CN111088237B

CN111088237B - 一种红麻HcPDS基因VIGS沉默体系

Info

Publication number: CN111088237B
Application number: CN202010073462.1A
Authority: CN
Inventors: 张立武; 徐益; 张力岚; 祁建民; 张列梅; 徐建堂
Original assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Current assignee: Fujian Agriculture and Forestry University
Priority date: 2020-01-22
Filing date: 2020-01-22
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2040-01-22
Also published as: CN111088237A

Abstract

本发明提供一种红麻HcPDS基因VIGS沉默体系，属于基因工程技术领域。通过构建含有HcPDS基因特异性片段的pTRV2病毒沉默表达载体，该载体经农杆菌介导转化红麻，诱导红麻内源HcPDS基因发生沉默，有效降低了红麻HcPDS基因的表达水平，导致白化表型。包括如下步骤：构建重组病毒质粒pTRV2‑HcPDS；制备侵染液；农杆菌介导法侵染红麻，并后续检测基因沉默效率。本发明的有益效果是首次在红麻中应用VIGS技术体系，为VIGS技术体系在红麻上的大规模应用奠定了基础。

Description

一种红麻HcPDS基因VIGS沉默体系

技术领域

本发明属于植物基因工程技术领域，具体为一种红麻HcPDS基因VIGS沉默体系。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing, VIGS)是通过插入目的基因片段的重组病毒来抑制植物内源基因表达的遗传技术，主要用于基因的功能分析，是植物体内普遍存在的一种遗传免疫机制，属于转录后沉默。与基因敲除和突变体筛选等转基因技术相比，VIGS技术无需构建转基因植株，具有周期短、操作简便和成本低等优点，是目前功能基因组学研究领域常用的技术手段之一。广泛应用于植物的生长发育、抗虫病和代谢调控等相关基因功能研究。到目前为止。TRV-VIGS 已在茄属的番茄、烟草、辣椒、拟南芥、麻风树、矮牵牛、罂粟等植物上成功应用。

红麻(Hibiscus spp.)是继棉花和黄麻之后的世界上第三大天然纤维作物，广泛在亚热带和热带地区种植，主要分布在中国、印度、泰国、孟加拉国、越南、印度尼西亚、巴西、古巴、伊朗与埃及等。由于红麻韧皮部纤维具有抑菌、透气、吸湿性好和可降解等特点，被视为21世纪潜在的优势作物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种红麻HcPDS基因VIGS沉默体系。该体系实现简单、快速、高通量分析鉴定红麻HcPDS基因功能。

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS（Phytoene desaturase），其全长基因序列如SEQ ID NO.1所示。

一种用于沉默红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的HcPDS基因特异性片段，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

一种沉默红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的VIGS病毒载体，利用gateway重组克隆技术将HcPDS基因特异性片段连接至VIGS病毒骨架载体pTRV2中，构建获得重组病毒载体pTRV2-HcPDS。

一种红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的VIGS沉默体系，其建立方法包括以下步骤：

(1)通过冻融法将重组病毒载体pTRV2- HcPDS转化到农杆菌GV3101感受态细胞，PCR鉴定阳性；

(2)将转化后的阳性农杆菌菌液与pTRV1菌液按菌液体积比1:1混合制成混合菌液；

(3)通过侵泡法将红麻种子在步骤（2）的混合菌液中侵泡24h；

(4)将侵泡后的种子播种后置于培养条件为22℃，光照/黑暗=14h/10h的条件下生长，观察新长出的红麻叶片的表型变化，并检测叶片中HcPDS的表达情况，即构建得到红麻HcPDS基因序列沉默体系。

上述HcPDS基因特异性片段在沉默红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS中的应用。

上述一种沉默红麻八氢番茄红素脱氢酶HcPDS基因的VIGS载体在沉默红麻HcPDS基因中的应用。

上述的一种红麻HcPDS基因VIGS沉默体系在沉默红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS中的应用。

