JP3665321B2 - 植物内での増強発現 - Google Patents
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Description
本発明は、組換え体発現系に関し、詳しくは植物中でより大量の蛋白質を発現する植物発現系に関する。
植物中で蛋白質を生産するための組換え遺伝子は、植物中で機能するプロモーター、標的蛋白質をコードする構造遺伝子、及び植物中でポリアデニル化ヌクレオチドをＲＮＡ配列に付加させるべく機能する非翻訳領域をこの順序で含む。多くの科学研究が、より大量の標的蛋白質を発現させるためにこれらの組換え体植物遺伝子の改良に向けられてきた。
より高いレベルの発現の一つの利点は、耕種学的に重要である充分な量の標的蛋白質を生産する植物を回収するために、より少数のトランスジェニック植物が生産及びスクリーニングされる必要が有るということである。高レベルの発現は、商業的に重要な表現型特性を示す植物をもたらす。
改良された組換え体植物遺伝子が、植物ウィルス由来のプロモーターの如きより強力な
プロモーターの使用により見い出されている。プロモーターの５′側にエンハンサ−配列を配置することにより、発現の改良が遺伝子構築物で得られている。また更なる改良が、特に単子葉植物に於いて、構造遺伝子をコードする配列とプロモーターとの間に位置する非翻訳リーダー内にイントロンを有する遺伝子構築物によって達成されている。例えば、Callisら（1987年）Genes and Development , 1 巻、1183−1200ページは、アルコール脱水素酵素−１（Adh−1）イントロン又は Bronze−1 イントロンの存在が高レベルの発現に導くことを報告している。Dietrichら（1987年）J. Cell Biol., 105, 67ページは、５′非翻訳リーダー鎖長がプロトプラスト中での遺伝子発現に重要であると報告している。Mascarenhasら（1990年） Plant Mol. Biol., 15 巻,913−920ページは、Adh−1 イントロンの使用によりＣＡＴ発現の１２倍及び２０倍の増強を報告している。Vasil ら（1989年）Plant Physiol., 91, 1575−1579 ページは、Shrunken−1 （Sh−1） イントロンが、Adh−1 イントロン含有構築物に比べて約１０倍の高い発現を 生じさせることを報告している。Silva ら（1987年） J. Cell Biol., 105, 245ページは、ＣＡＴの発現に対する１８Ｋｄ熱ショック蛋白質（ＨＳＰ１８）遺伝子の非翻訳領域の作用についての研究を報告している。Semrauら（1989年） J. Cell Biol., 109, 39Aページ及び、Mettler らN.A.T.O. Advanced Studies Institute on Molecular Biology, Elmer, Bavaria（1990年 5月）は、８２Ｋｄ熱ショック蛋白質（ＨＳＰ８２）の１４０ｂｐイントロンが、トウモロコシプロトプラスト中で発現を増強することを報告している。
プロモーターの使用により見い出されている。プロモーターの５′側にエンハンサ−配列を配置することにより、発現の改良が遺伝子構築物で得られている。また更なる改良が、特に単子葉植物に於いて、構造遺伝子をコードする配列とプロモーターとの間に位置する非翻訳リーダー内にイントロンを有する遺伝子構築物によって達成されている。例えば、Callisら（1987年）Genes and Development , 1 巻、1183−1200ページは、アルコール脱水素酵素−１（Adh−1）イントロン又は Bronze−1 イントロンの存在が高レベルの発現に導くことを報告している。Dietrichら（1987年）J. Cell Biol., 105, 67ページは、５′非翻訳リーダー鎖長がプロトプラスト中での遺伝子発現に重要であると報告している。Mascarenhasら（1990年） Plant Mol. Biol., 15 巻,913−920ページは、Adh−1 イントロンの使用によりＣＡＴ発現の１２倍及び２０倍の増強を報告している。Vasil ら（1989年）Plant Physiol., 91, 1575−1579 ページは、Shrunken−1 （Sh−1） イントロンが、Adh−1 イントロン含有構築物に比べて約１０倍の高い発現を 生じさせることを報告している。Silva ら（1987年） J. Cell Biol., 105, 245ページは、ＣＡＴの発現に対する１８Ｋｄ熱ショック蛋白質（ＨＳＰ１８）遺伝子の非翻訳領域の作用についての研究を報告している。Semrauら（1989年） J. Cell Biol., 109, 39Aページ及び、Mettler らN.A.T.O. Advanced Studies Institute on Molecular Biology, Elmer, Bavaria（1990年 5月）は、８２Ｋｄ熱ショック蛋白質（ＨＳＰ８２）の１４０ｂｐイントロンが、トウモロコシプロトプラスト中で発現を増強することを報告している。
より改良された組換え体植物遺伝子の研究が、上記の理由により続けられている。
（発明の概要）
本発明は、植物中でのキメラ植物遺伝子の発現のための、詳しくは単子葉植物中でのより高い発現を達成するための改良された方法に関する。本発明の改良点は、遺伝子プロモーターから３′で且つ蛋白質をコードする構造ＤＮＡ配列から５′に位置する非翻訳リーダー内に、本質的に配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３から成る群から選ばれる７０Ｋｄトウモロコシ熱ショック蛋白質（ＨＳＰ７０）から誘導されるイントロンを有するキメラ植物遺伝子を発現することを含む。
本発明は、植物中でのキメラ植物遺伝子の発現のための、詳しくは単子葉植物中でのより高い発現を達成するための改良された方法に関する。本発明の改良点は、遺伝子プロモーターから３′で且つ蛋白質をコードする構造ＤＮＡ配列から５′に位置する非翻訳リーダー内に、本質的に配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３から成る群から選ばれる７０Ｋｄトウモロコシ熱ショック蛋白質（ＨＳＰ７０）から誘導されるイントロンを有するキメラ植物遺伝子を発現することを含む。
本発明の一の実施態様は、
（ａ）植物中でＲＮＡ配列を産生させるべく機能するプロモーター、
（ｂ）本質的に配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３から成る群から選ばれるイントロンを含む非翻訳リーダーＤＮＡ配列、
（ｃ）蛋白質をコードするＲＮＡ配列の産生を引き起こす構造ＤＮＡ配列、及び
（ｄ）植物細胞内でＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニル化ヌクレオチドを付加させるべく機能する３′非翻訳配列（ここで、イントロンはプロモーターに関して異種である）をこの順序で含む組換え二重鎖ＤＮＡ分子である。
（ａ）植物中でＲＮＡ配列を産生させるべく機能するプロモーター、
（ｂ）本質的に配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３から成る群から選ばれるイントロンを含む非翻訳リーダーＤＮＡ配列、
（ｃ）蛋白質をコードするＲＮＡ配列の産生を引き起こす構造ＤＮＡ配列、及び
（ｄ）植物細胞内でＲＮＡ配列の３′末端にポリアデニル化ヌクレオチドを付加させるべく機能する３′非翻訳配列（ここで、イントロンはプロモーターに関して異種である）をこの順序で含む組換え二重鎖ＤＮＡ分子である。
本発明の他の実施態様は、本質的に配列番号：１に示されるヌクレオチドから成る単離したＤＮＡ配列である。
本発明の他の実施態様は、本質的に配列番号：２に示されるヌクレオチド及び配列番号：３に示されるヌクレオチドから成る群から選ばれる合成ＤＮＡ配列である。
本発明の他の実施態様は、上記キメラ植物遺伝子を含むトランスジェニック植物、特にトランスジェニック単子葉植物である。その結果得られたトランスジェニック植物は、植物細胞の染色体中に挿入された外来遺伝子を発現することが出来る。
本発明は、トランスジェニック植物中で発現した場合、本発明のキメラ遺伝子内の構造コード配列によりコードされるより大量の目的蛋白質を与えるキメラ植物遺伝子を提供する。高蛋白質レベルは、存在する蛋白質に依存して植物に重要な耕種学的性質を賦与する。例えば、Bacillus thuringiensis結晶トキシン蛋白質の発現は、トランスジェニック植物を昆虫の攻撃から防御する。植物ウィルスコート蛋白質の発現は、植物ウィルス感染からトランスジェニック植物を防御する。グリホセート（glyphosate）耐性遺伝子の発現は、グリホセート除草剤の除草作用からトランスジェニック植物を防御する。
本発明のキメラ遺伝子のイントロンを、Rochester ら（1986年）Embo.J., 5:451−458によって記載されたｐＭＯＮ９５０２中の７０Ｋｄトウモロコシ熱ショック蛋白質（ＨＳＰ７０）からポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ）を用いて誘導した。本明細書中に記載したイントロン配列（配列番号：１）は、７７３塩基対のＨＳＰ７０イントロン、１０塩基対のフランキング５′エクソン配列及び、１１塩基対のフランキング３′エクソン配列を含む。イントロンを単離するために用いたプライマーは、ＰＣＲ産物が、５′末端に６塩基対のＢｇｌＩＩ部位及び３′末端に６塩基対のＮｃｏＩ部位を含むように設計する。
キメラ遺伝子は、植物プロモーター、評価可能な（scarable）マーカーコード配列及び、ポリアデニル化コード配列を含む発現ベクターの５′非翻訳リーダー内のＢｇｌＩＩ及びＮｃｏＩ部位中に前記イントロンを挿入することによって構築される。所望の蛋白質をコードする構造ＤＮＡ配列の挿入を可能にする適切な制限部位を有する発現ベクターを構築する。特に断らない限り、通常のクローニング手法及びスクリーニング手法を用いる。
ＨＳＰ７０イントロンを含む本発明の遺伝子は、所望の植物種の形質転換に適する植物形質転換ベクター中に挿入することが出来る。適切な植物形質転換ベクターとしては、Agrobacterium tumefaciens のＴｉプラスミドから誘導されるものが挙げられる。植物形質転換ベクターは、好ましくは、植物又は植物細胞の形質転換に必要とされる全ての必要な構成要素を含む。典型的植物形質転換ベクターは、選択可能マーカー遺伝子、１個又は両方のＴ−ＤＮＡボーダー、クローニング部位、トランスコンジュゲ−ト（transconjugates）の同定を容易にする適当な細菌遺伝子、広範な宿主域での複製及び転移機能及び、他の所望の構成要素を含む。
ＨＳＰ７０イントロンを含む本発明の遺伝子は、所望の植物種の形質転換に適する植物形質転換ベクター中に挿入することが出来る。適切な植物形質転換ベクターとしては、Agrobacterium tumefaciens のＴｉプラスミドから誘導されるものが挙げられる。植物形質転換ベクターは、好ましくは、植物又は植物細胞の形質転換に必要とされる全ての必要な構成要素を含む。典型的植物形質転換ベクターは、選択可能マーカー遺伝子、１個又は両方のＴ−ＤＮＡボーダー、クローニング部位、トランスコンジュゲ−ト（transconjugates）の同定を容易にする適当な細菌遺伝子、広範な宿主域での複製及び転移機能及び、他の所望の構成要素を含む。
植物細胞の形質転換は、ベクター又はＤＮＡでコートした微粒子発射体を植物組織中へ高速で打ち込むことから成る粒子銃（particle gun）の使用による形質転換ベクター又は遊離の ＤＮＡの送達により実現させることが出来る。形質転換した植物細胞の選択及び全植物体への再生は、通常の手法を用いて行うことが出来る。遊離のＤＮＡ取り込みを高めるエレクトロポレ−ション又は化学薬品の如き、植物細胞中へのＤＮＡの挿入が可能な他の形質転換技法を用いることが出来る。
植物中で発現させることの出来る遺伝子として、ＨＳＰ７０イントロンｃＤＮＡ配列を植物形質転換ベクター中に挿入する。本発明の目的により、“遺伝子”とは、単独で又は他の構成要素との組み合わせのいずれかで植物中で発現させることが可能である構成要素又は構成要素の組み合わせと定義する。かかる遺伝子は、一般に、以下の順序で、植物細胞中で機能するプロモーター、５′非翻訳リーダー配列、所望の蛋白質をコードするＤＮＡ配列、及び植物中でｍＲＮＡ転写体の３′末端にポリアデニル化リボヌクレオチドを付加させるべく機能する３′非翻訳領域を含む。この定義に於いて、上記の各構成要素を操作可能なように隣接の構成要素と結合させる。上記構成要素を含む植物遺伝子は、植物形質転換ベクター中に公知の標準組換えＤＮＡ法により挿入することが出来、必要に応じて他の構成要素をベクターに付加することが出来る。植物形質転換ベクターは、公知の方法によりＤＮＡコード領域をベクターに容易に付加することが出来る、蛋白質又はその一部をコードする所望のＤＮＡ領域を除く、植物発現のために必要な全ての構成要素を有するように調製することが出来る。一般に、本発明のイントロンは、５′非翻訳リーダー配列中に挿入される。
植物細胞中でＤＮＡの転写を引き起こすことが知られている又は見い出されているいずれのプロモーターも本発明に用いることが出来る。本発明のイントロンの利用による発現の増強量は、他のイントロンの利用により観察されているように、用いるプロモーターの種類によって変化する。Callisら（上掲）及びMascanenkas ら（上掲）の文献参照。適当なプロモーターは、植物又は植物ＤＮＡウィルスの如き種々の起源から得ることが出来、それとしては、必ずしもこれに限定されるものではないが、カリフラワーモザイクウィルス１９Ｓ及び３５Ｓ（ＣａＭＶ１９Ｓ及びＣａＭＶ３５Ｓ）転写プロモーター又はゴマノハグサモザイクウィルス（figwort mosaic virus）全長転写プロモーター（ＦＭＶ３５Ｓ）の如きカリモウィルス（caulimovirus）群から単離したプロモーターが含まれる。ＦＭＶ３５Ｓプロモーターは、たいていの植物組織中でそれに結合した蛋白質コード領域の高レベルの一定の発現を引き 起こす。他の有用なプロモーターとしては、Katら（1987年）Science 236: 1299−1302によって述べられた如き増強ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター（ｅＣａＭＶ３５Ｓ）及び、リブロ−ス１，５−ビスホスフェートカルボキシラーゼオキシゲナ−ゼ（ＲＵＢＩＳＣＯ）の小サブユニットプロモーターが挙げられる。
