb großes Kpn I-Not I cDNS-Fragment des Vektors Act2/crTMV/TRES_Mp,75^CR-GUS in das Plasmid pBluescipt Π KS+ (Stratagene) inseriert. Der Zielvektor wurde mit Kpn I-Sal I gespalten und beinhaltet den Replikationsstartpunkt (origin) des Phagen fl. Einzelstrang-DNS des Vektors KS/Act2/crTMV/IRESMP,75^CR-GUS wurde nach Sambrook et al, 1989 (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edn. Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York) hergestellt.

Beispiel 9

Herstellung eines tobamoviralen Vektors KS/Act2/crTMV-Int/TRESMP,75^CR-GUS, der ein Oleosin-Intron von ArabidoD-

sis thaliana beinhaltet.

[0189] Das wichtigste Ziel dieses Beispiels ist die Herstellung des Vektors KS/Act2/crTMV/TRES_Mp,75^CR-GUS, der das Oleosingen-Intron aus Arabidopsis thaliana besitzt. Dieses Intron soll nach dem Trankriptionsprozess entfernt werden (Fig. 28).
[0190] Die Klonierung setzt sich aus folgenden Schlitten zusammen:

1. Klonierung des A. thaliana Oleosingen-Introns

[0191] Das Intron des Oleosin-Gens aus A. thaliana wurde mittels PCR amplifiziert. Hierzu wurden folgende spezifische Primer verwendet: A.th./Int (direct) ATGCTGCAGgttttagttCAGTAAGCACACATTTATCATC (Die Pst I-Schnittstelle ist unterstrichen, kleine Buchstaben markieren die crTMV 5'-endständige Sequenz). Beim zweiten verwendeten Primer handelt es sich um A.tMnt (reverse): ATGAGGCCTG GTGCTCTCCCGTTGCGTACCTA (Stu I-Schnittstelle ist unterstrichen).

2. Insertion des A. thaliana Oleosin-Introns in das 334-Nukleotid große 5'-terminale Fragment der crTMV cDNS

[0192] cDNS, die das Intron des Oleosin-Gens von A. thaliana besitzt, wurde mit Pst I/S tu I restringiert und mit einem PCR-Fragment ligiert, das über PCR-Amplifikation durch die Verwendung folgender Primer gewonnen wurde: Primer 1:

atgAGGCCTTTATTG CAACAACAACAACAAATTA (Die Stu I-Schnittstelle ist unterstrichen). Primer 2:

ATGCGATCGAAGCCACC GGCCAAGGAGTGCA (Die Pvu I-Schnittstelle ist unterstrichen). Die Primer entsprechen den Positionen 10-334 des crTMV Genoms.

[0193] Die nächsten Schritte sind im Beispiel 7 beschrieben.
65

Beispiel 10

Einfluß von Rapamycin als Inhibitor der CAP-unabhängigen Initiation der Translation auf die GUS-Genexpression in Tabak-Protoplasten, die mit 358/CPZIRESmPJs'"¹¹ beinhaltenden bicistronischen Transkriptionsvektoren 35S/CP/

IRES_Mp,75^CR/GUS (Fig. 29) und'35SZGUSZrRES_Mp,75^CRZCP (Fig. 30) transfiziert wurden

[0194] Mit diesem Beispiel soll demonstriert werden, daß es grundsätzlich möglich ist, Inhibitoren der CAP-abhängigen Translation einzusetzten um die Effizienz der IRES-vermittelten, CAPunabhängigen Translation eines Gens von Interesse zu erhöhen.

[0195] Als Inhibitor der CAP-abhängigen Initiation der Translation wurde Rapamycin ausgewählt. Kürzlich wurde ein neuartiger Repressor der CAP-vermittelten Translation, der als 4E-BP1 (eIF-4E-bindendes Protein) oder PHAS-I bezeichnet wurde, charakterisiert (Lin et al, 1994, Science 226, 653-656; Pause et al., Nature 371, 762-767). 4E-BP1 ist ein Hitze- und Säurestabiles Protein, dessen Aktivität durch Phosphorylierung reguliert wird (Lin et al. 1994 Science 226, 653-656; Pause et al., Nature 371, 762-767). Die Wechselwirkung von 4EBP1 mit eIF-4E führt zu einer spezifischen Inhibierung von CAP-abhängiger Translation, sowohl in vitro als auch in vivo; Pause et al, Nature 371, 762-767). Es wurde gezeigt, daß Rapamycin die Dephosphorylierung und damit die Aktivierung von 4E-BP1 (Beretta et al. 1996, EMBO J. 15, 658-664) induziert.

[0196] Die Herstellung eines Vektors 35S/CP/TRES_Mp,75^CR/GUS (Fig. 29) bzw. 35S/GUS/TRES_Mp,75^CR/CP (Fig. 30), die IRES- und GUS-Sequenzen beinhalten und eine Methode zur Transfektion von Protoplasten mit einer 35S-basierenden cDNS wurden von Skulachev et al. (1999, Virology 263, 139-154) beschrieben. Der Vergleich der Expression der GUS-Gene in Tabak-Protoplasten, die mit Rapamycin behandelt wurden und mit bicistronischer cDNS transfiziert wurden, die ein GUS-Gen in 3'- und 5'-proximalen Positionen besitzen, verdeutlicht, daß es möglich ist, die IRES-vermittelte, CAP-unabhängige Translation zu erhöhen.

Beispiel 11

Einfluß des Poty virus VPg als ein Inhibitor der CAP-abhängigen Initiation der Translation bei GUS-Genen in Tabak-Protoplasten, die mit 35SZCPZIRESmPJs⁰¹¹ beinhaltenden bicistronischen Transkriptionsvektoren 35SZCPZTRESmp,75^CRZGUS (Fig. 29) und 35SZCP-VPgZrRES_Mp,75^CRZGUS transfiziert wurden

[0197] Dieses Beispiel verdeutlicht die grundsätzliche Möglichkeit der Verwendung eines Genproduktes zur Inhibierung der CAP-abhängigen Translation (Fig. 31). Kürzlich wurde über die Wechselwirkung zwischen dem viralen Protein, das an das Genom des Rübenmosaikvirus und dem eukaryotischen Translationsinitiationsfaktor eIF(iso)4E von Arabidopsis thaliana gekoppelt ist, berichtet (Wittman et al., 1997, Virology 234, 84-92). Die Interaktions-Domäne von VPg wurde in einen Bereich von 35 Aminosäuren kartiert. Der Austausch von Asparaginsäureresten in dieser Region verhinderte den Prozeß vollständig. Das CAP-Analogon In⁷GTP, jedoch nicht GTP, inhibiert die Bildung des Komplexes aus VPg und eIF(iso)4E. Dies deutet darauf hin, daß VPg und die zellulären mRNSs um die Bindungen an eIF(iso)4E konkurrieren (Leonard et al., 2000, J. Virology 74, 7730-7737). Die Fähigkeit von VPg, an eIF(iso)4E zu binden, kann zur Inhibition der CAP-abhängigen Translation verwendet werden. Wir schlagen vor, den Vektor 35SZCP-VPgZ IRESmp,75^CRZGUS (Fig. 31) zu verwenden. In diesem Vektor ist das Hüllprotein mit VPg des Potyvirus Kartoffevirus A fusioniert. Der Vergleich der Expression des GUS-Gens in Protoplasten, die mit 35SZCP-VPgZIRES-MP,75^CRZGUS oder 35SZCPZTRESmp,75^CRZGUS transfiziert wurden erlaubt die Erhöhung der IRES-vermittelten und CAP-unabhängigen Expression des GUS-Gens.

Beispiel 12

Genetische in vivo-Selektion einer IRES Seguenz oder eines subgenomischen Promoters unter Verwendung des TMV-

Vektors

[0198] In diesem Beispiel wird die Möglichkeit aufgezeigt, genetische in vivo-Selektionen oder die systematische Entwicklung von Liganten durch exponentiell Anreicherung (SELEX, Systematic Evolution of Ligants by Exponential enrichment) eines subgenomischen Promoters oder einer IRES-Sequenz, die CAP-unabhängige Expression eines Gens von Interesse in einem Vektor gewährleistet, durchzuführen. In diesem Ansatz wird eine side-by-side-Selektion einer großen Anzahl von zufälligen Sequenzen ebenso wie die Erzeugung von Sequenzen angewandt (Ellington und Szostak, 1990, Nature 346, 818-822; Tuerk and Gold, 1990, Science 249, 505-510; Carpenter und Simon, 1998, Nucleic Acids Res. 26, 2426-2432).
[0199] Das Projekt schließt ein:

1. In vitro-Synthese von crTMV-basierenden defective-interfering (DI) Trans-kripten, die folgende Elemente beinhalten (5'-3'-Richtung): (i) Ein T7 Transkriptionspromoter, (ii) ein 5'-endständiger Teil des crTMV-Genoms mit einer Sequenz, die für die Synthese des komplementären (minus-)Strang des viralen Genoms verantwortlich ist, (iii) eine Sequenz die für einen N-endständigen Teil der viralen Replikase kodiert, (iv) eine Sequenz, die 75 zufällige Basen beinhaltete, (v) ein Gen für die Neomycinphosphotransferase Π (NPTTl), (vi) ein crTMV Startpunkt des viralen Zusammenbaus (origin of assembly, Oa), und (vii) ein 3'-endständiger Teil des crTMV-Genoms mit einer Promotersequenz für den Minus-Strang (Fig. 32).