上述红麻八氢番茄红素脱氢酶基因（HcPDS， Phytoene desaturase），全长基因序列的获得：在TAIR网站（https://www.arabidopsis.org/）获得拟南芥AtPDS （AT4G14210）基因蛋白质序列。然后，在NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/, Sequence ReadArchive (SRA) 登录号 PRJNA596386），利用红麻优良品种福红952的参考基因组（Zhanget al., 2020, Plant Biotechnology Journal, DOI: 10.1111/pbi.13341），通过BLASTP查找红麻同源基因，获得八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的全长基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

上述HcPDS基因特异性片段的获得：以八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的全长基因序列为模板，设计用于扩增HcPDS基因CDS结构域上的250bp特异性片段的引物HcPDS-F和HcPDS-R；其核苷酸序列分别为：

HcPDS-F：SEQ ID NO.2：5’-GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTCCGTTAATTTTTTGGAGGCTGCT-3’

HcPDS-R：SEQ ID NO.3：5’-GGGGACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCGTAGGCCCCGAAGAATATGTGT-3’

取红麻的幼嫩叶片，用OMEGA试剂盒操作步骤提取RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒操作步骤合成cDNA第一链，于-20℃保存。以cDNA为模板利用设计的特异性引物HcPDS-F和HcPDS-R PCR扩增HcPDS基因特异性片段，其大小为250bp ，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本发明的有益效果为：

(1) 本发明首次构建了红麻HcPDS基因VIGS沉默体系，获得了具有能够使红麻基因沉默的体系。

(2) 本发明通过，并采用烟草脆裂病毒构建红麻HcPDS基因沉默体系，能够在红麻植株内进行系统扩散传播。

(3) 本发明所述沉默体系能够有效降低红麻HcPDS基因的表达水平，叶绿素被漂白。

附图说明：

图1构建重组病毒载体pTRV2-HcPDS农杆菌菌液PCR的琼脂糖凝胶电泳图。M: DNAladder DL2000; 1-6: 农杆菌克隆。

图2沉默载体侵染红麻幼苗后出现的新叶的白化表型形状。

图3实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测红麻HcPDS的沉默效果。CK：空载体pTRV2侵染的红麻苗；HcPDS：重组病毒载体pTRV2-HcPDS侵染的红麻苗。

图4 质粒pTRV2-HcPDS结构图。本发明采用gateway cloning的方法构建载体质粒pTRV2-HcPDS。其中，ccdB为致死基因，Cm为目标基因HcPDS。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明作进一步的说明，其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。

实施例1 红麻HcPDS基因特异性的克隆

（1）HcPDS全长基因序列的获得

首先，在TAIR网站（https://www.arabidopsis.org/）获得拟南芥AtPDS（AT4G14210）基因蛋白质序列。然后，在NCBI网站（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/,Sequence Read Archive (SRA) 登录号 PRJNA596386），利用红麻优良品种福红952的参考基因组（Zhang et al., 2020, Plant Biotechnology Journal, DOI: 10.1111/pbi.13341），通过 BLASTP查找红麻同源基因，获得八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的全长基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

HcPDS基因特异性片段的克隆

以八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS全长基因序列为模板，设计用于扩增HcPDS基因CDS结构域上的250bp特异性片段的引物HcPDS-F和HcPDS-R；其核苷酸序列分别为：

取红麻的幼嫩叶片，在研钵中用液氮冷冻并研磨成粉状，然后用OMEGA试剂盒操作步骤提取RNA，-80℃冻存备用。取出-80℃冻存的RNA，按照TaKaRa反转录试剂盒操作步骤合成cDNA第一链，于-20℃保存。以cDNA为模板利用设计的特异性引物HcPDS-F和HcPDS-R PCR扩增HcPDS基因特异性片段，其大小为250bp ，核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

PCR反应体系为：：cDNA模板2μL、上下特异性游引物各1 .5μL、dNTP(2mM)5μL、10×KOD PCR buffer 5μL、MgSO4(25mM)2μL、KOD Plus 1μL，补ddH₂O至50μL。扩增条件为：94℃变性3min、55℃30s、68℃2min 32个循环、72℃延伸10min。

