CN108841843B - 一种颠茄AbPDS基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种颠茄AbPDS基因及其应用，AbPDS基因的DNA序列为SEQ ID NO.1。本发明首次克隆了颠茄AbPDS基因并实现了颠茄VIGS体系的构建。本发明通过在特异性引物中引入SacI和KpnI酶切位点，在烟草脆裂病毒TRV系统中插入来源于颠茄AbPDS基因序列770‑bp长度的片段。通过VIGS技术该片段实现了AbPDS基因表达沉默，从而抑制了颠茄叶绿素的生物合成，最终导致了叶片出现漂白现象。本发明首次克隆AbPDS基因并建立了颠茄的VIGS体系，为研究颠茄基因的生物学功能提供了可靠的技术保障。

Description

一种颠茄AbPDS基因及其应用

技术领域

本发明属于VIGS技术体系领域，具体是一种颠茄AbPDS基因及其在构建VIGS体系中的应用。

背景技术

病毒诱导的基因沉默(Virus Induced Gene Silencing,VIGS)能够诱导靶基因瞬时沉默从而应用于植物基因功能的研究，然而目前在颠茄上的VIGS的体系尚未建立。病毒诱导的基因沉默目前已经广泛应用于植物基因功能的研究。该技术主要是以植物病毒为载体，导入靶基因的部分序列后，采用注射含病毒载体的菌体入植物细胞后，导入序列会与靶基因mRNA形成双链最终导致靶基因降解，从而起到了基因沉默的作用。

发明内容

鉴于此，本发明解决的技术问题是，本发明提供了一种在颠茄中实现瞬时基因沉默的VIGS体系，为研究颠茄基因功能提供了重要的技术支持。

本发明在传统中药材颠茄中建立了病毒诱导的VIGS体系。从颠茄中克隆了编码八氢番茄红素脱氢酶(Phytoene Desaturase,PDS)基因，通过VIGS技术在颠茄中实现了PDS基因表达沉默，从而抑制了颠茄叶绿素的生物合成，最终导致了叶片出现漂白现象。本发明首次克隆AbPDS基因并建立了颠茄的VIGS体系，为研究颠茄基因的生物学功能提供了可靠的技术保障。

本发明采用的技术方案是：一种颠茄AbPDS基因，其DNA序列为SEQ ID NO.1。

上述颠茄AbPDS基因，由DNA序列为SEQ ID NO.2和DNA序列为SEQ ID NO.3的上游引物和下游引物，进行PCR扩增获得。

PCR扩增的体系如下：

PCR程序为：95℃,3min→(95℃，变性30s→58℃，退火30s→72℃，延伸1min)×35循环→72℃，5min。

本发明所述AbPDS基因抑制叶绿素合成，用于构建VIGS体系。所述VIGS体系的构建步骤如下：

选择AbPDS基因中的770-bp片段克隆至pTRV2中，构建pTRV2-AbPDS重组质粒；pTRV2-AbPDS重组质粒是将所述AbPDS基因中的770-bp片段和TRV2质粒分别用SacI和KpnI进行双酶切；再通过T4连接酶进行连接获得的。

分别将TRV1以及TRV2-AbPDS重组质粒转化进入农杆菌GV3101；

用TRV1+TRV2-AbPDS转化的农杆菌GV3101注射两周大颠茄幼苗，暗培养48h后移入光照培养，10d左右发现光漂白现象；

用分光光度法测定VIGS介导的AbPDS沉默颠茄叶片的叶绿素含量，并用qPCR分析AbPDS基因的表达水平验证VIGS效果。

本发明获得了颠茄AbPDS基因，验证了AbPDS基因的沉默具有抑制叶绿素合成的作用，为颠茄VIGS体系的建立提供了重要的对照基因；颠茄VIGS体系的构建有助于研究颠茄基因的生物学功能。