他の適当なプロモーターの例としては、イネアクチンプロモーター、シクロフィリンプロモーター、ユビキチンプロモーター、上記CallisらのＡＤＨ１プロモーター、Bevan ら（1986年）Nucleic Acids Res. 14（11）, 4675−4638のクラスＩパタチンプロモーター、ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼプロモーター、Tierney ら（1987年）Planta 172:356−363のβ−コングリシニンプロモーター、Deikman ら（1988年）Embo J. 7（11） 3315−3320 のＥ８プロモーター、Pearら（1989年）Plant Mol. Biol. 13:639−651 の２ＡＩＩプロモーター、Samac ら（1990年）Plant Physiol. 93:907−914 の酸性キチナ−ゼプロモーターがある。
選ばれたプロモーターは、所望の蛋白質のみの充分な発現を引き起こすことが出来るはずであるが、特にＨＳＰ７０イントロンと共に用いる場合、発現蛋白質によって表現型でもたらされる性質を示す植物細胞及びそれから再生される植物をもたらす有効量の所望蛋白質の産生に導く。特に、増強したＣａＭＶ３５Ｓプロモーター又はＦＭＶ３５Ｓプロモーターは、本発明に有用である。増強したＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、植物細胞中で産生しようとする充分なレベルの蛋白質ｍＲＮＡ配列をもたらす。
プロモーターにより産生されるｍＲＮＡは、５′非翻訳リーダー配列を含有する。この非翻訳リーダー配列は、適当な起源から誘導することが出来、ｍＲＮＡの翻訳を増加させるために特に改変することが出来る。５′非翻訳領域は、遺伝子を発現させるために選ばれたプロモーター、発現させようとする遺伝子又はコード領域の本来の５′リーダー配列、ウィルスＲＮＡ、適当な真核細胞遺伝子配列、又は合成遺伝子配列から誘導することが出来る。本発明は、非翻訳領域がｅＣａＭＶ３５Ｓプロモーター由来の４５個のヌクレオチドから誘導される、後述の実施例で示される構築物に限定されるものではない。又、非翻訳リーダー配列は、上記の如き無関係のプロモーター又はウィルス性コード領域から誘導することが出来る。
キメラ植物遺伝子の３′非翻訳領域は、植物中でポリアデニル化リボヌクレオチドをｍＲＮＡ３′末端に付加させるべく機能するポリアデニル化シグナルを含有する。適当な３′領域の具体例としては、ＮＯＳ遺伝子の如きAgrobacterium 腫瘍誘導（Ｔｉ）プラスミド遺伝子のポリアデニル化シグナルを含有する３′転写非翻訳領域及び、大豆貯蔵蛋白質遺伝子の如き植物遺伝子及びＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子の小サブユニットプロモーターが有る。好ましい３′領域の具体例としては、下記実施例で述べた如きノパリンシンターゼ（nopaline synthase ）遺伝子由来のものが有る。
単離したＨＳＰ７０イントロン配列が所望のイントロン領域を含むかどうかを決定するために、又単離したＨＳＰ７０イントロンの有効性及び効用を示すために、リポーター遺伝子を植物カセットベクター中に挿入した。選択したリポーター遺伝子は、E. coli β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）コード配列及びルシフェラーゼ（ＬＵＸ）コード配列である。
本発明のキメラ遺伝子は、植物中で発現させようとする蛋白質をコードするいかなる構造遺伝子をも含有することが出来る。本発明の使用に適する蛋白質の具体例としては、植物のシキミ酸経路に関連する酵素であるＥＰＳＰシンターゼ（５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸シンターゼ；ＥＣ：２５．１．１９）がある。シキミ酸経路は、植物に必須の芳香族アミノ酸の合成に前駆物質を提供する。特に、ＥＰＳＰシンターゼは、ホスホエノールピルビン酸及び３−ホスホシキミ酸の５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸への変換を触媒する。Ｎ−ホスホノメチルグリシンを含有する除草剤は、ＥＰＳＰシンターゼ酵素を阻害し、そのことにより、植物のシキミ酸経路を阻害する。“グリホセート（glyphosate）”とは、通常、酸性又は陰イオン形態のＮ−ホスホノメチルグリシン除草剤を指すのに用いられる。新規なＥＰＳＰシンターゼ酵素が、グリホセート含有除草剤に対し増加した耐性を表すことが発見されている。特に、成熟野性型 ＥＰＳＰシンターゼアミノ酸配列内の８０番目と１２０番目の間に位置する配列： −L−G−N−A−G−T−A−を有する高度に保存された領域中のグリシンからアラニンへの単一置換を有するＥＰＳＰシンターゼ酵素は、グリホセートに対する増加した耐性を表すことが示されており、“グリホセート耐性５−エノールピルビル−３−ホスホシキミ酸シンターゼ”を発明の名称とする普通に譲渡された米国特許第４，９７１，９０８号明細書に記載されている。その教示は、参考として本明細書に含めるものとする。グリホセート耐性を表すように植物を形質転換する方法は、“グリホセート耐性植物”を発明の名称とする普通に譲渡された米国特許第４，９４０，８３５号明細書中で考察されており、その開示を、特に参考として本明細書に含めるものとする。グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼ植物遺伝子は、ＥＰＳＰシンターゼポリペプチド（又はその活性部分）が植物細胞内の葉緑体中へ運搬されるのを可能にする葉緑体転移 ペプチド（ＣＴＰ）を含有するポリペプチドをコードする。ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子は、核中のｍＲＮＡに転写され、ｍＲＮＡは、細胞質中で前駆物質ポリペプチド（ＣＴＰ／成熟ＥＰＳＰシンターゼ）に翻訳される。前駆物質ポリペプチドは、葉緑体内に輸送される。
本発明の使用に適した蛋白質の別の具体例は、グリホセートをアミノメチル燐酸及びグリオキシル酸に変換する酵素であるグリホセート酸化還元酵素（ＧＯＸ）である。植物内でＧＯＸ酵素を発現することにより、グリホセート除草剤に対 する植物耐性が生じる。ＧＯＸ酵素のアミノ酸配列及び、植物中で増強した発現を表すように改変したＧＯＸ酵素をコードする改変遺伝子については、“グリホセート耐性植物”を発明の名称とする１９９１年６月２４日出願の米国特許出願第０７／７１７，３７０号の普通に譲渡された特許出願に記載があり、その教示を参考として本明細書に含めるものとする。
本発明の使用に適した蛋白質の他の具体例は、Bacillus thuringiensis（B.t.）結晶トキシン蛋白質であり、これは、植物中で発現した場合、昆虫がB.t.トキシン蛋白質を含有する植物を食べて死ぬか食べるのを止めるかのいずれかであることから、昆虫来襲から植物を防御する。燐翅目昆虫又は甲虫類のいずれかに有毒なB.t.トキシン蛋白質を用いることが出来る。B.t.トキシン蛋白質をコードする特に好適なＤＮＡ配列の具体例については、１９９０年９月５日公開されたヨーロッパ特許出願第３８５，９６２号明細書の“合成植物遺伝子及びその製造法”と題する普通に譲渡された特許出願に記載があり、参考としてその教示を本明細書に含めるものとする。
本発明の使用に適した酵素の他の具体例は、植物中で発現した場合、植物組織内のエチレンレベルを減少させることにより果物が熟すのを遅らせるアミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）オキシダーゼである。ＡＣＣオキシダーゼをコードする好適なＤＮＡ配列の具体例については、１９９０年１２月２６日出願された米国特許出願第０７／６３２，４４０号の“植物に於ける果物の成熟及び老化の制御”と題する普通に譲渡された特許出願に記載があり、参考としてその教示を本明細書に含めるものとする。
本発明の使用に好適な他の酵素の具体例は、アセト乳酸シンターゼ、雄性不稔を起こすＲＮア−ゼ（Mariani ら（1990年）Nature 347:737−741）及び、小麦アグルテニンである。
本発明の使用に適した酵素の他の具体例は、植物中で発現した場合澱粉含量を増加させるＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼである。かかる澱粉増強酵素の具体例については、１９９１年６月７日出願された米国特許出願第０７／７０９，６６３号の“植物内で増加した澱粉含量”と題する普通に譲渡された特許出願に記載があり、参考としてその教示を本明細書に含めるものとする。
Adams ら（1983年）J. Amer. Chem. Soc. 105, 661の方法により全オリゴヌクレオチドを合成した。ヌクレオチド塩基アデニン、チミン、ウラシル、シトシン及びグアニンは、それぞれ文字Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ及びＧにより表される。
本発明は、これらに限定されるものではないが、トウモロコシ、イネ、大麦、カラス麦、小麦、モロコシ、ライ麦、サトウキビ、パイナップル、ヤマノイモ、タマネギ、バナナ、ココナッツ、ナツメヤシ及びホップを含む単子葉（monocot ）植物科のいずれにも好適である。本発明は、トウモロコシのトランスジェニック植物の生産にとりわけ有用性を有する。
植物細胞の形質転換及びトランスジェニック植物の再生に適したいずれの方法も、本発明の実施に用いることが出来る。トランスジェニック植物の再生に適した方法の具体例は、コーン（Fromm ら, 1990年, Bio/Technology 8:833−839; 及びGordon−Kamm ら, 1990年, The Plant Cell 2:603−618）;イネ（Wang ら，1988年, Plant Mol. Biol. 11:433−439）及び小麦 （Vasil ら, 1991年, Bio/Technology 9:743−747） である。
生殖能力のあるトランスジェニック単子葉植物の生産は、その生産法を共に形成するいくつかの工程を含む。一般に、これらの工程は、１）形質転換しようとする所望の単子葉植物組織を培養して適切な出発材料を得ること；２）好適なＤＮＡベクター及び、単子葉植物組織に移入させる遺伝子を開発すること；３）適当な方法により目的のＤＮＡを標的組織内に挿入すること；４）植物細胞；５）トランスジェニック細胞を生殖能力のあるトランスジェニック植物に再生し子孫を生産すること；及び６）挿入した異種のＤＮＡ又は外来遺伝子の存在を確認するためにトランスジェニック植物及びその子孫を分析することを含む。
本発明の好ましい方法は、出発植物材料として形質転換及び再生に好適である胚形成カルス（embryogenic callus）を用いる。胚形成カルスとは、形質転換されることができ、その後、生殖能力のある成熟トランスジェニック植物に再生することの出来るカルスと定義する。胚形成カルスは、好ましくは、組織培養に於いて良好なパフォ−マンスを示すもろい（すなわち、砕け易い）TypeIIカルス表現型を有する。胚形成カルスは、当業者に公知の標準手法（Armstrong, 1991, Maize Genetic Newsletter 65:92−93）を用いて得ることが出来る。好適なトウモロコシ胚形成カルス材料は、授粉後１０日から１２日のトウモロコシ植物から未成熟胚を分離することにより得ることが出来る。しかる後、カルス生育を開始させるため未成熟胚を固体培養培地上に移す。未成熟胚は、約１週間後TypeIIカルスとして増殖し始め、以後、これは、本発明の方法に用いるのに好適である。本発明の方法に用いるのに好適な胚形成カルスは、未成熟胚の初期カルス形成物から得ても良いし、或は２年齢までの古い樹立カルス培養物から得てもよい。しかしながら、生殖能力のあるトランスジェニック植物の回収を増強するために、より若いカルス培養物を用いるのが好ましい。１週齢から６カ月齢である胚形成カルスが好ましく、１週から４週齢の胚形成カルスが最も好ましい。本発明の胚形成カルスは、一度も懸濁培養を介して処理されたり、懸濁培養物として維持されたことのない“一次”カルスとみなされる。懸濁培養物とは、生育懸濁培養を樹立するために粉砕され１カ月から９カ月間液体溶液中に置かれたカルスと定義する。本発明の使用に適した胚形成カルスは、一度も懸濁培養を介して処理されたり、懸濁培養物として維持されたことがないものである。
本発明の好ましい方法は、生殖能力のある成熟トランスジェニック植物に再生することのできる全ての単子葉植物胚形成カルスへの適用が可能であり、特定の遺伝子型、近交系、ハイブリッド又は形質転換される所望の単子葉植物の種に依存しない。しかしながら、この方法の効率が、おそらく用いられる特定の植物系の培養能及び形質転換能に依存して変わるであろうことは、当然のことである。本発明に於いて、好ましいトウモロコシ胚形成カルスは、Ａ１８８×Ｂ７３Ｆ１遺伝子型ハイブリッド系、又はこの系の誘導体、又は“Ｈｉ−ＩＩ”遺伝子型から得ることが出来る。もろいTypeIIカルス材料を生じさせ得るいずれの遺伝子型も、本発明の方法に好適であり有用である。胚形成カルスは、所望の表現型のカルスの生育を促進する好適な組織培養培地中で培養を開始し維持することが出来る。好適な組織培養培地は、植物遺伝子工学の当業者等に公知である。表１に記載の組織培養培地中で、Ａ１８８×Ｂ７３Ｆ１ハイブリッド系及びＨｉ−ＩＩ系を首尾良く培養開始し維持し再生させた。
