KR101352039B1 - 콩에서 유용 유전자의 기능 분석을 위한 콩 황반 모자이크 바이러스 유래의 재조합 ｖｉｇｓ 벡터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 프로모터 및 전장(full length) SYMMV 핵산 서열을 포함하고, 상기 전장 SYMMV 서열 중 외피 단백질 코딩 유전자 내에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한효소 부위를 포함하는 SYMMV 유래의 재조합 VIGS (Virus-induced gene silencing) 벡터, 상기 재조합 VIGS 벡터에 PDS(phytoene desaturase) 유전자가 삽입된 재조합 VIGS 벡터, 상기 재조합 VIGS 벡터를 이용하여 외래 유전자의 기능을 분석하는 방법, 상기 재조합 VIGS 벡터를 이용하여 목적 유전자가 침묵된 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 목적 유전자가 침묵된 식물체 및 이의 종자, 및 상기 재조합 VIGS 벡터를 증폭하기 위한 프라이머 조합에 관한 것이다.

Description

콩에서 유용 유전자의 기능 분석을 위한 콩 황반 모자이크 바이러스 유래의 재조합 ＶＩＧＳ 벡터 및 이의 용도{Recombinant virus-induced gene silencing vector from SYMMV useful for functional analysis of useful genes in soybean and uses thereof}

본 발명은 콩에서 유용유전자의 대량 기능분석을 위한 콩 황반 모자이크 바이러스(soybean yellow mottle mosaic virus; SYMMV) 유래의 재조합 VIGS(Virus-induced gene silencing) 벡터에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 프로모터 및 전장(full length) SYMMV 핵산 서열을 포함하고, 상기 전장 SYMMV 서열 중 외피 단백질 코딩 유전자 내에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한효소 부위를 포함하는 SYMMV 유래의 재조합 VIGS (Virus-induced gene silencing) 벡터, 상기 재조합 VIGS 벡터에 PDS(phytoene desaturase) 유전자가 삽입된 재조합 VIGS 벡터, 상기 재조합 VIGS 벡터를 이용하여 외래 유전자의 기능을 분석하는 방법, 상기 재조합 VIGS 벡터를 이용하여 목적 유전자가 침묵된 식물체의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 목적 유전자가 침묵된 식물체 및 이의 종자, 및 상기 재조합 VIGS 벡터를 증폭하기 위한 프라이머 조합에 관한 것이다.

콩은 전 세계에서 경제적으로 매우 중요한 작물이다. 우리가 항상 섭취하는 음식과 사료용으로 많이 이용하고 있으며 더욱이 최근에는 바이오 디젤의 원료로써 많은 연구가 진행되고 있다. 따라서 전 세계 연구원들은 콩이 가지고 있는 수많은 유용 유전자들의 발굴과 연구로 인한 품종 개발에 집중하고 있으며, 특허를 통한 원천기술을 선점하기 위해 노력하고 있다.

작물이 가지고 있는 유전자들의 기능을 연구하기 위해서는 유전자들 각각의 돌연변이체가 필요하다. 지금까지는 이러한 대량의 돌연변이체를 얻기 위해 T-DNA 넉아웃 돌연변이체(knockout mutant) 등을 주로 사용하였으며, 몇몇 작물에서는 식물 바이러스를 이용한 VIGS (Virus-induced gene silencing) 방법을 사용하였다. 하지만 T-DNA 넉아웃 돌연변이체를 얻기 위해서는 형질전환기술이 반드시 필요하며 불행히도 콩에서는 아직 대량으로 형질전환할 수 있는 기술이 전무하다. 또한 VIGS 방법을 사용하기 위해서는 콩에서 사용 가능한 효과적인 바이러스 벡터가 반드시 필요하다.

콩에서 사용할 수 있는 VIGS 벡터의 개발을 위해서는 콩에 발생하는 새로운 바이러스의 탐색이 필요하다. 모든 바이러스들은 각각의 병원성과 기주 범위 또한 침묵현상 억제자(silencing suppressor)의 효율이 모두 다르므로 끊임없이 효율적인 VIGS 벡터의 탐색과 연구는 반드시 필요하다. 또한 바이러스로 인한 기주의 병징을 보이지 않게 하는 것이 중요하다. 이것은 바이러스에 대한 수많은 품종별 병징 조사를 통하여 정상적으로 바이러스의 증식은 이루어지면서 병징은 보이지 않는 품종을 선별함으로써 해결할 수 있다.

