CN101583719B

CN101583719B - 用于改变纤维长度和/或植物高度的核酸构建体和方法

Info

Publication number: CN101583719B
Application number: CN200780046680.9A
Authority: CN
Inventors: P·阿鲁达; I·R·格哈特
Original assignee: Monsanto do Brasil Ltda
Current assignee: Monsanto do Brasil Ltda
Priority date: 2006-12-20
Filing date: 2007-12-20
Publication date: 2015-03-25
Anticipated expiration: 2027-12-20
Also published as: EP2094852A1; WO2008074115A8; AU2007335207A1; CA2672771C; EP2094852A4; CN101583719A; AU2007335207B2; EP2094852B1; US9080181B2; BRPI0720468A2; US20100095405A1; CA2672771A1; WO2008074115A1

Abstract

本发明公开了用于改变纤维长度、植物高度和/或植物组织中的植物生物质的核酸构建体和方法。植物用编码拟南芥细胞壁关联激酶基因的构建体进行遗传工程化，当该基因在形成层/木质部优先启动子的控制下超表达时改变纤维长度和/或植物高度。带有细胞壁关联激酶基因的植物转化体表现出增加的纤维长度，这被认为是用于改善木质树木的制浆和造纸性能的一种性状。

Description

用于改变纤维长度和/或植物高度的核酸构建体和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2006年12月20日提交的60/871048号美国临时申请的优先权，该临时申请的公开内容完整引入作为参考。

技术领域

本发明涉及分子生物学的领域和转化植物中基因表达的改变。更具体地，本发明涉及通过调控编码细胞壁关联激酶(wall-associatedkinase)(WAK)的基因的表达改变具有工业价值的植物中的纤维长度和/或植物高度。

背景技术

对木制品和木材来源的产品的持续增长的需要构成了一个全球范围的问题。据估计，现在世界森林采伐量早已达到了最大的可持续速率。因此，存在着对更多的木本植物的急迫需要，以及开发提高林业植物的农业性状(如更高的植物高度。更大的生物质产量和更长的木质部纤维长度)的方法的需要。例如，纤维均匀度和强度是大多数工业应用的共同要求。在制浆中，强度特性部分地由纤维长度确定。长的纤维由于其强度和结合性能而对于高强度纸的生产、提高纸浆产量和减少碱消耗量等方面是理想的。

我们可以举出桉(Eucalyptus)树作为说明木本植物重要性的例子，桉树是全球用于造纸工业的纤维的最大来源(Bamber，1985，Appita 38：210-216)。据估计，一千万至一千五百万公顷的土地种植有桉树。Verhaegen和Plomion，1996，Genome 39：1051-1061。桉树的主要优点是其非常高的生长率和在大范围条件下生长的能力，在热带和温带条件下都能生长。但是，与其它来源(如松树)的纤维相比，桉树纤维具有一项缺点，就是其长度显著较短。因此，由桉树纸浆制成的纸通常强度较弱且通常需要用其它来源的较长纤维进行强化，从而增加了生产成本。

纤维长度受到细胞延长(一种由内膨压和细胞壁的机械强度之间的相互作用引起的过程)的内源性调节的控制，但其机理和所涉及的基因还没有完全弄清楚。

木质部纤维细胞产生自位于维管形成层内的早已大量相当延长的纺锤状原始细胞。它们通过其径向壁的扩展而增大其直径，且另外通过侵入性顶端生长产生纤维细胞延长，这导致细胞长度高达数倍的增加。Gray-Mitsumune等，2004，Plant Physiol.135：1552-1564。

在顶端生长细胞中，膨胀发生在细胞表面的小的区域内，这导致管状的、细长的细胞。例如，杨树纤维在木质部的径向膨胀带中侵入性地延长，当完全分化时其长度平均达到其原始细胞长度的150％。Hussey等，2006，Annu.Rev.Plant Boil.57：109-125；Mellerowicz等，2001，Plant Mol.Biol.47：239-274。

纤维细胞的快速膨胀可能通过膨压对细胞壁施加的推压和细胞壁的松弛的协同作用而实现。在棉纤维中，细胞延长阶段接着膨压的显著上升，这源于观察到的苹果酸盐、糖和K⁺(主要的渗压剂(osmoticum))的积聚，因此导致水的内流和纤维细胞内高膨压的产生。Ruan等，2004，Plant Physiol.136：4104-4113。

液泡转化酶可以在膨压维持和细胞壁膨胀中具有重要作用。最近用拟南芥(Arabidopsis thaliana)进行的工作表明细胞壁关联激酶(WAK)可能调节液泡转化酶，因此在WAK和液泡转化酶之间建立了跨区室的联系。Kohorn等，2006，Plant J.46：307-316。

在拟南芥中，WAK由五个紧密连接且高度相似的基因进行编码，并在叶、分生组织和发生膨胀的细胞中表达。Wagner和Kohorn，2001，Plant Cell 13：303-318。

存在T-DNA插入WAK2基因中的突变的拟南芥苗比野生型的植物显著较矮，根比胚轴受到更大的影响。Kohorn等，2006，Plant J.46：307-316。

这些突变植物显示出液泡转化酶活性降低62％，且作者提出WAK2对作为调整溶质浓度的机制和膨压调节的一个要素的液泡转化酶的转录进行调控，因此提供了WAK调节细胞膨胀的一种可能的机制。

在拟南芥中可诱导的反义WAK2的表达导致WAK蛋白水平的50％的下降，产生细胞延长的后续损失，并因此产生矮生植物。当反义WAK4基因用于降低总WAK蛋白水平时也报道了类似的结果。Wagner和Kohorn，2001，Plant Cell 13：303-318；Lally等，2001，PlantCell 13：1317-1331。

现在也知道，细胞壁关联激酶包含可以连接到细胞壁的果胶分子上的细胞外域、跨越质膜且具有胞质丝氨酸/苏氨酸激酶域。He等，1999，Plant Mol.Biol.39：1189-1196。

当纤维在两末端发生显著延长(侵入性顶端生长)时，胞间层的性质限制了这一类型的细胞生长。发育的木质细胞的胞间层富含果胶，且侵入性顶端生长需要胞间层的分解。参见Berthold等，WO2006/068603。

通过其果胶连结，WAK有可能感知细胞壁环境中的变化，因此提供了一种将细胞壁感知与溶质代谢的调节联系起来的分子机制，已知其随后参与生长细胞的膨压维持和细胞膨胀。这种信息对于细胞膨胀或膨压的调节可能是相当有用的。Huang等，2007，FunctionalPlant Biology，34：499-507。

纤维的特性受到一组复杂的遗传因素的控制并且不容易采用经典育种方法育种。通过传统的林木育种，获得某些纤维特性的改良是可能的。例如，已经培育出比亲本树种具有更长的纤维的杨树种间三倍体杂交种。Aziz等，1996，Wood and pulp properties of aspen andits hybrids.TAPPI Proc.Pilping Conference.P.437-443。还有，考虑到传统林木育种的缺陷，如由于其长的世代周期导致的缓慢进展和产生具有理想性状的植物的难度，基因技术的发展可以显著缩短产生植物的新品种所需要的时间并使得能够在特定的树种中更紧密地以林业和制浆工业需要的性状为目标。

发明内容

在一个方面中，本发明提供包含与木质部优先启动子可操作地连接的WAK多核苷酸序列的核酸构建体，该启动子引起所述WAK多核苷酸序列的超表达。在一个实施方式中，所述木质部优先启动子选自TUB基因启动子、SuSy基因启动子、COMT基因启动子和C4H基因启动子。在另一个实施方式中，转基因植物包含所述核酸构建体，且该植物与同种的非转基因植物相比具有纤维长度和/或高度的增加。在进一步的实施方式中，所述植物是双子叶植物、单子叶植物、裸子植物或阔叶树。本发明进一步包括转基因植物的后代，以及由转基因植物制备的木浆和木纤维。

在另一方面中，本发明提供增加纤维长度和/或植物高度的方法，包括：(a)向植物细胞中引入包含与木质部优先启动子可操作地连接的WAK多核苷酸序列的核酸构建体，该木质部优先启动子引起所述WAK多核苷酸序列的超表达；(b)在促进植物生长的条件下培养所述植物细胞；和(c)选择与同种的非转基因植物相比具有增加的纤维长度和/或植物高度的转基因植物。

附图说明

图1示意性地说明包含驱动本发明的细胞壁关联激酶核苷酸序列表达的形成层/木质部优先启动子的本发明的植物表达质粒载体pALELLYX-WAK。

图2显示了用本发明的植物表达质粒载体pALELLYX-WAK转化的几种转基因家系和相应的对照非转基因植物的纤维长度。星号表示统计学显著较高的平均纤维长度值(P＜0.05，t检验)。

图3显示用本发明的植物表达质粒载体pALELLYX-WAK转化的T1转基因植物(51B家系)的两种基因型的纤维长度。星号表示统计学显著较高的平均纤维长度值(P＜0.05，t检验)。

图4显示用本发明的植物表达质粒载体pALELLYX-WAK转化的T1转基因植物(47B家系)的两种基因型的纤维长度。星号表示统计学显著较高的平均纤维长度值(P＜0.05，t检验)。

图5显示用本发明的植物表达质粒载体pALELLYX-WAK转化的T1转基因植物(51B家系)的三种基因型的植物高度。星号表示统计学显著较高的平均植物高度值(P＜0.05，t检验)。

具体实施方式

本发明涉及植物纤维长度和/或增大植物高度的基因操作的方法。

植物细胞壁是赋予各细胞稳定外形的高强度纤维网络。为增大，细胞选择性地松弛这一网络，使得它能够顺从由细胞膨压产生的膨胀力。随着细胞膨胀，存在着对膨压的补偿调节的更大的需要，这取决于细胞溶质代谢。