附图说明

图1为VIGS沉默AbPDS导致的漂白结果图；

图2为颠茄叶绿素含量图；

图3为AbPDS基因表达水平示意图。

具体实施方式

1.利用PCR技术克隆获得AbPDS基因全长(编码区)，DNA序列为SEQ NO.1；如下所示：

其中下划线部分为本发明所选择的插入片段，用于构建pTRV2-AbPDS载体。

PCR反应中所用的引物：

序列为SEQ ID NO.2的上游引物(F-AbPDS CDS)：

5-ATGTGTCATAAGTTAAAGATTC-3

序列为SEQ ID NO.3的下游引物(R-AbPDS CDS)：

5-CTAAATTACACTTGCTTCTGCC-3

PCR步骤包括：

PCR体系如下：

PCR程序：95℃,3min→(95℃，变性30s→58℃，退火30s→72℃，延伸1min)×35循环→72℃，5min。

2.选择AbPDS基因中的770-bp片段克隆至VIGS载体pTRV2中，构建pTRV2-AbPDS沉默载体并转入农杆菌GV3101；

插入片段，以高保真酶扩增获得的AbPDS编码序列为模板，采用下列引物进行PCR扩增：

F-AbPDS-TRV2-SacI：

5-GCGAGCTCTCAATGCAGTGCATCTTGATCGC-3

R-AbPDS-TRV2-KpnI：

5-GCGGTACCAAGACAGCACCTTCCATTGAGGC-3

将获得的770-bp片段和TRV2质粒分别用SacI和KpnI进行双酶切；再通过T4连接酶进行连接获得pTRV2-AbPDS重组质粒

TRV1质粒编码了病毒的复制蛋白、运动蛋白和转运因子，是VIGS体系中不可或缺的质粒，在这个质粒的作用下，烟草脆裂病毒能够侵染植株。

分别将TRV1，TRV2以及TRV2-AbPDS重组质粒转化进入农杆菌GV3101。

3.用TRV1+TRV2-AbPDS转化的农杆菌GV3101注射两周大颠茄幼苗，暗培养48h后移入光照培养，10d左右发现光漂白现象；

在实验中分别设置有对照组(TRV1+TRV2)以及实验组(TRV1+TRV2-AbPDS)。对照组结果如图1左图所示，实验组结果如图1右图所示。

4.用分光光度法测定VIGS介导的AbPDS沉默颠茄叶片的叶绿素含量，并用qPCR分析AbPDS基因的表达水平验证VIGS效果。

分光光度法测定叶绿素的方法如下：

色素的提取：剪去新鲜的白化叶片与对照组叶片，除去粗大的叶脉并剪成均一碎块，分别称重0.5g作为实验材料。在研钵中加入丙酮5毫升、少许石英砂、少许碳酸钙，然后研磨成匀浆待用。把匀浆放入离心管中离心，并用80％的丙酮冲洗研钵2次一并倒进离心管离心，4000rpm/6min。待离心后取上清液用80％的丙酮定容到20ml。

OD值的测定：叶绿素a、叶绿素b分别在波长663nm、645nm处有最大吸收值，可采用光度法进行测定叶绿素的含量。取上述叶绿素提取液1毫升，稀释到5毫升，加入到比色皿中测定OD₆₆₃、OD₆₄₅的吸光值。将测定获得的吸光值分别用下列公式进行计算：

ρ_a＝0.0127A₆₆₃-0.00269A₆₄₅

ρ_b＝0.0229A₆₆₃-0.00468A₆₄₅

ρ_T＝ρ_a+ρb

ρ_a：叶绿素a含量；ρ_b：叶绿素b含量；ρ_T：总叶绿素含量。

分别计算出叶绿素a、叶绿素b的含量和总的含量，在计算出每g所含的叶绿素含量。将白化的叶片叶绿素含量与对照组叶片叶绿素的含量进行比对。结果如图2所示，图中(a)表示叶绿素a的含量，(b)表示叶绿素b的含量，(c)表示的是总叶绿素含量。从图中可知在VIGS植株中叶绿素a、叶绿素b和总叶绿素的含量较对照都有显著性地降低。

qPCR方法得到的结果如图3所示。

qPCR引物如下：

采用iQTM5多通道实时监测系统(Bio-Rad,USA)对上述处理样本进行了荧光定量PCR分析。按照

premix ExTaq(宝生物，中国大连)的方案进行如下操作。

在200μl EP管中加入以下反应试剂，正向引物和反向引物序列见上表所示：

反应程序为：95℃，30s；(95℃，5s；各基因最佳退火温度，30s；72℃，20s，检测荧光信号)×40个循环；各个组织的样本分别设3个机械重复1个阴性对照。为了判断荧光定量PCR的扩增是否特异，在上述扩增程序完成后进行融解曲线分析，程序如下：60℃到95℃逐渐升温，每间隔0.5℃读数一次，每次5s，连续记录荧光信号的变化。

