CN107338266A - 一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系及其构建方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系及其构建方法和应用，所述沉默体系具有如SEQ ID NO.1所示的干扰片段基因序列。本发明首次实现桑树MmPDS基因VIGS沉默体系的构建，获得了具有能够使桑树MmPDS基因沉默的体系；本发明通过在特异性引物中引入Xba I酶切位点和BamH I酶切位点，并采用烟草脆裂病毒TRV构建的桑树MmPDS基因沉默体系，能够在桑树植株内进行系统扩散转播；本发明所述沉默体系能够有效降低桑树MmPDS基因的表达水平，叶绿素被漂白。

Description

一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系及其构建方法和 应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及桑树基因工程领域，具体为一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系及其构建方法和应用。
背景技术
病毒诱导的基因沉默(VIGS)现已被开发为快速鉴定植物基因功能的一种反向遗传学新技术，至今已经建立了以RNA病毒、DNA病毒、卫星病毒和DNA卫星分子为载体的VIGS体系。与基因敲除、转基因、突变体筛选等植物转基因技术相比，VIGS无需构建转基因植株，具有周期短、操作简便、获得表型快速、成本低等优点，目前，这种反向遗传学新技术已广泛应用于与植物抗病、逆境胁迫、细胞信号转导以及生长发育等相关基因功能的研究，在植物功能基因组学的研究中发挥重要作用。桑树等林木植物往往童期长，遗传转化困难，制约了基因功能研究的进展，而VIGS技术则有望克服上述瓶颈从而大大促进相关基因的功能鉴定。
在不同的植物中建立VIGS体系，一般选用八氢番茄红素脱氢酶(phytoenedesaturase,PDS)基因作为报告基因。MmPDS是桑树中类胡萝卜素合成途径的限速酶基因，主要在叶片、茎中表达，当类胡萝卜素合成受阻时，桑树叶片会出现光漂白症状，表型肉眼容易观测。本发明构建了携带MmPDS干扰片段的烟草脆裂病毒重组载体，通过农杆菌成功侵染桑树，建立桑树高效VIGS体系，为桑树功能基因组学研究提供技术支撑。
发明内容
解决的技术问题：为了克服现有技术的缺陷，实现简单、快速、高通量分析、鉴定桑树MmPDS基因，本发明提供了一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系及其构建方法和应用。
技术方案：一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系，所述沉默体系具有如SEQ IDNO.1所示的基因序列。
一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系的构建方法，包括以下步骤：
(1)提取桑树种子萌发幼苗的RNA，反转录获得桑树cDNA；
(2)采用引入Xba I酶切位点和BamH I酶切位点的特异性引物进行桑树cDNA片段PCR扩增，纯化获得桑树MmPDS基因干扰片段；
(3)利用VIGS病毒载体构建含有桑树MmPDS基因的重组质粒，转化成功后，即构建得到具有SEQ ID NO.1所示的基因序列沉默体系。
优选的，所述特异性引物由以下步骤得到：将桑树MmPDS基因、枣树PDS基因、牛奶子PDS基因进行序列比对，选取三者同源性较高的片段设计引物。
优选的，所述特异性引物的序列为SEQ ID NO.2～3：
MmPDS-F2:CGGGATCCAACTTGTTTGGAGAGCTTGG；
MmPDS-R2:GCTCTAGACTTTGACATGGCAATAAACAC。
优选的，所述VIGS病毒载体为烟草脆裂病毒TRV。
所述的VIGS沉默体系在鉴定桑树MmPDS基因中的应用。
优选的，鉴定桑树MmPDS基因包括以下步骤：
(1)通过冻融法将重组病毒载体pTRV2-MmPDS转化到农杆菌感受态细胞，PCR鉴定阳性；
(2)取鉴定为阳性的菌液，注射桑树子叶背面；
(3)将注射后的植株采用水培方式进行培养，并观察其表型变化。
进一步的，所述水培条件为黑暗培养1天后转入光照:黑暗＝16h:8h。
有益效果：(1)本发明首次实现桑树MmPDS基因VIGS沉默体系的构建，获得了具有能够使桑树MmPDS基因沉默的体系；(2)本发明通过在特异性引物中引入Xba I酶切位点和BamH I酶切位点，并采用烟草脆裂病毒构建的桑树MmPDS基因沉默体系，能够在桑树植株内进行系统扩散传播；(3)本发明所述沉默体系能够有效降低桑树MmPDS基因的表达水平，叶绿素被漂白。
附图说明
图1是本发明实施例1中PCR扩增的MmPDS基因干扰片段的琼脂糖凝胶电泳图；
图2是本发明实施例2中构建的重组病毒载体pTRV2-MmPDS农杆菌菌液PCR的琼脂糖凝胶电泳图；
图3是本发明实施例2将沉默载体侵染桑树后出现的叶片白化表型形状，其中A、B为试验组植株，C为对照组植株；
图4是本发明实施例2检测侵染植株内的病毒表达结果的琼脂糖凝胶电泳图；
图5是本发明实施例2采用qRT-PCR检测桑树MmPDS沉默效果。
