JP2008526222A

JP2008526222A - 植物中の特定遺伝子の過剰発現または死滅のための機能的なウイルスベクターおよびその適用

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Publication number: JP2008526222A
Application number: JP2007549934A
Authority: JP
Inventors: クリストフブルギドゥ; クリステルシル
Original assignee: アンスティテュドゥルシェルシュプールルデヴロップマーン（イエールデ）
Priority date: 2005-01-05
Filing date: 2006-01-05
Publication date: 2008-07-24
Also published as: WO2006072742A9; US9222097B2; FR2880357A1; CA2593128A1; WO2006072742A2; EP1833974A2; FR2880357B1; WO2006072742A3; US20090162832A1

Abstract

本発明は、植物において、サイレンシングに関して機能的多様性を有するタンパク質をエンコードする遺伝子の使用であって、特定の遺伝子を過剰発現させるまたはサイレンシングさせる機能を有する植物ウイルスベクターを構築するために有効性のレベルを有する遺伝子の選択を包含するものに関する。

Description

本発明は、植物中の興味のある遺伝子の過剰発現、または転写後の死滅（以下、「サイレンシング」と称する）のための機能的なウイルスベクターに関する。本発明は、より特定的には、植物ウイルスから生じさせられ、穀草類、特にイネの中の遺伝子の過剰発現またはサイレンシングに関して機能的多様性を有するタンパク質をエンコードする配列を含むベクターに関する。

植物さらには動物における主要な抗ウイルス防御メカニズムの一つは、PTGS（post-transcriptional gene silencing：転写後遺伝子サイレンシング）の現象に基づく。この現象は、外来のまたは過剰発現されたＲＮＡの特異的な分解を結果としてもたらす。

ウイルスの場合、ウイルスのゲノムがこの現象の引き金剤（triggering agent）およびターゲットである。

附随して、ウイルスは、PTGSのキーステップをターゲットとするサプレッサー機能をサイレンシングすることに一部のそれらのタンパク質を特殊化することによって、このタイプの防御メカニズムを回避することを可能にする機能を発達させる。

「サイレンシングサプレッサー」と称される多くのタンパク質が、植物病原性ウイルスにおいて、Nicotiana benthamiana中のそれらの一部についての非宿主相互作用の理由で記述された。実際に、PVX潜在性（PVX-potential）サプレッサータンパク質ベクターが生じさせられ、PTGSを示すN.benthamiana植物上に接種され（agroinfiltration法により）、研究されたタンパク質のサプレッサー容量が評価された。rice yellow mottle sobemovirus（以降では、「RYMV」と称する）（イネおよび若干の野生型のイネ科植物の感染症に専ら制限されるウイルス）のP1タンパク質は、それ故に、サイレンシング・サプレッサーとして記述された。

RYMVのＰ１タンパク質は、４のウイルスORFの第１によってエンコードされる１５８のアミノ酸のタンパク質である。このタンパク質は、全体的な感染サイクルの間に翻訳され、１８および１９ｋＤａのダブレットのかたちで検出される。それは、ウイルス複製に間接的作用を発揮し、細胞から細胞へのRYMVの移動および長距離の移動に必要であるようである。相補研究は、それがウイルス感染の間に移動して（in trans）作用することを示した。このタンパク質は、「非自律的」細胞モードで、したがって、PTGSシグナルの伝播に関して作用するサイレンシングサプレッサーとして記載された。

本発明者らは、RYMVとその宿主であるイネとの間の生来の相互作用との関連でPTGSを抑制する際のP1タンパク質およびRYMVの有効性を評価した。

病理学および系統発生の点で特徴付けられるRYMV分離株の集合について行われた研究は、P1の多様性およびこの多様性に関連がある活性における機能的な相違を証明することを可能にした。これらの研究はまた、PTGS抑制についてのこれらのP1およびRYMVの定量的および定性的効果を調査することを可能にした。

したがって、本発明の目的は、サイレンシングサプレッサーの機能的多様性を利用して、新規なウイルス発現またはサイレンシングベクター、および植物ウイルスのサプレッサータンパク質の機能的多様性に基づく機能的ゲノムツールを提供することである。

本発明はまた、単子葉植物のモデル植物であるイネにおける機能的ゲノムのための効果的ツールを提供する目的のために、ウイルス発現およびVIGS（virus induced gene silencing）ベクターおよび植物ウイルス、より特定的には、RYMVからのその構築物を提供することを目的とする。

したがって、第１の態様によると、本発明は、植物において、サイレンシングの点で機能的多様性を有するタンパク質をエンコードする遺伝子の使用、所望の興味のある遺伝子を過剰発現またはサイレンシングさせる機能を有する植物ウイルスベクターを構築するための有効性のレベルを有する遺伝子の選択に関する。

本発明はまた、興味のある遺伝子を過剰発現またはサイレンシングさせる機能的植物ウイルスベクターを構築するための、タンパク質により弱−強のサプレッサー効果を有するRYMVのＰ１タンパク質を植物においてエンコードする遺伝子の使用に関する。

より特定的には、本発明は、活性の所与のレベルのために選択されたタンパク質の使用であって、
− RYMV 35Sプロモーター等の適切なプロモーターの下流で機能的多様性を有するサイレンシングサプレッサータンパク質をクローニングすること；
− 微粒子銃（biolistics）によりイネの葉上に種々のタンパク質を接種すること；
− L2、4およびL10系統等の系統上にウイルスを機械的に接種すること；
− 所与の分離株（例えば、マダガスカル（Madagascar）分離株）に対するポリクローナル抗体を用いるDAS-ELISAによりウイルス量をアッセイすること；
− GUS組織化学アッセイによってレポーター遺伝子の発現の回復を視覚化すること；
− 酵素活性をアッセイすることによってレポーター遺伝子の発現の回復を定量すること；
− ノーザンブロッティングによりsiRNA（PTGSの証拠）を検出すること、および
− 興味のある遺伝子の過剰発現またはサイレンシングのいずれかに必要とされる活性レベルを有するタンパク質を選択すること
を含む技術を用いるものを目的とする。

P1タンパク質の選択のために、上記技術は、35Sプロモータの下流の種々のP1、より特定的にはTz3、Tz8、Mg1、BF1、CI63をクローニングすることによって適用される。

好ましくは、sP1-Ci63およびTz3タンパク質が、PTGS抑制における高い有効性のために用いられる。sP1-Tz8等のＰ１タンパク質は、中程度の有効性を示す一方で、s-P1Mg1および-BF1は、PTGS抑制においてあまり有効的でない。

得られた結果は、実施例によって例示され、種々のP1タンパク質によるPTGS抑制における可変性が、定量的スケール（タンパク質は、多かれ少なかれ実質的な活性を示す）および定性的スケール（結果は、PTGS抑制の差速（differential rate）を示す）の両方において表されることを示す。

PTGS抑制についてのP1タンパク質の活性は、miRNAおよびsiRNAの蓄積についてのそれらの効果を分析することによって評価された。PTGS抑制の可変の有効性が、結果として、試験された導入遺伝子に特異的なsiRNAの可変の減少をもたらすことが見出された。行われた分析はまた、P1タンパク質がmiRNA蓄積の減少を引き起こすことを示した。

本発明はまた、可変の、強−弱のPTGS抑制効果を有するRYMV分離株のゲノムの使用に関する。

別の態様によると、本発明は、興味のある遺伝子の発現またはサイレンシングのためのウイルスベクターであって、RYMVゲノムから生じさせられ、所望の過剰発現またはサイレンシング機能性を規定するための有効性のレベルを有するように選ばれるサイレンシングサプレッサーをエンコードする遺伝子を含むことを特徴とするものに関する。

このようなベクターの構築は、おそらく、ウイルスの構造によって課される全ての制約を考慮に入れ、（移動およびキャプシド封入（encapsidation）に対して）その感染ポテンシャルを保存するウイルスの能力に緊密に依存している。

本発明は、興味のある遺伝子の発現またはサイレンシングのためのウイルスベクターであって、RYMVゲノムから生じさせられ、かつ、サイレンシングサプレッサーとして機能的多様性を発現させるP1タンパク質をエンコードする遺伝子を含むことを特徴とするものを目的とする。この遺伝子は、任意のP1タンパク質をエンコードするRYMVゲノムのものに取って代わる。

