KR101957550B1 - 항진균성 식물 단백질, 펩티드 및 사용 방법 - Google Patents

항진균성 식물 단백질, 펩티드 및 사용 방법 Download PDF

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Abstract

민감한 균류에 대해 높은 수준의 저항성을 나타내는 MtDef5 항진균성 단백질 및 펩티드를 발현하는 형질전환 식물이 제공된다. 이와 같은 형질전환 식물은 이와 같은 분자들을 인코딩하는 핵산 염기서열에 작동가능하게 결합된 천연 또는 이종 신호 펩티드 서열을 포함하는 재조합형 DNA 작제물을 함유한다. 또한 이와 같은 식물의 생성 방법, 민감한 진균 감염증 및 손상으로부터 식물을 보호하는 방법뿐만 아니라, 식물의 유전자좌에 적용될 수 있는 조성물이 제공되는데, 여기에는 이들 분자를 발현시키는 미생물들, 이들 분자들 자체뿐만 아니라, 이들 분자를 함유하는 약제학적 조성물이 포함된다. 민감한 진균 감염증 치료를 위한 MtDef5 항진균성 단백질 및 펩티드의 인간 및 가축 치료에 사용 또한 본 발명에 포함된다.

Description

항진균성 식물 단백질, 펩티드 및 사용 방법{ANTIFUNGAL PLANT PROTEINS, PEPTIDES, AND METHODS OF USE}
관련 출원의 상호 참조
본원은 2013년 4월 30일에 출원된 미국 임시 출원 일련번호 제61/817,415호의 우선권의 혜택을 주장하고, 상기의 내용은 전체가 본원에 참조로 편입되었다.
본 발명은 메디카고 트룬카툴라(Medicago truncatula)(Barrel Medic, Barrel Medick, 또는 Barrel Clover)에서 유도된 소형 항진균성 단백질 및 펩티드, 즉, MtDef5 디펜신과, 이들 분자들의 항진균성 활성에 민감한(susceptible) 병원성 균류를 방제하기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 항진균성 단백질 및 펩티드는 항진균성 조성물의 구성성분으로서 식물에 직접 적용되거나, 상기 단백질 또는 펩티드를 생성하는 미생물의 형태로 식물에 적용될 수 있고, 또는 식물 그 자체가 상기 단백질 또는 펩티드를 생성하도록 유전자 변형될 수 있다. 본 발명은 또한 DNA 작제물, 미생물들 및, 상기 DNA 작제물에 의해 변형된 식물, 및 병원성 식물 및 기타 균류의 방제에 유용한 조성물에 관한 것이다.
농업 측면에서 중요한 작물들을 병원성 균류로부터 보호하는 것은 작물 수율을 향상시키는 데 아주 중요하다. 축축한 기후의 경우, 진균 감염증이 특히 문제로, 작물 보관 중, 이와 같은 감염이 식량 또는 사료 제품을 균류 독소로 훼손하고 오염시킬 수 있어서, 주요한 문제가 될 수 있다. 안타깝게도, 현대의 경작 방법 및 수확 및 보관 시스템은 식물 병원체 감염을 촉진할 수 있다.
식물 병원체의 방제는 별개의 속의 다양한 균류를 동시에 방제해야 하기 때문에 더욱 복잡하다. 예를 들어, 알터나리아(Alternaria); 아스페르길러스(Aspergillus); 아스코치타(Ascochyta); 보트리티스(Botrytis); 케르코스포라(Cercospora); 코레토트리쿰(Colletotrichum); 디플로디아(Diplodia); 에리시페(Erysiphe); 푸사리움(Fusarium); 개우마노마이세스(Gaeumanomyces); 헬민토스포리움(Helminthosporiumm); 마크로포미나(Macrophomina); 넥트리아(Nectria); 페로노스포라(Peronospora); 파코스포라(Phakopsora); 포마(Phoma); 파이마토트리춤(Phymatotrichum); 파이토프토라(Phytophthora); 플라스모파라(Plasmopara); 포도스파에라(Podosphaera); 푸치니아(Puccinia); 파이티움(Pythium); 파이레노포라(Pyrenophora); 파이리큘라리아 ( Pyricularia ); 리족토니아 ( Rhizoctonia ); 스케로티움 (Scerotium); 스케로티나 ( Sclerotinia ); 셉토리아 ( Septoria ); 티에라비옵시스 (Thielaviopsis); 운치눌라 ( Uncinula ); 벤투리아 ( Venturia ); 및 버티실리움 (Verticillium) 종과 같은 균류가 모두 확인된 식물 병원체이다. 결과적으로, 저항력 있는 작물 식물 품종들 또는, 제한된 하위부류의 균류 병원체만을 방제하는 살진균제는 다양한 병원체가 존재하는 조건 하에서 충분한 보호를 제공하는 데 실패할 수 있다. 또한, 식물 병원성 균류가 기존 살진균제 및, 형질전환 및 비-형질전환 작물 품종들에 내성이 생길 수 있고, 그럼으로써 내성이 생긴 균류를 방제하기 위해 별개의 작용기작(modes of action)을 가진 균류 방제제의 도입을 필요로 함이 예측된다.
식물 병원성 균류 활성의 억제를 위한 한 가지 접근 방법은 식물 병원성 균류에 대한 항진균성 활성을 나타내는 펩티드, 폴립펩티드, 및 단백질을 식별하여 단리하는 것이었다(Bowles, 1990; Brears et al, 1994). 상기 항진균성 펩티드, 폴립펩티드, 및 키틴 분해효소, 시스테인이 풍부한 키틴-결합 단백질, β-1,3-글루카나아제, 퍼매틴(지마틴 포함), 티오닌, 리보솜-비활성화 단백질 및 비특이적 지질 운반 단백질을 포함하는 단백질이 진균 감염증에 대한 식물의 방어에 중요한 역할을 하는 것으로 여겨진다. 형질전환 식물에서 식물 병원체를 방제하기 위해 이와 같은 단백질 생성물들의 사용이, 예를 들어, 유럽 특허 출원 0 392 225에 보고된 바 있다.
디펜신(Defensin)으로 알려진 또 다른 그룹의 펩티드가 식물 병원체를 억제하는 것으로 나타난 바 있다. 디펜신은 식물의 선천적 면역의 중요한 성분을 이루는, 45~54개 아미노산으로 이루어진 시스테인이 풍부한 소형 펩티드이다(Thomma 등, 2002; Lay and Anderson, 2005). 식물에 널리 분포된, 디펜신은 그것의 아미노산 조성에 있어서 상당히 다양하다. 그러나, 이들은 모두 4개 또는 5개의 분자내 이황화 결합에 의해 안정화된 조밀한 형태를 갖는다. 식물 디펜신은 식물 방어 체계에서 이것의 역할에 대해 광범위한 연구가 진행된 바 있다. 일부 식물 디펜신은 마이크로 몰의 농도로 광범위한 균류의 증식을 억제하고(Broekaert 등, 1995; Broekaert 등, 1997; da Silva Conceicao and Broekaert, 1999), 형질전환 식물에서 발현될 경우, 균류 병원체에 강한 저항력을 제공한다(da Silva Conceicao and Broekaert, 1999; Thomma 등, 2002; Lay and Anderson, 2005). 무 종자에서 단리된 시스테인이 풍부한 소형 단백질 2종인 Rs-AFPl 및 PvS-AFP2는 상기의 순수 단백질이 체외 항진균성 검사 배지에 첨가되었을 때, 여러 병원성 균류의 증식을 억제하였다(미국 특허 제5,538,525호). Rs-AFP2 단백질을 인코딩하는 유전자를 함유하는 형질전환 담배 식물이 형질 전환되지 않은 식물에 비해, 균류의 공격에 좀 더 저항성이 있음이 발견되었다.
항진균성 디펜신 단백질은 또한 알팔파(메디카고 사티바)에서 확인된 바 있고, 체외 실험 및 형질전환 식물 모두에서 푸사리움(Fusarium) 및 버티실리움(Verticillium)와 같은 식물 병원체를 억제하는 것으로 나타났다(미국 특허 제6,916,970호). 저염 체외 검사 조건 하에서, 상기의 알팔파 디펜신 AlfAFPl은 1 μg/ml로 푸사리움 쿨모룸 증식을 50% 억제하였고, 4 μg/ml로 버티실리움 달리아 증식을 50% 이하 억제하였다(즉, 각각 1 μg/ml 및 4 μg/ml의 IC50의 값). 형질전환 감자 식물에서의 AlfAFPl 단백질의 발현은 또한 온실 및 밭 시험 모두에서 버티실리움 달리아에 대한 저항력을 제공하는 것으로 나타났다(Gao et al, 2000). 작용기작 분석은 또한 AlfAFPl(메디카고 사티바 디펜신 1의 경우 MsDef1이라고 대안적으로 일컬어짐)가 푸사리움 그래미네아룸의 과도한 분기(hyper-branching)를 유도하고 L-유형 칼슘 통로를 차단할 수 있음을 나타내었다(Spelbrink et al, 2004).
기타 디펜신 유전자들이 또한 콩과식물 메디카고 트룬카툴라에서 확인된 바 있다(Hanks et al, 2005). 체외 실험을 통해 복제된 MtDef2 단백질에는 항진균성 활성이 전혀 없음이 입증된 바 있다(Spelbrink et al, 2004). 염기서열 데이터베이스 검색의 분석으로 잘 알려진 메디카고 디펜신 유전자와 상동성을 갖는 10개의 잠정적 공통 염기서열(다중 EST로 표현되는 10개의 독특한 디펜신-인코딩 유전자) 및 6개의 단개체(즉, 단일 EST로 표현되는 6개의 독특한 디펜신 유전자)가 확인되었다. 잠정적 공통 염기서열들 중 하나가 TC85327로 확인되었고, 거짓 처리된(mock-treated), 그리고 균근식물의 균류에 감염된 메디카고 트룬카툴라 뿌리 모두에서 발현됨이 나타났다. 본 연구에서 TC85327 메디카고 트룬카툴라 염기서열들 중 어느 것에 의해 인코딩된 단백질이 항균 활성을 보유한다는 증거는 없었다(Hanks et al, 2005).
비록 AlfAFPl(MsDef1) 및 Rs-AFP2와 같은 디펜신 단백질이 진균 감염증에 저항력을 갖는 형질전환 식물을 수득하기 위해 사용되었다고는 하나, 증가된 수준의 저항성을 지원할 수 있는 기타 단백질들이 요구된다. 특히, 균류 병원체에 대한 증가된 특이 활성을 갖는 단백질이 형질전환 식물에서 획득되는 균류 저항성 수준을 개선하는 데 특히 유용할 것이다. 그 뿐만 아니라, 별개의 작용기작을 통해 균류 병원체를 억제하는 단백질은 또한 디펜신 단백질, 예컨대 AlfAFPl(MsDef 1) 및 Rs-AFP2에 내성을 갖게 된 균류 병원체와 싸우는 데 유용할 것이다.
본 발명은 메디카고 트룬카툴라에서 유래된 신규의 소형 항진균성 단백질 및 펩티드 부류, MtDef5.1-5.6(서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64) 부류를 제공함으로써, 상기의 요구를 충족시킨다.
이에 따라, 본 발명의 다양한 측면 중에서, 본 발명은 하기를 제공한다.
1. 단리된, 정제 항진균성 단백질 또는 펩티드로, 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90%의 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열을 포함하는 단리된, 정제 항진균성 단백질 또는 펩티드.
2. 1항에 있어서, N-말단에 식물 아포플라스트, 액포 또는 소포체를 표적으로 삼는 아미노산 염기서열을 포함하는 단리된, 정제 항진균성 단백질 또는 펩티드.
3. 2항에 있어서, 상기 표적형(targeting) 염기서열이 서열번호 30 내지 35 및 42 내지 48로 표시된 아미노산 염기서열들로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90%의 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열을 포함하는 것인 단리된, 정제 항진균성 단백질 또는 펩티드.
4. 1항 내지 3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단리된, 정제 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 단리된, 정제 뉴클레오티드 염기서열.
5. 4항에 있어서, 관심대상 식물에서 발현을 위해 코돈이 최적화된 단리된, 정제 뉴클레오티드 염기서열.
6. 4항 또는 5항에 있어서, 상기 관심대상 식물이 식량 작물 식물인 것인 단리된, 정제 뉴클레오티드 염기서열.
7. 6항에 있어서, 상기 식량 작물 식물이 대두, 밀, 옥수수, 사탕수수, 쌀 및 감자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 단리된, 정제 뉴클레오티드 염기서열.
8. 형질전환 식물로, 이것의 세포들이 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90%의 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드를 함유하는 것인 형질전환 식물.
9. 8항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 N-말단에 식물 아포플라스트, 액포 또는 소포체를 표적으로 하는 아미노산 염기서열을 추가로 포함하는 것인 형질전환 식물.
10. 8항 또는 9항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 항진균성 유효량만큼 상기 세포에 존재하는 것인 형질전환 식물.
11. 8항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 뿌리 세포인 것인 형질전환 식물.
12. 8항 내지 11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 알터나리아(Alternaria sp.), 아스코치타(Ascochyta sp.), 아스페르길러스(Aspergillus sp.), 보트리티스(Botrytis sp.); 케르코스포라(Cercospora sp.), 코레토트리쿰(Colletotrichum sp.), 디플로디아(Diplodia sp.), 에리시페(Erysiphe sp.), 푸자리움(Fusarium sp.), 개우마노마이세스(Gaeumanomyces sp.), 헬민토스포리움(Helminthosporiumm, sp.), 마크로포미나(Macrophomina sp.), 넥트리아(Nectria sp.), 페로노스포라(Peronospora sp.), 파콥소라(Phakopsora sp.), 포마(Phoma sp.), 파이마토트리쿰(Phymatotrichum sp.), 파이토프토라(Phytophthora sp.), 플라스모파라(Plasmopara sp.), 푸치니아(Puccinia sp.), 포도스패라(Podosphaera sp.), 파이레노포라(Pyrenophora sp.), 파이리쿨라리아(Pyricularia sp.), 파이티움(Pythium sp.), 리족토니아(Rhizoctonia sp.), 스케로티움(Scerotium sp.), 스클레로티니아(Sclerotinia sp.), 셉토리아(Septoria sp.), 티엘라비옵시스(Thielaviopsis sp.), 운키눌라(Uncinula sp.), 벤투리아(Venturia sp.), 및 버티실리움(Verticillium sp.)으로 이루어진 군에서 선택되는 균류 종들에 의해 유발되는 상기 식물에 대한 손상을 억제하는 것인 형질전환 식물.
13. 8항 내지 12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 식물의 게놈이 추가로 하기를 포함하는 것인 형질전환 식물:
MsDefl, MtDef2, MtDef4, NaDl, Rs-AFPl, Rs-AFP2, KP4 및 KP6으로 이루어진 군에서 선택되는 식물 디펜신을 인코딩하는 DNA(상기 DNA가 발현되어 항균 유효량의 상기 디펜신을 생산함), 및/또는
바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 내독소를 인코딩하는 DNA(상기 DNA가 발현되어 방충 유효량의 상기 바실러스 투린지엔시스 내독소를 생산함), 및/또는
상기 식물에 제초 저항성을 제공하는 단백질을 인코딩하는 DNA(상기 DNA가 제초 저항성을 제공하는 상기 항제초 유효량의 단백질을 생산함).
14. 8항 내지 13항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 방법에 의해 제조되는 형질전환 식물:
a) 식물 세포의 게놈에, 발현을 위해 작동가능하게 연결되는 하기를 포함하는 재조합형, 이중가닥 DNA 분자를 삽입:
(i) 식물 세포에서 작용하여 이웃한 코딩 염기서열의 RNA로의 전사를 유발하는 프로모터 염기서열;
(ii) 선택적으로, 인트론;
(iii) 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90%의 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열, 및 N-말단에 식물 아포플라스트, 액포 또는 소포체를 표적으로 하는 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 코딩 염기서열;
(iv) 식물 세포에서 작용하여 전사 종료 및 상기 전사된 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐기 뉴클레오티드의 첨가를 유발시키는 3' 미번역된 염기서열;
b) 변형된 식물 세포를 획득; 및
c) 상기 변형된 식물 세포에서 유전적으로 변형된 식물(이것의 세포가 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 발현함)을 재생.
15. 14항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 상기 변형된 식물의 세포에서 항진균성 유효량만큼 발현되는 것인 형질전환 식물.
16. 14항 또는 15항에 있어서, 상기 코딩 염기서열이 서열번호 10 내지 15, 23 내지 29 및 65 내지 78로 표시된 뉴클레오티드 염기서열들로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드 염기서열과, 상기 코딩 염기서열이 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩할 수 있게 또는 상기 코딩 염기서열의 코돈이 최적화된 형태가 상기 식물에서 그것의 발현을 최적화하기에 충분한 염기서열 동일성을 갖는, 뉴클레오티드 염기서열을 포함하는 것인 형질전환 식물.
17. 14항 내지 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 뿌리-특이성 프로모터인 것인 형질전환 식물.
18. 17항에 있어서, 상기 뿌리-특이성 프로모터가 RB7, RD2, ROOT1, ROOT2, ROOT3, ROOT4, ROOT5, ROOT6, ROOT7 및 ROOT8로 이루어진 군에서 선택되는 것인 형질전환 식물.
19. 8항 내지 18항 중 어느 한 항에 있어서, 옥수수, 대두, 밀, 사탕수수, 쌀 및 감자로 이루어진 군에서 선택되는 형질전환 식물.
20. 8항 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서 상기 형질전환 식물의 일부.
21. 20항에 있어서, 원형질체, 세포, 조직, 기관, 절단편(cutting) 및 외식편으로 이루어진 군에서 선택되는 부분.
22. 21항에 있어서, 꽃송이, 꽃, 꽃받침, 꽃잎, 암술, 암술머리, 암술대, 씨방, 밑씨, 배아, 생식가지(receptacle), 종자, 과실, 수술, 수염, 꽃밥, 숫 배우체 또는 암 배우체, 화분립, 분열조직, 끝눈, 곁눈, 잎, 줄기, 뿌리, 덩이줄기 뿌리, 뿌리줄기, 덩이줄기, 기는 줄기(stolon), 알줄기, 알뿌리, 기는 줄기(offset), 배양액 중 상기 식물의 세포, 배양액 중 상기 식물의 조직, 배양액 중 상기 식물의 기관 및 가피로 이루어진 군에서 선택되는 부분.
23. 8항 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 식물의 자손.
24. 8항 내지 19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 식물의 종자.
25. 형질전환 식물로, 이것의 세포가 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열들로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90%의 염기서열 동일성을 갖는 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 코딩 염기서열을 포함하는 것인 형질전환 식물.
26. 25항에 있어서, 상기 뉴클레오티드코딩 염기서열이 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드의 N-말단에 있는 식물 아포플라스트, 액포 또는 소포체를 표적으로 하는 아미노산 염기서열을 추가로 인코딩하는 것인 형질전환 식물.
27. 25항 또는 26항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 상기 세포에서 항진균성 유효량만큼 발현되는 것인 형질전환 식물.
28. 25항 내지 27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 뿌리 세포인 것인 형질전환 식물.
29. 25항 내지 28항 중 어느 한 항에 있어서, 하기를 포함하는 방법에 의해 생산되는 형질전환 식물:
a) 식물 세포의 게놈에, 발현을 위해 작동가능하게 연결된 하기를 포함하는 재조합형, 이중가닥 DNA 분자를 삽입:
(i) 식물 세포에서 작동하여 이웃한 코딩 염기서열의 RNA로의 전사를 유발시키는 프로모터;
(ii) 선택적으로, 인트론;
(iii) 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 90%의 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열, 및 그것의 N-말단에 식물 아포플라스트, 액포 또는 소포체를 표적으로 하는 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 코딩 염기서열; 및
(iv) 식물 세포에서 작용하여 전사 종료 및, 상기 전사된 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐기 뉴클레오티드의 첨가를 유발시키는 3' 미번역된 영역;
b) 변형된 식물 세포를 수득; 및
c) 상기 변형된 식물 세포에서 유전적으로 변형된 식물(이것의 세포가 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 발현)을 재생.
30. 29항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 상기 식물의 세포에서 항진균성 유효량만큼 발현되는 것인 형질전환 식물.
31. 29항 또는 30항에 있어서, 상기 코딩 염기서열이 서열번호 10 내지 15, 23 내지 29 및 65 내지 78로 표시된 뉴클레오티드 염기서열들로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드 염기서열과, 상기 코딩 염기서열이 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩할 수 있게 또는 상기 코딩 염기서열의 코돈이 최적화된 형태가 상기 식물에서 그것의 발현을 최적화할 수 있게 하기에 충분한, 염기서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 염기서열을 포함하는 것인 형질전환 식물.
32. 29항 내지 31항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 뿌리-특이성 프로모터인 것인 형질전환 식물.
33. 32항에 있어서, 상기 뿌리 특이성 프로모터가 RB7, RD2, ROOT1, ROOT2, ROOT3, ROOT4, ROOT5, ROOT6, ROOT7 및 ROOT8로 이루어진 군에서 선택되는 것인 형질전환 식물.
34. 29항 내지 33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 식물의 게놈이 하기를 추가로 포함하는 것인 형질전환 식물:
MsDefl, MtDef2, MtDef4, NaDl, Rs-AFPl, Rs-AFP2, KP4 및 KP6으로 이루어진 군에서 선택되는 식물 디펜신을 인코딩하는 DNA(상기 DNA가 발현되어 상기의 항균 유효량의 디펜신을 생산함), 및/또는
바실러스 투린지엔시스 내독소를 인코딩하는 DNA(상기 DNA가 발현되어 상기 방충 유효량의 바실러스 투린지엔시스 내독소를 생산함), 및/또는
상기 식물에 제초 저항성을 제공하는 단백질을 인코딩하는 DNA(상기 DNA가 발현되어 제초 저항성을 제공하는 상기의 항제초 유효량의 단백질을 생산함).
35. 29항 내지 34항 중 어느 한 항에 있어서, 옥수수, 대두, 밀, 사탕수수, 쌀 및 감자로 이루어진 군에서 선택되는 형질전환 식물.
36. 알터나리아, 아스코치타, 아스페르길러스, 보트리티스; 케르코스포라, 코레토트리쿰, 디플로디아, 에리시페, 푸자리움, 개우마노마이세스, 헬민토스포리움, 마크로포미나, 넥트리아, 페로노스포라, 파콥소라, 포마, 파이마토트리쿰, 파이토프토라, 플라스모파라, 푸치니아, 포도스패라, 파이레노포라, 파이리쿨라리아, 파이티움, 리족토니아, 스케로티움, 스클레로티니아, 셉토리아, 티엘라비옵시스, 운키눌라, 벤투리아 및 버티실리움으로 이루어진 군에서 선택되는 균류의 종에서 정상적으로 감염되기 쉬운 식물로, 상기 식물의 세포가 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90%의 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 코딩 염기서열을 함유하는 것인 식물.
37. 36항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 N-말단에 식물 아포플라스트, 액포 또는 소포체를 표적으로 하는 아미노산 염기서열을 추가로 포함하는 것인 식물.
38. 36항 또는 37항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 상기 세포에 항진균성 유효량만큼 존재하는 것인 식물.
39. 36항 내지 38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 뿌리 세포인 것인 식물.
40. 36항 내지 39항 중 어느 한 항에 있어서, 옥수수, 대두, 밀, 사탕수수, 쌀 및 감자로 이루어진 군에서 선택되는 식물.
41. 알터나리아, 아스코치타, 아스페르길러스, 보트리티스; 케르코스포라, 코레토트리쿰, 디플로디아, 에리시페, 푸자리움, 개우마노마이세스, 헬민토스포리움, 마크로포미나, 넥트리아, 페로노스포라, 파콥소라, 포마, 파이마토트리쿰, 파이토프토라, 플라스모파라, 푸치니아, 포도스패라, 파이레노포라, 파이리쿨라리아, 파이티움, 리족토니아, 스케로티움, 스클레로티니아, 셉토리아, 티엘라비옵시스, 운키눌라, 벤투리아 및 버티실리움으로 이루어진 군에서 선택되는 균류 종으로부터 감염되기 쉬운 식물에의 손상을 예방, 치료, 방제, 퇴치, 감소 또는 억제하기 위한 방법으로, 상기 방법은 상기 감염되기 쉬운 식물의 유전자좌에, 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90%의 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드 및 이들의 조합의 항진균성 유효량를 제공하는 단계를 포함하는 방법.
42. 41항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 상기 감염되기 쉬운(susceptible) 식물의 세포들 내에서 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 DNA를 발현시킴으로써, 상기 감염되기 쉬운 식물 유전자좌에 제공되는 것인 방법.
43. 42항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 상기 DNA가 서열번호 10~15, 23~29 및 65~78에 나타나는 뉴클레오티드 염기서열들로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드 염기서열과, 상기 코딩 염기서열이 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하도록 하기에 또는 상기 코딩 염기서열의 코돈이 최적화된 형태가 상기 식물에서 그것의 발현을 최적화하게 하기에 충분한 염기서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 염기서열을 포함하는 것인 방법.
44. 43항에 있어서, 상기 DNA가 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드의 N-말단에 식물 아포플라스트, 액포 또는 소포체를 표적으로 하는 아미노산 염기서열을 인코딩하는 하나의 뉴클레오티드 염기서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
45. 41항 내지 44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 뿌리 세포인 것인 방법.
46. 41항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 생산하는 식물에 대량서식하는 미생물들에 의해, 상기 감염되기 쉬운 식물에 제공되는 것인 방법.
47. 41항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 생산하는 식물에 대량서식하는 미생물들을 포함하는 조성물을 적용시킴으로써, 또는 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드 그 자체를 그것에 적용시킴으로써, 상기 감염되기 쉬운 식물 유전자좌에 제공되는 것인 방법.
48. 47항에 있어서, 상기 조성물이 농업적으로 허용가능한 희석제, 부형제 또는 운반체를 포함하는 것인 방법.
49. 41항 내지 48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감염되기 쉬운 식물이 옥수수, 대두, 밀, 사탕수수, 쌀 및 감자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
50. 알터나리아, 아스코치타, 아스페르길러스, 보트리티스; 케르코스포라, 코레토트리쿰, 디플로디아, 에리시페, 푸자리움, 개우마노마이세스, 헬민토스포리움, 마크로포미나, 넥트리아, 페로노스포라, 파콥소라, 포마, 파이마토트리쿰, 파이토프토라, 플라스모파라, 푸치니아, 포도스패라, 파이레노포라, 파이리쿨라리아, 파이티움, 리족토니아, 스케로티움, 스클레로티니아, 셉토리아, 티엘라비옵시스, 운키눌라, 벤투리아 및 버티실리움으로 이루어진 군에서 선택되는 균류의 종으로부터 감염되기 쉬운 식물에 대한 손상을 예방, 치료, 방제, 퇴치, 감소 또는 억제하기 위한 방법으로, 상기 감염되기 쉬운 식물의 세포들에서, 서열번호 l, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64에 표시된 아미노산 염기서열들로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90%의 염기서열 동일성을 갖는 아미노산 염기서열을 포함하는 단백질 또는 펩티드, 및 이들의 조합을 인코딩하는 뉴클레오티드 염기서열을 포함하는 DNA를, 상기 균류 손상을 억제하기에 충분한 수준으로 발현시키는 단계를 포함하는 방법.
51. 50항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 상기 감염되기 쉬운 식물의 세포들의 아포플라스트, 액포 또는 소포체에 적중되는 것(be targeted to) 방법.
52. 50항 또는 51항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 서열번호 10 내지 15, 23 내지 29 및 65 내지 78로 표시된 뉴클레오티드 염기서열들로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드 염기서열과, 상기 뉴클레오티드 염기서열이 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩할 수 있게 하기에 또는 또는 상기 뉴클레오티드 염기서열의 코돈이 최적화된 형태가 상기 식물에서 그것의 발현을 최적화할 수 있게 하기에 충분한, 염기서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 염기서열에 의해 인코딩되는 것인 방법.
53. 50항 내지 52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포가 뿌리 세포인 것인 방법.
54. 50항 내지 53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감염되기 쉬운 식물이 옥수수, 대두, 밀, 사탕수수, 쌀 및 감자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
55. 알터나리아, 아스코치타, 아스페르길러스, 보트리티스; 케르코스포라, 코레토트리쿰, 디플로디아, 에리시페, 푸자리움, 개우마노마이세스, 헬민토스포리움, 마크로포미나, 넥트리아, 페로노스포라, 파콥소라, 포마, 파이마토트리쿰, 파이토프토라, 플라스모파라, 푸치니아, 포도스패라, 파이레노포라, 파이리쿨라리아, 파이티움, 리족토니아, 스케로티움, 스클레로티니아, 셉토리아, 티엘라비옵시스, 운키눌라, 벤투리아 및 버티실리움으로 이루어진 군에서 선택되는 균류 종으로부터 감염되기 쉬운 식물의 손상을 억제하는 방법으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 식물 세포의 게놈에, 발현을 위해 작동가능하게 연결된 하기를 포함하는 재조합형, 이중가닥 DNA 분자를 삽입:
(i) 식물 세포에서 작용하여 이웃한 코딩 염기서열의 RNA로의 전사를 유발시키는 프로모터;
(ii) 선택적으로, 인트론;
(iii) 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90% 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 염기서열을 포함하는 코딩 염기서열; 및
(iv)상기 식물 세포에서 작용하여 전사 종료 및 상기 전사된 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐기 뉴클레오티드의 첨가를 유발시키는 3' 미번역된 영역;
b) 변형된 식물 세포 수득; 및
c) 상기 변형된 식물 세포에서 유전적으로 변형된 식물(이들의 세포가 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 발현함)을 재생.
56. 55항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 상기 변형된 식물의 세포에서 항진균성 유효량만큼 발현되는 것인 방법.
57. 55항 또는 56항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 상기 변형된 식물의 세포의 아포플라스트, 액포 또는 소포체에 적중되는 것인 방법.
58. 55항 내지 57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 염기서열이 서열번호 10~15, 23~29, 및 65~78에 표시된 뉴클레오티드 염기서열들로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드 염기서열과, 상기 뉴클레오티드 염기서열이 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩할 수 있게 하기에 또는 상기 뉴클레오티드 염기서열의 코돈이 최적화된 형태가 상기 식물에서 이것의 발현을 최대화할 수 있게 하기에 충분한, 염기서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 염기서열인 것인 방법.
59. 55항 내지 58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 뿌리-특이성 프로모터인 것인 방법.
60. 59항에 있어서, 상기 뿌리 특이성 프로모터가 RB7, RD2, ROOT1, ROOT2, ROOT3, ROOT4, ROOT5, ROOT6, ROOT7 및 ROOT8로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
61. 55항 내지 60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 감염되기 쉬운 식물이 옥수수, 대두, 밀, 사탕수수, 쌀 및 감자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
62. 알터나리아, 아스코치타, 아스페르길러스, 보트리티스; 케르코스포라, 코레토트리쿰, 디플로디아, 에리시페, 푸자리움, 개우마노마이세스, 헬민토스포리움, 마크로포미나, 넥트리아, 페로노스포라, 파콥소라, 포마, 파이마토트리쿰, 파이토프토라, 플라스모파라, 푸치니아, 포도스패라, 파이레노포라, 파이리쿨라리아, 파이티움, 리족토니아, 스케로티움, 스클레로티니아, 셉토리아, 티엘라비옵시스, 운키눌라, 벤투리아 및 버티실리움으로 이루어진 군에서 선택되는 균류 종을 방제, 퇴치 또는 억제하는 방법으로, 상기 방법이 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90%의 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드 및 이들의 조합의 항진균성 유효량을 포함하는 조성물과 상기 균류 종들을 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
63. 62항에 있어서, 상기 조성물이 항진균성 단백질 또는 펩티드, 및 농업적으로 허용가능한 운반체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 것인 방법.
64. 62항에 있어서, 상기 조성물이 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 발현시키는 미생물들을 포함하는 것인 방법.
65. 균류에 의한 식물의 손상을 예방, 치료, 방제, 퇴치, 감소 또는 억제하기 위한 방법으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
a) 식물 세포의 게놈에, 발현을 위해 작동가능하게 연결된 하기를 포함하는 재조합형, 이중가닥 DNA 분자를 삽입:
(i) 식물 세포에서 작용하여 이웃한 코딩 염기서열의 RNA로의 전사를 유발시키는 프로모터;
(ii) 선택적으로, 인트론;
(iii) 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90%의 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 염기서열을 포함하는 코딩 염기서열; 및
(iv) 식물 세포에서 작용하여 전사 종료 및, 상기 전사된 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐기 뉴클레오티드의 첨가를 유발시키는 3' 미번역된 영역;
b) 변형된 식물 세포 수득; 및
c) 상기 변형된 식물 세포에서 유전적으로 변형된 식물(이것의 세포가 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 발현시킴) 재생.
66. 65항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 상기 변형된 식물의 세포에서 항진균성 유효량만큼 발현되는 것인 방법.
67. 65항 또는 66항에 있어서, 상기 코딩 염기서열이 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드의 N-말단에 식물 아포플라스트, 액포 또는 소포체를 표적으로 하는 아미노산 염기서열을 인코딩하는 뉴클레오티드 염기서열을 추가로 포함하는 것인 방법.
68. 65항 내지 67항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 상기 뉴클레오티드 염기서열이 서열번호 10 내지 15, 23 내지 29 및 65 내지 78로 표시된 뉴클레오티드 염기서열들로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 뉴클레오티드 염기서열과, 상기 코딩 염기서열이 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩할 수 있게 하기에 또는 상기 코딩 염기서열의 코돈이 최적화된 형태가 상기 식물에서 그것의 발현을 최적화할 수 있도록 하기에 충분한, 염기서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 염기서열을 포함하는 것인 방법.
69. 65항 내지 68항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 프로모터가 뿌리 특이성 프로모터인 것인 방법.