具体实施方式
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
实施例1沉默体系构建
1MmPDS基因干扰片段的获得
1.1设计引物
将桑树MmPDS基因(NCBI登录号：XM_010102809.1)、枣树PDS基因(NCBI登录号：XM_016031629.1)、牛奶子PDS基因(NCBI登录号：GQ254067.1)进行序列比对，选取三者同源性较高的片段设计引物，在上游引物上添加Xba I酶切位点，在下游引物上添加和BamH I酶切位点，添加后得到引物如下所示SEQ ID NO.2～3：
MmPDS-F2:CGGGATCCAACTTGTTTGGAGAGCTTGG；
MmPDS-R2:GCTCTAGACTTTGACATGGCAATAAACAC。
1.2干扰片段克隆
使用Takara试剂盒提取桑树嫩叶RNA，提取步骤按照试剂盒说明书进行，电泳检测RNA条带完整；并按照Takara反转录试剂盒说明书将RNA反转录成cDNA。以桑树cDNA为模板，利用MmPDS-F2/R2为引物进行PCR扩增，测序得到346bp的片段(见图1所示)，其中，PCR酶使用Takara公司生产的Ex Taq，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火35s，72℃延伸45s，37个循环；72℃复性5min；4℃保存。使用Takara PCR产物纯化试剂盒纯化回收PCR产物，得到桑树MmPDS基因干扰片段，即目的基因，纯化方法参照试剂盒说明书。
2重组病毒载体的构建
本发明使用的VIGS病毒载体为烟草花叶病毒TRV，该病毒为RNA病毒，具有两条RNA链，RNA1和RNA2，分别构建在两个质粒上：pTRV-RNA1和pTRV-RNA2，用于沉默的片段构建在RNA2链上。
具体实施方法如下：
使用Takara公司生产的限制性内切酶Xba I和BamH I同时对步骤1.2获得的目的基因干扰片段产物和载体骨架pTRV-RNA2进行双酶切，酶切体系50μL，酶切温度37℃，时间60min，对目的基因干扰片段酶切产物进行纯化处理，对质粒使用Takara胶回收试剂盒切胶回收载体片段，方法参照试剂盒说明书。然后使用Takara T4连接酶连接载体和干扰片段，方法参照试剂盒说明书，反应体系：20μL，连接温度16℃，连接时间8h，得到连接产物。取5μL连接产物转化大肠杆菌(DH5α，天根公司)，菌液PCR鉴定阳性克隆后，提取质粒测序验证，得到连接成功的重组病毒载体，并命名为pTRV2-MmPDS，得到沉默体系。
实施例2桑树MmPDS基因的鉴定
1重组病毒载体转化农杆菌
将实施例1制备的沉默体系，即实施例1中步骤2构建的重组病毒载体pTRV2-MmPDS、pTRV1和pTRV2(阴性对照)各lμg分别加入到0.1mL农杆菌感受态细胞中，冰浴30min，使重组病毒载体进入细胞中，再将其放入液氮中速冻1min，立即37℃水浴5min，使细胞融化，再向细胞中加800μL无抗生素的YEB液体培养基，28℃培养2-3h，转速为150r/min。然后在4000r/min转速条件下离心1min，弃去上清，使其重新悬浮于100μL YEB液体培养基中，得到质粒转化后的农杆菌菌液。取100μL菌液均匀地涂于含50mg/L卡那霉素(Kan，Sigma)25mg/L庆大霉素(Gm，Sigma)、和25mg/L利福平(Rif，Sigma)的抗性YEB平板上，28℃培养2天，挑取单菌落接种到1mL相应抗性液体YEB培养基中，28℃震荡培养过夜，对其进行PCR鉴定阳性克隆菌液后(见图2所示)，得到GV3101-pTRV2-MmPDS农杆菌菌液，及GV3101-pTRV2农杆菌菌液，将其直接接种至新鲜YEB液体培养基中，准备侵染。
2侵染植株
2.1材料准备
将桑树种子洒在营养土中，上面再覆盖薄薄一层营养土，浇足水，放置于光照培养箱中，培养条件为：光照16h，25℃，黑暗8h，22℃。发芽后7-10天，等两片子叶完全展开后，可用于侵染实验。
2.2侵染菌液准备
将小量摇好且鉴定正确的农杆菌液GV3101-pTRV2-MmPDS和GV3101-pTRV2接到25mL含有50mg/L Kan、25mg/L Gm和25mg/L Rif抗生素的YEP液体培养基中28℃过夜培养。第二天早上，将摇好的菌液倒入50mL离心管中，室温7000rmp离心5min，弃上清，用重悬液悬浮菌体，调整OD600＝1.0左右。(重悬液终浓度10mM MgCl2，10mM MES，150μM AS)，涡旋混匀后，室温静置3h以上。
2.3菌液注射植株
取等体积的GV3101-TRV1载体农杆菌重悬液与带有目的基因的重组病毒载体GV3101-pTRV2-MmPDS农杆菌重悬液充分混合，进行注射感染。用一次性1mL注射器(不带针头)吸取适量感染菌液，先轻微摩擦制造伤口，再将菌液通过压迫直接注射植物叶片(子叶)背面，使菌液在叶片中扩散。注射GV3101-pTRV2菌液的设为阴性对照组，注射不含菌液的重悬液设为空白对照组。将注射感染后的植株培养在铁盘中，浇足水，黑暗放置一天后转入16h：8h的光照：黑暗条件，观察桑树叶片表型变化。
3表型观察及检测
3.1白化表型
