BR112018002567B1

BR112018002567B1 - Gene recombinante, célula hospedeira, método de produção de uma planta transgênica, método de efetuação de expressão preferencial em raiz de um ácido nucleico, método para alterar a tolerância ao estresse biótico ou abiótico, arquitetura de raiz, eficiência no uso de nutriente, ou rendimento de uma planta e uso de um ácido nucleico isolado

Info

Publication number: BR112018002567B1
Application number: BR112018002567-4A
Authority: BR
Inventors: Younousse SAIDI; Bart den Boer; Celine MOUCHEL; Stephane PIEN
Original assignee: BASF Agricultural Solutions Seed US LLC
Priority date: 2015-08-07
Filing date: 2016-07-19
Publication date: 2023-10-31
Also published as: WO2017025282A1; CN114032251A; US10844390B2; MX2018001408A; US20210040493A1; AU2016305181B2; AU2016305181A1; US20200056197A1; MA45638A; CA2994588A1; UY36846A; EP3332010A1; CN107849568A; BR112018002567A2; CN107849568B

Abstract

gene recombinante, célula hospedeira, método de produção de uma planta transgênica, método de efetuação de expressão preferencial em raiz de um ácido nucleico, método para alterar a tolerância ao estresse biótico ou abiótico, arquitetura de raiz, eficiência no uso de nutriente, ou rendimento de uma planta e uso de um ácido nucleico isolado. a presente invenção se refere ao campo da agricultura. em particular, a invenção fornece um promotor, um gene recombinante, plantas compreendendo os genes recombinantes e um método para aprimorar o rendimento de uma planta de algodão sob condições de estresse.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[0001] A presente invenção se refere ao campo da biotecnologia agrícola, mais especificamente, ao uso de um transgene para aprimorar o rendimento de planta sob condições de estresse. Em particular, é fornecido um método para expressar um gene que codifica uma Anexina de Brassica juncea em plantas para aprimorar o rendimento sob condição de estresse por seca. É fornecido um promotor preferencial em raiz induzido por estresse bem como um cassete de expressão para regular a expressão de Anexina preferencialmente nas raízes sob condições de estresse.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Nos últimos anos, o fenômeno do aquecimento global e seu efeito sobre a produção de espécies vegetais se tornou um problema crucial. Resolver esse problema no nível da planta é quase exclusivamente uma questão de lidar com estresse da planta. Instituições de pesquisa ambiental e agrícola internacionais bem como empresas agora constataram novamente o estresse da planta como um componente principal do efeito do aquecimento global na produção de alimentos local e global. A pesquisa para enfrentar esses desafios envolve disciplinas amplamente divergentes com ciências atmosféricas, ciência do solo, fisiologia vegetal, bioquímica, genética, melhoramento genético de plantas, biologia molecular e engenharia agrícola.

[0003] O estresse ambiental abiótico em plantas constitui uma grande limitação para a produção agrícola. Os principais estresses ambientais em plantas de importância econômica contemporânea no mundo todo são o estresse hídrico, incluindo a seca e inundações, frio (refrigeração e congelamento), calor, salinidade, extração de água, deficiência mineral do solo, toxicidade mineral do solo e estresse oxidativo. Esses fatores não estão isolados, mas também inter-relacionados e se influenciam.

[0004] Um grande desafio na prática agrícola e na pesquisa atual é, portanto, como lidar com o estresse ambiental das plantas em uma abordagem econômica e ambientalmente sustentável. Tendo em vista as regiões já existentes expostas a condições de estresse abiótico no mundo e as mudanças climáticas em curso, a provisão de plantas transgênicas que conferem resistência a pelo menos um tipo de estresse abiótico ainda é um objetivo importante para alcançar uma situação nutricional satisfatória também em regiões expostas a esse estresse abiótico no mundo.

[0005] O algodão (Gossypium spp.) é a fibra têxtil natural mais importante do mundo e também é uma cultura significativa de oleaginosas. A produção de algodão fornece renda para aproximadamente 250 milhões de famílias, e cerca de 150 países estão envolvidos na importação e na exportação do algodão. Seu impacto econômico é estimado em aproximadamente US$ 500 bilhões/ano em todo o mundo. O consumo mundial de fibra de algodão é aproximadamente 115 milhões de fardos ou aproximadamente 27 milhões de toneladas métricas por ano (National Cotton Council, www.cotton.org, 2006). O gênero Gossypium é relativamente complexo e inclui aproximadamente 45 espécies diploides (2n = 2x = 26) e cinco tetraploides (2n = 4x = 52), apresentando padrões dissômicos de herança. Espécies diploides (2n = 26) caem em oito grupos genômicos (A-G, e K). O clado africano, que compreende os genomas A, B, E e F, ocorre naturalmente na África e na Ásia, enquanto o clado do genoma D é indígena das Américas. Um terceiro clado diploide, incluindo C, G e K, é encontrado na Austrália. Todas as 52 espécies de cromossomos, incluindo Gossypium hirsutum e Gossypium barbadense, são alotetraploides naturais clássicos que surgiram no Novo Mundo a partir da hibridização interespecífica entre uma espécie africana ancestral tipo genoma A e uma espécie americana do tipo genoma D. Os parentes mais próximos dos progenitores tetraplóides originais são as espécies de genoma A Gossypium herbaceum (A1) e Gossypium arboreum (A2) e as espécies de genoma D Gossypium raimondii (D5) ‘Ulbrich’. Estima-se que a poliploidização tenha ocorrido há 1 a 2 milhões de anos, dando origem a cinco espécies allotetraploides existentes. Curiosamente, as espécies do genoma A produzem fibras que podem ser fiadas e são cultivadas em uma escala limitada, enquanto as espécies do genoma D não. Mais de 95 % da safra de algodão anual em todo o mundo é G. hirsutum, algodão do México (Upland) ou Americano, e o algodão de fibra extralonga ou Pima (G. barbadense) representam menos de 2 % (National Cotton Council, www.cotton.org, 2006).

[0006] Além de sua importância para a indústria têxtil, a agricultura de algodão também fornece sementes de algodão para alimentar gado, gado leiteiro e aves de capoeira, enquanto o óleo de semente de algodão é usado para produtos alimentares como o óleo de cozinha (National Cotton Council, www.cotton.org, 2016).

[0007] Embora as plantas de algodão sejam naturalmente muito tolerantes à seca em comparação com outras culturas e são cultivadas principalmente sem irrigação (Cotton Today), o rendimento do algodão é severamente afetado por períodos de seca, especialmente no pico de floração, com cada dia de estresse por seca reduzindo o rendimento de fiapos em mais de 18 kg/ha (Gibb et al. 2013, WATERpak seção 3.1, páginas 117-126).

[0008] A soja (Glycine max (L.) Merrill) é a principal fonte mundial de óleo vegetal e farinha de proteínas. O óleo extraído da soja é usado para óleo de cozinha, margarina e molhos de salada. O óleo de soja é composto de ácidos graxos saturados, monoinsaturados e poli-insaturados. O mesmo tem uma composição típica de teor de ácido graxo de 11 % de ácido palmítico, 4 % de esteárico, 25 % de oleico, 50 % de linoleico e 9 % de linolênico (“Economic Implications of Modified Soybean Traits Summary Report”, Iowa Soybean Promotion Board and American Soybean Association Special Report 92S, maio de 1990). As mudanças na composição de ácidos graxos para melhorar a estabilidade oxidativa e nutrição são constantemente procuradas. Os usos industriais do óleo de soja que é submetido a processamento adicional incluem ingredientes para tintas, plásticos, fibras, detergentes, cosméticos, lubrificantes e combustível biodiesel. O óleo de soja pode ser dividido, interesterificado, sulfatado, epoxidado, polimerizado, etoxilado ou clivado. Projetar e produzir derivados de óleo de feijão-soja com funcionalidade aprimorada e oleoquímica aprimorada é um campo em rápido crescimento. A mistura típica de triglicerídeos é geralmente dividida e separada em ácidos graxos puros, que são, então, combinados com álcoois ou ácidos derivados do petróleo, nitrogênio, sulfonatos, cloro ou com álcoois graxos derivados de gorduras e óleos.