实施例2 重组病毒载体pTRV2-HcPDS的构建

采用Gateway技术构建载体。其操作步骤如下：

将实施例扩增所得的HcPDS基因特异性片段、载体pDONR207和BP酶按体系混匀后，置于25℃的PCR仪中进行过夜连接。再将得到的连接产物热激转化到DB3.1感受态细胞中，然后涂布在含有50 μg mL^-1的庆大霉素的LB平板上，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养。提取质粒pDONR207-HcPDS后，用pDONR207的通用引物pDONR207-F(SEQ ID NO.5)和pDONR207-R(SEQ ID NO.6) PCR扩增检测。再将质粒pDONR207-HcPDS、载体pTRV2和LR酶按体系混匀后，置于25℃的PCR仪中进行过夜连接。再将得到的连接产物热激转化到TOP10感受态细胞中，然后涂布在含有50 μg mL^-1的卡那霉素的LB平板上，37℃过夜培养，挑取阳性单克隆扩大培养。提取质粒pTRV2-HcPDS，用HcPDS-F(SEQ ID NO.2)和HcPDS-R(SEQ IDNO.3)进行PCR扩增检测，测序验证序列为HcPDS的特异性片段，即HcPDS基因CDS结构域上的250bp大小的片段(SEQ ID NO.4)。将质粒pTRV2-HcPDS（其结果如图4所示）通过冻融法转入GV3101感受态细胞中，经过含有50 μg mL^-1的卡那霉素、50 μg mL^-1的庆大霉素和50 μg mL^-1的利福平的筛选，获得含目标基因片段的农杆菌菌株。

实施例3 红麻HcPDS基因的功能鉴定

(1) 重组病毒载体转化农杆菌

以pTRV1 质粒、pTRV2 质粒和pTRV2-HcPDS重组病毒载体分别转化农杆菌GV3101，挑取新鲜培养转化子单菌落（图1）, 分别接种到1 mLLB 液体培养基(Kan, 50 μg mL^-1;Gen, 50 μg mL^-1;Rif, 50 μg mL^-1)中,28℃ 180 转 min^-1 培养24 h; 然后转入150 mLLB 液体培养基 (Kan, 50 μg mL^–1; Gen, 50 μg mL^–1;Rif, 50 μg mL^–1)中,28℃ 180 转min^-1 培养12 h; 28℃ 5000rpm 离心10 min 收集菌体细胞, 以适当体积的重悬液(10mmol L^-1 MgCl₂, 10 mmol L^-1 MES 以及200 μmol L^-1 乙酰丁香酮) 重悬至终浓度为OD₆₀₀=1.5; 将重悬液于室温下静置3 h, 将携带有pTRV1载体的农杆菌GV3101菌液分别与携带pTRV2的农杆菌GV3101菌液和携带pTRV2-HcPDS重组病毒载体的农杆菌GV3101菌液的重悬液按体积比1∶1 混匀制成2种混合菌液, 用于侵染红麻种子。红麻种子在混合菌液中侵泡24h，将红麻种子实验材料置于温度22℃，光/暗周期14 h/10 h 的条件下生长。

侵染后红麻HcPDS基因表达量测定

播种后3周，观察新长出的红麻叶片的表型变化，叶片表型为白色时（图2），取其叶片，用RNA试剂盒提取叶片总RNA，以Actin为内参基因，通过RT-PCR检测被沉默后目标基因的表达量。所用引物为：HcPDS-RT-F(SEQ ID NO.7); HcPDS-RT-R(SEQ ID NO.8); Actin-RT-F(SEQ ID NO.9); Actin-RT-R(SEQ ID NO.10)。红麻叶片中HcPDS基因表达量测定结果见图3，图3结果表明：与对照CK相比，受到携带pTRV2-HcPDS重组病毒载体农杆菌侵染的红麻叶片中HcPDS基因表达量显著降低。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建农林大学