70. 69항에 있어서, 상기 뿌리 특이성 프로모터가 RB7, RD2, ROOT1, ROOT2, ROOT3, ROOT4, ROOT5, ROOT6, ROOT7 및 ROOT8로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
71. 65항 내지 70항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균류가 알터나리아, 아스코치타, 아스페르길러스, 보트리티스; 케르코스포라, 코레토트리쿰, 디플로디아, 에리시페, 푸자리움, 개우마노마이세스, 헬민토스포리움, 마크로포미나, 넥트리아, 페로노스포라, 파콥소라, 포마, 파이마토트리쿰, 파이토프토라, 플라스모파라, 푸치니아, 포도스패라, 파이레노포라, 파이리쿨라리아, 파이티움, 리족토니아, 스케로티움, 스클레로티니아, 셉토리아, 티엘라비옵시스, 운키눌라, 벤투리아 및 버티실리움으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
72. 65항 내지 71항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물이 옥수수, 대두, 밀, 사탕수수, 쌀 및 감자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
73. 균류에 의해 유발되는 식물의 손상을 예방, 치료, 방제, 퇴치, 감소 또는 억제하기 위한 방법으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90% 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열, 및 변형된 식물을 생산하는 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드의 N-말단에 있는 식물 아포플라스트, 액포 또는 소포체를 표적으로 하는 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 DNA 분자로 식물을 변형시키되,
상기 변형된 식물의 세포가 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 생산하고, 및
상기 변형된 식물이, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 생산하지 않으며 미변형된 것을 제외하고 모든 것이 동일한 대조군 식물의 균류 손상과 비교하여, 두 식물이 유사한 양의 상기 균류에 접촉되어 동일한 조건에서 재배되었을 때, 상기의 균류 손상의 감소를 나타낸다.
74. 73항에 있어서, 상기 세포가 뿌리 세포인 것인 방법.
75. 73항 또는 74항에 있어서, 상기 균류가 알터나리아, 아스코치타, 아스페르길러스, 보트리티스; 케르코스포라, 코레토트리쿰, 디플로디아, 에리시페, 푸자리움, 개우마노마이세스, 헬민토스포리움, 마크로포미나, 넥트리아, 페로노스포라, 파콥소라, 포마, 파이마토트리쿰, 파이토프토라, 플라스모파라, 푸치니아, 포도스패라, 파이레노포라, 파이리쿨라리아, 파이티움, 리족토니아, 스케로티움, 스클레로티니아, 셉토리아, 티엘라비옵시스, 운키눌라, 벤투리아 및 버티실리움으로 이루어진 군에서 선택되는 종인 것인 방법.
76. 73항 내지 75항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 식물이 옥수수, 대두, 밀, 사탕수수, 쌀 및 감자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
77. 토양의 균류 오염을 감소 또는 억제하기 위한 방법으로, 상기 방법은 하기를 포함한다:
상기 토양에서, 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90% 염기서열 동일성을 갖는 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드를, 상기 형질전환 식물의 뿌리의 세포에서 발현시키는 형질전환 식물들을 재배하는 것이 포함되는 방법.
78. 77항에 있어서, 상기 뿌리 세포가 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 항진균성 유효량만큼 생산하는 것인 방법.
79. 77항 또는 78항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 상기 뿌리 세포의 아포플라스트, 액포 또는 소포체에 적중되는 것인 방법.
80. 77항 내지 79항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 균류가 알터나리아, 아스코치타, 아스페르길러스, 보트리티스; 케르코스포라, 코레토트리쿰, 디플로디아, 에리시페, 푸자리움, 개우마노마이세스, 헬민토스포리움, 마크로포미나, 넥트리아, 페로노스포라, 파콥소라, 포마, 파이마토트리쿰, 파이토프토라, 플라스모파라, 푸치니아, 포도스패라, 파이레노포라, 파이리쿨라리아, 파이티움, 리족토니아, 스케로티움, 스클레로티니아, 셉토리아, 티엘라비옵시스, 운키눌라, 벤투리아 및 버티실리움으로 이루어진 군에서 선택되는 종인 것인 방법.
81. 77항 내지 80항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 식물이 형질전환 식량 작물 식물인 것인 방법.
82. 81항에 있어서, 상기 형질전환 식량 작물 식물이 옥수수, 대두, 밀, 사탕수수, 쌀 및 감자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
83. 발현을 위해 작동가능하게 연결된 하기를 포함하는 재조합형, 이중가닥 DNA 분자:
a) 식물 세포에서 작용하여 이웃한 코딩 염기서열의 RNA로의 전사를 유발시키는 프로모터;
b) 선택적으로, 인트론;
c) 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90% 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열, 및 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드의 N-말단에 있는 식물 아포플라스트, 액포 또는 소포체를 표적으로 하는 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 염기서열; 및
d) 식물 세포에서 작용하여 전사 종료 및, 상기 전사된 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐기 뉴클레오티드의 첨가를 유발시키는 3' 미번역된 염기서열.
84. 83항에 있어서, 상기 프로모터가 뿌리 특이성 프로모터인 것인 재조합형, 이중가닥 DNA 분자.
85. 84항에 있어서, 상기 뿌리 특이성 프로모터가 RB7, RD2, ROOT1, ROOT2, ROOT3, ROOT4, ROOT5, ROOT6, ROOT7 및 ROOT8로 이루어진 군에서 선택되는 것인 재조합형, 이중가닥 DNA 분자.
86. 83항 내지 85항 중 어느 한 항에 있어서, 관심대상 식물에서 발현을 위해 코돈이 최적화된 재조합형, 이중가닥 DNA 분자.
87. 86항에 있어서, 상기 관심대상 식물이 옥수수, 대두, 밀, 사탕수수, 쌀 및 감자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 재조합형, 이중가닥 DNA 분자.
88. 발현을 위해 작동가능하게 연결된 하기를 포함하는 재조합형, 이중가닥 DNA 분자를 포함하는 발현 작제물:
a) 식물 세포에서 작용하여 이웃한 코딩 염기서열의 RNA로의 전사를 유발시키는 프로모터;
b) 선택적으로, 인트론;
c) 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90% 염기서열 동일성을 갖는 아미노산 염기서열, 및 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드의 N-말단에 있는 식물 아포플라스트, 액포 또는 소포체를 표적으로 하는 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 염기서열; 및
d) 식물 세포에서 작용하여 전사 종료 및, 상기 전사된 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐기 뉴클레오티드의 첨가를 유발시키는 3' 미번역된 염기서열.
89. 88항에 있어서, 상기 프로모터가 뿌리 특이성 프로모터인 것인 발현 작제물.
90. 89항에 있어서, 상기 뿌리 특이성 프로모터가 RB7, RD2, ROOT1, ROOT2, ROOT3, ROOT4, ROOT5, ROOT6, ROOT7 및 ROOT8로 이루어진 군에서 선택되는 것인 발현 작제물.
91. 89항 내지 90항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 재조합형, 이중가닥 DNA 분자가 관심대상 식물에서의 발현을 위해 코돈이 최적화된 것인 발현 작제물.
92. 91항에 있어서, 상기 관심대상 식물이 옥수수, 대두, 밀, 사탕수수, 쌀 및 감자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 발현 작제물.
93. 83항 내지 87항 중 어느 한 항의 상기 재조합형, 이중가닥 DNA 분자, 또는 88항 내지 92항 중 어느 한 항의 발현 작제물, 및 변형된 식물 세포의 선택을 위한 선택가능 또는 채점가능 표지를 포함하는 식물 변형 벡터.
94. 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90% 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드 및 이들의 모든 조합을 포함하는 진균성 조성물.
95. 94항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드, 또는 이들의 조합이 항진균성 유효량만큼 존재하는 것인 항진균성 조성물.
96. 94항 또는 95항에 있어서, 농업적으로 또는 약학적으로 허용가능한 운반체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 항진균성 조성물.
97. 94항 내지 96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드, 또는 이들의 조합이 1 밀리리터당 약 0.1 마이크로그램 내지 1 밀리리터당 약 500 밀리그램의 범위로 존재하는 것인 항진균성 조성물.
98. 94항 내지 96항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드, 또는 이들의 조합이 1 밀리리터당 약 5 마이크로그램 내지 1 밀리리터당 약 250 밀리그램의 범위의 농도로 존재하는 것인 항진균성 조성물.
99. 94항 내지 98항 중 어느 한 항에 있어서, pH가 약 3 내지 약 9의 범위에 있는 항진균성 조성물.
100. 94항 내지 99항 중 어느 한 항에 있어서, 비활성 물질, 계면활성제 및 용매로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 첨가제와 함께 제형화되는 항진균성 조성물.
101. 94항 내지 100항 중 어느 한 항 있어서, 살충성 활성 성분, 비료, 살충제, 유인제, 살균제제, 살진드기제, 살선충제, 제초제 및 증식 조절제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 또는 그 이상의 활성 제제들의 혼합물에 제형화되는 항진균성 조성물.
102. 101항에 있어서, 상기 살충성 활성 성분이 균류 항생제 및 화학 살진균제로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항진균성 조성물.
103. 102항에 있어서, 상기 균류 항생제 또는 화학 살진균제가 폴리옥신, 닉코마이신, 카복시아미드, 방향족 탄화수소, 카복신, 모르폴린, 스테롤 생합성 억제제 및 유기인산 화합물으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 항진균성 조성물.
104. 민감한 균류 종의 증식을 억제하기 위한, 94항 내지 103항 중 어느 한 항의 항진균성 조성물의 사용.
105. 104항에 있어서, 상기 민감한 균류 종이 알터나리아, 아스코치타, 아스페르길러스, 보트리티스; 케르코스포라, 코레토트리쿰, 디플로디아, 에리시페, 푸자리움, 개우마노마이세스, 헬민토스포리움, 마크로포미나, 넥트리아, 페로노스포라, 파콥소라, 포마, 파이마토트리쿰, 파이토프토라, 플라스모파라, 푸치니아, 포도스패라, 파이레노포라, 파이리쿨라리아, 파이티움, 리족토니아, 스케로티움, 스클레로티니아, 셉토리아, 티엘라비옵시스, 운키눌라, 벤투리아 및 버티실리움으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 사용.
106. 민감한 균류 중의 증식을 억제하는 데 사용하기 위한, 94항 내지 103항 중 어느 한 항의 항진균성 조성물.
107. 106항에 있어서, 상기 민감한 균류 종이 알터나리아, 아스코치타, 아스페르길러스, 보트리티스; 케르코스포라, 코레토트리쿰, 디플로디아, 에리시페, 푸자리움, 개우마노마이세스, 헬민토스포리움, 마크로포미나, 넥트리아, 페로노스포라, 파콥소라, 포마, 파이마토트리쿰, 파이토프토라, 플라스모파라, 푸치니아, 포도스패라, 파이레노포라, 파이리쿨라리아, 파이티움, 리족토니아, 스케로티움, 스클레로티니아, 셉토리아, 티엘라비옵시스, 운키눌라, 벤투리아 및 버티실리움으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 사용.
108. 94항 내지 103항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단백질, 펩티드, 또는 이들의 조합을 생산하는 식물에 대량서식하는 미생물들에 의해, 또는 상기 식물에 대량서식하는 미생물들을 포함하는 조성물에 의해, 식물 유전자좌에 제공되는 항진균성 조성물.
109. 94항 또는 95항에 있어서, 상기 단백질, 펩티드 또는 이들의 조합이 형질전환 식물의 세포 내에서, 상기 단백질, 펩티드, 또는 이들의 조합을 인코딩하는 DNA로부터 발현되는 것인 항진균성 조성물.
110. 민감한 균류를 방제, 퇴치 또는 억제하는 방법으로, 상기 방법이 상기 민감한 균류를 형질전환 식물(이것의 세포가 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90% 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열 및, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드의 N-말단에 있는 식물 아포플라스트, 액포, 또는 소포체를 표적으로 하는 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 염기서열을 포함하고 발현시킴)과 접촉시키는 단계를 포함하는 것인 방법.
111. 110항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 상기 형질전환 식물의 뿌리의 세포에서 발현되는 것인 방법.
112. 111항에 있어서, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 상기 뿌리 세포에 의해, 항진균성 유효량만큼 발현되는 것인 방법.
113. 110항 내지 112항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 민감한 균류가 알터나리아, 아스코치타, 아스페르길러스, 보트리티스; 케르코스포라, 코레토트리쿰, 디플로디아, 에리시페, 푸자리움, 개우마노마이세스, 헬민토스포리움, 마크로포미나, 넥트리아, 페로노스포라, 파콥소라, 포마, 파이마토트리쿰, 파이토프토라, 플라스모파라, 푸치니아, 포도스패라, 파이레노포라, 파이리쿨라리아, 파이티움, 리족토니아, 스케로티움, 스클레로티니아, 셉토리아, 티엘라비옵시스, 운키눌라, 벤투리아 및 버티실리움으로 이루어진 군에서 선택되는 종인 것인 방법.
114. 110항 내지 113항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환 식물이 옥수수, 대두, 밀, 사탕수수, 쌀 및 감자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
115. 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90% 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열을 포함하고, 인간 치료에 사용하기 위한 항진균성 단백질 또는 펩티드.
116. 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90% 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열을 포함하고, 민감한 진균 감염증을 치료하는 데 사용하기 위한, 항진균성 단백질 또는 펩티드.
117. 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90%의 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드의, 인간 치료에서의 사용.
118. 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90%의 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드의, 민감한 진균 감염증의 치료에서의 사용.
119. 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90%의 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드의, 민감한 진균 감염증 치료용 약물 제조를 위한 사용.
120. 치료를 필요로 하는 환자에게서 민감한 진균 감염증을 치료하기 위한 방법으로, 상기 방법이 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64로 표시된 아미노산 염기서열로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 아미노산 염기서열과 최소한 90%의 염기서열 동일성을 갖는 하나의 아미노산 염기서열을 포함하는 항진균성 단백질 또는 펩티드 및 이들의 조합을 항진균성 유효량만큼 상기 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 방법.
121. 120항에 있어서, 상기 투여가 국소적으로 수행되는 것인 방법.
본 발명의 적용성의 추가 범위가 하기 제시된 상세한 설명 및 도면(들)로부터 명백해질 것이다. 그러나 하기의 상세한 설명 및 구체적 실시예들은, 본 발명의 바람직한 구현예를 명시하는 한편, 본 발명의 원칙 및 범위 내에서의 다양한 변경 및 수정이 이와 같은 상세한 설명을 통해 당해 기술의 숙련가들에게 명백해질 것이기 때문에, 단지 실례로서 주어진 것임이 이해되어야 한다.
본 발명의 그 밖의 측면, 특징 및 이점은 첨부된 도면과 함께 취한 하기의 상세한 설명으로부터 보다 잘 이해될 것이고, 이들은 모두 단지 실례로서만 제시된 것으로 본 발명을 제한하지 않는다.
도 1은 MtDef5-발현 대두 계통을 만들기 위해 사용된 변형 벡터 AKK/FMV/Def5를 나타낸다. "LB" = T-DNA 왼쪽 경계; "T-DNA RB" =T-DNA 오른쪽 경계; "tNOS" = 노팔린 합성효소 종결자 염기서열; "FMV" = 피그워트(Figwort) 모자이크 바이러스 35S; "SU 인트론" = 수퍼 유비퀴틴 인트론; "BAR" = 비알로포스(Bialophos) 저항성 유전자; "NOS" = 노팔린 합성효소 프로모터; "Ori" =복제 시발점; "TraF" =전이 F; "Tet(R)" = 테트라사이클린 저항성 유전자; "Kan(R) " = 카나마이신 저항성 유전자; "TrfA" =T-DNA 복제 인자 및 "Def5"는 MtDef5 단백질 또는 펩티드 코딩 염기서열을 나타낸다.
도 2는 MtDef5-발현 밀 계통를 만들기 위해 사용된 변형 벡터 pZP212-Def5를 보여준다. "LB" = T-DNA 왼쪽 경계; "T-DNA RB" =T-DNA 오른쪽 경계; nptII= 네오마이신 인산전이효소 II; 35S= CaMV35S 프로모터; Ubi 및 Ubi 인트론= 옥수수 Ubi1 프로모터 및 인트론; TEV=담배 식각 바이러스 리더; Def5= MtDef5 단백질 또는 펩티드코딩 염기서열; ter= CaMV 35S 종결 신호.
도 3은 MtDef5.la의 화학적 합성 GMA-5C 펩티드 GACHRQGFGFACFCYKKC(서열번호 58)로 푸사리움 그라미네아룸 PH-1 분생자를 배양한 지 24시간 후, 상기 펩티드의 체외 항진균성 활성의 정량적 평가를 보여준다. 값들은 세 가지 복제의 중간값이다. 오차 막대는 표준 편차를 표시한다. 상기 펩티드의 상기 체외 항진균성 활성이 앞서 기술된 바와 같이 측정되었다(Ramamoorthy 등 (2007) Cellular Microbiology 9: 1491-1506).
본 발명의 하기 상세 설명은 당해 기술의 숙련가들이 본 발명을 실행하는 데 도움을 주기 위해 제공된다. 그렇지만, 당해 기술의 숙련가들에 의해 본 발명의 원칙 또는 범위를 벗어나지 않으면서, 본원에서 논의된 구현예에 수정 및 변경을 가할 수 있어서, 하기 상세 설명은 본 발명을 지나치게 제한하는 것으로 여겨져서는 안 된다.
본 명세서에서 논의된 참조문헌들 (그곳에서 언급된 참조문헌들 포함) 각각의 내용들은 그 전체가 참조로 본원에 편입되었다.
본원에 기술된 모든 특징 또는 특징들의 조합은, 이와 같은 조합에 포함된 특징들이 맥락, 본 명세서, 당해 기술의 숙련가들의 지식에서 명백해지는 것과 같이, 상호간에 서로 배치되지 않는다면, 본 개시의 범위에 포함된다. 본원의 개시의 추가적인 이점 및 측면들이 하기 상세 설명 및 청구항에 명백하게 보여진다.
상기 MtDef5 단백질 및 펩티드의 아미노산 및 뉴클레오티드 염기서열은, 본 발명의 작제물, 방법 및 유기체에 사용될 수 있는 기타 요소들의 그것과 마찬가지로, 본 명세서 말미에서 찾아볼 수 있다. 본 발명에서 다루는 모든 아미노산 및 뉴클레오티드 염기서열에는 본원에 구체적으로 개시된 것들로 이루어진, 반드시 이것으로 이루어진 또는 이들을 포함하는 염기서열들이 포함된다. 당해 기술의 숙련가에 의해 이해되는 바와 같이, 상기 유전자 코드의 축중(degeneracy)의 결과로서, 본원에 개시된 단백질 및 펩티드 분자들를 인코딩하는 여러 뉴클레오티드 염기서열들이 존재한다. 이와 같은 폴리뉴클레오티드들 중 일부는 모든 본래의 코딩 염기서열의 뉴클레오티드 염기서열과 최소한의 상동성을 가질 수 있다.
또한, 코돈 사용의 차이 때문에 다양해지는 폴리뉴클레오티드들이 본 발명에 의해 구체적으로 고안되고, 여기에는 외떡잎식물, 쌍떡잎식물, 효모 또는 박테리아에서 발현하기에 최적화된 것들이 포함된다. Nakamura 등 (2000) Nucl. Acids Res. 28(1):292는 다양한 유기체에서 폴리뉴클레오티드의 발현을 증진하기 위한 바람직한 코돈의 편입을 논의한다. 다양한 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물 유전자에서의 코돈 사용법이 Kawabe and Miyashita (2003) "Patterns of codon usage bias in three dicot and four monocot plant species", Genes Gente. yst. 78:343-352, 및 Murray 등 (1989) "Codon Usage in Plant Genes" NAR 17:477-498에 개시된 바 있다. 식물에서 코돈 사용을 최적화하는 방법들이 또한 미국 특허 Nos. 5,500,365; 5,689,052; 5,500,365; 및 5,689,052에 개시되었다.
MtDef5 단백질- 및 펩티드-인코딩 뉴클레오티드 염기서열, 및 이들의 발현을 추진하기 위해 사용되는 프로모터 뉴클레오티드 염기서열들은 게놈 또는 비게놈 뉴클레오티드 염기서열일 수 있다. MtDef5 단백질 및 펩티드를 인코딩하는 게놈/비게놈 뉴클레오티드 염기서열, 그리고 프로모터는, 예를 들어, 자연발생적 mRNA, 합성생산된 mRNA, MtDef5 단백질 및 펩티드를 인코딩하는 자연발생적 뉴클레오티드 염기서열 및 프로모터, 또는 MtDef5 단백질 및 펩티드를 인코딩하는 합성 생산된 뉴클레오티드 염기서열 및 프로모터를 포함한다. 합성 뉴클레오티드 염기서열은 당해 기술에 잘 알려진 수단, 예컨대 올리고뉴클레오티드의 화학적 또는 효소적 합성에 의해 생산될 수 있고, 상기 염기서열에는 예를 들어, cDNA, 상이한 형질전환 식물들(이와 같은 식물들에서 코돈 사용의 패턴을 반영함)에서의 효율적인 발현을 위해 코돈이 최적화된 염기서열, 그들의 정상적인 활성에 나쁜 영향을 미치지 않는 보완적(또는 비-보완적) 아미노산 치환을 함유하는 변형체, PCR-증폭 뉴클레오티드 염기서열 등이 포함된다.
정의
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용되는 모든 기술 및 과학적 용어는 본 발명과 관련된 당해 기술의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본원에 기술된 것과 유사하거나 또는 동일한 모든 방법 및 재료는 본원에 기술된 방법 및 재료 대신에 본 발명의 실행 또는 실험에 사용될 수 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위해, 하기의 용어들이 다음과 같이 정의된다.
본원에 개시된 방법 및 조성물들이 적용될 수 있는, 용어 "식량 작물 식물"은 직접 먹을 수 있거나, 또는 먹을 수 있는 생성물을 생산할 수 있고, 직접 또는 간접적으로 동물을 통해 인간이 먹는 식품으로 통상적으로 사용되는 식물을 가리킨다. 이와 같은 식물의 비제한적인 예에는 하기가 포함된다:
1. 곡물: 밀, 쌀, 옥수수(콘), 보리, 오트, 수수, 호밀 및 수수;
2. 단백질 작물: 땅콩, 병아리, 렌틸콩, 강낭콩, 대두, 리마 콩;
3. 뿌리 및 덩이줄기: 감자, 고구마 및 카사바;
4. 식물성 기름 작물: 옥수수, 대두, 유채, 밀, 땅콩, 팜, 코코넛, 홍꽃, 면종자, 해바라기, 아마, 올리브 및 홍꽃;
5. 설탕 작물: 사탕수수 및 사탕무;
6. 과일 작물: 바나나, 오렌지, 사과, 배, 빵나무열매, 파인애플 및 체리;
7. 야채 작물 및 덩이줄기: 토마토, 상추, 당근, 멜론, 아스파라거스 등
8. 너츠: 캣슈, 땅콩, 호두, 피스타치오, 알몬드;
9. 목초 및 잔디풀;
10. 목초 콩과식물s: 알팔파, 클로버;
11. 약물 작물: 커피, 코코아, 콜라 너트, 양귀비;
12. 향신 및 풍미 작물: 바닐라, 세이지, 타임, 아니스, 샤프론, 멘톨, 페페민트, 스페아민트, 고수.
본 발명의 방법 및 조성물이 적용될 수 있는, 용어 "생물연료 작물" 또는 "에너지 작물"에는 앞서 항목 4에 열거된 식물성 기름 작물이 포함되고, 추가로 사탕수수, 피마자, 양구슬냉이, 수수속 풀, 억새 및 자트로파(Jatropha)와 같은 식물들이 포함된다.
단수를 지칭하는 용어에는, 맥락에 달리 명확히 명시되지 않는 한, 복수 지시어가 포함된다. 이와 유사하게, 단어 "또는"은 맥락에 달리 명확히 명시되지 않는 한, "그리고(및)"을 포함하는 것이다. 따라서, 'A 또는 B를 포함하는'이란 A를 포함하고, 또는 B를 포함하거나, 또는 A 및 B를 포함하는 것을 의미한다.
"약"이란 기준 양, 수치, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 차원, 크기, 양, 중량, 길이 등과 비교하여 무려 ± 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 달라지는 양, 수치, 값, 숫자, 빈도, 백분율, 차원, 크기, 양, 중량, 길이 등을 의미한다.
동일한 성분 또는 특성과 관련된 본원에 개시된 모든 범위의 종점들은 포괄적이고 독립적으로 조합가능하다(예컨대, "최대 약 25 wt%, 또는 좀 더 구체적으로, 약 5 wt% 내지 약 20 wt%"의 범위에는 "약 5 wt% 내지 약 25 wt%"의 범위의 종점 및 모든 중간값들이 포함된다).
본원의 청구항에 사용되는 용어 "포함하는(comprise)"은 달리 제약이 없고, 상기 청구항은 거기서 구체적으로 언급된 모든 특성들을 반드시 구비함을 의미하지만, 또한 존재하는 것으로 언급되지 않은 추가적 특성들에 대한 제한이 없음을 의미한다. 용어 "포함하는"은 명시되지 않은 성분들을 심지어 주요한 양만큼 포함하기 위해 청구항을 열린 상태(open)로 둔다. 청구항에서 용어 "근본적으로 ~로 구성된"은 본 발명이 반드시 열거된 성분들을 포함하고, 본 발명의 기본적이고 신규한 특성들에 실질적으로 영향을 미치지 않는 미열거된 성분들에는 열린 상태임을 의미한다. 청구항에서 "근본적으로 ~로 구성된"은 "~으로 구성된"이라는 닫힌 형태로 쓴 닫힌 청구항과 "포함하는"이라는 형태로 쓴 완전히 열린 상태의 청구항 사이의 중간 입장을 차지한다. 이와 같은 용어들은 이것이 필요한 경우, 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
게다가, 용어 "포함하는(including)"의 사용은, "포함하다" 및 "포함된"과 같은 다른 관련된 형태와 마찬가지로, 제한이 없다.
용어 "이종(Heterologous)의"는 주변과 이질적인 핵산 절편 또는 단백질을 가리킨다. 핵산 절편이란 관점에서, 이것은 전형적으로 하나의 원천에서 유도된 이와 같은 절편을 상이한 숙주에 유입시키는 것에 의해 완성된다. 숙주 유기체에 삽입된 바 있는 코딩 염기서열과 같은 이종 핵산 절편은 정상적으로, 숙주 유기체의 유전적 보완체에서 발견되지 않는다. 본원에 사용되는 용어 "이종"은 또한 동일한 유기체에서 유도된 핵산 절편을 가리키지만, 이것은 이와 같은 유기체의 게놈에서 상이한, 예컨대 비-본래의(non-본연의) 위치에 놓인 것이다. 따라서, 상기 유기체는 상기 게놈 내, 또한 식물 세포의 경우, 세포 내 상이한 게놈 내에, 예를 들어 핵 게놈에서 그리고 또한 색소체 또는 미토콘드리아 게놈 내에서, 그것의 정상적인 위치에 놓인 그와 같은 절편의 일반적인 복제수보다 더 많이 가질 수 있다. 핵상 절편이 삽입되었거나 또는 전이된 유기체와 관련하여 이종인 핵산 절편은 때로 "이식유전자"라 일컬어진다.
"이종" MtDef5 단백질- 또는 펩티드-인코딩 뉴클레오티드 염기서열은 내생적 MtDef5 단백질- 또는 펩티드-인코딩 뉴클레오티드 염기서열의 하나 이상의 추가적 복제본, 또는 다른 출처에서 유래된 뉴클레오티드 염기서열일 수 있다. 또한, 이들은 게놈 또는 비게놈 뉴클레오티드 염기서열일 수 있다. MtDef5 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 비게놈 뉴클레오티드 염기서열에는, 예를 들어, 자연발생적 mRNA; 예를 들어, 효소 합성 또는 화학적 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 생성된 합성 mRNA; 합성생산된 MtDef5 단백질- 또는 펩티드-인코딩 DNA 염기서열, 예컨대, 예를 들어, 화학적 올리고뉴클레오티드 합성 또는 효소 합성에 의해 제조된 것들, 예컨대, 예를 들어, cDNA, 상이한 형질전환 식물(이와 같은 식물에서 코돈 사용의 패턴을 반영)들에서 효율적인 발현을 위해 코돈이 최적화된 염기서열, 유전자 코드의 축중 때문에 자연발생적 게놈의 염기서열과 다르지만 본원에 개시된 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 여전히 인코딩하는 뉴클레오티드 염기서열, 보존적(또는 비보존적) 아미노산 치환(이들의 정상적인 항진균성 활성에 나쁜 영향을 미치지 않음)을 포함하는 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 염기서열, PCR-증폭 뉴클레오티드 염기서열 및 당해 기술의 숙련가에게 친숙한 기타 비게놈 형태의 뉴클레오티드 염기서열들이 포함된다.
"형질전환" 유기체, 예컨대 형질전환 식물은 유전적으로 변형되어 하나 이상의 이종 핵산 절편, 예컨대 뉴클레오티드 코딩 염기서열, 발현 카세트, 벡터 등을 함유하는 숙주 유기체이다. 형질전환 세포를 형성하기 위한 이종 핵산의 숙주 세포으로의 유입은 특정 전달 방식에 제한되지 않고, 예를 들어, 당해 기술의 숙련가에게 잘 알려진 바와 같이, 미세주입, 흡착, 전기천공, 유전입자 총법, 위스커스-매개 변형, 리포솜-매개 전달, 아그로박테리움-매개 전달, 바이러스 및 레트로바이러스 벡터의 사용 등이 포함된다.
용어 "게놈"은 종합적으로 식물 세포들 내 상이한 게놈들의 총체, 즉, 핵 게놈, 색소체(예컨대, 엽록체 게놈) 및 미토콘드리아 게놈을 가리킬 수 있고, 또는 구체적으로 명시된 경우 이들 개별적 게놈들 각각을 별도로 가리킬 수도 있다. 본원에 사용되는 용어 "게놈"은 달리 명시되지 않는 한 핵 게놈을 가리킨다. 본 발명의 재조합 방법 및 식물에 활용되는 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 발현을 위한 "게놈"은 핵 게놈이다. 그러나 색소체 게놈, 예컨대, 엽록체 게놈에서의 발현, 또는 색소체를 표적으로 하는 염기서열의 사용을 통한 엽록체와 같은 색소체 게놈에 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 표적화(targeting) 또한 본 개시에 포함된다.
용어 "대조군 식물"은 유입된 특질-개선 재조합형 DNA가 없는 식물을 가리킨다. 대조군 식물은 이와 같은 특질-개선 재조합형 DNA를 포함하는 형질전환 식물과 관련하여 특질 개선을 측정하고 비교하기 위한 기준으로 사용된다. 대조군 식물의 한 가지 적절한 유형은 형질전환 식물을 생성하기 위해 사용된 모 계통의 비-형질전환 식물, 즉, 그 외에는 동일한 야생형 식물이다. 적절한 대조군 식물의 또다른 유형은 특이적 특질-생성 DNA가 없는 재조합형 DNA, 예컨대, 단순히 빈 벡터를 포함하는 형질전환 식물이다.
본원에 사용되는 구문 "항진균성 단백질" 또는 "항진균성 펩티드"는 하기의 특성들 중 하나 이상을 보이는 단백질 및 펩티드를 가리킨다: 균류 세포의 증식을 억제 또는 지연; 균류 세포 살진균; 균류 생명 주기의 단계들, 예컨대 포자 발아, 포자형성 또는 교배의 교란 또는 지연; 및/또는 식물 내 균류 세포 감염, 침투 또는 전파 방해. 순수한 효과는 균류 병원체 발병 및/또는 식물의 손상을 제한, 감소 또는 제거하는 것이다.
본원에 사용되는 구문 "생물학적 기능성 등가물" 등은 본 발명의 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 염기서열 또는 구조적 특징(들)과 유사하거나 또는 동일한 것을 함유하고, 본 발명의 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 항진균성 활성과 동일한 또는 유사한, 예컨대, 약 ± 30%의 활성을 보이는 펩티드, 폴립펩티드 및 단백질을 가리킨다. 생물학적 기능성 등가물은 또한 본원에 개시된 MtDef5 단백질 또는 펩티드에 대항하는 단클론성 및/또는 다클론성 항체와 반응하고(즉, 상기 항체에 구체적으로 결합하는) 본 발명의 MtDef5 단백질 또는 펩티드와 동일한 또는 유사한, 예컨대, 약 ± 30% 항진균성 활성을 보이는 펩티드, 폴립펩티드 및 단백질을 가리킨다.
본원에 사용되는 구문 "균류 손상 퇴치", "균류 손상 퇴치 또는 방제", "균류 손상 방제" 등은 균류 병원체에 의한 감염으로 인한 작물 식물 또는 작물 식물 제품의 손상의 감소를 가리킨다. 좀 더 일반적으로, 이와 같은 구문은 작물 식물에 바람직하지 않은 균류의 존재에 의해 유발된 악영향의 감소를 가리킨다. 균류 증식의 악영향에는 모든 유형의 식물 조직 손상 또는 괴사, 모든 유형의 식물 수확 감소, 작물 식물 제품의 가치 하락, 및/또는 바람직하지 않은 균류 대사물질 또는 균류 증식 부산물, 예컨대, 비제한적으로, 진균독의 생산이 포함되는 것으로 이해된다.
본원에 사용되는 구문 "DNA 작제물"는 둘 이상의 일반적으로 구별되는 DNA 염기서열이 공유결합으로 연결되어 있는 모든 DNA 분자를 가리킨다. DNA 작제물의 예에는, 비제한적으로, 플라스미드, 코스미드, 바이러스, BACs(박테리아 인공 염색체), YACs(효모 인공 염색체), 식물 소형염색체, 자기 복제 염기서열, 파지, 또는 어떤 원천에서든 유도되어, 게놈 통합 또는 자기 복제를 할 수 있는 선형 또는 환형 단일가닥 또는 이중가닥 DNA 염기서열이 포함된다. DNA 작제물은 다양한 방법들, 예컨대, 비제한적으로, 재조합형 DNA 기법, DNA 합성 기법, PCR(중합효소 연쇄반응) 기법, 또는 이와 같은 기법들의 모든 조합에 의해 조립될 수 있다.