细胞壁关联激酶(WAK)可以通过其与果胶的连结感知细胞壁膨胀，从而如上面所概述的提供将这些信号转导到调节溶质变化的系统的机制。但是，先前在WAK上的工作并没有预示着植物中组织特异性方式的WAK基因的超表达导致纤维长度的显著变化以及植物高度的显著变化。该结果开启了改变对植物纤维、林业、制浆和造纸工业极重要的性状的途径。

因此，按照本发明的一个方面，提供了通过控制细胞壁关联激酶的活性改变植物组织中，如木质被子植物木质部的纤维细胞、裸子植物木质部的管胞细胞和棉籽的纤维细胞中的纤维长度的方法。按照本发明的这一方面，植物细胞或整个植株用细胞壁关联激酶编码序列遗传工程化，该序列在被子植物的木质纤维细胞、裸子植物的木质管胞或棉籽的纤维细胞中表达时引起细胞长度的增加。

本发明中使用的所有技术术语为生物化学、分子生物学和农学中常用的术语，且可以被本发明所属领域的普通技术人员理解。那些技术术语可以在以下材料中找到：MOLECULAR CLONING：ALABORATORY MANUAL，第三版，vol.1-3，编者Sambrook和Russel，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2001；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，编者Ausubel等，Greene Publishing Associates and Wiley-Interscience，NewYork，1988(具有定期更新)；SHORT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY：A COMPENDIUM OF METHODS FROM CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，第五版，vol.1-2，编者Ausubel等，John Wiley&Sons，Inc.，2002；GENOME ANALYSIS：ALABORATORY MANUAL，vol.1-2，编者Green等，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1997。涉及植物生物学技术的方法学在本文中进行描述并在专著中详细说明，如METHODS IN PLANT MOLECULAR BIOLOGY：A LABORATORYCOURSE MANUAL，编者Maliga等，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，N.Y.，1995。在例如Innis等，PCRPROTOCOLS：A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS，Academic Press，San Diego，1990及Dieffenbach和Dveksler，PCRPRIMER：A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，2003中描述了各种使用PCR的技术。PCR-引物对可通过已知技术，如使用为该目的设计的计算机程序(例如Primer，Version 0.5，1991，Whitehead Institute forBiomedical Research，Cambridge，MA)从已知序列获得。例如，在Beaucage和Caruthers，1981，Tetra.Letts.22：1859-1862和Matteucci和Caruthers，1981，J.Am.Chem.Soc.103：3185中描述了核酸化学合成的方法。

如在Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，第二版(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press中所描述的进行限制性酶消化、磷酸化、连接和转化。除非另外说明，所有用于细菌细胞的生长和维持的试剂和材料都从AldrichChemicals(Milwaukee，WI)、DIFCO Laboratories(Detroit，MI)、Invitrogen(Gaithersburg，MD)或Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)获得。

术语“编码”和“译码”指的是基因通过转录和翻译的机制向细胞提供信息的过程，由此一系列氨基酸可组装成特定的氨基酸序列以产生活性酶。由于遗传密码的简并性，DNA序列中的特定碱基变化不改变蛋白质的氨基酸序列。因此可以理解，对蛋白质的功能特性不产生实质影响的编码细胞壁关联激酶的DNA序列的改变是可预想的。

在本说明书中，“表达”表示由基因编码的蛋白质产物的产生。可选择地或另外地，“表达”表示由编码DNA分子发生的细胞内过程(包括转录和翻译)的组合以产生多肽。“超表达”指的是特定基因序列的表达，其中转基因生物体中mRNA或多肽的产生超过非转基因生物体中的产生水平。

术语“异源核酸”指的是通过人的努力引入到细胞(或细胞的原型)中的核酸、DNA或RNA。这种外源的核酸可以是其所引入的细胞中天然发现的序列的副本或其片段。

相反，术语“内源核酸”指的是存在于待遗传工程化的植物或生物体中的核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA。内源序列是待遗传工程化的植物或生物体“本身的”序列，即待遗传工程化的植物或生物体原产的序列。

术语“同源序列”指的是由于共同祖先和序列保守性而类似的多核苷酸或多肽序列。

术语“功能性同源物”指的是由于共同祖先和序列保守性而类似且在催化、细胞或生物体水平上具有相同或类似的功能的多核苷酸或多肽序列。

细胞壁关联激酶序列

在本说明书中，术语“细胞壁关联激酶多核苷酸序列”表示编码细胞壁关联激酶多肽的任何核酸、基因、多核苷酸、DNA、RNA、mRNA或cDNA分子，细胞壁关联激酶多肽的超表达改变纤维长度和/或植物高度。DNA或RNA可以是双链或单链的。单链DNA可以是编码链，也称为有义链，或者可以是非编码链，也称为反义链。说明这一类别的是包含从拟南芥鉴别的SEQ ID NO：1、3、5、7和9且可以用于增加纤维长度和/或植物高度的多核苷酸分子。

适用于本发明的细胞壁关联激酶多核苷酸序列可以从特征为存在WAK基因的极大数量的生物体中鉴别出来。虽然本发明中公开了前述核苷酸序列，但它们并不对本发明构成限制。因此，WAK序列可以进行鉴别并通过序列比较进行功能性解释。技术人员可以轻易使用向公众提供的序列分析程序和参数在合适的数据库(如GenBank)中鉴别功能相关的WAK序列。或者，采用基于本发明公开的DNA或蛋白质序列的合适杂交探针或引物筛查cDNA文库或基因组文库应导致功能相关的WAK序列(功能性同源物)的鉴别。本领域中还理解的是，具有较低的同一性水平的序列也可以借助于简并的寡核苷酸和基于PCR的方法进行分离。尽管本发明的多核苷酸是从拟南芥分离的，来自其它植物的功能性同源物也可用于产生具有增加的纤维长度和/或植物高度的植物。可以从中分离WAK基因的植物品种的例子包括双子叶植物，例如葫芦科(Cucurbitaceae)、茄科(Solanaceae)、十字花科(Brassicaceae)、蝶形花科(Papilionaceae)如紫花苜蓿(alfalfa)和豇豆(Vigna unguiculata)、锦葵科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)、金虎尾科(Malpighiaceae)如杨属(Populus)、桃金娘科(Myrtaceae)如桉属，和单子叶植物，例如禾本科(Gramineae)，包括水稻、小麦、甘蔗、大麦和玉米。

在本说明书中，术语“细胞壁关联激酶多核苷酸序列”、“WAK多核苷酸序列”和“WAK DNA序列”也指具有能够在严格条件下与本发明公开的任何序列杂交且能够编码具有与包含本发明公开的SEQ ID NO：2、4、6、8或10氨基酸序列的蛋白质等同的WAK活性的多肽的核苷酸序列的任何核酸分子。该术语还包括与SEQ IDNO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：7或SEQ IDNO：9交叉杂交的序列，优选具有与SEQ ID NO：1、3、5、7和9的一种或多种至少65％的同源性或同一性的序列。本发明的核苷酸序列可以编码与本发明公开的SEQ ID NO：2、4、6、8或10中任何一种的预计基因产物同源的蛋白质。另外，本发明的核苷酸序列包括编码具有与本发明公开的SEQ ID NO：2、4、6、8或10中任何一种的氨基酸序列至少55％，优选至少60％，更优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％和最优选至少95％的序列同一性的氨基酸序列的WAK多肽的序列。遗传密码的简并性使多核苷酸的核苷酸序列中的大多数变异成为可能，同时保持所编码的氨基酸序列。

这里的短语“严格条件”意味着本领域熟知的参数。当单链多核苷酸基于多种良好表征的物理化学力(如氢键、溶剂排斥和碱基堆积)结合时发生杂交。杂交的严格性反映了所涉及的核酸的序列同一性程度，从而严格性越高，两条多核苷酸链越相似。严格性受到多种因素的影响，包括存在于杂交液和洗涤液中的温度、盐浓度和组成、有机和非有机添加剂、溶剂等，及孵育(和次数)。本领域普通技术人员可以轻易地通过改变杂交反应和洗涤处理过程中的温度、杂交反应和洗涤处理过程中的盐浓度等等选择这些条件。

对于具有超过100个互补残基的互补核酸的杂交，在Southern或Northern印迹分析的滤膜上，“严格”杂交条件的例子是在限定的离子强度和pH下低于特定序列的热解链温度(Tm)5℃-20℃的温度。Tm是在限定的离子强度和pH下50％的目标序列与完美匹配的探针杂交的温度。在严格条件下杂交的核酸分子通常与基于完整cDNA或所选择的部分的探针杂交。更优选地，这里的“严格条件”指的是本领域中熟知的参数，例如65℃下在3.5x SSC、1x Denhardt′s液、25mM磷酸钠缓冲液(pH 7.0)、0.5％SDS和2mM EDTA中杂交18小时，随后在65℃下在2x SSC和0.1％SDS中对滤膜进行四次的20分钟洗涤，并在0.5x SSC和0.1％SDS或者0.3x SSC和0.1％SDS中进行最多20分钟的最终洗涤以达到更高的严格性，且0.1xSSC和0.1％SDS用于甚至更高的严格性。可以使用其它条件替代，只要严格性的程度等于本发明中使用0.5x SSC的最终洗涤提供的程度。对于较低相关同源物的鉴别，洗涤可以在较低温度(例如，50℃)下进行。一般，严格性通过升高洗涤温度和/或降低SSC的浓度而提高。