2. Kotransfektion von Tabak-Protoplasten mit einem Transkript und genomischer RNS von crTMV (Fig. 7). Die Protoplasten wachsen und regenerieren auf einem Kanamycinhaltigen Medium.

3. Selektion und Isolierung einer IRES-Sequenz oder eines subgenomischen Promotors, die es den Protoplasten er-

möglicht zu überleben und in Anwesenheit von Kanamycin zu regenerieren.

ANHANG B
5

VERFAHREN UND VEKTOREN ZUR ERZEUGUNG VON TRANSGENEN PFLANZEN

GEBIET DER ERFINDUNG

[0200] Die vorgelegte Erfindung bezieht sich auf Verfahren und Vektoren zur Erzeugung transgener Pflanzen und Pflanzenzellen, die dadurch erhalten werden.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

[0201] Die Erzeugung von bestimmten, stabil vererbten Expressionsmustern, die in transgenen Linien gewünscht werden, sind immer noch ein Hauptproblem der Pflanzenbiotechnologie. Der normale Ansatz geht dahin, ein Transgen als Teil einer völlig unabhängigen Transkriptionseinheit in einen Vektor einzuführen, wobei das Transgen unter der Kontrolle von pflanzenspezifischen Promotor- und Terminationssequenzen gestellt wird, die entweder heterolog oder homolog sein können (US 05,591,605; US 05,977,441; WO 0053762 A2; US 05,352,605). Viele verschiedene Wirtsfaktoren beeinflussen jedoch nach der Integration der exogenen DNS in die genomische Pflanzen-DNS die Genexpression ausgehend von solchen transkriptionellen Vektoren, weil die Insertion zufällig ist. Diese Faktoren machen die Expression des Transgens instabil, unvorhersehbar und führt oft in der Nachkommenschaft zu der Stilllegung (Silencing) des Transgens (Matzke & Matzke, 2000, Plant Mol. BioL, 43, 401^15; Gelvin, 1998, Gurr. Opin. Biotechnol., 9, 227-232; Vaucheret et al, 1998, Plant J., 16, 651-659). Es sind gut dokumentierte Beispiele für die Stilllegung (Silencing) von Transgenen in Pflanzen bekannt, welche die Prozesse des transkriptionellen (TGS) und des posttranskriptionellen (PTGS) Gen-Silencing einschließen. Neue Ergebnisse zeigen eine enge Verbindung zwischen der Methylierung und der Chromatinstruktur im TGS und die Beteiligung von einer RNS-abhängigen RNS-Polymerase und einer Nuklease im PTGS (Meyer, 2000, Plant Mol. BioL, 43, 221-234; Ding, 2000, Gurr. Opin. Biotechnol., 11, 152-156; Iyer et al. Plant Mol. BioL, 2000, 43, 323-346). So konnte im Fall des TGS gezeigt werden, dass der Promotor des Transgens bei vielen Integrationsstellen mit Ghromatinstrukturen oftmals einer Methylierung unterliegt, die eine stabile Expression eines Transgens nicht begünstigt. Aus diesen Resultaten ergibt sich die Notwendigkeit, dass mit den existierenden Methoden praktisch immer mehrere, unabhängige, transgene Pflanzen hergestellt und in mehreren Generationen analysiert werden müssen, um diejenigen zu finden, die das gewünschte Expressionsmuster zeigen. Überdies hinaus können sogar diejenigen Pflanzen, die ein stabiles Expressionsmuster des Trangens durch Generationen hindurch aufweisen, danach immer noch unter natürlich auftretenden Bedingungen wie Stress oder Pathogenbefall einer Stilllegung (Silencing) des Transgen unterliegen. Existierende Ansätze haben eine verbesserte Expressionskontrolle zum Ziel. Dazu kann der Gebrauch von Scaffold attachment-Regionen, die die Transkriptionseinheit flankieren, gezählt werden (Allen, 1996, Plant Gell, 8, 899-913; Gapham, 1995, J. Exp. Bot., 46, 655-662; Allen, 1993, Plant Gell, 5, 603-613). Diese können möglicherweise die Unabhängigkeit und die Stabilität der Expression eines Transgens erhöhen, indem die Abhängigkeit von den verschiedenen Varianten der sogenannten "Positionseffekte" reduziert wird (Matzke & Matzke, 1998, Gurr Opin. Plant BioL, 1, 142-148; Gelvin, 1998, Gurr. Opin. Biotechnol., 9, 227-232; WO 9844 139 Al; WO 0000676757 Al; EP 1 005 560 Al; AU 00,018,331 Al). Sie stellen jedoch nur teilweise eine Lösung für das bestehende Problem dar, Pflanzen mit einem gewünschten Expressionsmuster eines Transgens zu erzeugen.
[0202] Das Gen-Silencing kann als ein pflanzlicher Verteidigungsmechanismus bei Virusinfektionen ausgelöst werden (Ratcliff et al., 1997, Science, 276, 1558-1560; Al-Klaff et al., 1998, Science, 279, 2113-2115). Dieses Silencing ist in nicht transgenen Pflanzen gegen das Pathogen gerichtet, während es in transgenen Pflanzen auch das Transgen stilllegen kann. Dies tritt besonders verstärkt auf, wenn das Transgen Sequenzhomologien mit dem Pathogen aufweist. Hieraus ergibt sich ein besonderes Problem, wenn viele, verschiedene Elemente viralen Ursprungs für die Konstruktion von transkriptionellen Vektoren verwendet werden. Ein anschauliches Beispiel hierfür stellt die kürzlich erschienende Publikation von Al-Kaff und Mitarbeiter dar, in der gezeigt wird, dass GaMV (Gauliflower Mosaic Virus)-Infektionen einer transgenen Pflanze die Expression des BAR-Gens stilliegt, die mit Hilfe des vom GaMV abstammenden 35S-Promotors vermittelt wird (Al-Kaff et al., 2000, Nature Biotech., 18, 995-999).

[0203] In den letzten Jahren erhöhte sich signifikant die Reihe der cis-regulatorischen Elemente, die zur Zeit die Instrumente für eine differenziertere, räumliche und zeitliche Kontrolle der Expression eines Transgens darstellen. Dies umfasst mehrere transkriptionelle Elemente wie verschiedene Promotoren und Transkriptionsterminatoren sowie translationeile, regulatorische Elemente der Genexpression. Im Allgemeinen können die Translation verstärkende Elemente (Enhancers) als cis-agierende Elemente definiert werden, die zusammen mit zellulären transagierenden Faktoren die Translation der mRNS vermitteln. Die Translation in eukaryotischen Zellen wird generell durch das Absuchen der mRNS mittels der Ribosomen vom geschützten (capped) 5'-Ende der mRNS initiiert. Die Initiierung der Translation kann jedoch auch durch Mechanismen eingeleitet werden, die unabhängig von der GAP-Struktur sind. In diesem Fall werden die Ribosomen mit Hilfe einer internen, ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) zu dem ersten Godon des Translationstartes geleitet. Diese Elemente, die man zunächst in Picornaviren entdeckte, wurden dann auch in anderen viralen und zellulären eukaryotischen mRNSs identifiziert (Jackson & Kaminski, 1995, RNA, 1, 985-1000). IRES-Elemente sind cis-agierende Elemente, die zusammen mit anderen zellulären transagierenden Faktoren, den Aufbau des ribosomalen Komplexes am internen Startcodon der mRNS vermitteln. Diese hervorstechende Eigenschaft wurde in der Konstruktion von Vektoren ausgenutzt, die eine Expression von zwei oder mehreren Proteinen mittels einer polycistronischen Transkriptionseinheit in tierischen Zellen oder Insektenzellen erlauben. Gegenwärtig sind IRES-Elemente in bicistronischen Expressionsvektoren für tierische Systeme weit verbreitet, wobei das erste Gen GAP-abhängig und das zweite Gen unter der Kontrolle

des IRES-Elementes translatiert wird (Mountford & Smith, 1995, Trends Genet., 4, 179-184; Martines-Salas, 1999, Curr. Opin. Biotech., 19, 458^-64). Gewöhnlich variiert die Expression eines Gens, das unter der Kontrolle eines IRES-Elementes steht, signifikant und bewegt sich in einem Bereich von 6-100% im Vergleich zu der CAP-abhängigen Expression des ersten Gens (Mizuguchi et al., 2000, Mol. Then, I, 376-382). Diese Ergebnisse haben wichtige Implikationen in bezug auf den Gebrauch von IRES-Elementen. So muss zum Beispiel entschieden werden, welches Gen als erstes in einem bicistronischen Vektor verwendet werden soll. Die Anwesenheit eines IRES-Elementes in einem Expressionsvektor verleiht eine selektive Translation nicht nur unter normalen Bedingungen, sondern auch unter Bedingungen, bei denen die CAP-abhängige Translation inhibiert ist. Dieses geschieht normaler Weise unter Stressbedingungen wie Virusinfektionen, Hitzeschock, Wachstumsarretierung oder Ähnlichem, weil notwendige transagierende Faktoren nicht anwesend sind (Johannes & Sarnow, 1998, RNA, 4, 1500-1513; Sonenberg & Gingras, 1998, Curr. Opin. Cell BioL, 10, 268-275).