これらのベクターは、有利には、既知の感染クローンの強度に等価な複製強度を示し、同じ症状を誘発する。

一つの実施形態において、本発明のベクターは、サイズにおいて７００ｂｐ未満の過剰発現させられるかまたは消滅させられるべき興味のある遺伝子の挿入物を含有するウイルス発現ベクターであることを特徴とする。

７００ｂｐより大きい挿入サイズのために、複製可能なORF（すなわち、ORF_2a,_2b）またはRYMVの「アンプリコン」（これは、大配列の挿入のために十分なスペースを有することを可能にする）の使用がなされる。

欠失ORFは、trans（すなわち、遺伝子組換え植物）でまたはcis（すなわち、共接種（coinoculation））で補足され得る。

これらのウイルス発現ベクターは、遺伝子の一時的発現のためのツールとしての良好な候補である。

有利には、それらは、外因性配列のクローニングのための興味のある制限部位を有する配列を有する。

これらのベクターはまた、非宿主細胞、例えば、BY2プロトプラストにおいてクローンをより機能的にするために、p19 PTGSサプレッサーをエンコードする遺伝子を追加的に含むことを特徴とする。

別の実施形態において、本発明のベクターは、５０ｂｐ未満のサイズの挿入物を含むVIGSベクターであり、ウイルスゲノムにおける挿入物の配向（orientation）はともかく、そのターゲットは、導入遺伝子のmRNAであることを特徴とする。

上記に規定されたベクターは、有利には、
− PCR増幅；
− 消化；
− ライゲーション；および
− コンピテント細菌の形質転換
の工程を包含するプロトコルに従って得られる。

発現ベクターは、
− インビトロの転写；
− 転写物を有するプロトプラストの調製およびエレクトロポレーション；
− エレクトロポレーションの３〜７日後の挿入物の視覚化；
− 同じタイミングによるRNAの抽出；および
− RT-PCRによる挿入された遺伝子の複製および安定性の確証
の工程を包含するプロトコルに従ってより特定的に確証される。

VIGSベクターは、特に、
− インビトロの転写；
− 転写物を有する、RYMVに対して可変の抵抗度を有する種々のイネ種および形質転換系統の機械的な接種；
− サイレンシング表現型の視覚化による表現型の特徴化；および
− 全RNAの抽出、低分子量RNAのポリアクリルアミドゲルのノーザンブロッティングおよびVIGSによりターゲットにされた遺伝子に特異的なsiRNAの検出による分子の特徴化
の工程を包含するプロトコルに従って確証される
このように、本発明は、RYMVゲノムへの外因性遺伝子の挿入のための、それらを過剰発現させるかまたはそれらをサイレンシングさせることを目的とする非常に興味のあるツールを提供する。

RYMVによるPTGS抑制の研究は、接種されるウイルスの量の重要性を証明することを可能にした。

ウイルス発現およびVIGSベクターの構築および確証は、一過性にイネにおいて遺伝子発現を研究し、興味のある分子を製造するために適した一連のツールを開発することを可能にする（アグロバクテリウム、例えばA.tumefaciensとの共培養によるイネの細胞懸濁物におけるエレクトロポレーションによるイネプロトプラスト中のタンパク質の製造）。組織スケールで、微粒子銃によるイネの葉の接種は、機能的相補研究を行うことを可能にする。

P1タンパク質およびRYMVによるPTGS抑制についての本発明により得られた結果は、全体として、ベクターの使用のより良好なターゲッティングを可能にする。

弱いPTGS抑制活性を有する、P1タンパク質、またはサプレッサーの組合せは、VIGSベクターの作製のための理想的なツールを構成することになる。他方、強いPTGS抑制活性は、発現ベクターの最適化のために利用されることになる。

本発明の他の特徴および利点は、後に続く実施例および図１〜１２において与えられる。

（物質と方法）
本特許出願は、種々のアフリカ諸国に由来する生物学的物質の特性を用いる。本発明は、生物多様性に関するリオ条約の取り決めに従って適用されることになる（http://www.biodiv.org）。

種々のアフリカ諸国が起源の複数のRYMV分離株のP1タンパク質は、遺伝子の過剰発現または消滅を得るために用いられる。下記表において参照される分離株のP1タンパク質の使用は、本記載および請求の範囲において明確にターゲットにされる。

（感染性クローン）
以下の感染性クローン（これらは図１に例示される）により得られた結果が報告される。

− FL5（Brugidouら，1995）：これはT7バクテリオファージプロモーターの下流でクローニングされたウイルスゲノムの完全なcDNAに対応する；
− FL5ΔCP：このものから、キャプシドタンパク質をエンコードするORF₃の一部が検出され（すなわち、３６３４〜４１６７ｎｔ）、このものは、３’位において欠失の下流に１４の追加的なヌクレオチド（ACG TAC TAG TGG GC）を有し、これは、過剰配列の挿入に有利な独自の制限部位に対応する；
− 新しいクローンCP^*：このものは、FL5から5’r PCRによって（すなわち、センスプライマー5’ ACA AAG ATG GCC AGG AAG GGC AAG 3’およびリバースプライマー5’ GAA TTC TAC GTA TCA CGT ATT GAG TGT TGG ATC 3’，温度６０℃により）増幅させられたCPのORFに対応する７２０ｂｐフラグメントの挿入によって構築され、MscI（太線部）およびSnaBI（下線部）により消化されて、MscI（３４５０ｎｔ位）およびSnaBI（３６３７ｎｔ位）により消化されたFL5ΔCPになる。

− 発現ベクター
ウイルス発現ベクターは、組換え型CP^*から生じさせられた。

（融合）
第１工程において、SpeI部位（３９９６〜４１７２ｎｔの位置）における外因性配列の挿入による転写融合が行われ、結果として、CPのORFにおいて部分的欠失が生じた。この欠失はタンパク質中の５４アミノ酸に対応する。gfp+遺伝子（GenBankアクセス番号Ｕ８４７３７）およびuidA遺伝子（GenBankのアクセス番号ＡＪ４１４１１２）の完全配列が、以下のオリゴヌクレオチドにより増幅させられた：
− gfp+プライマー：センス5’ GAA TTC ACT AGT GTG AGC AAG GGC GAG GA 3’、アンチセンス5’ GAA TTC ACT AGT TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT 3’（温度６２℃）；
− uidAプライマー：センス5’ GAA TTC ACT AGT TTA CGT CCT GTA GAA ACC 3’、アンチセンス5’ GAA TTC ACT AGT TCA TTG TTT GCC TCC CTG 3’（温度６０℃）（レポーター遺伝子の配列に相補的な配列には下線が引かれている）；PCR産物（すなわち、gpf+についての７２０ｂｐおよびuidAについての１８１６ｂｐ）は、CP^*のSpeI部位においてクローニングされ、そうして産生された構築物は、それぞれ、C-gfpおよびC-Gusと呼ばれる）。

（サブゲノムＲＮＡプロモーター（SIT）の重複（Hacker & Sivakumaraan，1997））
プロモーターは、CPのORFの３’位に、PCR増幅によってFL5からセンスプライマー5’ ACA AAG ATG GCC AGG AAG GGC AAG 3’およびアンチセンスプライマー5’ GAA TTC TAC GTA GCA TGC CAT CTT TGT GGG AGA CTC GCC CTA TCC CAC TCA CGT ATT GAG TGT TGG ATC 3’（温度６０℃）により挿入される。

SphIおよびSnaBI部位も、PCRによって、SIT（下線部）の５’位に導入された。そうして増幅させられた７７４ｂｐのフラグメントは、FL5ΔCPへのライゲーションによって、MscIおよびSnaBI部位に導入され、生じさせられたクローンは、C-Sitと呼ばれた。

（SITの下流のgfp+のクローニング）
センスプライマー5’ GAA TTC GCA TGC GTG AGC AAG GGC GAG GAG 3’およびアンチセンスプライマー5’ GAA TTC GCA TGC TTA CTT GTA CAG CTC GTC CAT 3’により増幅させられたgfp+遺伝子の完全配列に対応する７２０ｂｐのPCRフラグメントは、C-SitのSphI部位においてクローニングされた。この組換え体は、Sit-gfpと表示される。

（VIGSベクター）
VIGSベクターは、O.sativa L.spp.indica cv.IR36のsgfp（GenBankアクセス番号Ｕ４３２８４、ＡＡＣ５３６５９）（Pangら，1996；Sallaudら，2003）およびpds（GenBankアクセス番号ＡＦ０４９３５６）遺伝子の種々のサイズ（４４〜１２１ｂｐ）のPCRフラグメントの、CP^*のSnaBI部位（４１７０ｎｔ位）における挿入によって生じさせられた。結果は、下記表１に与えられる。