<120> 一种红麻HcPDS基因VIGS沉默体系

<130> 10

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 9773

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

caagccgaaa attagcaacc agccaaaaag acattacaat ggttttattt acgtcatttt 60

cccttgtatt tcggttcggc cgaactctcg tgcattaaaa atagaagcac aacactaact 120

tatatcctcc accacttccc ttggatctgc ccaacccact ttccattctt aatcttaagg 180

taagtcgagt gtttttcttt tttcataact caaaatctta ttttcctttt gttggactgt 240

tactcaatct atttcttcac tttgttcgtg ttcaattggc ttctgcaaca cccttttctc 300

ctcttttcga tgcaagtaat ggtttttttg tgtggctttg tttaggcaaa accaaaaagg 360

gtttcttttg ctttttgttc tttatgttga taaactatca ttacccaatt ctcgtttttg 420

cttatttgca gcatctgcag ttgaatcggg tcatctgagc tttgggattt tggttttgaa 480

gaaaatgagt ctctctggga gtgtttctgc tttgcactta aacttccaaa gcaacaggat 540

gcgcatggga aatgccttgg cttttaaaag tggtgaatcc atgggaaata ccttgagagt 600

tccattaaga aagaggtcaa gtaagggtgc ttgtcctttg caggttggtt ggcgttgatg 660

aatgtttggg taaccttatc cctttgcaat agttgaataa atattttttt tacttttttt 720

ttggttaaaa aaaattatta tgagccaggt agtttgcata gattatccaa ggccagagct 780

tgagaatacc gttaattttt tggaggctgc ttctctatcc gcttctttcc gttctgctcc 840

ccgtccagct aagccattgc aaatcatagt tgctggtgca ggtatcaatt ttctcttatt 900

tcttatatgt gttctcgtca tattttgaga aatccacttt gtgaacattt gcatgcgagc 960

tgaattaagc ttttctaccg ataagaatgt tttggttcct tttttcccag gtttcaagta 1020

tgaataagct ttcatttgag agagaagtga gaatcttcat gctaaaagtt actattagag 1080

tgtaaatata gccctttata cccataattt ttgttccata tatagttttt ctgcatacct 1140

tttacatgta tttttttttg ggaattagtc ttgtaaatgc tatattaggt cactacaggg 1200

ttctatgtat aatccatcgc tggagtttgc tttttctaat agactagact tgttgctttt 1260

gaatttttgc aggtttggct ggtttgtcaa ctgcaaagta tctagcggat gcaggtcata 1320

aaccaatatt attagaagca agagatgttc taggtggaaa ggtttttgca ctactctgtt 1380

ttatagaatt tcagccctct tgatattatt ggatcatctt attcctcatt tctgaaatct 1440

tcttgttcat agcatgaaag cttttcttat gagttcatct ttgatgaaga aaacacaatt 1500

taatggcaag atttgttcaa aggaagcttt agttattttc tgtatggcat gcagcattaa 1560

ataattagtg ttttccatga gaaactaaac tgcgctaagg actgatttga gtttctatat 1620

gtaatgtctt ggatttgctt ttctcatgcc tccaatcaca tgccaagaaa agaaaagaaa 1680

agaaaaggtt tgagttaaat tattgatcta ctaattaaaa tatctttaaa ttcctgctag 1740

taaactttta ggttttagtg tttaacttaa cacgcttacg tatgtagcga tcgaattctc 1800

tgatagtgat ttatgctaga gctttagatg tttggatgat caaatcggga aatgttttta 1860

tgctgagttt cttttacatt tttcctgtca tttcggacat tagagttcgt ttatttttta 1920

aacaggtggc tgcatggaaa gatgatgatg gagattggta tgagacaggc ttacacatat 1980

tctgtaagta tagatacatc tttagttttc tcaggcttac atctggtctt cctctttaca 2040

tttttgacgg ttgtagttaa attcatttaa ttttaatttt atcatcctct tctttagcac 2100

ttgaacgctg taaatacata ggcttgtgga gattttggac aatatgatca acctactgtt 2160

ttcttttcat ctcccgacta ttttattgta ccaaactatt acgttgcaac agctttatta 2220

tttttctttc ctttttggca agtcggggcc tacccgaatg tgcaaaactt gtttggagaa 2280