[0204] Die auf der Translation basierenden Vektoren zogen kürzlich die Aufmerksamkeit der Wissenschaftler auf sich, die mit tierischen Zellsystemen arbeiten. Ein Artikel beschreibt den Gebrauch einer IRES-Cre Rekombinase-Kassette, mit der eine gewebespezifische Expression der Cre Rekombinase in Mäusen erreicht wurde (Michael et al., 1999, Mech. Dev., 85, 35^-7). In dieser Arbeit wurde eine neue IRES-Cre Kassette in die Exon-Sequenz des EPHA2-Gens eingeführt. Das EPHA2-Gen kodiert dabei für den EPH-Rezeptor einer Protein-Tyrosinkinase, die in der frühen Entwicklungsphase exprimiert wird. Diese Arbeit ist von speziellem Interesse, weil es die erste Demonstration eines translationellen Vektors für die Gewebe spezifische Expression eines Transgens in tierischen Zellen ist, die sich auf die transkriptioneile Kontrolle der Wirts-DNS stützt. Eine andere wichtige Anwendung der IRES-Elemente ist ihr Gebrauch in Vektoren für die Insertionsmutagenese. In diesen Vektoren ist der Reporter oder der selektierbare Marker unter der Kontrolle eines IRES-Elementes und kann nur exprimiert werden, wenn er innerhalb einer transkribierten Region eines transkriptionell aktiven Gens inseriert ist (Zambrowich et al, 1998, Nature, 392, 608-611; Araki et al., 1999, Cell Mol. BioL, 45, 737-750). Trotz des Fortschrittes, der in der Anwendung von IRES-Elementen im tierischen System gemacht wurde, sind jedoch IRES-Elemente aus diesem System in Pflanzenzellen nicht funktionell. Darüber hinaus wurden ähnliche Ansätze mit Pflanzenzellen nicht in Betracht gezogen, weil die Sequenz gerichtete oder homologe Rekombination in Pflanzenzellen extrem selten auftreten und von keinem praktischen Nutzen sind.

[0205] Es stehen wesentlich weniger Daten von pflanzenspezifischen IRES-Elementen zur Verfügung. Unlängst jedoch wurden mehrere IRES-Elemente in dem Tobamovirus crTMV entdeckt, die auch in Pflanzen aktiv sind (Ivanov et al, 1997, Virology, 232, 32^3; Skulachev et al, 1999, Virology, 263,139-154; WO 98/54342). crTMV ist ein TMV Virus, der Kreuzblütler infiziert. Daneben gibt es Hinweise, dass IRES-Elemente auch in anderen Pflanzenviren eine Translationskontrolle ausüben (Hefferon et al, 1997, J. Gen. ViroL, 78, 3051-3059; Niepel & Gallie, 1999, J. ViroL, 73, 9080-9088). Die IRES-Technologie hat ein großes Potential im Bereich der Erzeugung von transgenen Pflanzen und pflanzlichen, viralen Vektoren, die eine geeignete Alternative zu bestehenden Vektoren darstellen. Bis heute liegt die einzige Anwendung von pflanzlichen IRES-Elementen darin, ein Gen von Bedeutung mit Hilfe von IRES-Sequenzen in einem bicitronischen Konstrukt zu exprimieren, das stabil, nuklear transformiert wurde (WO 98/54342). Dieses besagte Konstrukt umfasst dabei in 5'-3' Richtung, einen Transkriptionspromotor, das erste Gen, das mit dem besagten Transkriptionspromoter verbunden ist, ein IRES-Element, das am 3'-Ende des ersten Gens lokalisiert ist und das zweite Gen, das am 3'-Ende des IRES-Elementes lokalisiert ist, d. h. es enthält noch den ganzen Satz der Transkriptionskontrollelemente. [0206] Überraschenderweise haben wir gefunden, dass translationeile Vektoren, die ohne ihre eigenen Transkriptionskontrollelemente auskommen und ganz von der Insertion in eine transkriptionell aktive, genomische DNS abhängen, die Gewinnung von zahlreichen Transformanden erlauben, die das Zielgen exprimieren. Noch erstaunlicher war es, dass wir solche Transformanden sogar in Wirtspflanzen mit einem sehr geringen Anteil von transkriptionell aktiver DNS in ihrem Genom wie z. B. in Weizen sehr leicht detektieren konnten. Diese Entdeckung ist die Basis für das vorgeschlagene Verfahren, der die Expression eines Transgens erlaubt, die vollkommen von der Transkriptionsmaschinerie der Wirtszelle kontrolliert wird. Somit wird die Anzahl der genetisch heterologen DNS-Elemente minimiert, die dafür bekannt sind das Gen-Silencing auszulösen. Dadurch wird ebenfalls ein neuer Weg der Transgenkontrolle möglich, indem das Verhältnis von CAP-abhängiger gegen CAP-unabhängiger Translation moduliert wird.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

[0207] Fig. 33 zeigt die Expression des Transgens von vier Translationsvektoren aus einer Vielzahl von möglichen Varianten.

A - der Vektor enthält ein Translation verstärkendes Element (Enhancer) und einen Translationsstop;
B - der Vektor enthält ein IRES-Element als Translation verstärker und eine Region, die die Transkription terminiert;
C - identisch zu B, zusätzlich ist dem IRES-Element ein Translations-Stop-Codon in allen drei Leserastern vorangestellt; D - identisch zu C, außer, dass der Vektor von Intron/Exon Begrenzungsregionen (3Ί-5Έ und 3'-5'I) flankiert wird, um die Eigenschaften eines Exons einzuführen und um den Einbau in die prozessierte mRNS zu erleichtern.
[0208] Fig. 34 zeigt den Vektor pIC1301 mit dem IRES_Mp,75^CR-Element, dem BAR-Gen und dem 35S-Terminator.
[0209] Fig. 35 zeigt den Vektor pIC1521 mit der "Haarnadelstruktur", dem rRES_Mp,i48^CR-Element, dem BAR-Gen und dem 35S-Terminator. Die "Haarnadelstruktur" dient dabei als Alternative zu einem Translations-Stop-Codon, um die Bildung eines translationellen Fusionsproduktes zu verhindern.

[0210] Fig. 36 zeigt den Vektor pIC1451 mit dem BAR-Gen und dem 35S-Terminator ohne Promotor.
[0211] Fig. 37 zeigt den Vecktor pIC052 mit IoxP, HPT und NOS-Terminator.

[0212] Fig. 38 zeigt den Vektor pIC06-IRES mit dem rRES_Mp,75^CR-Element und dem AHAS-Gen, wobei das AHAS-Gen die mutierte Version des Arabidopsis Acetohydroxysäure-Synthase Gens ist, das eine Resistenz gegenüber Imidazol-Herbiziden verleiht.

[0213] Fig. 39 zeigt den Vektor pIC-DOG und pIC-CRE mit der Sequenz der 2-Deoxyglucose-6-phosphat (2-DOG-6-P) Phosphatase aus Hefe bzw. der Cre Rekombinase unter der Kontrolle des Reis Actin-Promotors.

[0214] Fig. 40. zeigt den translationellen Vektor pIC-dSpm mit einem integrierten Transposonelement und den Vektor pIC1491 mit der Transposase. pHBT ist ein chimärer Promotor, der eine Fusion des 35S-enhancer mit dem basalen Teil des C4PPDK-Gens aus Weizen darstellt.

DETAILIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

[0215] Ein primäres Ziel dieser Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen Verfahrens oder Vektors, um transgene Pflanzen für die stabile Expression von transgenem Material, das in dem Pflanzengenom integriert wurde, zu erzeugen. [0216] Dieses Ziel wird durch ein Verfahren zur Erzeugung transgener Pflanzen oder Pflanzenzellen erreicht, die eine transgene codierende Zielsequenz unter transkriptioneller Kontrolle eines Kernpromotors eines Wirtes exprimieren können, durch Einführen eines Vektors in das Kerngenom, wobei der Vektor in seinem Transkript eine Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen in einer zur Initiation der Translation funktionellen Form aufweist sowie, stromabwärts davon, die transgene codierende Sequenz, und anschließende Selektion von Pflanzenzellen oder Pflanzen, die die transgene codierende Sequenz exprimieren. Das Zielgen steht unter der Kontrolle eines Translationssignals wie dem IRES-Element und ist nicht operativ mit einem Promotor verbunden. Diese Translationssignale sind dabei nicht auf die IRES-Sequenzen limitiert. Solche Vektoren hängen von der Insertion des Transgens in transkriptionell aktive DNS-Abschnitte des Wirtsgenoms ab.

[0217] Ferner wird ein neuer Vektor für die Transformation von Pflanzenzellen zur Verfügung gestellt, wobei der Vektor, wahlweise nach Prozessierung in der Wirtszelle, in seinem Transkript eine Sequenz zum Binden an pflanzliche cytoplasmatische Ribosomen in einer zur Initiation der Translation funktionellen Form umfasst sowie, stromabwärts davon, eine codierende Sequenz, wobei der Vektor frei von einem für die Transkription der codierenden Sequenz funktionsfähigen Promotor ist.

