CN111676238B

CN111676238B - 一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法

Info

Publication number: CN111676238B
Application number: CN202010548746.1A
Authority: CN
Inventors: 潘铖烺; 陈建明
Original assignee: Minjiang University
Current assignee: Minjiang University
Priority date: 2020-06-16
Filing date: 2020-06-16
Publication date: 2022-03-29
Anticipated expiration: 2040-06-16
Also published as: CN111676238A

Abstract

本发明属于基因功能鉴定技术领域，公开了一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法，配制重悬缓冲液，在菌液重悬过程中，重悬液的pH值为5.8‑6.0；重悬pTRV‑KoPDS和pTRV1 2种菌液时，浓度应控制在OD₆₀₀＝1.0，再等量混合菌液，使得pTRV‑KoPDS和pTRV1 2种菌液各自的终浓度在OD₆₀₀＝0.5；结合RT‑qPCR测定KoPDS的表达量，剪取注射侵染区域的叶片，侵染叶片选择顶芽下3‑4片叶；侵染后将秋茄幼苗于28℃温室大棚正常管理，温度不超过30℃。本发明将在红树植物秋茄上实现内源基因的沉默，在秋茄上直接验证基因的功能；对秋茄以及红树植物分子生物学方向具有突破性意义。

Description

一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法

技术领域

本发明属于基因功能鉴定技术领域，尤其涉及一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法。

背景技术

目前，红树林分布在热带亚热带地区的海陆交界处，在生物固碳、维护生物多样性、消减风浪、保护海岸带区域生活生产安全等方面提供了价值巨大的生态服务功能(Lee，et al.2014)。然而随着人类活动的不断干扰，使世界范围内的红树林正以每年1-2％的速度减少(Duke，et al.2007)。因此，开展红树林的保育工作刻不容缓。秋茄(Kandeliaobovata)是我国东南沿海红树林的优势种，对海陆交错带高有机质、低氧以及水淹等多种复杂环境有较强的耐受性(Weng， et al.2012)。解析秋茄对潮间带的适应机制对进一步了解红树植物特殊的生理生态学特性至关重要，同时也对后期红树植物在滨海潮间带的保育工作有重要的指导意义。随着当今科研技术的发展，利用基因组学和转录组学等分子生物学的手段探索植物生理生态相关的现象和问题已成为主流趋势，其不仅能精确地揭示传统植物生理现象背后的分子机制，还能发掘重要的功能基因用于后续的应用研究(Tsai，et al.2018)。但是，对于非模式生物的红树植物而言，其均未有完善的遗传转化系统，对其功能基因的鉴定通常需要借助拟南芥(Hong， et al.2018)、水稻(Prashanth，etal.2008)等模式植物。但不同植物种类间的差异使得外源转化的结果均无法确切体现目的基因在红树植物中的生物学功能。这使得红树植物在分子水平上的研究大大落后于其他模式植物。

病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing，VIGS)是近年来新兴的一种快速检验植物基因功能的反向遗传学技术。烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus，TRV)具有寄主范围广、沉默效率高、持续时间长、引起的病毒症状轻等优点(季娜娜等，2016)。TRV属于RNA病毒，其基因组包含RNA1和RNA2 两条链。RNA1编码RNA依赖型RNA聚合酶(RNAdependent RNA polymerase， RdRp)基因、运动蛋白(movementprotein，Mp)和富含半胱氨酸的蛋白质。 RNA2编码衣壳蛋白(coatprotein，Cp)和克隆目标基因的酶切位点。RNA1和RNA2在介导基因沉默的过程中同时发挥作用构成双元载体(Senthil-Kumar，et al.2014)。现已有不少报道证实TRV-VIGS技术被广泛应用于多种非模式植物的基因功能研究中，例如：桃(Prunuspersica.Batschcultivar“Akatsuki”and “Manami”)果实中类胡萝卜素裂解双加氧酶基因CCD4(Bai，et al.2015)、草莓(Fragaria×ananassa Duch.)八氢番茄红素去饱和酶基因PDS(Tian，et al. 2015)、苹果查尔酮异构酶基因(王丽辉，2014)、樱桃(Prunusavium)P450 单加氧酶基因CYP707A(Li，et al.2015a)、荔枝(Litchi chinensis)类黄酮-3-O- 葡萄糖基转移酶基因LcUFTG(Li，et al.2015b)、辣椒(Capsicumannuum)酰基转移酶3基因AT3(Arce-Rodríguez，et al.2015)、蔊菜(Rorippaindica)1- 脱氧木酮糖-5-磷酸合成酶基因CLA(张怡等，2013)、茄子(Solanum melogena) 甲硫氨酸亚砜还原酶基因SmMsrA(赵祯等，2015)以及甜菜(Bete vulgaris) 八氢番茄红素去饱和酶基因PDS(龚攀等，2015)等等。但对于红树植物而言， TRV-VIGS技术是否适用于功能基因的研究还未知晓，在红树植物中如何构建 TRV-VIGS沉默体系更未见报道。