콩에서 VIGS 벡터로 사용할 수 있는 바이러스의 발굴을 위해서는 기존에 보고된 바이러스만을 가지고는 한계가 있다. 이는 많은 연구원들이 이미 벡터로서의 가능성 여부에 대한 연구를 대부분 끝마쳤기 때문에 지속적인 새로운 바이러스의 탐색이 필요하다. 콩 황반 모자이크 바이러스는 최근 국내에서 처음 발견된 바이러스이면서 아직 그 연구가 매우 미진한 상태이다. 또한 지금까지의 VIGS 벡터는 대부분 두가닥의 RNA 바이러스(담배 래틀 바이러스, 강낭콩 꼬투리 얼룩 바이러스 등)를 이용하였으며 콩 황반 모자이크 바이러스와 같이 한 가닥의 RNA 바이러스를 이용한 예는 극히 드물다. 따라서 새로운 바이러스인 콩 황반 모자이크 바이러스를 가지고 지금까지의 벡터보다 더욱 효과적인 유전자 침묵현상(silencing) 효과가 요구된다.

식물 바이러스 내 유전자에는 식물체 내에서 일어나는 침묵현상(silencing)을 억제하는 억제자(suppressor)가 존재하는데 이들 유전자로 인하여 실제로 VIGS 효과가 효율적으로 일어나기 어려운 경우가 많이 있으며 이들 억제자(suppressor)의 기작과 능력은 바이러스별로 조금씩 다르다고 알려져 있다. 또한 VIGS 실험에서 중요한 점은 벡터로 사용한 바이러스의 병징이 식물체에서 보이지 말아야 한다는 것이다. 이는 후에 바이러스 병징과 VIGS로 인한 표현형(phenotype)의 혼돈을 피하기 위해서이다. 따라서 이러한 조건을 모두 만족시키는 바이러스 벡터의 개발이 필요하다.

현재 여러 작물에서 VIGS를 이용하여 유전자 기능 분석을 진행하고 있으며, 담배, 토마토, 고추, 애기장대 등에서는 담배 래틀 바이러스(Tobacco rattle virus; TRV) 벡터를 주로 이용하고 있다(Ratcliff, Frank. Tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing. 2001 Vol.25, 237-245). 콩의 경우에는 TRV 벡터와 같이 강력한 침묵(silencing) 효과를 기대할 수 있는 바이러스 벡터는 아직 없으며, 현재 미국에서 강낭콩 꼬투리 얼룩 바이러스(Bean pod mottle virus; BPMV) 벡터가 개발되어 연구가 진행되고 있다(US 2007/0214518 A1 (Ghabrial, S. A.) Sep. 13, 2007).

한국등록특허 제10-0795367호에는 병원균에 저항성을 갖는 고추의 전사 조절 유전자를 담배 래틀 바이러스 벡터에 삽입시켜 구축한 VIGS 벡터가 개시되어 있으며, 한국공개특허 제2009-0114715호에는 고추 리폭시제나제 유전자를 담배 래틀 바이러스 벡터에 삽입시켜 구축한 VIGS 벡터가 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 콩에서 분리된 콩 황반 모자이크 바이러스를 이용하여 재조합 VIGS 벡터를 구축하였고, 이로부터 RNA 전사체를 제조하여 식물체에 접종한 결과, 식물세포 유전자에서 침묵현상이 효율적으로 나타나는 것을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 프로모터 및 전장(full length) SYMMV 핵산 서열을 포함하고, 상기 전장 SYMMV 서열 중 외피 단백질 코딩 유전자 내에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한효소 부위를 포함하는 SYMMV 유래의 재조합 VIGS (Virus-induced gene silencing) 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 VIGS 벡터에 PDS(phytoene desaturase) 유전자가 삽입된 재조합 VIGS 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 VIGS 벡터를 이용하여 외래 유전자의 기능을 분석하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 VIGS 벡터를 이용하여 목적 유전자가 침묵된 식물체의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 목적 유전자가 침묵된 식물체 및 이의 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 VIGS 벡터를 증폭하기 위한 프라이머 조합을 제공한다.