cttggcatca atgatcggct gcagtggaag gagcattcta tgatatttgc aatgccaaat 2340

aagcctggag agttcagtcg atttgatttt ccagaagttc tacctgcacc cataaatggt 2400

aaacaactca ttttcgtgga aactaaatat atgtttaaat aatctatgag actttgtttt 2460

tgcttttaca cagtacgtga caacaaagtt ttaaatgaaa tagaagcacc tacttttatc 2520

tattttaata gttagacgcg tccttgttct aaatagttat ataatgatac aaacaagatt 2580

acttgctctg ccactactct atcttatagg ttggtcaatg tatttgacgt ttattttacc 2640

atttatgcgt atttagtgtg aagggctaat taaaattctt tacatctact agtaaaatat 2700

cttgtagaat tgacatattg gatattacat ttccaacaaa tattatatca ttccagactc 2760

ccaatttgct cacccttttt cccttattag aaaacatatg actcaagcat tgtcatcctc 2820

attgagtcct ggtaaacaca gagtgattag tttggggctt cttatgaccc acctgatatt 2880

caggacagca ctttccattt attgctaatt ggttttaagt tggagattga aaattagcgt 2940

tctgctttct tgaaatcttg aacttgcaga cttctaccat tttttgaact accctttgga 3000

gttatatttg acattagttt gaggcagaac gtcggtttat gaagttctga gcttccataa 3060

aatgataaaa aaatgagtgt ggtttgatat tctgactttc attaacacaa caattatgtt 3120

tcagcatatt aagccaagag cgatttccac tcttctctgt gtatagactt tccaggccct 3180

tcattgagaa aaggagtcat ttgatgtttc taagtatgcc aatgagcatt tcagtgagaa 3240

aagcacataa taaagtgaga aaaggagtct tttgaatttt ttctatagac acttgagttc 3300

caggactacc gcctaaaagt gtaaaaattt acaatttgcg tctacttttc ttgttttttc 3360

atatcaatat aatctgacag ggatatgggc cattttgaag aacaatgaaa tgctgacttg 3420

gcctgagaaa gtgaaatttg caataggact cctacccgca atgcttggtg gacaacctta 3480

tgttgaggcc caagatggtt tatctgttaa agagtggatg gaaaagcagg tgtgcatgtt 3540

attttttggt aaaattctcc cttcaagtct aatagcacat acaaaaatgg tatggctgta 3600

agtttggctt gtttctaagc gaacatagtt catcttgatg aaaaacttcc caaagagaac 3660

attgttagct tgaagtttgt tcatataatg gcaattaatt tattgtcctg ttgttgagtg 3720

cacttatggg ttacagaatt ttaagcctgt tacagacaca cgatgcttta tttgcttgac 3780

ataagagcac atgatagagt aacaatctta catctgggtt tgtttggagt cacttggagt 3840

ccctgaggtg tcttttttcc tttttttttt tgctttattc ataatattat aagtgtgcat 3900

gtctgtccat tgattagtgt tggtgcttca tttttattga gtacaacatg aaacatcata 3960

ttgcaaaact tctaggtggg aggagagtat tgctgaaggc ttcttggaaa tggaaaaaag 4020

aagaggaagg gggagaggga gaggggtgaa tttctggaat tctgttacaa aagaaaattt 4080

tagaaaccaa gttatcatgt gcagagttaa tttttactag actgaacttt tgtgaagcac 4140

tgcaaagtta tcagttaatg tatgcaatat cctcagaata catttacata gtgccaatgt 4200

ctcgttgtta agaatatggt atggattgca ttcttaggaa aaacttgtta taggattgaa 4260

gatgatgaaa attggtttta ttattatttt tctttggcag ggcgtacctg atcgtgtgac 4320

tgaggaggtg tttattgcca tgtcaaaggc tctgaacttc attaaccctg atgaactttc 4380

aatgcagtgt atattgattg ctctcaatcg ttttcttcag gtatggttcc ctgtttgctt 4440

cagtcaattt gattttggca aactggatat tctccagtca atttatgatc acatgtgtct 4500

tgtaactctg acacactagt ctcgaagcat ctcaaggcag tgatgctttt gtagtttgta 4560

ctgcaagtat ggtttgtata atatatcact gttggatagt catgttcatt catatatata 4620

cattgaatgt tatagaaaat agaaggaaaa caaagtatat aacattacaa ttgcttggta 4680