[0218] Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Unteransprüchen definiert.
[0219] Die Konstruktion von Vektoren für die stabile Transformation von Pflanzen wurde von zahlreichen Autoren beschrieben (für Übersichtsartikel siehe Hansen & Wright, 1999, Trends in Plant Science, 4, 226-231; Gelvin, 1998, Curr. Opin. Biotech 9, 227-232). Das Basisprinzip all dieser Konstrukte ist identisch - eine völlig funktionelle Transkriptionseinheit, die in 5'-3' Richtung einen pflanzenspezifischen Promotor, den strukturellen Teil des Gens von Bedeutung und einen transkriptioneilen Terminator umfasst, muss in die Pflanzenzelle eingeführt und stabil in das Genom integriert werden, damit die Expression des Gens von Bedeutung erzielt wird.

[0220] Wir haben eine andere Technologie zur Erzeugung von stabilen, nuklearen Pflanzentransformanden entwickelt. Unsere Erfindung stützt sich dabei auf den überraschenden Befund, dass die Transkriptionsmaschinerie der Wirtspflanze in der Lage ist, die Bildung der mRNS eines Transgens von Bedeutung in einer transformierten Pflanzenzelle zu bewirken. Das vorgeschlagene Verfahren nutzt Vektoren, die ein Gen von Bedeutung besitzen, das in diesen besagten Vektoren nicht operativ mit einem Promotor verbunden ist. Eigentlich bestehen sie nur aus der kodierenden Region eines Zielgens, das unter der Kontrolle eines Translationselementes steht. Dieses translationelle Element kann eine Sequenz zur Bindung eines cytoplasmatischen Ribosoms aus Pflanzen sein, wodurch die Translation einer kodierenden Sequenz erreicht wird. Die kodierende Sequenz liegt dabei unterhalb dieses Elementes und die Bindung an diese Sequenz sollte bevorzugt nach der Transkription stattfinden. Bevorzugterweise ist dieses translationelle Element eine Ribosomeneingangssstelle, die funktionell in Pflanzen ist. Noch bevorzugter sollte es ein pflanzenspezifisches IRES-Element, wenigstens aber ein IRES-Element aus einem Pflanzenvirus oder einer Pflanze sein, wobei es auch nicht pflanzlichen Ursprungs oder ein künstlich konstruiertes IRES-Element sein kann.

[0221] Diese Vektor-DNS erzeugt nach der Integration in eine transkribierte Region eines residenten Gens eine chimäre mRNS, die anschließend in das Protein von Bedeutung translatiert wird. Dabei wird die Translation von der besagten Sequenz für die Bindung eines pflanzlichen, cytoplasmatischen Ribosoms initiiert (Fig. 33). Nach unserem besten Wissen gibt es keine anderen Ansätze auf diese Weise stabile, nukleare Pflanzentransformanden zu erzeugen.

[0222] Da der Anteil von transkriptionell aktiver DNS in Pflanzengenomen gering ist, war es sehr überraschend, dass die Transformationsexperimente mit den in dieser vorliegenden Erfindung beschriebenen, translationellen Vektoren zahlreiche Transformanden hervorbrachten, die das Gen von Bedeutung exprimierten.
[0223] Unsere Erfindung bezieht sich auf die bevorstehenden Probleme der zuverlässigen Expression eines Transgens.

Die Expression eines Transgens, das mit Hilfe unseres erfundenen Verfahrens in das Wirtsgenom integriert wird, hängt von der Transkriptionamaschinerie, die alle oder fast alle transkriptionellen, regulatorischen Elemente der residenten Wirtsgene einschließt, ab. Auf diese Weise wird die Stilllegung eines Transgens (Gen-Silencing), das gewöhnlich von xenogenetischen DNS-Elementen ausgelöst wird, minimiert.
[0224] Die Vektoren, die für die Integration eines Transgens verwendet werden, können auf verschiedenste Art und Weise konstruiert werden. Die einfachste Version besteht nur aus der Kodierungssequenz des Zielgens oder eines Teils desselben und einem Translationssignal (Grundversion des translationellen Vektors). In einem bevorzugten Vektor ist ein Translations-Stop-Signal stromaufwärts der Zielsequenz des pflanzlichen, cytoplasmatischen Ribosoms vorhanden. Das Stop-Signal kann zum Beispiel wenigstens ein Stop-Codon und/oder eine sekundäre Haarnadelstruktur in der RNS oder etwas Ähnliches sein. Dieses Stop-Signal verursacht den Abbruch der Translation der oberhalb gelegenen Sequenzen.

Fortgeschrittene Versionen der Vektoren können ein pflanzenspezifisches IRES-Element enthalten, dem die kodierende Sequenz des Zielgens folgt. Oder sie können Sequenzen für die ortspezifische Rekombination enthalten, die entweder den Austausch eines existierenden Transgens oder die Integration irgendeines zusätzlichen Zielgens in die transkribierte Region der Wirts-DNS erlauben (für Übersichtsartikel siehe Corman & Bullock, 2000, Curr Opin. BiotechnoL, 11, 455^4-60). Ortspezifische Rekombinasen/Integrassen aus Bakteriophagen und Hefen werden häufig gebraucht, um DNS in vitro oder in Pflanzen zu manipulieren. Beispiele für Rekombinase spezifische Rekombinationsstellen, die für diese Erfindung eingesetzt werden können, sind im Folgenden aufgelistet: CRE Rekombinase-LoxP Rekombinationsstellen, FLP Rekombinase-FRT Rekombinationsstellen, R Rekombinase-RS Rekombinationsstellen, pHiC31 Integrase-attp/attB Rekombinationsstellen etc.

[0225] Die Einbringen von Splicing-S teilen in den translationellen Vektor kann dazu verwendet werden, die Wahrscheinlichkeit der Inkorporation eines Transgens in das prozessierte Transkript zu erhöhen.

[0226] Der Vektor kann ferner eine Sequenz, die für ein Targeting Signalpeptid kodiert und zwischen der besagten Sequenz zur Bindung eines pflanzlichen, cytoplasmatischen Ribosoms und besagter kodierenden Sequenz lokalisiert ist, enthalten. Ein bevorzugtes Beispiel für dieses Signalpeptid kann ein Piastiden Transitpeptid, ein Transitpeptid für Mitochondrien, ein nukleares Targeting-Signalpeptid, ein vakuoläres Targeting-Peptid und Sekretions-Signalpeptid sein.
[0227] Verschiedene Methoden können verwendet werden, um den translationellen Vektor in die Pflanzenzelle zu bringen. Dies schließt die direkte Einführung des Vektors in eine Pflanzenzelle mittels Mikroprojektilbeschuss, Elektroporation oder PEG-vermittelter Behandlung von Protoplasten ein. Agrobakterium vermittelte Pflanzentransformation ist auch einen effizienter Weg, um den translationellen Vektor einzubringen. Die T-DNS Insertionsmutagnese in Arabidopsis und Nicotiana mit dem promotorlosen Reportergen ΑΡΗ(3')Π, das in der Nähe der rechten T-DNS-border lokalisiert war, zeigte, dass wenigstens 30% aller Insertionen eine transkriptionelle und translationeile Genfusion induzierten (Koncz et al, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei 86, 8467-8471).

[0228] Ein translationeller Vektor kann ebenfalls in ein transponierbares Element kloniert werden, um passende, transkribierte Regionen zu finden und um entweder konstitutive oder gewebe-/organspezifische Expressionmuster für das Transgen zu erzielen. Transponierbare Elemente werden intensiv in Pflanzen genutzt, um Gene auf Grund ihrer Inaktivierung zu isolieren (Pereira & Aarts, 1998, Methods Mol Biol. 82, 329-338; Long & Coupland, Methods Mol. BioL, 82, 315-328; Martin, 1998, Curr. Opin. BiotechnoL, 9, 220-226). Verschiedene Versionen der Transposon-Markierungssysteme wurden entwickelt. In der einfachsten Version, werden Transposons für die Insertionsmutagenese ohne irgendeine Modifikation, außer der Einführung von Deletionen oder Frame shift-Mutationen, um nicht autonome transponierbare Elemente zu generieren, genutzt. In weiter entwickelten Versionen sind zusätzliche Gene wie zum Beispiel re-Insertionsmarker, Reportergene oder Plasmid-rescue-Vektoren in das transponierbare Element integriert (Carroll et al., 1995, Genetics, 13, 407^20; Tissier et al, 1999, The Plant Cell, 11, 1841-1852). Daneben gibt es auch sogenannte Enhancer-trap und Gene-trap-Systeme (Sundaresan et al, 1995, Genes Dev., 9, 1797-1810; Fedorov & Smith, 1993, Plant L, 3 273-289). Die transponierbaren Elemente dieser Systeme sind entweder mit einem Reportergen ohne Promotor oder einem Reportergen unter der Kontrolle eines Minimalpromotors ausgestattet. In dem ersten Fall kann das Reportergen nach der Insertion in eine transkribierte Region der Wirts-DNS exprimiert werden. Dabei muss die Insertion unmittelbar nach einem Wirtspromotor oder in eine kodierende Region des Wirtsgens stattfinden, so dass eine Fusionstranskript entsprechend des Leserasters des Wirtsgens erzeugt wird.