挿入物全てが、同一配向に集積されるわけではなく、「s」はセンス配向に対応し、「as」は、アンチセンス配向に対応する。挿入物gf^*、gf^**、f^*fp^*およびfp^**は、表に特定されるプライマーを用いて、プラスミドpCambia5305のDNAから増幅させられた。pds^*挿入物は、PCRによって、適切なプライマーの存在下に、イネcv.IR₆₄の葉から抽出された７５０ｎｇのRNAについて行われる逆転写反応の産物から、oligodTタイプのオリゴヌクレオチドプライマーの存在下に増幅させられた。

（確証）
組換体のインビトロ転写
（発現ベクター）
・エレクトロポレーション
約１００万本のタバコ（Nicotiana tabaccum var BY2）またはイネ（O.sativa var O₂₄₂₈，RYMVに感受性）プロトプラストが、発現ベクターに対応する３０μｇのインビトロ転写物によりエレクトロポレーションされた。

各組換えベクターについて７回の独立したエレクトロポレーションが行われ、実験の終了時に混合された。

（VIGSベクター）
・RYMVに対する可変の抵抗度を有する様々な種類のイネの機械的接種
pds遺伝子をターゲットとする、VIGSベクターから発生させられたインビトロ転写物は、RYMVに対して種々の抵抗度を有するイネ種：cv.IR64 spp.indica（感受性）、cv.Azucena spp.japonica（一部抵抗性）、cv.Nipponbare spp.japonica、cv.Taipei309 spp.japonica）および遺伝子組換え系統（cv.Taipei309）（上記のPangらおよびSallaudら）上に機械的に接種された。

各種または系統の４または５本の苗（すなわち、播種１５日後、二葉の段階）が、カーボランダムを用いて機械的に接種された。接種物は、２０ｍＭのリン酸ナトリウムバッファ（ｐＨ７）に２倍希釈された２０μｇのインビトロ転写物に対応する。

表現型の特徴化：サイレンシング表現型の視覚化（gfp＝ＵＶ照射下のgfpの消失、pds＝葉の脱色）。

分子の特徴化：全ＲＮＡの抽出（Trizol）、低分子量RNAのポリアクリルアミドゲルのノーザンブロッティングおよびＶＩＧＳによるターゲットにされた遺伝子に特異的なsiRNAの検出。

（分子生物学および細胞培養プロトコル）
Ａ）PTGS抑制の分析
（１ａ）DAS-ELISAによるウイルス量の評価
全体的に感染した葉におけるウイルス含有量は、DAS-ELISA技術（Double Antibody Sandwich-Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay）に従う酵素免疫アッセイによって推定される。

１ミリリットルのPBS-T（１．３６ＭのNaCl、１４ｍＭのKH₂PO₄、８０ｍＭのNa₂HPO₄、２６ｍＭのKCl、ｐＨ６．８、０．５％ｖ／ｖのTween 20）が、地上に生える全体的に感染した葉に由来する１００ｍｇの粉体に加えられ、このようにして、抗原溶液が構成された。マダガスカル分離株に対抗する血清に由来するポリクローナル抗体（１／１０００に希釈された）が、以前に記載された手順（N’Guessanら，2000）に従ってマイクロ滴定プレート（Nunc）に前もって結合させられた。連続的なインキュベーションおよび洗浄工程の結果、堆積された抗原とアルカリホスファターゼに結合させられたポリクローナル抗体との間に陽性反応が検出された。アルカリホスファターゼと、ジエタノールアミン（SIGMA（登録商標））の溶液に希釈されたその基質（pNPP（ｐ−ニトロフェニルホスファターゼ基質）（SIGMA（登録商標）））との反応は、蛍光光度計（Multiskan蛍光光度計，Labsystem）を用いて４０５ｎｍにおいて光学密度を読み出すことによって強度が測定される着色反応を生じさせる。

（２ａ）タンパク質の抽出
全ての水溶性タンパク質は、１００ｍｇの地上に生えた葉から、リン酸バッファ（５０ｍＭのNaHPO₄、１０ｍＭのNa₂EDTA、１ｍｇ／ｍｌのＮ−ラウリルサルコシン、０．１％ｖ／ｖのトリトン）中に抽出され、４℃での３０分間にわたる２００００ｇの２回の連続的な遠心分離の終了時に上澄が回収される。タンパク質は、Bradford法に従ってアッセイされる（Coomassieタンパク質アッセイキット，Pierce）（Bradford，1976）。標準範囲は、BSAの既知濃度により得られる５９５ｎｍにおける光学密度を測定することによって引き出される。

（３ａ）組織化学アッセイおよび蛍光定量アッセイによるＧＵＳ活性の評価
β−グルクロニダーゼ（GUS）の酵素活性を検出するために行われた、２タイプの実験が以下に報告される。葉についての組織化学アッセイは、減圧下（１５分、０．３３ＭＰａ）、適切なバッファ（５０ｍＭのリン酸ナトリウム、０．２５ｍＭのK₃Fe(CN)₆、０．２５ｍＭのK₄Fe(CN)₆、０．５％ｖ／ｖのトリトン）に希釈された１ｍｇ／ｍｌのX-GlucA（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−β−Ｄ−グルクロニド）（Duchefa）の存在下での浸透後に、文献（Jeffersonら，1987）に記載されたようにして行われた。次いで、サンプルは、１２時間にわたり暗所において３７℃でインキュベートされる。次いで、葉は、２４時間にわたる室温での葉緑素を不安定にする溶液（１０％ｖ／ｖのホルムアルデヒド、５％ｖ／ｖの氷酢酸、４２．５％ｖ／ｖのエタノール）による処理によって対比染色される。最後に、葉は、数回水洗され、７０％（ｖ／ｖ）のエタノール中に保存される。

Gus活性の蛍光定量アッセイは、全体的に感染した葉から抽出された水溶性タンパク質について行われた。次いで、５マイクロリットルのタンパク質が、２００μｌの反応容積中の１ｍＭの基質（MUG（４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド），Sigma（登録商標））の存在下に、Gus活性についての酵素アッセイに付された。酵素反応の蛍光産物（すなわち、MU、３６５ｎｍで励起、４５５ｎｍで発光）の見かけの速度論は、蛍光光度計（Fluoroskan蛍光光度計，Labsystem）を用いて、２時間にわたり、３０分の間隔で読み出すことにより実現される。参照標準範囲は、MUの種々の濃度の蛍光を測定することによって引き出される。Gusの酵素活性は、単位時間当たりの合成された産物の量として表され、タンパク質の同一量（ｐｍｏｌＭＵ／分／μｇタンパク質）に関連付けられる。

（４ａ）ノーザンブロッティングによるＲＮＡ分析
種々のサンプルのRNAは、１００ｍｇの粉体から、Trizol（登録商標）（Invitrogen（登録商標））を用いて供給元の推奨に従って抽出され、３０〜５０μｌの５０％脱イオン化ホルムアルデヒドにおいて開始された。RNAの量および質は、それぞれ、２６０ｎｍにおける光学密度を測定することによって評価され、２μｇのＲＮＡが、１％のアガロースゲル上に装填され、0.5X TBEにおいて５０Ｖ／ｃｍで移動させられた。

１５マイクログラムの全RNA（ローディングバッファー（５０％ｖ／ｖのグリセロール、５０ｍＭのトリス（ｐＨ７．７）、５ｍＭのEDTA、０．０３％ｖ／ｖのブロモフェノールブルー）の１／４による変性後に完全になる）は、変性条件の条件下の電気泳動によって、１７．５％のポリアクリルアミドゲル（７Ｍの尿素、１７．５％ｖ／ｖのアクリルアミド−ビスアクリルアミド１９：１、0.5X TBE、０．０４％ｖ／ｖのTemed、０．０８％ｖ／ｖの過硫酸アンモニウム）上で、以前に記載されたようにして（Hamilton & Baulcombe，１９９９）、２時間にわたり１００Ｖ／ｃｍで、0.5X TBEにおいて分離される。このようにして分離された低分子量RNAは、非荷電ナイロン膜（Hybond NX，Amersham）上に、４℃で１時間にわたり１０００Ｖで0.5X TBEにおいてエレクトロブロッティングされる。

siRNAの検出のために、プローブは、ランダムプライマーのアンカリングによって、Megaprime（登録商標）DNAラベリングシステムキット（Amersham）を用いて、２０Ｕのクレノウおよび５μＣｉのα-³²P-dCTPの存在下に、５０μｌの反応容積で、供給元の推奨に従ってラベリングされる。ラベリングは、１時間にわたり３７℃で行われ、ラベリングされたプローブは、次いで、Sephadex-G50カラム（Amersham）上で精製され、その後に、変性させられ、ハイブリッド形成バッファ（PerfectHyb（登録商標）Plusハイブリッド形成バッファ，Sigma（登録商標））に組み込まれる。

miRNAの検出のために用いられるプローブは、選択されたmiRNAに相補的なオリゴヌクレオチドプライマー（２０ｐｍｏｌ）のリン酸化によって、１０単位のT4 ポリヌクレオチドキナーゼ（Qbiogene）により、２μｌの反応バッファおよび５μＣｉのγ-³²P-dCTPの存在下に、２０μｌの反応容積で合成される。ラベリングは、１時間にわたって３７℃で行われ、ラベリングされたプローブは、Sephadex G25カラム（Amersham）上で精製され、その後に、変性させられ、ハイブリッド形成バッファに組み込まれる。