MtDef5 단백질 또는 펩티드를 발현하는 형질전환 식물 또는 미생물들, 또는 MtDef5 단백질, 펩티드, 또는 항진균을 목적으로 사용되는 이들의 조합을 함유하는 농업적 또는 약제학적 조성물의 맥락에서, 본원에 사용되는 구문 "식물 병원성 균류 억제 양" 또는 "항진균성 유효량" 등은, 경우에 따라, 상기 형질전환 식물에서 균류 증식의 측정 가능한 감소 및/또는 상기 형질전환 식물에서 균류 증식에 의해 유발되는 악영향의 측정 가능한 감소를 초래하는 MtDef5 단백질 및/또는 펩티드의 양, 또는 그 양이, 각각, 사용되는 특정 적용 개소에서 균류 증식의 측정 가능한 감소 및/또는 균류 증식에 의해 유발되는 악영향의 측정 가능한 감소를 초래하는 MtDef5 단백질 및/또는 펩티드의 양을 지칭한다. 후자에는, 예를 들어, 인간 및 동물 치료 적용이 포함된다. MtDef5 단백질 또는 펩티드, 또는 이들 조합의 항진균성 유효량은 환자 또는 개체에 단일 또는 다중 용량 투여 시, 바람직한 예방 또는 치료를 제공하는 양 또는 용량이다.
형질전환 식물의 맥락에서, MtDef5 단백질 또는 펩티드의 식물 병원성 균류 억제용 양(항진균성 유효량)은 최소한 약 0.05 PPM, 최소한 약 0.5 PPM, 최소한 약 1.0 PPM 또는 최소한 약 2.0 PPM으로, 여기서 PPM이란 생중량(fresh weight) 식물 조직에 존재하는 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 "백만분율(parts per million)"로, 생중량 식물 조직 1그램 당 MtDef5 단백질 또는 펩티드 1마이크로그램이 1 PPM의 농도를 나타낸다.
DNA 작제물의 맥락으로, 본원에 사용되는 구문 "이종 프로모터"는 i) 작동가능하게 연결된 구조적 코딩 염기서열과 구별되는 원천에서 유도되는 프로모터 또는 ii) 작동가능하게 연결된 구조적 유전자와 동일한 원천에서 유도되되, 상기 프로모터의 염기서열이 그것의 본래 형태에서 변형된 것인 프로모터 중 하나를 가리킨다.
본원에서어 사용되는 용어 "상동체"는 상기 DNA 염기서열 또는 상기 인코딩된 단백질 염기서열 중 하나의 동일성에 의해 두 번째 유전자와 관련된 유전자를 가리킨다. 상동체인 유전자들은 종분화의 발생("오솔로그(ortholog)" 참조)에 의해 분리된 유전자일 수 있다. 상동체인 유전자들은 또한 유전적 중복(duplication)의 발생("파랄로그(paralog)" 참조)에 의해 분리된 유전자일 수 있다. 상동체는 동일한 또는 상이한 유기체에서 유래될 수 있고, 동일한 또는 상이한 유기체 각각에서 동일한 생물학적 기능을 수행할 수 있다.
본원에 사용되는 구문 "MtDef5 단백질 또는 펩티드"는 i) 본원에 개시된, 성숙한 MtDef5 단백질 염기서열, 또는 펩티드 염기서열과 최소한 약 70%의 염기서열 동일성을 갖는 단백질 또는 펩티드 및 ii) MtDef5 신호 펩티드 및 성숙한 MtDef5 단백질을 포함하는 MtDef5 전구체 단백질 염기서열과 최소한 약 70%의 염기서열 동일성을 갖는 단백질을 가리킨다. 성숙한 MtDef5 단백질 염기서열에는, 비제한적으로, MtDef5.1a 성숙한 단백질 염기서열(서열번호 16), MtDef5.1b 성숙한 단백질 염기서열(서열번호 17), MtDef5.2 성숙한 단백질 염기서열(서열번호 18), MtDef5.3 성숙한 단백질 염기서열(서열번호 19), MtDef5.4 성숙한 단백질 염기서열(서열번호 20), MtDef5.5 성숙한 단백질 염기서열(서열번호 21) 및 MtDef5.6 성숙한 단백질 염기서열(서열번호 22)이 포함되고, 또한 각각 서열번호 23 내지 29에 의해 예시된 코딩 염기서열들; 이들 염기서열과 최소한 약 70% 염기서열 동일성을 갖는 단백질; 및 이들 염기서열의 생물학적 기능성 등가물이 포함된다. MtDef5 전구체 단백질 염기서열에는, 비제한적으로, MtDef5.1a 전구체 단백질 염기서열(서열번호 l), MtDef5.lα~MtDef5.lb 전구체 단백질 염기서열(서열번호 4), MtDef5.2 전구체 단백질 염기서열(서열번호 5), MtDef5.3 전구체 단백질 염기서열(서열번호 6), MtDef5.4 전구체 단백질 염기서열(서열번호 7), MtDef5.5 전구체 단백질 염기서열(서열번호 8) 및 MtDef5.6 전구체 단백질 염기서열(서열번호 9)뿐만 아니라 이들에 대해 각각 서열번호 10 내지 15에 예시된 코딩 염기서열들; 이들 염기서열과 최소한 약 70%의 염기서열 동일성을 갖는 단백질; 및 이들 염기서열의 생물학적 기능성 등가물이 포함된다.
성숙한 MtDef5.1a 단백질(서열번호 16) 및 성숙한 MtDef5.1b 단백질(서열번호 17)이 MtDef5.lα~MtDef5.lb 전구체 단백질(서열번호 4)의 구성성분으로서 이합체로 발현되는 것으로 보이는데, 상기 서열번호 2에 표시된 아미노산 염기서열을 갖는 펩티드, 즉, APKKVEP가 "링커"로 작용함은 주목할 만하다.
본원에 사용되는 구문 "식물 병원성 균류의 증식을 억제"는 증식의 모든 주목할 만한 감소를 초래하는 방법들을 가리키는데, 여기서 균류 증식은, 비제한적으로, 균류 세포, 포자, 분생자, 또는 균사의 숫자 및/또는 범위의 모든 측정 가능한 감소를 포함한다. 본원에 사용되는 "식물 병원성 균류의 증식을 억제"는 또한 식물에서 균류 증식에 의해 유발되는 악영향의 모든 주목할 만한 감소를 포함하는 것으로 이해된다. 식물에서 균류 증식의 악영향에는 모든 유형의 식물 조직 손상 또는 괴사, 모든 유형의 식물 수확량 감소, 작물 식물 제품의 가치 하락, 및/또는 바람직하지 않은 균류 대사물질 또는 균류 증식 부산물, 예컨대, 비제한적으로, 진균독의 생산이 포함된다.
본원에서 사용되는 용어 "오솔로그"는 공통된 조상 유전자에서 종분화에 의해 진화된 상이한 종들에서의 둘 이상의 상동체 유전자를 가리킨다. 상기 오솔로그는 상이한 종에서 동일한 생물학적 기능을 가질 수 있다.
본원에 사용되는 구문 "작동가능하게 연결된"은 하나의 염기서열이 연결된 염기서열에 필요한 기능을 제공할 수 있게 하기 위한, 핵산 염기서열의 결합을 가리킨다. 프로모터의 맥락에서, "작동가능하게 연결된"은 관심대상 염기서열의 전사가 상기 프로모터에 의해 제어 및 조절되도록 상기 프로모터가 관심대상 염기서열에 연결된 것을 뜻한다. 상기의 관심대상 염기서열이 단백질을 인코딩하고, 상기 단백질의 발현이 바람직할 경우, "작동가능하게 연결된"이란 수득된 전사체가 효율적으로 번역되도록, 상기 프로모터가 상기 염기서열에 결합된 것을 뜻한다. 만약 상기 프로모터의 상기 코딩 염기서열로의 결합이 전사적 융합이고, 상기 인코딩된 단백질의 발현이 바람직한 경우, 수득된 전사체에서의 제1 번역 개시 코돈이 상기 코딩 염기서열의 개시 코돈이 되도록 상기 결합이 이루어진다. 선택적으로, 상기 프로모터의 상기 코딩 염기서열로의 결합이 번역 융합이고 상기 인코딩된 단백질의 발현이 바람직할 경우, 상기 프로모터 및 상기 코딩 염기서열과 관련된 5 ' 미번역 염기서열에 함유된 제1 번역 개시 코돈이, 수득된 번역 생성물이 상기의 바람직한 단백질을 인코딩하는 번역 개방 판독 틀(translational open reading frame) 안에 있도록 결합될 수 있게, 상기 결합이 이루어진다. 작동가능하게 연결될 수 있는 핵산 염기서열에는, 비제한적으로, 유전자 발현 기능을 제공하는 염기서열(예컨대, 유전자 발현 요소들, 예를 들어 프로모터, 5' 미번역 영역, 인트론, 단백질코딩 영역, 3' 미번역 영역, 폴리아데닐화 부위, 및/또는 전사 종결자), DNA 전이 및/또는 통합 기능을 제공하는 염기서열(예컨대, T-DNA 경계 염기서열, 부위특이성 재조합효소 인식부위, 통합효소 인식 부위), 선택적 기능을 제공하는 염기서열(예컨대, 항생제 저항 표지, 생합성 유전자), 채점가능 표지 기능을 제공하는 염기서열(예컨대, 리포너 유전자), 염기서열의 체외 또는 체내 조작을 돕는 염기서열(예컨대, 폴리링커 염기서열, 부위 특이성 재조합 염기서열) 및 복제기능을 제공하는 염기서열(예컨대, 박테리아 복제개시점, 자기 복제 염기서열, 동원체 염기서열)이 포함된다.
본원에 사용되는 구문 "백분율 동일성"은 최적으로 배열된 2개의 DNA, RNA 또는 단백질 절편의 일정 길이 내에서, 염기서열 중 동일한 요소들(즉, 아미노산 또는 뉴클레오티드)의 수를 가리킨다. "백분율 동일성"을 계산하기 위해, 동일한 요소들의 수를 배열된 절편의 일정 길이 내 요소들의 총합으로 나누고, 이어서 100을 곱한다. 단백질과 관련하여 동일성의 백분율이 사용될 경우, 어떤 아미노산 잔기들은 동일하지 않을 수 있으나 유사한 화학적 특성들을 갖는 아미노산 잔기(예컨대, 산성 또는 염기성, 소수성, 친수성, 수소결합 공여체 또는 수용체 잔기)의 치환을 반영하는 보존적 아미노산 치환임이 이해된다. 이와 같은 치환은 상기 분자의 기능적 특성들을 바꾸지 않을 수 있다. 결과적으로, 단백질 염기서열의 백분율 동일성은 보존적 아미노산 치환을 감안하여, 증가될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "재생"은 예를 들어, 종자, 원형질체, 식물 세포, 식물 세포 군, 식물 가피 조직, 또는 식물의 절제된 편 중 어느 하나에서 전체 식물을 수득하는 모든 방법을 가리킨다.
용어 "민감한 균류(또는 균류)", 민감한 진균 감염증 등은 식물, 또는 인간 또는 동물 환자 또는 개체를 감염시키는 균류, 또는 본원에 개시된 MtDef5 분자들의 증식 억제 또는 증식 지연 효과, 및/또는 병리 지연 효과에 반응하는, 그리고 이것에 의해 불리한 영향을 받는, 이것의 진균 감염증을 가리킨다. 이와 같은 민감한 균류는 이와 같은 분자들에 의해 살해되거나, 균류의 생명주기의 단계들, 예컨대 포자 발아, 포자형성 또는 교배; 식물 또는 포유류 내에서의 감염, 침투 또는 전파가 MtDef5 분자들에 의해 교란되거나 또는 지연된다. 그와 같은 균류 및 진균 감염증에 미치는 Def5 분자들의 순효과는 균류 병원체 발병 및/또는, 그와 같은 균류와의 접촉 시 식물, 인간 또는 동물에게 가해지는 손상을 예방, 제한, 감소, 치료, 억제 또는 완전히 제거하는 것이다. 민감한 균류는 본원에 개시된 모든 검사 방법에 의해 확인될 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "변형"은 외래적 DNA 염기서열(예컨대, 벡터, 재조합형 DNA 분자)의 세포 또는 원형질체로의 유입을 위한 과정을 가리키는데, 상기 세포 또는 원형질체에서 외래적 DNA가 염색체에 편입되거나 또는 자기 복제할 수 있다.
구문 "형질전환 식물"은 변형된 식물 세포, 원형질체, 또는 기타 변형된 식물 조직에서 유도된 식물 또는 이것의 후손을 가리키되, 상기 식물 DNA는 동일한 종의 상응하는 천연의 비-형질전환 식물에 본래 존재하지 않는, 유입된 외래적 DNA 분자를 함유한다.
용어 "치료하는"(또는 "치료하다" 또는 "치료")는 식물 또는 기타 균류 병원체에 의해 유발된 증상, 장애, 질환 또는 질병의 진행 또는 중증도를 지연, 방해, 저지, 억제, 중지, 감소 또는 역행시키는 것을 뜻하고, 영향을 받은 식물 또는 인간 또는 가축 개체의 모든 균류 질병-관련 증상, 질환, 또는 장애의 완전한 제거를 포함할 수 있다.
본원에 사용되는 용어 "벡터"는 숙주 세포에서 복제가 가능한 DNA 또는 RNA 분자, 및/또는 또 다른 DNA 또는 RNA 절편이 부착된 절편의 복제를 야기하기 위해 작동가능하게 연결된 것을 가리킨다. 플라스미드가 예시적 벡터이다.
본 발명은 본원에 개시된 MtDef5 항진균성 단백질 및 펩티드를 발현하기 위해 유용한 단리된 DNA 작제물을 제공한다. 상기 단리된 DNA 작제물은 이종 프로모터, 선택적 인트론, MtDef5 단백질 또는 펩티드(서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64 중 어느 하나와 최소한 약 85%의 염기서열 동일성을 가짐)를 인코딩하는 염기서열 및 아데닐산중합반응 염기서열을 포함하되, 상기 프로모터, 선택적 인트론, 신호 펩티드를 인코딩하는 염기서열, 성숙한 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 염기서열 및 아데닐산중합반응 염기서열이 발현을 위해 작동가능하게 연결된다.
본 발명의 단리된 DNA 작제물은 추가로 상기 MtDef5 단백질을 인코딩하는 염기서열에 작동가능하게 연결된 신호 펩티드를 인코딩하는 염기서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 DNA 작제물에 사용되는 신호 펩티드는 효모 신호 펩티드, 외떡잎식물 신호 펩티드, 쌍떡잎식물 신호 펩티드 및 합성 신호 펩티드로 이루어진 군에서 선택된다. 효모 신호 펩티드는 α-인자 신호 펩티드, 인버타제 신호 펩티드 및 PHOl 신호 펩티드로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 쌍떡잎식물 식물 신호 펩티드는 MtDefl.1, MsDefl.6, MtDef2.1, MtDef4, MtDef5 및 담배 PRlb 신호 펩티드로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 외떡잎식물 신호 펩티드는 시스테인 엔도프로테나제 신호 펩티드 및 α-아밀라아제 신호 펩티드로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 MtDef5 신호 펩티드는 서열번호 30 내지 35의 신호 펩티드 서열들로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
상기 MtDef5 단백질 및 펩티드를 인코딩하는 다양한 DNA 염기서열들이 본 발명의 DNA 작제물에 사용될 수 있다. 일반적으로, 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64 중 어느 하나와 최소한 약 85%의 염기서열 동일성을 갖는 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 염기서열이 사용될 수 있다. DNA 작제물의 인코딩된 MtDef5 단백질 또는 펩티드 염기서열에는, 비제한적으로, 성숙한 MtDef5 단백질을 인코딩하는 염기서열이 포함된다. 상기 DNA 작제물의 인코딩된 MtDef5 단백질 및 펩티드 염기서열은 또한 MtDef5 신호 펩티드 및 성숙한 MtDef5 단백질을 포함하는 MtDef5 전구체 단백질을 인코딩하는 핵산 염기서열을 포함한다. MtDef5.1α-5.6 전구체 단백질 염기서열은 서열번호 1 및 4 내지 9로 표시되어 있다. 이와 같은 염기서열과 최소한 70%의 염기서열 동일성을 갖는 단백질, 및 이들 염기서열의 생물학적 기능성 등가물이 본 발명에 포함된다. 상기 DNA 작제물에 의해 인코딩된 상기 MtDef5 단백질 및 펩티드는 따라서 서열번호 l, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64에 표시된 아미노산 염기서열을 포함할 수 있다. 상기 DNA 작제물에 의해 인코딩된 성숙한 MtDef5 단백질은 또한 서열번호 16 내지 22에 표시된 아미노산 염기서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 어떤 구현예에서, 상기 단리된 DNA 작제물은 형질전환 식물에 유입될 경우, 작동가능하게 연결된 염기서열의 발현을 허용하는 프로모터 및 아데닐산중합반응 염기서열을 사용한다. 서열번호 l, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64 중 하나와 최소한 약 85% 동일한 MtDef5 단백질 및 펩티드를 인코딩하는 염기서열이 형질전환 식물에서의 발현을 허용하는 프로모터 및 아데닐산중합반응 염기서열에 작동가능하게 연결된다. 식물에서의 발현을 허용하는 상기 프로모터는 구성 프로모터, 조직 특이성 프로모터, 스트레스 유발 프로모터, 일시적 프로모터 및 진균 감염증-유도 프로모터로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 구성 프로모터는 CaMV35S 프로모터, FMV35S 프로모터, 옥수수 유비퀴틴 프로모터 및 쌀 액틴 프로모터로 이루어진 군에서 선택된다. 아데닐산중합반응 염기서열은 CaMV35S, NOS, 쌀 젖산탈수소효소 및 밀 Hspl7 아데닐산중합반응 염기서열로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 기타 구현예에서, 상기 단리된 DNA 작제물은 식물의 핵 게놈에 유입된 경우 작동가능하게 연결된 염기서열의 발현을 허용하는 인트론 염기서열, 및 상기 인트론 염기서열이 상기 프로모터에 작동가능하게 연결된 경우, 신호 펩티드를 인코딩하는 염기서열, 성숙한 MtDef5 폴리펩티드를 인코딩하는 염기서열 및 아데닐산중합반응 염기서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 인트론 염기서열은 쌀 액틴 인트론, 옥수수 hsp70 인트론, 옥수수 소형 서브유닛 RUBISCO 인트론, 옥수수 유비퀴틴 인트론, 옥수수 Adhl 인트론, 쌀 페닐알라닌 암모니아 분해효소 인트론, 수크로스 합성효소 인트론, CAT-1 인트론, pKANNIBAL 인트론, PIV2 인트론 및 수퍼 유비퀴틴 인트론을 포함하는 군에서 선택될 수 있다.
식물에서 성숙한 MtDef5 단백질의 발현을 허용하는 DNA 작제물은 옥수수 유비퀴틴 프로모터 및 인트론을 함유하는 폴리뉴클레오티드, MtDef5 신호 펩티드 및 성숙한 MtDef5 단백질 둘 다를 인코딩하는 합성 MtDef5 유전자 및 아데닐산중합반응 신호를 포함할 수 있다. 식물에서 성숙한 MtDef5 단백질의 발현을 허용하는 또 다른 DNA 작제물은 FMV 프로모터, 수퍼 유비퀴틴 인트론, 신호 펩티드, 인트론 및 성숙한 MtDef5 단백질을 인코딩하는 게놈 MtDef5 염기서열 및 tNOS 종결자를 포함할 수 있다. 본 발명에서 다루는 DNA 작제물에는 MtDef5 단백질 또는 펩티드에 작동가능하게 연결된 액포를 표적으로 하는 펩티드 또는 소포체 보존 펩티드를 인코딩하는 염기서열을 추가로 포함하는, 식물에서 MtDef5 단백질 또는 펩티드 발현을 허용하는 것들이 포함된다. 식물에서 성숙한 MtDef5 단백질의 발현을 허용하는 DNA 작제물은 FMV 프로모터, 수퍼 유비퀴틴 인트론, 신호 펩티드, 인트론 및 액포 또는 소포체를 표적으로 하는 펩티드에 작동가능하게 연결된 성숙한 MtDef5 단백질을 인코딩하는 게놈 MtDef5 염기서열, 및 tNOS 종결자를 포함할 수 있다.
본 발명의 DNA 작제물은 선택가능 표지를 인코딩하는 염기서열을 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 선택가능 표지는 전형적으로 상기 DNA 작제물을 함유하는 형질전환 식물을 선택하기 위해 사용된다. 상기 선택가능 표지는 네오마이신 인산전이효소 단백질, 포스피노트리신아세틸 전달효소 단백질, 글리포세이트 저항성 5-에놀-피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소(EPSPS) 단백질, 히그로마이신 인산전이효소 단백질, 디히드로프테로에이트 합성효소 단백질, 술포닐우레아 둔감 아세토락테이트 합성효소 단백질, 아트라진 둔감 Q 단백질, 브로목시닐을 분해할 수 있는 나이트릴라아제 단백질, 달라폰을 분해할 수 있는 데할로게나아제 단백질, 2,4-디클로로-페녹시아세테이트 모녹시게나아제 단백질, 메토트렉세이트 둔감 디히드로엽산환원효소 단백질, 및 아미노에틸시스테인 둔감 옥토파인 합성효소 단백질로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 DNA 작제물은 채점가능 표지를 인코딩하는 염기서열을 추가로 포함할 수 있다. 이와 같은 채점가능 표지는 전형적으로 상기 DNA 작제물을 함유하는 형질전환 식물을 확인하기 위해 사용된다. 상기 채점가능 표지는 베타-글루쿠로니다아제 단백질, 녹색형광 단백질, 황색형광 단백질, 베타-갈락토시다아제 단백질, luc 유전자에서 유도된 발광 효소 단백질, lux 유전자에서 유도된 발광 효소 단백질, 시알리다아제 단백질, 스트렙토마이신 인산전이효소 단백질, 노팔린 합성효소 단백질, 옥토파인 합성효소 단백질 및 클로람페니콜아세틸전달효소 단백질로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
앞서 언급된 DNA 작제물을 포함하는 형질전환 식물(이와 같은 식물에서 상기 DNA 작제물이 MtDef5 단백질 및 펩티드를 발현함)이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 상기 형질전환 식물은 식량 작물 식물 또는 생물연료 작물 식물, 및 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물 중 하나 일 수 있다. 본 발명의 형질전환 외떡잎식물은 보리, 옥수수, 아마, 귀리, 쌀, 호밀, 수수, 잔디풀, 사탕수수 및 밀로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 본 발명의 형질전환 쌍떡잎식물은 알팔파, 애기장대, 배럴 메틱(barrel medic), 바나나, 브로콜리, 콩, 양배추, 유채, 당근, 카사바, 콜리플라워, 셀러리, 감귤류, 면, 조롱박, 유칼립투스, 마늘, 포도, 양파, 상추, 완두콩, 땅콩, 후추, 감자, 포플러, 소나무, 해바라기, 홍꽃, 대두, 딸기, 사탕무, 고구마, 담배 및 토마토로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 DNA 작제물은 효모 세포에 유입된 경우, 작동가능하게 연결된 염기서열의 발현을 허용하는 프로모터 및 아데닐산중합반응 염기서열을 사용한다. 이와 같은 프로모터는 AOX1 프로모터, AOX2 프로모터, PHO 프로모터, MOX 프로모터, DAS 프로모터, ADH 프로모터, GAPDH 프로모터 및 LAC4 프로모터로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 이와 같은 아데닐산중합반응 염기서열은 AOX1, AOX2, CYC1, p40, p76, MOX, LAC4 및 액틴 아데닐산중합반응 염기서열로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 DNA 작제물은 작동가능하게 연결된 AOX1 프로모터를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 효모 α-인자 신호 염기서열, 성숙한 MtDef5 디펜신 염기서열 및 AOX1 아데닐산중합반응 염기서열을 포함할 수 있다. 선택적으로, 상기 DNA 작제물은 작동가능하게 연결된 AOX1 프로모터를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드, 효모 α-인자 신호 염기서열, 성숙한 MtDef5 디펜신 염기서열 및 AOX1 아데닐산중합반응 염기서열를 포함할 수 있다.
효모에서 성숙한 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 발현을 위한 DNA 작제물은 선택가능 또는 채점가능 표지 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 선택가능 표지 유전자는 ADE 단백질, HIS5 단백질, HIS4 단백질, LEU2 단백질, URA3 단백질, ARG4 단백질, TRPl 단백질, LYS2 단백질, 블레오마이신 또는 플레오마이신 항생제에 대한 저항성을 부여하는 단백질, 클로람페니콜에 대한 저항성을 부여하는 단백질, G418 즉 게네티신에 대한 저항성을 부여하는 단백질, 히그로마이신에 대한 저항성을 부여하는 단백질, 메토트렉세이트에 대한 저항성을 부여하는 단백질, AR04-OFP 단백질 및 FZF 1 -4 단백질을 인코딩하는 유전자들로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
채점가능 표지 유전자는 베타-글루쿠로니다아제 단백질, 녹색형광 단백질, 황색형광 단백질, 베타-갈락토시다아제 단백질, luc 유전자에서 유도된 발광 효소 단백질, lux 유전자에서 유도된 발광 효소 단백질, 시알리다아제 단백질, 스트렙토마이신 인산전이효소 단백질, 노팔린 합성효소 단백질, 옥토파인 합성효소 단백질 및 클로람페니콜 아세틸전달효소 단백질을 인코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
효모에서 MtDef5 단백질 및 펩티드를 인코딩하는 작동가능하게 연결된 염기서열의 발현을 허용하는 프로모터 및 아데닐산중합반응 염기서열을 포함하는 상기 언급된 DNA 작제물을 포함하는 효모 세포 역시 본 발명에 의해 제공된다. 상기 효모 세포가 칸디다, 클루베로마이세스, 한수엘라(Hansuela), 피치아, 사카로미세스, 스키조사카로미세스 및 야로이야로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 추가로 식물 병원성 균류의 증식을 억제할 수 있는 형질전환 식물을 수득하는 방법을 제공한다. 이와 같은 방법은 하기의 단계를 포함한다: 식물, 식물 세포, 또는 식물 조직에 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 발현을 허용하는 DNA 작제물을 유입시키고, 식물 병원성 균류 억제성 양만큼의 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 발현하는 DNA 작제물을 포함하는 형질전환 식물을 수득한다. 이와 같은 방법을 실행하기 위해, 상기 DNA 작제물이 예를 들어, 입자 폭격, DNA 형질주입, DNA 전기천공 및 T-DNA 매개 변형으로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의해 상기 식물에 유입될 수 있다.
본 방법의 어떤 구현예에서 사용되는 DNA 작제물은 선택가능 표지 유전자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 DNA 작제물이 추가로 선택가능 표지 유전자를 포함할 경우, 본 발명의 형질전환 식물은 식물 증식용 선택가능 표지 유전자의 발현을 필요로 하는 조건 하에서 상기 식물, 식물 세포, 또는 식물 조직을 키움으로써 수득된다. 이와 같은 선택가능 표지 유전자는 네오마이신 인산전이효소 단백질, 포스피노트리신아세틸전달효소 단백질, 글리포세이트 저항성 5-에놀-피루빌쉬키메이트-3 -포스페이트 합성효소(EPSPS) 단백질, 히그로마이신 인산전이효소 단백질, 디히드로프테로에이트 합성효소 단백질, 술포닐우레아 둔감 아세토락테이트 합성효소 단백질, 아트라진 둔감 Q 단백질, 브로목시닐을 분해할 수 있는 나이트릴라아제 단백질, 달라폰을 분해할 수 있는 데할로게나아제 단백질, 2,4-디클로로페녹시아세테이트 모녹시게나아제 단백질, 메토트렉세이트 둔감 디히드로엽산 환원효소 단백질 및 아미노에틸시스테인 둔감 옥토파인 합성효소 단백질을 인코딩하는 유전자들로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
형질전환 식물을 수득하기 위한 이와 같은 방법은 또한 식물에서 작용하는 채점가능 표지 유전자를 추가로 포함하는 DNA 작제물을 활용한다. 이와 같은 경우에, 상기 채점가능 표지 유전자의 발현이 검사되어 형질전환 식물 세포 또는 재생된 형질전환 식물을 수득할 수 있다. 채점가능 표지 유전자는 베타-글루쿠로니다아제 단백질, 녹색형광 단백질, 황색형광 단백질, 베타-갈락토시다아제 단백질, luc 유전자에서 유도된 발광 효소 단백질, lux 유전자에서 유도된 발광 효소 단백질, 시알리다아제 단백질, 스트렙토마이신 인산전이효소 단백질, 노팔린 합성효소 단백질, 옥토파인 합성효소 단백질 및 클로람페니콜아세틸전달효소 단백질을 인코딩하는 유전자들로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
이와 같은 방법에서, 식물 병원성 균류 억제성 양만큼의 성숙한 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 발현하는 형질전환 식물은 형질전환 식물에서 MtDef5를 인코딩하는 이식유전자의 발현을 분석함으로서 수득된다. MtDef5를 인코딩하는 이식유전자의 발현은 예를 들어, 면역분석법, 효소-연결 면역분석법, RNA 혼성화에 의한 검출을 기초로 하는 분석 및 역전사 효소 중합효소 연쇄반응에 의한 검출을 기초로 한 분석으로 이루어진 군에서 선택되는 방법에 의해 분석될 수 있다. 선택적으로, 상기 형질전환 식물을 식물 병원성 균류에 노출시키고, 상기 식물 병원성 균류의 증식이 억제되는지 여부를 판단함으로써, MtDef5를 인코딩하는 이식유전자의 발현이 분석된다. 성숙한 MtDef5 단백질의 식물 병원성 균류 억제성 양은 최소한 약 0.05 PPM, 약 0.5 PPM, 약 1.0 PPM 또는 약 2.0 PPM으로, 여기서 PPM은 생중량 식물 조직에 존재하는 MtDef5 단백질의 "백만분율"이다. 전형적으로, 형질전환 식물 조직의 1그램 생중량 당 몇 마이크로그램의 MtDef5 단백질이 존재한다. 바람직한 구현예에서, MtDef5 단백질의 상기 식물 병원성 균류 억제성 양은 최소한 약 0.5 PPM이다. 좀 더 바람직한 구현예에서, MtDef5의 상기 식물 병원성 균류 억제성 양은 최소한 약 1.0 PPM이다. 가장 바람직한 구현예에서, MtDef5의 식물 병원성 균류 억제성 양은 최소한 약 2.0 PPM이다.
본 방법은 다양한 MtDef5 분자에 감염되기 쉬운 식물 병원성 균류의 증식의 억제를 허용한다. 본 발명에 의해 억제된 식물 병원성 균류는 알터나리아, 아스코치타, 아스페르길러스, 보트리티스; 케르코스포라, 코레토트리쿰, 디플로디아, 에리시페, 푸자리움, 개우마노마이세스, 헬민토스포리움, 마크로포미나, 넥트리아, 페로노스포라, 파콥소라, 포마, 파이마토트리쿰, 파이토프토라, 플라스모파라, 푸치니아, 포도스패라, 파이레노포라, 파이리쿨라리아, 파이티움, 리족토니아, 스케로티움, 스클레로티니아, 셉토리아, 티엘라비옵시스, 운키눌라, 벤투리아 및 버티실리움으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 방법에 의해 생산되는 식물 병원성 균류의 증식을 억제할 수 있는 형질전환 식물을 허용한다. 본 발명의 DNA 작제물을 식물, 식물 세포 또는 식물 조직에 주입하는 단계 및 식물 병원성 균류 억제성 양만큼의 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 발현하는 DNA 작제물을 포함하는 형질전환 식물을 수득하는 단계를 포함하는 과정에 의해 생산된 형질전환 식물들 또한 따라서 본 발명에 의해 고안된다. 성숙한 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 식물 병원성 균류 억제성 양은 최소한 약 0.05 PPM, 0.5 PPM, 1.0 PPM 또는 2.0 PPM으로, 여기서 PPM은 생중량 식물 조직에 존재하는 MtDef5 단백질의 "백만분율"이다.
본 발명은 추가로 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64에 표시된 아미노산 염기서열들과 최소한 약 85% 염기서열 동일성을 갖는 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 생산하는 방법을 제공한다. 상기 성숙한 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 생산하는 방법은 효모 세포가 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 발현하는 조건 하에서, 상기 효모에서 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 발현을 허용하는 DNA 작제물을 포함하는 상기 효모 세포를 배양하는 단계 및, 전 단계의 배양액에서 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 단리하는 단계를 포함한다. MtDef5 단백질 또는 펩티드는 상기 두 번째 단계에서, 상기 세포 배양액 배지로부터 단리될 수 있다. 선택적으로, 상기 MtDef5 단백질 또는 펩티드는 상기 효모 세포로부터 단리될 수 있다. 본 방법의 어떤 구현예에서, 상기 MtDef5 단백질은 성숙한 MtDef5 단백질이다. 본 방법에서 사용된 효모 세포는 신호 펩티드를 인코딩하는 염기서열 및 성숙한 MtDef5 단백질을 인코딩하는 염기서열에 작동가능하게 연결된 AOX1 프로모터를 함유하는 DNA 작제물을 포함하는 피치아 세포일 수 있고, 상기 성숙한 MtDef5 단백질의 발현을 허용하는 조건은 메탄올의 존재 하에 상기 피치아 세포를 배양하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64의 염기서열들 중 어느 하나와 최소한 약 85% 염기서열 동일성을 갖는 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 인식하는 항체를 허용한다. 서열번호 l, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64 중 어느 하나와 최소한 약 85%의 염기서열 동일성을 갖는 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 특이적으로 검출하는 키트가, 서열번호 l, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64 중 어느 하나와 최소한 약 85%의 염기서열 동일성을 갖는 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 인식하는 항체 및 상기 항체를 검출하는 시약을 포함하는데, 이것 역시 본 발명에 의해 제공된다.