agaattatga aaatccacca acaggaaaaa catggatcaa agatggcatt cttggatgga 4740

aaccctccag agaggctttg catgccgatc gttaatcata ttgaatcact gggtggtgag 4800

gtccggctta actcacgaat aaagaaaata gagctcaacg atgatggaac tgtgaagagt 4860

tttcttctaa ataatggcag tacaattgaa ggagatgctt atgtaattgc aactcctggt 4920

attgtctatt tcctattgaa ctatttagct tacagggtga ccatattctc taatattaac 4980

tcatggattt tgaacttttc agttgatgtc ttcaagttac ttttgcctga agactggaga 5040

gagatttcat acttcaagaa attagagaag ttagttggag ttccagttat caacgttcac 5100

atctggttag taacaaattc tattttttgt tcggacaact tattgatact gcactggtct 5160

gtaacttttc ccctctactt tttttctaaa tctttgcact tcagaaatat gtcatttaat 5220

ttacatccca ttgactttta cacctttttt gaactttgaa ccgttggatg agggtaataa 5280

atagaacatt aaaacaatgc tggacaaatg aagggattgt ataaattgtt cagcctttca 5340

ctccatttac attgtgttca ttggacatgc cctctaagca aaaaagcagg cttattgacc 5400

atgtcctgac tctctagggc ttcctacact ctcctttctc cacttctaga ctgttttaga 5460

ggaggacgtg tgtgtttcct attgttttta tgtggtacaa ttgtgttaat aacatattgg 5520

catcaaagca acattataag ctttgggctt tagttgaaac cccataggta taccattatt 5580

ttctcattta gaagggataa acaaagggtg gaatatttga ggtacgcaga aaagggtagt 5640

tcgtttgagg ttatctctaa aagtgtagtc ttaggatatg aaacattcaa ataaacttgt 5700

tatccttatc ctatttcttt ttgaattagt agtttgaatt tcataagttg ttttatcttt 5760

acctctataa ttagaggttt ctatcaataa atcaacagag ccatttcatt aaccttccat 5820

tgcttcaatc tggtatcaaa gccctctgtt aagccacatg gttctcaaac ttggcctact 5880

cgtagtttct tacaattttg ctcaaataag caaatcctgg ggccatcaca ttcccacaat 5940

ttatctgtca gctggaataa caccagtttt tgtttatcaa agatgaccaa ttggctttct 6000

ttatcaccaa acaatcatct gctcctatcc actactggtt caatgccgtg agatttgagc 6060

ccgaccattt cagtagtcgg ttgaggggcc tcgcctaatg gatgccaaac caagtcttgg 6120

atgtaccaac ccactggttt acttaagcat ttgcttcatg ctgtttgcca tgcgccgctc 6180

aactctgtaa caatattgtc accatctgaa tagtctataa aagcacaata ttcccgattc 6240

agttctttat tgccataact cacaacgaga gtctttcatc ataacgcctt tagtcgtcaa 6300

atccaccttt tttcctttaa ctgtatgtgc ttcttcatca tcatcaatcc aagattgctg 6360

ctctattaac catcaatctt acgggggcat aatgatatcg tcttagatat gaaacattca 6420

aatattcaaa taaacttgtt aatatccata tcctacttct aaattatttt tttggatcgt 6480

tgttttctta tattttaata gtagtttgaa tttcatgaat tgttctatct ttgcctctat 6540

aaatagaggt ttctatcaat aaattagcgg agccatttca taaccttctg tagataatgg 6600

atattttgtg aagagaatca aatcaaattc tctatgattc ttatgtttta ttgataacat 6660

cagctcctat ttataactta caatagagcc taatctaagg aaaaattccc agaaaatcag 6720

caactatatc tgaatctatt acaccaattc aacacctatt tatcctaaaa atcagcagct 6780

aaatatctag gaataaattt cctaactttc tgcaatttca tcaaagtaga gtcttcacat 6840

atcttgtaac ttacagcttc tattacttca aaattctgat ggccaatgta gtttagagac 6900

gaaatgcaag gggggaaatt tgttgagtac tcttcactgc tcataagctg agtgaagctt 6960

aactcaaaga ttggcatggt tgaatttcac atgcaagatg taattgttga gttgagatgg 7020

ctggaagctg tttctttcta aaatgaattg caagaaaaat ggaggattca cgcaccacaa 7080