另外，合适的细胞壁关联激酶序列的类别包括由具有一个或多个缺失、置换、插入或添加的碱基的SEQ ID NO：1或3或5或7或9的变异体构成的核酸分子，该变异体编码在超表达时导致纤维长度和/或植物高度改变的多肽。这里所称的“具有一个或多个缺失、置换、插入或添加的碱基的碱基序列”为本领域普通技术人员广泛已知，甚至在通常具有生理活性的蛋白质的氨基酸序列具有一个或多个置换、缺失、插入或添加的氨基酸时保持生理活性。例如，聚A尾或者5’或3’末端非翻译区域可以被删除，且碱基可以被删除到氨基酸被删除的程度。碱基也可以被置换，只要不导致移码。碱基也可以被“添加”到氨基酸被添加的程度。但是，任何这类修饰不导致生理活性的丧失是非常重要的。在该环境中的修饰DNA可以通过改变本发明的DNA碱基序列而获得，从而例如，在特定位置的氨基酸通过定点诱变被置换、删除、插入或添加。Zoller&Smith，1982，Nucleic Acid Res.10：6487-6500。因此，术语“变异体”是与特定基因或蛋白质的标准的或给定的核苷酸或氨基酸序列偏离的核苷酸或氨基酸序列。变异体可以具有“保守的”改变，其中置换的氨基酸具有类似的结构或化学性质，例如亮氨酸被异亮氨酸取代。变异体可以具有“非保守的”改变，例如甘氨酸被色氨酸取代。类似的小变异也可以包括氨基酸缺失或插入，或者包括两者。确定哪些氨基酸残基可以被置换、插入或删除的指引可以使用本领域中公知的计算机程序，如Vector NTI Suite(InforMax，MD)软件找到。“变异体”还可以指“改组的基因(shuffled gene)”，例如在美国专利6506603、6132970、6165793和6117679中描述的。

获得WAK DNA序列的进一步途径是通过，例如使用合适的cDNA序列作为模板从合适的碱基从头合成。

核酸构建体

本发明包括包含一种或多种本发明的核酸序列的重组构建体。该构建体通常包含沿正或反方向插入核酸序列的载体，如质粒、粘粒、噬菌体、病毒(例如，植物病毒)、细菌人工染色体(BAC)、酵母人工染色体(YAC)等等。众多的合适载体是已知的且可商购得到，因此不需要在此反复说明。

重组核酸构建体可以使用标准技术制得。例如，用于转录的核苷酸序列可以通过用限制性内切酶处理包含所述序列的载体以切出适当的片段而获得。用于转录的核苷酸序列还可以通过退火和结合合成的寡核苷酸或通过在聚合酶链式反应(PCR)中使用合成的寡核苷酸以在各末端得到合适的限制性位点而产生。然后核苷酸序列克隆到包含合适的调控元件(如上游启动子和下游终止子序列)的载体中。通常，植物转化载体包括一个或多个在5’和3’调控序列的转录控制下的克隆植物编码序列(基因组的或cDNA)及一个可选择的标志。这类植物转化载体通常还包含启动子、转录启动开始位点、RNA加工信号(如剪接信号序列)、转录终止位点和/或多腺苷酸化信号。还可以存在增强子和导向序列。

本发明提供很可能引起转化的植物中纤维长度和植物高度改变的核酸分子。本发明的一个重要方面是其中细胞壁关联激酶编码核苷酸序列与一个或多个启动子可操作地连接的核酸构建体的用途，该启动子以组成型方式或在特定的细胞类型、器官或组织中驱动细胞壁关联激酶编码序列的表达，从而与非转基因植物的纤维长度相比改变转化植物的纤维长度。

可用于表达适用于本发明的细胞壁关联激酶序列的合适组成型植物启动子包括，但不限于花椰菜花叶病毒(CaMV)35S启动子、玉米和杨属聚泛素启动子，其在大多数植物组织中赋予组成型的高水平表达(参见，例如WO 2007/00611、美国专利5510474号、Odell等，Nature，1985，313：810-812)、胭脂氨酸合酶(nopaline synthase)启动子(An等，1988，Plant Physiol.88：547-552)、来自玄参花叶病毒的FMV启动子(美国专利5378619号)和章鱼氨酸合酶启动子(Fromm等，1989，Plant Cell 1：977-984)。

也可以选择启动子以使得表达在植物发育的确定时间点、或者由外部影响因素确定的时间点、或者以组织特异性的或组织优先的方式发生。例如，它可以确保纤维细胞中的特异性的或优先的表达(棉纤维-、木质部纤维-或额外木质纤维-特异性的或-优先的启动子)。

示例性的棉纤维-特异性的或-优先的启动子包括，例如棉CFACT1基因启动子(美国专利6995256号)、E6基因启动子(美国专利6096950号；John等，1996，Plant mol.Biol.30：297-306；John等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.93：12768-12773)；H6基因启动子(John等，1995，Plant Physiol.108：669-676)；GhTUB1基因启动子(Li等，2002，Plant Physiol.130：666-674)和FbL2A(Rinehart等，1996，PlantPhysiol.112：1331-1341和John等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：12768-12773)。

维管系统-优先的或-特异性的启动子，如木质部优先启动子，可以用于影响本发明中的核酸分子的表达，具体来说在维管组织中，特别是在木质部组织中。因此，“木质部-优先的”意思是本发明的核酸分子在木质部中比在任何其它植物组织中更活跃。所选择的启动子应引起按照本发明的细胞壁关联激酶的超表达，从而改变细胞木质部的长度、改变宿主植物的高度或者同时改变两者。

合适的启动子的例子是，但不限于木质部优先的微管蛋白(TUB)基因启动子、咖啡酸3-O-甲基转移酶基因启动子(COMT)、蔗糖合成酶基因启动子(SuSy)和木质部优先香豆酸-4-羟基化酶(C4H)基因启动子。其它合适的木质部优先启动子在国际专利申请WO2005/096805中公开，该文献通过引用引入本申请。

也可以使用包括赋予组织特异性或组织优先表达的特定核苷酸区域的合成启动子，例如赋予木质部优先的表达的较大启动子内调控元件的鉴别。Seguin等，1997，Plant Mol.Biol.35：281-291；Torres-Schumann等，1996，Plant J.9：283-296和Leyva等，1992，PlantCell 4：263-271。

虽然基因表达率主要由启动子调节，表达的提高也可以通过以独立于方向的方式提高位置接近的基因的表达水平的增强子序列(如基因的内含部分)的鉴别和使用实现。在植物中，在基因构建体中启动子和基因编码序列之间包含一些内含子导致mRNA和蛋白质累积的增加。已知提高植物中的表达的内含子已在玉米基因中鉴别出来，例如hsp70、tubA1、Adh1、Sh1、UbH(Brown和Santino，美国专利5424412和5859347号；Jeon等，2000，Plant Physiol.123：1005-1014；Callis等，1987，Genes Dev.1：1183-1200；Vasil等，1989，Plant Physiol.91：1575-1579)，且在双子叶植物基因中，如来自矮牵牛花(Petunia)的rbcS(Dean等，1989，Plant Cell 1：201-208)；来自土豆的ST-LS1(Leon等，1991，Plant Physiol.95：968-972)及来自拟南芥的UBQ3(Norris等，1993，Plant Mol.Biol.21：895-906)和PAT1(Rose和Last，1997，Plant J.11：455-464)。

按照本发明的一个方面，细胞壁关联激酶序列被引入适用于植物转化的核酸构建体中。因此，提供包含在植物中有效的转录起始区域控制下的细胞壁关联激酶序列的核酸构建体，从而该构建体可以在宿主植物细胞中产生RNA。优选地，转录起始区域是维管或木质部-优先启动子(如以上所述启动子的任一种)的部分。如上所述，这种核酸构建体可用于改变植物中的细胞壁关联激酶基因表达。

表达载体还可以包含可选择标志，转化细胞可以通过该可选择标志在培养中鉴别。该标志可以与异源核酸分子，即与启动子可操作地连接的基因关联。如本发明中所使用的，术语“标志”指的是编码允许对包含该标志的植物或细胞进行选择或筛选的性状或基因型的基因。在植物中，例如标志基因编码抗生素或除草剂抗性。这能够从未转化或转染的细胞中选择转化的细胞。

合适的可选择标志的例子包括腺苷脱氨酶、二氢叶酸还原酶、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶、黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶、草甘膦和草铵膦抗性及氨基-糖苷3’-O-磷酸转移酶(卡那霉素、新霉素和G418抗性)。这些标志可以包括对G418、潮霉素、博来霉素、卡那霉素和庆大霉素的抗性。构建体还可以包含可选择标志基因Bar，其赋予对除草剂膦丝菌素(phosphinothricin)类似物如草丁膦铵的抗性。Thompson等，EMBO J.6：2519-23(1987)。其它合适的选择标志也是已知的。

可以使用可视标志，如绿色荧光蛋白(GFP)。用于基于细胞分裂的控制鉴别或选择转化的植物的方法也已说明。参见John和VanMellaert，WO 2000/052168和Fabijansk等，WO 2001/059086。

也可以包括细菌或病毒源的复制序列以允许将载体克隆到细菌或噬菌体宿主中。优选地，使用广泛宿主范围的原核复制起点。可以包括用于细菌的可选择标志以允许选择携带需要的构建体的细菌细胞。合适的原核可选择标志还包括对抗生素(如卡那霉素或四环素)的抗性。

其它编码另外的功能的DNA序列也可以存在于载体中，如本领域中已知的。例如，当土壤杆菌属(Agrobacterium)为宿主时，可以包括T-DNA序列以利于后续的向植物染色体中的转移和整合。

用于遗传工程的植物

本发明包括植物，特别是阔叶树中的遗传操作以在维管组织中通过引入细胞壁关联激酶基因超表达，优选在木质部-优先或木质部-特异性启动子的控制下。该结果增加纤维长度和植物高度。

在本说明书中，术语“植物”表示可以进行遗传操作的任何含纤维植物材料，包括但不限于分化的或未分化的植物细胞、原生质体、全植物、植物组织或植物器官，或者植物的任何部分如叶、茎、根、芽、块茎、果实、根茎等等。