어떤 단리된 뉴클레오티드 염기서열이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 본 발명의 단리된 뉴클레오티드 염기서열은 서열번호 10 내지 15, 23 내지 29 및 65 내지 78로 이루어진 군에서 선택되는 MtDef5코딩 염기서열, 및 서열번호 30 내지 35 및 42 내지 48로 이루어진 군에서 선택되는 MtDef5 또는 기타 신호 펩티드 코딩 염기서열을 포함한다. 상기 염기서열들에서 유도된 올리고-뉴클레오티드가 추가로 고안된다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드가 사용되어 상기 언급된 뉴클레오티드 염기서열을 함유하는 형질전환 식물을 확인하거나, 또는 이와 같은 형질전환 식물에서 수득된 물질을 확인할 수 있다. 이와 같은 올리고뉴클레오티드를 사용하여 상기 형질전환 식물 물질을 확인하는 방법 및 이와 같은 방법들을 수행하기 위한 키트가 또한 고안된다.
다양한 단리된, 정제 MtDef5 전구체 단백질, 성숙한, 및 펩티드 염기서열이, 또한 서열번호 l, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64에 다양하게 표시된 바와 같이 본 발명에 의해 제공되고, 또한 따라서 앞서 언급된 바와 같이, 각각 서열번호 10 내지 15, 23 내지 29 및 65 내지 78로 표시된 것과 같은 코딩 염기서열이 본 발명에 의해 제공된다.
식물 발현 카세트를 포함하는 DNA 작제물
외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물에서 사용하기 위한 발현 카세트의 구성이 잘 성립되어 있다. 발현 카세트는 다양한 프로모터, 코딩 및 아데닐산중합반응 염기서열들이 작동가능하게 연결된 것인 DNA 작제물이다. 일반적으로, 발현 카세트는 전형적으로 아데닐산중합반응 또는 종결자 영역에 작동가능하게 연결된, 관심대상 염기서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 어떤 경우에는, 예컨대, 비제한적으로, 외떡잎식물에서 이식유전자의 발현의 경우에, 인트론 염기서열을 포함시키는 것이 또한 유용할 수 있다. 인트론 염기서열이 포함되는 경우, 이것은 전형적으로 상기 이식유전자의 5' 미번역 리더 영역에 놓인다. 어떤 경우에는, 특이적 5' 미번역 염기서열을 이식유전자에 편입시켜 전사 안정성을 증진시키거나 또는 전사체의 효율적인 번역을 촉진하는 것이 또한 유용할 수 있다.
프로모터
다양한 프로모터가 본 발명의 실행에 사용될 수 있다. 유용한 프로모터의 광범위한 부류는 이들이 식물 발달 과정을 통틀어 대부분의 식물 기관에서 활성이기 때문에, "구성" 프로모터라고 일컬어진다. 예를 들어, 상기 프로모터는 바이러스 프로모터, 예컨대 CaMV35S 또는 FMV35S 프로모터일 수 있다. 상기 CaMV35S 및 FMV35S 프로모터는 다양한 변형된 식물 조직 및 대부분의 식물 기관(예컨대, 가피, 잎, 종자 및 뿌리)에서 활성이다. 상기 CaMV35S 및 FMV35S 프로모터의 향상된 또는 복제된(duplicate) 형태가 특히 본 발명의 실행에 유용하다(미국 특허 제5,378,619호, 그 전체가 본원에 참조로 편입됨). 기타 유용한 프로모터에는 노팔린 합성효소(NOS) 및 옥토파인 합성효소(OCS) 프로모터(아그로박테리움 투메파시엔스의 종양-유발 플라스미드 상에서 운반됨), 콜리플라워 모자이크 바이러스(CaMV) 19S 프로모터, 옥수수 유비퀴틴 프로모터, 쌀 Actl 프로모터 및 피그워트(Figwort) 모자이크 바이러스(FMV) 35 S 프로모터(예컨대, 미국 특허 제5,463,175호(그 전체가 본원에 참조로 편입됨) 참조)가 포함된다. 이와 같은 예시적 프로모터들의 군은 비제한적이며, 당해 기술의 숙련가는 본 발명의 실행 시 본원에서 명확히 언급되지 않은 다른 프로모터들을 사용할 수 있음이 이해되어야 한다.
어떤 식물 조직에서 활성인 프로모터(즉, 조직 특이성 프로모터)는 또한 MtDef5 단백질 및 펩티드의 발현을 추진하기 위해 사용될 수 있다. 전형적으로 균류 병원체에 의해 감염되는 조직에서의 MtDef5 단백질 및 펩티드의 발현이 특히 유용할 것으로 기대된다. 따라서, 생식 조직, 종자, 뿌리, 줄기 또는 잎에서의 발현이 어떤 작물에서 어떤 균류 병원체에 의한 이들 조직의 감염을 퇴치하는 데 특히 유용할 수 있다. 유용한 조직-특이성, 발달단계에서 조절되는 프로모터의 예에는, 비제한적으로 β-콘글리시닌 7S 프로모터(Doyle et al, 1986), 종자-특이성 프로모터(Lam and Chua, 1991) 및, 나핀, 파세올린, 제인, 대두 트립신 억제제, ACP, 스테아로일-ACP 불포화효소 또는 올레오신 유전자와 관련된 프로모터가 포함된다. 뿌리-특이성 프로모터의 예에는, 비제한적으로 미국 특허 5,459,252 및 5,837,876에 각각 기술된 RB7 및 RD2 프로모터가 포함된다.
또 다른 부류의 유용한 프로모터는 다양한 환경적 자극 요인에 의해 유도되는 프로모터다. 환경적 자극요인에 의해 유도되는 프로모터에는, 비제한적으로, 열에 의해 유도되는 프로모터(예컨대, 열 충격 프로모터, 예컨대 Hsp70), 빛에 의해 유도되는 프로모터(예컨대, 리불로스 1,5-비스포스페이트 카복실라아제, ssRUBISCO, 아주 풍부한 식물 폴리펩티드의 소형 서브유닛에서 유래된 광-유도성 프로모터), 냉기에 의해 유도되는 프로모터(예컨대, COR 프로모터), 산화 스트레스에 의해 유도되는 프로모터(예컨대, 카탈라아제 프로모터), 가뭄에 의해 유도되는 프로모터(예컨대, 밀 Em 및 쌀 rabl6A 프로모터) 및 다중 환경 신호에 의해 유도되는 프로모터(예컨대, rd29A 프로모터, 글루타티온-S-전이효소(GST) 프로모터)가 포함된다.
식물에서 진균 감염증에 의해 유도되는 프로모터 또한 MtDef5 단백질 및 펩티드의 발현을 추진하기 위해 사용될 수 있다. 진균 감염증에 의해 유도된 유용한 프로모터에는 페닐프로파노이드 대사에 관여하는 유전자(예컨대, 페닐알라닌 암모니아 분해효소, 칼콘 합성효소 프로모터), 식물 세포벽을 변형시키는 유전자(예컨대, 하이드록시프롤린이 풍부한 당단백질, 글리신이 풍부한 단백질 및 페록시다아제 프로모터), 균류 세포벽을 분해하는 효소를 인코딩하는 유전자(예컨대, 키틴 분해효소 또는 글루카나아제 프로모터), 타우마틴-유사 단백질 프로모터를 인코딩하는 유전자, 또는 진균 감염증에 중요한 유도를 나타내는 알려지지 않은 기능의 단백질을 인코딩하는 유전자와 관련된 프로모터들이 포함된다. 각각 Misl 및 Fisl로 명명된 옥수수 및 아마 프로모터 또한 식물에서 진균 감염증에 의해 유도되고 사용될 수 있다(미국 특허 출원 20020115849).
보호를 추구하려는 대상인 균류에 따라서, 본 발명의 MtDef5 단백질 및 펩티드는 상기 균류가 공격하는 식물의 모든 조직 또는 기관에서 발현될 수 있다. 푸사리움의 경우 예를 들어, 바람직한 발현 부위는 뿌리 내부이다. 외부 식물 표면을 진입함으로써 감염시키는 균류의 경우, 아포플라스트에서의 MtDef5 단백질 및 펩티드의 축적이 바람직하고, 이들 분자는 뿌리, 줄기, 잎 등에서 조직-특이성 프로모터의 사용에 의해 발현될 수 있다.
식물 생명 주기의 특정 발달 단계에서 활성인 프로모터가 또한 진균 감염증 및/또는 손상에 대한 저항성을 최적화하는 데(이것이 가장 필요한 것일 경우) 사용될 수 있다.
인트론
인트론 역시, 특히, 관심 대상 염기서열이 외떡잎식물에서 발현되어야 할 경우, DNA 발현 작제물에 포함될 수 있다. 외떡잎식물에 사용하기 위해, 옥수수 hsp70 인트론(미국 특허 제5,424,412호; 그 전체가 본원에 참조로 편입됨), 옥수수 유비퀴틴 인트론, Adh 인트론 1(Callis 등, 1987), 수크로스 합성효소 인트론(Vasil 등, 1989) 또는 쌀 Actl 인트론 (McElroy et al, 1990)과 같은 인트론이 사용될 수 있다. 유용한 쌍떡잎식물 인트론에는 이식유전자에 작동가능하게 통합된 바 있는 인트론들, 예컨대 CAT-1 인트론(Cazzonnelli and Velten, 2003), pKANNIBAL 인트론 (Wesley et al, 2001; Collier et al, 2005), PIV2 인트론(Mankin et al, 1997) 및 "수퍼 유비퀴틴" 인트론(미국 특허 제6,596,925호, 그 전체가 본원에 참조로 편입됨; Collier 등, 2005)이 포함된다. 이와 같은 예시적 인트론의 군은 비제한적이며, 당해 기술의 숙련가가 본 발명의 실행 시 본원에 명백히 언급되지 않은 다른 인트론들을 활용할 수 있음이 이해되어야 한다.
본 발명의 어떤 구현예에는 식물 세포로부터 성숙한 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 분비를 촉진하는 신호 펩티드를 인코딩하는 염기서열이 포함된다. MtDef5.1α-5.6 cDNAs(서열번호 l 및 4 내지 9)의 일부분에는 식물 또는 다른 세포로부터 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 분비하기 위해 사용될 수 있는 MtDef5 신호 펩티드를 인코딩하는 염기서열(서열번호 30 내지 35)이 함유된다.
MtDef5 신호 펩티드-인코딩 염기서열이 다양한 방식으로 본 발명의 DNA 작제물에 사용될 수 있다. 이와 같은 MtDef5 신호 염기서열은 소정의 MtDef5 cDNA 또는 게놈 클론에서 소정의 MtDef5 전구체 단백질 코딩 염기서열과 연관된 MtDef5 신호 염기서열일 수 있다. 선택적으로, 상기 MtDef5 신호 펩티드가 별개의 성숙한 MtDef5 단백질(또는 MtDef5 펩티드)-인코딩 염기서열에 작동가능하게 연결될 수 있다(즉, 별개의 게놈 또는 cDNA 클론에서 유도된 MtDef5 신호 펩티드 및 성숙한 단백질(또는 펩티드)-인코딩 염기서열이 작동가능하게 연결될 수 있다). 상기 DNA 작제물에서, MtDef5 신호 펩티드 및 성숙한 MtDef5 단백질을 모두 포함하는 MtDef5 전구체 단백질 중 어느 하나를 인코딩하는 뉴클레오티드 염기서열 역시 2개의 별개의 신호 펩티드 및 성숙한 MtDef5 단백질-인코딩 염기서열 대신 사용될 수 있다. 이와 같은 염기서열에 의해 인코딩되는 MtDef5 전구체 단백질에는, 비제한적으로, 서열번호 1 및 4 내지 9를 포함하는 MtDef5 전구체 단백질 염기서열, 이와 같은 염기서열과 최소한 약 70%의 염기서열 동일성을 갖는 단백질, 및 이와 같은 염기서열의 생물학적 기능성 등가물이 포함된다. 상기 MtDef5 신호 펩티드가 사용되어 외떡잎식물 또는 쌍떡잎식물 세포 중 하나로부터 성숙한 MtDef5 단백질 및 펩티드가 분비될 수 있을 것으로 기대된다. 상기 MtDef5 신호 펩티드 염기서열를 인코딩하는 합성 뉴클레오티드 염기서열 역시 사용될 수 있다. 이와 같은 합성 염기서열은 유전암호의 적용을 통해 본원에 개시된 MtDef5 신호 펩티드 서열에서 연역될 수 있다. 표 1에 세포로부터 성숙한 MtDef5 또는 기타 단백질을 분비하기 위해 사용될 수 있는 MtDef5 및 기타 신호 펩티드의 목록이 제시된다.
Figure 112015115776816-pct00001
선택적으로, 다른 메디카고 디펜신 단백질(Hanks et al, 2005)에서 유도된 신호 펩티드 서열이 사용될 수 있다. 이와 같은 다른 메디카고 디펜신 단백질 신호 펩티드의 예에는, 비제한적으로, MtDefl.l, MsDefl.6 및 MtDef2.1의 신호 펩티드가 포함된다. 외떡잎식물에 사용될 수 있는 유용한 신호 펩티드-인코딩 염기서열의 또 다른 예는 보리 시스테인 엔도프로테나제 유전자에서 유도된 신호 펩티드이다(Koehler and Ho, 1990). 쌍떡잎식물에 사용될 수 있는 유용한 신호 펩티드-인코딩 염기서열의 또 다른 예는 담배 PRlb 신호 펩티드이다. 이와 같은 신호 펩티드 군은 예시적이고 비제한적인 것이고, 당해 기술의 숙련가는 본 발명의 실행 시, 본원에 명백하게 언급되지 않은 다른 신호 펩티드를 활용할 수 있다.
본 발명에서, 성숙한 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 염기서열은 전형적으로 신호 펩티드-인코딩 염기서열에 연결된다. 다양한 성숙한 MtDef5 단백질 및 펩티드를 인코딩하는 다양한 DNA 염기서열들이 본 발명을 실행하는 데 사용될 수 있다. 상기 DNA 염기서열은, 비제한적으로, 서열번호 16 내지 22 및 49 내지 64에 표시된 아미노산 염기서열 및 상기 아미노산 염기서열들 중 어느 하나의 생물학적 기능성 등가물을 포함하는, 성숙한 MtDef5 단백질 및 펩티드를 인코딩할 수 있다. MtDef5 전구체 단백질, 성숙한 단백질, 또는 펩티드의 생물학적 기능성 등가물에는 또한 비제한적으로, 서열번호 1, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64 중 어느 하나와 최소한 약 85%의 염기서열 동일성을 갖는 MtDef5 전구체 단백질, 성숙한 단백질 및 펩티드가 포함된다. 본 발명의 어떤 구현예에서, 성숙한 MtDef5 단백질- 또는 펩티드-인코딩 염기서열은 메디카고 트룬카툴라 식물 조직에서 수득된 게놈 DNA 또는 cDNA 중 하나로부터 물리적으로 유도되거나 또는 수득될 수 있다. 메디카고 트룬카툴라에서 유사한 디펜신 유전자들을 수득하기 위한 방법들이 기술된 바 있다(Hanks et al, 2005). 본연의 또는 내생적 MtDef5-인코딩 뉴클레오티드 염기서열이, 일반적으로 상기 내생적 MtDef5 프로모터 염기서열의 제어 하에 발현되는 쌍떡잎식물에서 유도된다. 결과적으로, 상기의 내생적 또는 자연발생적 MtDef5-인코딩 뉴클레오티드 염기서열이 식물에서 발현될 수 있을 것으로 기대된다. 일반적으로, MtDef5 단백질 및 펩티드를 인코딩하는 핵산은 MtDef5 공통 뉴클레오티드 염기서열에서, MtDef5 폴리펩티드 염기서열의 "역-번역"에 의해 유도된 합성 MtDef5 유전자에서, 게놈 클론에서, 게놈 클론에서 유도된 연역된 코딩 염기서열에서, cDNA 또는 EST 염기서열에서, 그리고 돌연변이 유도을 거친 바 있는 상기의 염기서열들 중 어느 것에서, 수득될 수 있다. 성숙한 MtDef5 단백질-인코딩 뉴클레오티드 염기서열을 함유하는 핵산의 예에는, 비제한적으로, 서열번호 10 내지 15 및 23 내지 29가 포함된다. 다양한 MtDef5 단백질 및 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 염기서열은 또한, 연역된 인트론 염기서열을 제거하여 MtDef5 단백질 및 펩티드에 대한 상기의 연역된 MtDef5 코딩 염기서열을 수득함으로써, 게놈의 염기서열로부터 수득될 수 있다. MtDef5 게놈 클론에서 상기 인트론 염기서열의 제거는 체외 돌연변이 유도 기법에 의해 야기될 수 있다. 선택적으로, 상기 인트론 염기서열은 가상환경(컴퓨터 파일에서)에서에서 제거될 수 있고, 결과적으로 연역된 코딩 염기서열은 표준 DNA 합성 기법에 의해 합성된다. 밀접하게 관련된 식물 메디카고 사티바가 본 발명의 MtDef5 단백질 및 펩티드와 동일하거나, 또는 그 외에 생물학적으로 동등한 MsDef4 단백질을 인코딩하는 MsDef4 EST의 원천일 수 있음에 또한 주목해야 한다.
본 발명의 MtDef5 단백질 및 펩티드를 인코딩하는 뉴클레오티드 염기서열 역시 따라서 다른 메디카고, 예컨대 메디카고 사티바에서 유도될 수 있고, 본 발명에 사용될 수 있다. 성숙한 MtDef5 단백질 및 펩티드를 인코딩하는 염기서열을 함유하는 앞서 언급된 뉴클레오티드 염기서열의 일부분이, 표준 재조합형 DNA 기법, 또는 DNA 합성 방법을 통해, 이들이 일반적으로 연결되는 본연의 MtDef5 신호 펩티드 서열 또는 또 다른 신호 펩티드에 작동가능하게 연결될 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 상기 MtDef5-인코딩 뉴클레오티드 염기서열이 본원에 개시된 MtDef5 단백질 또는 펩티드 염기서열에서 새로(de novo) 합성될 수 있다. MtDef5-인코딩 뉴클레오티드 염기서열의 염기서열이 유전암호의 사용을 통해, 상기 MtDef5 단백질 또는 펩티드 염기서열에서 연역될 수 있다. "BackTranslate"(GCG™ Package, Acclerys, Inc. San Diego, CA)와 같은 컴퓨터 프로그램이 사용되어 단백질 또는 펩티드 염기서열을, 상기 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 상응하는 뉴클레오티드 염기서열로 전환할 수 있다.
추가로, 상기 합성 MtDef5-인코딩 뉴클레오티드 염기서열이 식물에서 최적으로 발현되도록 설계될 수 있다. 미국 특허 제5,500,365호에, 합성된 유전자에 의해 인코딩되는 단백질의 발현 수치를 최적화하기 위해 식물 유전자를 합성하는 방법이 기술되었다. 이와 같은 방법은 외래적 이식유전자의 구조적 유전자 염기서열의 변형에 관한 것으로, 이 방법은 이들을 좀 더 "식물-유사체"로 만들고, 따라서 좀 더 효율적으로 식물에 의해 전사되고, 공정되고, 번역되어 발현된다. 식물에서 잘 발현되는 유전자의 특성에는 식물 숙주에 의해 일반적으로 사용되는 코돈의 사용 및 유전자 전사체의 코딩 영역에서 바람직하지 않은 인트론 스플라이싱(splicing) 또는 아데닐산 중합반응을 유발할 수 있는 염기서열의 제거가 포함된다. 외떡잎 식물에서 이식유전자의 향상된 발현을 수득하기 위한 유사한 방법이 미국 특허 제5,689,052호에 개시되었다. 뿐만 아니라, 미국 특허 제5,500,365호 및 미국 특허 제5,689,052호에 개시된 상기 합성 설계 방법을 또한 사용하여 일반적으로 식물에서, 또는 특히 외떡잎식물에서의 발현을 위해 최적화된 신호 펩티드-인코딩 염기서열을 합성할 수 있다.
본 발명의 다른 구현예에서, 세포소 기관에서 MtDef5의 국재화(localization)를 허용하는, 펩티드를 인코딩하는 염기서열이 상기 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 염기서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 신호 펩티드에 작동가능하게 연결된 MtDef5 단백질 및 펩티드는 분비 경로로 진입할 것으로 예상되고, 소포체(ER)와 같은 기관에 의해 보존되거나 또는 적절한 보존 또는 표적형(targeting) 펩티드를 상기 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 C-말단에 작동가능하게 연결함으로써 액포에 적중될 수 있다. 액포를 표적으로 하는 펩티드의 예에는, 비제한적으로, 보리 렉틴 유전자에서 유래된 CTPP 액포-표적 신호가 포함된다. ER-표적 펩티드의 예에는, 비제한적으로, KDEL 아미노산 염기서열을 포함하는 펩티드가 포함된다.
소포체 또는 액포 중 하나에 MtDef5 단백질 및 펩티드의 국재화(Localization)는 형질전환 식물에서 증가된 발현 및/또는 형질전환 식물에서 균류 증식 억제의 증가된 효능과 같은 바람직한 특성들을 가능하게 한다.
앞서 논의된 바와 같이, 관심대상 염기서열이 또한 아데닐산중합반응 신호를 함유하는 3' 미번역된 영역에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이와 같은 아데닐산중합반응 신호는 RNA의 3' 말단에 폴리아데닐기 염기서열의 첨가를 허용한다. 아그로박테리움 종양-유도(Ti) 플라스미드 노팔린 합성효소(NOS) 유전자 3' 및 완두콩 ssRUBISCO E9 유전자 3' 미번역된 영역은 폴리아데닐기 신호를 함유하고 본 발명의 실행에 사용될 수 있는 그와 같은 3' 미번역 영역의 비제한적 예를 나타낸다. 이와 같은 예시적 아데닐산중합반응 영역의 예는 비제한적이며, 당해 기술의 숙련가가 본 발명의 실행에서 본원에 명백하게 언급되지 않은 기타 아데닐산중합반응 영역을 활용할 수 있음이 이해된다.
앞서 기술된 식물 발현 카세트를 포함하는 DNA 작제물이 전형적으로 다양한 벡터에서 유지된다. 벡터는 숙주 세포에서 벡터와, 공유결합으로 연결된 염기서열의 복제를 가능하게 하는 염기서열을 함유한다. 예를 들어, 박테리아 벡터는 하나 이상의 박테리아 숙주에서 상기 벡터의 복제를 허용하는 복제기점을 함유한다. 아그로박테리움-매개 식물 변형 벡터는 전형적으로 대장균 및 아그로박테리움 모두에서 복제를 허용하는 염기서열뿐만 아니라 상기 발현 카세트의 식물 염색체로의 통합을 허용하기 위해 배열된 하나 이상의 "경계" 염기서열을 포함한다. 이와 같은 아그로박테리움 벡터는 아그로박테리움 투메파시엔스 또는 아그로박테리움 리조게네스 중 하나에서 사용하기 위해 개조될 수 있다. 항생제에 대한 저항성을 부여하는 선택가능 표지-인코딩 유전자 역시 전형적으로 상기 벡터에 포함되어 박테리아 숙주에서의 그것의 보존을 가능하게 한다.
항진균성 식물의 수득 방법
식물 병원성 균류의 증식을 억제할 수 있는 형질전환 식물을 수득하는 방법이 또한 본 발명에 의해 제공된다. 우선, 다양한 쌍떡잎식물 및 외떡잎식물에서 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 발현에 적합한 발현 벡터가, 본원에 기술된 바와 같은 변형 기법을 사용하여, 식물, 식물 세포, 원형질체, 또는 식물 조직에 유입된다. 그러고 나서, MtDef5 발현 벡터를 함유하거나 또는 포함하는 형질전환 식물이 상기 발현 벡터를 수용한 식물, 식물 세포, 원형질체 또는 식물 조직에서 상기 형질전환 식물을 재생함으로써, 수득된다. 최종 단계는 성숙한 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 식물 병원성 균류 억제성 양만큼 발현하는 형질전환 식물을 수득하는 것으로, 여기서 "식물 병원성 균류 억제성 양만큼"이란 상기 형질전환 식물에서 균류 증식의 모든 주목할 만한 감소 및/또는 상기 형질전환 식물에서 균류 증식에 의해 초래되는 악영향의 모든 주목할 만한 감소를 제공하기에 충분한 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 수치이다.
MtDef5 발현 벡터는 모두 아그로박테리움-매개 변형, 리조비움-매개 변형, 사이노리조비움-매개 변형, 입자-매개 변형, DNA 형질주입, DNA 전기천공 또는 "위스커스"-매개 변형과 같은 방법들을 통해, 숙주 식물의 염색체에 유입될 수 있다. 앞서 언급된 이식유전자를 유입시키는 방법들은 당해 기술의 숙련가에게 잘 알려져 있고, 미국 특허 출원 No. 20050289673 (옥수수의 아그로박테리움-매개 변형), 미국 특허 제7,002,058호(대두의 아그로박테리움-매개 변형), 미국 특허 제6,365,807호(쌀의 입자 매개 변형) 및 미국 특허 제5,004,863호(면의 아그로박테리움-매개 변형)에 기술되었으며, 이들 각각은 그 전체가 본원에 참조로 편입되었다. 리조비움 또는 사이노리조비움과 같은 박테리아를 사용하여 식물을 변형시키는 방법들이 Broothaerts, et al, Nature. 2005, 10;433(7026):629-33에 기술되었다. MtDef5 발현 벡터는 부위-특이성 재조합효소, 예컨대 Cre, Flp, Gin, Pin, Sre, pinD, Int-B13 및 R에 의해 인식되는 cis-작용 부위-특이성 재조합 부위를 포함할 수 있음이 추가로 이해된다. 부위-특이성 재조합효소의 사용을 통해 특이적 위치의 DNA 분자를 형질전환 식물의 게놈에 통합시키는 방법이 이어서 사용될 수 있다(미국 특허 7,102,055). 당해 기술의 숙련가는 또한 이와 같은 모든 유전자 전이 기법들이 상기 발현 벡터를 식물 세포, 원형질체, 식물 조직 또는 식물의 염색체에 유입시키기 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
재조합형 미니염색체의 보존을 가능하게 하는 식물 동원체를 포함하는 식물 미니염색체를 형질전환 식물에 유입시키는 방법 또한 본 발명을 실행하는 데 사용될 수 있다(미국 특허 6,972,197). 본 발명의 이와 같은 구현예에서, 상기 형질전환 식물은 미니염색체를 숙주 식물의 염색체에 통합되지 않은 염색체외 요소로 품는다.
형질전환 식물은 전형적으로 관심대상 유전자(이 경우, MtDef5-인코딩 뉴클레오티드 염기서열)를 선택가능 표지 유전자에 연결하고, 연결된 이식유전자를 앞서 기술된 방법들 중 어느 하나를 사용하여 식물 세포, 원형질체, 식물 조직 또는 식물에 유입시켜서, 식물 증식에 대한 선택가능 표지 유전자의 발현을 필요로 하는 조건 하에서, 상기 형질전환 식물을 재생하거나 또는 그렇지 않으면 회수함으로써, 수득된다. 상기 선택가능 표지 유전자는 네오마이신 인산전이효소 단백질, 포스피노트리신아세틸전달효소 단백질, 글리포세이트 저항성 5-에놀-피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소(EPSPS) 단백질, 히그로마이신 인산전이효소 단백질, 디히드로프테로에이트 합성효소 단백질, 술포닐우레아 둔감 아세토락테이트 합성효소 단백질, 아트라진 둔감 Q 단백질, 브로목시닐 분해 가능 나이트릴라아제 단백질, 달라폰 분해 가능 데할로게나아제 단백질, 2,4-디클로로페녹시아세테이트 모녹시게나아제 단백질, 메토트렉세이트 둔감 디히드로엽산환원효소 단백질 또는 아미노에틸시스테인 둔감 옥토파인 합성효소 단백질을 인코딩하는 유전자일 수 있다. 각각의 유전자와 함께 사용되는 상응하는 선택적 제제는 네오마이신(네오마이신 인산전이효소 단백질 선택용), 포스피노트리신(포스피노트리신아세틸전달효소 단백질 선택용), 글리포세이트(글리포세이트 저항성 5-에놀-피루빌쉬키메이트-3-포스페이트 합성효소(EPSPS) 단백질 선택용), 히그로마이신(히그로마이신 인산전이효소 단백질 선택용), 술파디아진(디히드로프테로에이트 합성효소 단백질 선택용), 클로르술푸론(술포닐우레아 둔감 아세토락테이트 합성효소 단백질 선택용), 아트라진(아트라진 둔감 Q 단백질 선택용), 브로목시닐(나이트릴라아제 단백질 선택용), 달라폰(데할로게나아제 단백질 선택용), 2,4-디클로로페녹시아세트산(2,4-디클로로페녹시아세테이트 모녹시게나아제 단백질 선택용), 메토트렉세이트(메토트렉세이트 둔감 디히드로엽산 환원효소 단백질 선택용) 또는 아미노에틸시스테인(아미노에틸시스테인 둔감 옥토파인 합성효소 단백질 선택용)일 수 있다.
형질전환 식물은 또한 관심대상 유전자(이 경우, MtDef5-인코딩 뉴클레오티드 염기서열)을 채점가능 표지 유전자에 연결하고, 연결된 이식유전자를 앞서 기술된 방법들 중 어느 하나에 의해 식물 세포로 유입시키고, 상기 채점가능 표지 유전자의 발현에 대해 양성 결과를 나타내는 변형된 식물 세포에서 상기 형질전환 식물을 재생함으로써, 수득될 수 있다. 상기 채점가능 표지 유전자는 베타-글루쿠로니다아제 단백질, 녹색형광 단백질, 황색형광 단백질, 베타-갈락토시다아제 단백질, luc 유전자에서 유도된 발광 효소 단백질, lux 유전자에서 유도된 발광 효소 단백질, 시알리다아제 단백질, 스트렙토마이신 인산전이효소 단백질, 노팔린 합성효소 단백질, 옥토파인 합성효소 단백질 또는 클로람페니콜아세틸전달효소 단백질을 인코딩하는 유전자일 수 있다.
상기 발현 벡터가 식물 세포 또는 식물 조직에 유입된 경우, 상기 변형된 세포 또는 조직은 전형적으로 식물 전체의 형성을 촉진하는 환경 하에서 이와 같은 세포 또는 조직을 배양함으로서 식물 전체로 재성된다(즉, 잎, 줄기, 뿌리, 그리고 어떤 식물의 경우에는 생식 조직을 재생하는 과정). 단일 식물 원형질체 또는 다양한 외식편 중 하나에서 형질전환 식물의 발생 또는 재생은 당해 기술에 잘 알려져 있다(Horsch, R. B. 등 1985). 이와 같은 재생 및 증식 과정은 전형적으로 변형된 세포의 선택 단계 및 뿌리내린 묘목을 수확하는 조건 하에서 선택된 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 수득된 형질전환 뿌리내린 싹은 추후에 흙과 같은 적절한 식물 재배 배지에 옮겨 심는다. 선택적으로, 이식유전자는 또한 가피 단계 조직 배양을 거치지 않고 재생된 단리된 식물 싹 분열 조직 및 식물에 유입될 수 있다(미국 특허 7,002,058). 이식유전자가 직접 식물에 유입되거나, 또는 좀 더 구체적으로 식물의 분열 조직에 유입된 경우, 종자가 상기 식물에서 수확되어, 상기 이식유전자의 존재에 대해 선택되거나 또는 채점될 수 있다. 유성생식하는 형질전환 식물 종의 경우, 종자가 자가수분 또는 이종교배(out-crossed) (즉, 화수분 공여체 또는 수혜자로 사용됨)된 바 있는 식물에서 수집되어, 형질전환 식물 계통를 성립하여 유지시킬 수 있다. 유성생식하지 않는 형질전환 식물은 영양번식되어 형질전환 식물 계통을 성립하여 유지시킬 수 있다. 본원에 사용되는 "형질전환 식물 계통"은 이식유전자가 식물 게놈의 하나 이상의 위치에 삽입된 변형 사건에서 유도된 형질전환 식물들을 가리킨다. 관련 측면에서, 본 발명은 또한 상기 과정에 따라 생산된, 상기 변형된 식물에 의해 생산된 종자, 그와 같은 종자의 후손, 및 본래 형질전환 식물의 후손에 의해 생산된 종자를 모두 아우른다. 이와 같은 후손 및 종자는 그들의 게놈에 안정적으로 편입된 MtDef5 단백질- 또는 펩티드-인코딩 이식유전자를 갖고 있을 것이고, 이와 같은 후손 식물은 멘델의 방식으로 안정된 이식유전자의 유입에 의해 부여된 특질들을 물려받을 것이다. 게놈에 하나 또는 그 이상의 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 인코딩하는 형질전환 DNA 절편을 편입시킨 이와 같은 모든 형질전환 식물은 본 발명의 측면이다. 또한 본원에 기술된 DNA 작제물을 함유하는 형질전환 식물 및 이들로부터 유도된 물질들이 PCR의 사용 또는 DNA 작제물에서 상기 염기서열을 특이적으로 검출할 수 있는 기타 방법들을 통해, 확인될 수 있음이 인식된다.