一旦、所望の胚形成カルス培養物を手に入れたならば、組織の形質転換は可能である。外来遺伝子又は目的とする遺伝子を胚形成カルスに移入することができる。一般的に、胚形成カルス中に挿入されたＤＮＡを異種ＤＮＡと称する。異種ＤＮＡは、形質転換される特定の単子葉植物中に普通に存在してもよいし存在しなくてもよい一つ以上の外来遺伝子を含有することが出来る。外来遺伝子は、典型的には、形質転換される特定の単子葉植物のゲノム中に普通に存在してもよいし存在しなくてもよいＤＮＡ配列を含む、キメラ又は組換え遺伝子構築物である。異種ＤＮＡは、通常、特定の植物内での所望のポリペプチドの発現に必要な構成要素を含む外来遺伝子を含有する。単子葉植物への形質転換に好適な異種ＤＮＡは、典型的には、形質転換される植物に所望の形質又は特性を賦与するポリペプチドをコードする外来遺伝子及び、植物材料が形質転換されたかどうか決定するための、スクリーニング及び選択が可能なマーカーを含有する。単子葉植物内で発現することのできる典型的外来遺伝子は、単子葉植物中で機能することの出来るプロモーター、イントロン、所望のポリペプチドをコードする構造ＤＮＡコード配列及び、単子葉植物内で認識されるポリアデニル化部位領域を含有する。トランスジーン（transgene）は、植物又は植物細胞中に移入された遺伝子又はＤＮＡ配列である。単子葉植物中での発現に好適な異種ＤＮＡベクター及び／又は外来遺伝子の構築の詳細は、植物遺伝子工学の当業者等に公知である。単子葉胚形成カルスに移入させようとする異種ＤＮＡは、単一のプラスミドベクター上に含まれてもよいし又は異なるプラスミド上にあってもよい。
本発明の方法で胚形成カルスを形質転換するのに用いる異種ＤＮＡは、好ましくは、非形質転換細胞の生育を遅らせる代謝阻害物質の存在下で形質転換細胞を生育させる選択可能マーカー遺伝子を含む。トランスジェニック細胞のこの生育の有利性は、培養時間により、この細胞と遅い生育又は非生育細胞との識別を可能にする。あるいは、選択可能マーカーと共に、E. coli β−グルクロニダーゼ遺伝子又は蛍ルシフェラーゼ遺伝子（deWet ら, 1987年, Mol. Cell Biol. 7:725−737）の如き視覚化可能な選択可能マーカーも、トランスジェニック細胞の回収を容易にする。
本発明の方法に用いる好ましい選択可能マーカー遺伝子としては、クロルスルフロン（chlorsulfuron）の如きスルホニルウレア除草剤に対する耐性を賦与する突然変異体アセト乳酸シンターゼ遺伝子又はｃＤＮＡ、抗生物質カナマイシンもしくはＧ４１８に耐性のＮＰＴＩＩ遺伝子、又はホスフィノトリシンもしくはビアラホス（bialaphos）に耐性のbar遺伝子が挙げられる。
単子葉胚形成カルス中への挿入のために選ばれる外来遺伝子は、単子葉植物中で発現した場合有用であるだろういかなる外来遺伝子であってもよい。単子葉植物中で発現する特に有用な外来遺伝子としては、除草剤に対する耐性、昆虫に対する耐性、ウィルスに対する耐性を賦与する遺伝子及び、栄養価又は植物の加工特性もしくは品質に影響を及ぼす改良された又は新しい特性を提供する遺伝子が挙げられる。耕種学的に有用な適当な遺伝子の具体例としては、昆虫抵抗性を賦与するためのBacillus thuringiensis由来の殺虫遺伝子及び、グリホセート除草剤に対する耐性を賦与するための５′−エノールピルビル−３′−ホスホシキミ酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子及びその変異体が挙げられる。当業者等に容易に理解してもらえることではあるが、所望の形質を賦与する多数の他の耕種学的に重要な遺伝子を、本発明の方法と組合わせて胚形式カルス中に導入することが出来る。本発明の技術の実際の利益の一つは、耕種学的形質を改良したトランスジェニック単子葉植物の生産である。
所望の異種ＤＮＡを含有する形質転換ベクターを調製したならば、このＤＮＡは、粒子銃技術又はBiolistics法とも呼ばれる微粒子発射体突射（microprojectile bombardment ）法を用いることにより単子葉胚形成カルスに移入させることが出来る。移入させようとする異種ＤＮＡは、まず、植物遺伝子工学分野の当業者等に公知のいくつかの方法のいずれかにより適当な微粒子発射体上にコートする。この微粒子発射体を微粒子発射銃装置により標的胚形成カルス中に撃ち込む。加速機能を果たす限り、加速装置又は加速銃の設計は重要ではない。加速された微粒子発射体は、調製された胚形成カルスに強い衝撃を与え、遺伝子移入を実現させる。微粒子発射体突射法を用いる場合、胚形成カルスに所望の遺伝子を移入させるために用いるＤＮＡベクターは、典型的には、プラスミドベクターとして調製し、タングステン又は金の微粒子発射体上にコートする。
いずれの粒子銃装置も用いることが出来るが、本発明に於いては、Biolistics PDS 1000 微粒子発射銃装置を用いた。この装置は、レキサンディスク（lexan disk）が３／８″厚さでディスクの中央に３／３２″直径の穴を有することを除いては、市販のストッピングプレート（stopping plates）と同様のストッピングプレート構造を有する。この穴は、上部表面で７／１６″に広がっており、穴の口を広げた配置で深さ１／４″まで先細りにし、この位置で穴の直径が３／３２″に狭まり、この穴は残り１／１８″厚さでは先細りを持たない。胚形成標的組織は、底部から１レベルであるこの装置のレベル４にセットする。カルス組織サンプルを１〜３回の突射に供した。１００μ開口部を有するシ−ルドメタルスクリ−ンは、典型的には、ストッピングプレートのすぐ下の棚の位置で用いられる。この装作は、適当な真空下で行なわれる。
胚形成カルスを所望の異種ＤＮＡベクターで突射した後、突射された細胞を、非選択培養培地中で数日間生育させ、非形質転換細胞の生育は阻害するがトランスジェニック細胞の生育は継続させる選択培地上に移す。約８週間で継続生育トランスジェニックカルス細胞が大きい生育カルスとして明白になり、回収することが出来、個別に増殖させることが出来る。しかる後、トランスジェニック胚形成カルスを、非形質転換胚形成カルスを再生させるプロトコールに準じて全成熟トランスジェニック植物に再生させることが出来る。通常、再生植物が、三葉段階に達し、良好に発達した根系を有する時点で、温室に移す前の２週間、土壌に移して生育室で鍛えることが出来る。本発明の形質転換胚形成カルスは、非トランスジェニックカルスのために機能する再生手法に良好に応答する。
その後、再生植物を温室に移動させることが出来、授粉及び採種用の普通の植物として扱うことが出来る。トランスジェニックカルスの性質及び再生植物の確認は、形質転換を実証する、ＰＣＲ分析、抗生物質又は除草剤耐性、酵素分析及び／又はサザンブロット法により行うことが出来る。再生植物の子孫を得、これを又分析してトランスジーンの遺伝性（hereditability）を実証することが出来る。これは、安定した形質転換及び、Ｒ１植物に於けるトランスジーンの遺伝を示す。
以下の実施例は、本発明の方法を具体的に説明するために提供するものであり、本発明の範囲は、これにより制限されるものではない。本発明の思想及び範囲から逸脱しない限り、本明細書に記載した方法に合わせて種々の変形をすることが出来ることを、当業者は認識するであろう。
ポリメラーゼ連鎖反応法によるＨＳＰ７０イントロンの合成
ポリメラーゼ連鎖反応法を用い、トウモロコシＨＳＰ７０遺伝子（pMON9502: Rochester 等, 1986年, Embo J., 5:451−458）を含有するゲノミッククロ−ンからＨＳＰ７０イントロンを合成した。
ポリメラーゼ連鎖反応法を用い、トウモロコシＨＳＰ７０遺伝子（pMON9502: Rochester 等, 1986年, Embo J., 5:451−458）を含有するゲノミッククロ−ンからＨＳＰ７０イントロンを合成した。
二つの異なるオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ反応法に用いた。最初のプライマーは、ヌクレオチド１〜２６の配列番号：１から成り、クローニングのためのＢｇ１ＩＩ部位、１０個のヌクレオチドのフランキングＨＳＰ７０エクソン１配列及び、１０個の塩基のイントロン配列を含有する。二番目のプライマーは、配列番号：１の７９１番目から８１６番目までの塩基の逆相補配列であり、１０ｂｐのイントロン配列、１１ヌクレオチドのフランキング３′ＨＳＰ７０エクソン配列及び、クローニングのためのＮｃｏＩ部位を含有する。
“ＨＳＰ７０イントロン”塩基７〜８１２は、トウモロコシＨＳＰ７０遺伝子（塩基１７〜７９９）由来の全イントロン及びＨＳＰ７０エクソン１（塩基７〜１６）由来の１０個のヌクレオチド及びＨＳＰ７０エクソン２（塩基８００〜８１２）由来の１１個の塩基を含有する。塩基１〜６及び８１３〜８１６は、クローニングに用いる制限部位を含む。塩基８０２は、天然のＨＳＰ７０エクソン内のＧであるが、遺伝子発現を最大に増強するためＡで置換した。
１０ｎｇのｐＭＯＮ９５０２ ＤＮＡ、それぞれ４０ピコモルのＳＥＱ７及びＳＥＱ２０、１０ｍＭのトリス−ＨＣＬ（ｐＨ８．３）、５０ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＭｇＣｌ２、０．０１％（ｗ／ｖ）のゼラチン、各２０ナノモルのｄＮＴＰ及び２．５単位の Amplitaq ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin Elmer Cetus）を含有する１００ｕｌの反応液でＰＣＲ法を行った。２８サイクル行った（１サイクル当り、９４℃での変性１分、５０℃でのアニーリング２分、７２℃での伸長３分）。
ＰＣＲ反応生成物をフェノ−ル：クロロホルム（１：１）抽出により精製し、続いてＢｇ１ＩＩ及びＮｃｏＩを用いて消化した。０．８ｋｂのＨＳＰ７０イントロン断片をゲル電気泳動により単離し、続いてElutip−Dカラム（Schleicher & Schuell）で精製した。ＨＳＰ７０イントロン配列をサンガ−のジデオキシＤＮＡ配列決定法により確認した。ＨＳＰ７０イントロン配列を配列番号：１と命名し、図１に示す。しかる後、０．８ｋｂのＨＳＰ７０イントロン断片をｐＭＯＮ８６７７の５′非翻訳リーダー領域内のＢｇ１ＩＩ及びＮｃｏＩ部位にクロ−ンし、下記の如きｐＭＯＮ１９４３３を形成させた。
トランジエントアッセイに於けるコーン遺伝子発現に対するＨＳＰ７０イントロンの効果
Ａ．ｐＭＯＮ８６７７、ｐＭＯＮ８６７８、ｐＭＯＮ１９４３３、ｐＭＯＮ１９４２５、ｐＭＯＮ１９４００及びｐＭＯＮ１９４３７の調製
充分に特徴付けられている遺伝的構成要素を用いｐＭＯＮ ８６７７（図４）を構築した。−９０から−３００領域の重複を含有する０．６５ｋｂカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（ｅ３５Ｓ）（Kay 等, 1987年, Science 236:1299−1302）、E.coliβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子由来の１．９ｋｂコード配列（Jefferson等, 1986年, PNAS 83:8447−8451）及び、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子由来の３′ポリアデニル化配列を含有する０．２５ｋｂ断片（Fraley等, 1983年, Proc. Natl. Acad. Sci. 80:4803−4807）を、ｐＵＣ１１９（Yanisch−Perron 等, 1985年, Gene 33:103−119）中に挿入し、植物遺伝子発現ベクターｐＭＯＮ８６７７を形成させた。
Ａ．ｐＭＯＮ８６７７、ｐＭＯＮ８６７８、ｐＭＯＮ１９４３３、ｐＭＯＮ１９４２５、ｐＭＯＮ１９４００及びｐＭＯＮ１９４３７の調製
充分に特徴付けられている遺伝的構成要素を用いｐＭＯＮ ８６７７（図４）を構築した。−９０から−３００領域の重複を含有する０．６５ｋｂカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（ｅ３５Ｓ）（Kay 等, 1987年, Science 236:1299−1302）、E.coliβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子由来の１．９ｋｂコード配列（Jefferson等, 1986年, PNAS 83:8447−8451）及び、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）遺伝子由来の３′ポリアデニル化配列を含有する０．２５ｋｂ断片（Fraley等, 1983年, Proc. Natl. Acad. Sci. 80:4803−4807）を、ｐＵＣ１１９（Yanisch−Perron 等, 1985年, Gene 33:103−119）中に挿入し、植物遺伝子発現ベクターｐＭＯＮ８６７７を形成させた。
Vasil等（1991年）Bio/Technology 9:743−747に記載の如きｐＭＯＮ８６７７中に、トウモロコシのＡＤＨ１遺伝子（Callis等, 1987年, Genes and Dev. 1:1183−1200）由来の第一イントロンを含有する０．６ｋｂ断片を挿入することによりｐＭＯＮ８６７８（図５）を形成させた。ｐＭＯＮ８６７８に於ける単子葉植物発現領域は、５′非翻訳リーダー中にＡＤＨ１イントロン断片を含有することを除いてはｐＭＯＮ８６７７と同じである。
５′非翻訳リーダー内にトウモロコシＨＳＰ７０イントロン断片を含有することを除いてはｐＭＯＮ８６７７と同じである単子葉植物発現ベクターを生成させるために、ｐＭＯＮ８６７７内のＮｃｏＩ−Ｂｇ１ＩＩ部位に、トウモロコシＨＳＰ７０イントロン配列を含有するＢｇ１ＩＩ−ＮｃｏＩ消化ＰＣＲ断片をクローニングすることによりｐＭＯＮ１９４３３（図９）を構築した。
−９０から−３００領域の重複を含有する０．６５ｋｂカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓ ＲＮＡプロモーター（ｅ３５Ｓ）、蛍ルシフェラーゼ（ＬＵＸ）遺伝子（Ow 等, 1986年, Science 234:856−859; DeWet等, 1987年, Mol. Cell Biol. 7:725−737）の１．８ｋｂ断片及び、ＮＯＳポリアデニル化配列を含有する０．２５ｋｂ断片を、ｐＵＣ１１９（上記Yanisch−Perron等, 1985年）中に挿入することにより、ｐＭＯＮ１９４２５（図６）を構築した。
ｐＭＯＮ８６７８中のＧＵＳコード配列をＬＵＸ遺伝子の１．８ｋｂ断片で置き換えることによりｐＭＯＮ１９４００（図１８）を形成させた。ｐＭＯＮ１９４００内の単子葉植物発現領域は、５′非翻訳リーダー内にＡＤＨ１イントロン断片を含有することを除いてはｐＭＯＮ１９４２５と同じである。
５′非翻訳リーダー内にトウモロコシＨＳＰ７０イントロン断片を含有することを除いてはｐＭＯＮ１９４２５と同じである単子葉植物発現ベクターを生成させるために、ｐＭＯＮ１９４２５内のＮｃｏＩ−Ｂｇ１ＩＩ部位に、ｐＭＯＮ１９４３３由来のＨＳＰ７０イントロン配列を０．８ｂｐ ＮｃｏＩ−Ｂｇ１ＩＩ断片としてクローニングすることによりｐＭＯＮ１９４３７（図１０）を構築した。