콩(Soybean)은 약 975 Mb의 염기서열을 가지고 있으며, 약 66,000여개의 단백질을 코딩하고 있다. 이러한 수많은 유전자들의 특성을 분석하기 위한 도구로써 VIGS가 가장 커다란 대안으로 부각되고 있으며 여기에 콩 황반 모자이크 바이러스를 이용한 벡터를 이용할 수 있을 것이다.

따라서 콩 황반 모자이크 바이러스를 이용하여 연구자들이 원하는 유전자들을 효율적으로 침묵현상(silencing)을 일으켜 유전자들의 고유 기능 연구를 가능하게 할 뿐 아니라 경제적으로 가치 있는 유용 유전자들의 탐색에 매우 유용할 것으로 여겨진다.

또한, 유용 유전자들을 이용한 콩의 새로운 품종 육성을 기대할 수 있으며 특허를 통한 원천기술을 확보할 수 있다. 따라서 앞으로 펼쳐지는 신품종에 대한 종자 전쟁에서 세계시장에서의 경쟁력 있는 콩의 신품종 개발에 대한 기반을 갖출 수 있을 것이다.

도 1은 콩(soybean)에서 분리한 새로운 바이러스인 SYMMV(콩 황반 모자이크 바이러스)의 모식도를 나타낸다.
도 2는 SYMMV를 이용하여 구축한 감염성 클론의 모식도를 나타낸다.
도 3은 SYMMV 표준 균주 및 SYMMV 감염성 클론을 콩에 접종하여 그 병원성을 조사한 결과를 나타낸다.
도 4는 SYMMV 감염성 클론에 gmPDS 단편의 삽입을 나타낸 모식도이다.
도 5는 SYMMV 감염성 클론을 이용하여 구축한 재조합 VIGS 벡터의 모식도를 나타낸다.
도 6은 PDS가 삽입된 SYMMV 감염성 클론의 RNA 합성 결과를 나타낸다.
도 7은 pSYMMT7-PDS3 에 의해 유도되는 백화현상을 나타낸다.
도 8은 RT-PCR을 이용한 재조합 VIGS 벡터의 침묵현상(silencing effect) 검정을 나타낸다.
도 9는 Single-joint PCR을 이용한 USV3 VIGS 벡터의 제작 모식도이다.
도 10은 pSYMM35S-PDS3 에 의해 유도되는 백화현상을 나타낸다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 프로모터 및 전장(full length) SYMMV(콩 황반 모자이크 바이러스) 핵산 서열을 포함하고, 상기 전장 SYMMV 서열 중 외피 단백질 코딩 유전자 내에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 제한효소 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 SYMMV 유래의 재조합 VIGS (Virus-induced gene silencing) 벡터를 제공한다.

VIGS (Virus-induced gene silencing)는 바이러스 벡터에 식물유전자를 도입한 후 식물체를 감염시키면, 그 도입된 유전자의 내인성 식물유전자가 발현이 억제되는 현상을 말한다. 이는 PTGS (Post-transcriptional gene silencing)의 일종으로서, 전사-후(post-transcriptional), RNA 턴오버(RNA turnover) 및 뉴클레오티드 서열 특이적(nucleotide sequence-specific) 이라는 특징들을 가진다. 따라서, VIGS를 이용하면 도입유전자의 기능을 신속하고 간편하게 대량으로 분석할 수 있다.

본 발명의 재조합 VIGS 벡터에서, 상기 프로모터는 시험관 내 전사에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 T7 프로모터, SP6 프로모터 또는 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 중합효소가 결합하는 DNA 분자를 말한다.