형질전환 식물의 확인 및 MtDef5 발현의 정량화
일단 형질전환 식물이 재생되거나 회수되면, 식물 병원성 균류 억제성 양만큼의 MtDef5를 발현하는 형질전환 식물을 확인하거나 또는 수득하기 위한 다양한 방법이 사용될 수 있다. 하나의 일반적 방법 세트는 생산된 MtDef5의 양을 측정하는 분석을 수행하는 것이다. 예를 들어, MtDef5를 인식하는 항체를 활용하는 다양한 항체-기반 검출 방법을 사용하여 생산된 MtDef5의 양을 정량화할 수 있다. 이와 같은 항체-기반 분석의 예에는 비제한적으로, ELISA, RIA, 또는 MtDef5-인식 항체가 효소, 동위원소, 형광발색단, 란탄계열원소 등으로 검출가능하게 표지되는 것인 기타 방법들이 포함된다. 그와 같은 분석에서 정제 또는 단리된 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 참조 기준으로 사용함으로써(즉, MtDef5의 알려진 양 제공), 식물 물질 1그램 당 몰 또는 식물 물질 1그램 당 질량으로 식물 조직에 존재하는 MtDef5의 양이 측정될 수 있다. MtDef5 단백질 또는 펩티드는 전형적으로 "백만분율" 즉 "PPM"의 수치로 형질전환 식물에서 발현되는데, 이때 생중량 식물 조직의 그램단위 양에 마이크로그램단위의 MtDef5가 존재한다. 이와 같은 경우에, 생중량 식물 조직 1그램 당 MtDef5 1마이크로그램이 MtDef5 농도 1 PPM을 나타낸다. MtDef5 단백질 또는 펩티드의 식물 병원성 균류 억제성 양은 최소한 약 0.05 PPM(즉, 생중량 식물 조직 1g당 MtDef5 단백질 또는 펩티드 0.05μg)이다. 바람직한 구현예에서, MtDef5의 식물 병원성 균류 억제성 양은 최소한 약 0.5 PPM이다. 가장 바람직한 구현예에서, MtDef5의 양은 최소한 약 1.0 PPM이다. 가장 바람직한 구현예에서, MtDef5 단백질 또는 펩티드의 양은 최소한 약 2.0 PPM이다.
선택적으로, 형질전환 식물에 의해 생산된 MtDef5-인코딩 mRNA의 양은 MtDef5를 식물 병원성 균류 억제성 양만큼 발현시키는 식물을 확인하기 위해 측정될 수 있다. 생산된 단백질의 양을 생산된 RNA의 양과 연관시키는 기법은 당해 기술의 숙련가에게 잘 알려져 있고, 특이성 RNA(즉, MtDef5 mRNA) 수치를 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 수치(면역학 또는 기타 방법에 의해 측정)에 연관시키는 표준 곡선의 구성과 같은 방법들이 포함된다. MtDef5 mRNA의 정량화 방법은 전형적으로 MtDefi mRNA 또는 cDNA(보완적 DNA)로의 폴리뉴클레오티드의 특이적 혼성화 또는 MtDef5 RNA에서 유도된 PCR 생성물을 필요로 한다. 이와 같은 폴리뉴클레오티드 프로브는 MtDef5-인코딩 이식유전자의 센스 및/또는 안티센스 가닥 뉴클레오티드 염기서열 중 하나에서 유도될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 프로브의 MtDef5 mRNA 또는 cDNA로의 혼성화는 예컨대, 비제한적으로, 동위원소, 형광발색단, 란탄계열원소, 또는 합텐 예컨대 바이오틴 또는 디곡시게닌으로 표지된 프로브의 사용과 같은 방법에 의해 검출될 수 있다. 표지된 프로브의 혼성화는 MtDef5 RNA가 용액에 있거나 또는 막과 같은 고체 지지체에 고정되었을 때 검출될 수 있다. 정량적 역전사 효소 중합효소 연쇄반응(qRT-PCR)의 사용에 의해 MtDef5 RNA를 정량화할 때, MtDef5-유도 PCR 생성물이 앞서 언급된 표지된 폴리뉴클레오티드 프로브 중 어느 것의 사용에 의해, 끼어들기 염색(intercalating dye), 예컨대 브롬화 에티듐 또는 SYBR 초록의 사용에 의해, 또는 형광발색단 및 소광제를 함유하는 혼성화 프로브의 사용에 의해 검출되어, 상기 형광발색단이 PCR 반응에 사용되는 중합효소의 5' 뉴클레아제 활성에 의해 방출될 때(즉, TaqMan™ 반응; Applied Biosystems, Foster City, CA) 또는 상기 형광발색단 및 소광제가 상보적 가닥의 중합효소-매개 합성에 의해 대체될 때(즉, Scorpion™ 또는 Molecular Beacon™ 프로브), 상기 형광발색단에서의 방출이 유일하게 검출된다.
qRT-PCR 분석을 수행하여 mRNA 수치를 정량화하는 다양한 방법들이 잘 성립되어 있다(Bustin, S.A.; 2002). 불일치된 핵산 복합체를 인식하는 효소의 작용에 의해 활성화되는 형광 프로브(즉, Invader™, Third Wave Technologies, Madison, WI) 역시 RNA 정량화에 사용될 수 있다. 당해 기술의 숙련가는 또한 정량적 핵산 염기서열 기반 증폭(Q-NASBA™)과 같은 RNA 정량화 기법이 MtDef5-인코딩 mRNA를 정량화하고 발현시키는 식물을 확인하기 위해 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
MtDef5 단백질 또는 펩티드를 식물 병원성 균류 억제성 양만큼 발현시키는 형질전환 식물은, 또한 식물 병원성 균류의 증식의 억제에 대해 그와 같은 식물을 직접 분석함으로써, 확인될 수 있다. 이와 같은 분석을 독립적으로 또는 MtDef5 발현 분석과 함께 사용하여 저항성 형질전환 식물을 확인할 수 있다.
어떤 식물 병원체 균류에 의한 어떤 식물의 감염은 관측이 용이한, 식물 증식에 대한 뚜렷한 효과를 초래할 수 있다. 결과적으로, MtDef5-인코딩 이식유전자로 변형된 식물을 간단히 병원성 식물 균류로 감염시키고, 그와 같은 감염과 일반적으로 연관된 증상의 감소를 관찰함으로써, MtDef5-발현 형질전환 식물을 구별할 수 있다. MtDef5-인코딩 이식유전자를 함유하지 않는 것 외에는 동일한 비-형질전환 대조군 식물을, MtDef5-인코딩 이식유전자를 함유한 형질전환 식물을 감염시키기 위해 사용된 식물 병원성 균류와 동일한 유형 및 동일한 용량으로 공동감염시킴으로써, 이와 같은 관찰이 수월해진다. 진균 감염증을 방제 또는 퇴치하는 형질전환 식물은 질병 증상의 감소의 관측을 토대로, 감염된 식물에서 균류 증식의 감소 측정(예컨대, 감염된 조직 1그램 당 콜로니 형성 단위의 개수를 측정함으로써) 및/또는 감염된 식물 조직에 존재하는 진균독의 양의 측정에 의해 확인될 수 있다. 버티실리움 달리아에 저항성이 있는 형질전환 MsDefl-발현 감자 식물을 확인하기 위한 발현 분석과 함께, 균류 질병 중증도 분석 및 콜로니 형성 분석의 사용이 기술된 바 있다(미국 6,916,970 및 Gao et al, 2000). 이와 유사하게, 균류 병원체를 퇴치 또는 방제하는 다양한 MtDef5-발현 형질전환 식물은, 이와 같은 식물을 감염시키는 균류 병원체에 대한 저항성에 대해 상기 형질전환 식물의 점수를 매김으로써, 식별될 수 있을 것으로 기대된다. 질병 증상의 감소 또는 균류 증식의 감소를 관측함으로써 분석될 수 있는 MtDef5 이식유전자-부여 균류 저항성에는, 비제한적으로, 형질전환 옥수수의 푸사리움 베르티실리오이데스(Fusarium verticillioides), 푸사리움 모닐리포르메(Fusarium moniliforme), 스테노카르펠라 마이디스(Stenocarpella maydis), 및/또는 케르코스포라 제애마이디스(Cercospora zeae-maydis)에 대한 저항성; 형질전환 밀의 이삭마름병(푸사리움 그래미니아룸), 흰가루곰팡이병( 에리시페 그라미니스 f. sp. 트리티치), 또는 잎 녹병(푸치니아 레콘디타 f. sp. 트리티치)에 대한 저항성; 형질전환 면의 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporum)에 대한 저항성; 형질전환 쌀의 마그나포르테 그리세아(Magnaporthe grisea) 및 리족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 저항성 및 형질전환 대두의 아시안 대두녹병(파콥소라 파키리지(Phakopsora pachyrhizi)), 파이토프토라 뿌리 썩음병(파이토프토라(Phytophthora sp.)), 흰곰팡이병(스클레로티니아(Sclerotinia sp.)), 돌연사증후군(푸사리움 솔라니(Fusarium solani)) 및/또는 갈색 줄기 썩음병(피알로포라 그레가타(Phialophora gregata))에 대한 저항성이 포함된다.
MtDef5를 식물 병원성 균류 억제성 양만큼 발현시키는 형질전환 식물은, 그와 같은 식물에서의 균류 증식에 의해 초래되는 악영향의 감소를 측정함으로써, 확인될 수 있다. 이와 같은 감소는 MtDef5를 발현하지 않는 것 이외에는 동일한 비-형질전환 대조군 식물과 대비하여, MtDef5-발현 형질전환 식물에서의 악영향의 범위를 비교함으로써, 확인될 수 있다. 측정될 수 있는, 식물에서의 균류 증식의 악영향에는 모든 유형의 식물 조직 손상 또는 괴사, 모든 유형의 식물 수확량 감소, 작물 식물 생성물의 가치의 모든 감소, 및/또는 바람직하지 않은 균류 대사물질 또는 균류 증식 부산물, 예컨대 비제한적으로, 진균독의 생산이 포함된다. 진균독은 균류종들에 의해 생산되는 수 많은 독소 분자들, 예컨대, 비제한적으로 폴리케티드(아플라톡신, 데메틸스테리그마토시스틴, O-메틸스테리그마토시스틴 등 포함), 푸모니신, 알페리신(예컨대, Als　A2, Bls　B2), 스핀고푼진(A, B, C 및 D), 트리코데케네스(trichothecenes), 푸미푼진스 등을 포함한다. 진균독 수치를 정량화하는 방법들이 널리 문서화되어 있다. 게다가, 아플라톡신, 푸모니신, 디옥시니발레놀 및 제아라레논과 같은 진균독의 측정을 위한 상용 키트가 또한 사용가능하다(VICAM, Watertown, MA, USA).
표적 식물/관심대상 식물
다양한 식물이 MtDef5-발현 벡터로 변형되어 진균 감염증을 퇴치 또는 방제하고, 또는 그와 같은 감염에 저항하는 형질전환 식물이 수득된다. 관심대상 식물에는 앞서 열거된 식량 작물 식물 및 생물연료 또는 에너지 작물 식물이 포함된다. 본원에 기술된 발현 벡터 및 방법에 의해 수득가능한 형질전환 외떡잎식물에는 비제한적으로 보리, 옥수수, 아마, 귀리, 쌀, 호밀, 수수, 잔디풀, 사탕수수 및 밀이 포함된다. 본원에 기술된 발현 벡터 및 방법에 의해 수득가능한 형질전환 쌍떡잎식물에는, 비제한적으로, 알팔파, 애기장대, 배럴 메틱(barrel medic), 바나나, 브로콜리, 콩, 양배추, 유채, 당근, 카사바, 콜리플라워, 셀러리, 감귤류, 면, 조롱박, 유칼립투스, 마늘, 포도, 양파, 상추, 완두콩, 땅콩, 후추, 감자, 포플러, 소나무, 해바라기, 홍꽃, 대두, 딸기, 사탕무, 고구마, 담배 및 토마토가 포함된다.
적층 유전자: 다중 저항성
식물에서 다중 항진균성 및/또는 기타 항-병원체 단백질의 동시 공동 발현은, 식물 병원체의 둘 이상의 방제 방식을 활용하기 때문에, 유용하다. 이것은, 둘 이상의 항진균성 단백질이 발현되는 것으로, 내성 균류 종의 발달 가능성을 최소화하고, 저항성의 범위를 넓히고, 잠재적으로 상승적인 항진균성 효과를 초래함으로써, 저항성의 수준을 향상시킨다.
본 발명의 MtDef5 분자들을 인코딩하는 DNA와 공동발현될 수 있는, 어떤 이점들을 부여하는 기타 단백질에는 하기가 포함된다: (1) 효소, 예컨대 글루코오스 산화효소(글루코오스를 글루콘산으로 전환하고, 부수적으로 식물 병원체에 광범위한 저항성을 부여하는 과산화수소를 생산함); 피루빈산염 산화효소; 옥살산염 산화효소; 콜레스테롤 산화효소; 아미노산 산화효소; 및, 분자 산소를 과산화물, 예컨대 과산화수소를 생산하는 1차 또는 2차 기질로 사용하는 기타 산화효소를 인코딩하는 DNA들; (2) 발병-관련 단백질, 예컨대 SAR8.2a 및 SAR8.2b 단백질; 산성 및 염기성 형태의 담배 PR-la, PR-lb, PR-lc, PR-Γ, PR-2, PR-3, PR-4, PR-5, PR-N, PR-O, PR-O*, PR-P, PR-Q, PR-S 및 PR-R 단백질; 키틴 분해효소, 예컨대 담배 염기성 키틴 분해효소 및 오이 키틴 분해효소/라이소자임; 페록시다아제, 예컨대 오이 염기성 페록시다아제; 글루카나아제, 예컨대 담배 염기성 글루카나아제; 오스모틴-유사 단백질; (3) 바이러스 캡시드 단백질 및 식물 바이러스의 레플리카아제; (4) 식물 R-유전자(저항성 유전자) 및 이것의 상동체, 예컨대, 비제한적으로 애기장대 RPS2 (Bent et al, 1994), 애기장대 RPM1 (Grant et al, 1995), 담배 N-유전자 및 N'-유전자, 토마토 Cf-9, 아마 L6 및 쌀 Xa21; (5) 병원체- 또는 화학적-유도가능 프로모터를 사용하여 발현될 수 있는, 병원체 Avr 유전자, 예컨대 클라도스포리움 풀붐(Cladosporium fulvum) Avr9; (6) 살리실산의 생합성에 관여하는 유전자, 에컨대 벤조산 2-수산화효소; 및 (7) MtDef5의 작용기작과 별개의 항진균성 작용기작을 갖는 기타 디펜신 단백질, 예컨대 비제한적으로, MsDefl , MtDef2, NaD 1 , Rs-AFP 1 및 Rs-AFP2가 포함된다. 균류 병원체 감염에 대한 저항성을 부여하기 위해 본 발명의 MtDef5 디펜신과 함께 형질전환 식물에서 공동발현될 수 있는 기타 항진균성 단백질에는 KP4 및 KP6 단백질이 포함된다.
MtDef5 단백질 및 펩티드를 발현시키는 형질전환 식물에서 해충 및 제초제 저항성 유전자의 공동-발현은 추가적인 농업적 혜택을 부여한다. 이와 같은 형질전환 식물의 게놈은 따라서 하기를 포함할 수 있다:
예를 들어, MsDefl, MtDef2, MtDef4, NaDl, Rs-AFPl, Rs-AFP2, KP4 및 KP6으로 이루어진 군에서 선택되는 식물 디펜신을 인코딩하는 DNA(이와 같은 DNA가 발현되어 항진균성 유효량의 상기 디펜신을 생산함), 및/또는
바실러스 투린지엔시스 내독소를 인코딩하는 DNA(이와 같은 DNA가 발현되어 항-해충 유효량의 바실러스 투린지엔시스 내독소를 생산함), 및/또는
이와 같은 식물에 제초제 저항성을 부여하는 단백질을 인코딩하는 DNA (이와 같은 DNA가 발현되어, 제초제 저항성을 부여하는, 항-제초제 유효량의 단백질을 생산함).
효모 발현 벡터 및 변형 시스템
효모에서의 MtDef5 단백질 및 펩티드의 발현이 본원에서 구체적으로 고안되었다. 다양한 효모 속에서 이종 단백질의 생산을 위한 발현 벡터의 구성이 잘 성립되어 있다. 일반적으로, 이와 같은 발현 벡터는 전형적으로 아데닐산중합반응 또는 종결자 영역에 작동가능하게 연결된 관심대상 염기서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 이종 유전자를 성공적으로 발현시키기 위해 사용되어 온 효소 속의 예에는 칸디다, 클루베로마이세스, 한수엘라, 피치아, 사카로미세스, 스키조사카로미세스 및 야로이야가 포함된다. 사카로미세스에 대한 발현 벡터 및 변형 시스템의 일반적 설명이 Kingsman et al (1985)에서 발견된다. 사카로미세스 이외의 효모에 유용한 발현 벡터 및 변형 시스템이 Reiser et al (1990)에 기술되어 있다.
일반적으로, 상기 프로모터 및 아데닐산중합반응 영역이 바람직한 효모 숙주에서 그들의 작동가능성을 기반으로 선택된다. 예를 들어, 피치아의 AOX1 또는 AOX2 프로모터가, 이종 단백질, 예컨대 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 발현시키기 위해, 피치아의 AOX1, AOX2, p40 또는 p76 아데닐산중합반응 염기서열과 함께 사용될 수 있다. AOX1 및 AOX2 프로모터 둘 다 특히 피치아에서 유용한데, 이것은 두 프로모터 모두 증식 배지에 메탄올의 첨가에 의해 유도될 때, 연결된 이종 유전자의 풍부한 발현을 허용하기 때문이다. 이와 같은 피치아 프로모터 및 아데닐산중합반응 염기서열의 사용이 미국 특허 4,855,231(그 전체가 명백히 본원에 참조로 편입됨)에 기술되었다.
이와 유사하게, 한수엘라 MOX, DHAS 또는 FMDH 프로모터가 사용되어 한수엘라에서 MtDef5와 같은 이종 단백질을 발현시킬 수 있다. MOX, DHAS 또는 FMDH 프로모터는 특히 한수엘라에서 유용한데, 이것은 이들 프로모터가 증식 배지에 메탄올의 첨가에 의해 유도될 때 연결된 이종 유전자의 풍부한 발현을 허용하기 때문이다. 한수엘라에서 MOX 및 DHAS 프로모터의 사용이 미국 특허 5,741,672에 기술된 반면, 한수엘라에서 FMDH 프로모터의 사용이 미국 특허 5,389,525(그 전체가 명백히 본원에 참조로 편입됨)에 기술되었다.
클루베로마이세스의 경우, 락타아제 프로모터 및 아데닐산중합반응 염기서열을 사용하여 MtDef5와 같은 이종 유전자를 발현시킬 수 있다. 락타아제 프로모터 및 아데닐산중합반응 염기서열에 작동가능하게 연결된 이종 유전자의 발현이 갈락토오스의 존재 하에 클루베로마이세스를 증식시킴으로써 달성된다. 클루베로마이세스에 락타아제 프로모터 및 아데닐산중합반응 염기서열의 사용이 미국 특허 6,602,682(그 전체가 명백히 본원에 참조로 편입됨)에 기술되어 있다.
변형된 효모에 의한 MtDef5와 같은 이종 단백질의 증식 배지로의 분비를 가능하게 하는 효모 발현 벡터 또한 고안되었다. 성숙한 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 분비는 전형적으로 성숙한 MtDef5 단백질-또는 펩티드-인코딩 염기서열로의 신호 펩티드 서열 또는 신호 펩티드 및 전구체 펩티드 염기서열의 작동가능 연결에 의해 달성된다. 효모에서 이종 단백질의 분비를 위해 유용한 신호 펩티드의 예에는, 비제한적으로 α-인자 신호 펩티드, 인버타제 신호 펩티드 및 PHOl 신호 펩티드가 포함되고, 이들 모두는 효모에서 유도된 것이다. 상기 α-인자 신호 펩티드는 전형적으로 사카로미세스, 클루베로마이세스, 또는 칸디다에서 유도되는 반면, 상기 PHOl 신호 펩티드는 피치아에서 유도된다.
효모에서 단백질 분비에 특히 유용한 신호 펩티드 서열 또는 신호 펩티드 및 전구체 펩티드 염기서열은 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) α-인자에서 유도되고, 미국 특허 4,546,082, 4,588,684, 4,870,008 및 5,602,034에 기술되어 있다. 상기 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) α-인자 신호 펩티드 및 전구체 펩티드 염기서열은 사카로미세스 세레비지에(S. cerevisiae) 알파-교배 인자 유전자(GenBank 승인번호: P01149)의 1차 미공정 번역 생성물의 아미노산 1 내지 83으로 구성된다. 어떤 구현예에서, 아미노산 1 내지 약 19 내지 23의 알파-교배 인자 전구체 단백질을 포함하는 알파-교배 인자의 신호 펩티드 서열은 성숙한 MtDef5 단백질의 N-말단에 직접 연결되어 성숙한 MtDef5 단백질의 분비를 가능하게 할 수 있다. 이와 같은 경우에, 상기 신호 펩티드는 분비 과정 중 상기 성숙한 MtDef5 단백질에서 쪼개진다. 선택적으로, 알파-교배 인자의 신호 펩티드 및 전구체 펩티드는 스페이서 염기서열을 통해 성숙한 MtDef5-인코딩 염기서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 이와 같은 스페이서 염기서열은 관심대상 리더 염기서열 및 유전자의 단백질 분해 가공과정을 가능하게 하는 다양한 염기서열을 포함할 수 있다. 본연의 사카로미세스 세레비지에 알파-교배 인자 유전자에서, 상기 스페이서 염기서열은 아미노산 잔기 84~89에 상응하고, 염기서열 Lys84-Arg85-Glu86-Ala87-Glu88-Ala 89로 표현된다. 염기서열 Lys-Arg는 KEX2 프로테아제 인식 부위에 사응하는 반면, Glu-Alα-Glu-Ala 염기서열은 복제된 디펩티딜암모펩티다아제 또는 STE13 인식 부위에 상응한다. 어떤 구현예에서는, 89 아미노산 사카로미세스 세레비지에 알파 인자 신호, 전구체 펩티드코딩 영역 및 전체적인 본연의 스페이서 코딩 영역(즉, 잔기 84 및 85 모두에 Lys-Arg KEX2 프로테아제 쪼개짐 부위를 함유하고, 또한 잔기 86-89에 Glu-Alα-Glu-Ala 디펩티딜암모펩티다아제 또는 STE13 인식 부위를 함유하는 알파 교배 인자 전구체 단백질의 N-말단 89 아미노산 잔기)를 인코딩하는 DNA 절편이 성숙한 MtDef5 단백질을 인코딩하는 염기서열에 작동가능하게 연결된다. 알파 교배 인자 전구체 단백질의 N-말단 89 아미노산이 MtDef5와 같은 이종 단백질의 N-말단에 융합될 때, 상기 전구체 펩티드 염기서열은 전형적으로 KEX2 또는 STE13 인식 부위 중 한 곳에서 내생적 효모 프로테아제에 의한 쪼개짐을 통해, 상기 이종 단백질에서 분리된다. 다른 구현예에서, 소형화 85 아미노산 사카로미세스 세레비지에 알파 인자 신호 펩티드, 전구체 펩티드 및 KEX2 스페이서 요소(즉, 잔기 84 및 85에 바로 Lys-Arg KEX2 프로테아제 쪼개짐 부위를 함유하는 알파 교배 인자 전구체 단백질의 N-말단 85 아미노산 잔기)를 인코딩하는 DNA 절편이 성숙한 MtDef5 단백질을 인코딩하는 염기서열에 작동가능하게 연결된다. 알파 교배 인자 전구체 단백질의 N-말단 85 아미노산이 이종 단백질, 예켄대 MtDef5의 N-말단에 융합될 때, 상기 전구체 펩티드 염기서열은 전형적으로 KEX2 인식 부위에서 내생적 효모 프로테아제에 의한 쪼개짐을 통해 상기 이종 단백질에서 분리된다. MtDef5 단백질은 따라서 glu-ala 반복체 없이 발현될 수 있다.
MtDef5 단백질 및 펩티드를 발현시키는 변형된 효모를 수득하기 위해, 상기 효모 MtDef5 발현 카세트(예컨대, 효모 프로모터, 효모 신호 펩티드 인코딩 염기서열, 성숙한 MtDef5 단백질 염기서열 및 아데닐산중합반응 염기서열)가 전형적으로 변형된 효모의 선택을 가능하게 하는 다른 염기서열과 조합된다. 유용한 선택가능 표지 유전자의 예에는, 비제한적으로, ADE 단백질, HIS5 단백질, HIS4 단백질, LEU2 단백질, URA3 단백질, ARG4 단백질, TRP1 단백질, LYS2 단백질, 블레오마이신 또는 플레오마이신 항생제에 대한 내성을 부여하는 단백질, 클로람페니콜에 대한 내성을 부여하는 단백질, G418 즉 게네티신에 대한 내성을 부여하는 단백질, 히그로마이신에 대한 내성을 부여하는 단백질, 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 단백질, AR04-OFP 단백질 및 FZF1-4 단백질을 인코딩하는 유전자가 포함된다.
효모 MtDef5 발현 카세트 및 선택가능 표지 유전자를 포함하는 DNA 분자들이 기법, 예컨대 효모로의 형질주입, 스페로플라스트 또는 전기천공에 의해, 효모 세포에 유입된다. 본 발명의 어떤 구현에에서, 효모 MtDef5 발현 카세트 및 선택가능 표지 유전자를 포함하는 DNA 분자들이 변형된 효모 숙주 세포의 게놈에 통합되는 선형 DNA 절편으로서 유입된다. 통합은 효모 숙주 세포 게놈의 무작위 부위 또는 효모 숙주 세포 게놈의 특정 부위 중 하나에서 발생할 수 있다. 효모 숙주 세포 게놈의 특이적 부위에서의 통합은 전형적으로 발현 벡터에 함유된 염기서열들과 상기 효모 숙주 세포 게놈의 염기서열들 사이의 상동 재조합에 의해 달성된다. 상동 재조합은 전형적으로 상동 염기서열 내(예를 들어, 피치아 숙주 세포의 내생적 AOX1 유전자에 상기 발현 벡터를 통합할 때, 피치아 발현 벡터의 AOX1 프로모터 염기서열 내) 발현 벡터를 선형화함으로써 달성된다. 본 발명의 다른 구현예에서, 상기 효모 발현 카세트는 또한 발현 카세트를 염색체외(비통합된) 요소로서 함유하는 DNA의 복제를 가능하게 하는 추가적 염기서열, 예를 들어 자기 복제 염기서열(ARS)을 포함할 수 있다. 이와 같은 염색체외 요소들은 전형적으로 연결된 선택가능 표지 유전자의 존재에 대한 지속적인 선택에 의해, 효모 세포에 유지된다. 복제 및 유사분열 전달을 가능하게 하는 염기서열을 함유하는 효모 인공 염색체(YACs)는 효모 숙주에 DNA 작제물을 유지하기 위해 사용될 수 있는 또 다른 유형의 벡터이다.
효모에서 MtDef5 단백질의 생산 방법
효모 MtDef5 발현 카세트로 변형된 효모 세포를 사용하여 MtDef5 단백질 및 펩티드를 생산할 수 있다. 이와 같은 MtDef5 분자들이 직접적으로 항진균성 제제로 사용되어, MtDef5 단백질 또는 펩티드를 인식하는 항체를 증식하기 위한 면역원으로서, 또는 다양한 샘플에서 MtDef5 단백질의 농도를 측정하기 위한 키트에서 참조 표준으로서, 식물에 적용할 수 있는 항진균성 조성물을 생산할 수 있다. MtDef5 항진균성 분자들을 발현하는 상기 변형된 효모 세포는 또한 식물에 적용되어 병원성 진균 감염증을 퇴치/방제할 수 있다. MtDef5 단백질 및 펩티드를 생산하기 위한 방법은 전형적으로 우선 효모 세포가 성숙한 MtDef5 분자를 발현하는 조건 하에서, MtDef5 발현 카세트로 변형된 효모 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일반적으로, 효모 세포가 성숙한 MtDef5 분자들을 발현하는 조건은 효모 발현 카세트에서 MtDef5코딩 염기서열에 작동가능하게 연결된 효모 프로모터의 발현을 가능하게 하거나 또는 구체적으로 유도하는 조건이다. 상기 효모가 피치아이고 상기 신호-펩티드/MtDef5 유전자가 AOX1 또는 AOX2 프로모터의 제어 하에 있는 경우, 증식 배지에 메탄올 첨가가 성숙한 MtDef5 단백질의 발현을 가능하게 한다. 이와 유사하게, 상기 효모가 한수엘라이고 상기 신호-펩티드/MtDef5 유전자가 MOX, DHAS 또는 FMDH 프로모터의 제어 하에 있는 경우, 증식 배지에 메탄올 첨가가 성숙한 MtDef5 단백질의 발현을 가능하게 한다. 선택적으로, 상기 효모가 클루베로마이세스이고 상기 신호-펩티드/MtDef5 유전자가 락타아제 프로모터의 제어 하에 있는 경우, 증식 배지에 갈락토오스의 첨가가 성숙한 MtDef5 단백질의 발현을 가능하게 한다.
일단 변형된 효모 배양액이 성숙한 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 발현을 가능하게 하는 배양 조건 하에서, 충분한 시간 동안 배양되고 나면, 상기 성숙한 MtDef5 분자는 상기 배양액에서 단리될 수 있다. 상기의 충분한 시간은, 주기적으로 배양액의 일부 또는 분취액을 수확하여 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 존재에 대해 본석함으로써 결정될 수 있다. 분석적 검사법, 예컨대 단백질 염색을 이용한 SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 분석, 또는 모든 면역검출법(예컨대, ELISA)을 사용하여 MtDef5 생산을 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 1~8일 동안 메탄올의 존재 하에 배양은 피치아에서 AOX1 프로모터로부터 성숙한 MtDef5 단백질의 발현을 가능하게 하기에 충분하다.
상기 배양액에서 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 단리는 부분적 또는 온전할 수 있다. 효모 신호 펩티드가 성숙한 MtDef5 단백질을 인코딩하는 염기서열에 작동가능하게 연결된 MtDef5 발현 벡터의 경우, 상기 성숙한 MtDef5 단백질은 효모 세포 배양액 배지에서 회수될 수 있다. 성숙한 MtDef5 단백질을 함유한 효모 세포 배양액 배지는 원심분리 또는 여과로 효모 세포로부터 분리될 수 있어서, 성숙한 MtDef5 단백질의 단리를 이행시킨다. 성숙한 MtDef5 단백질을 함유하는 효모 세포 배양액 배지는 추가로 투석 및/또는 농축 기법(예컨대, 침전, 동결건조, 여과)의 조합에 의해 처리되어 MtDef5 단백질을 함유하는 조성물을 생산할 수 있다. MtDef5 단백질의 생산은 또한 MtDef5 단백질의 부분적으로 또는 완전히 순수한 제제를 생성하는 추가적인 정제 단게를 포함할 수 있다. 이와 같은 정제를 이행하기 위해, 여과 크기배제막이 사용될 수 있다. 선택적으로, 다양한 유형의 크로마토그래피 기법, 예컨대 크기배제 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 또는 친화성 크로마토그래피가 사용되어 부분적으로 또는 완전하게 순수한 MtDef5 단백질 제제를 생산할 수 있다.
다양한 단리 기법들의 조합이 또한 활용되어 성숙한 MtDef5 단백질을 생산할 수 있다. 예를 들어, 세포 배양액 배지가 원심분리에 의해 세포에서 분리되고, 투석 또는 조절될 수 있다. 투석 또는 조절을 위한 바람직한 완충용액은 약 pH4.5~pH6.0의 25mM 아세트산나트륨 완충용액이다. 이와 같은 투석액에 이어서 이온교환 크로마토그래피가 시행된다. 예를 들어, 양이온교환 수진, 예컨대 약 pH6.0의 25mM 아세트산나트륨 완충용액으로 평형을 맞춘 CM-Sephadex C-25가 사용될 수 있다. 양이온 교환 수지에 결합된 MtDef5 단백질은 세척되고, 이어서 용출된다. 예를 들어, 앞서 언급된 컬럼은 약 pH6.0의 25mM 아세트산나트륨완충용액으로 세척되고, 순차적으로 1M NaCl, 50mM Tris(pH7.6)에서 용출된다. 디펜신 단백질을 함유하는 분획이 검사 또는 UV 흡수에 의해 확인되고, 이어서 크기배제 여과막에 의해 농축된다. 농축된 MtDef5 단백질은 이어서 투석되어 바람직한 완충용액에서 근본적으로 순수한 MtDef5 단백질을 수득한다. 바람직한 완충용액에는, 비제한적으로, 완충용액, 예컨대 10 mM Tris(pH 7.6)가 포함된다.
MtDef5 염기서열에 보존적 아미노산 변화를 함유하는 펩티드, 폴립펩티드 및 단백질
생물학적으로 MtDef5 전구체 단백질, 성숙한 단백질 및 펩티드와 동등한 펩티드, 폴립펩티드 및 단백질에는, 비제한적으로, MtDef5 염기서열(본원에 기술된 서열번호 l, 3 내지 9, 16 내지 22 및 49 내지 64)에 보존적 아미노산 치환을 함유하는 아미노산 염기서열이 포함된다. 이와 같은 아미노산 염기서열에서, 상기 염기서열 중 하나 이상의 아미노산이 또 다른 아미노산(들)(그것의 전하량 및 극성이 본연의 아미노산의 그것과 유사함)로 치환되는데, 즉, 보존적 아미노산 치환으로, 잠재적 변화(silent change)를 초래한다.