Ｂ．トランジエントアッセイを用いた遺伝子発現分析
コーン細胞中でのＨＳＰ７０イントロンベクター及びＡＤＨ１イントロンベクターからの発現を評価するために、二つのトランジエント遺伝子発現系を用いた。上記のプラスミドＤＮＡでコートした高速発射体をコーン細胞又は組織に撃ち込むことにより、二つのコーン細胞系を形質転換した。一方の細胞系は、ブラックメキシカンスィート（ＢＭＳ）コーンの再生不能コーンカルス浮遊細胞である。他方の細胞系は、雄穂原基周辺の節の最も内側の葉由来の４週齢植物体から得たコーンの葉由来の組織として用いたＢＣ１７コーンである。
コーン細胞中でのＨＳＰ７０イントロンベクター及びＡＤＨ１イントロンベクターからの発現を評価するために、二つのトランジエント遺伝子発現系を用いた。上記のプラスミドＤＮＡでコートした高速発射体をコーン細胞又は組織に撃ち込むことにより、二つのコーン細胞系を形質転換した。一方の細胞系は、ブラックメキシカンスィート（ＢＭＳ）コーンの再生不能コーンカルス浮遊細胞である。他方の細胞系は、雄穂原基周辺の節の最も内側の葉由来の４週齢植物体から得たコーンの葉由来の組織として用いたＢＣ１７コーンである。
標準アルカリ細胞溶解、続いてＣｓＣｌ勾配精製（Maniatis等, 1982年, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, CSH Labs）を用いることによりプラスミドＤＮＡを調製した。２５ｕｌの微粒子（５０％グリセロール中に２５ｍｇ／ｍｌ）、３ｕｌの実験用プラスミドＤＮＡ（１ｕｇ／ｕｌ）、２ｕＬの内部対照用プラスミドＤＮＡ（１ｕｇ／ｕｌ）、２５ｕＬの１Ｍ塩化カルシウム及び、１０ｕＬの０．１Ｍスペルミジンを加え短時間撹拌することにより、プラスミドＤＮＡをタングステンＭ１０微粒子上に沈着させた。この微粒子を２０分間沈降させた後、２５ｕｌの上澄を除去した。各々の評価したベクターのために二つの独立した微粒子調製物を作成した。
しかる後、微粒子調製物を以下の如く組織／細胞中に爆撃した。ＤＮＡ−タングステンの各サンプルを簡単に超音波で処理し、その２．５ｕｌを、ＰＤＳ−1000（デュポン社）バイオティックスパーティクルガンを用いて一つのプレートに入れられた組織／細胞内に撃ち込んだ。それぞれの微粒子調製物で組織／細胞が入った三つのプレートを爆撃した。
２４〜４８時間のインキュベ−ション（２５℃、暗所）後、組織／細胞を回収した。各微粒子調製物で爆撃された三つのプレートに入っていた細胞／組織を合わせ、液体窒素で冷凍し、乳鉢と乳棒で細かい白色粉末に粉砕した。各サンプルを氷上で１ｍｌのＧＵＳ抽出緩衝液（ＧＥＢ：０．１ＭのＫＰＯ４ ｐＨ７．８、１ｍＭのＥＤＴＡ、１０ｍＭのＤＴＴ、０．８ｍＭのＰＭＳＦ及び５％グリセロール）中で解凍した。しかる後、サンプルを撹拌し、５℃で１５分間８Ｋで遠心し、上澄を新しい試験管に移した。直ちに酵素のアッセイを行わない場合、サンプルは、ドライアイスで冷凍し−８０℃で貯蔵した。
トランジエントβ−グルクロニダーゼ遺伝子発現を蛍光分析（Jefferson 等, 1987年, Embo. J. 6:3901−3907）を用いて定量した。２ｍＭの４−メチルウンベリフェリルグルクロニドを含有する１ｍｌのＧＥＢ中に含まれる５０ｕｌの粗抽出物をアッセイした。０、１０、２０及び３０分の時点で１００ｕｌを採取し、２ｍｌの０．２Ｍ Ｎａ２ＣＯ３に加えることにより反応を停止させた。しかる後、各サンプルの蛍光を、Hoescht ＤＮＡフルオロメ−タ−（モデルＴＫＯ１００）を用いて測定した。ＧＵＳ活性は、反応時間に対する蛍光の傾きとして表される。
ルシフェラーゼの定量分析を次の通りに行った。０．２ｍｌの２５ｍＭトリシンｐＨ７．８、１５ｍＭのＭｇＣｌ２、５ｍＭのＡＴＰ及び０．５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡが入ったキュベットに５０ｕｌの抽出物を加えた。０．５ｍＭのルシフェリン基質を、ルミノメ−タ−（Berthold Bioluminat LB9500C）により自動的に分注させ、２５℃で１０秒カウント間でピ−クのルミネセンスを測定した。ＬＵＸ活性は、抽出物ｕｌ当りの平均光単位として表される。
試験した全てのベクターは、その酵素活性が、評価されるベクターのそれと区別できる蛋白をコードする内部対照用ベクターと共に撃ち込まれた。例えば、ＬＵＳベクターを評価する 実験では、ｐＭＯＮ８６７８（ＧＵＳ）を内部対照用ベクターとして用い、ＧＵＳベクターを試験する場合には、ｐＭＯＮ１９４００（ＬＵＸ）を内部対照用ベクターとして用いた。しかる後、手法に於ける変動を修正するために、結果を、内部対照用リポーター遺伝子発現に対する実験リポーター遺伝子発現の比として表した。結果を表２に示す。
表２に示すように、ＨＳＰ７０イントロンベクターは、ＢＭＳ浮遊細胞に於いて、イントロンを含まない（４０倍の増加）ベクター又は、ＡＤＨ１イントロン（１０倍の増加）ベクターと比較した場合、有意に増加した遺伝子発現を示した。この効果は、リポーター遺伝子としてＧＵＳ又はＬＵＸのいずれかを用いて観察した。表２Ｂは、この効果がＢＭＳ細胞系に限定されないことを示す。葉トランジエント遺伝子発現分析に於いて、ＨＳＰ７０イントロンベクターは、イントロンを含まない対照に対し８．７倍のＧＵＳ発現レベルを示し、一方、ＡＤＨ１イントロンは、イントロンを含まない対照に対し僅か１．６倍のＧＵＳ発現レベルを示した。
安定に形質転換された再生不能コーン培養物に於ける遺伝子発現に対するＨＳＰ７０イントロンの効果
Ａ．安定に形質転換されたＢＭＳ細胞系の産生
実質的に上記の通りのパーティクルガン爆撃によりブラックメキシカンスィートコーン浮遊細胞を形質転換した。爆撃用プラスミドＤＮＡを調製し、１２．５ｕｌの微粒子（５０％グリセロール中に２５ｍｇ／ｍｌ）、２．５ｕｌのプラスミドＤＮＡ（１ｕｇ／ｕｌ）、１２．５ｕＬの１Ｍ塩化カルシウム及び、５ｕＬの０．１Ｍスペルミジンを加え短時間撹拌することにより、これををタングステンＭ１０微粒子上に沈着させた。この微粒子を２０分間沈降させた後、１２．５ｕｌの上澄を除去した。ＤＮＡ−タングステンの各サンプルを短時間超音波で処理し、その２．５ｕｌを、ＰＤＳ−1000バイオリシティックスパーティクルガン（デュポン社）を用いて胚子培養物中に撃ち込んだ。アセト乳酸シンターゼ遺伝子を含有するプラスミドであるＥＣ９（図１９）を、形質転換した対照細胞のクロルスルフロン選択に用いるのに含めた。試験構築物を含有する二番目のプラスミドをを、ＥＣ９と共に沈着させた。ＢＭＳ細胞をフィルター上にプレーティングし、ＰＤＳ−1000 （デュポン社）パーティクルガンを用いて爆撃した。爆撃後、細胞をＭＳ液体培地に移して１日置いた後、２０ｐｐｂのクロルスルフロンを含有する固形培地上にプレーティングした。約４週間後、クロルスルフロン耐性カルスを選択し、遺伝子発現分析のため生育させた。
Ａ．安定に形質転換されたＢＭＳ細胞系の産生
実質的に上記の通りのパーティクルガン爆撃によりブラックメキシカンスィートコーン浮遊細胞を形質転換した。爆撃用プラスミドＤＮＡを調製し、１２．５ｕｌの微粒子（５０％グリセロール中に２５ｍｇ／ｍｌ）、２．５ｕｌのプラスミドＤＮＡ（１ｕｇ／ｕｌ）、１２．５ｕＬの１Ｍ塩化カルシウム及び、５ｕＬの０．１Ｍスペルミジンを加え短時間撹拌することにより、これををタングステンＭ１０微粒子上に沈着させた。この微粒子を２０分間沈降させた後、１２．５ｕｌの上澄を除去した。ＤＮＡ−タングステンの各サンプルを短時間超音波で処理し、その２．５ｕｌを、ＰＤＳ−1000バイオリシティックスパーティクルガン（デュポン社）を用いて胚子培養物中に撃ち込んだ。アセト乳酸シンターゼ遺伝子を含有するプラスミドであるＥＣ９（図１９）を、形質転換した対照細胞のクロルスルフロン選択に用いるのに含めた。試験構築物を含有する二番目のプラスミドをを、ＥＣ９と共に沈着させた。ＢＭＳ細胞をフィルター上にプレーティングし、ＰＤＳ−1000 （デュポン社）パーティクルガンを用いて爆撃した。爆撃後、細胞をＭＳ液体培地に移して１日置いた後、２０ｐｐｂのクロルスルフロンを含有する固形培地上にプレーティングした。約４週間後、クロルスルフロン耐性カルスを選択し、遺伝子発現分析のため生育させた。
Ｂ．ＧＵＳ発現に対するＨＳＰ７０イントロンの効果
ＧＵＳ遺伝子及び、イントロン非含有（ｐＭＯＮ８６７７）、ＡＤＨ１イントロン（ｐＭＯＮ８６７８）又は、ＨＳＰ７０イントロン（ｐＭＯＮ１９４３３）を含有するプラスミドを、ＢＭＳ細胞中に撃ち込み、安定に形質転換した系を上記の如く作製した。クロルスルフロン耐性系を選択して、組織化学染色（Jefferson 等, 1987年, Embo. J. 6:3901−3907）によりＧＵＳ発現を評価した。表３Ａに示す如く、ＨＳＰ７０イントロンベクターを用いた形質転換は、ＡＤＨ１イントロン含有又はイントロン非含有ベクターのいずれかを用いた形質転換に比し、有意に高い割合の非選択ＧＵＳマーカーの共発現を示した。より多数のクロルスルフロン耐性カルスが、組織化学ＧＵＳ染色検出の閾値より上にあることから、ＨＳＰ７０イントロンベクターは、ＡＤＨ１ベクター又はイントロン非含有ベクターより高いレベルで発現すると考えられる。これを確認するために、各ベクターから得た１０個の独立したＧＵＳ陽性形質転換体由来の抽出物に於けるＧＵＳ活性を測定した（ｐＭＯＮ８６７７は１個のＧＵＳ陽性カルスをアッセイし、他の９個は任意に選んだ）。これらのアッセイのデータを、表３Ｂに示す。これらの結果は、ＨＳＰ７０イントロンが、安定に形質転換された細胞系に於けるＧＵＳ発現を、トランジエント遺伝子発現分析で観察されたものよりより大きい程度に増強することを示している。ＨＳＰ７０イントロンベクターを含有する系で観察されたＧＵＳ発現の平均レベルは、ＡＤＨ１イントロンベクターを含有する系で観察されたそれの約８０倍以上であった。１０個のＨＳＰ７０系の最高は、ＡＤＨ１系の最高の１００倍以上、イントロンを含まない系の最高の約８００倍以上のＧＵＳを発現した。
ＧＵＳ遺伝子及び、イントロン非含有（ｐＭＯＮ８６７７）、ＡＤＨ１イントロン（ｐＭＯＮ８６７８）又は、ＨＳＰ７０イントロン（ｐＭＯＮ１９４３３）を含有するプラスミドを、ＢＭＳ細胞中に撃ち込み、安定に形質転換した系を上記の如く作製した。クロルスルフロン耐性系を選択して、組織化学染色（Jefferson 等, 1987年, Embo. J. 6:3901−3907）によりＧＵＳ発現を評価した。表３Ａに示す如く、ＨＳＰ７０イントロンベクターを用いた形質転換は、ＡＤＨ１イントロン含有又はイントロン非含有ベクターのいずれかを用いた形質転換に比し、有意に高い割合の非選択ＧＵＳマーカーの共発現を示した。より多数のクロルスルフロン耐性カルスが、組織化学ＧＵＳ染色検出の閾値より上にあることから、ＨＳＰ７０イントロンベクターは、ＡＤＨ１ベクター又はイントロン非含有ベクターより高いレベルで発現すると考えられる。これを確認するために、各ベクターから得た１０個の独立したＧＵＳ陽性形質転換体由来の抽出物に於けるＧＵＳ活性を測定した（ｐＭＯＮ８６７７は１個のＧＵＳ陽性カルスをアッセイし、他の９個は任意に選んだ）。これらのアッセイのデータを、表３Ｂに示す。これらの結果は、ＨＳＰ７０イントロンが、安定に形質転換された細胞系に於けるＧＵＳ発現を、トランジエント遺伝子発現分析で観察されたものよりより大きい程度に増強することを示している。ＨＳＰ７０イントロンベクターを含有する系で観察されたＧＵＳ発現の平均レベルは、ＡＤＨ１イントロンベクターを含有する系で観察されたそれの約８０倍以上であった。１０個のＨＳＰ７０系の最高は、ＡＤＨ１系の最高の１００倍以上、イントロンを含まない系の最高の約８００倍以上のＧＵＳを発現した。
安定に形質転換したＢＭＳ細胞系に於けるＢ．ｔ．ｋ．発現に対するＨＳＰ７０イントロンの効果
本発明者等は、商業上重要なＢ．ｔ．ｋ．遺伝子の発現に対するＨＳＰ７０イントロンの効果を同様に調査した。含有す るイントロンのみが異なる二つのプラスミド、即ち、ｐＭＯＮ１０９２０（ｅ３５Ｓ／ＡＤＨ１／Ｂ．ｔ．ｋ．／ＮＯＳ）及びｐＭＯＮ１０９２１（ｅ３５Ｓ／ＨＳＰ７０／Ｂ．ｔ．ｋ．／ＮＯＳ）を構築した。それぞれは、Adang 等（1985年） Gene 36:289−300 により記載されたBacillus thuringiensis kurstaki （B.t.k.）昆虫防除蛋白をコードする３．６ｋｂ全合成遺伝子を含有する。この遺伝子の植物中での発現は、昆虫耐性に帰する。１．９ｋｂのＧＵＳ断片の代りに、ｐＭＯＮ８６７８（図５）中にＢ．ｔ．ｋ．を含有する３．６ｋｂのＮｃｏｌ／ＥｃｏＲＩ断片を挿入することによりｐＭＯＮ１０９２０（図２０）を構築した。ｐＭＯＮ１９４３３（図９）中にＢ．ｔ．ｋ．コード配列を含有する３．６ｋｂのＮｃｏｌ／ＥｃｏＲＩ断片を挿入したことを除いては同様にしてｐＭＯＮ１０９２１（図１１）を構築した。
本発明者等は、商業上重要なＢ．ｔ．ｋ．遺伝子の発現に対するＨＳＰ７０イントロンの効果を同様に調査した。含有す るイントロンのみが異なる二つのプラスミド、即ち、ｐＭＯＮ１０９２０（ｅ３５Ｓ／ＡＤＨ１／Ｂ．ｔ．ｋ．／ＮＯＳ）及びｐＭＯＮ１０９２１（ｅ３５Ｓ／ＨＳＰ７０／Ｂ．ｔ．ｋ．／ＮＯＳ）を構築した。それぞれは、Adang 等（1985年） Gene 36:289−300 により記載されたBacillus thuringiensis kurstaki （B.t.k.）昆虫防除蛋白をコードする３．６ｋｂ全合成遺伝子を含有する。この遺伝子の植物中での発現は、昆虫耐性に帰する。１．９ｋｂのＧＵＳ断片の代りに、ｐＭＯＮ８６７８（図５）中にＢ．ｔ．ｋ．を含有する３．６ｋｂのＮｃｏｌ／ＥｃｏＲＩ断片を挿入することによりｐＭＯＮ１０９２０（図２０）を構築した。ｐＭＯＮ１９４３３（図９）中にＢ．ｔ．ｋ．コード配列を含有する３．６ｋｂのＮｃｏｌ／ＥｃｏＲＩ断片を挿入したことを除いては同様にしてｐＭＯＮ１０９２１（図１１）を構築した。