可以按照本发明工程化的植物包括，但不限于树木，如桉属的种(白桉(E.alba)、白花桉(E.albens)，杏仁桉(E.amygdalina)、E.aromaphloia、圆叶桉(E.baileyana)、E.balladoniensis、双脉桉(E.bicostata)、葡萄桉(E.botryoides)、短蕊桉(E.brachyandra)、褐桉(E.brassiana)、短柱桉(E.brevistylis)、布罗韦桉(E.brockwayi)、钝盖赤桉(E.camaldulensis)、E.ceracea、大花序桉(E.cloeziana)、聚果桉(E.coccifera)、异心叶桉(E.cordata)、角蕾桉(E.cornuta)、E.corticosa、常桉(E.crebra)、E.croajingolensis、E.curtisii、山桉(E.dalrympleana)、剥桉(E.deglupta)、大桉(E.delegatensis)、E.delicata、卡瑞桉(E.diversicolor)、E.diversifolia、E.dives、E.dolichocarpa、E.dundasii、邓恩桉(E.dunnii)，滨河白桉(E.elata)、E.erythrocorys、E.erythrophloia、E.eudesmoides、E.falcata、E.gamophylla、E.glaucina、蓝桉(E.globulus)、双脉蓝桉(E.globulus subsp.bicostata)、蓝桉原种(E.globulus subsp.globulus)、E.gongylocarpa、巨桉(E.grandis)、巨尾桉杂交种(E.grandis x urophylla)、E.guilfoylei、西达桉(E.gunnii)、E.hallii、E.houseana、E.jacksonii、E.lansdowneana、E.latisinensis、E.leucophloia、白藓叶桉(E.leucoxylon)、E.lockyeri、E.lucasii、直杆蓝桉(E.maidenii)、边缘桉(E.marginata)、E.megacarpa、蜜味桉(E.melliodora)、E.michaeliana、小帽桉(E.microcorys)、小套桉(E.microtheca)、缪勒纤皮桉(E.muelleriana)、亮果桉(E.nitens)、E.nitida、斜叶桉(E.oblique)、E.obtusiflora、西方桉(E.occidentalis)、E.optima、卵叶桉(E.ovata)、E.pachyphylla、雪桉(E.pauciflora)、粗皮桉(E.pellita)、穿叶桉(E.perriniana)、E.petiolaris、弹丸桉(E.pilularis)、E.piperita、阔叶桉(E.platyphylla)、多花桉(E.polyanthemos)、E.populnea、E.preissiana、E.pseudo globulus、E.pulchella、E.radiata、E.radiata subsp.radiata、王桉(E.regnans)、E.risdonii、E.robertsonii、E.rodwayi、河红桉(E.rubida)、赤褐桉(E.rubiginosa)、柳叶桉(E.saligna)、红皮桉(E.salmonophloia)、E.scoparia、银顶白蜡桉(E.sieberi)、E.spathulata、E.staeri、E.stoatei、E.tenuipes、E.tenuiramis、细叶桉(E.tereticornis)、E.tetragona、达尔文纤皮桉(E.tetrodonta)、E.tindaliae、E.torquata、E.umbra、尾叶桉(E.urophylla)、E.vernicosa、多枝桉(E.viminalis)、E.wandoo、韦塔桉(E.wetarensis)、E.willisii、E.willisii subsp.falciformis、E.willisii subsp.willisii、E.woodwardii)，杨属种类(银白杨(P.alba)、银白杨大齿白杨杂交种(P.alba x P.grandidentata)、银白杨欧洲山杨杂交种(P.alba x P.tremula)、银白杨欧洲山杨杂交种(变种)(P.alba x P.tremula var.glandulosa)、银白杨美洲山杨杂交种(P.alba x P.tremuloides)、香脂杨(P.balsamifera)、毛果香脂杨(P.balsamifera subsp.trichocarpa)、毛果香脂杨美洲黑杨杂交种(P.balsamifera subsp.trichocarpa x P.deltoids)、缘毛杨(P.ciliate)、美洲黑杨(P.deltoids)、胡杨(P.euphratica)、欧美黑杨(P.euramericana)、杂交颤杨(P.kitakamiensis)、大叶杨(P.lasiocarpa)、苦杨(P.laurifolia)、马氏杨(P.maximowiczii)、毛果马氏杨香脂杨杂交种(P.maximowiczii x P.balsamifera subsp.trichocarpa)、黑杨(P.nigra)、西氏杨大齿白杨杂交种(P.sieboldii x P.grandidentata)、甜杨(P.suaveolens)、川杨(P.szechuanica)、毛白杨(P.tomentosa)、欧洲山杨(P.tremula)、欧洲山杨北美颤杨杂交种(P.tremula x P.tremuloides)、北美颤杨(P.tremuloides)、椅杨(P.wilsonii)、加拿大杨(P.Canadensis)、滇杨(P.yunnanensis))，松类如火炬松(Pinus taeda)、湿地松(Pinus elliotii)、美国黄松(Pinus ponderosa)、小干松(Pinuscontorta)和辐射松(Pinus radiata)，花旗松(Pseudotsuga menziesii)，美国西部铁杉(加拿大铁杉(Tsuga canadensis))，北美云杉(Piceaglauca)，红杉(Sequoia sempervirens)，真杉(true fir)如银杉(Abiesamabilis)和香脂冷杉(Abies balsamea)及雪松类如大侧柏(北美乔柏(Thuja plicata))和黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis)。

产生纤维的植物也包括在本发明中。示例性的作物是棉花(草棉种(Gossipium spp.))、亚麻(Linum usitatissimum)、小荨麻(异株荨麻(Urtica dioica))、蛇麻(Humulus lupulus)、椴树类(欧洲小叶椴(Tiliacordata)、欧洲椴(T.x.europaea)和阔叶椴(T.platyphyllus))、鹰爪豆(Spartium junceum)、苎麻(Boehmeria nivea)、楮(Broussonetyapapyrifera)，新西兰麻(Phormium tenax)、罗布麻(磁麻(Apocynumcannabinum))、鸢尾类(道氏鸢尾(I.douglasiana)、I.macrosiphon和I.purdyi)、乳草类(马利筋种(Asclepia species))、凤梨、香蕉和其它。还包括饲料作物，如紫花苜蓿、黑麦草、羊茅和三叶草。

在本说明书中，“转基因植物”指的是已经引入核酸序列的植物，核酸序列包括，但不限于正常地不存在于宿主植物基因组中的基因、正常地不转录为RNA或翻译成蛋白质的核酸序列或者希望引入到野生型植物中的任何其它基因或核酸序列，如可能正常地存在于野生型植物中但希望进行遗传工程或改变表达的基因。“转基因植物”类别包括原始转化体和其世系中的包括转化体的植物，例如通过标准基因渗入或另一育种过程的途径。

“杂种植物”指的是由两个亲本植物的杂交(cross)产生的植物或其部分，其中一个亲本是本发明的遗传工程化植物。这种杂交可以通过，例如有性生殖天然发生或通过，例如体外核融合人工产生。植物育种的方法是公知的且在植物生物学领域的普通技术人员的能力范围内。

相反，未进行遗传操作的植物是对照植物，且称为“非转基因”或“对照”植物。非转基因植物可以是其基因组未通过引入包含本发明的多核苷酸序列或其片段的构建体而发生改变的植物。它也可以是从培养细胞或组织再生而没有通过引入包含本发明的多核苷酸序列的构建体而发生在先改变的植物，或者可以包含由转基因植物的自体受精产生的纯合隐性后代(即，不具有转基因的任何副本)。

可以预想，在一些情况中，本发明的转基因植物的基因组通过转基因的稳定引入而扩增。但是在其它情况中，引入的基因取代内源序列。按照本发明的相关优选基因是细胞壁关联激酶DNA序列，例如从拟南芥获得的序列。

遗传工程的方法

按照本发明的构建体可以使用合适的技术引入任何植物细胞中。单子叶和双子叶的被子或裸子植物细胞都可以以本领域已知的各种方法进行遗传工程。例如，参见Klein等，1993，Biotechnology 4：583-590；Bechtold等，1993，C.R.Acad.Sci.Paris 316：1194-1199；Koncz和Schell，1986，Mol.Gen.Genet.204：383-396；Paszkowski等，1984，EMBO J.3：2717-2722；Sagi等，1994，Plant Cell Rep.13：262-266。

例如，可以按照Nagel等，1990，Microbiol Lett 67：325的方法使用土壤杆菌，如根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)和发根土壤杆菌(A.rhizogenes)。简单地说，土壤杆菌可以通过例如电穿孔与植物表达载体一起使用，这之后土壤杆菌通过例如公知的叶盘(leaf-disk)方法引入植物细胞中。

用于完成这一任务的其它方法包括，但不限于通过根瘤菌属(Rhizobium)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium)或中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium)的转化(Broothaerts等，2005，Nature 433：629-633)、电穿孔、基因枪轰击、磷酸钙沉淀、和聚乙二醇融合、转移到发芽花粉粒中、直接转化(Lorz等，1985，Mol.Genet.199：179-182)及本领域中已知的其它方法。如果采用了选择标志如卡那霉素抗性，这使得确定哪些细胞成功转化更容易。

上面讨论的土壤杆菌转化方法已知可用于转化双子叶植物。另外，de la Pena等，1987，Nature 325：274-276；Rhodes等，1988，Science240：204-207和Shimamoto等，1989，Nature 328：274-276(所有这些文献通过引用引入本申请)已经用土壤杆菌转化谷类单子叶植物。另外参见Bechtold和Pelletier，1998，Methods Mol.Biol.82：259-266，其表明真空渗入用于土壤杆菌介导的转化的用途。