본 발명의 재조합 VIGS 벡터에서, 상기 제한효소 부위는 외래 유전자를 삽입할 수 있는 부위로서, 외피 단백질(coat protein) 코딩 유전자 내에 위치하며, 바람직하게는 외피 단백질 코딩 유전자의 3'-말단에 위치할 수 있다. 콩 황반 모자이크 바이러스와 같은 카르모바이러스(carmovirus)에 속하는 순무 주름 바이러스(Turnip crinkle virus; TCV)에서 강력한 RNA 침묵(silencing)의 억제자(suppressor)로 P38 단백질인 외피 단백질 (coat protein)이 알려져 있다. 따라서 RNA 침묵(silencing)의 억제자(suppressor)의 기능을 막기 위해, 외래 유전자를 외피 단백질 코딩 유전자 내에 삽입하는 것이다.

용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 단편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 VIGS 벡터 내의 외피 단백질 코딩 유전자의 3'-말단에 PDS(phytoene desaturase) 유전자가 안티센스 방향으로 삽입된 것을 특징으로 하는 PDS 단편이 삽입된 재조합 VIGS 벡터를 제공한다. 상기 PDS 단편이 삽입된 재조합 VIGS 벡터는 바람직하게는 도 5에 기재된 pSYMMT7-fullIC-PDS3 벡터 또는 도 10에 기재된 pSYMM35S-fullIC-PDS3 벡터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, VIGS의 성공 여부를 확인하기 위해 광합성 관련 유전자인 PDS 유전자를 마커로 사용하였다. PDS 유전자는 카로티노이드 생합성에 관여하는 효소를 코딩하고 있으므로, 이 유전자가 억제되는 경우 식물 잎의 백화현상을 관찰할 수 있다. 본 발명은 PDS 유전자 단편을 재조합 VIGS 벡터의 제한효소부위에 삽입하여 식물체에 감염 후, 식물체의 표현형에 변화(백화현상)가 나타나는 것을 확인하였다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 VIGS 벡터에 기능을 분석하고자 하는 외래 유전자를 삽입하는 단계;

외래 유전자가 삽입된 재조합 VIGS 벡터를 절단 후, 시험관 내 전사(in vitro transcription)을 수행하여 RNA 전사체를 제조하는 단계;

상기 RNA 전사체를 식물체에 접종하여 외래 유전자를 침묵시키는 단계; 및

외래 유전자가 침묵된 식물체의 표현형을 분석하는 단계를 포함하는 외래 유전자의 기능을 분석하는 방법을 제공한다.

본 발명의 외래 유전자의 기능을 분석하는 방법은 본 발명의 재조합 VIGS 벡터에 기능을 분석하고자 하는 외래 유전자를 삽입하는 단계를 포함한다. 이때, 상기 외래 유전자는 바람직하게는 외피 단백질 코딩 유전자 내에 삽입되며, 더욱 바람직하게는 외피 단백질 코딩 유전자의 3'-말단에 삽입될 수 있다. 또한, 삽입되는 방향은 센스 또는 안티센스 방향으로 삽입될 수 있으며, 바람직하게는 안티센스 방향으로 삽입될 수 있다.

본 발명의 외래 유전자의 기능을 분석하는 방법에서, 시험관 내 전사는 예를 들면, T7 RNA 중합효소 등을 이용할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 외래 유전자의 기능을 분석하는 방법은 상기 RNA 전사체를 식물체에 접종하여 외래 유전자를 침묵시키는 단계를 포함한다.

"침묵"이란 일반적으로 유전자의 발현이 하향조절(downregulation) 또는 완전히 억제(suppression)되는 현상을 말한다. 식물체는 SYMMV에 의해 감염되는 식물체는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 콩(대두)이다.

본 발명에 따른 재조합 VIGS 벡터를 이용하여 분석가능한 유용 유전자는 식물 생장 유전자, 병 저항성 유전자, 환경 스트레스 관련 유전자 등일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

본 발명은 또한, 본 발명의 재조합 VIGS 벡터에 침묵시키고자 하는 외래 유전자를 삽입하는 단계;

외래 유전자가 삽입된 재조합 VIGS 벡터를 절단 후, 시험관 내 전사(in vitro transcription)을 수행하여 RNA 전사체를 제조하는 단계; 및

상기 RNA 전사체를 식물체에 접종하여 외래 유전자를 침묵시키는 단계를 포함하는 목적 유전자가 침묵된 식물체의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 목적 유전자가 침묵된 식물체의 제조 방법에서, 각 단계는 외래 유전자의 기능을 분석하는 방법에서 기재한 바와 같다.