VIGS的作用机制具体为：当携带植物内源基因片段的重组TRV载体侵染植物后，在RdRp作用下转录形成双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)。作为植物内源基因沉默的关键诱导因子，dsRNA在RNaseIII家族特异性核酸内切酶Dicer类似物的作用下，被切割成21-24核苷酸的小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。siRNA在植物细胞内进一步扩增后，以单链形式与 Agronautel(AGO1)蛋白等结合，形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)。RISC诱导Rnase降解目标基因，从而达到降低目标基因表达量以达到基因沉默的效果。依据该原理，通过基因重组技术将外源基因片段插入TRVRNA2载体的多克隆位点上，获得重组病毒载体。再利用该载体侵染植株，以达到沉默目的基因的效果(闵德栋等，2017)。

TRV-VIGS技术在不同植物中的沉默效率存在较大差异。影响VIGS沉默效率的原因大致有以下几个方面：首先，不同的宿主与VIGS载体的选择直接影响目的基因的沉默效率。例如，在番木瓜(Caricapapaya)中无法利用TRV对目标基因进行沉默，研究表明番木瓜并非TRV的寄主，因此不能以TRV为载体在番木瓜中构建VIGS体系(刘国成，2010)。其次，接种的环境对沉默效率有一定影响。接种后的环境需要满足病毒与植物的互作，让二者协同生长。第三，不同的接种方式也是影响沉默效率的关键。VIGS接种主要有机械接种法、摩擦法、农杆菌介导法以及金属离子轰击法等，其中农杆菌介导的接种使用较广(石嵘，2017)。

然而，在红树植物中，对于VIGS体系的构建条件和沉默效率皆为空白。因此，在红树植物上构建VIGS体系是对红树植物功能基因研究的重要突破。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：目前在红树植物中对于 VIGS体系的构建条件和沉默效率皆为空白。

解决以上问题及缺陷的难度为：红树植物秋茄植株富含单宁等次生代谢物，按普通模式植物所用的VIGS系统，较易引起叶片超敏反应。

解决以上问题及缺陷的意义为：红树植物秋茄为非模式植物，由于无法对内源基因进行原位功能分析，只能通过外源转化来分析基因的功能，这大大限制了红树植物秋茄特殊分子机制的研究。本专利的发明有望在秋茄上实现内源基因的验证，为特殊功能基因的发掘和利用具有重要意义。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法。

本发明是这样实现的，一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法，所述鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法包括：

配制重悬缓冲液，在菌液重悬过程中，重悬液的pH值为5.8-6.0；重悬 pTRV-KoPDS和pTRV12种菌液时，浓度应控制在OD₆₀₀＝1.0，再等量混合菌液，使得pTRV-KoPDS和pTRV12种菌液各自的终浓度在OD₆₀₀＝0.5；

结合RT-qPCR测定KoPDS的表达量，剪取注射侵染区域的叶片，侵染叶片选择顶芽下3-4片叶；侵染后将秋茄幼苗于28℃温室大棚正常管理，温度不超过30℃。

进一步，所述重悬缓冲液的配制包括：MES 195.2mg；MgCl₂·6H₂O 203 mg；ddH₂O定容至100ml后，加入乙酰丁香酮终浓度200μM，用1molNaOH 调整pH至6.0；将重悬菌液放置28℃2-4小时后，等量混合pTRV-KoPDS和pTRV1 菌液，用注射器注射入秋茄的叶片中，7天后观测光漂白现象。

进一步，所述结合RT-qPCR测定KoPDS的表达量，剪取注射侵染区域的叶片，利用EASYspin Plus Complex Plant RNA Kit提取秋茄RNA，并利用PrimeScript^TMRTreagentKitwith gDNAEraser完成反转录；利用

PremixEx Taq^TMII(TaKaRa)进行KoPDS的表达量的测定，相对表达量的计算按2^-△△Ct法。

进一步，qPCR体系和程序参照

PremixEx Taq^TM II中的程序进行， qPCR及内参引物序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4。