これらの各プラスミド及び、実施例３Ａに記載の如きＥＣ９（ＡＬＳ）でＢＭＳ系を共同形質転換した。各形質転換に於いて、約３０個の独立したクロルスルフロン耐性系が生じ た。これらのカルスについてタバコホーンウォーム（Tobacco Hornworm, ＴＨＷ） 毒性を試験し、昆虫耐性系を更にアッセイした。各ＴＨＷ耐性カルス由来の可溶性抽出物中のＢ．ｔ．ｋ．蛋白の量を、ＥＬＩＳＡにより測定し、全蛋白に対するパ−センテ−ジとして表した。ＡＤＨ１イントロンベクター（ｐＭＯＮ１０９２０）を含有する昆虫陽性系１１個の内、１個の系のみが、ＥＬＩＳＡアッセイに於いて検出されるべき充分なＢ．ｔ．ｋ．蛋白を含有した。その量は、０．４×１０−５％であった。ＨＳＰ７０イントロンベクター（ｐＭＯＮ１０９２１）を含有する２９個のＴＨＷ耐性系の内の２０個がＥＬＩＳＡによる検出にとって充分な蛋白を生成した。その量の平均は、５．１×１０−５％であり、範囲は＜．０１−１０．５×１０−５％であった。平均Ｂ．ｔ．ｋ．蛋白レベルを比較した場合、ＨＳＰ７０イントロンベクターは、ＡＤＨ１イントロンベクターに対し１２倍発現を増加させる。
ＢＭＳ形質転換体に於けるＧＯＸ発現に対するＨＳＰ７０イントロンの効果
ＧＯＸ発現に対するイントロンの効果を試験するためにｐＭＯＮ１９６３２及びｐＭＯＮ１９６４３を構築した。両方のベクターは、Arabidopsis thaliana SSU 1a 遺伝子（ＳＳＵＣＴＰ）（Timko 等, 1988年, The Impact of Chemistry on Biotechnology, ACS Books, 279−295）から誘導されるＮ−末端０．２６ｋｂの葉緑体トランジットペプチド配列及び、Ｃ−末端１．３ｋｂの合成ＧＯＸ遺伝子配列から成る遺伝子融合体を含有する。ＧＯＸ遺伝子は、グリホゼートから除草剤として不活性な生成物であるアミノメチル燐酸及びグリオキシル酸への変換を触媒する酵素グリホゼート酸化還元酵素をコードする。遺伝子融合体の植物中での発現は、ＣＴＰが切断及び分解され成熟ＧＯＸ蛋白（della−Cioppa等, 1986年, Proc．Natl．Acad．Sci. USA 83:6873−6877 ）を放出する葉緑体内に迅速に運ばれるプレー蛋白を生成する。
ＧＯＸ発現に対するイントロンの効果を試験するためにｐＭＯＮ１９６３２及びｐＭＯＮ１９６４３を構築した。両方のベクターは、Arabidopsis thaliana SSU 1a 遺伝子（ＳＳＵＣＴＰ）（Timko 等, 1988年, The Impact of Chemistry on Biotechnology, ACS Books, 279−295）から誘導されるＮ−末端０．２６ｋｂの葉緑体トランジットペプチド配列及び、Ｃ−末端１．３ｋｂの合成ＧＯＸ遺伝子配列から成る遺伝子融合体を含有する。ＧＯＸ遺伝子は、グリホゼートから除草剤として不活性な生成物であるアミノメチル燐酸及びグリオキシル酸への変換を触媒する酵素グリホゼート酸化還元酵素をコードする。遺伝子融合体の植物中での発現は、ＣＴＰが切断及び分解され成熟ＧＯＸ蛋白（della−Cioppa等, 1986年, Proc．Natl．Acad．Sci. USA 83:6873−6877 ）を放出する葉緑体内に迅速に運ばれるプレー蛋白を生成する。
ｐＭＯＮ８６７８と同じ方法で、ＡＤＨ１イントロン及びＮＯＳポリアデニル化配列間の１．６ｋｂ Ｂｇ１ＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてＳＳＵ・ＣＴＰ−−ＧＯＸ融合体を挿入することにより、ｐＭＯＮ１９６３２（図２１）を構築した。従って、ｐＭＯＮ１９６３２は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＡＤＨ１イントロン、ＳＳＵ・ＣＴＰ−−ＧＯＸコード配列及び、細菌に於けるアンピシリン選択のためのβ−ラクタマ−ゼ遺伝子を含有するｐＵＣ骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
ＨＳＰ７０イントロン（図７）に隣接するＧＯＸの如きクローニングコード配列用カセットベクターｐＭＯＮ１９４７０を構築した。ＫｐｎＩ及びＳａｃＩで消化したｐＢＳＫＳ+ （Stratagene社）中に、ＫｐｎＩ／ＮｏｔＩ／ＨｉｎｃＩＩ／ＨｉｎｄＩＩＩ／Ｂｇ１ＩＩ／ＤｒａＩ／ＸｂａＩ／ＮｃｏＩ／ＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ／ＥｃｏＲＶ／ＸｍａＩ／ＮｏｔＩ／ＳａｃＩ部位を含有するアニーリングした合成オリゴヌクレオチドを挿入することにより、受容体プラスミドｐＭＯＮ１９４５３を作成した。ｐＭＯＮ８６７８（図５）をＢａｍＨＩで消化し、末端円滑を創出するためにクレノウポリメラーゼを添加し、ＥｃｏＲＩで消化することにより、ノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）ポリアデニル化領域（Fraley 等, 1983年, Proc．Natl．Acad．Sci. 80:4803−4807）を挿入した。ｐＭＯＮ１９４５３のポリリンカーのＥｃｏＲＶ／ＥｃｏＲＩ部位に０．２５ｋｂＮＯＳ断片を挿入しｐＭＯＮ１９４５９を形成させた。ＣａＭＶＥ３５Ｓプロモーター（Kay 等, 1987年, Science 236:1299−1302）を含有する０．６５ｋｂ断片を、ｐＭＯＮ１９４５９内のＨｉｎｄＩＩＩ／Ｂｇ１ＩＩ部位に挿入することにより、ｐＭＯＮ１９４５７を構築した。ｐＭＯＮ１９４３３をＮｃｏＩで直鎖にし、リョクトウヌクレアーゼで末端円滑し、Ｘｂａリンカーを加えた。しかる後、ＨＳＰ７０イントロン断片を、Ｂｇ１ＩＩで消化することによって取リーダーし、ｐＭＯＮ１９４５７内のＸｂａＩ／Ｂｇ１ＩＩ部位中に挿入してｐＭＯＮ１９４５８を形成させた。しかる後、制限部位の順序を変化させる合成リンカーを、ｐＭＯＮ １９４５８注に挿入してｐＭＯＮ１９４６７を形成させた。ｐＭＯＮ１９４６７からＮｏｔＩ発現カセットを取リーダーし、ｐＫＣ７（Rao and Rogers, 1978 年, Gene 3:247）由来のＮＰＴＩＩ配列を含有するｐＵＣ様ベクターｐＭＯＮ１００８１中に挿入してｐＭＯＮ１９４７０（図８）を形成させた。従って、ｐＭＯＮ１９４７０は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、コード配列クローニング用ポリリンカー及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子を含有する ｐＵＣ様骨格内のＮＯＳポリアデニル化領域を含む。
ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩで消化したｐＭＯＮ１９４７０（図８）中に１．６ｋｂ Ｂｇ１ＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてＳＳＵ・ＣＴＰ−−ＧＯＸ融合体コード配列を挿入することにより、ｐＭＯＮ１９６４３（図１７）を構築した。従って、ｐＭＯＮ１９６４３は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、ＳＳＵ・ＣＴＰ−−ＧＯＸコード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子を含有するｐＵＣ様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
実施例３Ａに記載の如くｐＭＯＮ１９６３２又はｐＭＯＮ１９６４３でＢＭＳ浮遊細胞を爆撃した。形質転換ＢＭＳ細胞をクロルスルフロンで選択できるようにするために、各々の爆撃にプラスミドＥＣ９を含有させた。クロルスルフロン耐性カルスを、５ｍＭグリホゼート培地に移し、２週間後、新鮮な５ｍＭグリホゼート培地に移した。２週間後、グリホゼート培地上で生存するカルスのパ−センテ−ジを調べた。
結果を表４に示す。ＡＤＨ１イントロンベクター（ｐＭＯＮ１９６３２）は、グリホゼート耐性カルスをほとんど又は全く生じさせなかった。ＨＳＰ７０イントロンベクター（ｐＭＯＮ１９６４３）は、クロルスルフロン耐性カルスの４０％以上が、グリホゼートに対しても耐性があることを示した。クロルスルフロン耐性系に於けるＧＯＸ蛋白の蓄積レベルをウェスタンブロット分析法により測定した。表４に示すように、ＨＳＰ７０イントロンベクターは、ＡＤＨ１イントロンベクターに比し、有意に高いレベルのＧＯＸ発現を示す。
ＥＰＳＰシンターゼ及びグリホゼート選択に対するＨＳＰ７０イントロンの効果
５−エノールピルビルシキメ−ト−３−燐酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子の発現に対するＡＤＨ１及びＨＳＰ７０イントロンの効果を比較するために、二つのベクター、ｐＭＯＮ８６３１及びｐＭＯＮ１９６４０を構築した。除草剤グリホゼートに対する耐性を賦与する二つの突然変異（成熟ペプチドのGoy101>Ala及び Gly163>Asp）を有するトウモロコシＥＰＳＰＳコード配列を含有する１．７５ｋｂ断片を、ＡＤＨ１イントロンとＮＯＳポリアデニル化配列の間に挿入したことを除いては、ｐＭＯＮ８６７８（図５）と同様にしてｐＭＯＮ８６３１（図２２）を構築した。従って、ｐＭＯＮ８６３１は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＡＤＨ１イントロン、ＥＰＳＰＳコード配列及び、細菌に於けるアンピシリン選択のためのβ−ラクタマ−ゼ遺伝子を含有するｐＵＣ骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
５−エノールピルビルシキメ−ト−３−燐酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子の発現に対するＡＤＨ１及びＨＳＰ７０イントロンの効果を比較するために、二つのベクター、ｐＭＯＮ８６３１及びｐＭＯＮ１９６４０を構築した。除草剤グリホゼートに対する耐性を賦与する二つの突然変異（成熟ペプチドのGoy101>Ala及び Gly163>Asp）を有するトウモロコシＥＰＳＰＳコード配列を含有する１．７５ｋｂ断片を、ＡＤＨ１イントロンとＮＯＳポリアデニル化配列の間に挿入したことを除いては、ｐＭＯＮ８６７８（図５）と同様にしてｐＭＯＮ８６３１（図２２）を構築した。従って、ｐＭＯＮ８６３１は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＡＤＨ１イントロン、ＥＰＳＰＳコード配列及び、細菌に於けるアンピシリン選択のためのβ−ラクタマ−ゼ遺伝子を含有するｐＵＣ骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
ｐＭＯＮ１９６４０（図１２）を形成させるために、ｐＭＯＮ８６３１由来の１．７５ｋｂ ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＭＯＮ１９４７０（図８）内の対応する制限部位中に挿入した。従って、ｐＭＯＮ１９６４０は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、ＥＰＳＰＳコード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子を含有するｐＵＣ様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
グリホゼート含有培地に対する直接選択により、安定に形質転換したＢＭＳ系を作出した。実施例３Ａに記載の如くｐＭＯＮ８６３１又はｐＭＯＮ１９６４０のいずれかで細胞を爆撃した。爆撃後、細胞を選択することなくＭＳ培地中に１日間再浮遊させた。しかる後、グリホゼートを最終濃度５ｍＭになるように液体培地に加え、培養物を４日間インキュベートした。爆撃から５日後、細胞を５ｍＭグリホゼートを含むアガロ−ス中に埋没した。約６週間培養後、グリホゼート耐性カルスの数を調べた。ｐＭＯＮ８６３１（ＡＤＨ１イントロン）は、５９個のグリホゼート耐性カルスを産生し、一方、ｐＭＯＮ１９６４０（ＨＳＰ７０イントロン）は、２倍の増加である１１７個のグリホゼート耐性カルスを産生した。これらのカルスに於けるＥＰＳＰＳ発現のレベルは測定しなかったが、ＨＳＰ７０イントロンベクターはより多くのＥＰＳＰＳを発現し、それは培地中のグリホゼートの毒性を克服するに充分な ＥＰＳＰＳを産出する、より多くの形質転換事象に帰し、従って、グリホゼート耐性カルスの回収頻度が高いと、考えられる。
殺虫蛋白をコードするＨＳＰ７０イントロンベクターを用いた他のコード配列の発現
Bacillus thuringensis var. tenebrionis （B.t.t.） 殺虫蛋白（McPherson等, 1988年, Bio/Technology 6:61−66）をコードする合成遺伝子を含有するｐＭＯＮ１９４８４（図１３）を、ｐＭＯＮ１９４７０（図８）中のＢａｍＨＩ部位にＢｇ１ＩＩ断片上の１．８ｋｂ Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子を挿入することにより構築した。従って、ｐＭＯＮ１９４８４は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、Ｂ．ｔ．ｔ．コード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子を含有するｐＵＣ様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
Bacillus thuringensis var. tenebrionis （B.t.t.） 殺虫蛋白（McPherson等, 1988年, Bio/Technology 6:61−66）をコードする合成遺伝子を含有するｐＭＯＮ１９４８４（図１３）を、ｐＭＯＮ１９４７０（図８）中のＢａｍＨＩ部位にＢｇ１ＩＩ断片上の１．８ｋｂ Ｂ．ｔ．ｔ．遺伝子を挿入することにより構築した。従って、ｐＭＯＮ１９４８４は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、Ｂ．ｔ．ｔ．コード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子を含有するｐＵＣ様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
実施例３Ａに記載の如くｐＭＯＮ１９４８４を誘導するためにパーティクルガン爆撃を用いて安定に形質転換したＢＭＳカルスを作出した。ＥＣ９（図１９）との組み合わせでｐＭＯＮ１９４８４をＢＭＳ細胞中に爆撃した。耐性カルスを２０ｐｐｂクロルスルフロン上で選択した。しかる後、耐性カルスについてＢ．ｔ．ｔ．遺伝子の発現を調べた。