MtDef5 염기서열 내 아미노산의 치환체가 자연발생적 아미노산이 속한 부류의 다른 구성원들로부터 선택될 수 있다. 아미노산은 다음과 같으 4군으로 분류될 수 있다: (1) 산성 아미노산; (2) 염기성 아미노산; (3) 중성 극성 아미노산; 및 (4) 중성 무극성 아미노산. 이와 같은 다양한 군에서 대표적 아미노산에는 비제한적으로: (1) 산성(음전하를 띤) 아미노산, 예컨대 아스파르트산 및 글루탐산; (2) 염기성 (양전하를 띤) 아미노산, 예컨대 아르기닌, 히스티딘 및 라이신; (3) 중성 극성 아미노산, 예컨대 글리신, 세린, 트레오닌, 시스테인, 시스틴, 타이로신, 아스파라긴 및 글루타민; (4) 중성 무극성(소수성) 아미노산, 예컨대 알라닌, 류신, 아이소류신, 발린, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌.
MtDef5 염기서열 내 보존적 아미노산 변화는 이들 군 중 하나에 속한 한 아미노산을 동일한 군에 속한 또 다른 아미노산으로 치환함으로써 이루어질 수 있다. 생물학적으로 기능성이 동등한 MtDef5의 등가물은 10 또는 그 이하의 보존적 아미노산 변화를, 좀 더 바람직하게는 7개 또는 그 이하의 보존적 아미노산 변화를, 가장 바람직하게는 5, 4, 3, 2, 또는 1개 보존적 아미노산 변화를 갖는다. 엔코딩 뉴클레오티드 염기서열 (예컨대, 유전자, 플라스미드 DNA, cDNA 또는 합성 DNA)은 따라서 상응하는 염기 치환을 갖고, 이것은 상기 염기서열이 생물학적으로 MtDef5 분자의 등가물 형태를 인코딩하게 한다.
본원에서 고안된 생물학적 기능이 동등한 펩티드, 폴립펩티드 및 단백질은 관심대상의 특정 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 염기서열과, 또는 이것 내의 상응하는 모이어티와, 약 70% 이상의 염기서열 동일성, 바람직하게는 약 85% 이상의 염기서열 동일성, 좀 더 바람직하게는 약 90% 내지 약 95% 염기서열 동일성, 예컨대, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94% 또는 약 95% 염기서열 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 약 96%>, 97% 또는 98%> 보다 큰 염기서열 동일성, 또는 약 99% 염기서열 동일성을 가져야 한다. 이와 같은 생물학적으로 기능이 동등한 펩티드, 폴립펩티드 및 단백질은 바람직하게는 본원에 개시된 상응하는 MtDef5 분자의 약 ±30%의 항진균성 활성, 또는 약 +30%보다 큰 항진균성 활성을 보유하는데, 이 값들은 본원에 개시된 항진균성 활성 분석 방법 모두에 의해 결정된다.
이와 같이 생물학적으로 기능이 동등한 펩티드, 폴립펩티드 및 단백질에 대한 코딩 염기서열은 서열번호 10 내지 15, 23 내지 29 및 65 내지 78로 표시된 뉴클레오티드 염기서열들로 이루어진 군에서 선택되는 뉴클레오티드 염기서열과 상기 코딩 염기서열이 생물학적으로 기능이 동등한 항진균성 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩할 수 있게 또는 코딩 염기서열의 코돈이 최적화된 형태가 식물에서 상기의 발현을 최적화할 수 있게 하기에 충분한 염기서열 동일성을 갖는 뉴클레오티드 염기서열을 포함할 수 있다.
염기서열 동일성 측정 방법
비교를 위해 염기서열들을 배열하는 방법들이 당해 기술에 잘 알려져 있다. 비교를 위한 염기서열의 최적의 배열은 Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)의 국지적 상동성 알고리즘에 의해; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970)의 상동성 배열 알고리즘에 의해; Pearson and Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci. 85: 2444 (1988)의 유사성 검색 방법에 의해; 이들 알고리즘의 실행을 전산화함으로써(예를 들면, 비제한적으로: CLUSTAL in the PC/Gene program, Intelligenetics, Mountain View, Calif; 및 the GCG.RTM.에서 GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA, 및 TFASTA in Wisconsin Package.TM. from Accelrys, Inc., San Diego, Calif.)에 의해 수행될 수 있다.
유전자 동일성은 BLAST "nr" 데이터베이스(모든 미중복 GenBank CDS 번역, 3-차원 구조 Brookhaven Protein Data Bank에서 유도된 염기서열, SWISS-PROT 단백질 염기서열 데이터베이스의 최종 주요 방출, EMBL, 및 DDBJ 데이터베이스 포함)에 함유된 염기서열과의 유사성에 대한 기본 매개변수 하에서 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool; Altschul, S. F., et al, (1993) J. Mol. Biol. 215:403-410; NCBI (National Center for Biotechnology Information, U.S. National Library of Medicine, 8600 Rockville Pike, Bethesda, Md. 20894)의 사용가능 정보 참조) 검색에 의해 측정될 수 있다. cDNA 염기서열은 BLASTN 프로그램을 사용하는 "nr" 데이터베이스에 함유된 모든 공개사용되는 DNA 염기서열과의 유사성에 대해 분석된다. DNA 염기서열은 모든 판독 프레임에서 번역되고, NCBI에서 제공하는 BLASTX 프로그램을 사용하는 "nr" 데이터베이스에 함유된 모두 공개사용된 단백질 염기서열과의 유사도에 대해 비교된다(Gish, W. and States, D. J. Nature Genetics 3:266-272 (1993)). 일부 경우에, 둘 이상의 DNA의 중복 절편을 함유하는 둘 이상의 클론에서 유래된 시퀀싱 데이터가 사용되어 인접한 DNA 염기서열을 구성할 수 있다.
염기서열 배열 및 백분율 동일성 계산은 소프트웨어, 예컨대 GCG.RTM의 일부로서 사용 가능한 GAP, BestFit, PileUp 또는 Pretty를 사용하여 수행될 수 있다. Wisconsin Package.TM. from Accelrys, Inc., San Diego, Calif. GAP 및 BestFit를 사용하는 폴리뉴클레오티드 염기서열의 쌍배열용 기본 매개변수는 간격 형성 페널티=50, 간격 확장 페널티=3; nwsgapdna.cmp는 점수 행렬이다. GAP 및 BestFit을 사용하는 폴리펩티드 염기서열의 쌍배열용 기본 매개변수는 간격 형성 페널티=8, 간격 확장 페널티=2; BLOSUM62는 점수 행렬이다. 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 배열의 말단에 있는 간격에 대한 페널티는 없다.
PileUp 및 Pretty를 사용하는 폴리뉴클레오티드 염기서열 비교용 기본 매개변수는 간격 형성 페널티=5, 간격 확장 페널티=l이다. PileUp 또는 Pretty를 사용하는 폴리펩티드 염기서열 비교용 기본 매개변수는 간격 형성 페널티=8, 간격 확장 페널티=2이고; BLOSUM62은 점수 행렬이다.
염기서열 배열은 또한 LASERGENE 생물정보학 전산 세트(DNASTAR Inc., Madison, Wis.)의 Megalign 프로그램으로 달성될 수 있다. 상기 염기서열의 다중 배열은 기본 매개변수(간격 페널티=10, 간격 길이 페널티=10)로 배열의 Clustal법(Higgins and Sharp (1989) CABIOS. 5: 151-153)을 사용하여 수행될 수 있다. Clustal법을 사용하는 쌍배열용 기본 매개변수는 KTUPLE 1, 간격 페널티=3, WINDOW=5 및 DIAGONALS SAVED=5이다.
기타 쌍 비교 도구가 구입가능하고, 당해 기술의 숙련가에게 알려져 있다.
명시된 바와 같이, 본 발명의 MtDef5 단백질 및 펩티드, 그리고 이들을 인코딩하는 DNA 절편의 구조에 변형 및 변경이 이루어질 수 있고, 그래도 바람직한 항진균성 특성들을 갖는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질을 인코딩하는 기능성 분자를 수득할 수 있다. 하기는 동등한, 심지어는 개선된 차세대 분자를 형성하기 위해 단백질의 아미노산을 변경하는 것을 기반으로 한 논의이다. 본 발명의 특정 구현예에서, 변이가 일어난 MtDef5 단백질 또는 펩티드가, 이들 분자의 항진균성 활성을 증가시키고, 결과적으로 식물 세포 중 재조합형 이식유전자의 항진균성 활성 및/또는 발현을 증가시키는 데 유용하도록, 고안된다. 상기 아미노산 변경은 표 2에 제시된 코돈에 따라, DNA 염기서열의 코돈을 변경함으로써 달성될 수 있다.
Figure 112015115776816-pct00002
Figure 112015115776816-pct00003
예를 들어, 어떤 아미노산은 생화학적 또는 생물학적 활성의 눈에 띄는 손실 없이 단백질 구조의 다른 아미노산 대신으로 치환될 수 있다. 이것은 단백질의 생물학적 기능적 활성을 정의하는 단백질의 상호작용 역량 및 속성이기 때문에, 어떤 아미노산 염기서열 치환은 단백질 염기서열 및, 또한 그것의 기저 DNA코딩 염기서열에서 이루어질 수 있고, 그럼에도 불구하고 유사한 특성을 갖는 단백질을 수득할 수 있다. 따라서, 본 발명의 발명가에 의해, 이들의 생물학적 활용도 또는 활성의 눈에 띄는 손실 없이, 본 발명의 MtDef5 단백질 염기서열 또는 이들을 인코딩하는 상응하는 DNA 염기서열에 다양한 변경이 이루어질 수 있는 것이 고안되었다.
Betts and Russell ((2003), "Amino Acid Properties and Consequences of Substitutions", Bioinformatics for Geneticists, Michael R. Barnes and Ian C. Gray, Eds., John Wiley & Sons, Ltd, Chapter 14, pp. 289-316)는 특정 아미노산 변경이 단백질 구조 및 기능에 미치는 영향을 예상하고 해석하는 것을 돕기 위한 목적으로 상이한 단백질의 다양한 맥락에서 아미노산의 돌연변이의 속성 및 특성들을 검토한다. 저자는 아미노산 돌연변이를 고려하는 것과 관련된 단백질의 특성들에는 세포 환경, 3차원 구조 및 진화뿐만 아니라, 진화적, 화학적, 구조적 원칙을 기반으로 아미노산의 분류 및, 다른 맥락에서, 단백질 구조 및 기능에서 상이한 부류의 아미노산의 역할이 포함된다는 점을 지적한다. 저자는 그들의 리뷰의 도 14.3에 나타낸 바와 같은 부류들로 아미노산을 분류하는 것(일반적인 물리화학적 특성들, 크기, 물에 대한 친화도(극성 및 무극성; 음전하 또는 양전하), 방향족성 및 지방족성, 수소결합능, 정확하게 영역을 전환하는 경향 등)이 단순한 분류에 대한 신뢰가 오도할 수 있음을 명확하게 만들어준다는 점에 주목하고, 선택적 아미노산이 각 위치에서 단백질로 조작될 수 있음을 시사한다. 특정 돌연변이가 단백질 구조 및 기능에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 해석하기 위한 기준이 본 리뷰의 14.7절에 요약되어 있고, 상기 기준에는 약 상기 단백질에 대한 질문, 그러고 나서 고안된 특정 아미노산 치환에 대한 질문이 포함된다.
아미노산 변경을 수행할 때 시작점으로서, 아미노산의 수치요법(hydropathic) 지수가 고려될 수 있다. 단백질에 상호작용의 생물학적 기능을 부여할 때 수치요법 아미노산 지수의 중요도는 당해 기술에서 일반적으로 알려져 있다(Kyte and Doolittle, 1982, 참조로 본원에 편입됨). 아미노산의 상대적 수치요법 특성(hydropathic character)이 수득된 단백질의 2차적 구조에 기여하고, 그 결과로 다른 분자들, 예를 들어, 효소, 기질, 수용체, DNA, 항체, 항원 등과 상기 단백질의 상호작용을 정의하는 것으로 받아들여진다.
각 아미노산에 그것의 소수성 및 전화 특성을 기반으로 수치요법 지수가 부여된 바 있다(Kyte and Doolittle, 1982). 이것은 다음과 같다: 아이소류신 (+4.5); 발린 (+4.2); 류신 (+3.8); 페닐알라닌 (+2.8); 시스테인/시스틴 (+2.5); 메티오닌 (+1.9); 알라닌 (+1.8); 글리신 (-0.4); 트레오닌 (-0.7); 세린 (-0.8); 트립토판 (-0.9); 타이로신 (-1.3); 프롤린 (-1.6); 히스티딘 (-3.2); 글루타메이트 (-3.5); 글루타민 (-3.5); 아스파르테이트 (-3.5); 아스파라긴 (-3.5); 라이신 (-3.9); 및 아르기닌 (-4.5).
어떤 아미노산은 유사한 수치요법 지수 또는 점수를 갖는 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 그럼에도 불구하고, 유사한 생물학적 활성을 갖는 단백질이 초래됨이, 즉 그럼에도 불구하고, 생물학적 기능적 동등한 단백질을 수득할 수 있음이 당해 기술에 알려져 있다. 이와 같은 변경을 수행할 때, 수치요법 지수가 + 2 내인 아미노산의 치환이 바람직하고, + 1 내인 아미노산의 치환이 특히 바람직하고, + 0.5 내인 경우가 훨씬 더 특히 바람직하다.
또한 유사 아미노산의 치환이 친수성을 토대로 효과적으로 이루어질 수 있음이 당해 기술에 알려져 있다. 미국 특허 제4,554,101호(참조로 본원에 편입됨)은 단백질의 최고 국재평균 친수성은, 그것의 이웃한 아미노산의 친수성에 의해 통제를 받는데, 상기 단백질의 생물학적 특성과 상관관계가 있음을 언급하였다.
미국 특허 제4,554,101호에 기술된 바와 같이, 하기의 친수성 값들이 아미노산 잔기에 부여되었다: 아르기닌 (+3.0); 라이신 (+3.0); 아스파르테이트 (+3.0.+ 0.1); 글루타메이트 (+3.0.+ 0.1); 세린 (+0.3); 아스파라긴 (+0.2); 글루타민 (+0.2); 글리신 (0); 트레오닌 (-0.4); 프롤린 (-0.5.+ 0.1); 알라닌 (-0.5); 히스티딘 (-0.5); 시스테인 (-1.0); 메티오닌 (-1.3); 발린 (-1.5); 류신 (-1.8); 아이소류신 (-1.8); 타이로신 (-2.3); 페닐알라닌 (-2.5); 트립토판 (-3.4).
MtDef5 염기서열에서의 비보존적 치환
MtDef5 염기서열에서의 비보존적 치환이 이루어져서, 본원에 개시된 MtDef5 분자들의 기능적 생물학적 등가물인 MtDef5 단백질 및 펩티드를 수득할 수 있음이 추가로 인식된다. 이와 같은 경우에, 비보존적 치환은 단순히 소정의 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 기능적 생물학적 등가물을 허용하는 비보존적 치환을 확인하기 위해 균류 증식의 억제에 미치는 그것의 영향에 대해 테스트될 수 있다.
MtDef5 단백질 및 펩티드의 절편 및 변종
본 발명의 항진균성 디펜신은 MtDef5 전구체 단백질, 성숙한 MtDef5 단백질 및 MtDef5 펩티드를 포함한다. 이와 같은 MtDef5 분자들과 비교하여 동일한, 유사한, 또는 이보다 훨씬 큰 항진균성 활성을 보유하는 염기서열의 절편 및 변종 또한 본 발명에서 다룬다. 따라서, 항진균성 활성을 나타내는 성숙한 MtDef5 단백질에서 최소한 8개 또는 그 이상의 아미노산으로 이루어진 인접한 염기서열이 본 발명에서 다뤄진다. 본 발명에서 다뤄지는 항진균성 활성을 갖는 MtDef5 분자의 절편 또는 변종은 또한 MtDef5 염기서열에 아미노산 치환, 결실, 삽입 또는 첨가를 포함할 수 있다.
끝이 잘린 형태일 수 있는, 성숙한 MtDef5 단백질의 절편은, 하나 이상의 아미노산이 N-말단, C-말단, 상기 단백질의 중간, 또는 이들의 조합에서 결실된 것으로, 항진균성 활성을 보유한 것인데, 이것 역시 본 발명에서 다뤄진다. 이와 같은 절편은 MtDef5 분자들의 자연발생적 또는 합성 돌연변이체로, MtDef5의 항진균성 활성을 보유하는데, 바람직하게는 본원에 개시된 상응하는 MtDef5 단백질 또는 펩티드의 항진균성 활성의 약 ±30%, 또는 약 +30%보다 훨씬 큰 항진균성 활성을 갖는데, 이것은 보다 더 크게 본원에 개시된 항진균성 활성 분석 방법들 중 어느 것에 의해 측정된다.
MtDef5 단백질의 변종은 하나 이상의 아미노산이 천연 염기서열에 삽입된 형태를 포함한다. 이와 같은 변종은 또한 MtDef5의 자연발생적 또는 합성 변이체일 수 있고, 본원에 개시된 상응하는 MtDef5 단백질의 항진균성 활성의 약 ±30%를 또는 약 +30% 항진균성 활성보다 더 큰 활성을 보유해야 한고, 이것은 본원에 개시된 항진균성 활성 분석 방법들 중 어느 하나에 의해 측정된다.
상기, 즉 아미노산 결실 및 첨가를 모두 함유하는 항진균성 MtDef5 디펜신의 조합물들 또한 본 발명에서 다뤄진다. 아미노산 치환 또한 그 안에 존재한다.
본 발명에서 다뤄지는 MtDef5 단백질의 절편 및 변종은, MtDef5 염기서열의 염기서열, 또는 이것 내부의 상응하는 모이어티와, 바람직하게는 약 70~75% 또는 그 이상의 염기서열 동일성, 바람직하게는 약 85% 이상의 염기서열 동일성, 더욱 바람직하게는 약 90%~95%의 염기서열 동일성, 훨씬 더 바람직하게는 약 96%, 97%, 98% 또는 99%보다 큰 염기서열 동일성을 보유한다. 이와 같은 생물학적 기능적으로 동등한 펩티드, 폴립펩티드 및 단백질은 바람직하게는 본원에 개시된 상응하는 MtDef5 분자의 항진균성 활성의 약 ±30%을, 또는 약 +30%보다 훨씬 큰 항진균성 활성을 나타내는데, 이것은 본원에 개시된항진균성 활성 분석 방법들 어느 것에 의해 측정된다.
MtDef5 변종을 설계하기 위한 MtDef5 디펜신 구조 기능 관계의 사용
상기 MtDef5 단백질은 디펜신 유전자 계열의 구성원으로, 따라서 디펜신과 공통된 어떤 구조적 및 생화학적 특성들을 보유할 것으로 예상된다. 특히, MtDef5 단백질은 디펜신 단백질에서 전형적으로 관측되는, 비평행 β-가닥 3개 및 α-헬릭스 1개로 이루어진, 시스테인-안정화된 α/β 모티프를 보유할 것으로 예상된다(Almeida et al, J. Mol. Biol. (2002) 315, 749-757; Thomma et al, Planta (2002) 216: 193-202). 이론에 의해 제한됨 없이, MtDef5 및 기타 디펜신 사이의 구조적 상동성이 유사한 또는 심지어 향상된 항진균성 활성을 보유한 변종을 확인하기 위해 사용될 수 있다.
선택적으로, MtDef5 디펜신의 보존된 구조적 특징 또한, 기타 바람직한 특성들을 가진 변종 MtDef5 유도체를 조작하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 디펜신 단백질에서 전형적으로 이황산 결합을 형성하는 MtDef5의 8개 기본형 시스테인 잔기는 전형적으로 모든 MtDef5 변종에서 보존되거나 또는 유지될 것이다. MtDef5에서 예측되는 이황화결합의 쌍은 시스테인 잔기 3 및 50, 14 및 35, 20 및 44, 그리고 24 및 46이다. 따라스, Cys-쌍 1이 Cys3-Cys50 이황화 결합에 의해 형성될 것으로 예측되고, Cys-쌍 2가 Cysl4-Cys35 이황화 결합에 의해 형성될 것으로 예측되고, Cys-쌍 3이 Cys20-Cys44 이황화 결합에 의해 형성될 것으로 예측되고, 그리고 Cys-쌍 4가 Cys24-Cys46 이황화 결합에 의해 형성될 것으로 예측된다. 이론에 의해 제한되지 않으면서, 하나 이상의 이황화 결합이 없는 MtDef5 시스테인 변종이, 이와 같은 변종이 형질전환 식물 제품을 소비하는 동물 또는 인간에 의해 좀 더 용이하게 소화될 것으로 예측되는 가운데, 궁극적으로 동물 사료로 또는 인간 소비를 위한 식품으로 사용되는 형질전환 식물에서의 사용에 바람직할 것으로 여겨진다. 동물 또는 인간의 소화기관에서 더 짧은 반감기를 갖는 MtDef5 변종 단백질은 이론적으로 그것의 항진균성 활성은 보유하면서 식품알레르기원이 될 잠재성은 더 적을 것으로 예상된다. 따라서, 이황화 결합은 수가 적으나 항진균성 활성을 보유하는 MtDef5 디펜신 유도체를 설계하는 것이 바람직할 것이다.
MtDef5 단백질 및 펩티드의 기타 생물학적으로 기능이 동등한 형태
본 발명에서 유용한 MtDef5 단백질 및 펩티드의 기타 생물학적으로 기능이 동등한 형태에는, 기타 펩티드, 폴립펩티드 또는 단백질과 이들 분자의 콘쥬게이트, 또는 앞서 기술된 바와 같은 이들의 생물학적으로 기능이 동등한 등가물이 포함되는데, 이들은 서로 융합 생성물을 형성하며, 상응하는 MtDef5 분자와 비교하여, 동일한, 유사한 또는 그 이상의 항진균성 활성을 보인다.
적층된 유전자의 논의에서 앞서 주목한 바와 같이, 식물에서 다중 항진균성 및/또는 기타 항-병원체 단백질의 동시 공동발현은, 식물 병원체의 둘 이상의 방제 기작을 활용하기 때문에, 이롭다. 이것은, 둘 이상의 항진균성 단백질이 발현되는 경우로, 내성 균류 종의 발달 가능성을 최소화하고, 저항성의 범위를 넓히고, 잠재적으로 상승적 항진균성 효과를 초래함으로써, 저항성의 수준이 향상된다.
부위-특이성 돌연변이 유도
부위-특이성 돌연변이 유도은 개별적 펩티드, 또는 생물학적으로 기능성이 동등한 펩티드, 폴립펩티드, 또는 단백질을 인코딩하는 DNA의 특이적 돌연변이 유도을 통해, 상기 분자들을 제조하는 데 유용한 기법이다. 상기 기법은 추가로 염기서열 변종을 제조하고 테스트하는 용이한 능력을 제공하는데, 이것은 하나 이상의 뉴클레오티드 염기서열 변경을 상기 DNA에 유입시킴으로써, 예를 들어, 앞서 언급된 고려사항들 중 하나 이상을 편입시킨다. 부위-특이성 돌연변이 유도 덕분에 바람직한 돌연변이의 DNA 염기서열을 인코딩하는 특이적 올리고뉴클레오티드 염기서열뿐만 아니라 충분한 개수의 이웃한 뉴클레오티드의 사용을 통한 변이체의 생산이 충분한 크기 및 염기서열 복잡성을 갖는 프라이머 염기서열을 제공하여 결실 접합부의 양측에 가로방향의 안정적인 복층구조(duplex)를 형성할 수 있다. 전형적으로, 뉴클레오티드 약 17 내지 25개의 길이의 프라이머가 바람직한데, 상기 염기서열의 접합점의 양측 상의 약 5~10개 잔기가 변경된다.
일반적으로, 부위-특이성 돌연변이 유도 기법은 당해 기술에 잘 알려져 있고, 다양한 문헌에서 실례로 제시되었다. 이해하다시피, 상기 기법은 전형적으로 단일가닥 및 이중가닥 형태 모두에 존재하는 파지 벡터를 활용한다. 부위 특이적(directed) 돌연변이 유도에 유용한 전형적인 벡터에는 Ml 3 파지와 같은 벡터가 포함된다. 이와 같은 파지 벡터는 쉽게 구매할 수 있고, 이들의 사용은 일반적으로 당해 기술의 숙련가에게 잘 알려져 있다. 이중가닥 플라스미드 또한 관심대상 유전자를 플라스미드에서 파지로 전이하는 단계를 제거하는 부위 특이적 돌연변이 유도에 일상적으로 활용된다. 돌연변이 유도를 수행하기 위한 상용 키트 또한 구할 수 있고, 사용될 수 있다. 예시적 키트에는 QuikChange® 부위 특위적 돌연변이 유도 키트(Stratagene, La Jolla, CA, USA)가 포함된다.
일반적으로, 본 발명에 따른 위치 특이적 돌연변이 유도는 우선 단일가닥 벡터를 수득하거나 또는 그것의 염기서열 내에 원하는 펩티드를 인코딩하는 DNA 염기서열을 포함하는 두 가닥의 이중가닥 벡터를 녹임으로써 수행된다. 원하는 변이된 염기서열을 간직한 올리고뉴클레오티드 프라이머가 일반적으로 합성을 통해 제조된다. 이와 같은 프라이머는 이후 상기 단일가닥 벡터와 어닐링되고, DNA 중합효소, 예컨대 대장균 중합효소 I Klenow 절편 처리가 되는데, 이것은 변이를 간직한 가닥의 합성을 완성하기 위한 것이다. 따라서, 이형이중가닥이 형성되는데, 여기서 한 가닥은 본래의 변이되지 않은 염기서열을 인코딩하고, 두 번째 가닥은 원하는 변이를 품는다. 이와 같은 이형이중가닥 벡터는 그러고 나서 적절한 세포, 예컨대 대장균 세포를 변형하기 위해 사용되고, 변이된 염기서열 배열을 간직한 재조합형 벡터를 포함하는 클론이 선택된다.
위치 특이적 돌연변이 유도를 사용한, 선택된 펩티드-인코딩 DNA 절편의 염기서열 변종의 제제가 잠재적으로 유용한 종을 생산하기 위한 수단으로 제공되는데, 펩티드 및 그것을 인코딩하는 DNA 염기서열의 염기서열 변종이 수득될 수 있느 다른 방식들이 있기에 이것은 제한적인 것이 아니다. 예를 들어, 원하는 펩티드 염기서열을 인코딩하는 재조합형 벡터는 돌연변이 유발 제제, 예컨대 히드록실아민으로 처리되어, 염기서열 변종을 수득할 수 있다.
MtDef5 항체 조성물 및 항체 제조 방법
특정 구현예에서, 본 발명의 발명가들이 단클론 또는 다중클론 중 하나로, 본원에 개시된 MtDef5 단백질 및 펩티드에 결합되는 항체를 고안한다. 항체를 제조하고 특징 짓는 수단들은 당해 기술에 잘 알려져 있다(예를 들어, Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1999, 및 미국 특허 제4,196,265호(둘 다 참조로 본원에 편입됨)참조).
MtDef5 단백질 검사 및 검출 키트
본 발명은 MtDef5 단백질 또는 펩티드를 함유하거나 또는 MtDef5-관련 펩티드, 폴립펩티드 또는 단백질, 또는 그와 같은 분자들을 생산하는 세포를 함유하는 것으로 추측되는 샘플을 검사하기 위한 면역검출 방법 및 키트를 고안한다. 키트는 본 발명의 하나 이상의 항체를 함유할 수 있고, 또한 샘플과 본 발명의 항체 사이의 상호작용을 검출하기 위한 시약(들)을 함유할 수도 있다. 상기 제공된 시약(들)은 방사선 표지, 형광 표지 또는 효소 표지될 수 있다. 상기 키트는, 본 발명의 핵산 또는 항체에 결합하거나 또는 이들과 상호작용할 수 있는, 알려진 방사선표지된 제제를 함유할 수 있다. 면역복합체 형성의 검출이, 예를 들어, ELISA, RIA, 면역블롯(예컨대, 점 블롯), 간접적 면역형광기법 등의 적용을 통해 달성될 수 있다.
MtDef5 농업적 및 약제학적 항진균성 조성물
본 발명은 본 발명의 하나 이상의 단리된, 정제 항진균성 MtDef5 단백질 또는 펩티드, 또는 이것의 생물학적으로 기능이 동등한 등가물을, 항진균성 식물, 또는 항진균성 인간 또는 가축, 병원성 균류 억제성 양만큼("항진균성 유효량") 포함하는 농업적 및 약제학적 항진균성 조성물을 아우른다. 이와 같은 조성물은 본원에 개시된 MtDef5 단백질 또는 펩티드 하나 또는 이들의 모든 조합을 포함할 수 있고, 농업적으로 또는 약제학적으로/수의학적으로 허용가능한 운반체, 희석제 또는 부형제를 포함할 수 있다. 아래 명시된 바와 같이, 농업 및 치료의 맥락에서 관련된 다른 성분들이 또한 그와 같은 조성물에 포함될 수 있다. 상기 항진균성 조성물은 식물, 또는 인간 또는 동물 진균 감염증과 연관된 MtDef5 단백질- 또는 펩티드-susceptible 병원성 균류의 증식을 억제하거나 또는 이들 균류를 살진균하기 위해 사용될 수 있다. 이와 같은 항진균성 조성물은 국소 투여를 위해 제형화되어, 식물, 식물 환경(흙 포함), 또는 인간 또는 동물 중 하나에 국소적으로 적용될 수 있다.
MtDef5 단백질 및 펩티드를 포함하는 농업적 조성물, 및 단백질- 및 펩티드-생산 미생물들
본 발명의 MtDef5 분자들 중 어느 하나를 포함하는 농업적 조성물이 단독으로, 또는 어떤 조합으로, 예를 들어, Winnacker-Kuchler (1986) Chemical Technology, Fourth Edition, Volume 7, Hanser Verlag, Munich; van Falkenberg (1972-1973) Pesticide Formulations, Second Edition, Marcel Dekker, N.Y.; 및 K. Martens (1979) Spray Drying Handbook, Third Edition, G. Goodwin, Ltd., London에 기술된 바와 같이 제형화될 수 있다.
필요한 제형 보조제, 예컨대 운반체, 비활성 물질, 계면활성제, 용매 및 기타 첨가제들이 또한 당해 기술에 잘 알려져 있고, 예를 들어, Watkins, Handbook of Insecticide Dust Diluents and Carriers, Second Edition, Darland Books, Caldwell, N.J., 및 Winnacker-Kuchler (1986) Chemical Technology, Fourth Edition, Volume 7, Hanser Verlag, Munich에 기술되어 있다. 이와 같은 제형들을 사용하여, 본 발명의 MtDef5 단백질 및 펩티드와 기타 살충성 활성 성분, 비료, 및/또는 증식 조절제 등의 혼합물을, 최종 제형의 형태로 또는 수조 혼합의 형태로, 제조할 수 있다.
단독으로 또는 다른 활성 제제와 조합으로, 본 발명의 항진균성 MtDef5 단백질 및 펩티드는 약 0.1 μg/ml 내지 약 100 mg/ml의 농도 범위로, 바람직하게는 약 5 μg/ml 내지 약 5 mg/ml의 농도 범위로, 약 3.0 내지 약 9.0의 범위의 pH에서, 적용될 수 있다. 이와 같은 조성물은 예를 들어, 약 1 mM 내지 1 M의 포스페이트 완충용액, 바람직하게는 약 10 mM 내지 100 mM, 좀 더 바람직하게는 약 15 mM 내지 50 mM의 완충용액을 사용하여 완충될 수 있다. 낮은 완충용액 농도의 경우, 이온 강도를 높이기 위해, 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 1 M, 좀 더 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 100 mM의 범위의 NaCl와 같은 염을 첨가하는 것이 바람직하다.
본 발명의 MtDef5 단백질 및 펩티드가 조합될 수 있는 수많은 종래의 균류 항생제 및 화학적 살진균제가 당해 기술에 알려져 있고, Worthington and Walker (1983) The Pesticide Manual, Seventh Edition, British Crop Protection Council에 기술되어 있다. 여기에는 예를 들어, 폴리옥신, 닉코마이신, 카복시 아미드, 방향족 탄화수소, 카복신, 모르폴린, 스테롤 생합성의 억제제 및 유기인산 화합물이 포함된다. 본 발명의 항진균성 단백질 및 펩티드와의 조합으로 제형화될 수 있는 기타 활성 성분에는, 예를 들어, 살충제, 유인제, 살균제제, 아칸사이드(acancides), 살선충제 및 제초제가 포함된다. 미국 특허 5,421,839에는 본 발명의 항진균성 MtDef5 단백질 및 펩티드와 같은 물질들과 함께 제형화될 수 있는 여러 활성 제제의 포괄적인 요약이 담겨 있다.