본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조된 목적 유전자가 침묵된 식물체 및 이의 종자를 제공한다. 상기 식물체는 SYMMV에 의해 감염되는 식물체는 특별히 제한되지 않으나, 바람직하게는 콩(대두)이다.

본 발명은 또한, T7 프로모터 및 전장(full length) SYMMV 핵산 서열을 포함한 SYMMV 감염성 클론을 증폭하기 위한 서열번호 1 내지 서열번호 4의 프라이머 조합을 제공한다. 상기 프라이머 조합은 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트 및 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트로 이루어지며, 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트는 T7 프로모터 및 SYMMV의 5' 단편을 포함하는 부분을 증폭하며, 서열번호 3 및 4의 프라이머 세트는 SYMMV의 3' 단편을 포함하는 부분을 증폭한다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 콩에서 분리한 새로운 바이러스인 콩 황반 모자이크 바이러스의 전체 염기서열 해독

콩(soybean)으로부터 콩 황반 모자이크 바이러스(soybean yellow mottle mosaic virus, SYMMV)를 국내에서 처음으로 분리하여, 바이러스의 전체 염기서열을 분석하였다. 콩 황반 모자이크 바이러스는 한 가닥의 RNA 게놈(genome)을 가지고 있으며, 총 4009 bp의 염기로 이루어져 있다(GenBank FJ457015.1, 서열번호 13). 전체 ORF(Open Reading Frame)은 6개로 구성되어 있으며, ORF1 (nt 40-723) 및 ORF2 (nt 724-2280)는 각각 28 kDa 단백질 및 56 kDa 단백질을 코드하고 있으며 바이러스의 복제에 관여하고, ORF3 (nt 2280-2486) 및 ORF4 (nt 238302667)는 각각 7 kDa 단백질 및 10 kDa 단백질을 코드하고 있으며 바이러스의 이동에 관여한다. 그리고 ORF5 (nt 2664-3728)는 38 kDa 단백질을 코드하고 있으며 바이러스 외피 단백질을 생성하며, ORF6 (nt 2668-3339)는 25 kDa 단백질을 코드하고 있고 그 기능은 아직 알지 못한다 (도 1).

실시예 2: SYMMV 를 이용하여 감염성 클론의 제작

SYMMV를 이용하여 감염성 클론을 제작하기 위해 중합효소 연쇄반응(PCR)을 이용하여 두 개의 겹쳐지는(overlapping) 단편을 SalⅠ 부위를 중심으로 제작하였다. 두 개의 단편은 각각 5'-단편 및 3'-단편으로 구성되며, 각각 2.4 kb 및 1.6 kb의 크기를 가진다. 5'-단편은 SYMMV-T7-EcoRⅠ-U (5'-AAAGAATTCTAATACGACTCACTATACGGTAACCCAGCCAGTTATC-3'; 서열번호 1) 및 SYMM-R (5'-GATCACCGCCAGGTGGTTTA-3'; 서열번호 2) 프라이머로 증폭하였으며, EcoRⅠ 부위와 T7 프로모터를 가지고 있다. 3'-단편은 SYMM-F (5'-GCCAGAGAACAAGCAGATTCA-3'; 서열번호 3) 및 SYMM-End2-PstⅠ-L (5'-AAACTGCAGGGGGGGGGCCCCGCATGCCC-3'; 서열번호 4) 프라이머로 증폭하였으며 PstⅠ부위를 가지고 있다. 각각의 두 단편은 pUC19 벡터에 클로닝하였으며, SalⅠ 부위를 이용하여 하나의 SYMMV 전체 감염성 클론으로 완성하였다(도 2).