コロラドポテトビートル（Colorado Potato Beetle, CPB ）フィーディングアッセイを用いて、Ｂ．ｔ．ｔ．蛋白の発現についてｐＭＯＮ１９４８４で爆撃したクロルスルフロン耐性カルスをスクリーニングした。ＣＰＢの幼虫を、余分な水分を除くために僅かに吸水処理ＢＭＳカルスに供した。５匹の幼虫に、各クロルスルフロン耐性系を表すカルスをエサとして与えた。昆虫死亡率及び／又は発育阻止のレベルを、５日後に評価した。４０個のカルスを調べた。８個のカルス（２０％）は殺虫活性を示し、１１個のカルス（２８％）は発育阻止を起こし、６個のカルス（１５％）はわずかな発育阻止を起こし、１５個のカルス（３８％）はＣＰＢ昆虫に対して何等影響を及ぼさなかった。
最も大きい殺虫／発育阻止効果を示すカルスを、ウェスタンブロット法により更に分析した。ＢＭＳカルスをワットマンフィルター上で乾燥させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ緩衝液中に直接抽出した（Laemmli, 1970年, Nature 227:680−685） 。全蛋白レベルを測定（Biorad）し、４０〜５０ｕｇの蛋白を１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに供した。又、E. coli 産生 B.t.t．蛋白も定量標準として供した。ゲル電気泳動後、蛋白をゲルから膜へ電気泳動により移動させた（Towbin 等, 1979年, PNAS 76:4350−4354）。しかる後、この膜を、抗−B.t.t．抗体と共にインキュベートし、続いて化学発光（アマシャム社）検出システムを用いて検出した。
七つの系について調査した。一つの系は、高レベルの蛋白発現（全蛋白の０．０２％）を示し、四つの系は、中間のB.t.t.蛋白レベル（０．００１％）を示し、二つの系は、ウェスタンブロット法による検出をするのに充分なB.t.t.蛋白を産生しなかった。
ｐＭＯＮ１９４８６（図１４）は、Bacillus thuringensis kurstaki ＣｒｙＩＩＡ遺伝子をコードする合成遺伝子を含有する。この遺伝子（１．９ｋｂ）のアミノ酸配列は、Widner等 （1989年） J ．Bacteriol. 171:965−974に於いてＣｒｙＢ１と呼ばれる遺伝子と同一である。これは、鱗翅類及び双翅類昆虫の両者に対する殺虫活性を有する。１．９ｋｂ ＣｒｙＩＩＡコード配列を有するＢｇ１ＩＩ断片をｐＭＯＮ１９４７０（図８）内のＢａｍＨＩ部位中に挿入することによりｐＭＯＮ１９４８６を構築した。従って、ｐＭＯＮ１９４８６は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、ＣｒｙＩＩＡコード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子を含有するｐＵＣ様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
実施例３Ａに記載の如くｐＭＯＮ１９４８６を誘導するためにパーティクルガン爆撃を用いて安定に形質転換したＢＭＳカルスを作出した。ＥＣ９（図１９）との組み合わせでｐＭＯＮ１９４８４をＢＭＳ細胞中に爆撃した。耐性カルスを２０ｐｐｂクロルスルフロン上で選択した。しかる後、耐性カルスについてＣｒｙＩＩＡ遺伝子の発現を調べた。
ｐＭＯＮ１９４８６で爆撃したクロルスルフロン耐性カルスに於けるＢ．ｔ．ｋ． ＣｒｙＩＩＡ蛋白の発現は、初めに感受性タバコホーウォーム（Tobacco Hornworm，THW）を用いたフィーディングアッセイに於ける殺虫活性により検出した。ＴＨＷ昆虫を殺すに充分な高ＣｒｙＩＩＡ発現カルスを生育させ、ヨーロッパコーンボーダー（European Corn Border，ECB ）及びフォールアーミーウォーム（Fall Army Worm，FAW ）昆虫フィーディングアッセイに供した。１６匹のＥＣＢ又は１２匹のＦＷ昆虫の体重を予め測定した後、７日間ＢＭＳカルスで飼育した。生存数を数えて死亡率を決定した。発育阻止の程度は、対照に対する生存昆虫の平均増体重を測定することにより決定した。データを表５に示す。
又、殺虫活性を有するカルスについて、上記の如きウェスタンブロット法によりＣｒｙＩＩＡ蛋白の蓄積を調べた。ＣｒｙＩＩＡ蛋白の量は、同一のブロット上のE. coli 産生標準に対して定量した。表５に示すように、七つの殺虫系の内六つは、低感受性ウェスタンブロットによる検出に充分なＣｒｙＩＩＡ蛋白の発現を示した。ＣｒｙＩＩＡの発現は、全細胞内蛋白の０．００４％から０．１５％の範囲であり、平均０．００７％であった。
ｐＭＯＮ１８０１３（図１６）は、Arabidopsis thaliana SSU 1a 遺伝子 （SSU ・CTP）（Timko等, 1988年, The Impact of Chemistry on Biotechnology, ACS Books, 279−295） 及び、E. coli ＡＤＰグルコースピロホスホリラーゼ突然変異体遺伝子ｇｌｇＣ１６（Leung等, 1986年, J. Bacteriol. 167:82−88）から誘導されるＮ−末端０．２６ｋｂ葉緑体トランジットペプチド配列を含む遺伝子融合体を含有する。ＳＳＵ・ＣＴＰ／ｇｌｇＣ１６融合体の発現は、植物細胞内の澱粉蓄積増加に帰する。ＳＳＵ・ＣＴＰ／ｇｌｇＣ１６コード配列を有する１．６ｋｂ ＸｂａＩ断片をｐＭＯＮ１８１０３（図２３参照）内のＸｂａＩ部位中に挿入することによりｐＭＯＮ１８１０３を構築した。従って、ｐＭＯＮ１９４８６は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、ＳＳＵ・ＣＴＰ／ｇｌｇＣ１６コード配列及び、細菌に於けるアンピシリン選択のためのβ−ラクタマ−ゼ遺伝子を含有するｐＵＣ骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
実施例３Ａに記載の如くｐＭＯＮ１８１０３を誘導するためにパーティクルガン爆撃を用いて安定に形質転換したＢＭＳカルスを作出した。ＥＣ９（図１９）との組み合わせでｐＭＯＮ１９１０３をＢＭＳ細胞中に爆撃した。耐性カルスを２０ｐｐｂクロルスルフロン上で選択した。しかる後、耐性カルスについてｇｌｇＣ１６遺伝子の発現を調べた。
ｐＭＯＮ１８１０３で爆撃したクロルスルフロン耐性ＢＭＳ系について、Ｉ２／ＩＫＩ染色（Coe 等, 1988年, Corn and Corn Improvement, GF Sprague及び JW Dudley．編 AGS Inc.,Madison, WI 81−258ページ）を用いて澱粉蓄積を調べた。６７個の系の内８個が、対照カルスに対し澱粉染色の増加を示した。これらの系について上記の如きウェスタンブロット法を行った。全ての系は、E. coli−生産ＡＤＰ−ＧＰＰ蛋白を用いた定量標準に対し全蛋白の０．０２−０．１％のレベルでＡＤＰ−ＧＰＰ発現を示した。
ｐＭＯＮ１８１３１（図１５）は、Pseudomonas 由来のＡＣＣデアミナーゼ遺伝子を含有する。ＡＣＣデアミナーゼ酵素は、１−アミノシクロプロパン−１−カルボン酸（ＡＣＣ）をα−ケト酪酸とアンモニアに変換する（Honma and shimomura，1978年, Agric. Biol. Chem. 42 巻 10 号:1825−1813）。ＡＣＣデアミナーゼ酵素の発現は、成熟に影響を及ぼすエチレン生合成（Klee 等, 1991年, Plant Cell 3巻, 1187−1193）の阻害に帰する。ｇｌｇＣ１６コード配列の代りに、１．１ｋｂ ＡＣＣデアミナーゼ遺伝子をＸｂａＩ−ＢａｍＨＩ断片としてｐＭＯＮ１８１０３（図１６）中に挿入することによりｐＭＯＮ１８１３１を構築した。従って、ｐＭＯＮ１８１３１は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、ＡＣＣデアミナーゼコード配列及び、細菌に於けるアンピシリン選択のためのβ−ラクタマ−ゼ遺伝子を含有するｐＵＣ骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
実施例３Ａに記載の如くｐＭＯＮ１８１３１を誘導するためにパーティクルガン爆撃を用いて安定に形質転換したＢＭＳカルスを作出した。ＥＣ９（図１９）との組み合わせでｐＭＯＮ１８１３１をＢＭＳ細胞中に爆撃した。耐性カルスを２０ｐｐｂクロルスルフロン上で選択した。しかる後、耐性カルスについてＡＣＣデアミナーゼ遺伝子の発現を調べた。
ｐＭＯＮ１８１３１で爆撃したクロルスルフロン耐性カルスをウェスタンブロット法により分析した。試験した２４個の系の内１７個が、高レベルのＡＣＣデアミナーゼ蛋白蓄積（全蛋白の〜０．１％）を示した。
ＨＳＰ７０イントロン及びビアラホス選択を有するベクターを用いた植物の生産
ｐＭＯＮ１９４７７（図２４）は、S. hygroscopicus由来のＢＡＲ遺伝子を含有する。ＢＡＲ遺伝子は、除草剤ＢＡＳＴＡに於ける有効成分ホスフィノトリシン又はビアラホスに対する耐性を賦与することにより選択マーカーとして用いることのできるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードする（Fromm 等, 1990年, Bio/Technology 8:833−839; De Block 等, 1987年, Embo．J. 6:2513−2518; Thompson等, 1987年, Embo．J. 6:2519−2523）。ＢＡＲ遺伝子を０．６ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＢＣ１Ｉ断片としてｐＭＯＮ１９４７０（図８）内のＢａｍＨＩ部位中に挿入することによりｐＭＯＮ１９４７７を構築した。従って、ｐＭＯＮ１９４７７は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、ＢＡＲコード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子を含有するｐＵＣ様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
ｐＭＯＮ１９４７７（図２４）は、S. hygroscopicus由来のＢＡＲ遺伝子を含有する。ＢＡＲ遺伝子は、除草剤ＢＡＳＴＡに於ける有効成分ホスフィノトリシン又はビアラホスに対する耐性を賦与することにより選択マーカーとして用いることのできるホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ酵素をコードする（Fromm 等, 1990年, Bio/Technology 8:833−839; De Block 等, 1987年, Embo．J. 6:2513−2518; Thompson等, 1987年, Embo．J. 6:2519−2523）。ＢＡＲ遺伝子を０．６ｋｂ ＢａｍＨＩ−ＢＣ１Ｉ断片としてｐＭＯＮ１９４７０（図８）内のＢａｍＨＩ部位中に挿入することによりｐＭＯＮ１９４７７を構築した。従って、ｐＭＯＮ１９４７７は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、ＢＡＲコード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子を含有するｐＵＣ様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
ｐＭＯＮ１９４９３（図２５）は、６１６−１１７７番目のアミノ酸（Adang等, 1985年, Gene 36:289−300）をコードするＣｒｙＩＡ（ｃ）遺伝子の１．８ｋｂ３′ハ−フと翻訳融合した、Fischhoff 等，（1987年）Bio/Technology 5:807−813によって記載された Bacillus thuringensus kurstaki ＣｒｙＩＡ（ｂ）昆虫防除蛋白の１番目から６１５番目のアミノ酸をコードする１．８ｋｂ切断遺伝子から成る“合成”Ｂ．ｔ．ｋ．遺伝子を含有する。この遺伝子の植物に於ける発現は、昆虫耐性に帰する。３．６ｋｂ“合成”Ｂ．ｔ．ｋ．遺伝子コード配列をＢｇ１ＩＩ断片としてｐＭＯＮ１９４７０（図８）内のＢａｍＨＩ部位中に挿入することによりｐＭＯＮ１９４９３を構築した。従って、ｐＭＯＮ１９４９３は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、“合成”Ｂ．ｔ．ｋ．コード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子を含有するｐＵＣ様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
ｐＭＯＮ１９４６８（図２６）は、E. coli ＧＵＳ遺伝子を含有し、組織化学染色を用いた形質転換の肉眼的に計数可能マーカーとして用いることが出来る。ｐＭＯＮ８６７８由来のＧＵＳ遺伝子を含有する１．８ｋｂ Ｂｇ１ＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片をｐＭＯＮ１９４７０骨格内のＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位中に挿入することによりｐＭＯＮ１９４６８を構築した。従って、ｐＭＯＮ１９４６８は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、ＧＵＳコード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子を含有するｐＵＣ様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
０．２％ＰｈｙｔａｇｅｌＴＭ（シグマ社）で固形化した、２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１８０ｍｇ／Ｌのカゼイン加水分解物、２５ｍＭのＬ−プロリン、１０ｕＭの硝酸銀、ｐＨ５．８を含むように改変したＮ６２−１００−２５−Ａｇ培地（Chu等, 1975年, Sci. Sin．Peking 18:659−688）上で１８−３３日培養した“Ｈｉ−ＩＩ”ゲノタイプ（Armstrong等, 1991年, Maize Genetic Newsletter 65:92−93）の未成熟トウモロコシ胚子から胚子培養を開始した。これらの胚子培養物を、パーティクルガン爆撃による形質転換のための標的組織として用いた。