[0009] A soja também é usada como fonte de alimento para animais e seres humanos. A soja é amplamente utilizada como fonte de proteína para alimentos para animais para aves de capoeira, suínos e bovinos. Durante o processamento da soja integral, o casco fibroso é removido e o óleo é extraído. A farinha de soja restante é uma combinação de carboidratos e aproximadamente 50 % de proteína. Para consumo humano, o farelo de soja é transformado em farinha de soja que é processada em concentrados de proteínas usados para extensores de carne ou alimentos especiais para animais de estimação. A produção de ingredientes com proteína comestíveis da soja oferece uma substituição mais saudável e menos dispendiosa para proteína animal em carnes, bem como em produtos do tipo lácteo. A soja integral é uma excelente fonte de proteínas e fibras alimentares. A proteína da soja é o único vegetal com uma proteína completa, pois contém todos os oito aminoácidos essenciais para a saúde humana. A maioria da soja é processada, ou "esmagada" em farelo de soja e óleo. A maior parte do farelo de soja que é esmagada é posteriormente transformada em ração animal com o restante usando para produzir farinha e proteínas de soja. Da fração de óleo, a maioria é consumida como óleo comestível, o resto é usado para produtos industriais, como ácidos graxos, sabões, tintas, óleo hidráulico, graxa, biodiesel, solventes, plásticos e outros produtos. Os usos alimentares da soja incluem alimentos de soja tradicionais, como tofu e leite de soja, bem como análogos de carne e iogurtes à base de soja.

[0010] A soja cresce em uma variedade de solos e uma grande variedade de climas, e a maioria da soja é produzida nos Estados Unidos, Brasil, Argentina, China e Índia. Uma determinada área de terra plantada com soja pode produzir muito mais proteína do que a terra plantada com outras culturas, ou se a terra fosse usada para criar gado. A soja é, no entanto, particularmente sensível a pragas como nematódeos que podem causar perdas de rendimento superiores a 30 % em campos fortemente infestados. Combinado com a seca, o impacto da infecção por nematódeos aumenta drasticamente e pode levar à perda de rendimento completa.

[0011] Muitos genes envolvidos em mecanismos de resposta ao estresse em plantas foram descritos na técnica e alguns demonstraram conferir algum nível de tolerância ao estresse à planta. Por exemplo, esses genes codificam enzimas antioxidantes, genes sintéticos de osmólitos, chaperonas moleculares como HSPs, enzimas envolvidas na produção de hormônios vegetais como o ácido abscísico (analisado, por exemplo, em Hu et al. 2014. Annu. Rev. Plant Biol. 65:71541).

[0012] Apesar dos inúmeros relatórios de genes que conferem tolerância ao estresse abiótico nas plantas, poucos relatam uma melhoria do rendimento nas condições de campo. Esse sucesso limitado analisado, por exemplo, em Cominelli et al. 2012, New Biotechnol, dx.doi.org/10.1016/ j.nbt.2012.11.001, Lawlor 2013, J Exp Bot, Vol 64(1):83-108 e Tardieu 2012, J. Exp. Bot, Vol 63(1):25-31, é atribuído principalmente a condições de estresse agronomicamente irrealistas e ao momento da aplicação do estresse. Além disso, as condições de crescimento são bem controladas em experimentos em laboratório ou em estufa, enquanto as plantas cultivadas em campo experimentam condições variáveis e raramente um único estresse. Os genes que conferem a melhoria real do rendimento sob estresse em condições de campo são, portanto, limitados e a transferibilidade da tolerância ao estresse identificada em laboratórios ou experimentos de estufa para condições de campo não é direta.

[0013] Até o presente momento, os genes conhecidos por conferir tolerância à seca, sal ou osmótica no algodão são o gene da pirofosfatase vacuolar H+ de Arabidopsis AVP1 (Pasapula et al. 2011, Plant Biotechnology Journal 9:88-99), o gene EDT1/HDG11 de Arabidopsis envolvido na sinalização de ABA (Yu et al., 2016, Plant Biotechnol J, 14(1):72-84), o gene LOS5 de Arabidopsis envolvido na biossíntese de ABA (Yue et al., 2012, J. Exp Bot, 63(10): 3741-3748), o gene IPT envolvido na biossíntese de citoquinina (Kuppu et al. 2013, PLoS ONE 8(5): e64190), o gene SNAC1 do arroz (Liu et al. 2014, PLoS ONE 9(1): e86895), o gene de anexina 1 de Brassica juncea AnnBj1 ou GhAnn1 de Gossypium hirsutum (Divya et al. 2010, Plant Mol. Biol. 73:293-308 e Zhang et al. 2015, Plant Mol. Biol., 87: 47-67, respectivamente) e o gene da proteína de choque térmico gene GHSP26 de Gossypium arboreum (Maqbool et al. 2009, Biotechnol. Prog. 26(1): 21 25). Destes, apenas AVP1 mostrou conferir um aumento de rendimento sob estresse no campo.

[0014] Anexinas (ANN) formam uma família multigene e foram identificadas até agora no reino vegetal e animal. Eles codificam proteínas de ligação à membrana dependentes de cálcio envolvidas no crescimento polar dependente de cálcio de células como pelos de raiz, pólen e fibras de algodão. As anexinas são definidas por sua dobra altamente conservada consistindo em quatro ou mais repetições de uma chamada sequência de assinatura de domínio de anexina repetida (Barton et al. 1991, Eur. J. Biochem. 198: 749 760).

[0015] As anexinas são expressas de forma ubíqua e seu nível de expressão é modulado por estímulos ambientais como a luz, a gravidade, os estresses abióticos e os ferimentos, sugerindo um papel na mediação da resposta ao estresse. Tal papel é suportado pela constatação de que foi percebido que ANN1s de Arabidopsis thaliana e Brassica juncea têm atividade de peroxidase (Gorecka et al., 2005, Biochem Biophys Res Commun, 336(3):868-875, Divya et al., 2010, Plant Mol. Biol. 73:293-308), portanto, capazes de atuar como antioxidante celular.

[0016] O envolvimento de ANN1 na resposta ao estresse foi estudado em Arabidopsis, tabaco e algodão. A perda de análise de função de mutantes de Atann1 e Atann4 indicou uma sensibilidade aumentada ao estresse osmótico e sal, bem como uma taxa de germinação reduzida e crescimento após tratamento com ácido abscísico (Pedido US 2005/089872). Cantero et al. (2006, Plant Physiology and Biochemistry, 44: 13-24) mostrou que AtANN1 é regulado positivamente pelo frio, calor, seca e estresse do sal. O mutante de desativação de Atann1 de Arabidopsis acumula espécies de oxigênio mais reativas e é mais sensível ao estresse severo da seca do que o tipo selvagem. Constatou-se que as plantas de Arabidopsis que expressam excessivamente AtANN1 eram mais tolerantes à seca visto que poderiam ressuscitar de uma dessecação severa (Konopka-Postupolska et al., 2009, Plant Physiology, 150: 1394-1410). Além disso, as plantas de arroz que expressam AtANN1 constitutiva ou preferencialmente nos tecidos verdes tiveram um rendimento aumentado em condições de estresse ótimas e de seca (Pedido US 2010/0170011).