膜は、次いで、適切な温度（すなわち、siRNAの検出のために４２℃、miRNAの検出のために２０℃）で終夜ハイブリッド形成させられる。５０℃での２０分の２回の連続的な洗浄工程が、次いで、2 X SSCおよび２％のSDSの溶液により行われる。最後に、膜は、サランラップ内にラッピングされ、所望のシグナル強度に応じた可変の期間にわたり−８０℃でｘ線フィルム（LifeRay（登録商標）XDA Plus，Ferrania imaging technologies）に対して露出させられる。Ｘ線フィルムは、手操作で現像される。

一旦、膜がハイブリッド形成させられると、それらは、連続的なハイブリッド形成実験のために、沸騰に至った０．１％ SDSの溶液による２０分の２回の連続的な処理によって脱ハイブリッド形成させられ得る。

Ｂ）構築物の調製およびクローニング
（１ｂ）ベクターおよび挿入物の調製
ベクターは、１００μｌの反応容積における適切な酵素によるプラスミドDNAの消化によって調製される。消化産物は、次いで、GFX（登録商標）PCR，DNA and Gel Band Purificationキット（Amercham）を用い、供給元の推奨に従って精製され、３０μｌの溶出バッファにおいて開始される。平滑末端を生じさせる酵素により消化されたベクターは、アルカリホスファターゼにより処理される。このようにして、全体的な精製された消化産物は、４０μｌの反応容積において1X NEB3 バッファ（New England Biolabs）と共に１ＵのCIP¹（New England Biolabs）を用いて、１時間にわたり３７℃で脱リン酸化される。脱リン酸化されたベクターは、次いで、ＧＦＸ（登録商標）カラム（GFX（登録商標）PCR,DNA and Gel Band Purificationキット，Amersham）上で精製される。

挿入物は、５０μｌの反応容積における高フィデリティポリメラーゼ（Pfu，Promega）により産生されたPCR増幅産物である。PCR増幅は、供給元の推奨に従って、そのバッファ（1X）、２００μＭのdNTP、０．５μＭの各プライマーおよび１．２５ＵのTaqの存在下に行われる。３分間にわたる９５℃での変性の終了時に、PCRサイクルは、特定の条件に従って行われた：テンプレートへのプライマーのアンカリングは、プライマーの平均Tmで３０秒にわたり行われ、フラグメントの伸長は、増幅させられるべきｋｂｐ当たり７２℃で１分間にわたって行われ、３０回の増幅サイクルが行われた。期待されるサイズのPCR産物が、次いで、アガロースゲルからGFX（登録商標）カラム（GFX（登録商標）PCR,DNA and Gel Band Purificationキット，Amercham）上で精製され、３０μｌの溶出バッファにおいて開始された。挿入物が、次いで、４０μｌの反応容積中の適切な酵素により消化される。消化産物は、GFX（登録商標）カラム（GFX（登録商標）PCR,DNA and Gel Band Purificationキット，Amersham）上で精製される。

ベクターおよび挿入物の質および量は、それぞれ、1X TAEにおける非変性条件下の電気泳動および２６０ｎｍにおける光学密度を測定することによって評価される。

（２ｂ）ライゲーション
各ライゲーション反応のために１００ｎｇのベクターが用いられ、このベクターに、以下の式にしたがって所望量の挿入物が加えられた：挿入物の重量（ｎｇ）＝比（挿入物／ベクター）×（ベクター重量（ｎｇ）×挿入物サイズ）／ベクターサイズ。数種類のベクター／挿入物のモル比が用いられた：１：１、１：３、１：５。２０時間にわたり１６℃で１０μｌの反応容積において行われる種々のライゲーション反応のために２μｌの5Xリガーゼバッファー（Invitrogen）を有する（１＋１／２）単位のT4 DNAリガーゼ（Invitrogen）が用いられた。

（３ｂ）コンピテント大腸菌（JM110，Promega）の形質転換
５マイクロリットルのライゲーション産物が５０μｌのコンピテント細胞に加えられる。１０分間にわたる氷中のインキュベーションの後、細菌は、４２℃での５０秒にわたる熱ショックによって形質転換させられ、直ちに２分間にわたり氷に戻される。次いで、７００マイクロリットルの冷SOC培地が細胞に加えられ、これは、１時間にわたり３７℃で攪拌しながら（２２５ｒｐｍ）インキュベートされる。次いで、細菌は、選択培地（すなわち、５０μｇ／ｍｌのアンピシリンにより補給されたLB）上で一定分量により（すなわち５０〜３００μｌ）平板培養され、培養物は、その後インキュベーターに３７℃で終夜にわたって置かれる。

陽性クローンは、コロニーについてのPCRによって確証される。

（４ｂ）大腸菌プラスミドＤＮＡの調製
細菌（すなわち、白金耳を用いて集められる２０μｌのグリセロール化された培養物またはコロニー）が、１０ｍｌの選択的LB培地に接種される。３７℃で攪拌しながら（２２５ｒｐｍ）の終夜培養の後、培養物は、１５分間にわたり４０００ｒｐｍで遠心分離にかけられ、GFX（登録商標）Micro plasmid prepキット（Amersham）を用い、供給元の推奨に従ってプラスミドDNAが細胞ペレット状物から抽出され、６０μｌの溶出バッファにおいて開始される。

（５ｂ）Agrobacterium tumefaciens（GV3101株）のエレクトロポレーション
１〜２μｌのDNAが、４０μｌのコンピテントアグロバクテリウムに加えられ、これは、次いで、２分間にわたって氷中でインキュベートされる。次いで、プラスミドDNAのアグロバクテリウムへの統合が、エレクトロポレーション（Biorad Gene Pulserシステム）によって事前に冷却された４ｍｍタンクにおいて２．５ｋＶ（２５μＦ；２００オーム）の電気放電を印加することにより行われる。次いで、１ｍｌの冷SOC培地が細胞に加えられ、その後に、それらは３時間にわたって２８℃で攪拌しながら（２２５ｒｐｍ）インキュベートされる。

形質転換体の一定分量（すなわち、５０〜３００μｌ）が、選択培地（すなわち、５０μｇ／ｍｌのリファンピシンおよび５０μｇ／ｍｌのカナマイシンにより補給されたLB）上で平板培養され、培養物は、その後、２〜３日にわたって２８℃でインキュベートされる。

（６ｂ）アルカリ性融解によるA.tumefaciensプラスミドDNAの調製
アグロバクテリウムは、１０ｍｌの選択LB培地に接種され、３０時間にわたって（あるいは用いられた株に応じてそれ以上にわたって）２８℃で攪拌しながら（２２５ｒｐｍ）培養される。１５分間にわたる４０００ｒｐｍでの細胞の遠心分離後に得られる細菌ペレット状物が、５０ｍＭのトリス、１０ｍＭのEDTA、１００μｇ／ｍｌのRNアーゼＡおよび５ｍｇ／ｍｌのリゾチームの１００μｌに再懸濁させられる。５分間にわたる氷中でのインキュベーションの後、２００μｌの融解バッファが加えられる（２００ｍＭのNaOH、１％ｗ／ｖのSDS）。細菌壁融解は、４分間にわたって４℃で行われる。最後に、２００μＬの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．５）が加えられ、混合物は、４℃で１０分間にわたって１３０００ｒｐｍの遠心分離にかけられ。上澄に含まれるDNAは、フェノール−クロロホルムによる２回の精製工程の後に、エタノール（１／１０（ｖ／ｖ）の３Ｍ NaAc；ｐＨ５．５、２倍容積の１００％エタノール）により３０分間にわたって−２０℃で沈殿させられる。沈殿させられたDNAは、４℃での４５分間にわたる１５０００ｇの遠心分離によってペレット状にされる。７０％エタノールによる洗浄工程の後、ＤＮＡペレット状物は、６０μｌの１Ｍトリス−HCl（ｐＨ８）に溶出させられる。