叶片经注射侵染后可观察到明显的圆形痕迹，叶面充满液体。侵染15d后，发现接种重组GV3101-pTRV2-MmPDS病毒载体的实验组开始出现叶片白化症状，侵染20d后，白化现象沿叶脉向四周逐渐系统扩散，说明沉默载体开始发挥作用，如图3A和3B所示，而阴性对照组和空白对照组没有任何变化，见图3C、3D所示，叶片没有出现白化现象。
3.2病毒检测
取空白对照组叶片，编为WT组，取空载阴性对照组叶片，变为CK组，取实验组白化叶片编为W(White)组，每组设3个重复，使用Takara RNA提取试剂盒分别提取WT组、CK组和W组叶片的RNA，并反转录成cDNA，方法参照试剂盒说明书。设计特异引物用于PCR检测病毒，引物如下SEQ ID NO.4～5：
TRVCPF：CGGTCCTGCTGACTTGAT；
TRVCPR：TCCCTTGGTTCGTCGTAA。
PCR反应程序：94℃，5min；94℃，30s，54℃，35s，72℃，40s，37cycles；72℃，5min；4℃，∞。
检测结果如图4，没有注射菌液的WT1-3都没有检测到病毒条带，注射了GV3101-pTRV2菌液的CK1-3和注射了GV3101-pTRV2-MmPDS的W1-3都能检测到病毒条带，说明该病毒载体确实在桑树实验组里进行了繁殖传播。
3.3病毒载体沉默效果检测
为了检测病毒载体的沉默效果，采用荧光定量PCR的实验来检测，设计引物qMmPDSF/R用于检测桑树MmPDS的表达量，来反映重组病毒载体的沉默效果，内参使用β-actin，引物序列如下SEQ ID NO.6～9：
qMmPDS F：CTGACATGGCCAGAGAAAGT；
qMmPDS R：CGATCAGGTATGCCCTGTTT；
β-actin F：AGCAACTGGGATGACATGGAGA；
β-actin R：CGACCACTGGCGTAAAGGGA。
荧光定量仪器为96Real-Time PCR System(Roche,USA)，酶为FastStart Universal SYBR Green Master Mix kit(Roche,USA)，方法参照试剂盒说明书。
检测结果如图5所示，由图5可以看出桑树实验组的MmPDS基因的表达量相对于阴性对照组极显著降低，表明桑树MmPDS的表达被抑制，结合桑树实验组的表型，说明本实验里克隆的桑树MmPDS基因是正确的，本体系确实可以用于鉴定桑树的基因功能。
SEQUENCE LISTING
<110> 江苏科技大学
<120> 一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系及其构建方法和应用
<130>
<160> 9
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 330
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
aacttgtttg gagagcttgg aattgatgat cggttacaat ggaaagagca ttctatgata 60
tttgcaatgc ctaacaaacc tggagagttc agccgatttg atttccctga agtgctgcca 120
gcacccttaa atggaatatg ggccatctta aggaacaatg agatgctgac atggccagag 180
aaagtcaagt ttgcaatcgg actgctgcca gcaatacttg gtggccagcc ttatgttgaa 240
gcacaagatg gtttaaccgt taaagaatgg atgataaaac agggcatacc tgatcgcgta 300
actgatgagg tgtttattgc catgtcaaag 330
<210> 2
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgggatccaa cttgtttgga gagcttgg 28
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
gctctagact ttgacatggc aataaacac 29
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cggtcctgct gacttgat 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tcccttggtt cgtcgtaa 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
ctgacatggc cagagaaagt 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cgatcaggta tgccctgttt 20
<210> 8
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
agcaactggg atgacatgga ga 22
<210> 9
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
cgaccactgg cgtaaaggga 20