SEQUENCE LISTING

<110>重庆科技学院

<120>一种颠茄AbPDS基因及其应用

<160>9

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>1602

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(1602)

<223>AbPDS

<400>1

atgtgtcata agttaaagat tcgtactccc tatgccacga ccagaagatt ggcaaaggaa 60

ttccatcctt taaaggtagt ttgcgttgat tatccaagac cagagctaga caatacagtt 120

aactatttgg aggctgcatt cttatcatca tcattcggta ctcctccatg cccaactaaa 180

cctttggaga ttgttattgc tggtgcaggt ttgggtggtt tgtctacagc aaaatatttg 240

gcagatgctg gtcacaaacc aatactgcta gaggcaaggg atgttttagg tggaaaggta 300

gctgcatgga aagatgacga tggagattgg tacgagactg gtttgcacat attctttggg 360

gcttacccaa atatgcagaa cctgtttgga gaactaggga ttaacgatcg attgcagtgg 420

aaggaacatt caatgatatt tgcaatgcca aacaagccag gagaattcag ccgctttgat 480

ttccccgaag ctttacctgc tcctttaaac ggaattttgg ctatcctaaa gaacaatgaa 540

atgcttacat ggccagagaa agtcaaattt gcaattggac tcttgccagc aatgctgggt 600

gggcaatcat atgttgaagc tcaagacggg ataagtgtta aggactggat gagaaaacaa 660

ggtgttccgg atagggtgac agatgaggtg ttcatcgcca tgtcaaaggc acttaacttc 720

ataaaccctg aggagctctc aatgcagtgc atcttgatcg ctttgaacag atttcttcag 780

gagaaacatg gttcaaaaat ggccttttta gatggtagtc ctcctgagcg actttgcatg 840

ccgattgttg aacatatcga gtcaaaaggt ggccaagtca gactgaactc acgaataaaa 900

aagattgagc tgaatgagga tggaagtgtc aagtgtttta tactgaataa tggtagtaca 960

attgagggag atgctttcgt gtttgccact ccagtggata ttttcaagct tcttttgcct 1020

gaagagtgga aagagatccc atatttccaa aagttggaga agttagtcgg agtacctgtg 1080

ataaatgtcc atatatggtt tgacagcaaa ctgaagaaca cagaagataa tctgctcttc 1140

agcagaagcc cactgctcag tgtgtatgct gacatgtccg tcacatgtaa ggaatattac 1200

aaccccaatc agtctatgtt ggaattggtt tttgcacctg cagaagagtg gatatctcgt 1260

agtgactcgg aaattattga tgctacaatg aaggaactag caaagctttt ccctgatgaa 1320

atttcggcag atcagagcaa agcaaaaata ttgaagtatc atgttgtcaa aactccaagg 1380

tctgtttata aaactgtgcc aggttgtgaa ccctgtcggc cgttgcaaag atccccaata 1440

gaggggttct atttagctgg tgactacacg aaacagaaat acttggcctc aatggaaggt 1500

gctgtcttag caggaaagct ttgtgcgcaa gctattgtgc aggattacga gttacttgtt 1560

ggccggggcc agaggaagtt ggcagaagca agtgtaattt ag 1602

<210>2

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>F-AbPDS CDS

<400>2

atgtgtcata agttaaagat tc 22

<210>3

<211>22

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(22)

<223>R-AbPDS CDS

<400>3

ctaaattaca cttgcttctg cc 22

<210>4

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(31)

<223>F-AbPDS-TRV2-SacI

<400>4

gcgagctctc aatgcagtgc atcttgatcg c 31

<210>5

<211>31

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(31)

<223>R-AbPDS-TRV2-KpnI

<400>5

gcggtaccaa gacagcacct tccattgagg c 31

<210>6

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>F-qAbPDS

<400>6

aactgtgcca ggttgtgaac 20

<210>7

<211>20

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(20)

<223>R-qAbPDS

<400>7

gcttctgcca acttcctctg 20

<210>8

<211>21

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(21)

<223>F-qAbPGK

<400>8

tcgctcttgg agaaggttga c 21

<210>9

<211>23

<212>DNA

<213>Artificial

<220>

<221>misc_feature

<222>(1)..(23)