[0229] Die Wahrscheinlichkeit für eine erfolgreiche Fusion "im Leseraster" kann signifikant durch die Einführung von Splicing donor und acceptor sites für alle drei Leseraster vor dem Reportergen erhöht werden (Nussaume et al, 1995, Mol. Gen. Genet., 249, 91-101). In dem zweiten Fall wird die Transkription des Reportergens ausgehend von dem minimalen Promotor aktiviert, wobei das Konstrukt in der Nähe eines aktiven Wirtspromotors inseriert ist (Klimyuk et al., 1995, Mol. Gen. Genet., 249, 357-365). Der Erfolg von solchen Ansätzen für das Transposon-Tagging zeigt die Möglichkeiten der ähnlichen Ansätze für die translationalen Vektoren, die ein IRES-Element vor dem Zielgens inseriert haben.

[0230] Alle Ansätze, die zuvor beschrieben wurden, zielen auf das Design eines Systems ab, ein Transgen unter der Expressionskontrolle eines residenten Gens zu stellen, in welches die Insertion stattgefunden hat. Dieses kann für spezifische Aufgaben oder in bestimmten Fällen von Vorteil sein. In vielen, anderen Fällen wird vielleicht ein verändertes Expressionsmuster des Transgens bevorzugt. In solchen Anwendungen kann der translationelle Vektor mit transkriptionell aktiven Elementen ausgestattet werden. Dazu gehören zum Beispiel Enhancer-Elemente, die das Expressionsmuster des Transgens modulieren. Es ist bekannt, dass Enhancer-Sequenzen die Stärke von Promotoren, die mehrere tausend Basenpaare entfernt sind, beeinflussen können (Müller, 2000, Current Biology, 10, 241-244). Die Durchführbarkeit solcher Ansätze wurde in Activation tagging-Experimenten in Arabidopsis und in den oben beschriebenen Enhancer-trap Transposon Tagging-Experimenten demonstriert. In den Activation tagging-Experimenten veränderte ein 35S-enhancer-Element in der T-DNS das Expressionsmuster von residenten Genen (Weigel et al., 2000, Plant PhysioL, 122, 1003-1013). In den Enhancer-trap Transposon Tagging-Experimenten bestimmten die Enhancer Elemente der residenten Gene die Expressionsmuster der Reportergene. Dieser Ansatz kann zum Beispiel in den Anfangsstadien einer Pflanzentransformation oder wenn das Expressionsmuster des Transgens nach der Transformation verändert werden soll, sehr nützlich sein. Die Enhancer-Sequenzen können sehr leicht mit Hilfe von Sequenz spezifischen Rekombinationssystemen in Abhängigkeit der Bedürfnisse der Anwendung verändert (inseriert, deletiert oder entfernt) werden.

[0231] Unsere Vorgehensweise war es, einen Satz von Konstrukten mit IRES-Elementen zu erzeugen, die in Pflanzenzellen funktionell sind. Diese Konstrukte enthielten IRES-Elemente, denen ein Selektionsmarker für Pflanzen und ein Transkription/Translation-Terminationssignal folgte. Gleichzeitig konnten diese Konstrukte direkt für Pflanzenzelltransformationen, nachdem sie vom 5'-Ende vor der IRES-Sequenz linearisiert wurden, eingesetzt werden. Oder sie konnten in eine T-DNS für den Agrobacterium vermittelten DNS-Transfer kloniert werden. Ein anderer Satz von Konstrukten, die als Kontrollen dienten, enthielten entweder ein Selektionsmarkergen ohne Promotor (negative Kontrolle) oder ein selektierbares Gen unter der Kontrolle eines konstitutiven Promotors, der funktionell in monokotylen und/oder dikotylen Zellen ist (positive Kontrolle). Die DNS wurde mit Hilfe verschiedener Technologien in Pflanzenzellen transformiert. Dazu gehörten Ti-Plasmidvektoren aus Agrobakterien (US 5,591,616; US 4,940,838; US 5,464,763), Projektil- oder Mikroprojektilbeschuss (US 05100792; EP 00444882 Bl; EP 00434616 Bl). Im Prinzip können auch andere Pflanzentransformationsmethoden wie Mikroinjektion (WO 09209696; WO 09400583 Al; EP 175966 Bl), Elektroporation (EP 00564595 Bl; EP 00290395 Bl; WO 08706614 Al) verwendet werden, wobei weitere Transformationsmethoden nicht auf diese beschränkt sind.

[0232] Die Transformationsmethode hängt von der Pflanzenspezies ab, die transformiert werden soll. Unsere Beispiele enthalten Daten bezüglich der Transformations-effizienzen für repräsentative Pflanzenarten der Monokotylidonen (z. B. Triticum monocoecum) und Dikotylidonen (z. B. Brassica napus, Orichophragmus violaceous). Auf diese Weise wird die Durchführbarkeit unseres Ansatzes für Pflanzenspezies verschiedensten phylogenetischen Ursprungs und mit unter-

schiedlicher Dichte der transkribierten Regionen in dem Speziesgenom demonstriert.

[0233] Die transgene Kodierungssequenz in dem Vektor kann nur ein Teil eines Zielgens repräsentieren. In diesem Fall wird das Gen mit Hilfe der Sequenz gerichteten oder homologen Rekombination in der funktionellen Länge wieder hergestellt. Die Translation der Zielsequenz ist bevorzugt CAP-unabhängig. Der Wirt kann in der Art modifiziert werden, dass die CAP-abhängige Translation inhibiert (oder verstärkt) oder die CAP-unabhängige Translation verstärkt (oder inhibiert) wird. Dies kann zum einen durch Behandlung von exogenen Agenzien oder durch die Einführung einer Sequenz in den Vektor oder der Pflanze erreicht werden, dessen Expression den gewünschten Effekt hat.

BEISPIELE

BEISPIEL 1
Konstruktion von Vektoren, die IRES-Elemente enthalten

[0234] IRES-vermittelte Expressionsvektoren wurden mit Hilfe von Standardmethoden der Molekularbiologie konstruiert (Maniatis et al., 1982, Molecular cloning: a Laboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory, New York). Der Vektor pIC1301 (Fig. 34) wurde durch Verdau des Plasmids pIC503 (p35S-GFP-rRES_Mp,75^CR-BAR-35S Terminator in pUC120) mit Hind HI und darauffolgender Religation des großen, gelelektrophoretisch gereinigten Fragments hergestellt. Die IRESMP,75^CR-Sequenz stellt die 3'-terminalen 75 Basen der nicht translatierten 5'-Leader-Sequenz der subgenomischen RNS des Movement-Proteins (MP) aus dem Kruziferen infizierenden Tobamovirus (CRTMV) dar.

[0235] Der Vektor pIC1521 (Fig. 35) wurde in den drei folgenden Klonierungsschritten hergestellt. Im ersten Schritt wurde das Plasmid pIC1311 (nicht dargestellt) durch Ligation des großen Hindlll-Pstl-Fragmentes aus dem Plasmid pIC031 mit dem kleinen Hindll-Ncol Fragment aus dem Plasmid pIC032 und dem kleinen BspHI-Pstl-Fragment aus dem Plasmid pIC018 konstruiert. Das resultierende Plasmid, welche das unter dem 35S-Promotor stehende BAR-Gen enthält, wurde als vergleichende Kontrolle in den Transformationsexperimenten eingesetzt. Das Plasmid pIC1311 wurde mit Hindin-Nrul verdaut und die Restriktionsenden mit dem Klenow-Fragment der DNS-Polymerase I aufgefüllt. Anschließend wurde das große Restriktionsfragment gelelektrophoretisch aufgereinigt und religiert, wodurch das Plasmid pIC1451 geschaffen wurde (BAR-35S Terminator ohne Promotor; Fig. 36). Durch Ligation des großen Sacl-Pstl Fragmentes aus dem Plasmid pIC1451 mit dem kleinen Sacl-Ncol Fragment aus dem Plasmid pIC033 und dem kleinen BspHI-Pstl Fragment aus dem Plasmid pIC018 wurde das Plasmid pIC1521 (Fig. 35) hergestellt. Dieses Konstrukt enthält eine "Haarnadel-Struktur" vor dem IREScp,i48^CR-Element (CP steht hierbei für das Hüllprotein, Coat protein). Die "Haarnadelstruktur" kommt durch das Vorhandensein einer invertierten Tandem-Wiederholung, die mit Hilfe des Kpnl-EcoRI bzw. des Call-Kpnl Fragmentes der Polylinkersequenz aus dem Blueskript II SK+-Plasmid gebildet wird, zustande.

[0236] Sämtliche Vektoren wurden für die Transformationsexperimente linearisiert, indem sie entweder mit dem Restriktionsenzym Sacl (pIC1521; pIC1451) oder Hindin (pIC1311; pIC1301) geschnitten wurden. Nicht verdaute Vektor-Plasmid-DNS wurde mittels Gelelektrophorese entfernt.

BEISPIEL 2

PEG-vermittelete Protoplasten-Transformation von Brassica napus Isolierung der Protoplasten

[0237] Die Isolierung von Brassica Protoplasten basierte auf bereits vorhandenen Protokollen (Glimelius, 1984, Physiol. Plant., 61, 38^4; Sundberg & Glimelius, 1986, Plant Science, 43,155- 162 und Sundberg et al, 1987, Theor. Appl.