MtDef5 단백질 및 펩티드, 그리고 이들의 생물학적으로 기능이 동등한 등가물은 식물에서 광범위한 민감한 균류를 방제하는 데 유용할 것으로 예상되고, 이러한 균류들의 예에는 하기의 속 및 종에 속하는 것들이 포함된다: 알터나리아(알터나리아 브라시콜라; 알터나리아 솔라니); 아스코치타(아스코치타 피시); 아스페르길러스(아스페르길러스 플라부스; 아스페르길러스 푸미가투스); 보트리티스(보트리티스 키네레아); 케르코스포라(케르코스포라 키쿠치; 케르코스포라 제애마이디스); 코레토트리쿰(코레토트리쿰 린데무티아눔); 디플로디아(디플로디아 마이디스); 에리시페(에리시페 그라미니스 f.sp. 그라미니스; 에리시페 그라미니스 f.sp. 호르데이); 푸사리움(푸사리움 니발레; 푸사리움 옥시스포룸; 푸사리움 그래미니아룸; 푸사리움 쿨모룸; 푸사리움 솔라니; 푸사리움 모닐리포르메; 푸사리움 로세움; 개움마노마이세스(개움마노마이세스 그라미니스 f.sp. 트리티치); 헬민토스포리움 투르치쿰; 헬민토스포리움 카르보눔; 헬민토스포리움 마이디스; 마크롭호미나 (마크롭호미나 파세올린; 마가나포르테 그리세아); 넥트리아(넥트리아 해마토코카); 페로노스포라(페로노스포라 만슈리카; 페로노스포라 타바치나); 파코프소라(파코프소라 파치리지); 포마(포마 베테); 파이마토트리춤(파이마토트리춤 옴니보룸); 파이토프토라(파이토프토라 친나모미; 파이토프토라 칵토룸; 파이토프토라 파세올리; 파이토프토라 파라시티카; 파이토프토라 시트로프토라; 파이토프토라 메가스페르마 f.sp. 소자에; 파이토프토라 인페스탄스); 플라스모파라(플라스모파라 피티콜라); 포도스파에라(포도스파에라 레우코트리차); 푸치니아 (푸치니아 소르기; 푸치니아 스트리이포르미스; 푸치니아 그라미니스 f.sp. 트리티치; 푸치니아 아스파라기; 푸치니아 레콘디타; 푸치니아 아라치디스); 파이티움(파이티움 아파니데르마툼); 파이레노포라(파이레노포라 트리티치-레펜텐스); 파아리쿨라리아(파아리쿨라리아 오리자에); 파이티움(파이티움 울티뭄); 리족토니아(리족토니아 솔라니; 리족토니아 세레알리스); 스케로티움 (스케로티움 롤프시이); 스클레로티니아(스클레로티니아 스클레로티오룸); 셉토리아(셉토리아 라이코페르시치; 셉토리아 글리신스; 셉토리아 노도룸; 셉토리아 트리티치); 티에라비옵시스(티에라비옵시스 바시콜라); 운치눌라(운치눌라 네카토르); 벤투리아(벤투리아 인아에쿠알리스); 버티실리움(버티실리움 달리아에; 버티실리움 알보아트룸).
본원에서 아우르는 농업적으로 유용한 항진균성 조성물에는, MtDef5 단백질 및 펩티드를 생산할 수 있고, 식물, 예컨대 뿌리, 싹, 잎 또는 식물의 기타 부분에 대량서식할 수 있는, 숙주 세포의 형태의 것들, 예컨대 박테리아 및 균류 세포가 포함된다.
용어 "식물에 대량서식하는 미생물들"은 본원에서 "식물 환경"에 대량서식할 수 있고, 상기 "식물 환경"에서 본 발명의 MtDef5 항진균성 단백질 및 펩티드를 발현시킬 수 있는 미생물들을 가리킨다. 식물에 대량서식하는 마이크로-유기체는 식물 환경에서 식물들과 공생 또는 무해한 관계로 생존할 수 있는 것이다.
미국 특허 제5,229,112호는 본원에 개시된 MtDef5 항진균성 단백질 및 펩티드에 적용가능한, 항진균성 단백질을 발현시키도록 조작될 수 있는 식물에 대량서식하는 다양한 미생물들 및 이들의 사용 방법을 개시한다. 본 발명에 따라 식물의 진균 감염증 및 손상을 억제하는 데 유용한 본원에 개시된 MtDef5 항진균성 단백질 및 펩티드를 발현하는, 식물에 대량서식하는 미생물들에는 예를 들어, 바실라세아 계열의 포자 형성 유기체, 예를 들어 바실러스 종, 예컨대 바실러스 투린지엔시스, 바실러스 이스라에렌시스, 및 바실러스 수브틸리스; 슈도모나스; 아르트로박테르; 아조스피릴룸; 클라비박테르; 에스체리키아; 아그로박테리움, 예를 들어 라디오박테르; 리조비움; 에르위니아; 아조토박테르; 아조 스피릴룸; 클렙시엘라; 알칼리게네스; 리조박테리움; 및 플라보박테리움; 및 사카로미세스 세레비지아에; 피치아 파스토리스; 및 피치아 메타놀리카로 이루어진 군에서 선택되는 효모로 이루어진 군에서 선택되는 박테리아가 포함된다.
용어 "식물 환경"에는 식물의 표면, 예컨대, 잎, 줄기, 봉오리, 꽃자루, 꽃 부분, 또는 뿌리 표면, 식물 및 그것의 세포의 내부, 및 "근권(rhizosphere)", 즉 식물의 뿌리를 둘러싸고, 뿌리의 영향을 받는 흙이 포함된다.
본 발명의 MtDef5 분자들을 근권에 적용하는 것이 바람직한 경우, 슈도모나스 속에서 유래된 근권에 대량서식하는 박테리아가 특히 유용한데, 특별히 형광 슈도모나스, 예컨대, 슈도모나스 형광물질이 식물 근권에서 그리고 식물 뿌리에 대량으로 서식할 때, 경쟁력이 있다. 적합한 엽면(잎)에 대량서식하는 박테리아의 예는 P. 푸티다, P. 사이링가에 및 에르위나 종이다.
본 발명의 항진균성 식물에 대량서식하는 미생물들은 식물 환경, 예컨대, 잎, 봉오리, 뿌리, 싹, 꽃 부분, 종자 등의 표면에, 또는 흙에 직접 적용될 수 있다. 종자 코팅으로 사용될 경우, 본 발명의 식물에 대량서식하는 미생물들이 파종 전에 식물 종자에 도포된다. 이와 같은 종자를 처리하는 데, 일반적으로 적은 양의 항진균성 활성 미생물이 필요하다.
본 발명의 방법에 유용하고 특정 식물에 요구되는 식물에 대량서식하는 미생물들의 항진균성 유효량의 결정인자는 당해 기술에 알려져 있고, 예컨대 식물 종, 균류 병원체, 파종 방법, 및 토양 유형(예컨대, pH, 유기물질 함량, 수분 함량)과 같은 인자들에 따라 달라진다.
이론적으로, 본원에 개시된 MtDef5 항진균성 단백질 및 펩티드를 인코딩하는 DNA를 함유하는 본 발명의, 단일 식물에 대량서식하는 미생물들은 항진균성 유효량의 디펜신을 발현하기에 충분한 수만큼의 클론의 콜로니로 증식할 수 있기 때문에, 균류 병원체를 방제하기에 충분하다. 그러나, 현실에서는, 미생물들의 생존 및 증식에 영향을 미칠 수 있는 다양한 환경적 인자들 때문에, 생존 및/또는 증식을 보장하기 위해서는, 충분한 양의 식물에 대량서식하는 미생물들이 식물 환경(예컨대, 뿌리 또는 본엽)에 제공되어야 하는데, 예를 들면, 종자 당 103 내지 1010 개 박테리아 또는 효모의 도포가 뿌리 표면에 상기 미생물들이 대량서식하도록 하기 위해 충분할 것이다. 50 내지 250 나노그램의 디펜신을 발현하는 군집을 유지하기에 충분한 박테리아 또는 기타 식물에 대량서식하는 미생물들을 식물 환경에 투여하는 것이 바람직하다. 예를 들어, 식물 표면 1제곱센티미터 당 105 내지 108개의 박테리아가 진균 감염증 방제에 충분한 양일 것이다. 최소한 0.5 나노그램, 바람직하게는 1~100 나노그램의 항균류 활성 단백질 또는 펩티드가 식물에 대한 균류 손상을 방제하기에 충분할 것이다.
본 발명의 항진균성 활성 식물-관련 미생물들를 함유하는 조성물은 보조제, 희석제, 운반체 등과 함께 생물학적 활성 미생물들을 제형화함으로써 제조되어, 조성물을 미세하게 분할된 입자성 고체, 과립, 펠릿, 습식 분말, 분진, 수성 현탁액, 분산제 또는 에멀션의 형태로 제공할 수 있다. 적합한 운반체 비히클의 예는 다음과 같다: 용매, 예컨대, 물 또는 유기용매, 및 미세하게 분할된 고체, 예컨대, 카올린, 초크, 탄산칼슘, 주석, 실리케이트 및 석고.
본 발명은 또한 본 발명의 방법 및 조성물에서 캡슐 형태로 항진균성 식물에 대량서식하는 미생물들의 사용을 아우른다. 예컨대, 식물에 대량서식하는 미생물들은 중합체, 젤라틴, 지질 등의 껍질벽 내에 캡슐화될 수 있다. 특히 이와 같은 조성물이 사용 전에 일정 기간 동안 보관될 경우,기타 제형화 보조제, 예컨대 예를 들어, 유화제, 분산제, 계면활성제, 습윤제, 항발포제 및 항동결제가 상기 항진균성 조성물에 편입될 수 있다.
본 발명의 조성물은, 항진균성 활성 식물에 대량서식하는 미생물들뿐만 아니라, 기타 알려진 생물학적 활성 제제, 예컨대 살진균제, 제초제 또는 살충제를 추가적으로 함유할 수 있다. 또한 둘 이상의 항진균성 활성 식물에 대량서식하는 미생물들이 조합될 수 있다.
활성 제제로 본 발명의 유전자 조작된 식물에 대량서식하는 미생물들을 함유하는 항진균성 조성물의 적용은 종래 기법들, 예를 들어, 스프레더, 파워더스터, 붐 앤 핸드 스프레이어, 스프레이 더스터 및 과립 도포기에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 조성물은 항진균성 유효량만큼 적용되는데, 유효량은 예를 들어, 방제대상인 구체적 균류 병원체, 처리대상인 구체적 식물(및 식물의 일부 또는 토양), 항진균성 활성 조성물의 적용 방법과 같은 인자들에 따라 달라진다.
MtDef5 항진균성 단백질- 및 펩티드-함유 약제학적 조성물
본 발명은 MtDef5 단백질 및 펩티드 및 식물의 유전자좌에 적용될 수 있는 변형된 미생물들을 발현하는 형질전환 식물들을 아우를 뿐만 아니라, 인간 또는 동물을 감염시키는 민감한 병원성 균류의 증식을 억제하거나 또는 상기 균류를 살진균하기 위해, 즉 항진균성 유효량의 MtDef5 단백질, 펩티드 또는 그것의 생물학적으로 기능이 동등한 등가물을 필요로 하는 환자 또는 기타 개체에 투여함으로써 그와 같은 진균 감염증을 치료하기 위해 사용될 수 있는 약제학적 조성물도 아우른다.
MtDef5 단백질 및 펩티드, 그리고 이것의 생물학적으로 기능이 동등한 등가물을 포함하는 이와 같은 약제학적 조성물은 Remington: The Science and Practice of Pharmacy (2005), 21st　Edition, University of the Sciences in Philadelphia, Lippincott Williams & Wilkins에 기술된 것과 같은 종래의 방법들에 의해 제형화될 수 있다. 이와 같은 조성물은 MtDef5 단백질 및 펩티드, 그리고 이들의 다양한 조합물을, 약 0.1 μg/ml 내지 약 100 mg/ml의 범위의 농도로, 바람직하게는 약 5 μg/ml 내지 약 5 mg/ml의 범위 농도로, 약 3.0 내지 약 9.0의 범위의 pH로 포함할 수 있다. 이와 같은 조성물은 예를 들어, 약 1 mM 내지 1 M, 바람직하게는 약 10 mM 내지 100 mM, 좀 더 바람직하게는 약 15 mM 내지 50 mM의 포스페이트 완충용액을 사용하여 완충될 수 있다. 낮은 완충용액 농도의 경우, 이온강도를 증가시키기 위해, 바람직하게는 약 1 mM 내지 약 1 M, 좀 더 바람직하게는 약 10 mM 내지 약 100 mM의 범위의 NaCl인 염을 첨가하는 것이 바람직하다.
상기의 MtDef5 단백질 및 펩티드는 단독으로, 또는 서로 조합하여 제형화될 수 있는데, 이들 중 하나는 부가적으로 기타 종래의 항진균성 치료화합물, 예컨대 비제한적인 예로서, 폴리엔 항진균제; 이미다졸, 트리아졸 및 티아졸 항진균제; 알릴아민; 및 인간 및 가축 약품에 일상적으로 사용되는 에키노칸딘과 함께 제형화될 수 있다.
본 발명의 MtDef5 분자의 투여는 종래의 다양한 경로를 통해 달성될 수 있는데, 국소 도포가 바람직하다.
하기의 실시예들은 본 발명의 다양한 측면을 기술하는데, 본원에 사용된 화합물, 조성물 및 방법들을 제한하기 위한 것이라기보다는 실례를 보여주려는 위한 것이다.
실시예 1
대두 변형 벡터 AKK /FMV/ MtDef5 의 구성
도 1에 표시된 바와 같이, MtDef5 유전자 또는 그것 자체의 신호 펩티드를 갖는 cDNA를, 대두 발현 벡터 AKKI 472(Hammes 등 (2005) Molecular Plant Microbe Interactions 18: 1247-1257)에서 피그워트(Figwort) 모자이크 바이러스 35S 프로모터(Sanger 등 (1990) Plant Molecular Biology 14:433-443) 및 노팔린 합성효소 아데닐산중합반응 신호(Gleave (1992) Plant Molecular Biology 20: 1203-1207) 사이의 Nco I-Xba I 절편으로서 복제하였다. MtDef5 키메라 유전자 또는 cDNA 및, 선택가능 표지 유전자로서 Basta®　저항성을 부여하는 제한(bar) 유전자를 함유하는 상기 AKKI 472 벡터(Thompson 등 (1985) EMBO Journal 6:2519-2523)를, 대두 변형을 위해, 아그로박테리움 투메파시엔스 변종 EHA105로 전이하였다(Clemente 등 (2000) Crop Sci. 40:797-803; Zhang 등 (1999) Plant Cell, Tiss. Organ Cult. 56:37-46).
실시예 2
대두 변형 및 형질전환 식물의 재생
아그로박테리움을 사용하여 형질전환 대두 계통을 형성하기 위해 본 실시예에서 사용한 변형 프로토콜은 이전에 기술된 바 있다(Clemente 등 (2000) Crop Sci.40:797-803; Zhang 등 (1999) Plant Cell, Tiss. Organ Cult. 56:37-46).
우선, 종자의 외부(이 경우, 대두 종을 "Jack"이라 칭함)를 상용등급 Clorox®(5% 수성 차아염소산나트륨, NaClO)를 사용하여 밤새 살균하였다. 이어서, 상기의 살균된 종자가 발아배지에서 발아하도록 두었다(GM; Gamborg's B5 배지(Gamborg 등 (1968) Experimental Cell Research 50: 151)에 2% 수크로스 보충함, pH 5.8, 0.8% 한천으로 고체화함), 24℃에서 5일 동안(18/6) 광 요법). 저속 원심분리를 통해 실시예 1의 벡터로 변형된 아그로박테리움 투메파시엔스를 수집하여, 최종 OD650이 0.6~1.0이 될 때까지 공동배양 배지에 현탁시켰다. 공동배양 배지는 1/lOth Gamborg's B5 배지로 1.67 mg/1 6-벤질아미노퓨린(BAP), 0.25 mg/1 지베렐린산(GA3), 3% 수크로스, 200μΜ 아세토시린곤, 20 mM 2-(N-모르폴리노)-에탄술폰산(MES)으로 보충하였다(pH 5.4).
하기의 프로토콜은 이전에 기술된 바 있다(Clemente 등 (2000) supra; Zhang 등 (1999) supra).
아그로박테리움 이노쿨룸을 준비된 외식편(손상된 발아 중 종자에서 유래)과 함께 페트리 접시에 담아 종종 교반하면서, 30분 동안 두었다. 그러고 나서, 상기 외식편을 향축편이 아래로 향한 공동배양 접시(페트리접시 0.76g Gamborg Basal Salt Mixture, 7.4g MES, 60g 수크로스, 1 M KOH를 사용하여 pH를 5.4로 조절, 따뜻한 배지에 5g/L 아가로스 용해)에 담았다. 접시를 파라필름으로 싸서, 3일 동안 24℃, 18/6 광 요법으로 두었다. 공동배 양기간 후, 상기 외식편을 0.25 mg/1 GA3으로 보충한 액체 발아 개시 배지(3.08g Gamborgs B5 염, 30g 수크로스, 0.56g MES, 1M KOH를 사용하여 pH를 5.6으로 조절)에서 간단하게 세척하였다. 첫 2주 후, 배축 영역을 잘라 발달절(developing node)을 향해 물을 부어 씻어주고, 이후 글루포시네이트의 부재 하에 2주 동안 배양하였다. 그러고 나서, 상기 조직을 2주에 한번씩 신선한 싹 개시 배지에 옮겼고, 이것을 대략 10주 동안, 3 mg/1 글루포시네이트로 진행하였다. 상기 조직은 새로 자른 표면이 배지에 잠기도록 방향을 틀어주었고, 분화 영역은 표면을 향해 물을 부어 씻어주었다. 발아 개시 시기의 끝에, 분화 중인 외식편만을 사용하였다. 외식편에서 떡잎을 제거하고, 발달절(developing node)의 밑둥을 수평하게 새로 잘라내어, 상기 조직을 싹 늘리기 배지(shoot elongation medium)에 옮겨 24℃에서 18/6 광요법으로 배양하였다. 싹 늘리기 배지는 MS 염/Gamborg's 비타민으로 구성되고 1mg/l 제아틴 리보시드, 0.1 mg/1 인돌 아세트산(IAA), 0.5 mg/l GA3, 3% 수크로스, 100 mg/1 파이로글루탐산, 50 mg/1 아스파라긴, 3 mM MES (pH 5.6)로 보충하고, 0.8% 정제 한천으로 고형화하였다. bar 유전자를 표지로 사용하였기 때문에, 3 mg/1 글루포시네이트를 첨가하였다. 상기 조직을 2주에 한번씩 신선한 싹 늘리기 배지로 옮겼다. 옮길 때마다, 조직의 기저에 새로운 수평 슬라이스를 내었다. 늘어난 싹(3cm 초가)을 추가 선택 없이 뿌리내리기 배지에 뿌리내리게 했다. 뿌리내리기 배지는 4.33g Murashige & Skoog Basal Salt Mixture, 20g 수크로스, 0.56g MES로 구성되었다. pH는 1M KOH를 사용하여 5.6으로 조절하였고, 1리터 당 3g 파이타겔을 첨가하였다. 상기 용액을 가압멸균처리(20분)하고, 냉각 시 1 ml Gamborg B5 비타민(1000X), 1 ml L-아스파라긴 모노하이드레이트(50 mg/ml 보관농도) 및 1 ml L-파이로글루탐산 (100 mg/ml 보관농도)를 첨가하였다.
PCR를 사용하여 MtDef5 유전자 또는 cDNA의 존재를 검출하기 위해, 상기 식물을 키워서 선별하였다. qRT-PCR 분석법을 사용하여, RNA 수준에서 MtDef5 유전자 또는 cDNA의 발현이 확인되었고, MtDef5 단백질의 발현은 MtDef5 다중클론 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA에 의해 확인되었다. AB StepOne Plus-실시간 PCR 시스템(Applied Biosystems, Carlsbad, CA) per 제조업체의 설명에 따라, Promega GoTaq®　qPCR 마스터 믹스(Promega Corporation, Madison, WI)를 사용하는 정량적 PCR를 사용하여 결과적을 동형접합체를 선택하였다.
MtDef5 DNA 작제물 삽입을 위한 동형성 형질전환 식물을 수득 및 확인하고, 추후에 Chen 등 (1999) Theor . Appl . Genet. 99:755-760에 기술된 바와 같은 푸사리움(Fusarium) 이삭마름병; Cheng 등 (2010) Theor . Appl . Genet. 121 : 195-204)에 기술된 바와 같은 잎 녹병 및 줄무늬 녹병; 및 Nirmala 등 (2011) PNAS 108: 14676-14681에 기술된 바와 같은 줄기 녹병에 대한 저항성을 검사하였다.
실시예 3
밀 변형 벡터 pZP212 /Maize Ubi1A 프로모터/ MtDef5 /35S 3'의 구성
밀에서 MtDef5의 발현의 경우, MtDef5 유전자 또는 cDNA를 외떡잎식물의 바람직한 코돈을 기반으로 합성함으로써, MtDef5 신호 펩티드 및 성숙한 단백질의 아미노산 염기서열이 변하지 않았다. 합성 MtDef5 유전자 또는 cDNA를 GenScript Corporation (Piscataway, NJ, USA)으로부터 수득하였다. 상기 합성 MtDef5 유전자를 옥수수 유비퀴틴(Ubil) 프로모터/인트론 및 CaMV 35S 아데닐산중합반응 신호 염기서열 사이에 위치시키고, 도 2에 표시된 바와 같이, 바이너리(binary) 식물 발현 벡터 pZP212 (Hajdukiewicz 등,1994)의 T-DNA 경계 사이에서 복제하였다.
합성 MtDef5 유전자 또는 cDNA, 그리고 네오마이신 인산전이효소 선택가능 표지 유전자(nptll)를 함유하는 pZP212 벡터를 Bobwhite 및/또는 XC9 밀에 유입시켰다. 상기 형질전환 밀을 아래 실시예 4에 기술된 바와 같이 수득하였다.
실시예 4
형질전환 식물의 밀 변형 및 재생
밀 변형을 위해 사용된 프로토콜은 이미 Cheng 등 ( 1997) Plant Physiology 115:971-980에 기술되었다.
이와 같은 변형의 경우, 트리티쿰 애스티붐 cv 밥화이트(Bobwhite)를 사용하였다. 개화 후 14일이 지나 미성숙한 영과(caryopses)를 채집하였다. 미성숙한 배아를 무균 상태에서 분해하여, 100mg L-아스코르브산(CM4C)이 보충된 반고체 또는 액체 CM4 배지(Zhou 등 (1995) Plant Cell Replication 15: 159-163)에서 배양하였다. CM4 배지 중 MS 염(Murashige and Skoog (1962) Physiology Plant. 15:473-497)을 전 강도(full-strength) 또는 10분의 1의 강도로 조정하였다(Fry 등 (1987) Plant Cell Reports 6: 321-325). 상기 미성숙한 배야를 3~4시간 동안 배양하였다. CM4C 배지에서 미성숙한 배아를 10~25일 동안 배양함으로써, 배발생 캘러스를 제조하였다. 미성숙한 배아에서 유도된 상기 가피편에 배발생 가피 부문을 사용하는 아그로박테리움 투메파시엔스를 접종하였다. 실시예 3(도 2)에 기술된 벡터를 품은 아그로박테리움 투메파시엔스 C58 (ABI)를 대두 변형을 위해, 실시예 3에 기술된 바와 같이 제조하였다. 접종을 위해 상기 세포 밀도 A600 1~2로 아그로박테리움 투메파시엔스를 증식시켰다. CM4C 배지에 유지된 상기 미성숙한 배아 및 배발생 캘러스를 페트리 접시에 담긴 아그로박테리움 투메파시엔스 세포 현탁액에 옮겨 담았다. 상기 접종을 23~25℃에서 3시간 동안 어둠 속에서 시행하였다. 접종 후, 아그로박테리움 투메파시엔스 세포를 제거하고, 상기 외식편을 10 g/L 글루코오스 및 200 μΜ 아세토시린곤으로 보충하고, 전강도(full-strength) MS 염을 가진 액체 CM4C가 담긴 반고체 배지(겔라이트)에 놓았다. 공동배양을 24~26℃의 어둠속에서 2~3일 동안 수행하였다. 공동배양 후, 감염된 미성숙한 배아 및 캘러스를 250 mg/L 카르베니실린이 담긴 상기 고체 CM4C 배지에서 2~5일 동안 선택 없이 배양하였다. 가피 유도를 위해, 아그로박테리움 투메파시엔스-감염된 외식편을 3 mg/1 글루포시네이트 및 250 mg/L 카르베니실린으로 보충된 CM4C 배지에 옮겨담았다. 2주 후, 상기 외식편을 첫 번째 재생 배지 MMS0.2C(MS 염 및 비타민, 1.95 g/L MES, 0.2 mg/L 2,4-디클로로-페녹시아세트산, 100 mg/L 아스코르브산 및 40 g/L 말토오스로 구성되고, 2 g/L 겔라이트로 고체화되며, 3 mg/1 글루포시네이트 및 250 mg/L 카르베니실린으로 보충함)로 옮겼다. 재생 배지에 옮길 시, 미성숙한 배야에서 유도된 각각의 가피 조각 또는 접종된 가피 한 조각을 여러 작은 조각들(대략 2 mm)로 나누어다. 또 다시 2주 후, 어린 싹과 생존가능한 가피 조직을 두 번째 재생 배지 MMSOC(MMS0.2C와 동일한 성분을 함유하며, 모든 항생제가 포함됨)로 옮겼다. 상기 싹이 약 3 cm 이상의 작은식물로 발달하면, 이들은 추가 증식 및 선택을 위해 상기 재생 배지를 함유하는 보다 큰 배양 용기에 옮겨 담았다. 이 단계에서 PCR 검사를 위해, 상기 작은 식물에서 잎 샘플을 채취하였다. 글루포시네이트 저항성이 상당히 높은 식물을 토양에 옮겨 심었다. 동일한 배야 또는 가피 조각에서 유도된 식물은 모두 주어진 경우에 복제된 것으로 여겨진다.
그러고 나서, 상기 식물을 재배하여 MtDef5 유전자 또는 cDNA의 존재를 검출하기 위한 PCR의 사용을 위해 선별하였다. RNA 수준에서 상기 MtDef5 유전자 또는 cDNA의 발현을 qRT-PCR 분석을 사용하여 판단하였고, MtDef5 단백질의 발현을 MtDef5 다중클론 항체를 사용하는 샌드위치 ELISA로 판단하였다. 결국, 제조업체의 설명서에 따라, AB StepOne Plus-Real time PCR 시스템(Applied Biosystems, Carlsbad, CA)에서 Promega GoTaq®　qPCR 마스터 믹스(Promega Corporation, Madison, WI)를 사용하는 정량적 PCR를 사용하여, 동형접합체를 선별하였다.
MtDef5 DNA 작제물 삽입에 있어서 동형인 형질전환 식물들을 수득 및 확인하고, 추후에 Chen 등 (1999) Theor. Appl. Genet. 99:755-760에 기술된 푸사리움(Fusarium) 이삭마름병; Cheng 등 (2010) Theor. Appl. Genet. 121 : 195-204)에 기술된 잎 녹병 및 줄무늬 녹병; 및 Nirmala 등 (2011) PNAS 108: 14676-14681에 기술된 줄기 녹병에 대한 저항성을 검사하였다.
실시예 5
C-말단 확장(GMα-5C)(GACHRQGFGFACFCYKKC (SEP ID NO:58))을 가진 화학적으로 합성된 MtDef5.la 감마 코어 펩티드의 체외 항진균성 활성
전장 MtDef5 단백질에서 유도된 소형 펩티드가 항진균성 활성을 나타내는지 여부를 판단하기 위해, C-말단 18 아미노산으로 이루어진 펩티드를 Genemed, Inc., Texas에서 획득하여, 푸사리움 그래미니아룸 PH-1에 대한 항진균성 활성을 검사하였다. 이와 같은 펩티드는 성숙한 MtDef5 단백질의 감마 α-코어 모티프 및 마지막 6 아미노산을 함유하였다.
MtDef5.1a의 감마 α-코어 모티프의 항진균성 활성을 아미노산 염기서열 GACHRQGFGFACFCYKKC(서열번호 58)를 갖는 화학적 합성 GMα-5C 펩티드를 사용하여 검사하였다. 화학적 합성 GMα-5C 펩티드의 체외 항진균성 활성의 정량적 분석을 Ramamoorthy 등 (2007) Cellular Microbiology 9: 1491-1506에 기술된 펩티드와 함께 푸사리움 그래미니아룸 PH-1 분생자를 배양한 후 24시간이 지나 분석하였다. 상기 결과를 도 3에 나타내었는데, 보고된 상기 값은 복제 3개의 중간값이다. 오차 바는 표준편차를 나타낸다.
상기 펩티드의 상기 데이터는 IC50(50% 균류 증식의 억제에 필요한 농도)이 약 6~12μΜ였고, 반면에 IC100(100% 균류 증식 억제에 필요한 농도)은 약 24μΜ이었다.
본원에 기술된 발명은, 다양한 방식으로 변형될 수 있음이 명백할 것이다. 이와 같은 변형은 본 발명의 원칙과 범위에서 이탈로 간주되지 않을 것이고, 당해 기술의 숙련가에게 명백한 것처럼, 이하의 청구항의 범위에 포함되는 것으로 여겨진다.