SYMMV 감염성 클론은 PstⅠ을 이용하여 한 가닥의 플라스미드로 만든 후에 T7-RNA 중합효소를 이용하여 RNA를 합성한 후, 합성된 RNA를 접종원으로 사용하였다. 콩은 파종한 지 10일이 지난 후 2개의 본엽에 접종을 하였다. 도 3에서와 같이 (a) 및 (b)는 완충용액을 접종하였으며, (c) 및 (d)는 SYMMV 표준 균주(type strain)을 접종하였고, (e) 및 (f)는 SYMMV 감염성 클론(pSYMMT7-fullIC)을 접종하였다. 접종 후 일주일이 지나면 조금씩 병징이 보이기 시작하였으며 15일이 지난 후에는 명확한 병징을 확인할 수 있었다. 완충용액을 접종한 콩은 전혀 병징이 보이지 않았으며 SYMMV 표준 균주와 SYMMV 감염성 클론을 접종한 것은 병징의 패턴이 조금 다르지만 명확한 병징을 확인할 수 있었다(도 3). 또한 PCR을 통해 접종하지 않은 윗잎에서 바이러스가 검출되는 것으로 보아 감염성 클론이 정상적으로 작동한다는 것을 알 수 있었다.

실시예 3: SYMMV 감염성 클론을 이용하여 VIGS 벡터의 제작

SYMMV 감염성 클론을 이용하여 Virus-induced gene silencing (VIGS) 벡터로 이용 가능성을 알아보기 위해 SYMMV 감염성 클론에 phytoene desaturase (PDS) 유전자 단편(서열번호 14)을 삽입하였다. SYMMV와 같은 카르모바이러스(carmovirus)에 속하는 순무 주름 바이러스(Turnip crinkle virus; TCV)에서 강력한 RNA 침묵(silencing)의 억제자(suppressor)로 P38 단백질인 외피 단백질 (coat protein)이 알려져 있다. 따라서 RNA 침묵(silencing)의 억제자(suppressor)의 기능을 막기 위해, PDS 단편을 하나는 SYMMV 외피 단백질 중간에 넣었고 또 다른 하나는 외피 단백질 끝에 삽입하였다. 두 개의 gmPDS 단편은 대두에서 각각 RT-PCR로 증폭하였으며 gmPDS1의 단편은 gmPDS1-MluⅠ-U (5'-AAAACGCGTAACGGTGAAGAGCTTCTTACTA-3'; 서열번호 5) 및 gmPDS1-MluⅠ-L (5'-AAAACGCGTACCAACTCTAACATTGACTGGT-3'; 서열번호 6)을 사용하였고, gmPDS3의 단편은 gmPDS3-XbaⅠ-U (5'-AAATCTAGAACGGTGAAGAGCTTCTTACTAA-3'; 서열번호 7) 및 gmPDS3-XbaⅠ-L (5'-AAATCTAGAAACCAACTCTAACATTGACTGGTT-3'; 서열번호 8)을 사용하여 증폭하였다. SYMMV 감염성 클론에 gmPDS 단편을 삽입하기 위해 서열번호 13의 염기서열 중 3575번째 또는 3725번째 염기서열 위치인 SYMMV 3'-클론의 각각 C3575A 및 C3725A 위치에 자리 지정 돌연변이유발(site-directed mutagenesis)을 하여 삽입할 위치에 제한효소 자리를 만들었으며 gmPDS1 및 gmPDS3는 각각 제한효소자리를 이용하여 그림과 같이 삽입하였으며, gmPDS1은 정방향으로 gmPDS3는 역방향으로 삽입되었다(도 4).

gmPDS가 삽입된 SYMMV 3'클론은 다시 SYMMV 감염성 클론의 동일한 부위와 치환하였다. SalⅠ 및 PstⅠ을 이용하여 gmPDS가 삽입된 SYMMV 3'클론을 치환하였으며, 최종적으로 SYMMV 감염성 클론의 외피 단백질 부위에 gmPDS 단편이 삽입된 클론을 완성하였다(도 5).