Genet., 75, 96-104). Sterilisierte Samen (siehe Appendix) wurden in 90 mm Petrischalen ausplatiert, die ¹A MS-Medium mit 0.3% Gelrite enthielten. Die Samen wurden in Reihen mit geringen Abständen voneinander auf dem Medium platziert. Die Petrischalen wurden verschlossen und in einem Winkel von 45° geneigt sechs Tage im Dunkeln bei 28°C aufbewahrt. Die Hypokotylen wurden mit einer scharfen Rasierklinge in 1-3 mm lange Stücke geschnitten. Dabei wurden die Klingen immer wieder erneuert, um eine Mazerisierung des Materials zu vermeiden. Die geschnittenen Stücke wurden in TVL-Lösung gegeben (siehe Appendix), um die Zellen zu plasmolysieren. Anschließend wurde das Material 1-3 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Diese Vorbehandlung verbesserte signifikant die Ausbeute an intakten Protoplasten. Die Plasmolyse-Lösung wurde durch 8-10 ml der Enzym-Lösung ersetzt (siehe Appendix). Die Enzym-Lösung sollte dabei das gesamte Material bedecken, aber nicht in einem Überschuss eingesetzt werden. Das Material wurde dann bei 20-25⁰C im Dunkeln für wenigstens 15 Stunden auf einem Rundschüttler mit leichter Schüttelbewegung inkubiert.

Die Mischung aus Protoplasten und zellulärer Debris wurde anschließend durch einen Filter mit einer Maschenweite von 70 mm filtriert. Die Petrischalen wurden mit 5-10 ml W5-Lösung (siehe Appendix) gespült (Menczel et al, 1981, Theor. Appl. Genet., 59, 191-195). Anschließend wurde diese Waschlösung ebenfalls filtriert und mit der Protoplastensuspension vereinigt. Die Protoplastensuspension wurde in ein steriles 40 ml Falcon-Röhrchen überführt und bei 120 g für 7 min zentrifugiert, um die Protoplasten zu pelletieren. Der Überstand wurde verworfen und das Protoplastenpellet in 0.5 M Saccharose resuspendiert. Die Suspension wurde wiederum in ein steriles 10 ml Zentrifugenröhrchen überführt (8 ml pro Zentrifugenröhrchen), mit 2 ml W5-Lösung aufgefüllt und 10 min bei 190 g zentrifugiert. Anschließend konnten die intakten Protoplasten mit Hilfe einer Pasteurpipette aus der Interphase abgezogen werden. Nach dem Transfer in neue Zentrifugenröhrchen wurden sie in 0.5 Manitol mit 10 mM CaCL: resuspendiert und erneut mit 120 g (5 min) pelletiert.

PEG-Behandlung

[0238] Die Protoplasten wurden in dem Transformationspuffer resuspendiert (siehe Appendix). Die Protoplastenkonzentration wurde mit Hilfe einer Zählkammer bestimmt und auf einen Wert von 1- 1.5 X 10⁶ Protoplasten/ml eingestellt.

Ein 100 μΐ Tropfen dieser Suspension wurde am unteren Rand einer gekippten 6-cm Petrischale aufgetragen und für einige Minuten stehen gelassen, so dass die Protoplasten sich absetzen konnten. Die Protoplasten wurden dann mit 50-100 μΐ der DNS-Lösung (Qiagen gereinigt, gelöst in TE, Konzentration 1 pg/ml) vorsichtig gemischt. Anschließend wurden 200 μΐ der PEG-Lösung (siehe Appendix) tropfenweise zu dieser Protoplasten/DNS-Mischung gegeben. Nach 15-30 min wurde in kleinen Aliquots (tropfenweise) der Transformationspuffer (oder W5-Lösung) soweit zugegeben, dass die Petrischale fast gefüllt war (~6 ml). Die Suspension wurde für 1-5 Stunden stehen gelassen. Anschließend wurden die Protoplasten in ein Zentrifugenröhrchen überführt, resuspendiert und wiederum mit 120 g (5-7 min) pelletiert.

Protoplastenkultur und Selektion der Transformanden

[0239] Die Protoplasten wurden in das Kulturmedium 8 pM überführt und bei 25°C, geringer Lichtintensität, in 2.5 cm oder 5 cm Petrischalen mit 0.5 ml bzw. 1.5 ml Medium inkubiert (Kao & Michayluk, 1975, Planta, 126, 105-110; siehe auch Appendix). Die Protoplastendichte betrug 2.5 X 10⁴ Protoplasten/ml. Drei Volumen frisches 8 pM-Medium ohne Hormonzusatz wurde nach der ersten Protoplastenteilung zugesetzt. Die Zellen wurden für 16 Stunden pro Tag bei hoher Lichtintensität inkubiert. [0240] Nach 10 bis 14 Tagen wurden die Zellen auf das mit 0.13% Agarose verfestigte Differenzierungsmedium K3 mit 0.1 M Saccharose, 5-15 mg/1, Phosphinotricin (PPT) transferiert (Nagy & Maliga, 1976, Z. Pflanzenphysiol., 78, 453^-55). Die Hormonkonzentration in diesem Medium war vier Mal geringer als in dem 8 pM-Medium. Um die Zellen auf frisches Medium zu transferieren, wurden die Zellen auf ein steriles Filterpapier gebracht und vorsichtig in einer dünnen Schicht auf diesem Papier verteilt. Die Zellen wurden 16 Stunden pro Tag bei hoher Lichtintensität gehalten. Zeilkolonien mit einem Durchmesser von rund 0.5 cm wurden schließlich auf K3-Medium transferiert.

BEISPIEL 3
Transformation von Triticum monococcum mittels Mikroprolektilbeschuss Pflanzenzellkultur

[0241] Eine Suspensionszellkulturlinie von T. monococcum L. wurde in MS2-Medium (MS-S alze, 0.5 mg/1, Thiamine HCl, 100 mg/1, Inosit, 30 g/l, Saccharose, 200 mg/1 Bacto-Trypton, 2 mg/12,4-D) in einem 250 ml Erlenmeyerkolben auf einem Rundschüttler mit 160 rpm bei 25°C angezogen (Murashige & Skoog, 1962, Physiol. Plant., 15, 473^-97). Die Subkultivierung erfolgte wöchentlich. Vier Tage nach der Subkultivierung wurden die Zellen auf einem sterilem 50 mm Filterpapier verteilt und mit dem Filterpapier auf das mit Gelrite (4 g/l,) verfestigte MS2-Medium mit 0.5 M Saccharose gebracht.

Mikroprojektilbeschuss

[0242] Der Mikroprojektilbeschuss wurde mit Hilfe des Biolistic PDS-1000/He Particle Delivery System der Firma BioRad durchgeführt. Die Zellen wurden bei einem Druck von 900-1100 psi, mit einer Distanz von 15 mm vom Makrocarrier zum Stopping screen und einer Distanz von 60 mm vom Stopping screen zum Zielgewebe beschossen. Der Abstand zwischen Rupture disk und Makrocarrierbetrug 12 mm. Die Zellen wurden nach vierstündiger, osmotischer Vorbehandlung beschossen. [0243] Die Beschichtung der Goldpartikel mit DNS wurde nach dem Orginalprotokoll von BioRad in folgender Weise durchgeführt: 25 μΐ eines Goldpuders (0.6-1 pm) in 50% Glycerol (60 mg/ml) wurde mit 5 μΐ Plasmid-DNS (0.2 pg/pl), 25 μΐ 2.5 M CaCL: und 10 μΐ 0.1 M Spermidin gemischt. Die Mischung wurde 2 min gevortext und 30 min bei Raumtemperatur inkubiert, zentrifugiert (2000 rpm, 1 min) und mit 70%igem bzw. 99.5%igem Ethanol gewaschen. Schließlich wurde das Pellet in 30 μΐ 99.5%igem Ethanol resuspendiert und die beschichteten Partikel für den Beschuss verwendet (6 μΙ/Schuss) (Sanford et al, 1993, in: Methods in Enzymology, Hrsg. R. Wu. 217, 483-509).

[0244] Eine neue Methode der Goldbeschichtung (PEG/Mg) wurde wie folgt durchgeführt: 25 μΐ einer Goldsuspension (60 mg/ml in 50% Glycerol) wurde mit 5 μΐ Plasmid-DNS in einem Eppendorfgefäß gemischt und danach mit 30 μΐ einer 40%igen PEG-Lösung in 1.0 M MgCL·; ergänzt. Die Mischung wurde für 2 min gevortext und weitere 30 min bei Raumtemperatur belassen. Nach der Zentrifugation dieser Mischung (2000 rpm, 1 min) wurde das Pellet zweimal mit 1 ml 70%igem Ethanol, einmal mit 99.5%igem Ethanol gewaschen und schließlich in 30 μΐ 99.5%igen Ethanol aufgenommen. Ein Aliquot dieser DNS-Goldsuspension von 6 μΐ wurde auf die Makrocarrier-Scheibe aufgetragen. Diese wurde anschließend 5 bis 10 min getrocknet, bevor sie für den Beschuss eingesetzt wurde.

Plasmid-DNS Präparation

[0245] Plasmid-DNS wurde in den E. coli Stamm DHlOB transformiert, um Maxipreparationen der Plasmide durchzuführen. Die Zellen wurden hierfür in LB-Medium angezogen und die DNS mit dem entsprechenden Kit der Firma Qiagen aufgereinigt.

60 Selektion

[0246] Für stabile Transformationsexperimente wurden die Filter mit den beschossenen Zellen auf verfestigtes MS2-Medium mit dem entsprechenden, selektiven Agens (150 mg/1 Hygromycin B (Duchefa); 10 mg/1 Bialaphos (Duchefa)) transferiert. Die verwendeten Antibiotika wurden vor der Zugabe zum Medium steril filtriert. Die Inkubation der Platten erfolgte bei 26°C im Dunklen.