[0017] Foi constatado que linhagens de Arabidopsis manipuladas para superexpressão do Annexin1 de Lotus (NnAnn1) têm uma taxa de germinação aprimorada sob estresse por calor (Pedido de Patente CN102229662).

[0018] O gene Annexin1 de Brassica juncea (AnnBj1) é induzido por ABA, sal e tratamentos de peróxido (Jami et al., 2009, Plant Physiology and Biochemistry 47: 977-990). As plantas de tabaco que expressam constitutivamente AnnBj1 mostraram ser mais tolerantes à seca (manitol), sal e estresse oxidativo nos ensaios de sobrevivência no estágio da muda (Jami et al., 2008, Plant Physiology and Biochemistry, 46: 1019-1030). Do mesmo modo, plantas de algodão que expressam constitutivamente AnnBj1 têm tolerância aumentada ao estresse de sal, osmótico e oxidativo no estágio da muda (Divya et al., 2010, Plant Mol. Biol. 73: 293-308). Além disso, estas plantas transgênicas demonstraram manter o desenvolvimento normal da semente e a qualidade da fibra quando cultivadas sob estresse de sal (Divya et al., 2010, Plant Mol. Biol. 73:293-308).

[0019] No algodão, a expressão de GhAnn1 é induzida mediante o tratamento com ABA, peróxido, sal e PEG (Zhang et al., 2015, Plant Mol. Biol. 87: 47-67). A germinação e crescimento de mudas de plantas de algodão que superexpressam GhAnn1 foi estudo sob vários estresses. As linhagens de superexpressão germinaram mais rapidamente e apresentaram melhor crescimento de muda do que o tipo selvagem quando submetidas a estresse de sal ou à seca (PEG), indicando uma melhor tolerância ao estresse (Zhang et al., 2015, Plant Mol. Biol. 87: 47-67).

[0020] Mesmo que a técnica anterior descrevesse uma germinação aprimorada e crescimento precoce em algodão sob vários estresses abióticos e aumento de rendimento em arroz, a técnica anterior não revela um aumento no rendimento de fibras de algodão. Permanece assim a necessidade de aumentar o rendimento do algodão (rendimento de fiapos e rendimento de sementes) sob o estresse da seca em condições de campo. Para esse fim, também é necessária uma expressão apropriada (espacial, temporal). Também é necessário obter um aumento mais consistente no rendimento das plantas, particularmente em condições de seca, particularmente em condições de campo.

[0021] A modificação genética das plantas para alterar e/ou aprimorar as características fenotípicas (como produtividade ou qualidade) depende da disponibilidade de um meio para conduzir e controlar a expressão gênica conforme necessário. De fato, a modificação genética baseia-se na disponibilidade e uso de promotores adequados que são eficazes em plantas e que regulam a transcrição de modo a proporcionar o(s) efeito(s) desejado(s) na planta transgênica.

[0022] Para inúmeras aplicações na biotecnologia vegetal, é necessário expressar os transgenes de forma tecidual preferencial e/ou induzível para evitar os efeitos indesejáveis que a expressão do transgene pode causar em outros tecidos ou, às vezes, não é necessária.

[0023] Promotores preferenciais em raiz são úteis para expressar ou regular negativamente os genes preferencialmente nas raízes para obter a função ou efeito desejado, como aprimorar a resistência aos patógenos transmitidos pelo solo ou aos agentes patogênicos radiculares, aprimorar a tolerância ao estresse abiótico, como a temperatura, a água ou o estresse salino, ampliar a amplitude dos solos em que a planta pode crescer, alterar a arquitetura da raiz, como a densidade da raiz ou a força da raiz, alterar ou aprimorar a absorção de nutrientes e/ou o uso de nutrientes, modificar a interação entre as raízes e a biomassa acima do solo ou modificar vias metabólicas na raiz.

[0024] Exemplos de promotores preferenciais em raiz incluem o promotor RB7 de Nicotiana tabacum (Patentes US n° 5.459.252 e 5.750.386); o promotor ARSK1 de Arabidopsis thaliana (Hwang e Goodman (1995) Plant J 8:37-43), o promotor MR7 de Zea mays (Patente US n° 5.837.848), o promotor ZRP2 de Zea mays (Patente US n° 5.633.363), e o promotor MTL de Zea mays (Patentes US n° 5.466.785 e 6.018.099), os promotores pLTP e TIP2-3 de Sorghum bicolor (documentos WO2014/164399A1 e WO2014/159113A1, respectivamente), O Promotor de Patatina Classe H (Koster- Topfer et al., Mol. Gen. Genet. 219 (1989), 390-396), o Promotor de Agropinsintase (ags) (Inoguchi et al., Plant Phys. 149 (1996), 73-78), o promotor AKT1 (Lagarde et al., Plant J. 9 (1996), 195-203), e o promotor TobRB7 (Yamamoto et al., Plant Cell 3 (1991), 371-382).

[0025] Os promotores induzíveis por estresse são úteis para expressar ou regular negativamente os genes especificamente em condições estressantes para obter a função ou efeito desejado, como aprimorar a tolerância ao estresse abiótico, como estresse de temperatura, água ou sal.

[0026] Exemplos de promotores induzíveis ao estresse abiótico incluem o promotor rd29a induzível por seca de Arabidopsis thaliana (Yamaguchi-Shinozaki et al. 1993, Mol. Gen. Genet., 236: 331-340), o HSP81.1 induzível por calor de Arabidopsis thaliana (Takahashi et al., 1992, Plant Physiol., 99: 383-390), e o promotor rab17 induzível por seca de Zea mays (Morran et al., 2011, Plant Biotechnology Journal, 9: 230-249).

[0027] Poucos promotores que combinam a especificidade do tecido e a indutibilidade ao estresse foram isolados. Exemplos de tais promotores incluem o promotor HPR1 induzível por seca e específico em broto de Arabidopsis (Wang et al., 2009, Molecular Plant, 2(1): 191-200), o promotor AlSAP induzível por estresse de sal e seca e específico em broto de Aeluropus littoralis (Saad et al., 2011, Transgenic Res, 20: 1003-1018), o promotor EgTIP2 responsivo a estresse osmótico e específico em raiz de Eucalyptus grandis (Rodrigues et al., 2013, Plant Science, 213: 106-113) e o promotor btg-26 específico em epiderme de raiz e induzível por sal de Brassica napus (documentos WO 2001/055433, US2005044585A1), também demonstraram ser funcionais em cevada (Good et al., 2007, Can J. Bot. 85: 252-262) e o promotor de seu gene ortólogo de arroz OsANT1 (documento US 7.982.093).

[0028] Existe uma necessidade de outros promotores que confiram especificidade de tecido, inducibilidade ao estresse ou ambos, particularmente promotores que controlam a expressão induzida pelo estresse e/ou preferencial em raiz em plantas, como plantas Gossypium, plantas Glycine e plantas Triticum.