ｐＭＯＮ１９４７７、ｐＭＯＮ１９４９３及びｐＭＯＮ１９４６８プラスミドＤＮＡの２：１：１の混合物に１２．５ｕｌの微粒子（５０％グリセロール中に２５ｍｇ／ｍｌ）、２．５ｕｌの実験用プラスミドＤＮＡ（１ｕｇ／ｕｌ）、１２．５ｕＬの１Ｍ塩化カルシウム及び、５ｕＬの０．１Ｍスペルミジンを加え短時間撹拌することにより、これををタングステンＭ１０微粒子上に沈着させた。この微粒子を２０分間沈降させた後、１２．５ｕｌの上澄を除去した。ＤＮＡ−タングステンの各サンプルを短時間超音波で処理し、その２．５ｕｌを、ＰＤＳ−1000 バイオリシティックスパーティクルガン（デュポン社）を用いて胚子培養物中に撃ち込んだ。
爆撃の翌日にこの組織を新鮮な非選択培地に移した。爆撃後６日目に、この材料を、２ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１０ｕＭの硝酸銀、０．３ｍｇ／Ｌのビアラホスを含有しカザミノ酸もプロリンも非含有の選択培地に移した。２−３週後、この培養物を１．０ｍｇ／Ｌビアラホスを含有する新鮮な培地に移した。ビアラホス耐性カルスを識別することが出来るまで、この培養物を２−３週間隔で移しながら１．０ｍｇ／Ｌビアラホス培地上に維持した。８個の胚子材料プレートから７個のビアラホス耐性カルスを回収した。
ビアラホス耐性系を生育させ、Ｂ．ｔ．ｋ．又はＧＵＳ発現を調べた。Ｂ．ｔ．ｋ．発現を調べるために、全ての系についてタバコホーンウォーム（Tobacco Hornworm，THW ）フィーディングアッセイに於ける殺虫活性を試験した。約０．５ｇの胚子カルスを１０−１２匹のＴＨＷの幼虫に餌として与えた。二つの系、２８４−５−３１及び２８４−６−４１は、陽性であり、ｐＭＯＮ１９４９３由来のＢ．ｔ．ｋ．遺伝子がゲノム内に導入され発現したことを示す、ＴＨＷ昆虫に対する有意な致死を示した。又、全ての系について、組織化学アッセイ（Jefferson ，R.A., Kavanagh, T.A., and Bevan, M.W.,1987年, Embo.J. 6:3901−3907 ）を用いたＧＵＳ発現も調べた。試験した七つの系の内ただ一つの系、２８４−８−３１のみが、ｐＭＯＮ１９４６８由来のＧＵＳ発現を示す検出可能な青色染色を示した。
三段階再生プロトコールを用いて全ビアラホス耐性カルスから植物体を再生した。全再生は、１ｍｇ／ＬのＢＡＳＴＡ上で行った。胚子組織を約２週間各培地上でインキュベートした後、次の段階の培地（表６の再生培地成分参照）に移した。初めの二段階は、２８℃の暗所で行い、最終段階は、〜２５℃で白色蛍光灯により提供された〜７０ｕＥ、ｍ−２、ｓｅｃ−１、照射間隔１６時間：８時間の条件下で行った。１００×２５ｍｍのペトリ皿内の再生培地３上に形成された小さい緑の苗条を２００×２５ｍｍのパイレックスＴＭ又はフィタトレイＴＭ内の再生培地３に移し、更なる小植物体への生育及び根形成をなさしめた。充分な根系形成後、植物体を培地から慎重に取リーダーし、根系を流水で洗浄し、Metromix 350生育培地が入った２．５″ポット内にこの植物体を置いた。この植物を多湿環境で７日間維持した後、湿度を徐々に減らして植物を鍛えた。この植物は、生育中２．５″のポットから６″のポットに移植し、最終的に１０″のポットに移植した。
ビアラホス耐性胚子カルスから再生した全コーン植物体は、爆撃された遺伝子、即ちＢＡＲ、Ｂ．ｔ．ｋ．又はＧＵＳの内少なくとも一つを発現することを示した。ビアラホス耐性、ＴＨＷ陰性カルス系から再生した植物体は、トランスジェニックであり、ＢＡＲ遺伝子を発現することをＢＡＳＴＡリーフペインティングアッセイによって確認した。輪生体から４−５枚の葉が充分に出た時点で苗木をアッセイした。１％ＢＡＳＴＡ、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０の溶液を、初めに充分出た葉の上部及び下部表面に供した。塗布後３日目に植物体を評価した。対照となる植物体は、葉の黄変及び壊死を示したが、一方、耐性系由来の葉は、緑色で健康的であった。これは、ｐＭＯＮ１９４７７内のＢＡＲ遺伝子がこれらの植物体に於いて発現したというだけでなく、発現レベルが植物体レベルに於ける除草剤ＢＡＳＴＡに対する耐性を賦与するに充分高いことを示している。
ＴＨＷ活性を示す二つの系、２８４−５−３１及び２８４−６−４１から再生した植物体について、全植物体フィーディングアッセイによりＢ．ｔ．ｋ．発現をアッセイした。高さ約３０″の植物体に１００個のヨーロッパコーンボアラ−（European Corn Borer ，ECB）の卵を接種した。接種して２週間経過後、フィーディングダメージを０（ダメージ無し）から９（高レベルのリーフフィーディングダメージ）までの尺度で評価した。対照植物体は、昆虫フィーディング格付け９の評価であった。ｐＭＯＮ１９４９３を含有するいずれかの系由来の全植物体は、ＥＣＢダメージがないゼロの格付けを受けた。
ＥＣＢ飼育調査結果は、Ｂ．ｔ．ｋ．遺伝子が、再生した植物体に於いて昆虫耐性を実現する充分高いレベルで発現したことを示す。発現のレベルを定量するために、再生した系由来のサンプルをＥＬＩＳＡによりアッセイした。各々のカルス系から再生した８つの植物体を分析した。系２８４−５−３１由来の植物体は、Ｂ．ｔ．ｋ．の発現が全細胞内蛋白の０．００６％から０．０３４％の範囲であり、平均値は０．０２％であった。系２８４−６−４１由来の植物体は、Ｂ．ｔ．ｋ．の発現が全蛋白の０．００５％から０．０５％の範囲であり、平均値は同じく０．０２％であった。
ＨＳＰ７０イントロンを含有するグリホゼート選択ベクターを用いた植物体の生産
ｐＭＯＮ１９６４０（図１２）は、５−エノールピルビルシキミ酸−３−燐酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子を含有する。ｐＭＯＮ１９６４０（図１２）を形成するために、グリホゼート除草剤に対する耐性を賦与する、成熟ペプチドの二つの突然変異（Ｇｌｙ１４４＞Ａｌａ及びＧｌｙ２０６＞Ａｓｐ）を有するトウモロコシＥＰＳＰＳコード配列を含有する１．７５ｋｂ ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＭＯＮ１９４７０（図８）内の対応する制限部位中に挿入した。従って、ｐＭＯＮ １９６４０は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、ＥＰＳＰＳコード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子を含有するｐＵＣ様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
ｐＭＯＮ１９６４０（図１２）は、５−エノールピルビルシキミ酸−３−燐酸シンターゼ（ＥＰＳＰＳ）遺伝子を含有する。ｐＭＯＮ１９６４０（図１２）を形成するために、グリホゼート除草剤に対する耐性を賦与する、成熟ペプチドの二つの突然変異（Ｇｌｙ１４４＞Ａｌａ及びＧｌｙ２０６＞Ａｓｐ）を有するトウモロコシＥＰＳＰＳコード配列を含有する１．７５ｋｂ ＸｂａＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ｐＭＯＮ１９４７０（図８）内の対応する制限部位中に挿入した。従って、ｐＭＯＮ １９６４０は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、ＥＰＳＰＳコード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子を含有するｐＵＣ様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
ｐＭＯＮ１９６４３（図１７）は、Arabidopsis thaliana SSU 1a 遺伝子（SSU CTP）から誘導されるＮ−末端０．２６ｋｂ葉緑体トランジットペプチド配列（Timko等, 1988年, The Impact of Chemistry on Biotechnology, ACS Books, 279−295）及び、Ｃ−末端１．３ｋｂ合成ＧＯＸ遺伝子配列を含む遺伝子融合体を含有する。ＧＯＸ遺伝子は、グリホゼートの、除草剤として不活性な生成物、アミノメチル燐酸及びグリオキシル酸への変換を触媒する酵素グリホゼート酸化還元酵素をコードする。遺伝子融合体の植物中での発現は、ＣＴＰが切断及び分解され成熟ＧＯＸ蛋白（della−Cioppa 等, 1986年, Proc．Natl．Acad．Sci. USA 83:6873−6877）を放出する葉緑体内に迅速に運ばれるプレー蛋白を生成する。ｐＭＯＮ１９４７０（図８）を消化したＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ部位中に１．６ｋｂ Ｂｇ１ＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片としてＳＳＵ・ＣＴＰ−−ＧＯＸ融合体コード配列を挿入することにより、ｐＭＯＮ１９６４３（図１７）を構築した。従って、ｐＭＯＮ１９６４３は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、ＳＳＵ・ＣＴＰ−−ＧＯＸコード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子を含有する ｐＵＣ様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
０．２％ＰｈｙｔａｇｅｌＴＭ（シグマ社）で固形化した、１ｍｇ／Ｌの２，４−ジクロロフェノキシ酢酸、１８０ｍｇ／Ｌのカゼイン加水分解物、２５ｍＭのＬ−プロリンを含むように改変したＮ６１−１００−２５培地（Chu等, 1975年, Sci. Sin．Peking 18:659−688）上で１８−３３日培養した“Ｈｉ−ＩＩ”ゲノタイプ（Armstrong等, 1991年, Maize Genetic Newsletter 65:92−93）の未成熟トウモロコシ胚子から胚子培養を開始した。これらの胚子培養物を、パーティクルガン爆撃による形質転換のための標的組織として用いた。
ｐＭＯＮ１９６４０及びｐＭＯＮ１９６４３プラスミドＤＮＡの１：１の混合物に１２．５ｕｌの微粒子（５０％グリセロール中に２５ｍｇ／ｍｌ）、２．５ｕｌの実験用プラスミドＤＮＡ（１ｕｇ／ｕｌ）、１２．５ｕＬの１Ｍ塩化カルシウム及び、５ｕＬの０．１Ｍスペルミジンを加え短時間撹拌することにより、これをタングステンＭ１０微粒子上に沈着させた。この微粒子を２０分間沈降させた後、１２．５ｕｌの上澄を除去した。ＤＮＡ−タングステンの各サンプルを短時間超音波で処理し、その２．５ｕｌを、ＰＤＳ−1000 バイオリシティックスパーティクルガン（デュポン社）を用いて胚子培養物中に撃ち込んだ。
爆撃の１週間後、培養物を新鮮なＮ６ １−０−２５培地（カゼイン加水分解物を省き１ｍＭのグリホゼートを加えたことを除いては開始用培地と同じ）に移した。１ｍＭのグリホゼート培地上で２週間生育後、培養物を、３ｍＭのグリホゼートを含有することを除いては同じ基本培地に移した。約２週間間隔で３ｍＭのグリホゼート培地上への更なる移動を行った。爆撃の約８−１０週後、爆撃プレート当り約０．２−１．０のグリホゼート耐性カルスの頻度で耐性カルスを同定した。
１ｍｇ／Ｌ Ｂａｓｔａの代りに培養培地に０．０１ｍＭのグリホゼートを加えるか又は選択試薬を何も加えないかのいずれかであることを除いては、実施例１０に於いてビアラホス耐性カルスのために記載した通りに、グリホゼート耐性カルスから植物体を再生させた。植物体に於けるｐＭＯＮ１９６４３の発現を、ウェスタンブロット法により分析した。三つの独立したグリホゼート耐性カルスから再生したいくつかの個別の植物体から葉のパンチを採取した。三つの系全てが、検出可能なレベルのＧＯＸ遺伝子発現を示した。系２６４−２−１由来のアッセイした四つの植物体は、低いが検出可能なレベルのＧＯＸの発現（全蛋白の約０．００２％）を有した。系２６９−１−１由来の五つの植物体は、全蛋白の０．０４−０．０６％の範囲の高いＧＯＸ蛋白レベルを示した。最後に、系２９２−５−１由来の２３の植物体をアッセイした。ＧＯＸ蛋白レベルは、全蛋白の０．０５％から０．１％の範囲であった。２９オンス／エーカーでグリホゼートを噴霧されたこれらの植物体は、充分に多産の植物体を生産した。これらの植物体のＲ1 子孫は、２９オンス／エーカー、５８オンス／エーカー及び１１５オンス／エーカーでグリホゼートを噴霧した。植物体の一つの系は、完全な雑草抑制を達成するレベルでグリホゼート耐性を示す最も高い使用割合で植物としてのダメージをなんら示さなかった。
ＨＳＰ７０イントロン改変の影響
Ａ．ＨＳＰ７０イントロン内の欠失
ｐＭＯＮ１９４３３をＢｓｍＩ及びＮｓｉＩで消化し、続いて円滑末端を創るためにＴ４ポリメラーゼで処理し、再ライゲ−ションすることにより、欠失１（図２）（配列番号：２）を創出した。消化にＢｓｍＩ及びＳｎａＢＩを用いたことを除いては同様にして欠失２（図３）（配列番号：３）を作成した。実施例２に於いて記載したようなＢＭＳパーティクルガントランジエントアッセイにより、全長鎖ＨＳＰ７０イントロンの遺伝子発現に対する影響と欠失１又は欠失２の影響とを比較した。下記に示す如く、ｐＭＯＮ１９４３３に於いて、内部欠失を有するイントロンは、イントロンを含まない対照に対し全長鎖イントロンと同じ程度にＧＵＳ遺伝子発現を増加させる。
Ａ．ＨＳＰ７０イントロン内の欠失
ｐＭＯＮ１９４３３をＢｓｍＩ及びＮｓｉＩで消化し、続いて円滑末端を創るためにＴ４ポリメラーゼで処理し、再ライゲ−ションすることにより、欠失１（図２）（配列番号：２）を創出した。消化にＢｓｍＩ及びＳｎａＢＩを用いたことを除いては同様にして欠失２（図３）（配列番号：３）を作成した。実施例２に於いて記載したようなＢＭＳパーティクルガントランジエントアッセイにより、全長鎖ＨＳＰ７０イントロンの遺伝子発現に対する影響と欠失１又は欠失２の影響とを比較した。下記に示す如く、ｐＭＯＮ１９４３３に於いて、内部欠失を有するイントロンは、イントロンを含まない対照に対し全長鎖イントロンと同じ程度にＧＵＳ遺伝子発現を増加させる。
Ｂ．５′及び３′スプライス部位共通配列に於ける改変