gttaagacca atgttttaat ctgttagggt tgcattgtct ccaacaccct actctgatag 7140

cattcttttt tgggtttgta gactgcaata taaataactt ttgtgcttgc cgccaaaagt 7200

taatgtgaga gcccatgtga tatgatgtga tgtaaatgat ttcaatttgc aggtttgata 7260

ggaaattgaa gaacacctat gatcatctac tcttcagcag gtcgtcctac ttcatctatt 7320

agtgcttttt tcccatactt tcttgtttgt tatctgcttc tcaatttcta gctttatgaa 7380

tgttccctaa ttgtctttct gaaatattaa attgaaatgg aagtatagta catttggaag 7440

agaaagtttt ttgcttataa gaaagtggaa actctagtgt aggaatattt ttactacctg 7500

cctatggcct gtgcctttga taactaagca aatcagtttc acactattaa gttttcgacc 7560

atttcgttat aatgttttcc atattcaaat aacttgacta atcctaggtg cagctatggg 7620

gtgtgaggag aatggctatc ctccattctc acatcatttg tattaaattt tactcaacag 7680

tttcttttgc tcttttcatt ttacttaaat aaagtgaatt tcattaagat attcaaatat 7740

tttcttttct acttgcagaa gtcccctttt aagtgtttat gccgacatgt ctgtaacatg 7800

caaggtaaag aactccctca actttctttt tattgcattg aagttatgtt ttttaagcca 7860

ccatgttaac aatattttcc tacatatcgg atagaagtga tattatttac tttcttccaa 7920

gaattgttcc gtgtttgata cgatacacgt tcatagtaaa attatgggat gttaaaatca 7980

ttcttttatc tactagtcag aaaaaaaaat gtggagccag aaatgcatca cgataaattt 8040

caaatggcag atgctacgtt tagccttggc agggaaacct tttaaatcgt tggcaacttt 8100

caaatccaaa gaacatttgg aaataaatca gagttttgac tcaaacttcc attaaaagag 8160

tcttaactgt attagcttct tgtctcaggt gtgcttttga tcagtacttg atggtttatt 8220

gtgttatgca ggaatattac aacccgaacc aatccatgtt ggagttagtt tttgccccag 8280

cagaagaatg gattgcacga agtgactcgg aaattattga tgctacaatg acggaacttg 8340

caaagctctt ccctgatgaa atatctgcgg accagagtaa agcaaagatc ataaagtacc 8400

atattgttaa aacaccaagg ttagactgag tgcattctct ggaatccctg ttcatacttt 8460

tctttctatt actttttaaa atcaaaattc ttgccatgac tgaaaatttt atggttgcag 8520

cgggtttccc ttatattcat atagtgattc atcaaagagt ataattgtgc tacaaagtac 8580

aaacatgtaa tataaatatt tatttcaaat gtttaatgga tgctatcctg aacaaacttt 8640

cagacaatct taaacaggat ttcagtataa atacatgcat atgtgtggac agtagaccta 8700

ttttaaatgg attgcagttc ttatatcaat ttaagtttat aacttggtca gtagattact 8760

taatgaaact aaaggctaat tatcatttca gatctgtata taaaactgtg ccaaattgtg 8820

aaccatgccg tcccttgcaa agatctccga tacaggggtt ctatctagca ggtgactaca 8880

caaagcaaaa gtatttagct tcaatggaag gtgctgtcct ctcagggaag ctttgtgctc 8940

agtctattgt acaggtacat tttgcattca ttttctgtac cgtttttctg cataagttca 9000

aattacaagt tgtcttagat gcccaactcg ttgccatgta ccgtgctagg agtttgtaaa 9060

ggtggcaatg agcccatgct tacaagttac tataggacca tgagaatgga ttcatcagtt 9120

tcgttttata ttaacagtac tttttggagc atctggtgtg atctcatggt agtatctgtt 9180

tgtaacagca gttctaacgt attgaaatat gcaggattat gagttgcttt gtagtatggg 9240

acaaagaaag ttgactggag caagcattcg ctgatgttct ttaagttgaa agtaagcgat 9300

ttacgtgtta caaaggatca tctgcaaatc aattgtttaa ggctaatagg tgagtgtggt 9360

ctttttccat tctatatgct gtatgcctca tggccctttt aaatctgtaa catgtgcatc 9420

agaaattgag tataaaattc tattaatgga atatatatga tcttcattat cttgttgatt 9480