[0029] É um objetivo da presente invenção para aumentar o rendimento em plantas, como aumentar o rendimento do algodão, incluindo o rendimento de fiapos ou o rendimento das sementes sob o estresse da seca em condições de campo. Outro objetivo é obter um aumento mais consistente no rendimento em plantas, como rendimento de fiapos de algodão ou rendimento de semente de algodão. Estes e outros problemas são resolvidos conforme descrito a seguir, particularmente nas diferentes modalidades, exemplos e reivindicações. Também é fornecido um promotor de Gossypium para expressão induzida por estresse e/ou preferencial em raiz de genes de interesse em plantas. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[0030] Em um aspecto, a invenção fornece um ácido nucleico isolado que compreende atividade de promotor preferencial em raiz e induzível por estresse selecionada a partir do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7 ou um fragmento funcional do mesmo; (b) um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7 ou um fragmento funcional do mesmo; e (c) o ácido nucleico de um promotor funcional que se hibridiza em condições estringentes para a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, ou um fragmento funcional do mesmo; em que o dito fragmento funcional compreende na sequência de 400 pb a montante do início da transcrição de SEQ ID NO: 7.

[0031] Uma outra modalidade fornece um gene recombinante que compreende o ácido nucleico de acordo com a invenção ligada operativamente a uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um produto de expressão de interesse e, opcionalmente, uma sequência de terminação de transcrição e de poliadenilação, de preferência, uma terminação de transcrição e uma região de poliadenilação funcional em células de plantas. Em uma outra modalidade, o dito produto de interesse de expressão é um RNA capaz de modular a expressão de um gene ou é uma proteína.

[0032] Ainda outra modalidade fornece uma célula hospedeira, como uma célula de E. coli, uma célula de Agrobacterium, uma célula de levedura ou uma célula vegetal, que compreende o ácido nucleico isolado de acordo com a invenção, ou o gene recombinante de acordo com a invenção.

[0033] Em uma outra modalidade, é fornecida uma planta que compreende o gene recombinante de acordo com a invenção. Uma outra modalidade fornece partes de plantas e sementes obteníveis a partir da planta de acordo com a invenção. Estas partes e sementes de plantas compreendem o gene recombinante descrito acima. Em outra forma de realização, as plantas, partes de plantas ou sementes de acordo com a invenção são plantas, partes de plantas ou sementes de algodão, soja ou trigo. Também se pode esperar que este promotor seja funcional em outras plantas dicotiledôneas e monocotiledônicas.

[0034] Ainda outra modalidade fornece um método de produção de uma planta transgênica que compreende os passos de (a) introdução ou fornecimento do gene recombinante de acordo com a invenção a uma célula vegetal para criar células transgênicas; e (b) regenerar plantas transgênicas da dita célula transgênica.

[0035] Além disso, são fornecidos métodos de efetuação de expressão preferencial em raiz, induzível ao estresse e preferencial em raiz e induzível por estresse combinado de um ácido nucleico que compreende introduzir o gene recombinante de acordo com a invenção no genoma de uma planta, ou fornecer a planta de acordo com a invenção. Também é fornecido um método para alterar a tolerância ao estresse biótico ou abiótico, a arquitetura raiz, a eficiência do uso de nutrientes ou o rendimento de uma planta, em que o dito método compreende introduzir o gene recombinante de acordo com a invenção no genoma de uma planta, ou fornecer a planta de acordo com a invenção. Em outra modalidade, a dita planta é uma planta de algodão, soja ou trigo.

[0036] Também é fornecido o uso do ácido nucleico isolado de acordo com a invenção para regular a expressão de um ácido nucleico operacionalmente ligado em uma planta e o uso do ácido nucleico isolado de acordo com a invenção, ou o gene recombinante de acordo com a invenção para alterar tolerância ao estresse biótico ou abiótico, arquitetura da raiz, eficiência de uso de nutrientes ou rendimento de uma planta. Em uma modalidade adicional, a dita planta é uma planta de algodão, soja ou trigo.

[0037] Ainda outra modalidade fornece um método de produzir alimentos, ração ou um produto industrial que compreende (a) obter a planta ou uma parte dela, de acordo com a invenção; e (b) preparar o alimento, ração ou produto industrial da planta ou parte do mesmo. Em outra modalidade, o dito alimento ou alimento é óleo, farinha, sementes moídas ou trituradas, flocos de soja, grãos, amido, farinha ou proteína, ou o dito produto industrial é biocombustível, fibra, produtos químicos industriais, um produto farmacêutico ou nutracêutico. Esses alimentos, rações ou produtos industriais contêm o promotor preferencial em raiz, induzível pelo stress e induzido por estresse preferencial em raiz descrito no presente documento.

[0038] Em outro aspecto, a invenção fornece um gene recombinante que compreende (a) um promotor expressável em planta selecionado do grupo que consiste em i) promotor preferencial em raiz, ii) promotor induzível ao estresse e iii) promotor induzido por estresse preferencial em raiz, (b ) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína Anexina (c) e, opcionalmente, uma sequência de terminação e poliadenilação da transcrição, de preferência, uma região de poliadenilação e terminação da transcrição funcional em plantas.

[0039] Em uma modalidade adicional, o promotor preferencial em raiz é o promotor Pbtg-26GhD10.

[0040] Em outra modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína Anexina compreende (a) uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14; (b) uma sequência de nucleotídeos pelo menos 80 % idêntica a SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 (c) uma sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico capaz de hibridizar sob condições estringentes para a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14, (d) uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15 (e) uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15, (f) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína que compreende quatro ou mais domínios repetidos de anexina.

[0041] Em mais um aspecto, a invenção fornece um método para aumentar o rendimento, como rendimento de fibras e rendimento de sementes, de uma planta, como uma planta de algodão, soja ou trigo, em comparação com uma planta de controle sob condição de estresse compreendendo (a) fornecer a células da dita planta um gene recombinante que compreende (i) um promotor expressável em planta heteróloga, (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de Anexina (iii) e, opcionalmente, uma sequência de terminação e poliadenilação de transcrição, de preferência, uma região de terminação e poliadenilação e de transcrição funcional em plantas, e (b) regenerar a dita planta.

[0042] Em uma modalidade adicional, o promotor expressável em plantas heterólogas é selecionado do grupo que consiste em a) um promotor preferencial em raiz, b) um promotor induzível por estresse e c) um promotor preferencial em raiz induzido por estresse. Em outra modalidade, o dito promotor é o promotor Pbtg26-GhD10.

[0043] Em outra modalidade, o promotor expressável em planta heteróloga é um promotor constitutivo. Em outra modalidade, o dito promotor é o promotor CaMV35S do Vírus do Mosaico da Couve em Flor.

[0044] Em outra modalidade, a sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína Anexina compreende (a) uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14; (b) uma sequência de nucleotídeos pelo menos 80 % idêntica a SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 (c) uma sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico capaz de hibridizar sob condições estringentes para a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14, (d) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15 (e) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80 % de identidade com SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15, (f) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína que compreende quatro ou mais domínios repetidos de anexina.

[0045] Modalidades adicionais revelam o estresse como um estresse por seca, ocorrendo durante o estágio reprodutivo da planta, em plantas cultivadas no campo.

[0046] Outra modalidade fornece um método para aumentar o rendimento de uma planta. Em uma modalidade adicional, a dita planta é uma planta de algodão, soja ou trigo.

[0047] A presente invenção fornece um método para aumentar o rendimento de fiapo e um método para aumentar o rendimento de semente. Em uma modalidade adicional, o rendimento aumentado em comparação com uma planta de controle é pelo menos 5 %.