又、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）によるＨＳＰ７０イントロンの初めのポリメラーゼ連鎖反応法合成に於いて、変異体イントロンも合成した。この変異体イントロンは、β−グルクロニダーゼ又はルシフェラーゼに隣接してクロ−ンされる場合、イントロンを含まない対照に対し発現を４倍増加させるが、野性型ＨＳＰ７０イントロンより１０倍少ない。配列番号：１に示したヌクレオチド配列からの唯一の有意な相違は、１９番目のヌクレオチドに於けるアデニンの欠失のみである。
又、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）によるＨＳＰ７０イントロンの初めのポリメラーゼ連鎖反応法合成に於いて、変異体イントロンも合成した。この変異体イントロンは、β−グルクロニダーゼ又はルシフェラーゼに隣接してクロ−ンされる場合、イントロンを含まない対照に対し発現を４倍増加させるが、野性型ＨＳＰ７０イントロンより１０倍少ない。配列番号：１に示したヌクレオチド配列からの唯一の有意な相違は、１９番目のヌクレオチドに於けるアデニンの欠失のみである。
ＨＳＰ７０イントロンは、発表された（Brown, J.W.S., 1986年, Nuc. Acid Res. 14:9949−9959）５′スプライス部位共通配列と二つの位置で異なり、３′スプライス部位共通配列とは一つの位置で異なる。１９番目のヌクレオチドの欠失は、四つの位置で５′スプライス部位共通配列からそれる変異体ＨＳＰ７０イントロンを生じさせる。それで、この変異体イントロンは、野性型イントロンほど効率的にスプライスしないと考えられ、これで、遺伝子発現に対する影響の相違を説明することが出来る。
この問題を処理するために、５′スプライス部位、３′スプライス部位、又はその両方の位置に完全な共通配列を含有するＨＳＰイントロンの変異体を構築した。ＨＳＰ７０イントロンスプライス部位を５′及び／又は３′スプライス部位共通配列へ突然変異させる所望の変形体を含有するプライマーを用いてＰＣＲ法によりＨＳＰ７０イントロンの変異体を合成した。詳しくは、５′スプライス部位共通プライマーは、配列番号：１の１５番目のヌクレオチド及び２０番目のヌクレオチドが各々アデニンに変化したことを除いては１番目から２６番目のヌクレオチドを含有していた。３′スプライス部位共通プライマーは、８００番目のヌクレオチドがグアニン（プライマーではシトシン）に変化したことを除いては７９１番目から８１６番目までのヌクレオチドに相補的であるヌクレオチドを含有していた。
ＨＳＰ７０イントロン変異体を含有するＰＣＲ法生成物をＢｇ１ＩＩ及びＮｃｏＩで消化し、ｐＭＯＮ１９４３３の構築と同様にｐＭＯＮ８６７７中にクロ−ンした。従って、各々のベクターは、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン（オリジナル又は変異 体）、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）コード配列及び、ノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。これらは、イントロンを除いては全て同じである。ｐＭＯＮ１９４３３は、オリジナルのＨＳＰ７０イントロンを含有し、ｐＭＯＮ１９４６０は、５′スプライス部位共通変異体イントロンを含有し、ｐＭＯＮ１９４６３は、３′スプライス部位共通変異体イントロンを含有し、ｐＭＯＮ１９４６４は、５′及び３′の両方のスプライス部位共通配列を含有する変異体イントロンを含有する。
ｐＭＯＮ１９４６０、ｐＭＯＮ１９４６３、ｐＭＯＮ１９４６４及びｐＭＯＮ１９４３３について、実施例２に記載した如く、ＢＭＳ細胞に於けるトランジエント遺伝子発現アッセイの結果を比較した。下記に示す如く、ＨＳＰ７０イントロンの変形例のいずれも、ＧＵＳ遺伝子発現を有意に変えなかった。
Ｃ．エクソン配列数の増加はＨＳＰ７０イントロンに影響しない
オリジナルのＨＳＰ７０″イントロン″は、完全な介在配列を含み、又１０個の塩基のエクソン１及び１１個の塩基のエクソン２を含有する。このイントロンは、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとコード配列間の５′非翻訳リーダー領域内に位置することから、この２１個の塩基のエクソン配列はリーダー内に残されたままになる。過剰のＨＳＰ７０エクソン配列がスプライシング効率及び、遺伝子発現を増加させる能力に影響するかどうかを調査するために、ＨＳＰ７０エクソン１の３′末端の５０個のヌクレオチド及び／又はＨＳＰ７０エクソン２の５′末端の２８個のヌクレオチドを生じさせるＰＣＲ法用プライマー（Shah 等, 1985年, Cell and Mol．Biol．of Plant Stress. Alan R. Liss, Inc ．181−200）を用いて、異なる量のエクソン配列を含有するイントロンを合成した。
オリジナルのＨＳＰ７０″イントロン″は、完全な介在配列を含み、又１０個の塩基のエクソン１及び１１個の塩基のエクソン２を含有する。このイントロンは、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターとコード配列間の５′非翻訳リーダー領域内に位置することから、この２１個の塩基のエクソン配列はリーダー内に残されたままになる。過剰のＨＳＰ７０エクソン配列がスプライシング効率及び、遺伝子発現を増加させる能力に影響するかどうかを調査するために、ＨＳＰ７０エクソン１の３′末端の５０個のヌクレオチド及び／又はＨＳＰ７０エクソン２の５′末端の２８個のヌクレオチドを生じさせるＰＣＲ法用プライマー（Shah 等, 1985年, Cell and Mol．Biol．of Plant Stress. Alan R. Liss, Inc ．181−200）を用いて、異なる量のエクソン配列を含有するイントロンを合成した。
異なるエクソン鎖長を有する種々のＨＳＰ７０イントロンを含有するＰＣＲ法生成物を、ｐＭＯＮ１９４３３の構築と同様に、Ｂｇ１ＩＩ及びＮｃｏＩで消化し、ｐＭＯＮ８６７７中にクロ−ンした。従って、各々のベクターは、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン及びそれを取り囲むエクソン配列、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）コード配列及び、ノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。これらは、イントロンを囲むＨＳＰ７０エクソンの鎖長を除いては全て同じである。
しかる後、これらのベクターについて、実施例２に記載した如く、ＢＭＳ細胞に於けるトランジエント遺伝子発現アッセイの結果を比較した。下記に示す如く、ＨＳＰ７０イントロンの変形例のいずれも、ＧＵＳ遺伝子発現を有意に変えなかった。
ＨＳＰ７０イントロンは、小麦細胞に於ける遺伝子発現を増加させる
小麦細胞に於ける遺伝子発現に対するイントロンの効果を調べるために、トランジエント遺伝子発現アッセイを行った。実施例２に於いてコーン浮遊細胞について記載したように、Ｃ９８３小麦浮遊細胞（フロリーダー大学、I. Vasil博士より入手）をプレーティングし、イントロン非含有（ｐＭＯＮ８６７７）、ＡＤＨ１イントロン（ｐＭＯＮ８６７８）及びＨＳＰ７０イントロン（ｐＭＯＮ１９４３３）含有β−グルクロニダーゼベクターで爆撃した。下記に示す如く、小麦細胞に於けるＧＵＳ発現に対するＡＤＨ１イントロン及びＨＳＰ７０イントロンの効果は、コーン細胞に於けるものに匹敵する。ＡＤＨ１イントロンベクターは、イントロンを含まないベクターに比し高いレベルのＧＵＳ発現を示すが、ＨＳＰ７０イントロンベクターは、ＡＤＨ１イントロンベクターに比し有意に高いレベルの発現を示す。
小麦細胞に於ける遺伝子発現に対するイントロンの効果を調べるために、トランジエント遺伝子発現アッセイを行った。実施例２に於いてコーン浮遊細胞について記載したように、Ｃ９８３小麦浮遊細胞（フロリーダー大学、I. Vasil博士より入手）をプレーティングし、イントロン非含有（ｐＭＯＮ８６７７）、ＡＤＨ１イントロン（ｐＭＯＮ８６７８）及びＨＳＰ７０イントロン（ｐＭＯＮ１９４３３）含有β−グルクロニダーゼベクターで爆撃した。下記に示す如く、小麦細胞に於けるＧＵＳ発現に対するＡＤＨ１イントロン及びＨＳＰ７０イントロンの効果は、コーン細胞に於けるものに匹敵する。ＡＤＨ１イントロンベクターは、イントロンを含まないベクターに比し高いレベルのＧＵＳ発現を示すが、ＨＳＰ７０イントロンベクターは、ＡＤＨ１イントロンベクターに比し有意に高いレベルの発現を示す。
ＨＳＰ７０イントロンは、イネに於ける遺伝子発現を増加させる
イネ株８７０６、即ちインディカ／ジャポニカ雑種、由来のイネ組織培養系８１２ＭをＭＳ培地で生育させた。継代培養の翌日、パーティクルガン爆撃のため、細胞をワットマンフィルターに移した。ＢＭＳ細胞のために述べた（実施例３）ように、ＰＤＳ−１０００を用いて、ＣａＣｌ２／スペルミジンで沈澱させたプラスミドＤＮＡで爆撃を行った。この細胞に２日間導入した遺伝子を発現させた後、回収した。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）及びルシフェラーゼ（ＬＵＸ）を、前述のごとくアッセイした。表７に示すように、重複実験に於ける５′非翻訳領域内のＨＳＰ７０イントロンの存在は、イントロン非含有ベクターで観察される発現の、ＬＵＸ発現に対するＧＵＳ発現の平均値を約１０倍増加させる。
イネ株８７０６、即ちインディカ／ジャポニカ雑種、由来のイネ組織培養系８１２ＭをＭＳ培地で生育させた。継代培養の翌日、パーティクルガン爆撃のため、細胞をワットマンフィルターに移した。ＢＭＳ細胞のために述べた（実施例３）ように、ＰＤＳ−１０００を用いて、ＣａＣｌ２／スペルミジンで沈澱させたプラスミドＤＮＡで爆撃を行った。この細胞に２日間導入した遺伝子を発現させた後、回収した。β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）及びルシフェラーゼ（ＬＵＸ）を、前述のごとくアッセイした。表７に示すように、重複実験に於ける５′非翻訳領域内のＨＳＰ７０イントロンの存在は、イントロン非含有ベクターで観察される発現の、ＬＵＸ発現に対するＧＵＳ発現の平均値を約１０倍増加させる。
ＨＳＰ７０イントロンベクターを用いたＣＰ４ ＥＰＳＰＳの発現
ＨＳＰ７０イントロンベクター中のＣＰ４ ＥＰＳＰＳ遺伝子（1991年8月28日出願された米国特許出願Ｓ．Ｎ．０７／７４９，６１１、参照により本明細書に含めるものとする）の発現を調べるために、ｐＭＯＮ１９６５３（図２７）を構築した。１．４ｋｂ細菌ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ蛋白コード領域にフレ−ム内に融合させた、Arabidopsis EPSPS 遺伝子（AEPSPS CTP）由来の３００ｂｐ葉緑体トランジットペプチドを含有する１．７ｋｂ Ｂｇ１ＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ消化したｐＭＯＮ１９４７０中にクロ−ンして、ｐＭＯＮ１９６５３を形成させた。従って、ｐＭＯＮ１９６５３は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、ＡＥＰＳＰＳ ＣＴＰ／ＣＰ４コード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子を含有するｐＵＣ様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
ＨＳＰ７０イントロンベクター中のＣＰ４ ＥＰＳＰＳ遺伝子（1991年8月28日出願された米国特許出願Ｓ．Ｎ．０７／７４９，６１１、参照により本明細書に含めるものとする）の発現を調べるために、ｐＭＯＮ１９６５３（図２７）を構築した。１．４ｋｂ細菌ＣＰ４ ＥＰＳＰＳ蛋白コード領域にフレ−ム内に融合させた、Arabidopsis EPSPS 遺伝子（AEPSPS CTP）由来の３００ｂｐ葉緑体トランジットペプチドを含有する１．７ｋｂ Ｂｇ１ＩＩ−ＥｃｏＲＩ断片を、ＢａｍＨＩ−ＥｃｏＲＩ消化したｐＭＯＮ１９４７０中にクロ−ンして、ｐＭＯＮ１９６５３を形成させた。従って、ｐＭＯＮ１９６５３は、５′から３′までに、増強されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、ＨＳＰ７０イントロン、ＡＥＰＳＰＳ ＣＴＰ／ＣＰ４コード配列及び、細菌に於けるカナマイシン選択のためのＮＰＴＩＩ遺伝子を含有するｐＵＣ様骨格内のノパリンシンターゼポリアデニル化領域を含む。
ｐＭＯＮ１９６５３をｐＭＯＮ１９６４３と組み合わせて胚子細胞内に導入し、実施例１１に於いて記載した如きグリホゼート培地上で、形質転換されたカルスを選択した。グリホゼート耐性胚子カルスをウェスタンブロット法によりアッセイした。発現したＣＰ４蛋白の量をE. coli生産蛋白の標準と比較することにより決定した。九つの系が生じた。ＣＰ４発現レベルは、胚子カルスから調製した粗抽出物に於いて、検出不可能なものから全蛋白の０．３％までの範囲であり、平均値は０．１７％であった。
上記の実施例は、ＨＳＰ７０イントロンを含有するベクターの使用が蛋白をコードする他のＤＮＡ配列の単子葉植物に於ける発現を増強することが予期されることを示す。
Claims (9)
- トウモロコシ、イネまたはライ麦植物内でのキメラ植物遺伝子の発現法において、この方法の改良が、蛋白質をコードする構造ＤＮＡ配列の非翻訳リーダー５’中に配列番号：１、配列番号：２及び配列番号：３から成る群から選ばれるイントロンを含むキメラ植物遺伝子を発現することを包含する前記方法。
- イントロンが配列番号：１である、請求項１に記載の方法。
- イントロンが配列番号：２である、請求項１に記載の方法。
- イントロンが配列番号：３である、請求項１に記載の方法。
- 構造ＤＮＡ配列がＥＰＳＰシンターゼをコードする、請求項２に記載の方法。
- 構造ＤＮＡ配列がＡＣＣ−デアミナーゼをコードする、請求項２に記載の方法。
- 構造ＤＮＡ配列がＧＯＸ蛋白質をコードする、請求項２に記載の方法。
- 構造ＤＮＡ配列がＢ．ｔ．結晶トキシン蛋白質をコードする、請求項２に記載の方法。
- 構造ＤＮＡ配列がｇｌｇＣ１６蛋白質をコードする、請求項２に記載の方法。
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