蛋白质、多肽或核酸分子在特定细胞中的存在可以进行测量以确定，例如是否细胞已经被成功转化或转染。完成这种分析的能力是公知的，因而不需要在此反复说明。

定量纤维长度和植物高度

单词“纤维”通常用于对共有以下特征的各种各样植物细胞类型进行统一：具有细长的形状和厚细胞壁(通常，但并不总是，描述为次生壁)中具有丰富的纤维素。这种细胞壁可能木质化或可能未木质化，且这类细胞的原生质体可能在成熟时保持存活或不存活。在某些行业中，术语“纤维”通常包括厚壁传导细胞，如导管和管胞，和许多个体纤维细胞的纤维聚集体。为了本发明的目的，术语“纤维”包括：(a)木质部的传导和非传导细胞；(b)木质部外来源的纤维，包括来自韧皮部、树皮、基本组织和表皮的纤维和(c)来自茎、叶、根、种子和花或花序的纤维。

本发明的转基因植物特征是纤维长度增加，且优选高度也增加。遗传工程化植物中纤维长度的增加优选是通过发生细胞膨胀的植物组织中WAK的超表达实现的。在描述本发明的植物时，“纤维长度增加”指的是与野生型植物中纤维细胞的长度相比，植物中纤维细胞的长度量增大。纤维长度的量增大可以通过几种技术测量，例如数字化、Kajaani方法和纤维质量分析仪。Han等，1999，In：KenafProperties，Processing and Products，Mississipi State University，Ag&Bio Engineering，pp 149-167。

本发明的工程植物中的纤维长度比野生型植物的纤维长度长至少5-15％，优选至少10-30％，且最优选至少20-50％。

因为纤维长度增加可能跟随着植物高度的增加，本发明的转基因植物可以具增大的纤维长度和高度。因此在本说明书中，短语“植物高度增加”表示与野生型植物的高度相比植物高度的量增大。本发明的工程植物的高度可以增加到野生型植物高度的大约5％-大约90％，优选大约10％-大约75％，甚至更优选大约15％-大约65％的水平。

************************

下面给出获得细胞壁关联激酶基因以及通过土壤杆菌引入目标基因以产生植物转化体的特定实施例。它们是示例性的且不构成对本发明的限制。

实施例1

从拟南芥分离细胞壁关联激酶DNA序列

(a)从拟南芥茎的RNA制备和cDNA合成

三个月大的拟南芥植物的茎插条切割成小片，在液氮中冷冻并用于通过溴化十六烷三甲基铵(CTAB)提取方法进行RNA提取。Aldrich和Cullis，1993，Plant Mol.Biol.Report，11：128-141。cDNA池用于其中分离的总RNA用作模板的RT-PCR试验，且Superscript II逆转录酶(Invitrogen)和寡(dT)引物用于合成第一链cDNA。如下所述，双链cDNA使用基因特异性引物通过后续的聚合酶反应获得。

(b)引物设计

表现来自拟南芥的细胞壁关联激酶4mRNA的cDNA序列已确认并以登录号NM101974保存于GenBank中。基于这一序列，DNA寡聚体合成为PCR引物，包括编码细胞壁关联激酶4的主ORF的第一密码子ATG附近的区域或终止密码子附近的区域。

引物设计为扩增胞壁关联激酶4的ORF的整个编码区域，即从ATG到翻译终止密码子。引物的序列在下面给出：

WAK_NDE 长度：23 SEQ ID NO：11

CATATGAAAGTGCAGCGTCTGTT

WAK_XBA 长度：23 SEQ ID NO：12

TCTAGATCAGCGGCCTGCTTCAA

(c)PCR扩增

在(a)中获得的cDNA样品用作模板，且在(b)中设计的引物用于PCR。PCR步骤包括在94℃1分钟、50℃1分钟和72℃2分钟的40个循环，接着在72℃7分钟的额外延长步骤。PCR产物通过1.0％琼脂糖的凝胶电泳进行分离，接着进行电泳凝胶的溴化乙锭染色和在UV透射仪中检测扩增带。核实所检测的扩增带并用剃刀切割琼脂糖凝胶。凝胶片转移到1.5mL的微管中，且DNA片段使用GFX PCR净化和凝胶带纯化试剂盒(Amersham)分离和纯化。回收的DNA片段亚克隆到pGEM-T克隆载体(Promega)中，转化到大肠杆菌中，然后用于按照通常方式制备质粒DNA，其随后使用BigDye化学(AppliedBiosystems)通过双脱氧法测序以产生这里公开为SEQ ID NO：1的DNA序列，用于本发明的用途。

实施例2

转基因烟草(Nicotiana tabacum)植物的制备

在上面实施例1中获得的细胞壁关联激酶基因被引入植物宿主中以产生转基因烟草植物。

(a)构建体的制备和土壤杆菌的转化

表达构建体通过用合适的限制性内切酶切割上面实施例1中获得的细胞壁关联激酶基因以包括所有的可译框架并与合适的启动子一起将该基因插入植物转化载体pALELLYX-WAK(图1)中而制备。例如，实施例1中获得的细胞壁关联激酶基因被克隆到上述表达载体中来自美洲黑杨的木质部-优先管状蛋白基因(TUB)启动子的下游，如国际申请WO 2005/096805中所述。获得的表达构建体在大肠杆菌中扩增，然后通过冻融转化到根癌土壤杆菌LBA4404品系中。

(b)土壤杆菌介导的烟草转化

烟草属的种的转化使用Horsh等，1985，Science 227：1229的叶盘方法利用包含可操作地与木质部-优先基因的TUB启动子连接的(a)中获得的细胞壁关联激酶基因的核酸构建体完成。转化体在包含100mg/L的卡那霉素和500mg/L的羧苄青霉素(Sigma)的Murashige和Skoog培养基(Sigma，St.Louis，MO)上选择。使转化的烟草苗在Murashige和Skoog培养基上生根，且随后转移到土壤中并在温室中生长。

(c)外源基因插入宿主植物基因组中的PCR核实

PCR可用于核实基因构建体在转基因植物基因组中的整合。PCR反应混合物在50μL的总体积中含有100ng转化植物的基因组DNA及0.2μM的如上所述的各引物、100μM的各脱氧核糖核苷三磷酸、5μL的PCR缓冲液和2.5单位的AmpliTaq DNA聚合酶(AppliedBiosystems)。循环参数如下：94℃1分钟、50℃1分钟和72℃3分钟，40个循环，加上72℃5分钟的延伸。PCR产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳。

(d)转基因植物中转基因表达水平的确定

半定量RT-PCR用于检测转基因植物的茎组织中细胞壁关联激酶转录物的累积。总RNA使用Aldrich和Cullis，1993，Plant Mol.Biol.Report，11：128-141的CTAB方法从3个月大转基因烟草T0和T1植物的茎插条分离。

cDNA使用Superscript II核糖核酸酶H-RT(Invitrogen，USA)从500ng的总RNA合成。上面描述的引物与作为内部对照以使各样品中使用的总RNA的质量标准化的用于编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的组成性基因的引物一起使用。PCR以第一链cDNA的12.5倍稀释在以下条件下进行：94℃3分钟和27个循环的94℃1分钟，52-60℃45秒，及72℃1分30秒。

实施例3

在维管组织中超表达细胞壁关联激酶基因的烟草转基因植物中纤维长度的增加

对应于5个月大转基因和对照植物的50％高度的茎区域在70℃下乙酸-过氧化物溶液中浸解48小时或者直到获得单细胞。细胞用番红染色并在装配有与个人计算机连接的照相机(Sony)的显微镜(LeicaDMIL)下检验。细胞(大约每个家系100个)使用“Image Tool”软件直接在筛分机(screen)测量。

已知按照实施例2中详细描述的过程表达转基因的三个转基因事件显示纤维长度的统计学显著的增加(图2)。转基因事件43B与对照植物相比表现出纤维长度21％的增加(P＜0.05，t检验)。转基因事件47B与对照植物相比表现出纤维长度19％的增加(图2；P＜0.05，t检验)。另外，转基因事件48B与对照植物相比表现出纤维长度15％的增加(图2；P＜0.05，t检验)。

值得注意的是，通过果胶甲酯酶基因的超表达增加纤维长度的另一策略(Berthold等，WO 2006/068603)已经获得与对照植物相比转基因植物纤维长度仅5％的增加。

在生长到成熟后，T0事件自我受精(self)以产生T1品系。当与纯合隐性植物相比时，纯合显性的植物在纤维长度上存在着10％的显著增长(P＜0.05，t检验)。这些结果在两个不同的家系中观察到(图3和图4)。

实施例4

在维管组织中超表达细胞壁关联激酶基因的烟草转基因植物中植物高度的增加

由转基因植物的自体受精产生的T1后代在播种3周后个别地移栽到花盆中。定期对生长进行测量直到首次开花(植物大约5个月大)，并记录为总高度。

表现的结果是在不同品系的纯合显性植物中观察到植物高度增加的实例。对来自事件51B的三个基因型的植物高度进行了对比。纯合显性植物比纯合隐性植物高12％。半合子植物比纯合隐性植物高9％(P＜0.05，t检验)(图5)。

实施例5

转基因杨属植物的制备

在上述实施例1中获得的基因引入植物宿主中以产生转基因杨属植物。

(a)构建体的制备和土壤杆菌的转化

表达构建体可以通过用合适的限制性内切酶切割上面实施例1中获得的细胞壁关联激酶基因以包括所有的可译框架，并与合适的启动子一起将该基因插入植物转化载体pALELLYX-WAK(图1)中而制备。例如，实施例1中获得的细胞壁关联激酶基因被克隆到上述表达载体中来自美洲黑杨的木质部-优先管状蛋白基因(TUB)启动子的下游，如国际申请WO 2005/096805中所述。获得的表达构建体在大肠杆菌中扩增，然后通过冻融转化到根癌土壤杆菌LBA4404家系中。