[0048] De acordo com a presente invenção, o método forneceu um rendimento aumentado mais consistente quando o promotor usado é selecionado do grupo de promotores preferenciais em raiz, induzíveis por estresse ou preferenciais em raiz induzidos por estresse, preferencialmente o promotor Pbtg-26GhD10, em comparação com a quando o promotor usando é um promotor expressável em planta constitutivo, preferencialmente o promotor CaMV35S.

[0049] A invenção fornece ainda plantas, partes de plantas ou células de plantas que compreendem o gene recombinante fornecido. Em uma modalidade específica, a planta, parte de planta ou célula de planta é algodão, soja ou trigo. BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0050] Figura 1: alinhamento das regiões promotoras do gene btg-26 do subgenoma A e do subgenoma D de Gossypium hirsutum. A sequência de nucleotídeos do promotor do subgenoma A (sequência superior) corresponde à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 4 da posição 472 para a posição 1486. A sequência de nucleotídeos do promotor do subgenoma A (sequência inferior) corresponde à sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 da posição 2067 para a posição 3089. As diferenças na sequência de nucleotídeos são indicadas por caixas cinzas. Os nucleotídeos que não possuem um nucleotídeo correspondente na outra região promotora são indicados por traços na sequência de nucleotídeos que faltam os nucleotídeos. O primeiro nucleotídeo de cada fragmento promotor de cerca de 0,6 kb é sublinhado. A caixa TATA prevista é duplamente sublinhada enquanto o início da inicialização da transcrição é sublinhado em ondas. Os motivos de sítio de ligação do tipo elemento responsivo a ABA previsto (motivos do tipo ABRE) são enquadrados. Os nucleotídeos entre parênteses são substituídos pela sequência ACC nos T-DNAs devido à criação de um local de restrição de NcoI necessário para a clonagem dos promotores. O códon INICIAL de tradução é indicado em negrito. A identidade geral entre as duas regiões promotoras é de cerca de 78 % de identidade de sequência. A identidade de sequência entre cerca de 600 pb a montante do início da tradução dos dois promotores é de cerca de 94 %.

[0051] Figura 2: Alinhamento de sequência de aminoácidos de diferentes proteínas Anexina. Os resíduos de aminoácidos conservados em todas as proteínas são indicados por um asterisco. As substituições conservadas de aminoácidos são indicadas por uma coluna. Os domínios de repetição de anexina são sublinhados. A região de dobra de endonexina de 17 aminoácidos com seus motivos KGhGTDEXXLIpILApR característicos é enquadrada. O resíduo de Histidina conservado para a atividade da peroxidase é indicado em negrito em um fundo cinza. Os sítios de ligação de fosfolipídios conservados (resíduos de triptofano) são indicados em negrito em um fundo amarelo. As sequências de ligação de cálcio do tipo II (motivos GXGTD) são destacadas are em verde. AnnBj1: proteína Anexina1 de Brassica juncea (SEQ ID NO: 13); AtAnn1: proteína Anexina1 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 17); GhAnn1: proteína Anexina1 de Gossypium hirsutum (SEQ ID NO: 15). Os aminoácidos que não têm um nucleotídeo correspondente na outra sequência de proteínas são indicados por traços na sequência de aminoácidos que faltam os aminoácidos. A identidade geral entre AnnBj1 e AtAnn1 é cerca de 91 %, entre AnnBj1 e GhAnn1 é cerca 70 % e entre AtAnn1 e GhAnn1 é cerca de 72 %.

[0052] Figura 3: Alinhamento da sequência de nucleotídeos de sequências de codificação de Anexina diferentes. AnnBj1: Sequência de codificação de Anexina1 de Brassica juncea (SEQ ID NO: 12); AtAnn1: Sequência de codificação de Anexina1 de Arabidopsis thaliana (SEQ ID NO: 16); GhAnn1: Sequência de codificação de Anexina1 de Gossypium hirsutum (SEQ ID NO: 14). Os nucleotídeos conservados em todas as três sequências são indicados com um asterisco. Nucleotídeos conservados apenas entre as sequências AnnBj1 e AtAnn1 são indicados com uma coluna. Nucleotídeos conservados apenas entre as sequências AnnBj1 e GhAnn1são indicados com uma semicoluna. Nucleotídeos conservados apenas entre as sequências AtAnn1 e GhAnn1são indicados com um ponto. Os nucleotídeos que não possuem um nucleotídeo correspondente na outra sequência de nucleotídeos são indicados por traços na sequência de nucleotídeos que faltam os nucleotídeos. A identidade geral entre as sequências de codificação é cerca de 70 % entre AtAnn1 e GhAnn1 e entre AnnBj1 e GhAnn1 e é cerca de 89 % entre AnnBj1 e AtAnn1. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0053] A presente invenção baseia-se na constatação surpreendente de que a expressão de uma Anexina em uma planta leva a um rendimento aumentado sob condições de estresse no campo em comparação com as suas respectivas plantas de controle. Além disso, constatou-se que a sequência promotora do genoma D de Gossypium hirsutum Pbtg- 26GhD10 exibia atividade de promotor induzida por estresse preferencial em raiz em plantas. Além disso, constatou-se que o aumento de rendimento obtido ao expressar uma Anexina é mais consistente obtido quando a Anexina é expressa sob o controle de um promotor preferencial em raiz induzida por estresse do que quando a expressão da mesma Anexina está sob controle de um promotor constitutivo.

[0054] Em um primeiro aspecto, a invenção fornece um ácido nucleico isolado que compreende atividade de promotor preferencial em raiz e induzível por estresse selecionada a partir do grupo que consiste em (a) um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7 ou um fragmento funcional do mesmo; (b) um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7, ou um fragmento funcional do mesmo; e (c) o ácido nucleico de um promotor funcional capaz de hibridizar em condições estringentes para a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, ou um fragmento funcional do mesmo; em que o dito fragmento funcional compreende pelo menos na sequência de 400 pb a montante do início da transcrição de SEQ ID NO: 7. Promotor

[0055] SEQ ID NO: 7 representa a sequência de cerca de 1 kb de comprimento do promotor btg-26Gh-D a montante do início da tradução de Gossypium hirsutum. SEQ ID NO: 7 é um fragmento de promotor preferencial nesta invenção, porém podem ser usados fragmentos funcionais alternativos. Tal fragmento funcional preferencialmente será mais longo do que 600, mais longo que 700, mais longo que 800 ou mesmo mais longo que 900 nucleotídeos consecutivos a montante do sítio de início da transcrição (SEQ ID No 7, posição de nucleotídeo 755) ou ser mais longo do que 700, mais longo que 800, mais longo que 900 ou até mais longo que 1000 nucleotídeos consecutivos a montante do sítios de início da tradução (Figura 1, posições de nucleotídeo 1022-1024) e promover a transcrição de um ácido nucleico operacionalmente ligado preferencialmente nas raízes e de uma maneira induzível por estresse. Um fragmento de promotor de acordo com a invenção pode compreender, assim, uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo na posição 351 até o nucleotídeo na posição 755. Alternativamente, um fragmento de promotor de acordo com a invenção pode compreender, assim, uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo na posição 251 até o nucleotídeo na posição 755. Ainda outro fragmento de promotor de acordo com a invenção pode compreender, assim, uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo na posição 151 até o nucleotídeo na posição 755. Ainda outro fragmento de promotor de acordo com a invenção pode compreender, assim, uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo na posição 51 até o nucleotídeo na posição 755. Ainda outro fragmento de promotor de acordo com a invenção pode compreender, assim, uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo na posição 1 até o nucleotídeo na posição 755.

[0056] O ácido nucleico que compreende a atividade de promotor induzido por estresse preferencial em raiz também pode ser constituído por uma molécula de DNA maior.