PDS가 삽입된 SYMMV 감염성 클론의 RNA 합성을 위하여 시험관내 전사(in vitro transcription)를 실시하였다. PDS가 삽입된 SYMMV 감염성 클론을 약 10 ㎍을 가지고 PstⅠ을 이용하여 플라스미드를 한가닥으로 만든다. 한 가닥이 된 플라스미드는 T7 RNA 중합효소를 이용하여 37℃에서 2시간 동안 RNA를 합성한 후 DNaseI으로 남아있는 DNA를 제거하였다. 그리고 페놀/클로로포름(phenol/chloroform)으로 RNA를 깨끗하게 정제한 후에 RNA를 접종원으로 사용하였다(도 6).

실시예 4: pSYMMT7 - PDS3 의 VIGS 벡터로의 가능성 조사

완충용액, pSYMMT7-fullIC 그리고 pSYMMT7-PDS3 각각을 파종한 지 10일 지난 콩의 본옆에 접종하였다. 완충용액을 접종한 콩은 아무런 병징을 나타내지 않았으며 pSYMMT7-fullIC을 접종한 콩은 접종 후 7일 정도면 약한 병징을 확인할 수 있었으며 15일 정도 후에는 콩 전신에 심한 병징을 확인할 수 있었다. pSYMMT7-PDS3을 접종한 콩은 병징 발현이 조금 늦어 약 18일 정도 후에 바이러스 병징을 확인할 수 있었으며 약 23일 후부터 PDS의 전형적인 현상인 백화(photo bleaching) 현상을 확인할 수 있다(도 7).

또한 정상적으로 PDS 유전자의 침묵현상을 확인하기 위해 RT-PCR을 수행하였다. gmActin 유전자를 함께 RT-PCR하여 같은 양의 RNA가 사용되었음을 확인할 수 있었다. gmPDS 증폭에 사용된 프라이머는 gmPDS probe-U (5'-CACCAGCCGAAGAATGGATTT-3'; 서열번호 9) 및 gmPDS probe-L (5'-CTGTACAATAGCCTGTGCACA-3'; 서열번호 10)을 사용하였으며 도 8에서와 같이 완충용액과 SYMMV를 접종했을 때보다 증폭된 PDS 유전자의 양이 현저히 차이가 나는 것을 확인하였다. 이것으로 SYMMV를 이용한 VIGS를 이용하여 벡터에 삽입되어있는 PDS 단편이 식물 세포 내에서 발현되는 gmPDS 유전자를 침묵(silencing) 시킨 것을 확인할 수 있었다. 따라서 SYMMV를 이용한 VIGS 벡터가 콩의 특정 유전자를 침묵현상(silencing)을 유도 시키므로 유전자의 대량 기능분석이 이용 가능하다는 것을 확인할 수 있었다.

실시예 5: SYMMV 감염성 클론을 이용하여 VIGS 벡터의 제작

SYMMV 바이러스를 이용한 VIGS 시스템을 갖추기 위해 SYMMV의 5' 말단 부위에 single-joint PCR을 이용하여 35S 프로모터를 붙였다. pSNU1 벡터(서울대 김국형 교수님 제공)를 바탕으로 하여 35S 프로모터를 증폭하였으며, 35S 프로모터의 일부분을 포함한 SYMMV의 5' 단편을 PCR을 통하여 각각 증폭하였다. 이들 각각의 단편은 두 번째 PCR을 통하여 결합시켰으며 최종적으로 PSNU35S-SJ2-EcoR-1U 프라이머(5'-AAAGAATTCAAGCTTGCATGCCTGCTGGT-3'; 서열번호 11)와 SYMMV-R 프라이머(5'-GATCACCGCCAGGTGGTTTA-3'; 서열번호 12)를 통하여 SYMMV의 5'-말단에 35S 프로모터가 결합된 단편을 얻을 수 있었다. 이 단편은 Rz-NOS(cis-cleaving ribozyme sequence - NOS terminator)를 붙인 SYMMV 3'-말단 단편과 다시 결합하여 바이너리벡터인 pPZP211에 클로닝 하였다(도 9).