进一步，所述配制重悬缓冲液之前需要进行：

步骤一，对pTRV2载体进行酶切，按Thermo ScientificEcoR1和KpnI双酶切体系操作；

步骤二，利用EASYspin Plus Complex Plant RNAKit提取秋茄RNA，并利用PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser完成反转录；利用引物 KoPDS-F/R分离克隆KoPDS编码区中的片段312bp序列；

步骤三，设计带overlap的引物KoPDS-OF/R将载体末端重叠序列通过PCR 加入KoPDS片段两端，同时利用艾德莱无缝克隆系统构建重组质粒；

步骤四，克隆测序验证载体序列正确后，提取质粒转入农杆菌GV3101中；在250rpm转速下振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0，离心收集菌体，用等体积的侵染缓冲液重悬，室温放置2小时后注射侵染。

进一步，所述步骤二引物与序列为SEQ ID NO：1。

进一步，所述overlap的引物序列为SEQ ID NO：2。

进一步，所述步骤四克隆测序验证载体序列正确后，提取质粒转入农杆菌GV3101中；在250rpm转速下振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0，离心收集菌体，用等体积的侵染缓冲液重悬，室温放置2小时后注射侵染。

进一步，所述提取质粒转入农杆菌GV3101中采用冻融法，50μg/mL卡那 +25μg/mL利福平双抗。

进一步，所述用等体积的侵染缓冲液重悬的重悬浓度应控制在 OD₆₀₀＝0.5-0.6。

结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：本发明在菌液重悬过程中，重悬液的pH值需精确控制在5.8-6.0，过低或过高的pH值易引起秋茄叶片的超敏反应，影响实验效果。重悬2种菌液(pTRV-KoPDS和 pTRV1)时，浓度应控制在OD₆₀₀＝1.0左右，再等量混合菌液，使得2种菌液各自的终浓度在OD₆₀₀＝0.5左右。过高或过低菌液浓度注射时易引起叶片水渍状溃烂，严重影响侵染效果。侵染叶片应选择顶芽下3-4片叶，太嫩或太老的叶片侵染效果不佳。侵染后应将秋茄幼苗于28℃温室大棚正常管理，温度不宜超过30℃，否则影响侵染效果。

本发明在红树植物秋茄上建立VIGS体系，为后期功能基因的研究奠定基础。传统对红树植物功能基因的研究需要借助外源模式植物，而同源基因在不同物种间的生物学差异也一直制约着对红树植物功能基因的进一步分析。本发明将在红树植物秋茄上实现内源基因的沉默，从而实现在秋茄上直接验证基因的功能；对秋茄以及红树植物分子生物学方向的研究具有突破性意义。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对本申请实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例提供的鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法流程图。

图2是本发明实施例提供的鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法流程图。

图3是本发明实施例提供的pTRV2质粒图谱示意图。

图4是本发明实施例提供的重组质粒中KoPDS的片段连接位点示意图。

图5是本发明实施例提供的秋茄叶片光漂白现象观测示意图。

图6是本发明实施例提供的VIGS菌液侵染7-30天KoPDS基因相对表达量变化示意图。

图7是本发明实施例提供的不同菌液浓度对秋茄叶片的影响示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法，下面结合附图对本发明作详细的描述。

如图1所示，本发明提供的鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法包括以下步骤：

S101：对pTRV2载体进行酶切，按Thermo Scientific EcoR1和KpnI双酶切体系操作；

S102：利用EASYspin Plus Complex Plant RNAKit提取秋茄RNA，并利用PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)完成反转录；利用引物 KoPDS-F/R分离克隆KoPDS编码区中的片段(312bp)序列；

S103：设计带overlap的引物KoPDS-OF/R将载体末端重叠序列通过PCR 加入KoPDS片段两端，同时利用艾德莱无缝克隆系统构建重组质粒；

S104：克隆测序验证载体序列正确后，提取质粒转入农杆菌GV3101中；在250rpm转速下振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0，离心收集菌体，用等体积的侵染缓冲液重悬，室温放置2小时后注射侵染；

S105：配制重悬缓冲液；

S106：结合RT-qPCR测定KoPDS的表达量，剪取注射侵染区域的叶片，利用EASYspinPlus Complex Plant RNA Kit提取秋茄RNA，并利用 PrimeScript^TMRTreagentKitwithgDNAEraser完成反转录；利用