BEISPIEL 4
Transformation von Orychophraamus violaceus mittels Mikroprojektilbeschuss Präparation der Zeilsuspensionskultur

[0247] O. violaceus Pflanzen wurden für 3 bis 4 Wochen in vitro auf mit 0.3% Gelrite verfestigtem MS-Medium (alternativ ¹A MS mit 2% Saccharose und 0.8% Agar) bei 24°C und einer Photoperiode von 16 Stunden Licht und 8 Stunden Dunkel angezogen. In Abhängigkeit von der Größe wurden vier bis sechs Blätter in kleine Stücke geschnitten und in eine Magenta-Box mit 30 ml Kallus induzierendem Medium (Callus inducing medium (CIM), siehe Appendix) transferiert. Das Material wurde 4 bis 5 Wochen im Dunkeln oder bei reduziertem Licht stark geschüttelt. Während dieser Zeit wurde frisches CIM-Medium nachgefüllt, um das Pflanzengewebe in der Magenta Box immer mit Flüssigkeit zu bedecken. Zellen, die sich an den Wänden der Magenta Box befanden, wurden durch heftiges Invertieren und Schütteln der Box wieder resuspendiert.

Präparation des Pflanzenmaterials für den Mikroprojektilbeschuss

[0248] Ein Aliquot einer Zellsuspension wurde vorsichtig auf ein steriles Filterpapier in einer mit verfestigtem CIM-Medium gefüllten Petrischale gegeben und für fünf bis sieben Tage im Dunkeln gehalten. Vier Stunden vor dem Beschuss wurde das Filterpapier mit den Zellen auf frisches CIM-Medium mit 10% Saccharose überführt. Der Mikroprojektil-beschuss wurde wie in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. 14 Stunden nach dem Beschuss wurde das Material auf CIM-Medium mit 3% Saccharose transferiert und wiederum im Dunkeln gehalten.

Selektion der Transformanden

[0249] Zwei bis vier Tage nach dem Beschuss wurden die Zellen auf Platten mit CIM-Medium mit dem entsprechenden Selektionsagens (10-15 pg/ml PPT) transferiert. Alle sieben Tage wurde das Material auf frisches Selektionsmedium transferiert. Die Platten wurden im Dunkeln gehalten und nach ungefähr sechs Wochen wurde das Pflanzenmaterial auf Medium transferiert, das die Morphogenese induziert (Mophogenesis Inducing Medium MTM, siehe Appendix). Dem MTM-Medium war ebenfalls das entsprechende Selektionsagens (10-15 pg/ml PPT) zugesetzt. Die Platten wurden anschließend bei hoher Lichtintensität und einer Tageslänge von 16 Stunden inkubiert.
30

BEISPIEL 5

Transformation von Triticum monococcum mit dem promotorlosen IoxP-HPT-Gen

[0250] Plasmid-DNS des Konstruktes pIC052 (Fig. 37) wurde mit Hilfe des Restriktionsenzym HindHI linearisiert und anschließend Gel-gereinigt, um unverdaute DNS zu entfernen. Die so vorbereitete Plasmid-DNS wurde für den Mikroprojektil-beschuss wie in Beispiel 3 beschrieben eingesetzt. Der linearisierte Vektor enthält neben dem pUC19-Polylinker (57 bp) eine IoxP Rekombinationssequenz, die an dem 5'-Ende des HPT-Gens lokalisiert ist, so dass nach dem Verdau ungefähr 100 bp vor dem 5'-Ende des Translatiosnstartkodons des HPT-Gens verbleiben.

[0251] Insgesamt wurden 34 Platten beschossen und nach V/i Monaten der Hygromycin-Selektion (siehe Beispiel 3) wurden drei Hygromycin resistente Kolonien selektiert. Die Sequenz der Integrationsstelle wurde mit Hilfe einer inverse PCR-Analyse (iPCR) identifiziert. Diese Analyse bestätigte die Unabhängigkeit der Integrationen in den drei Transformanden.

BEISPIEL 6

Transformation von Orychophragmus Blättern mit dem promotorlosen IRESMP,75^CR-AHAS-Gen

[0252] Die pflanzliche Acetohydroxysäure Synthase (AHAS) ist ein nuklear kodiertes Gen, dessen Genprodukt in die Chloroplasten transportiert wird. Es katalysiert den ersten Schritt im Biosyntheseweg der Aminosäuren mit verzweigten Kettenresten. Das Enzym steht unter der allosterischen Kontrolle dieser Aminosäuren und kann durch mehrere Klassen von Herbiziden inhibiert werden.

[0253] Das Konstrukt pIC06-IRES wurde erzeugt, indem der Promotor des Arabidopsis AHAS-Gens (1.3 kb Pstl-Ncol-Fragment) in pIC06 durch die IRESMP,75^CR-Sequenz ersetzt wurde. Das Endkonstrukt (Fig. 38) enthält die mutierte Version des Arabidopsis Acetohydroxysäure Synthase Gens (AHAS) mit einem Aminosäureaustausch an der Position 653 (Ser653-Asn), der zu einer Resistenz gegenüber der Imidazol-Herbizidfamilie führt (Sathasivan, Haughn & Murai, 1991, Plant PhysioL, 97, 1044-1050). Das Plasmid wurde mittels Sall-Restriktion linearisiert und für den Mikroprojektil-beschuss von Zellen einer frisch induzierten O. violaceous Suspensionskultur eingesetzt. Blätter von steril aufgezogenen O. violaceous Pflanzen wurden dazu in kleine Stücke geschnitten und in flüssiges hoch Auxin Medium (High Auxin medium, HAM; siehe Appendix) gegeben und in Magenta Boxen einem Rundschüttler geschüttelt, um eine Suspensionskultur zu induzieren. Nach 7-14 Tagen wurde die Suspensionskultur mit Hilfe von sterilen Filterpapieren auf Petrischalen mit Ergrünungsmedium (Greening medium, GM; siehe Appendix) transferiert. Nach drei Tagen wurde das Filterpapier mit den Zellen auf GM-Medium mit 0.4 M Saccharose umgesetzt. Vier Stunden später wurden die Zellen für die Mikroprojektilbeschuss-Experimente mit linearisierter pIC06-IRES-DNS wie in Beispiel 3 beschrieben eingesetzt.

14 Stunden nach dem Beschuss wurde das Filterpapier mit den Zellen auf GM-Medium mit 0.3% Saccharose transferiert. Zwei Tage nach diesem Transfer wurden die Zellen auf GM-Medium mit 0.7 μΜ Imazethapyr (AC263,499 oder Pursuit, American Cyanamid) umgesetzt. Die Subkultivierung der Zellen erfolgte alle 7-10 Tage. Putative Integrationsereignisse wurden ungefähr nach vier bis sechs Wochen identifiziert. Transformanden wurden unter folgenden Bedingungen selek-

tiert: hohe Lichtintensität 16 Stunden Lichtdauer, Regenerierungsmedium (RM) mit 1-2 μΜ Imazethapyr (siehe Appendix).

BEISPIEL 7

5 Expression des 2-DOG-6-P-Gens mit Hilfe eines translationellen Vektors

[0254] Das Ziel dieses Beispiels ist es, die Möglichkeit der Manipulation von transgenen Pflanzenzellen zu demonstrieren, die schon eine translationelle Vektorsequenz mit Sequenzspezifischen Rekombinationsstellen besitzen. [0255] Die Hygromycin resistenten, mit dem Vektor pIC052 transformierten T. monococcum Zellen (Beispiel 5) wurden für ein Mikroprojektilbeschuss-Experiment mit zwei Plasmiden, pIC-DOG and pIC-Cre (Fig. 39) eingesetzt. Das Plasmid pIC-DOG enthält dabei die promotorlose 2-Deoxyglucose-6-phosphat (2-DOG-6-P) Phosphatase cDNS (WO 98/45456), die von zwei loxP-Sequenzen flankiert wird. Die Cre Rekombinase vermittelte Integration des 2-DOG-6-P-Gens in die loxP-Stellen des pIC052-Konstruktes in den Transformanden führt zu der Expression des 2-DOG-6-P-Proteins mit Hilfe eines residenten Promotors. Diese Expression verleiht der Zelle eine Resistenz gegenüber 2-Deoxyglucose (2-DOG). Die resistenten Kolonien wurden wie in Beispiel 3 beschrieben selektiert, wobei das selektives Agens 2-DOG in einer Konzentration von 0.075-0.1% eingesetzt wurde.

BEISPIEL 8

Translationeller Vektor, der ein Transposon inkorporiert hat

[0256] Das Ziel dieses Beispiels ist es, einen alternativen Weg der direkten Transformation eines translationellen Vektors, der gerichtet in eine gewünschte, transkriptionell aktive Stelle des Wirtsgenom integriert, zu zeigen. [0257] Dazu wurde eine Co-Transformation mit dem in Fig. 40 gezeigten Konstrukten in O. violaceous Zellen durchgeführt. Die Selektion der Transformanden erfolgte wie in Beispiel 4 beschrieben. Das nicht autonome, transponierbare dSpm-Element enthält dabei das promotorlose BAR-Gen, dem auf der 5'-Seite das IRESMP,75^CR-Element vorangestellt ist. Die durch die Spm-Transposase induzierte Transposition bewirkt die Suche nach einer transkriptionell aktiven Region mit einem gewünschten Expressionsmuster (in diesem Fall ist diese konstitutiv) innerhalb des besagten Wirtsgenoms. Auf diese Weise wird die Anzahl der primären Transformanden erhöht. Die Anzahl der Transformanden war um drei bis vier Mal höher als mit dem IRES_Mp,75^CR-BAR-Gen allein (pIC1301, Fig. 34).