<223>R-qAbPGK

<400>9

cttgtccgca atcactacat cag 23

Claims (6)

1.一种颠茄AbPDS基因，其特征在于：所述AbPDS基因的DNA序列为SEQ ID NO.1。

2.一种如权利要求1所述颠茄AbPDS基因，其特征在于：由DNA序列为SEQ ID NO.2和DNA序列为SEQ ID NO.3的上游引物和下游引物，进行PCR扩增获得。

3.根据权利要求2所述颠茄AbPDS基因，其特征在于：所述PCR扩增的体系如下：

2×PrimerSTAR Max Premix 25 μL 10 μM的上游引物 2.0 μL 10 μM的下游引物 2.0 μL 颠茄cDNA 2.0 μL ddH₂O 19.0 μL

PCR程序为：95 °C, 3 min→（95 °C，变性30 s→58 °C，退火30 s→72 °C，延伸1min）×35循环→72 °C，5 min。

4.一种如权利要求1所述颠茄AbPDS基因的应用，其特征在于：构建所述颠茄AbPDS基因的VIGS体系，抑制颠茄叶绿素合成。

5.根据权利要求4所述颠茄AbPDS基因的应用，其特征在于：所述VIGS体系的构建步骤如下：

选择AbPDS基因中的770-bp片段克隆至pTRV2中，构建pTRV2-AbPDS重组质粒；

所述770-bp片段如下划线所示：

721 ATAAACCCTGAGGAGCTCTCAATGCAGTGCATCTTGATCGCTTTGAACAGATTTCTTCAGGAGAAA CATGGTTCAAAAATGGCCTTTTTA

811 GATGGTAGTCCTCCTGAGCGACTTTGCATGCCGATTGTTGAACATATCGAGTCAAAAGGTGGCCAA GTCAGACTGAACTCACGAATAAAA

901 AAGATTGAGCTGAATGAGGATGGAAGTGTCAAGTGTTTTATACTGAATAATGGTAGTACAATTGAG GGAGATGCTTTCGTGTTTGCCACT

991 CCAGTGGATATTTTCAAGCTTCTTTTGCCTGAAGAGTGGAAAGAGATCCCATATTTCCAAAAGTTG GAGAAGTTAGTCGGAGTACCTGTG

1081 ATAAATGTCCATATATGGTTTGACAGCAAACTGAAGAACACAGAAGATAATCTGCTCTTCAGCAG AAGCCCACTGCTCAGTGTGTATGCT

1171 GACATGTCCGTCACATGTAAGGAATATTACAACCCCAATCAGTCTATGTTGGAATTGGTTTTTGC ACCTGCAGAAGAGTGGATATCTCGT

1261 AGTGACTCGGAAATTATTGATGCTACAATGAAGGAACTAGCAAAGCTTTTCCCTGATGAAATTTC GGCAGATCAGAGCAAAGCAAAAATA

1351 TTGAAGTATCATGTTGTCAAAACTCCAAGGTCTGTTTATAAAACTGTGCCAGGTTGTGAACCCTG TCGGCCGTTGCAAAGATCCCCAATA

1441 GAGGGGTTCTATTTAGCTGGTGACTACACGAAACAGAAATACTTGGCCTCAATGGAAGGTGCTGT CTTAGCAGGAAAGCTTTGTGCGCAA

1531 GCTATTGTGCAGGATTACGAGTTACTTGTTGGCCGGGGCCAGAGGAAGTTGGCAGAAGCAAGTGTAATTTAG

分别将pTRV1以及pTRV2-AbPDS重组质粒转化进入农杆菌GV3101；

用pTRV1+pTRV2-AbPDS转化的农杆菌GV3101注射两周大颠茄幼苗，暗培养48h后移入光照培养，10d左右发现光漂白现象；

用分光光度法测定VIGS介导的AbPDS沉默颠茄叶片的叶绿素含量，并用qPCR分析AbPDS基因的表达水平验证VIGS效果。

6.根据权利要求5所述颠茄AbPDS基因的应用，其特征在于：所述pTRV2-AbPDS重组质粒是将所述AbPDS基因中的770-bp片段和pTRV2质粒分别用SacI 和KpnI进行双酶切；再通过T4连接酶进行连接获得的。

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