PremixEx Taq^TM II(TaKaRa)进行KoPDS的表达量的测定，相对表达量的计算按2^-△△Ct法。

下面的结合附图对本发明的技术方案作进一步的描述。

本实验所用载体pTRV1和pTRV2购于长沙赢润生物技术有限公司。pTRV2 载体信息如下：启动子为CaMV 35S，载体大小为9663bp，原核抗性为卡那霉素。质粒图谱如图3所示。选择酶切位点EcoR1和KpnI(Thermo)对pTRV2 载体进行酶切，克隆秋茄八氢番茄红素去饱和酶基因(phytoene desaturase) KoPDS编码区中的片段(312bp)，采用艾德莱无缝克隆系统(CV12-Seamless Assembly and Cloning kit)构建重组质粒(图4)。

具体操作步骤如下：

(1)对pTRV2载体进行酶切，按Thermo ScientificEcoR1和KpnI双酶切体系操作。

(2)利用北京艾德莱生物科技有限公司的EASYspin Plus Complex Plant RNAKit提取秋茄RNA，并利用PrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)完成反转录。利用引物KoPDS-F/R分离克隆KoPDS编码区中的片段 (312bp)序列，引物与序列信息如下SEQ ID NO：1：

KoPDS-F：cgtgattgaaggagatgcttatgt

KoPDS-R：gagtcagtgcgtgaaatcca

gagtcagtgcgtgaaatccacgtgattgaaggagatgcttatgtatttgccactccggttgatatcctgaagcttctttt gcctgatgactggaaagatattccttacttcaagaaattggagaaattagttggagttcctgttatcaatgttcacatatggtttg acaggaagctgaaaaatacatatgatcacctactttttagcagaagtccccttcttagcgtgtatgctgatatgtctgtaacatg taaggagtattacaatccaaatcaatctatcctggaattagtacttgcacctgcagaagaatggatttcacgcactgactc

(3)设计带overlap的引物SEQ ID NO：2KoPDS-OF/R将载体末端重叠序列通过PCR加入KoPDS片段两端，同时利用艾德莱无缝克隆系统 (CV12-SeamlessAssembly andCloning Kit)构建重组质粒(图4)。

KoPDS-OF：taaggttaccgaattccgtgattgaaggagatgcttatgt

KoPDS-OR：cgcgtgagctcggtaccgagtcagtgcgtgaaatcca

(4)克隆测序验证载体序列正确后，提取质粒转入农杆菌GV3101(上海唯地生物技术有限公司)中(冻融法)(50μg/mL卡那+25μg/mL利福平双抗)。在250rpm转速下振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0，离心收集菌体，用等体积的侵染缓冲液重悬(重悬浓度应控制在OD₆₀₀＝0.5-0.6)，室温放置2小时后注射侵染。

(5)重悬缓冲液的配制：

MES 195.2mg；

MgCl₂·6H₂O 203mg

ddH₂O定容至100ml后，加入乙酰丁香酮(终浓度200μM)用1mol NaOH 调整pH至6.0。将重悬菌液放置28℃2-4小时后，等量混合pTRV-KoPDS和pTRV1 菌液，用注射器注射入秋茄的叶片中，7天后观测光漂白现象(图5)。

(6)结合RT-qPCR测定KoPDS的表达量，沉默效果如下所示(图6)。剪取注射侵染区域的叶片(空质粒为对照)，利用北京艾德莱生物科技有限公司的EASYspin Plus ComplexPlant RNAKit提取秋茄RNA，并利用PrimeScript^TMRT reagent Kitwith gDNAEraser(TaKaRa)完成反转录。利用

Premix Ex Taq^TM II(TaKaRa)进行KoPDS的表达量的测定，相对表达量的计算按2^-△△Ct法，qPCR 体系和程序依据不同仪器型号参照

PremixEx Taq^TM II(TaKaRa)中的程序进行。qPCR及内参引物序列如SEQ ID NO：3和SEQ IDNO：4：

KoPDS-qF：cgtgattgaaggagatgcttatg

KoPDS-qR：tgtgaacattgataacaggaactc

Koactin-F:accgaggctcctcttaatcc

Koactin-R:agctggcacattgaaggtct

本发明在菌液重悬过程中，重悬液的pH值需精确控制在5.8-6.0，过低或过高的pH值易引起秋茄叶片的超敏反应，影响实验效果。重悬2种菌液 (pTRV-KoPDS和pTRV1)时，浓度应控制在OD₆₀₀＝1.0左右，再等量混合菌液，使得2种菌液各自的终浓度在OD₆₀₀＝0.5左右。过高或过低菌液浓度注射时易引起叶片水渍状溃烂，严重影响侵染效果(图7)。侵染叶片应选择顶芽下3-4片叶，太嫩或太老的叶片侵染效果不佳。侵染后应将秋茄幼苗于28℃温室大棚正常管理，温度不宜超过30℃，否则影响侵染效果。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 闽江学院