[0057] "Atividade de promotor preferencial em raiz” no contexto desta invenção significa que a atividade de promotor é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes ou mesmo pelo menos 100 vezes maior nas raízes do que em outros tecidos. Em outras palavras, na atividade de promotor preferencial em raiz, a transcrição do ácido nucleico operacionalmente ligado ao promotor da invenção nas raízes é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes ou mesmo pelo menos 100 vezes maior do que em outros tecidos. Em outras palavras, o promotor preferencial em raiz controla a expressão preferencial em raiz do ácido nucleico operacionalmente ligado ao promotor preferencial em raiz. "Atividade de promotor preferencial em raiz" engloba "atividade de promotor preferencial em raiz induzida por estresse".

[0058] "Atividade de promotor induzível por estresse" significa que a atividade de promotor é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes ou mesmo pelo menos 100 vezes maior quando a planta ou parte da planta é submetida a estresse ambiental do que em condições de controle. Em outras palavras, na atividade de promotor induzível por estresse, a transcrição do ácido nucleico operacionalmente ligado ao promotor da invenção é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes ou mesmo pelo menos 100 vezes maior quando a planta ou parte da planta é submetida a estresse do que em condições de controle. Em outras palavras, o promotor induzível por estresse controla a expressão induzível por estresse do ácido nucleico operacionalmente ligado ao promotor induzível por estresse. “Atividade de promotor induzível por estresse" engloba "atividade de promotor preferencial em raiz induzida por estresse".

[0059] "Atividade de promotor preferencial em raiz induzida por estresse" significa que a atividade de promotor é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes ou mesmo, pelo menos, 100 vezes superior nas raízes em comparação com outros tecidos vegetais quando a planta ou planta é submetida a estresse ambiental. Em outras palavras, na atividade de promotor preferencial em raiz induzida por estresse, a transcrição do ácido nucleico operacionalmente ligado ao promotor da invenção é pelo menos 2 vezes, ou pelo menos 5 vezes, ou pelo menos 10 vezes, ou pelo menos 20 vezes ou mesmo pelo menos 100 vezes maior nos tecidos radiculares do que em outros tecidos vegetais quando a planta ou parte de planta é submetida a estresse. Em outras palavras, o promotor preferencial em raiz induzido por estresse controla expressão induzida por estresse preferencial em raiz do ácido nucleico operacionalmente ligado ao promotor induzido por estresse preferencial em raiz.

[0060] Conforme usado no presente documento, "promotor" significa uma região de sequência de DNA que é essencial para o início da transcrição de DNA, resultando na geração de uma molécula de RNA que é complementar ao ADN transcrito; essa região também pode ser referida como uma “região reguladora 5'". Os promotores estão geralmente situados a montante da sequência de codificação a ser transcrita e têm regiões que atuam como sítios de ligação para RNA polimerase II e outras proteínas, como fatores de transcrição (fatores de proteína de transatuação que regulam a transcrição) para iniciar a transcrição de um gene operacionalmente ligado. Os promotores podem, por si só, conter subelementos (isto é, motivos de promotor) como elementos cis ou domínios intensificadores que regulam a transcrição de genes operativamente ligados. Os promotores desta invenção podem ser alterados para conter "DNA intensificador" para auxiliar na elevação da expressão de gene. Como é conhecido na técnica, certos elementos de DNA podem ser usados para intensificar a transcrição de DNA. Esses intensificadores são frequentemente encontrados em 5’ em relação ao início da transcrição em um promotor que funciona em células eucarióticas, mas geralmente podem ser inseridos a montante (5') ou a jusante (3') em relação à sequência de codificação. Em alguns casos, esses elementos de DNA intensificadores de 5’ são íntrons. Entre os íntrons que são úteis como DNA intensificador são os íntrons 5’ do gene da actina 1 do arroz (consulte documento US 5.641.876), o gene da actina 2 do arroz, o gene da álcool desidrogenase do milho, o gene da proteína de choque térmico 70 do milho (consulte documento US 5.593.874), o gene shrunken 1 do milho, o gene sensível à luz 1 Solanum tuberosum, o íntron de histona 4 de Arabidopsis e o gene da proteína de choque térmico 70 de Petunia hybrida (consulte documento US 5.659.122). Dessa forma, tal como contemplado no presente documento, uma região promotora ou promotor inclui variações de promotores derivados por inserção ou deleção de regiões reguladoras, submetendo o promotor à mutagênese aleatória ou dirigida, etc. A atividade ou força de um promotor pode ser medida em termos de quantidades de RNA que o mesmo produz, ou a quantidade de acumulação de proteína em uma célula ou tecido, em relação a um promotor cuja atividade de transcrição foi previamente avaliada.

[0061] Um promotor conforme usado no presente documento pode, assim, incluir sequências a jusante do início da transcrição, tais como sequências que codificam a região não traduzida 5’ (UT 5') do RNA ou íntrons localizados a jusante do início da transcrição. Um fragmento de promotor de acordo com uma invenção pode compreender a sua própria 5'UTR que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo 756 até o nucleotídeo 1022. Conforme demonstrado experimentalmente, os últimos três nucleotídeos da 5'UTR dos promotores descritos no presente documento podem ser trocados por outros nucleotídeos para criar um sítio de reconhecimento de enzima de restrição conveniente. Dessa forma, um fragmento de promotor de acordo com uma invenção pode compreender a sua própria 5'UTR que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo 756 até o nucleotídeo 1019. Em combinação com os fragmentos de promotor descritos acima, um fragmento de promotor de acordo com uma invenção pode compreender, assim, a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo na posição 351 até o nucleotídeo na posição 1019, ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo na posição 251 até o nucleotídeo na posição 1019, ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo na posição 151 até o nucleotídeo na posição 1019, ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo na posição 51 até o nucleotídeo na posição 1019, ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo na posição 1 até o nucleotídeo na posição 1019, tal como a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo na posição 351 até o nucleotídeo na posição 1022, ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo na posição 251 até o nucleotídeo na posição 1022, ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo na posição 151 até o nucleotídeo na posição 1022, ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo na posição 51 até o nucleotídeo na posição 1022, ou a sequência de nucleotídeos de SEQ ID No: 7 do nucleotídeo na posição 1 até o nucleotídeo na posição 1022. Alternativamente, podem ser usados fragmentos de 5’UTR de outros genes.

[0062] A atividade de promotor para um fragmento de promotor funcional nas raízes e a atividade de promotor para um fragmento de promotor funcional sob estresse pode ser determinada pelos versados na técnica, por exemplo, com o uso de análise do acúmulo de RNA produzido a partir do ácido nucleico que está operacionalmente ligado ao promotor como descrito no presente documento, em que o ácido nucleico que está operacionalmente ligado ao promotor pode ser o ácido nucleico que está naturalmente ligado ao promotor, ou seja, o gene endógeno do qual a expressão é controlada pelo promotor.

[0063] A acumulação de RNA ou níveis de RNA, tal como mRNA, pode ser medida em um único ponto no tempo ou em múltiplos pontos no tempo e, como tal, o aumento da dobra pode ser um aumento de dobra médio ou um valor extrapolado derivado de valores experimentalmente medidos. Como é uma comparação de níveis, qualquer método que mede os níveis de mRNA pode ser usado. Em um aspecto preferencial, os tecidos ou órgãos comparados são tecidos radiculares com outros tecidos do organismo. Em um outro aspecto preferido, vários tecidos ou órgãos são comparados. Uma comparação múltipla preferencial é o tecido radicular comparado com 1 ou 2 tecidos ou órgãos selecionados do grupo que consiste em folhas e caules ou tecido folicular sob estresse. Outra comparação múltipla preferencial é tecidos ou órgãos sob condições de estresse comparados com os tecidos ou órgãos sob condições de controle. Conforme usado no presente documento, exemplos de órgãos de plantas são fibra, folha, raiz, etc. e exemplo de tecidos são primórdios de folhas, ápice de broto, tecido vascular, etc.