(b)土壤杆菌介导的杨属转化

野生型山杨使用携带包含可操作地与木质部-优先基因(TUB)的启动子连接的实施例1中获得的拟南芥细胞壁关联激酶基因的构建体的根癌土壤杆菌转化。来自体外微繁殖的植物的叶柄和节间茎段用作外植体。转化的苗在包含100mg/L的卡那霉素的再生培养基上选择并使其在Murashige和Skoog培养基上生根。所选择的植物随后转移到土壤中并在温室中生长。

序列表

<110>GERHARDT，Isabel Rodrigues

ARRUDA，Paulo

<120>用于改变纤维长度和/或植物高度的核酸构建体和方法

<130>

<140>

<141>

<150>US 60/871,048

<151>2006-12-20

<160>12

<210>1

<211>2217

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>mRNA

<222>(1)...(2217)

<223>细胞壁关联激酶4，cDNA，完整CD

<400>1

atg aaa gtg cag cgt ctg ttc tta gta gct att ttc tgc ctc tct tat 48

Met Lys Val Gln Arg Leu Phe Leu Val Ala Ile Phe Cys Leu Ser Tyr

1 5 10 15

atg cag ctg gtc aag ggg caa acc ttg cct cgt tgc ccc gaa aaa tgt 96

Met Gln Leu Val Lys Gly Gln Thr Leu Pro Arg Cys Pro Glu Lys Cys

20 25 30

ggc aac gtt aca ctt gag tac cct ttt ggc ttt tct cca ggt tgt tgg 144

Gly Asn Val Thr Leu Glu Tyr Pro Phe Gly Phe Ser Pro Gly Cys Trp

35 40 45

cgt gcc gaa gat cct agt ttc aat ctc agt tgt gtg aac gag aat cta 192

Arg Ala Glu Asp Pro Ser Phe Asn Leu Ser Cys Val Asn Glu Asn Leu

50 55 60

ttc tat aag ggc ctt gaa gtg gtc gaa ata tct cac agc agc cag tta 240

Phe Tyr Lys Gly Leu Glu Val Val Glu Ile Ser His Ser Ser Gln Leu

65 70 75 80

cgc gtc cta tat cct gca tcc tac att tgc tac aac agc aaa gga aag 288

Arg Val Leu Tyr Pro Ala Ser Tyr Ile Cys Tyr Asn Ser Lys Gly Lys

85 90 95

ttc gct aaa ggg act tac tac tgg agt aat cta ggt aat ttg act ctc 336

Phe Ala Lys Gly Thr Tyr Tyr Trp Ser Asn Leu Gly Asn Leu Thr Leu

100 105 110

tcc ggc aac aac acg att act gca tta ggc tgt aac tcg tac gct ttt 384

Ser Gly Asn Asn Thr Ile Thr Ala Leu Gly Cys Asn Ser Tyr Ala Phe

115 120 125

gtg tcc tct aat gga act cga aga aac tca gtt gga tgc ata tca gca 432

Val Ser Ser Asn Gly Thr Arg Arg Asn Ser Val Gly Cys Ile Ser Ala

130 135 140

tgt gat gct ctt tcc cat gaa gca aat gga gaa tgt aat ggt gaa ggc 480

Cys Asp Ala Leu Ser His Glu Ala Asn Gly Glu Cys Asn Gly Glu Gly

145 150 155 160

tgc tgc cag aac ccc gtc cct gca ggg aac aat tgg tta ata gtc aga 528

Cys Cys Gln Asn Pro Val Pro Ala Gly Asn Asn Trp Leu Ile Val Arg

165 170 175

tca tat cgc ttt gac aac gac acg tca gtg caa cct atc tct gag ggt 576

Ser Tyr Arg Phe Asp Asn Asp Thr Ser Val Gln Pro Ile Ser Glu Gly

180 185 190

caa tgc atc tac gcc ttt ctc gtt gaa aat ggc aag ttt aag tac aat 624

Gln Cys Ile Tyr Ala Phe Leu Val Glu Asn Gly Lys Phe Lys Tyr Asn

195 200 205

gct tcg gac aaa tat tct tat ctg cag aat agg aat gtg ggg ttt cct 672

Ala Ser Asp Lys Tyr Ser Tyr Leu Gln Asn Arg Asn Val Gly Phe Pro

210 215 220

gtg gtc ttg gat tgg tct att agg gga gag aca tgt ggg caa gtt gga 720

Val Val Leu Asp Trp Ser Ile Arg Gly Glu Thr Cys Gly Gln ValGly

225 230 235 240

gaa aag aaa tgc ggt gtg aat ggc ata tgt tcc aat tct gct agt ggg 768

Glu Lys Lys Cys Gly Val Asn Gly Ile Cys Ser Asn Ser Ala Ser Gly

245 250 255

atc ggg tat aca tgc aaa tgc aaa gga ggt ttc cag ggg aat cca tat 816

Ile Gly Tyr Thr Cys Lys Cys Lys Gly Gly Phe Gln Gly Asn Pro Tyr

260 265 270

ctt caa aac ggt tgc caa gac atc aat gag tgt act act gct aat cct 864

Leu Gln Asn Gly Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Thr Thr Ala Asn Pro

275 280 285

atc cat aaa cat aac tgc tcg ggt gac agc acc tgt gaa aac aag ttg 912

lle His Lys His Asn Cys Ser Gly Asp Ser Thr Cys Glu Asn Lys Leu

290 295 300

gga cac ttc cgt tgt aat tgt cga tct cgt tac gaa tta aat acc acc 960

Gly His Phe Arg Cys Asn Cys Arg Ser Arg Tyr Glu Leu Asn Thr Thr

305 310 315 320

act aat acc tgc aaa cct aaa ggc aat cct gaa tac gtt gaa tgg act 1008

Thr Asn Thr Cys Lys Pro Lys Gly Asn Pro Glu Tyr Val Glu Trp Thr

325 330 335

aca att gtt ctt gga acc act atc ggc ttc ttg gtc att ctg ctt gcc 1056

Thr Ile Val Leu Gly Thr Thr Ile Gly Phe Leu Val Ile Leu Leu Ala

340 345 350

att agc tgt ata gaa cat aaa atg aag aac acc aag gac acc gag ctc 1104

Ile Ser Cys Ile Glu His Lys Met Lys Asn Thr Lys Asp Thr Glu Leu

355 360 365

cga caa caa ttc ttc gag caa aat ggt ggc ggc atg ttg atg cag cga 1152

Arg Gln Gln Phe Phe Glu Gln Asn Gly Gly Gly Met Leu Met Gln Arg

370 375 380

ctc tca gga gca ggg cca tca aat gtt gat gtc aaa atc ttc act gag 1200

Leu Ser Gly Ala Gly Pro Ser Asn Val Asp Val Lys Ile Phe Thr Glu

385 390 395 400

gaa gga atg aag gaa gca act gat ggt tat gat gag aac aga atc ttg 1248

Glu Gly Met Lys Glu Ala Thr Asp Gly Tyr Asp Glu Asn Arg Ile Leu

405 410 415

ggc cag gga ggc caa gga aca gtc tac aaa ggt ata tta ccg gac aac 1296

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Gly Cys Cys Gln Ile Pro Val Pro Arg Gly Tyr Ser Phe Val Arg Val

165 170 175

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180 185 190

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210 215 220

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225 230 235 240

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245 250 255

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260 265 270

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325 330 335

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340 345 350

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355 360 365

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450 455 460

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545 550 555 560

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180 185 190

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Gly Val Cys Gly Gly Asn Ser Thr Cys Phe Asp Ser Thr Gly Gly Thr

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565 570 575

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580 585 590

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gga tgc ttg tca tta tgc aat tct caa cca gag gca aat gga aga tgt 480

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165 170 175

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180 185 190

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580 585 590

ctg aac gag aag agc gat gtg tat agc ttt ggg gta gtc ctc atg gaa 1824

Leu Asn Glu Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Met Glu

595 600 605

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Leu Leu Ser Gly Gln Lys Ala Leu Cys Phe Glu Arg Pro Gln Ala Ser

610 615 620

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690 695 700

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Asp Trp Ser Ile Gly Asn Gln Thr Cys Glu Gln Ala Gly Ser Thr Arg

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Ile Cys Gly Lys Asn Ser Ser Cys Tyr Asn Ser Thr Thr Arg Asn Gly

260 265 270

Tyr Ile Cys Lys Cys Asn Glu Gly Tyr Asp Gly Asn Pro Tyr Arg Ser

275 280 285

Glu Gly Cys Lys Asp Ile Asp Glu Cys Ile Ser Asp Thr His Asn Cys

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Lys Ile Phe Thr Glu Glu Gly Met Lys Glu Ala Thr Asn Gly Tyr Asp

405 410 415

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Ala Ser Lys Leu Ile Pro Met Asp Lys Glu Gln Leu Thr Thr Met Val

565 570 575

Gln Gly Thr Leu Gly Tyr Leu Asp Pro Glu Tyr Tyr Thr Thr Gly Leu

580 585 590

Leu Asn Glu Lys Ser Asp Val Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Met Glu

595 600 605

Leu Leu Ser Gly Gln Lys Ala Leu Cys Phe Glu Arg Pro Gln Ala Ser

610 615 620

Lys His Leu Val Ser Tyr Phe Val Ser Ala Thr Glu Glu Asn Arg Leu

625 630 635 640

His Glu Ile Ile Asp Asp Gln Val Leu Asn Glu Asp Asn Leu Lys Glu

645 650 655

Ile Gln Glu Ala Ala Arg Ile Ala Ala Glu Cys Thr Arg Leu Met Gly

660 665 670

Glu Glu Arg Pro Arg Met Lys Glu Val Ala Ala Lys Leu Glu Ala Leu

675 680 685

Arg Val Glu Lys Thr Lys His Lys Trp Ser Asp Gln Tyr Pro Glu Glu

690 695 700

Asn Glu His Leu Ile Gly Gly His Ile Leu Ser Ala Gln Gly Glu Thr

705 710 715 720

Ser Ser Ser Ile Gly Tyr Asp Ser Ile Lys Asn Val Ala Ile Leu Asp

725 730 735

Ile Glu Thr Gly Arg

740

<210>9

<211>2202

<212>DNA

<213>拟南芥

<220>

<221>mRNA

<222>(1)...(2202)