Ｃ）細胞生物学プロトコル
（１ｃ）タバコ（BY2）プロトプラストの取得
タバコプロトプラストは、２〜３日齢のNicotiana tabaccum BY2細胞懸濁液の培養物から単離される。２０分間にわたって室温で沈降させることによって５０ｍｌの細胞懸濁液が分離された後、上澄が取り除かれ、４０ｍｌの０．４Ｍマンニトールにより置換される。細胞は、室温での３０分のインキュベーションの終了時に原形質分離され、次いで、マンニトールが取り除かれる。第１のプロトプラスト単離工程が、１２．５ｍｌの酵素溶液と共に暗所で３０分間にわたり２８℃で穏やかに攪拌（５５ｒｐｍ）しながら原形質分離された細胞をインキュベートすることによって行われる。次いで、細胞凝集物は、プラスチック製のパスツールピペットを用いて５回連続的に上下にピペッティングすることによって解離される。次いで、第２のインキュベーションが、２時間にわたって２８℃で攪拌（５５ｒｐｍ）しながら暗所で行われる。このようにして得られたプロトプラストは、４℃で１５分間にわたって１００ｇの遠心分離にかけられ、酵素溶液が取り除かれる。

エレクトロポレーション前に、プロトプラストを維持するように２０ｍｌの０．４Ｍマンニトールが加えられ、これは、氷中に維持される。次いで、単離されたプロトプラストが計数される。次いで、プロトプラストは、４℃で１５分間にわたり１００ｇの遠心分離にかけられ、容積（ｍｌ）当たり１０^６のプロトプラストの密度を得るために、０．４Ｍのマンニトールの適切な容積において開始され；それらは、次いで、エレクトロポレーションの前に氷中に維持される。

（１ｂ）イネ（O₂₄₂₈）プロトプラストの取得
イネプロトプラストは、３〜５日齢のO.sativa O₂₄₂₈細胞懸濁液の培養物から、以前に記載されるようにして（Brugidouら，1995；Ndjiondjopら，2001）少しの改変が導入されて単離される。１０分間にわたる１００ｇでの遠心分離の後、上澄が取り除かれ、１００ｍｌの沈降細胞当たり１５〜２５ｍｌのR2培地により補給された１５〜２５ｍｌのPIS培地（各培地の１：１の比を維持している）と置換される。プロトプラストは、その後、２８℃で２０時間にわたり暗所において穏やかに攪拌しながら（５５ｒｐｍ）インキュベーションした後に単離される。次いで、数ミリリットルのCPW 13%MMa培地が、ふるい（５０μｍ）によるプロトプラストのろ過を促進するために単離されたプロトプラストの溶液に加えられる。ろ過されたプロトプラストは、４℃で１０分間にわたり１００ｇの遠心分離にかけられ、次いで、上澄は取り除かれ、１５ｍｌのCPW 13% MMaと置換され、エレクトポレーション前に氷中に維持されたプロトプラストが維持される。プロトプラストを計数する間、後者は、４℃での１０分間にわたる１００ｇの遠心分離によって沈降させられ、ペレット状物は、所望のプロトプラスト密度が得られるように適切な容積のCPW 0.04% MMAにおいて開始され、エレクトロポレーションの前に氷中に維持される。

（１ｃ）プロトプラストの計数
プロトプラストの数および生存率は、トリパンブルーの存在下に血球計数器を用いた計数によって評価される。プロトプラスト（２００μｌ）は、ハンクス平衡塩（３００μｌ）（Sigma）およびトリパンブルー（５００μｌ）の溶液中に１／５に希釈される。

（１ｄ）タバコおよびイネのプロトプラストのエレクトロポレーション
エレクトロポレーション反応は、２００μｌの接種源を有する６００μｌのエレクトロポレーション培地（すなわち、エレクトロポレーションバッファに希釈された３０μｇのインビトロ転写物または５μｇのプラスミドDNA）を、単離されたプロトプラストの１ｍｌの遠心分離（すなわち、５分、１００ｇ、４℃）の終了時に沈降させられたプロトプラストと混合することによって行われる。混合物は、Biorad Gene Pulserシステムを用いた２５０Ｖ（２５μＦａ，２００オーム）の電気放電に付される。エレクトロポレーションの後、プロトプラストは、３０分間にわたり氷中でおよび５分間にわたり室温で維持され、４℃で１０分間にわたり１００ｇの遠心分離にかけられる。上澄が取り除かれ、適切な容積のプロトプラスト培養培地（すなわち、イネ用のR2培地）と置換され、次いで、プロトプラストは、７日間にわたり２８℃で攪拌しながら（９０ｒｐｍ）暗所で維持される。

Ｄ）ウイルス発現およびＶＩＧＳベクター構築物の確証
（１ｄ）インビトロ転写
種々の構築物のプラスミドDNAは、HindIII酵素を用いた制限（すなわち、ウイルスゲノムの３’）およびその後の１時間にわたる３７℃での２ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫによる処理によって線形にされる。線形にされたDNAは、フェノール／クロロホルムによる２回の処理によって精製され、エタノールによって−２０℃で終夜沈殿させられる。

インビトロ転写は、１００μｌの反応容積において、５μｇの線形にされたＤＮＡについて、１０ｍＭのDTT、０．１ｍｇ／ｍｌのBSA、０．５ｍＭのCapアナログ構造（m⁷G(5’)ppp(5’)G，New England Biolabs）、rNTP（２ｍＭのrATP、２００μＭのrGTP、２ｍＭのrCTF、２ｍＭのrUTP）、８０ＵのRNAsin（Promega）、１００ＵのT7 RNAポリメラーゼ（Promega）存在下にその反応バッファにより行われる。３７℃で１時間の反応の終了時に、１μｌの転写物が、アガロースゲル上を移動させられ、１２ＵのT7 RNAポリメラーゼが、反応の第２の時間にわたって加えられる。

転写の終了時に、転写物の質および量は、アガロースゲル上の移動および２６０ｎｍでの光学密度を測定することによって評価される。

（２ｄ）RNA抽出
種々のサンプルのＲＮＡは、４ｍｌのプロトプラスト培地（１０分間にわたる１００ｇの遠心分離が先行する）から、０．５ｍｌのTRIzol Reagent（Invitrogen（登録商標））により、供給元の推奨に従って抽出された。抽出されたRNAは、１０μｌのＲＮアーゼ不含有水において開始された。

RNAの量および質は、それぞれ、２６０ｎｍでの光学密度を測定することおよび、非変性条件下の２μｇのRNAの0.5X TBEにおける５０Ｖ／ｃｍでの電気泳動によって評価された。

（３ｄ）RT-PCR RNA分析
線形にされた組換え型ベクターに対応する残留DNAテンプレート（すなわち、インビトロ転写の終了時）の増幅からのバイアスを排除するために、DNアーゼ処理がRNAについて行われる。処理の有効性は、PCＲ増幅の終了時に２μｌのDNアーゼ処理されたＲＮＡについて、組換え体の確証のために用いられたプライマーと同じプライマーを用いて評価される。

７５０ナノグラムのRNAが、１ＵのRQ1-DNアーゼ（Promega）により、そのバッファの存在下に、１０μｌの反応容積において、３０分間にわたり３７℃で処理される。１μｌの医療溶液（care solution）（Promega）を添加することによって反応は止められ、その後に、５分間にわたる６５℃でのインキュベーションが行われた。この処理は、サンプルについて二重に行われ、半分は、上記の処理の有効性を評価するために用いられることになり、もう半分は、以下に続く研究方法に従ってベクターを確証するために用いられる。DNアーゼ処理されたRNAは、６５℃で５分間にわたって１０ｐｍｏｌのアンチセンスプライマー（R20：5’ CTC CCC CAC CCA TCC CGA GA 3’またはオリゴｄＴ）および１０ｎｍｏｌのRNアーゼ不含有dNTPと共にインキュベートされる。氷中で、1X RTバッファ（Invitrogen）、１０ｍＭのDTT（Invitrogen）および４０ＵのRNアーゼ out（Invtrogen）の混合物が前の混合物に加えられ、４２℃で２分間にわたってインキュベートされる。最後に、２００ＵのSuperscript II（Invtrogen）が反応混合物に加えられる。RNAの相補鎖は、４２℃での５０分間のインキュベーションの終了時に合成され、反応は、７０℃でのインキュベーションの１５分後に止められる。次いで、サンプルは、３７℃で３０分間にわたって１００ＵのRNアーゼＨ（Invitrogen）により処理される。