실시예 6: SYMMV 를 이용한 VIGS 벡터인 pSYMMV 의 유전자 침묵 효과 검증

pSYMMV를 이용하여 VIGS 벡터의 유전자 침묵 효과를 검증하기 위해, SYMMV의 CP 뒷부분에 single point mutation을 이용하여 제한효소(XbaⅠ) 자리를 만든 후에 콩에서 증폭한 gmPDS 단편을 역방향으로 삽입하였다. SYMMV VIGS 벡터인 pSYMMV-full과 pSYMMV-PDS 클론을 아그로박테리움(Agrobacterium)에 각각 형질전환을 하였으며, 아세토실린곤(Acetocyringon)을 이용하여 바이너리벡터(binary vector) 내에 위치한 병원성 유전자(vir gene)을 활성화 시킨 후에 주사기를 사용하여 콩의 잎 뒷면에 접종하였다. 접종할 때는 대조구로 한쪽은 버퍼(buffer)를 접종하고 다른 한쪽은 PDS 유전자를 삽입하지 않은 SYMMV 바이러스 벡터를 접종하였다. 접종한지 약 2주가 지나기 시작하면서 pSYMMV-full을 접종한 식물에서 바이러스 병징이 조금씩 보이기 시작했으며 3주가 지나면서 pSYMMV-PDS를 접종한 식물에서는 PDS에 의한 silencing 효과가 나타나기 시작했다. 접종 약 4주가 지나면 콩의 잎이 흰색으로 변하는 백화(photo bleaching) 현상을 확인할 수 있었다(도 10). 이것은 SYMMV를 이용하여 제작한 VIGS 벡터 pSYMMV를 이용하여 콩의 유용유전자의 대량 식물검정이 가능하다는 것을 보여 주었다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims (13)

1. T7 프로모터, SP6 프로모터 또는 35S 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택되는 프로모터 및 서열번호 13의 염기서열로 이루어진 전장(full length) SYMMV(콩 황반 모자이크 바이러스) 핵산 서열을 포함하고, 상기 전장 SYMMV 서열인 서열번호 13의 염기서열 중 2664번째부터 3728번째 염기서열에 해당하는 외피 단백질 코딩 유전자 내에 외래 유전자를 삽입할 수 있는 서열번호 13의 염기서열 중 3725번째 염기서열 위치에 제한효소 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 SYMMV 유래의 재조합 VIGS (Virus-induced gene silencing) 벡터.
2. 삭제
3. 삭제
4. 제1항의 재조합 VIGS 벡터 내의 서열번호 13의 염기서열 중 2664번째부터 3728번째 염기서열에 해당하는 외피 단백질 코딩 유전자의 3725번째 염기서열 위치에 서열번호 14의 염기서열로 이루어진 PDS(phytoene desaturase) 유전자가 안티센스 방향으로 삽입된 것을 특징으로 하는 PDS 단편이 삽입된 재조합 VIGS 벡터.
5. 삭제
6. 제1항의 재조합 VIGS 벡터에 기능을 분석하고자 하는 외래 유전자를 삽입하는 단계;
   외래 유전자가 삽입된 재조합 VIGS 벡터를 절단 후, 시험관 내 전사(in vitro transcription)을 수행하여 RNA 전사체를 제조하는 단계;
   상기 RNA 전사체를 식물체에 접종하여 외래 유전자를 침묵시키는 단계; 및
   외래 유전자가 침묵된 식물체의 표현형을 분석하는 단계를 포함하는 외래 유전자의 기능을 분석하는 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 외래 유전자는 외피 단백질 코딩 유전자 내에 안티센스 방향으로 삽입되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 식물체는 콩인 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항의 재조합 VIGS 벡터에 침묵시키고자 하는 외래 유전자를 삽입하는 단계;
   외래 유전자가 삽입된 재조합 VIGS 벡터를 절단 후, 시험관 내 전사(in vitro transcription)을 수행하여 RNA 전사체를 제조하는 단계; 및
   상기 RNA 전사체를 콩 식물체에 접종하여 외래 유전자를 침묵시키는 단계를 포함하는 목적 유전자가 침묵된 콩 식물체의 제조 방법.
10. 제9항의 방법에 의해 제조된 목적 유전자가 침묵된 콩 식물체.
11. 삭제
12. 삭제
13. 삭제

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