Appendix
Samensterilisation

[0258] Samen werden für mindestens 2 Stunden (über Nacht ist bevorzugt) in 1% PPM-Lösung eingeweicht. Anschließend werden sie für eine Minute in 70% EtOH gewaschen und dann in 10% Hypochlorit-Lösung mit 0.01% SDS oder Tween 20 in einem 250 ml Erlenmeyerkolben auf einem Rundschüttler sterilisiert. Anschließend werden sie in 0.5 1 sterilem Wasser gewaschen.

TVL 0.3 M Sorbitol 0.05 M CaCI₂x2H₂O pH 5.6-5.8

Enzvm-Lösunq

1% Cellulases 0.2% Macerase R10 0.1% Dricelase

gelöst in 8pM Makrosalze mit 0.5 M

pH 5.6-5.8

W5_ 18.4g/LCaCI₂x2H₂O 9.0 g/L NaCI 1.0 g/L Glucose 0.8 g/L KCI pH 5.6-5.8

PEG-Lösung 40% (w/v) of PEG-2000 in H₂O

CIM Macro MS Micro MS Vitamin B5 MES PVP Sucrose 2.4-D Kin Geirrte pH 5.6-5.8

500 mg/L 500 mg/L 30 g/L 5 mg/L 0.25 mg/L 3g/L

MIM	Dl·	500 mg/L
Macro MS		500 mg/L
Micro MS		30 g/L
Vitamin B£		1mg/L
MES		0.5 mg/L
PVP	0.1 mg/L
Sucrose	3 g/L
ABA	I 5.6-5.8
BA
IAA
Gelrite

44

Greeninq Medium (GM)	500mg/L	3
Macro MS	500 mg/L
Micro MS	30g/L
VitBS	2 mg/L
MES	0.5 mg/L
PVP	0.1 mg/L
Sucrose
BA
Kin
NAA
pH 5.6-5.i

Hiqh Auxine	Medium (HAM)
Macro MS
Micro MS
VitB5
MES	500 mg/L
PVP	500 mg/L
Sucrose	30g/L
NAA	5 mg/L
Kin	0.25 mg/L
BA	0.25 mg/L

pH 5.6-5.8

Reqenerationsmed'ium

Macro MS

Micro MS
VitB5

MES 500 mg/L

PVP 500 mg/L

Sucrose 30 g/L

ABA 1 mg/L

BA 0.5 mg/L

IAA 0.1 mg/L

pH 5.6-5.8

[0259] Hormonlösungen wurden filtersterilisiert und den autoklavierten Medien zugesetzt.

Claims

Patentansprüche 45

1. Verfahren zur Kontrolle eines gewünschten biochemischen Prozesses (II) oder einer gewünschten biochemischen Kaskade (ΠΙ) in einer Pflanze, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es die folgenden Schritte umfasst:

(a) Einführen von einer oder mehreren ersten heterologen DNA Sequenzen in das Kerngenom der Pflanze,

(i) einer oder mehreren ersten heterologen DNA Sequenzen des Kerngenoms und/oder Expressionsprodukten der ersten heterologen DNA Sequenzen und

(ii) einer oder mehreren zweiten heterologen DNA Sequenzen des Transfektionsvektors und/oder Expressionsprodukten der zweiten heterologen DNA Sequenzen und, (iii) wahlweise, einer oder mehreren von außen zugegebenen Komponenten von niederem Molekulargewicht,

wodurch der gewünschte biochemische Prozess (Π) oder die gewünschte biochemische Kaskade (ΠΙ), der/die vor der Interaktion nicht funktionsfähig war, angeschaltet wird.

2. Verfahren gemäß Anspruch 2, wobei der Interaktionsprozess ein Expressionsprodukt einer ersten heterologen DNA Sequenz benötigt, die stabil in das Kerngenom der Pflanze integriert ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei der Interaktionsprozess ein Expressionsprodukt einer zweiten heterologen DNA Sequenz des Transfektionsvektors benötigt.

4. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Infektion der Pflanze in Schritt (b) mittels eines rekonstituierten Viruspartikels oder infektiöser viraler Nukleinsäuren erreicht wird, oder durch Aktivieren einer Transfektion durch Freisetzen viraler Nukleinsäuren, die zuvor in das Pflanzengenom eingebaut wurden.

5. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Interaktionsprozess eine DNA Transposition beinhal-

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tet.

6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Interaktionsprozess eine DNA Rekombination beinhaltet.

7. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei der gewünschte biochemische Prozess oder die biochemische Kaskade die Expression einer ersten oder einer zweiten DNA Sequenz umfasst, die ein promotorloses Gen in antisense Orientierung enthält, das bei dem Interaktionsprozess in sense Orientierung zu einem konstitutiven Promotor hin platziert wird.

8. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Interaktionsprozess die Erkennung eines heterologen Promotors durch eine heterologe RNA Polymerase beinhaltet.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, wobei die erste oder die zweite DNA Sequenz eine zu exprimierende heterologe Sequenz unter der Kontrolle eines heterologen Promotors, der von einer pflanzlichen RNA Polymerase nicht erkannt wird, aufweist, und die Transkription der zu exprimierenden Sequenz wird durch Interaktion des Promotors mit einer mit diesem funktionierenden RNA Polymerase angeschaltet, wobei die RNA Polymerase von der zweiten beispielsweise von der ersten DNA Sequenz kodiert wird.

10. Verfahren gemäß Anspruch 9, wobei die RNA Polymerase und der heterologe Promotor aus Bakteriophagen stammen.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Interaktionsprozess eine DNA Reaktion wie eine DNA Replikation oder eine DNA Restriktion beinhaltet.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei der Interaktionsprozess eine RNA Reaktion wie eine Replikation, Prozessierung, reverse Transkription, Hybridisierung oder Translation oder eine Aktivierung, Inhibierung oder Modifizierung einer solchen Reaktion beinhaltet.

13. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei der Interaktionsprozess eine Proteinreaktion wie Proteinfaltung, Zusammenlagerung, Aktivierung, posttranslationale Modifizierung, Targeting, Binden, enzymatische Aktivität oder Signaltransduktion oder eine Aktivierung, Inhibierung oder Modifizierung einer solchen Reaktion beinhaltet.

14. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei

(i) der gewünschte biochemische Prozess oder die Kaskade die Expression einer ersten oder einer zweiten DNA Sequenz beinhaltet, die von ihrem Promotor durch eine DNA Insertion getrennt ist, welche die Transkription der ersten oder der zweiten DNA Sequenz verhindern kann, und

(ii) der in Schritt (b) getriggerte Interaktionsprozess zur Entfernung der DNA Insertion führt, wodurch die erste oder die zweite DNA Sequenz exprimiert wird.

15. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die DNA Insertion ein nichtautonomes transponierbares Element ist, das durch eine Transposase entfernt wird, die

(i) für eine Insertion im Kerngenom von einer zweiten DNA Sequenz auf dem viralen Vektor codiert wird oder die

(ii) für eine Insertion im viralen Vektor von einer ersten DNA Sequenz im Kerngenom codiert wird.

16. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die DNA Insertion von gerichteten Stellen flankiert ist, die von einer ortspezifischen Rekombinase erkannt werden können, die

(i) für eine Insertion im Kerngenom von einer zweiten DNA Sequenz des viralen Vektors codiert wird oder die (ii) für eine Insertion im viralen Vektor von einer ersten DNA Sequenz im Kerngenom codiert wird.

17. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Transkription einer ersten oder einer zweiten DNA Sequenz von einem heterologen oder künstlich veränderten Transkriptionsfaktor angeschalten wird, der einen heterologen oder künstlich veränderten oder chimären Promotor erkennen kann, welcher funktionell an ein heterologes Zielgen der ersten oder der zweiten DNA Sequenz gekoppelt ist, wobei der Promotor von keinem natürlichen pflanzlichen Transkriptionsfaktor erkannt werden kann und wobei der heterologe oder künstlich veränderte Transkriptionsfaktor von der zweiten beispielsweise von der ersten DNA Sequenz codiert wird.

18. Verfahren gemäß Anspruch 17, wobei der Transkriptionsfaktor durch eine von außen zugegebene Komponente von niederem Molekulargewicht induzierbar ist.

19. Verfahren zur Herstellung eines Erzeugnisses in einer transgenen Pflanze umfassend die Verfahrensschritte eines der Ansprüche 1 bis 18.

20. Verfahren nach Anspruch 19, das die folgenden Schritte umfasst:

(c) Herstellen des Erzeugnisses in der Pflanze.

21. Kit zur Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 20 umfassend

(i) eine transgene Pflanze oder Samen derselben,
(ii) einen viralen Transfektionsvektor und

(iii) wahlweise eine Komponente von niederem Molekulargewicht.

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