逆転写反応の終了時に、１２．５μｌの反応容積中の２．５または５μｌのサンプル（または１５μｌの最終容積中の５μｌのRT）について、２ｍＭのMgCl₂、０．２ｍＭのdNTP、０．１μＭの各プライマー、０．０２ＵのDNAポリメラーゼ（Interchim）および1Xの増幅バッファの存在下に、PCRが行われる。増幅プログラムは、９４℃で３分間にわたる変性で始まり、次いで、３０回の増幅サイクル（９４℃で４５秒にわたる変性、用いられるプライマーの平均温度Tmで３０秒にわたるハイブリッド形成、増幅させられるべきｋｂｐ当たり１分間にわたる７２℃での伸長）が行われ、７２℃での５分の最終伸長工程で増幅反応が終わる。

１０マイクロリットルの増幅産物が、電気泳動によって、非変性条件下に、アガロースゲル上で、1X TAEにおいて１００Ｖ／ｃｍで分離される。

（４ｄ）ウエスタンブロッティングによるタンパク質分析
− タンパク質の分離
１０マイクログラムのタンパク質が、ローディングバッファの１／４と混合され、１００℃で１５分間にわたって変性させられる。次いで、タンパク質は、変性条件下に、１２．５％ SDS-PAGEゲル上で分離される。適切な移動緩衝液において２段階で電気泳動が行われる：
− サンプルは、８０Ｖ／ｃｍでの移動によってゲルの第１の部分に濃縮される（すなわち、スタッキング）；
− 次いで、それらは、３〜４時間にわたる移動の終了時に（すなわち、ローディングバッファからの青色がゲルを出るまで）１００Ｖ／ｃｍで分離される。

− エレクトロブロッティング
移動の終了時に、タンパク質は、０．４５μｍのニトロセルロース膜（Trans-Blot（登録商標）Transfer Medium，Biorad）上に、４℃で１時間にわたって１００Ｖまたは終夜２０Ｖの電圧を印加することによってエレクトロブロッティングされる。

−免疫検出
全てのインキュベーションおよび洗浄工程が室温で（プラットフォームシェーカーを用いて）それぞれインキュベーションおよび洗浄工程のために２０〜２５ｒｐｍおよび４５〜５０ｒｐｍの可変速度で攪拌しながら行われる。

膜は、１時間にわたって、ＴＢＳｔおよび０．５％ｗ／ｖのBSA（モノクローナル抗体による免疫検出）または３％ｗ／ｖの脱脂粉乳（Biorad）（ポリクローナル抗体による免疫検出）を含有する阻止溶液（blocking solution）においてインキュベートされる。次いで、膜は、１時間にわたって、同じ阻止溶液中に１／１０００に希釈された第１の抗体と共にインキュベートされる。用いられるモノクローナル抗体MabEは、RYMVのエピトープを用いて得られ、これに対して、ポリクローナル抗体Pab Maliの溶液は、Mali分離株の全体的なウイルス粒子を用いて得られた。次いで、膜は、５分間にわたるTBStによる６回の連続洗浄によってリンスされ、次いで、１時間にわたって、新しい阻止溶液中に１／４００００に希釈された第２の抗体（それぞれ、モノクローナルまたはポリクローナル抗体による血清反応を明らかにするためにペルオキシダーゼにカップリングさせられた抗マウスIgGまたは抗ウサギIgG）と共にインキュベートされる。６回の連続的な５分間にわたるTBStにおける膜の洗浄が、次いで、行われる。抗原−抗体の相互作用は、化学発光によって明らかにされ、励起は、ペルオキシダーゼとの化学反応を用いて、膜に塗布され、５分間にわたって光中でインキュベートされたWest Pico溶液（Pierce）の存在下に引き起こされる。サランラップにラッピングされた膜は、次いで、Ｘ線フィルム（CL-X Posure（登録商標）Film，Pierce）に、室温で所望のシグナル強度に応じた可変期間にわたって露出される。Ｘ線があてられたフィルムは、手操作で現像された。

（分子生物学バッファ）
10X TBE：０．９Ｍのトリス−ホウ酸塩、２０ｍＭのEDTA
50X TAE：２Ｍのトリス−酢酸塩、５０ｍＭのEDTA
（ウエスタンブロッティングのためのバッファおよび溶液）
分離用ゲル：１２％のアクリルアミド−ビスアクリルアミド（２９：１）、０．４Ｍのトリス HCl（ｐＨ８．８）、０．１％のSDS、０．１％の過硫酸アンモニウム、０．１％のTemed。

濃縮用ゲル：５％のアクリルアミド−ビスアクリルアミド（２９：１）、１２５ｍＭのトリスＨＣｌ（ｐＨ６．８）、０．１％のSDS、０．１％の過硫酸アンモニウム、０．１％のTemed。

移動緩衝液（migration buffer）：２５ｍＭのトリスベース（Tris base）、０．２５Ｍのグリシン、０．１％のSDS。

ブロッティングバッファ：２０ｍＭのトリスベース、０．１５Ｍのグリシン、２％のメタノール。

4X ローディングバッファ：２００ｍＭのトリスHCl（ｐＨ６．８）、４００ｍＭのDTT、８％のSDS、０．４％のブロモフェノールブルー、４０％のグリセロール。

TBS（ｐＨ７．５）：２０ｍＭのトリスベース、７５ｍＭのNaCl、２．５ｍＭのMgCl₂。

TBS-t：TBS、０．０５％のTween 20。

（細胞および細菌培養培地）
LB（ｐＨ７）：１０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母抽出物、１０ｇ／ｌのNaCl。

SOC：２０ｇ／ｌのトリプトン、５ｇ／ｌの酵母抽出物、０．５ｇ／ｌのNaCl、２．５ｍＭのKCl（ｐＨ７）。

滅菌ブドウ糖（２０ｍＭ）が、高圧滅菌後に培地に加えられる。

（細胞培養培地）
BY2タバコ細胞
タバコ懸濁液（ｐＨ５．８）の維持：４．３ｇ／ｌのMS塩（Duchefa M0221）、１ｍｇ／ｌのチアミンHCl、１００ｍｇ／ｌのミオイノシトール、３０ｇ／ｌのスクロース、０．２ｍｇ／ｌの2,4-D。

プロトプラスト培養培地（ｐＨ５．８）：４．３ｇ／ｌのMS塩（Duchefa M0221）、１ｍｇ／ｌのチアミンHCl、１００ｍｇ／ｌのミオイノシトール、１０ｇ／ｌのスクロース、０．４ＭのＤ−マンニトール、０．２ｍｇ／ｌの2,4-D。

プロトプラスト調製のための酵素溶液（ｐＨ５．５）：１％のセルラーゼOnozuka RS、０．１％のペクトリアーゼY-23、０．４ＭのＤ−マンニトール。溶液は、０．２２μｍによるろ過によって滅菌され、２５ｍｌの容積に等分される。−２０℃での保存。

プロトプラストのエレクトロポレーション培地（ｐＨ５．８）：０．３Ｍのマンニトール、７０ｍＭのKCl、５ｍＭのMES。

Ｏ_２４２８イネ細胞
PIS培地（プロトプラスト調製のための酵素溶液）（ｐＨ６）：２％のセルラーゼRS、０．１％のペクトリアーゼY23。酵素は、CPW 13% MMaに希釈され、０．２２μｍへのろ過によって滅菌される。溶液は、−２０℃で保存される。

CPW 13% MMa培地（プロトプラスト）：
100X溶液：２０ｍＭのKH₂PO₄、０．１ＭのKNO₃、０．２ＭのMgSO₄
CPW 13% MMa（ｐＨ５．８）：１０ｍｌ／ｌの100X溶液、１０ｍｇ／ｍｌのKI、１０ｍｇ／ｍｌのCuSO₄・5H₂O、５ｍＭのMES、１０ｍＭのCaCl₂、０．７Ｍのマンニトール。溶液は、−２０℃で保存されるべきである。