아미노산 및 뉴클레오티드 염기서열 정보
메디카고 트룬카툴라 MtDef5 .1a- MtPef5 .6 디펜신 전구체 단백질 아미노산 염기서열(MtDef5 신호 펩티드(8~29 아미노산, 밑줄) 및 성숙한 MtDefS 디펜신 단백질 (대략 50개 아미노산)과 볼드체 및 이탤릭체로 표현된 MtDefS 디펜신 각각의 γ-코어 모티프를 포함)
MtDef5 .1a: 서열식별번호:1
Figure 112015115776816-pct00004
MtDef5 .1a - MtDef5 .1b "링커 서열": 서열식별번호:2
Figure 112015115776816-pct00005
MtDef5 .1b: 서열식별번호:3
Figure 112015115776816-pct00006
MtDef5 .1a-"링커"- MtDef5 .1b: 서열식별번호:4
Figure 112015115776816-pct00007
MtDef5 .2: 서열식별번호:5
Figure 112015115776816-pct00008
MtDef5 .3: 서열식별번호:6
Figure 112015115776816-pct00009
MtDef5 .4: 서열식별번호:7
Figure 112015115776816-pct00010
MtDef5 .5: 서열식별번호:8
Figure 112015115776816-pct00011
MtDef5 .6: 서열식별번호:9
Figure 112015115776816-pct00012
MtDefS 신호 펩타이드 (8-29개의 아미노산) 코딩 서열 ( 밑줄친 ), 및 성숙 MtDefS 단백질 (대략 50개의 아미노산) 코딩 서열을, 굵은 활자체에서 보여진 γ-코어 모티프 코딩 서열과 함께 포함하는, 메디카고 트룬카둘라 MtDef5 .1a- MtPef5 .6 프로단백질 cDNA 코딩 서열
MtDef5 .1a 및 MtDef5 .1b cDNA (서열식별번호: 10). 볼드체, 이택릭체 , 및 밑줄친 것에서 보여진 뉴클레오타이드 서열은 "링커" 펩타이드 아미노산 서열 APKKVEP를 인코딩한다:
Figure 112015115776816-pct00013
MtDef5 .2 cDNA (서열식별번호: 11):
Figure 112015115776816-pct00014
MtDef5 .3 cDNA (서열식별번호: 12):
Figure 112015115776816-pct00015
MtDef5 .4 cDNA (서열식별번호: 13):
Figure 112015115776816-pct00016
MtDef5 .5 cDNA (서열식별번호: 14):
Figure 112015115776816-pct00017
Figure 112015115776816-pct00018
MtDef5 .6 cDNA (서열식별번호: 15):
Figure 112015115776816-pct00019
성숙 메디카소 트룬카둘라 MtDef5 .1a- MtDef5 .6 디펜신 단백질 아미노산 서열
MtDef5 .1a: 서열식별번호: 16
KLCQKRSTTWSGPCLNTGNCKRQCINVEHATFGACHRQGFGFACFCYKKC
MtDef5 .1b: 서열식별번호: 17
KLCERRSKTWSGPCLI SGNCKRQCINVEHA SGACHRQGIGFACFCKKKC
MtDef5 .2: 서열식별번호: 18
KLCRGRSKLWSGPCINSKCKRQCINVERAVSGGCHLDNTGVFCFCDFKC
MtDef5 .3: 서열식별번호: 19
KVCQKRSKTWSGPCLNTGNCKRQCVDVENATFGACHRQGYGFACFCYKKC
MtDef5 .4: 서열식별번호:20
NICKRKSTTWSGPCLNTGNCKNQCINVEHATFGACHQDGFGFACFCYFNC
MtDef5 .5: 서열식별번호:21
NTCQRKSKTWSGPCLNTANCKNQCI SKEPPA FGACHRDGIGFACFCYFNC
MtDef5 .6: 서열식별번호:22
KLCRGRSKLWSGPCINSKCKRQCINVERAVSGGCHLDNTGVFCFCDFKC
성숙 메디카고 트룬카툴라 MtDef5 .1a- MtDef5 .6 디펜신 단백질 cDNA 코딩
서열
MtDef5 .1a: 서열식별번호:23
Figure 112015115776816-pct00020
MtDef5 .1b: 서열식별번호:24
Figure 112015115776816-pct00021
MtDef5 .2: 서열식별번호:25
Figure 112015115776816-pct00022
MtDef5 .3: 서열식별번호:26
Figure 112015115776816-pct00023
MtDef5 .4: 서열식별번호:27
Figure 112015115776816-pct00024
MtDef5 .5: 서열식별번호:28
Figure 112015115776816-pct00025
MtDef5 .6: 서열식별번호:29
Figure 112015115776816-pct00026
MtDef5 .1a - 5.6 신호 펩타이드 아미노산 서열
MtDef5 .1a - 5.1b 신호 펩타이드 서열:
Figure 112015115776816-pct00027
(서열식별번호:30)
MtDef5 .2 신호 펩타이드 서열:
Figure 112015115776816-pct00028
(서열식별번호:31)
MtDef5 .3 신호 펩타이드 서열:
Figure 112015115776816-pct00029
(서열식별번호:32)
MtDef5 .4 신호 펩타이드 서열:
Figure 112015115776816-pct00030
(서열식별번호:33)
MtDef5 .5 신호 펩타이드 서열:
Figure 112015115776816-pct00031
(서열식별번호:34)
MtDef5 .6 추정 신호 펩타이드 서열:
Figure 112015115776816-pct00032
(서열식별번호:35)
MtDef5 .1a - 5.6 신호 펩타이드 cDNA 코딩 서열
MtDef5 .1a - 5.1b 신호 펩타이드 cDNA 코딩 서열:
ATGACTTCCTCTGCTAGTAAATTCTATACCATCTTCATTTTTGTCTGCCTTGCCTTTCTCTTTATTTC CACATCTGAGGTGGAAGCA (서열식별번호:36)
MtDef5 .2 신호 펩타이드 cDNA 코딩 서열:
ATGGCTTCCTCTTCTCCTAAATTGTTTACCATCTTTCTGTTTCTCATCCTTGTCGTGCTCCTTTTCTC AACTTCGGAGGTGCAAGCA (서열식별번호:37)
MtDef5 .3 신호 펩타이드 cDNA 코딩 서열:
ATGACTTCCTCTGCTACTAAATTTTACACCATCTTTGTTTTTGTCTGCCTTGCCCTTCTCCTTATTTC CATATGTGAGGTGGAAGCA (서열식별번호:38)
MtDef5 .4 신호 펩타이드 cDNA 코딩 서열:
ATGGCTTCATCTACTCTTAAATTCAACACTATCTTTCTGTTTCTCAGCCTTGCACTTCTCCTGTTCTT CACATTGGAGGTACAAGGA (서열식별번호:39)
MtDef5 .5 신호 펩타이드 cDNA 코딩 서열:
ATGGCTTCCTCTGCTCTTAAATACTACACTTTCTTTCTGTTTTTCATCCTTGCACTTATCCTGTTACC CACATTGGAGGTACAAGGA (서열식별번호:40)
MtDef5 .6 신호 펩타이드 cDNA 코딩 서열:
ATGGTGTGTACAGAGGTGCAAGCA (서열식별번호:41)
MtDef4 .1 - 4.3 및 다른 신호 펩타이드 아미노산 서열
MtDef4 .1( H33R ) 신호 펩타이드 서열:
Figure 112015115776816-pct00033
(서열식별번호:42)
MtDef4 .2 신호 펩타이드 서열:
Figure 112015115776816-pct00034
(서열식별번호:43)
MtDef4 .3 신호 펩타이드 서열:
Figure 112015115776816-pct00035
(서열식별번호:44)
AL385796 신호 펩타이드 서열:
Figure 112015115776816-pct00036
(서열식별번호:45)
AW573770 신호 펩타이드 서열:
Figure 112015115776816-pct00037
(서열식별번호:46)
BE999096 신호 펩타이드 서열:
Figure 112015115776816-pct00038
(서열식별번호:47)
MtDef4 신호 펩타이드 공통 서열:
Figure 112015115776816-pct00039
(서열식별번호:48)
MsDef1 , MtDef4 , 및 MtDef5 .1a- 5.6γ -코어 모티프 ( GXCX 3 -9 C) 펩타이드 아미노산 서열
MsDef1 : GRCRDDFRC (서열식별번호:49)
MtDef4 : GRCRGFRRRC (서열식별번호:50)
MtDef5 .1a: GACHRQGFGFAC (서열식별번호:51)
MtDef5 .1b: GACHRQGIGFAC (서열식별번호:52)
MtDef5 .2: GGCHLDNTGVFC (서열식별번호:53)
MtDef5 .3: GACHRQGYGFAC (서열식별번호:54)
MtDef5 .4: GACHQDGFGFAC (서열식별번호:55)
MtDef5 .5: GACHRDGIGFAC (서열식별번호:56)
MtDef5 .6: GGCHLDNTGVFC (서열식별번호:57)
MtDef5 .1a-5.6 C-말단 연장 ( GMA -5C)를 갖는 γ 코어 펩타이드
MtDef5 .1a: GACHRQGFGFACFCYKKC (서열식별번호:58)
MtDef5 .1b: GACHRQGIGFACFCKKKC (서열식별번호:59)
MtDef5 .2: GGCHLDNTGVFCFCDFKC (서열식별번호:60)
MtDef5 .3: GACHRQGYGFACFCYKKC (서열식별번호:61)
MtDef5 .4: GACHQDGFGFACFCYFNC (서열식별번호:62)
MtDef5 .5: GACHRDGIGFACFCYFNC (서열식별번호:63)
MtDef5 .6: GGCHLDNTGVFCFCDFKC (서열식별번호:64)
MtDef5 .1a- 5.6γ -코어 모티프( GXCX 3 -9 C) 펩타이드 아미노산 서열 cDNA 코딩 서열
MtDef5 .1a: GGTGCTTGTCATCGTCAAGGCTTTGGTTTTGCTTGC (서열식별번호:65)
MtDef5 .1b: GGTGCTTGTCACCGTCAAGGCATTGGTTTTGCTTGC (서열식별번호:66)
MtDef5 .2: GGGGGTTGTCACCTTGATAACACTGGAGTTTTTTGT (서열식별번호:67)
MtDef5 .3: GGTGCTTGTCACCGTCAAGGCTATGGTTTTGCTTGC (서열식별번호:68)
MtDef5 .4: GGGGCATGCCACCAAGATGGATTTGGATTTGCTTGC (서열식별번호:69)
MtDef5 .5: GGGGCATGTCACCGTGATGGCATTGGATTTGCTTGC (서열식별번호:70)
MtDef5 .6: GGGGGTTGTCACCTTGATAACACTGGAGTTTTTTGT (서열식별번호:71)
MtDef5 .1a-5.6 C-말단 연장 ( GMA -5C) cDNA 코딩 서열을 갖는 γ 코어 펩타이드
MtDef5 .1a: GGTGCTTGTCATCGTCAAGGCTTTGGTTTTGCTTGCTTCTGCTACAAAAAATGT (서열식별번호: 72)
MtDef5 .1b: GGTGCTTGTCACCGTCAAGGCATTGGTTTTGCTTGCTTCTGCAAGAAAAAATGT (서열식별번호:73)
MtDef5 .2: GGGGGTTGTCACCTTGATAACACTGGAGTTTTTTGTTTCTGCGACTTCAAATGC (서열식별번호: 74)
MtDef5 .3: GGTGCTTGTCACCGTCAAGGCTATGGTTTTGCTTGCTTCTGCTACAAAAAGTGT (서열식별번호:75)
MtDef5 .4: GGGGCATGCCACCAAGATGGATTTGGATTTGCTTGCTTCTGCTACTTCAATTGC (서열식별번호:76)
MtDef5 .5: GGGGCATGTCACCGTGATGGCATTGGATTTGCTTGCTTCTGTTACTTCAACTGC (서열식별번호:77)
MtDef5 .6: GGGGGTTGTCACCTTGATAACACTGGAGTTTTTTGTTTCTGCGACTTCAAATGC (서열식별번호:78)
언급된 비특허 문헌
다양한 특허 및 비특헌 문헌이 본원에서 언급되었고, 각각의 개시내용이 그 전체가 참조로 본원에 편입되었다.
Figure 112015115776816-pct00040
Figure 112015115776816-pct00041
Figure 112015115776816-pct00042
Figure 112015115776816-pct00043
<110> Donald Danforth Plant Science Center <120> ANTIFUNGAL PLANT PROTEINS, PEPTIDES, AND METHODS OF USE <130> WO 2014/179260 <140> PCT/US2014/035786 <141> 2014-04-29 <150> US 61/817,415 <151> 2013-04-30 <160> 78 <170> KopatentIn 3.0 <210> 1 <211> 79 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 1 Met Thr Ser Ser Ala Ser Lys Phe Tyr Thr Ile Phe Ile Phe Val Cys 1 5 10 15 Leu Ala Phe Leu Phe Ile Ser Thr Ser Glu Val Glu Ala Lys Leu Cys 20 25 30 Gln Lys Arg Ser Thr Thr Trp Ser Gly Pro Cys Leu Asn Thr Gly Asn 35 40 45 Cys Lys Arg Gln Cys Ile Asn Val Glu His Ala Thr Phe Gly Ala Cys 50 55 60 His Arg Gln Gly Phe Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Lys Lys Cys 65 70 75 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 2 Ala Pro Lys Lys Val Glu Pro 1 5 <210> 3 <211> 50 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 3 Lys Leu Cys Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Ser Gly Pro Cys Leu Ile 1 5 10 15 Ser Gly Asn Cys Lys Arg Gln Cys Ile Asn Val Glu His Ala Thr Ser 20 25 30 Gly Ala Cys His Arg Gln Gly Ile Gly Phe Ala Cys Phe Cys Lys Lys 35 40 45 Lys Cys 50 <210> 4 <211> 136 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 4 Met Thr Ser Ser Ala Ser Lys Phe Tyr Thr Ile Phe Ile Phe Val Cys 1 5 10 15 Leu Ala Phe Leu Phe Ile Ser Thr Ser Glu Val Glu Ala Lys Leu Cys 20 25 30 Gln Lys Arg Ser Thr Thr Trp Ser Gly Pro Cys Leu Asn Thr Gly Asn 35 40 45 Cys Lys Arg Gln Cys Ile Asn Val Glu His Ala Thr Phe Gly Ala Cys 50 55 60 His Arg Gln Gly Phe Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Lys Lys Cys Ala 65 70 75 80 Pro Lys Lys Val Glu Pro Lys Leu Cys Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp 85 90 95 Ser Gly Pro Cys Leu Ile Ser Gly Asn Cys Lys Arg Gln Cys Ile Asn 100 105 110 Val Glu His Ala Thr Ser Gly Ala Cys His Arg Gln Gly Ile Gly Phe 115 120 125 Ala Cys Phe Cys Lys Lys Lys Cys 130 135 <210> 5 <211> 78 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 5 Met Ala Ser Ser Ser Pro Lys Leu Phe Thr Ile Phe Leu Phe Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Val Leu Leu Phe Ser Thr Ser Glu Val Gln Ala Lys Leu Cys 20 25 30 Arg Gly Arg Ser Lys Leu Trp Ser Gly Pro Cys Ile Asn Ser Lys Cys 35 40 45 Lys Arg Gln Cys Ile Asn Val Glu Arg Ala Val Ser Gly Gly Cys His 50 55 60 Leu Asp Asn Thr Gly Val Phe Cys Phe Cys Asp Phe Lys Cys 65 70 75 <210> 6 <211> 79 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 6 Met Thr Ser Ser Ala Thr Lys Phe Tyr Thr Ile Phe Val Phe Val Cys 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Leu Ile Ser Ile Cys Glu Val Glu Ala Lys Val Cys 20 25 30 Gln Lys Arg Ser Lys Thr Trp Ser Gly Pro Cys Leu Asn Thr Gly Asn 35 40 45 Cys Lys Arg Gln Cys Val Asp Val Glu Asn Ala Thr Phe Gly Ala Cys 50 55 60 His Arg Gln Gly Tyr Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Lys Lys Cys 65 70 75 <210> 7 <211> 79 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 7 Met Ala Ser Ser Thr Leu Lys Phe Asn Thr Ile Phe Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Leu Phe Phe Thr Leu Glu Val Gln Gly Asn Ile Cys 20 25 30 Lys Arg Lys Ser Thr Thr Trp Ser Gly Pro Cys Leu Asn Thr Gly Asn 35 40 45 Cys Lys Asn Gln Cys Ile Asn Val Glu His Ala Thr Phe Gly Ala Cys 50 55 60 His Gln Asp Gly Phe Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Phe Asn Cys 65 70 75 <210> 8 <211> 80 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 8 Met Ala Ser Ser Ala Leu Lys Tyr Tyr Thr Phe Phe Leu Phe Phe Ile 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ile Leu Leu Pro Thr Leu Glu Val Gln Gly Asn Thr Cys 20 25 30 Gln Arg Lys Ser Lys Thr Trp Ser Gly Pro Cys Leu Asn Thr Ala Asn 35 40 45 Cys Lys Asn Gln Cys Ile Ser Lys Glu Pro Pro Ala Thr Phe Gly Ala 50 55 60 Cys His Arg Asp Gly Ile Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Phe Asn Cys 65 70 75 80 <210> 9 <211> 57 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 9 Met Val Cys Thr Glu Val Gln Ala Lys Leu Cys Arg Gly Arg Ser Lys 1 5 10 15 Leu Trp Ser Gly Pro Cys Ile Asn Ser Lys Cys Lys Arg Gln Cys Ile 20 25 30 Asn Val Glu Arg Ala Val Ser Gly Gly Cys His Leu Asp Asn Thr Gly 35 40 45 Val Phe Cys Phe Cys Asp Phe Lys Cys 50 55 <210> 10 <211> 411 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 10 atgacttcct ctgctagtaa attctatacc atcttcattt ttgtctgcct tgcctttctc 60 tttatttcca catctgaggt ggaagcaaaa ctttgtcaaa agcgaagtac aacatggtca 120 ggaccttgtc ttaacacagg aaactgcaaa agacaatgca ttaatgtgga gcatgctact 180 tttggtgctt gtcatcgtca aggctttggt tttgcttgct tctgctacaa aaaatgtgct 240 ccaaagaagg tggaacctaa actttgtgaa aggcgaagca aaacatggtc aggaccttgt 300 cttatctcag gaaattgtaa aagacagtgc atcaatgttg agcatgcaac ttctggtgct 360 tgtcaccgtc aaggcattgg ttttgcttgc ttctgcaaga aaaaatgttg a 411 <210> 11 <211> 237 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 11 atggcttcct cttctcctaa attgtttacc atctttctgt ttctcatcct tgtcgtgctc 60 cttttctcaa cttcggaggt gcaagcaaaa ctttgtagag ggagaagcaa actttggtca 120 gggccttgta ttaactcaaa atgcaaaaga caatgcatca acgtggagcg cgcagttagc 180 gggggttgtc accttgataa cactggagtt ttttgtttct gcgacttcaa atgctga 237 <210> 12 <211> 240 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 12 atgacttcct ctgctactaa attttacacc atctttgttt ttgtctgcct tgcccttctc 60 cttatttcca tatgtgaggt ggaagcaaaa gtgtgtcaaa aacgaagtaa aacgtggtca 120 ggaccttgtc ttaacacagg aaactgtaaa agacaatgcg ttgatgtgga gaatgcaacc 180 ttcggtgctt gtcaccgtca aggctatggt tttgcttgct tctgctacaa aaagtgttga 240 240 <210> 13 <211> 240 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 13 atggcttcat ctactcttaa attcaacact atctttctgt ttctcagcct tgcacttctc 60 ctgttcttca cattggaggt acaaggaaat atttgtaaaa ggaaaagcac aacatggtca 120 gggccatgtt taaacacggg aaactgtaaa aatcagtgca tcaatgtgga acatgctact 180 tttggggcat gccaccaaga tggatttgga tttgcttgct tctgctactt caattgctga 240 240 <210> 14 <211> 243 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 14 atggcttcct ctgctcttaa atactacact ttctttctgt ttttcatcct tgcacttatc 60 ctgttaccca cattggaggt acaaggaaat acttgtcaaa ggaaaagcaa aacatggtca 120 gggccatgtt taaacacggc aaactgtaaa aatcagtgca tcagtaagga accaccggca 180 acatttgggg catgtcaccg tgatggcatt ggatttgctt gcttctgtta cttcaactgc 240 taa 243 <210> 15 <211> 174 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 15 atggtgtgta cagaggtgca agcaaaactt tgtagaggga gaagcaaact ttggtcaggg 60 ccttgtatta actcaaaatg caaaagacaa tgcatcaacg tggagcgcgc agttagcggg 120 ggttgtcacc ttgataacac tggagttttt tgtttctgcg acttcaaatg ctga 174 <210> 16 <211> 50 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 16 Lys Leu Cys Gln Lys Arg Ser Thr Thr Trp Ser Gly Pro Cys Leu Asn 1 5 10 15 Thr Gly Asn Cys Lys Arg Gln Cys Ile Asn Val Glu His Ala Thr Phe 20 25 30 Gly Ala Cys His Arg Gln Gly Phe Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Lys 35 40 45 Lys Cys 50 <210> 17 <211> 50 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 17 Lys Leu Cys Glu Arg Arg Ser Lys Thr Trp Ser Gly Pro Cys Leu Ile 1 5 10 15 Ser Gly Asn Cys Lys Arg Gln Cys Ile Asn Val Glu His Ala Thr Ser 20 25 30 Gly Ala Cys His Arg Gln Gly Ile Gly Phe Ala Cys Phe Cys Lys Lys 35 40 45 Lys Cys 50 <210> 18 <211> 49 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 18 Lys Leu Cys Arg Gly Arg Ser Lys Leu Trp Ser Gly Pro Cys Ile Asn 1 5 10 15 Ser Lys Cys Lys Arg Gln Cys Ile Asn Val Glu Arg Ala Val Ser Gly 20 25 30 Gly Cys His Leu Asp Asn Thr Gly Val Phe Cys Phe Cys Asp Phe Lys 35 40 45 Cys <210> 19 <211> 50 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 19 Lys Val Cys Gln Lys Arg Ser Lys Thr Trp Ser Gly Pro Cys Leu Asn 1 5 10 15 Thr Gly Asn Cys Lys Arg Gln Cys Val Asp Val Glu Asn Ala Thr Phe 20 25 30 Gly Ala Cys His Arg Gln Gly Tyr Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Lys 35 40 45 Lys Cys 50 <210> 20 <211> 50 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 20 Asn Ile Cys Lys Arg Lys Ser Thr Thr Trp Ser Gly Pro Cys Leu Asn 1 5 10 15 Thr Gly Asn Cys Lys Asn Gln Cys Ile Asn Val Glu His Ala Thr Phe 20 25 30 Gly Ala Cys His Gln Asp Gly Phe Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Phe 35 40 45 Asn Cys 50 <210> 21 <211> 51 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 21 Asn Thr Cys Gln Arg Lys Ser Lys Thr Trp Ser Gly Pro Cys Leu Asn 1 5 10 15 Thr Ala Asn Cys Lys Asn Gln Cys Ile Ser Lys Glu Pro Pro Ala Thr 20 25 30 Phe Gly Ala Cys His Arg Asp Gly Ile Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr 35 40 45 Phe Asn Cys 50 <210> 22 <211> 49 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 22 Lys Leu Cys Arg Gly Arg Ser Lys Leu Trp Ser Gly Pro Cys Ile Asn 1 5 10 15 Ser Lys Cys Lys Arg Gln Cys Ile Asn Val Glu Arg Ala Val Ser Gly 20 25 30 Gly Cys His Leu Asp Asn Thr Gly Val Phe Cys Phe Cys Asp Phe Lys 35 40 45 Cys <210> 23 <211> 150 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 23 aaactttgtc aaaagcgaag tacaacatgg tcaggacctt gtcttaacac aggaaactgc 60 aaaagacaat gcattaatgt ggagcatgct acttttggtg cttgtcatcg tcaaggcttt 120 ggttttgctt gcttctgcta caaaaaatgt 150 <210> 24 <211> 150 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 24 aaactttgtg aaaggcgaag caaaacatgg tcaggacctt gtcttatctc aggaaattgt 60 aaaagacagt gcatcaatgt tgagcatgca acttctggtg cttgtcaccg tcaaggcatt 120 ggttttgctt gcttctgcaa gaaaaaatgt 150 <210> 25 <211> 147 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 25 aaactttgta gagggagaag caaactttgg tcagggcctt gtattaactc aaaatgcaaa 60 agacaatgca tcaacgtgga gcgcgcagtt agcgggggtt gtcaccttga taacactgga 120 gttttttgtt tctgcgactt caaatgc 147 <210> 26 <211> 150 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 26 aaagtgtgtc aaaaacgaag taaaacgtgg tcaggacctt gtcttaacac aggaaactgt 60 aaaagacaat gcgttgatgt ggagaatgca accttcggtg cttgtcaccg tcaaggctat 120 ggttttgctt gcttctgcta caaaaagtgt 150 <210> 27 <211> 150 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 27 aatatttgta aaaggaaaag cacaacatgg tcagggccat gtttaaacac gggaaactgt 60 aaaaatcagt gcatcaatgt ggaacatgct acttttgggg catgccacca agatggattt 120 ggatttgctt gcttctgcta cttcaattgc 150 <210> 28 <211> 153 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 28 aatacttgtc aaaggaaaag caaaacatgg tcagggccat gtttaaacac ggcaaactgt 60 aaaaatcagt gcatcagtaa ggaaccaccg gcaacatttg gggcatgtca ccgtgatggc 120 attggatttg cttgcttctg ttacttcaac tgc 153 <210> 29 <211> 147 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 29 aaactttgta gagggagaag caaactttgg tcagggcctt gtattaactc aaaatgcaaa 60 agacaatgca tcaacgtgga gcgcgcagtt agcgggggtt gtcaccttga taacactgga 120 gttttttgtt tctgcgactt caaatgc 147 <210> 30 <211> 29 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 30 Met Thr Ser Ser Ala Ser Lys Phe Tyr Thr Ile Phe Ile Phe Val Cys 1 5 10 15 Leu Ala Phe Leu Phe Ile Ser Thr Ser Glu Val Glu Ala 20 25 <210> 31 <211> 29 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 31 Met Ala Ser Ser Ser Pro Lys Leu Phe Thr Ile Phe Leu Phe Leu Ile 1 5 10 15 Leu Val Val Leu Leu Phe Ser Thr Ser Glu Val Gln Ala 20 25 <210> 32 <211> 29 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 32 Met Thr Ser Ser Ala Thr Lys Phe Tyr Thr Ile Phe Val Phe Val Cys 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Leu Ile Ser Ile Cys Glu Val Glu Ala 20 25 <210> 33 <211> 29 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 33 Met Ala Ser Ser Thr Leu Lys Phe Asn Thr Ile Phe Leu Phe Leu Ser 1 5 10 15 Leu Ala Leu Leu Leu Phe Phe Thr Leu Glu Val Gln Gly 20 25 <210> 34 <211> 29 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 34 Met Ala Ser Ser Ala Leu Lys Tyr Tyr Thr Phe Phe Leu Phe Phe Ile 1 5 10 15 Leu Ala Leu Ile Leu Leu Pro Thr Leu Glu Val Gln Gly 20 25 <210> 35 <211> 8 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 35 Met Val Cys Thr Glu Val Gln Ala 1 5 <210> 36 <211> 87 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 36 atgacttcct ctgctagtaa attctatacc atcttcattt ttgtctgcct tgcctttctc 60 tttatttcca catctgaggt ggaagca 87 <210> 37 <211> 87 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 37 atggcttcct cttctcctaa attgtttacc atctttctgt ttctcatcct tgtcgtgctc 60 cttttctcaa cttcggaggt gcaagca 87 <210> 38 <211> 87 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 38 atgacttcct ctgctactaa attttacacc atctttgttt ttgtctgcct tgcccttctc 60 cttatttcca tatgtgaggt ggaagca 87 <210> 39 <211> 87 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 39 atggcttcat ctactcttaa attcaacact atctttctgt ttctcagcct tgcacttctc 60 ctgttcttca cattggaggt acaagga 87 <210> 40 <211> 87 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 40 atggcttcct ctgctcttaa atactacact ttctttctgt ttttcatcct tgcacttatc 60 ctgttaccca cattggaggt acaagga 87 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 41 atggtgtgta cagaggtgca agca 24 <210> 42 <211> 29 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 42 Met Ala Arg Ser Val Pro Leu Val Ser Thr Ile Phe Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Val Ala Thr Gly Pro Ser Met Val Ala Glu Ala 20 25 <210> 43 <211> 30 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 43 Met Ala Arg Ser Val Pro Leu Val Ser Thr Ile Phe Val Phe Phe Leu 1 5 10 15 Leu Ile Val Ala Thr Glu Met Gly Pro Ser Met Val Ala Ala 20 25 30 <210> 44 <211> 31 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 44 Met Ala Arg Ser Val Pro Leu Val Ser Thr Ile Phe Val Phe Phe Leu 1 5 10 15 Leu Leu Val Ala Thr Glu Met Gly Pro Ile Met Val Ala Glu Ala 20 25 30 <210> 45 <211> 29 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 45 Met Ala Arg Ser Val Phe Leu Val Ser Thr Ile Phe Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Val Leu Val Ala Thr Gly Pro Ser Met Val Ala Glu Ala 20 25 <210> 46 <211> 29 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 46 Met Ala Arg Ser Val Ser Leu Val Phe Thr Ile Phe Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Val Val Ala Thr Gly Pro Ser Met Val Ala Glu Ala 20 25 <210> 47 <211> 29 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 47 Met Ala Arg Ser Val Pro Leu Val Ser Thr Ile Phe Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Val Ala Thr Gly Pro Ser Met Val Gly Glu Ala 20 25 <210> 48 <211> 29 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 48 Met Ala Arg Ser Val Pro Leu Val Ser Thr Ile Phe Val Phe Leu Leu 1 5 10 15 Leu Leu Val Ala Thr Gly Pro Ser Met Val Ala Glu Ala 20 25 <210> 49 <211> 9 <212> PRT <213> Medicago sativa <400> 49 Gly Arg Cys Arg Asp Asp Phe Arg Cys 1 5 <210> 50 <211> 10 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 50 Gly Arg Cys Arg Gly Phe Arg Arg Arg Cys 1 5 10 <210> 51 <211> 12 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 51 Gly Ala Cys His Arg Gln Gly Phe Gly Phe Ala Cys 1 5 10 <210> 52 <211> 12 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 52 Gly Ala Cys His Arg Gln Gly Ile Gly Phe Ala Cys 1 5 10 <210> 53 <211> 12 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 53 Gly Gly Cys His Leu Asp Asn Thr Gly Val Phe Cys 1 5 10 <210> 54 <211> 12 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 54 Gly Ala Cys His Arg Gln Gly Tyr Gly Phe Ala Cys 1 5 10 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 55 Gly Ala Cys His Gln Asp Gly Phe Gly Phe Ala Cys 1 5 10 <210> 56 <211> 12 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 56 Gly Ala Cys His Arg Asp Gly Ile Gly Phe Ala Cys 1 5 10 <210> 57 <211> 12 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 57 Gly Gly Cys His Leu Asp Asn Thr Gly Val Phe Cys 1 5 10 <210> 58 <211> 18 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 58 Gly Ala Cys His Arg Gln Gly Phe Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Lys 1 5 10 15 Lys Cys <210> 59 <211> 18 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 59 Gly Ala Cys His Arg Gln Gly Ile Gly Phe Ala Cys Phe Cys Lys Lys 1 5 10 15 Lys Cys <210> 60 <211> 18 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 60 Gly Gly Cys His Leu Asp Asn Thr Gly Val Phe Cys Phe Cys Asp Phe 1 5 10 15 Lys Cys <210> 61 <211> 18 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 61 Gly Ala Cys His Arg Gln Gly Tyr Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Lys 1 5 10 15 Lys Cys <210> 62 <211> 18 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 62 Gly Ala Cys His Gln Asp Gly Phe Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Phe 1 5 10 15 Asn Cys <210> 63 <211> 18 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 63 Gly Ala Cys His Arg Asp Gly Ile Gly Phe Ala Cys Phe Cys Tyr Phe 1 5 10 15 Asn Cys <210> 64 <211> 18 <212> PRT <213> Medicago truncatula <400> 64 Gly Gly Cys His Leu Asp Asn Thr Gly Val Phe Cys Phe Cys Asp Phe 1 5 10 15 Lys Cys <210> 65 <211> 36 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 65 ggtgcttgtc atcgtcaagg ctttggtttt gcttgc 36 <210> 66 <211> 36 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 66 ggtgcttgtc accgtcaagg cattggtttt gcttgc 36 <210> 67 <211> 36 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 67 gggggttgtc accttgataa cactggagtt ttttgt 36 <210> 68 <211> 36 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 68 ggtgcttgtc accgtcaagg ctatggtttt gcttgc 36 <210> 69 <211> 36 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 69 ggggcatgcc accaagatgg atttggattt gcttgc 36 <210> 70 <211> 36 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 70 ggggcatgtc accgtgatgg cattggattt gcttgc 36 <210> 71 <211> 36 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 71 gggggttgtc accttgataa cactggagtt ttttgt 36 <210> 72 <211> 54 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 72 ggtgcttgtc atcgtcaagg ctttggtttt gcttgcttct gctacaaaaa atgt 54 <210> 73 <211> 54 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 73 ggtgcttgtc accgtcaagg cattggtttt gcttgcttct gcaagaaaaa atgt 54 <210> 74 <211> 54 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 74 gggggttgtc accttgataa cactggagtt ttttgtttct gcgacttcaa atgc 54 <210> 75 <211> 54 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 75 ggtgcttgtc accgtcaagg ctatggtttt gcttgcttct gctacaaaaa gtgt 54 <210> 76 <211> 54 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 76 ggggcatgcc accaagatgg atttggattt gcttgcttct gctacttcaa ttgc 54 <210> 77 <211> 54 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 77 ggggcatgtc accgtgatgg cattggattt gcttgcttct gttacttcaa ctgc 54 <210> 78 <211> 54 <212> DNA <213> Medicago truncatula <400> 78 gggggttgtc accttgataa cactggagtt ttttgtttct gcgacttcaa atgc 54

Claims (20)

  1. 서열번호 4의 잔기 30에서 136, 또는 서열번호 16, 17, 또는 58의 아미노산 서열로 이루어지는 단리된 정제 단백질 또는 펩티드.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 서열번호 4의 잔기 30에서 136의 아미노산 서열 또는 서열번호 16, 17, 또는 58의 아미노산 서열의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 식물 아포플라스트 타겟팅 서열 말단으로 이루어진 단백질을 코딩하는, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  5. 청구항 4에 있어서, 관심대상의 식물에서 발현을 위해 코돈이 최적화된, 단리된 폴리뉴클레오티드.
  6. 청구항 5에 있어서, 상기 관심대상 식물이 식량작물 식물인 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 식량 작물 식물이 대두, 밀, 옥수수, 사탕수수, 쌀 및 감자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 단리된 폴리뉴클레오티드.
  8. 형질전환 식물로, 이것의 세포들이 서열번호 4의 잔기 30에서 136의 아미노산 서열 또는 서열번호 16, 17, 또는 58의 아미노산 서열의 N-말단에 작동 가능하게 연결된 식물 아포플라스트 타겟팅 서열로 이루어진 단백질을 코딩하는 핵산 단편을 포함하되,
    상기 핵산 단편은 이종 게놈에 삽입되어 있거나, 이종 핵산 단편에 작동 가능하게 연결되거나, 또는 이종 게놈에 삽입되어 있으면서 이종 핵산 단편에 작동 가능하게 연결된 것인, 형질전환 식물.
  9. 삭제
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 형질전환 식물의 게놈이 하기로부터 선택되는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열을 추가적으로 포함하는 것인, 형질전환 식물:
    MsDefl, MtDef2, MtDef4, NaDl, Rs-AFPl, Rs-AFP2, KP4 및 KP6으로 이루어진 군에서 선택되는 하나의 식물 디펜신을 인코딩하는 DNA로서, 상기 DNA가 발현되어 항진균적 유효량의 상기 디펜신을 생산하는 DNA,
    바실러스 투린지엔시스(Bacillus thuringiensis) 내독소를 인코딩하는 DNA로서, 상기 DNA가 발현되어 방충 유효량의 상기 바실러스 투린지엔시스 내독소를 생산하는 DNA, 및
    상기 식물에 제초제 저항성을 제공하는 단백질을 인코딩하는 DNA로서, 상기 DNA가 발현되어 제초 저항성을 제공하는 상기 항-제초 유효량의 단백질을 생산하는 DNA.
  11. 서열번호 4의 잔기 30에서 136의 아미노산 서열, 또는 서열번호 16, 17, 또는 58의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 또는 펩티드를 포함하는 조성물.
  12. 청구항 11에 있어서, 농업적으로 또는 약학적으로 허용가능한 운반체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함하는 조성물.
  13. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서, 살충성 활성 성분, 비료, 살충제, 유인제, 살균제제, 살진드기제, 살선충제, 제초제 및 증식 조절제로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 기타 활성 제제의 혼합물에 제형화되는 조성물.
  14. 알터나리아, 아스코치타, 아스페르길러스, 보트리티스; 케르코스포라, 코레토트리쿰, 디플로디아, 에리시페, 푸자리움, 개우마노마이세스, 헬민토스포리움, 마크로포미나, 넥트리아, 페로노스포라, 파콥소라, 포마, 파이마토트리쿰, 파이토프토라, 플라스모파라, 푸치니아, 포도스패라, 파이레노포라, 파이리쿨라리아, 파이티움, 리족토니아, 스케로티움, 스클레로티니아, 셉토리아, 티엘라비옵시스, 운키눌라, 벤투리아 및 버티실리움으로 이루어진 군에서 선택되는 균류의 종으로부터의 손상에 민감한 식물에 대한 손상을 예방, 치료, 방제, 퇴치, 감소 또는 억제하는 방법으로,
    상기 방법은 서열번호 4의 잔기 30에서 136의 아미노산 서열 또는 서열번호 16, 17, 또는 58의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질 혹은 펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드와 함께 항진균 유효량의 항균 단백질을 상기 민감한 식물좌에 제공하는 것을 포함하되,
    상기 폴리뉴클레오티드는 이종 게놈에 삽입되어 있거나, 이종 핵산 단편에 작동 가능하게 연결되거나, 또는 이종 게놈에 삽입되어 있으면서 이종 핵산 단편에 작동 가능하게 연결된 것인, 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드에 작동 가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 DNA 컨스트럭트를 상기 민감한 식물의 식물세포의 게놈에 삽입하고,
    상기 항진균 유효량의 상기 단백질 혹은 펩티드를 발현하는 식물 세포로부터 형질전환 식물을 수득함으로써, 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드가 상기 민감한 식물좌에 제공되는 것인 방법.
  16. 청구항 14에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 항진균성 단백질 또는 펩티드를 발현하는 벡터를 상기 식물에 적용함으로써 상기 민감한 식물 좌에 상기 항진균성 단백질 또는 펩티드를 제공하는, 방법.
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 삭제
  20. 청구항 14 내지 청구항 16 중 어느 한 항에 있어서, 상기 민감한 식물이 옥수수, 대두, 밀, 사탕수수, 쌀 및 감자로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
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