[0064] A capacidade de expressão preferencial em raiz, induzível por estresse ou induzida por estresse preferencial em raiz do fragmento identificado ou gerado do promotor pode ser convenientemente testada por ligação operacional de tais moléculas de DNA a uma sequência de nucleotídeos que codifica um marcador facilmente marcável, por exemplo, um gene de beta-glucuronidase, introduzindo tal gene recombinante em uma planta e analisando o padrão de expressão do marcador em raízes em comparação com o padrão de expressão do marcador em outras partes da planta. Outros candidatos para um marcador (ou um gene repórter) são cloranfenicol acetil transferase (CAT) e proteínas com propriedades fluorescentes, como proteína verde fluorescente (GFP) de Aequora victoria. Para definir uma região de promotor mínima, um segmento de DNA que representa a região de promotor é removido da região 5’ do gene de interesse e ligado operativamente à sequência de codificação de um gene (repórter) marcador por técnicas de DNA recombinante bem conhecidas na técnica. O gene repórter está ligado a jusante do promotor, de modo que os transcritos que iniciam no promotor prossigam através do gene repórter. Os genes repórter geralmente codificam proteínas, que são facilmente medidas, incluindo, sem limitação, cloranfenicol acetil transferase (CAT), betaglucuronidase (GUS), proteína verde fluorescente (GFP), beta-galactosidase (beta-GAL) e luciferase. O cassete de expressão contendo o gene repórter sob o controle do promotor pode ser introduzido em um tipo de célula apropriado por técnicas de transfecção bem conhecidas na técnica. Para testar a proteína repórter, preparam-se lisados celulares e são realizados ensaios apropriados, que são bem conhecidos na técnica, para a proteína repórter. O nível de atividade enzimática corresponde à quantidade de enzima que foi feita, o que, por sua vez, revela o nível de expressão e a funcionalidade específica em raiz do promotor ou fragmento de promotor de interesse. Esse nível de expressão também pode ser comparado com outros promotores para determinar a força relativa do promotor em estudo. Uma vez que a atividade e a funcionalidade são confirmadas, análises de mutação e/ou deleção adicionais podem ser empregadas para determinar a região mínima e/ou sequências necessárias para iniciar a transcrição. Assim, as sequências podem ser deletadas na extremidade 5’ da região de promotor e/ou na extremidade 3' da região de promotor e introduzidas as substituições de nucleotídeos. Esses construtos são, então, novamente introduzidos em células e sua atividade e/ou funcionalidade determinada.

[0065] A atividade ou a força de um promotor pode ser medida em termos da quantidade de mRNA ou acumulação de proteína que produz especificamente, em relação à quantidade total de mRNA ou proteína. O promotor expressa preferencialmente uma sequência de ácidos nucleicos ligada operativamente a um nível maior que cerca de 0,1 %, cerca de 0,2 %, cerca de 0,5 %, mais preferencialmente, maior que cerca de 1 % do mRNA total. Alternativamente, a atividade ou a força de um promotor pode ser expressa em relação a um promotor bem caracterizado (para o qual a atividade transcricional foi previamente avaliada).

[0066] Será adicionalmente evidente no presente documento que promotores preferenciais em raiz induzidos por estresse e induzíveis por estresse preferenciais em raiz equivalentes pode, ser isolados de outras plantas de Gossypium que portam o tipo genoma D, por exemplo, example Gossypium raimondii, Gossypium barbadense e Gossypium darwinii. Para este fim, os fragmentos de promotor ortólogo podem ser isolados de outras plantas usando SEQ ID NO: 7 ou um fragmento funcional que tem pelo 600 seus nucleotídeos consecutivos como uma sonda e identificando sequências de nucleotídeos a partir destas outras plantas que hibridizam sob as condições de hibridização descritas no presente documento. A título de exemplo, um promotor da invenção pode ser usado para triar uma biblioteca genômica de uma cultura ou planta de interesse para isolar as sequências de promotor correspondentes de acordo com técnicas bem conhecidas na técnica. Assim, uma sequência de promotor da invenção pode ser usada como uma sonda para hibridização com uma biblioteca genômica em condições de rigidez médias a altas. Como promotores equivalentes alternativos podem ser isolados usando as sequências de codificação dos genes controlados pelos promotores de SEQ ID NO: 7 para triar uma biblioteca genômica (por exemplo, por hibridização ou in silico) de uma cultura de interesse. Quando é obtida uma identidade suficiente entre as sequências de codificação (por exemplo, identidade superior a 95 %), as regiões de promotor podem ser isoladas a montante dos genes ortólogos.

[0067] Adequado para a invenção são ácidos nucleicos compreendendo atividade de promotor preferencial em raiz, induzível por estresse ou induzida por estresse preferencial em raiz que compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 95 % ou pelo menos 98 % ou pelo menos 99 % de identidade de sequência para os promotores e regiões de promotor ou fragmentos funcionais dos mesmos descritos no presente documento e também são ditos como variantes. O termo "variante" em relação à sequência de nucleotídeos reguladora da transcrição SEQ ID NO: 7 da invenção se destina a significar sequências substancialmente similares. As variantes alélicas de ocorrência natural, como estas, podem ser identificadas com as técnicas conhecidas de biologia molecular, como, por exemplo, com reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização como descrito no presente documento anteriormente. As sequências de nucleotídeos variantes também incluem sequências de nucleotídeos sinteticamente derivadas, como aquelas geradas, por exemplo, usando mutagênese sítio-dirigida de SEQ ID NO: 7. Geralmente, as variantes de sequência de nucleotídeos da invenção terão geralmente pelo menos 80 %, e 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, pelo menos 85 %, por exemplo, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % e 99 % de identidade de sequência de nucleotídeos com a sequência de nucleotídeos nativa (tipo selvagem ou endógeno) ou um fragmento funcional da mesma. Os derivados das moléculas de DNA revelados no presente documento podem incluir, sem limitação, deleções de sequência, mutações de ponto único ou múltiplos, alterações em um sítio de enzima de restrição particular, adição de elementos funcionais ou outros meios de modificação molecular que possam intensificar, ou de outra forma, alterar a expressão de promotor. As técnicas para obter tais derivados são bem conhecidas na técnica (consulte, por exemplo, J. F. Sambrook, D. W. Russell, e N. Irwin (2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Volumes 1, 2 e 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Por exemplo, um versado na técnica pode delimitar os elementos funcionais dentro dos promotores descritos no presente documento e excluir quaisquer elementos não essenciais. Os elementos funcionais podem ser modificados ou combinados para aumentar a utilidade ou a expressão das sequências da invenção para qualquer aplicação específica. Os versados na técnica estão familiarizados com os materiais de recursos padrão que descrevem condições e procedimentos específicos para a construção, manipulação e isolamento de macromoléculas (por exemplo, moléculas de DNA, plasmídeos, etc.), bem como a geração de organismos recombinantes e a triagem e o isolamento de moléculas de DNA.