CPW 0.04% MMa培地（プロトプラスト）：
培地は、CPW13%MMa培地と同じ組成であるが、マンニトールの濃度のみが変わる：０．４Ｍ。

R2培地（プロトプラスト）：
多量要素（macroelements）R2-I（10X）：４０ｇ／ｌのKNO₃、３．３ｇ／ｌの(NH₄)₂SO₄、３．１２ｇ／ｌのNaH₂PO₄・H₂O、１０ｍＭのMgSO₄。

多量要素R2-II（10X）：１．４６ｇ／ｌのCaCl₂・2H₂O
多量要素R2（1000X）：１．６ｇ／ｌのMnSO₄・H₂O、２．２ｇ／ｌのZnSO₄・7H₂O、２．８３ｇ／ｌのH₃BO₃、０．１２５ｇ／ｌのCuSO₄・5H₂O、０．１２５ｇ／ｌのNa₂MoO₄・2H₂O。

ビタミンR2（40X）：４０ｍｇ／ｌのチアミンHCl。

FeNaEDTA（100X）：１．２５ｇ／ｌのFeSO₄・7H₂O、０．５ｍＭのNa₂EDTA。

R2培地（ｐＨ５．８）：1X多量要素R2-I、1X多量要素R2-II（1X）、1X微量要素R2、1XビタミンR2（1X）、1X FeNaEDTA、２．５ｍｇ／ｌ、2,4-D、０．４Ｍのマルトース、０．５ｍｇ／ｌのニコチン酸、１００ｍｇ／ｌのミオイノシトール、０．５ｍｇ／ｌのピロドキシン（pyrodoxine）。

書誌参照
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gus消滅による遺伝子組換え系統における、ウイルス感染の間の、接種後１〜３０日のGus活性の回復の速度論（日）。（ａ）種々の遺伝子組換え系統のイネの葉におけるおよび種々の接種条件によるGus組織化学染色の結果。コントロールは、L4NIに相当する：L4遺伝子組換え系統は、uidA導入遺伝子およびL10 NI/BIを構成的に発現する：uidAを有するL10遺伝子組換え系統は、構成的に消滅させられ、接種され、および、バッファにより接種される。L10を用いてウイルスが接種された葉上のGus活性についての組織化学染色は、接種後１および２日に接種された葉において、および、７、１４および３０日に全体的に感染された葉において制御される。ウイルスの接種は、標準の接種物により行われる（条件 H^cI）。（ｂ）３０日でのL10を用いる感染葉におけるGus活性についての組織化学染色の結果。それぞれの独立した接種条件ごとに（H^cIまたはL^cI）、クラスI〜Vに属する対比化された症状強度を有する植物は、一緒にグループ化される。 L10を用いて全体的に感染し、３０日で収穫された葉において示される、RYMVによるサイレンシング抑制についてのウイルスの含有量の効果。ウイルスの含有量に合致する、蛍光光度法（ｐｍｏｌＭＵ／分／μｇ（タンパク質）で表され、影付きヒストグラムにより示される）によるGuｓ活性の測定は、DAS-ELISAによって評価され、吸光度（Ａ_４０５ｎｍ）に対応するデータは黒点によって示される。コントロールは、4NIに対応し、L4遺伝子組換え系統は、uidA導入遺伝子およびL10 NI/BIを構成的に発現し、uidAを有するL10遺伝子組換え系統は、構成的に消滅させられ、それぞれ、接種されないか、バッファと共に接種される。酵素活性も、３０日において見かけの症状の強度により（クラスIからVに）分類されるウイルス（すなわち、gus消滅を伴うL10系統）が接種された植物を用いて葉において測定された。（ａ）標準的な接種条件下でのウイルスの接種後の結果（H^cI）；（ｂ）弱い接種条件下でのウイルス接種後の結果（L^cI）。 gus特異的siRNAについての種々のP1の定量的効果；ウイルスの系統発生の代表的なRYMV分離株（sP1-Mg1、-Tz3、-Tz8、-Ci63）の種々のs-P1の微粒子銃による２日のgus特異的siRNAの検出のためのノーザンブロッティング実験。siRNAの検出は、イネの栽培品種Taipei、またはgus導入遺伝子の構成的発現を有する遺伝子導入イネ系統L4、N.benthamina 16c系統（16c）およびgus導入遺伝子の構成的発現を有する遺伝子導入イネ系統L10の葉から抽出された全ＲＮＡについて行われる。イネの葉は、種々の処理の後に分析される：無傷の葉（送ＮＤ；not delivered）、傷有りの葉（BD；微粒子銃によるバッファの送達）および微粒子銃によりsP1-Mg1、-Tz8、-Tz3、-Ci63、-BF1が接種された葉（Mg1、Tz8、Tz3、Ci63、BF1）。16cの葉は、uidA遺伝子上にPTGSを一過性に誘導するためにGusイントロンを有するバイナリープラスミドを有するA.tumefaciens株が浸透され（Ｉ）、浸透の５日後に分析される。rRNAの臭化エチジウム染色は、コントロールとして機能する。種々のRYMV分離株についての関係樹。系統樹は、種々の分離株のキャプシドタンパク質（CP）をエンコードするORF₃の核酸配列の配置に基づく近隣結合法に従って構築される。種々の分析のために用いられる分離株は、灰色で強調される。種々の血清群の組織に入る資格は、この樹の右に示される。種々の分離株に応じたPTGSの持ち上げ（lifting）の定量的研究。分離株（その名称は、図のｘ軸上に報告される）が全体的に感染し、３５日で集められた葉のタンパク質について行われたGus活性（Act.Gus）についての酵素アッセイの結果。酵素活性の回復レベルは、予想活性レベルとしての基準L4系統の酵素活性の百分率として表される。コントロールは、接種されないL4系統の葉（NI）および接種されずかつバッファにより接種される系統の葉（BI）から抽出されたタンパク質についてのGus活性をアッセイすることからなる。酵素活性（含まれる全分離株）の回復。制御された接種に応答する血清群２の種々の分離株に応じたPTGSの持ち上げの定量的および定性的研究。接種後２０および４０日におけるGus活性についての酵素アッセイの結果の比較。下図は、２０および４０日の間の酵素活性の回復の相対的な変動を示す。 PTGSについての、ウイルスの系統発生を代表する種々の分離株のP1の特有の効果の定量的評価。（ａ）pCambia1305.1（Gus）を含むA.tumefaciens株および種々の構築物pBin-P19、pBin-P1-HAおよびbin-P1（その名称は、図のｘ軸上に報告される）と共浸透させられ、３および４日に集められたN.benthamiana葉からのタンパク質について行われたGus活性についての酵素アッセイの結果。酵素活性の回復のレベルは、基準活性としてpCambia1305.1のみが浸透させられた葉の酵素活性の百分率として表される。各P1タンパク質について、３つの独立のサンプルが分析され、測定値の標準偏差は、バーによって図上に示される。（ｂ）３および４日におけるGus活性についての酵素アッセイの結果の比較および３および４日の間の基準レベルに対する酵素活性の強化における相対的な変動の表示。用いられた種々の感染性クローンおよび生じたウイルスベクター：サブゲノムRNAプロモーターに対応し、１４の追加的なヌクレオチド（ACG TAC TAG TGGGC）に対応する。クローニングのために用いられた種々の制限部位の位置および名称は、下向き矢によってウイルスゲノム上に示される。RT-PCRによってベクターを確証するために用いられたプライマーの位置および名称は、矢印により示される。クローンC-gfpの研究；（ａ）BY2プロトプラストにおけるもの；（ｂ）O₂₄₂₈プロトプラストにおけるもの。エレクトロポレーションされかつ２、３、４、５、６、および７日に集められたプロトプラストのRNAについて行われたRT-PCRの結果。種々のエレクトロポレーション条件が分析され、プロトプラストは、エレクトロポレーションされなかったもの（NE）、C-gfpクローンのインビトロ転写物によりエレクトロポレーションされたもの（Cg）、C-gfpクローンおよびプラスミドp19のインビトロ転写物によりエレクトロポレーションされたもの（Cg+p19）、感染性クローンFL5のインビトロ転写物によりエレクトロポレーションされたもの（FL）およびコントロールプラスミド35S-gfpによりエレクトロポレーションされたもの（gfp）である。３回のPCR増幅がRT産物について行われ、プライマー対：R15-R16、R19-GFP2およびGFP1-GFP2によりＲ２０プライマーを用いて合成される。レーンＭ、FL-DNA、Cg-DNAおよびgfp-DNAは、それぞれ、サイズマーカーおよびFL5およびC-gfpクローンおよび35S-gfpのプラスミドDNAについて行われたPCR増幅物に対応する。 C-Gusクローンの研究；（ａ）BY2プロトプラストにおけるもの；（ｂ）O₂₄₂₈プロトプラストにおけるもの。エレクトロポレーションされ、かつ、２、３、４、５、６および７日に集められたプロトプラストのRNAについて行われたRT-PCRの結果。種々のエレクトロポレーション条件が分析され、プロトプラストは、エレクトロポレーションされなかったもの（NE）、C-Gusクローンのインビトロ転写物によりエレクトロポレーションされたもの（CG）、C-Gusクローンおよびプラスミドp19のインビトロ転写物によりエレクトロポレーションされたもの（CG+p19）、感染性クローンFL5のインビトロ転写物によりエレクトロポレーションされたもの（FL）、およびコントロールプラスミド35S-Gusによりエレクトロポレーションされたもの（Gus）である。３回のPCR増幅がRT産物について行われ、R20プライマーを用いて、プライマーR15-R16、R19-GUS2およびGUS1-GUS2の対により合成された。レーンＭ、FL-DNA、CG-DNAおよびGus-DNAは、それぞれ、サイズマーカーおよびFL5およびC-Gusクローンのおよび35S-GusコントロールのプラスミドDNAについて行われたPCR増幅物に対応する。 Sit-gfpクローンの研究；（ａ）BY2プロトプラストにおけるもの；（ｂ）O₂₄₂₈プロトプラストにおけるもの。エレクトロポレーションされ、２、３、４、５、６および７日に集められたプロトプラストのRNAについて行われたRT-PCRの結果。種々のエレクトロポレーション条件が分析され、プロトプラストは、エレクトロポレーションされなかったもの（NE）、Sit-gfpクローンのインビトロ転写物によりエレクトロポレーションされたもの（Sg）、Sit-gfpクローンおよびプラスミドp19のインビトロ転写物によりエレクトロポレーションされたもの（Sg+p19）、感染性クローンFL5のインビトロ転写物によりエレクトロポレーションされたもの（FL）、および35S-gfpコントロールプラスミドによりエレクトロポレーションされたもの（gfp）である。３回のPCR増幅は、RT産物について行われ、R20プライマーを用いて、R15-R16、R19-GFP2およびGFP1-GFP2のプライマー対により合成された。R19-GFP2プライマーにより予想されるサイズより小さいサイズの増幅物は、プライマーR19およびR20（RTの残留プライマー）による増幅物に対応する。レーンＭ、FL-DNA、Sg-DNAおよびgfp-DNAは、それぞれ、サイズマーカー、FL5およびSit-gfpクローンのおよび35S-gfpコントロールのプラスミドDNAについて行われたPCR増幅物に対応する。種々のリコンビナーゼから生じたインビトロ転写物によるエレクトロポレーション４日後のN.tabaccmプロトプラスト（BY2）およびO.s.プロトプラスト（O₂₄₂₈）におけるレポーター遺伝子の発現の研究。Gfp（C-gfpおよびSit-gfp）を発現させるリコンビナーゼのために、タンパク質の視覚化は、可視光（vis）下でプロトプラストの観察後にUV照射（UV）下に行われた。エレクトロポレーションされなかったプロトプラスト（NE）の自己蛍光さらには35S-gfpコントロールプラスミドの発現によって生じた蛍光が評価され、発現ベクターによりエレクトロポレーションされたプロトプラストにおいて放たれたものと比較された。35S-GusコントロールプラスミドまたはC-GusリコンビナーゼによりエレクトロポレーションされたO₂₄₂₈プロトプラストにおいて組織化学アッセイによって検出されるGusの発現は可視光下に評価された。