<223>细胞壁关联激酶5，cDNA，完整CDS

<400>9

atg aag gtg cat agt ctg ttc ttg atg gct att ttc ttc tac cta gca 48

Met Lys Val His Ser Leu Phe Leu Met Ala Ile Phe Phe Tyr Leu Ala

5 10 15

tat acg cag ctg gtc aag gcg caa cct cgc gat gat tgc caa act aga 96

Tyr Thr Gln Leu Val Lys Ala Gln Pro Arg Asp Asp Cys Gln Thr Arg

20 25 30

tgt ggt gac gtc cca att gat tac cct ttt ggt att tct aca ggt tgt 144

Cys Gly Asp Val Pro Ile Asp Tyr Pro Phe Gly Ile Ser Thr Gly Cys

35 40 45

tac tac ccc gga gat gat agc ttc aat att acc tgt gag gaa gat aaa 192

Tyr Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Phe Asn Ile Thr Cys Glu Glu Asp Lys

50 55 60

cca aat gtc tta agc aac att gaa gtg cta aac ttt aat cat agc ggc 240

Pro Asn Val Leu Ser Asn Ile Glu Val Leu Asn Phe Asn His Ser Gly

65 70 75 80

cag cta cgc ggt ctg att cct cga tcc act gtt tgc tac gac cag caa 288

Gln Leu Arg Gly Leu Ile Pro Arg Ser Thr Val Cys Tyr Asp Gln Gln

85 90 95

aca aat aat gat ttc gag tcc ctc tgg ttt cgg ttg gat aat tta tct 336

Thr Asn Asn Asp Phe Glu Ser Leu Trp Phe Arg Lou Asp Asn Leu Ser

100 105 110

ttc tcc ccc aat aac aag ttt act tta gta ggc tgt aac gct tgg gca 384

Phe Ser Pro Asn Asn Lys Phe Thr Leu Val Gly Cys Asn Ala Trp Ala

115 120 125

ctt cta agc act ttt gga ata caa aac tac tca act gga tgt atg tca 432

Leu Leu Ser Thr Phe Gly Ile Gln Asn Tyr Ser Thr Gly Cys Met Ser

130 135 140

tta tgc gat act ccc ccg ccg cca aat agt aaa tgt aat ggt gtt ggt 480

Leu Cys Asp Thr Pro Pro Pro Pro Asn Ser Lys Cys Asn Gly Val Gly

145 150 155 160

tgc tgc aga aca gag gta tct atc ccc ttg gat agc cat aga att gaa 528

Cys Cys Arg Thr Glu Val Ser Ile Pro Leu Asp Ser His Arg Ile Glu

165 170 175

act caa cca tct cgc ttc gaa aac atg act tcc gtg gag cac ttt aat 576

Thr Gln Pro Ser Arg Phe Glu Asn Met Thr Ser Val Glu His Phe Asn

180 185 190

cct tgc agc tac gct ttt ttc gtt gaa gat ggt atg ttt aac ttc agt 624

Pro Cys Ser Tyr Ala Phe Phe Val Glu Asp Gly Met Phe Asn Phe Ser

195 200 205

tct tta gaa gat ctt aag gat ctg cga aat gtc acg agg ttc cct gtg 672

Ser Leu Glu Asp Leu Lys Asp Leu Arg Asn Val Thr Arg Phe Pro Val

210 215 220

tta cta gat tgg tct att gga aac cag aca tgt gag caa gtt gta ggt 720

Leu Leu Asp Trp Ser Ile Gly Asn Gln Thr Cys Glu Gln Val Val Gly

225 230 235 240

aga aac ata tgt ggt ggg aac agc aca tgt ttt gat tct act cgt gga 768

Arg Asn Ile Cys Gly Gly Asn Ser Thr Cys Phe Asp Ser Thr Arg Gly

245 250 255

aag ggt tat aac tgc aag tgt tta caa ggt ttt gat ggg aat cca tac 816

Lys Gly Tyr Asn Cys Lys Cys Leu Gln Gly Phe Asp Gly Asn Pro Tyr

260 265 270

ctt tcg gac ggt tgc caa gac atc aat gag tgt act acc cgt ata cat 864

Leu Ser Asp Gly Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Thr Thr Arg Ile His

275 280 285

aac tgt tcg gat acc agc aca tgt gaa aac aca ctt gga agc ttc cat 912

Asn Cys Ser Asp Thr Ser Thr Cys Glu Asn Thr Leu Gly Ser Phe His

290 295 300

tgt cag tgc cca tct ggt tct gat tta aat acc act act atg agc tgc 960

Cys Gln Cys Pro Ser Gly Ser Asp Leu Asn Thr Thr Thr Met Ser Cys

305 310 315 320

att gac aca cct aaa gaa gag cct aag tac tta gga tgg act act gtt 1008

Ile Asp Thr Pro Lys Glu Glu Pro Lys Tyr Leu Gly Trp Thr Thr Val

325 330 335

ctt ctt gga acc acc atc gga ttc tta atc atc ttg ctt acc att agc 1056

Leu Leu Gly Thr Thr Ile Gly Phe Leu Ile Ile Leu Leu Thr Ile Ser

340 345 350

tat ata caa caa aaa atg agg cac cga aaa aac acc gag ctg cga caa 1104

Tyr Ile Gln Gln Lys Met Arg His Arg Lys Asn Thr Glu Leu Arg Gln

355 360 365

caa ttc ttc gag caa aat ggt ggt ggc atg ttg ata cag cga ctc tca 1152

Gln Phe Phe Glu Gln Asn Gly Gly Gly Met Leu Ile Gln Arg Leu Ser

370 375 380

gga gca ggg cca tca aat gtg gat gtc aaa atc ttt act gaa gaa ggc 1200

Gly Ala Gly Pro Ser Asn Val Asp Val Lys Ile Phe Thr Glu Glu Gly

385 390 395 400

atg aag gaa gca act gat ggt tat aat gag agc aga atc cta ggc cag 1248

Met Lys Glu Ala Thr Asp Gly Tyr Asn Glu Ser Arg Ile Leu Gly Gln

405 410 415

gga gga caa gga aca gtc tac aaa ggg ata ttg caa gat aac tcc att 1296

Gly Gly Gln Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Leu Gln Asp Asn Ser Ile

420 425 430

gtt gct ata aag aaa gct cga ctt gga gac cgt agc caa gta gag cag 1344

Val Ala Ile Lys Lys Ala Arg Leu Gly Asp Arg Ser Gln Val Glu Gln

435 440 445

ttc atc aac gaa gtg cta gtg ctt tca caa ata aac cac agg aac gtg 1392

Phe Ile Asn Glu Val Leu Val Leu Ser Gln Ile Asn His Arg Asn Val

450 455 460

gtc aaa ctc ttg ggc tgt tgt cta gag act gaa gtt ccc ttg ttg gtc 1440

Val Lys Leu Leu Gly Cys Cys Leu Glu Thr Glu Val Pro Leu Leu Val

465 470 475 480

tat gag ttc att tcc agt ggc act ctt ttt gat cac ttg cac ggt tct 1488

Tyr Glu Phe Ile Ser Ser Gly Thr Leu Phe Asp His Leu His Gly Ser

485 490 495

atg ttt gat tct tcg ctt aca tgg gaa cac cgt ctg agg ata gcc ata 1536

Met Phe Asp Ser Ser Leu Thr Trp Glu His Arg Leu Arg Ile Ala Ile

500 505 510

gaa gtt gct gga act ctt gca tat ctt cac tcc tat gct tct att cca 1584

Glu Val Ala Gly Thr Leu Ala Tyr Leu His Ser Tyr Ala Ser Ile Pro

515 520 525

atc atc cac cga gat gtc aag act gct aac att ctc ctc gat gaa aac 1632

Ile Ile His Arg Asp Val Lys Thr Ala Asn Ile Leu Leu Asp Glu Asn

530 535 540

tta act gca aaa gta gct gat ttt ggt gca tca agg ctg ata ccg atg 1680

Leu Thr Ala Lys Val Ala Asp Phe Gly Ala Ser Arg Leu Ile Pro Met

545 550 555 560

gac caa gag cag ctc aca act atg gtt caa gga act ctt ggc tat tta 1728

Asp Gln Glu Gln Leu Thr Thr Met Val Gln Gly Thr Leu Gly Tyr Leu

565 570 575

gac cct gaa tac tac aat aca ggg ctt ctg aac gaa aag agc gat gtt 1776

Asp Pro Glu Tyr Tyr Asn Thr Gly Leu Leu Asn Glu Lys Ser Asp Val

580 585 590

tat agc ttt ggg gta gtc ctc atg gaa ctg ctc tca ggt gaa aag gca 1824

Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Met Glu Leu Leu Ser Gly Glu Lys Ala