ttttattttt attttatata agagaagaaa ggaatctata tatcttcatc attctaagct 9540

actgaggagt gaatgagata tcatcaggac tcatcataat cagctattct gtaggatgca 9600

tttgctatct ttttttggtg aacaaattaa gatagaaaca tcaggttcat tgatattgca 9660

atttgcaaat tgcaatccct aacttgtatg tttgactccc tcgagaatat aaattacgtg 9720

acacattact gggaatattt ttgaaatgta atgttaatgt taatgcatta ctg 9773

<210> 2

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggctt ccgttaattt tttggaggct gct 53

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggggaccact ttgtacaaga aagctgggtc gtaggccccg aagaatatgt gt 52

<210> 4

<211> 250

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgttaatttt ttggaggctg cttctctatc cgcttctttc cgttctgctc cccgtccagc 60

taagccattg caaatcatag ttgctggtgc aggtttggct ggtttgtcaa ctgcaaagta 120

tctagcggat gcaggtcata aaccaatatt attagaagca agagatgttc taggtggaaa 180

ggtggctgca tggaaagatg atgatggaga ttggtatgag acaggcttac acatattctt 240

cggggcctac 250

<210> 5

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcgcgttaac gctagcatgg atctc 25

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

gtaacatcag agattttgag acac 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ttctctatcc gcttctttcc gttc 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

agcctgtctc ataccaatct ccat 24

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttgcagaccg tatgagcaag 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

atcctccgat ccagacactg 20

Claims

1.一种红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS，其特征在于：其全长基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.一种用于沉默如权利要求1所述红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的HcPDS基因特异性片段，其特征在于：所述HcPDS基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.一种沉默如权利要求1所述红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的VIGS载体，其特征在于：利用gateway重组克隆技术将HcPDS基因特异性片段连接至VIGS病毒骨架载体pTRV2中，构建获得重组病毒载体pTRV2-HcPDS；所述HcPDS基因特异性片段的核苷酸序列如SEQID NO.4所示。

4.一种如权利要求1所述红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的VIGS沉默体系的构建方法，包括以下步骤：

(1)通过冻融法将重组病毒载体pTRV2- HcPDS转化到农杆菌GV3101感受态细胞，PCR鉴定阳性；所述重组病毒载体pTRV2-HcPDS是利用gateway重组克隆技术将HcPDS基因特异性片段连接至VIGS病毒骨架载体pTRV2中，构建获得重组病毒载体pTRV2-HcPDS；所述HcPDS基因特异性片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

(3)通过浸泡法将红麻种子在步骤（2）的混合菌液中浸泡24h；

(4)检测：将浸泡后的种子播种后置于培养温度为22℃，光照/黑暗=14h/10h的条件下生长，观察新长出的红麻叶片的表型变化，并检测叶片中八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的表达情况，即构建得到红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS沉默体系。

5.如权利要求2所述的HcPDS基因特异性片段在沉默红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS中的应用；所述红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.如权利要求3所述的一种沉默红麻八氢番茄红素脱氢酶HcPDS基因的VIGS载体在沉默红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS中的应用；所述红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.利用权利要求4所述的构建方法获得的沉默体系在沉默红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS中的应用；所述红麻八氢番茄红素脱氢酶基因HcPDS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。