Claims

サイレンシングに関して機能的多様性を有するRYMVのP1タンパク質のようなサイレンシングサプレッサーをエンコードする遺伝子の使用であって、
望みの興味の遺伝子を過剰発現またはサイレンシングさせる機能を有する植物ウイルスベクターを構築するための有効性のレベルを有する遺伝子の選択を包含する、使用。
P1タンパク質を選択するためのRYMV分離株から単離されたP1タンパク質の使用であって、種々のP1、より特定的には、Tz3、Tz8、Mg1、BF1、CI63が35Sプロモーターの下流でクローニングされ、PTGSについての所与レベルの活性のために、
− 適切なプロモーター、例えばRYMV 35Sプロモーターの下流で機能的多様性を有するサイレンシングサプレッサータンパク質をエンコードする遺伝子をクローニングすること；
− 微粒子銃によってイネの葉上にサプレッサータンパク質をエンコードする種々の発現カセットを接種すること；
− L2、4およびL10系統等の系統上にRYMVウイルスを機械的に接種すること；
− 所与の分離株、例えばマダガスカル分離株に対するポリクローナル抗体を用いるDAS-ELISAによってウイルス量をアッセイすること；
− 組織化学アッセイによってβ−グルコロニダーゼをエンコードするレポーター遺伝子（GUS）の発現の回復を視覚化すること；
− GUSの酵素活性をアッセイすることによってレポーター遺伝子の発現の回復を定量すること；
− ノーザンブロッティングによってsiRNA（PTGSの証拠）を検出すること、および
− 興味の遺伝子の過剰発現またはサイレンシングのいずれかに必要とされる活性のレベルを有するＰ１タンパク質を選択すること
を包含する技術を用いる、方法。
P1タンパク質の選択のために、種々のP1、より特定的には、Tz3、Tz8、Mg1、BF1、CI63が、35Sプロモーターの下流でクローニングされることを特徴とする請求項２に記載の使用。
PTGS抑制の高レベルの有効性を得るためにCI63またはTz3のP1タンパク質を使用することを特徴とする請求項３に記載の使用。
PTGSについての中程度レベルの有効性のTz8のP1タンパク質およびPTGS抑制における低レベルの有効性のためのMg1またはBF1のP1タンパク質を使用することを特徴とする請求項３に記載の使用。
興味の遺伝子の発現またはサイレンシングのためのウイルスベクターであって、
RYMVゲノムから生じさせられ、RYMVのP1タンパク質をエンコードする遺伝子を含むことを特徴とする、ベクター。
RYMVゲノムから生じさせられ、サイレンシングサプレッサーとしての機能的多様性を発現するP1タンパク質をエンコードする遺伝子を含み、この遺伝子は、P1タンパク質をエンコードするRYMVゲノムの遺伝子を置き換えることを特徴とする請求項６に記載のベクター。
サイズにおいて７００ｂｐ未満の、過剰発現させられるべきまたは消滅させられるべき興味の遺伝子の挿入物を含有するウイルス発現ベクターであることを特徴とする請求項７に記載のベクター。
サイズにおいて５０ｂｐ未満の挿入物を含有するVIGSベクターであり、ウイルスゲノム中の挿入物の配向にかかわりなく、そのターゲットは、挿入物のmRNAであることを特徴とする請求項６に記載のベクター。
RYMV増幅システムを用いる挿入物のサイズが７００ｂｐ超であることを特徴とする請求項８または９に記載のベクター。
請求項７〜１０のいずれか１つに記載のベクターであって、
− PCR増幅；
− 消化；
− ライゲーション；および
− コンピテント細菌の軽質転換
の工程を包含するプロトコルに従って得られることを特徴とするベクター。
発現ベクターは、
− インビトロ転写；
− 転写物を有するプロトプラストの調製およびエレクトロポレーション；
− エレクトロポレーション３〜７日後の挿入物の視覚化；
− 同じタイミングによるＲＮＡの抽出；および
− RT-PCRによる挿入された遺伝子の複製および安定性の確証
の工程を包含するプロトコルに従って確証されることを特徴とする請求項１１に記載のベクター。
VIGSベクターは、
− インビトロ転写；
− 転写物を有する、RYMVに対する可変の抵抗度を有する種々のイネ種および遺伝子組換え系統の機械的な接種；
− サイレンシング表現型の視覚化による表現型の特徴化；および
全RNAの抽出、低分子量RNAのポリアクリルアミドゲルのノーザンブロッティング、おおよびVIGSによってターゲットにされた遺伝子に特異的なsiRNAの検出による分子の特徴化
の工程を包含するプロトコルに従って確証されることを特徴とする請求項１０に記載のベクター。