595 600 605

tta tgc ttt gaa cgg cca caa agc tca aaa cat cta gtg agt tac ttt 1872

Leu Cys Phe Glu Arg Pro Gln Ser Ser Lys His Leu Val Ser Tyr Phe

610 615 620

gtt tct gcc atg aaa gaa aat agg ttg cat gag att att gac ggt caa 1920

Val Ser Ala Met Lys Glu Asn Arg Leu His Glu Ile Ile Asp Gly Gln

625 630 635 640

gtt atg aac gag tat aat cag agg gag atc cag gaa tct gca aga att 1968

Val Met Asn Glu Tyr Asn Gln Arg Glu Ile Gln Glu Ser Ala Arg Ile

645 650 655

gct gtt gag tgt aca aga att atg gga gag gaa agg cca agt atg aaa 2016

Ala Val Glu Cys Thr Arg Ile Met Gly Glu Glu Arg Pro Ser Met Lys

660 665 670

gaa gta gct gca gag tta gag gcc ttg aga gtc aaa aca acc aaa cat 2064

Glu Val Ala Ala Glu Leu Glu Ala Leu Arg Val Lys Thr Thr Lys His

675 680 685

cag tgg tca gat caa tat ccc aag gag gtt gag cat ttg ctt ggt gtt 2112

Gln Trp Ser Asp Gln Tyr Pro Lys Glu Val Glu His Leu Leu Gly Val

690 695 700

caa atc tta tcg acg caa ggt gat acc agt agc att ggc tat gac agc 2160

Gln Ile Leu Ser Thr Gln Gly Asp Thr Ser Ser Ile Gly Tyr Asp Ser

705 710 715 720

atc cag aat gta aca agg ttg gac att gaa act ggc cgc tga 2202

Ile Gln Asn Val Thr Arg Leu Asp Ile Glu Thr Gly Arg

725 730

<210>10

<211>733

<212>PRT

<213>拟南芥

<220>

<400>10

Met Lys Val His Ser Leu Phe Leu Met Ala Ile Phe Phe Tyr Leu Ala

5 10 15

Tyr Thr Gln Leu Val Lys Ala Gln Pro Arg Asp Asp Cys Gln Thr Arg

20 25 30

Cys Gly Asp Val Pro Ile Asp Tyr Pro Phe Gly Ile Ser Thr Gly Cys

35 40 45

Tyr Tyr Pro Gly Asp Asp Ser Phe Asn Ile Thr Cys Glu Glu Asp Lys

50 55 60

Pro Asn Val Leu Ser Asn Ile Glu Val Leu Asn Phe Asn His Ser Gly

65 70 75 80

Gln Leu Arg Gly Leu Ile Pro Arg Ser Thr Val Cys Tyr Asp Gln Gln

85 90 95

Thr Asn Asn Asp Phe Glu Ser Leu Trp Phe Arg Leu Asp Asn Leu Ser

100 105 110

Phe Ser Pro Asn Asn Lys Phe Thr Leu Val Gly Cys Asn Ala Trp Ala

115 120 125

Leu Leu Ser Thr Phe Gly Ile Gln Asn Tyr Ser Thr Gly Cys Met Ser

130 135 140

Leu Cys Asp Thr Pro Pro Pro Pro Asn Ser Lys Cys Asn Gly Val Gly

145 150 155 160

Cys Cys Arg Thr Glu Val Ser Ile Pro Leu Asp Ser His Arg Ile Glu

165 170 175

Thr Gln Pro Ser Arg Phe Glu Asn Met Thr Ser Val Glu His Phe Asn

180 185 190

Pro Cys Ser Tyr Ala Phe Phe Val Glu Asp Gly Met Phe Asn Phe Ser

195 200 205

Ser Leu Glu Asp Leu Lys Asp Leu Arg Asn Val Thr Arg Phe Pro Val

210 215 220

Leu Leu Asp Trp Ser Ile Gly Asn Gln Thr Cys Glu Gln Val Val Gly

225 230 235 240

Arg Asn Ile Cys Gly Gly Asn Ser Thr Cys Phe Asp Ser Thr Arg Gly

245 250 255

Lys Gly Tyr Asn Cys Lys Cys Leu Gln Gly Phe Asp Gly Asn Pro Tyr

260 265 270

Leu Ser Asp Gly Cys Gln Asp Ile Asn Glu Cys Thr Thr Arg Ile His

275 280 285

Asn Cys Ser Asp Thr Ser Thr Cys Glu Asn Thr Leu Gly Ser Phe His

290 295 300

Cys Gln Cys Pro Ser Gly Ser Asp Leu Asn Thr Thr Thr Met Ser Cys

305 310 315 320

Ile Asp Thr Pro Lys Glu Glu Pro Lys Tyr Leu Gly Trp Thr Thr Val

325 330 335

Leu Leu Gly Thr Thr Ile Gly Phe Leu Ile Ile Leu Leu Thr Ile Ser

340 345 350

Tyr Ile Gln Gln Lys Met Arg His Arg Lys Asn Thr Glu Leu Arg Gln

355 360 365

Gln Phe Phe Glu Gln Asn Gly Gly Gly Met Leu Ile Gln Arg Leu Ser

370 375 380

Gly Ala Gly Pro Ser Asn Val Asp Val Lys Ile Phe Thr Glu Glu Gly

385 390 395 400

Met Lys Glu Ala Thr Asp Gly Tyr Asn Glu Ser Arg Ile Leu Gly Gln

405 410 415

Gly Gly Gln Gly Thr Val Tyr Lys Gly Ile Leu Gln Asp Asn Ser Ile

420 425 430

Val Ala Ile Lys Lys Ala Arg Leu Gly Asp Arg Ser Gln Val Glu Gln

435 440 445

Phe Ile Asn Glu Val Leu Val Leu Ser Gln Ile Asn His Arg Asn Val

450 455 460

Val Lys Leu Leu Gly Cys Cys Leu Glu Thr Glu Val Pro Leu Leu Val

465 470 475 480

Tyr Glu Phe Ile Ser Ser Gly Thr Leu Phe Asp His Leu His Gly Ser

485 490 495

Met Phe Asp Ser Ser Leu Thr Trp Glu His Arg Leu Arg Ile Ala Ile

500 505 510

Glu Val Ala Gly Thr Leu Ala Tyr Leu His Ser Tyr Ala Ser Ile Pro

515 520 525

Ile Ile His Arg Asp Val Lys Thr Ala Asn Ile Leu Leu Asp Glu Asn

530 535 540

Leu Thr Ala Lys Val Ala Asp Phe Gly Ala Ser Arg Leu Ile Pro Met

545 550 555 560

Asp Gln Glu Gln Leu Thr Thr Met Val Gln Gly Thr Leu Gly Tyr Leu

565 570 575

Asp Pro Glu Tyr Tyr Asn Thr Gly Leu Leu Asn Glu Lys Ser Asp Val

580 585 590

Tyr Ser Phe Gly Val Val Leu Met Glu Leu Leu Ser Gly Glu Lys Ala

595 600 605

Leu Cys Phe Glu Arg Pro Gln Ser Ser Lys His Leu Val Ser Tyr Phe

610 615 620

Val Ser Ala Met Lys Glu Asn Arg Leu His Glu Ile Ile Asp Gly Gln

625 630 635 640

Val Met Asn Glu Tyr Asn Gln Arg Glu Ile Gln Glu Ser Ala Arg Ile

645 650 655

Ala Val Glu Cys Thr Arg Ile Met Gly Glu Glu Arg Pro Ser Met Lys

660 665 670

Glu Val Ala Ala Glu Leu Glu Ala Leu Arg Val Lys Thr Thr Lys His

675 680 685

Gln Trp Ser Asp Gln Tyr Pro Lys Glu Val Glu His Leu Leu Gly Val

690 695 700

Gln Ile Leu Ser Thr Gln Gly Asp Thr Ser Ser Ile Gly Tyr Asp Ser

705 710 715 720

Ile Gln Asn Val Thr Arg Leu Asp Ile Glu Thr Gly Arg

725 730

<210>11

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸(WAK_NDE PCR引物)

<400>11

catatgaaag tgcagcgtct gtt 23

<210>12

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成寡核苷酸(WAK_XBA PCR引物)

<400>12

tctagatcag cggcctgctt caa 23

Claims

1.一种用于增加纤维长度和/或植物高度的核酸构建体，包含与木质部优先启动子可操作地连接的编码功能性细胞壁关联激酶4的多核苷酸序列，该启动子引起所述编码功能性细胞壁关联激酶4的多核苷酸序列的超表达。

2.如权利要求1所述的构建体，其中所述木质部优先启动子选自TUB基因启动子、SuSy基因启动子、COMT基因启动子和C4H基因启动子。

3.一种包含权利要求1的核酸构建体的转基因植物细胞。

4.如权利要求3所述的转基因植物细胞，其中所述木质部优先启动子选自TUB基因启动子、SuSy基因启动子、COMT基因启动子和C4H基因启动子。

5.如权利要求3所述的转基因植物细胞，其中所述植物是双子叶植物。

6.如权利要求3所述的转基因植物细胞，其中所述植物是单子叶植物。

7.如权利要求3所述的转基因植物细胞，其中所述植物是裸子植物。

8.如权利要求3所述的转基因植物细胞，其中所述植物是阔叶树。

9.如权利要求8所述的转基因植物细胞，其中所述阔叶树是桉(Eucalyptus)树。

10.如权利要求8所述的转基因植物细胞，其中所述阔叶树是杨(Populus)树。

11.如权利要求7所述的转基因植物细胞，其中所述裸子植物是松(Pinus)树。

12.增加纤维长度和/或植物高度的方法，包括：

(a)向植物细胞中引入权利要求1或2的核酸构建体；

(b)在促进植物生长的条件下培养所述植物细胞；和

(c)选择与同种的非转基因植物相比具有增加的纤维长度和/或植物高度的转基因植物。

13.如权利要求12所述的方法，其中所述木质部优先启动子选自TUB基因启动子、SuSy基因启动子、COMT基因启动子和C4H基因启动子。

14.从包含权利要求3的转基因植物细胞的转基因植物获得的木浆。

15.从包含权利要求3的转基因植物细胞的转基因植物获得的木纤维。