Claims (8)

1.一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系，其特征在于，所述沉默体系具有如SEQ IDNO.1所示的基因序列。
2.权利要求1所述的一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)提取桑树种子萌发幼苗的RNA，反转录获得桑树cDNA；
(2)采用引入Xba I酶切位点和BamH I酶切位点的特异性引物进行桑树cDNA片段PCR扩增，纯化获得桑树MmPDS基因干扰片段；
(3)利用VIGS病毒载体构建含有桑树MmPDS基因的重组质粒，转化成功后，即构建得到具有SEQ ID NO.1所示的基因序列沉默体系。
3.根据权利要求2所述的一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，所述特异性引物由以下步骤得到：将桑树MmPDS基因、枣树PDS基因、牛奶子PDS基因进行序列比对，选取三者同源性较高的片段设计引物。
4.根据权利要求2或3所述的一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，所述特异性引物的序列为SEQ ID NO.2～3：
MmPDS-F2:CGGGATCCAACTTGTTTGGAGAGCTTGG；
MmPDS-R2:GCTCTAGACTTTGACATGGCAATAAACAC。
5.根据权利要求2所述的一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系的构建方法，其特征在于，所述VIGS病毒载体为烟草脆裂病毒TRV。
6.权利要求1所述的VIGS沉默体系在鉴定桑树MmPDS基因中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，鉴定桑树MmPDS基因包括以下步骤：
(1)通过冻融法将重组病毒载体pTRV2-MmPDS转化到农杆菌感受态细胞，PCR鉴定阳性；
(2)取鉴定为阳性的菌液，注射桑树子叶背面；
(3)将注射后的植株采用水培方式进行培养，并观察其表型变化。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述水培条件为黑暗培养1天后转入光照:黑暗＝16h:8h。
CN201710481375.8A 2017-06-22 2017-06-22 一种鉴定桑树MmPDS基因的VIGS沉默体系及其构建方法和应用 Active CN107338266B (zh)

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Application publication date: 20171110

Assignee: Zhenjiang Zhongnong Sericulture Technology Service Co., Ltd

Assignor: JIANGSU University OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

Contract record no.: X2020980007226

Denomination of invention: A VIGS silencing system for identification of MMPDS gene in mulberry and its construction method and Application

Granted publication date: 20200331

License type: Common License

Record date: 20201029

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Assignee: Zhenjiang Zhongnong Sericulture Technology Service Co., Ltd

Assignor: JIANGSU University OF SCIENCE AND TECHNOLOGY

Contract record no.: X2020980007226

Date of cancellation: 20201223