<120> 一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 356

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgtgattgaa ggagatgctt atgtgagtca gtgcgtgaaa tccacgtgat tgaaggagat 60

gcttatgtat ttgccactcc ggttgatatc ctgaagcttc ttttgcctga tgactggaaa 120

gatattcctt acttcaagaa attggagaaa ttagttggag ttcctgttat caatgttcac 180

atatggtttg acaggaagct gaaaaataca tatgatcacc tactttttag cagaagtccc 240

cttcttagcg tgtatgctga tatgtctgta acatgtaagg agtattacaa tccaaatcaa 300

tctatcctgg aattagtact tgcacctgca gaagaatgga tttcacgcac tgactc 356

<210> 2

<211> 77

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taaggttacc gaattccgtg attgaaggag atgcttatgt cgcgtgagct cggtaccgag 60

tcagtgcgtg aaatcca 77

<210> 3

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

cgtgattgaa ggagatgctt atgtgtgaac attgataaca ggaactc 47

<210> 4

<211> 40

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

accgaggctc ctcttaatcc agctggcaca ttgaaggtct 40

Claims

1.一种鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法，其特征在于，所述鉴定红树植物秋茄树基因功能的方法包括：

配制重悬缓冲液，在菌液重悬过程中；重悬pTRV-KoPDS和pTRV12种菌液时，再等量混合菌液；

结合RT-qPCR测定KoPDS的表达量，剪取注射侵染区域的叶片，侵染叶片选择顶芽下片叶；侵染后将秋茄幼苗于温室大棚正常管理；

重悬缓冲液的配制包括：MES 195.2mg；MgCl₂·6H₂O 203mg；ddH₂O定容至100ml后，加入乙酰丁香酮终浓度200μM，用1mol NaOH调整pH至6.0；将重悬菌液放置28℃2-4小时后，等量混合pTRV-KoPDS和pTRV1菌液，用注射器注射入秋茄的叶片中，7天后观测光漂白现象；

配制重悬缓冲液，在菌液重悬过程中，重悬液的pH值为5.8-6.0；重悬pTRV-KoPDS和pTRV12种菌液时，浓度应控制在OD₆₀₀＝1.0，再等量混合菌液，使得pTRV-KoPDS和pTRV12种菌液各自的终浓度在OD₆₀₀＝0.5；

结合RT-qPCR测定KoPDS的表达量，剪取注射侵染区域的叶片，侵染叶片选择顶芽下3-4片叶；侵染后将秋茄幼苗于28℃温室大棚正常管理，环境温度不超过30℃；

结合RT-qPCR测定KoPDS的表达量，剪取注射侵染区域的叶片，利用EASYspin PlusComplexPlant RNAKit提取秋茄RNA，并利用PrimeScript RT reagent Kitwith gDNAEraser完成反转录；利用Premix Ex Taq进行KoPDS的表达量的测定，相对表达量的计算按2^-△△Ct法；

qPCR体系和程序参照PremixEx Taq中的程序进行，qPCR及内参引物序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4；

所述配制重悬缓冲液之前需要进行：

步骤一，对pTRV2载体进行酶切，按Thermo Scientific EcoR1和KpnI双酶切体系操作；

步骤二，利用EASYspin Plus Complex Plant RNA Kit提取秋茄RNA，并利用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser完成反转录；利用引物KoPDS-F/R分离克隆KoPDS编码区中的片段312bp序列；

步骤三，设计带overlap的引物KoPDS-OF/R将载体末端重叠序列通过PCR加入KoPDS片段两端，同时利用艾德莱无缝克隆系统构建重组质粒；

步骤四，克隆测序验证载体序列正确后，提取质粒转入农杆菌GV3101中；在250rpm转速下振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0，离心收集菌体，用等体积的侵染缓冲液重悬，室温放置2小时后注射侵染；

所述步骤二引物与序列为SEQ ID NO：1；

所述overlap的引物序列为SEQ ID NO：2；

所述步骤四克隆测序验证载体序列正确后，提取质粒转入农杆菌GV3101中；在250rpm转速下振荡培养至OD₆₀₀＝0.6-1.0，离心收集菌体，用等体积的侵染缓冲液重悬，室温放置2小时后注射侵染；

所述提取质粒转入农杆菌GV3101中采用冻融法，50μg/mL Kana+25μg/mL利福平双抗；

所述用等体积的侵染缓冲液重悬的重悬浓度应控制在OD₆₀₀＝0.5-0.6。