[0068] Tal como usado no presente documento, o termo "porcentagem de identidade de sequência"se refere à porcentagem de nucleotídeos idênticos entre dois segmentos de uma janela de DNA idealmente alinhado. O alinhamento ideal de sequências para alinhar uma janela de comparação é bem conhecido pelos versados na técnica e pode ser conduzido por ferramentas como o algoritmo de homologia local de Smith e Waterman (Waterman, M. S. Introduction to Computational Biology: Maps, sequences and genomes. Chapman & Hall. London (1995), o algoritmo de alinhamento de homologia de Needleman e Wunsch (J. MoI. Biol., 48:443-453 (1970), a pesquisa pelo método de similaridade de Pearson e Lipman (Proc. Natl. Acad. Sci., 85:2444 (1988) e, de preferência, por implementações computadorizadas desses algoritmos como GAP, BESTFIT, FASTA e TFASTA disponível como parte de GCG (Marca Registrada), Wisconsin Package (Marca Registrada da Accelrys Inc., San Diego, Calif., EUA). Uma "fração de identidade" para segmentos alinhados de uma sequência de teste e uma sequência de referência é o número de componentes idênticos que são compartilhados pelas duas sequências alinhadas divididas pelo número total de componentes no segmento de sequência de referência, ou seja, toda a sequência de referência ou uma parte menor definida da sequência de referência. A identidade de sequência percentual é representada como a fração de identidade vezes 100. A comparação de uma ou mais sequências de DNA pode ser para uma sequência de DNA de comprimento completo ou uma porção da mesma, ou para uma sequência de DNA mais longa.

[0069] Um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7 pode, assim, ser um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 95 % ou pelo menos cerca de 98 %, 99 % ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7.

[0070] Um "fragmento funcional" de um ácido nucleico compreendendo promotor preferencial em raiz e induzível ao estresse denota um ácido nucleico compreendendo um estiramento das sequências de ácido nucleico de SEQ ID NO: 7, ou do ácido nucleico tendo pelo menos 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7 que é pelo menos 400bp e ainda exerce a função desejada, isto é, que tem atividade de promotor preferencial em raiz e induzível pelo estresse. Os ensaios para determinar a atividade de promotor preferencial em raiz são fornecidos no presente documento. De preferência, o fragmento funcional do promotor preferencial em raiz e induzível por estresse contém os motivos promotores conservados, como, por exemplo, motivos promotores conservados como descrito em DoOP (doop.abc.hu, databases of Orthologous Promoters, Barta E. et al. (2005) Nucleic Acids Research Vol. 33, D86-D90). Um fragmento funcional pode ser um fragmento de pelo menos cerca de 400 pb, pelo menos cerca de 500 pb, pelo menos cerca de 600 pb, pelo menos cerca de 700 pb, pelo menos cerca de 800 pb, pelo menos cerca de 900 pb do local de início da transcrição ou pelo menos cerca de 600 pb, pelo menos cerca de 700 pb, pelo menos cerca de 800 pb, pelo menos cerca de 900 pb, pelo menos cerca de 1000 pb do sítio de início da tradução.

[0071] Um ácido nucleico que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7 que compreende adicionalmente inserção, deleção, substituição de pelo menos 1 nucleotídeo até 20 nucleotídeos, pelo menos 1 nucleotídeo até 15 nucleotídeos, pelo menos 1 nucleotídeo até 10 nucleotídeos, pelo menos 1 nucleotídeo até 5 nucleotídeos, pelo menos 1 nucleotídeo até 4 nucleotídeos, pelo menos 1 nucleotídeo até 3 nucleotídeos, ou mesmo pelo menos 1 nucleotídeo até 2 nucleotídeos podem cobrir pelo menos cerca de 600 bp, pelo menos cerca de 700 bp, pelo menos cerca de 800 bp, pelo menos cerca de 900 bp do sítio de início de transcrição ou pelo menos cerca de 800 bp, pelo menos cerca de 900 bp, pelo menos cerca de 1000 bp do sítio de início de transcrição.

[0072] Vários elementos de resposta putativos foram identificados na sequência de promotor descrita no presente documento. A busca foi limitada aos elementos responsivos ao estresse. Quatro motivos do tipo elemento responsivo a ABA(do tipo ABRE) foram identificados nas posições de nucleotídeo 186 a 193, 192 a 199, 223 a 230 e 235 a 242 na SEQ ID NO: 7.

[0073] As variantes do promotor descrito no presente documento incluem aquelas que compreendem os motivos do tipo ABRE identificados, mas foram de outro modo modificadas para deletar estiramentos de nucleotídeos dentro da sequência que não são necessários para que o promotor seja funcional de maneira preferencial em raiz e induzível por estresse. Por exemplo, qualquer estiramento de nucleotídeo localizado entre os motivos e/ou entre o início da transcrição e o primeiro motivo pode ser pelo menos parcialmente excluído para resultar em uma sequência de nucleotídeos mais curta do que a sequência de aproximadamente 1kb de SEQ ID NO: 7.

[0074] Outros ácidos nucleicos compreendendo atividade de promotor preferencial em raiz, induzível por stress ou induzido por estresse preferencial em raiz podem ser identificados usando métodos conhecidos na técnica. Essa sequência de nucleotídeos pode ser identificada e isolada por hibridização sob condições estringentes usando como sondas um ácido nucleico compreendendo as sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7 ou parte da mesma. Outros ácidos nucleicos compreendendo atividade de promotor preferencial em raiz, induzível por estresse ou induzido por estresse preferencial em raiz também podem ser obtidos por amplificação de DNA usando oligonucleotídeos específicos para as sequências de acordo com uma invenção como iniciadores, como não limitados a oligonucleotídeos compreendendo ou consistindo em cerca de 20 a cerca de 50 nucleotídeos consecutivos de qualquer uma das sequências de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7 ou seu complemento. Outros ácidos nucleicos compreendendo atividade de promotor preferencial em raiz, induzível por estresse ou induzido por estresse preferencial em raiz podem ser identificados in silico usando pesquisa de homologia de Ferramenta de Pesquisa de Alinhamento Local Básico (BLAST) com outras sequências de aminoácidos ou nucleotídeos. A funcionalidade dos ácidos nucleicos identificados compreendendo atividade de promotor preferencial em raiz, induzível por estresse ou induzido por estresse preferencial em raiz pode ser validada usando os métodos descritos no presente documento. Outros ácidos nucleicos compreendendo atividade de promotor preferencial em raiz, induzível por estresse ou induzida por estresse preferencial em raiz também podem ser identificados pela identificação de sequências de genes ortólogas às sequências de genes das sequências de codificação endógena dos genes controlados pelos promotores da invenção, e isolando e testando as sequências de promotor a montante dessas sequências de codificação homólogas ortólogas.

[0075] Os promotores de acordo com uma invenção podem ainda ser usados para criar promotores híbridos, isto é, promotores contendo (partes de) um ou mais dos promotores da invenção atual e (partes de) outro promotor que pode ser recentemente identificado ou conhecido na técnica. Tais promotores híbridos podem ter nível de expressão ou especificidade de tecido otimizado.

[0076] Conforme usado no presente documento, "promotor expressável em planta" significa uma região de sequência de DNA que é essencial para o início da transcrição em uma célula vegetal. Isto inclui qualquer promotor de origem vegetal, mas também qualquer promotor de origem não vegetal que seja capaz de direcionar a transcrição em uma célula vegetal, isto é, certos promotores de origem viral ou bacteriana, tais como o CaMV35S, o promotor do vírus do trevo subterrâneo n° 4 ou n° 7 (documento WO9606932) ou promotores do gene T-DNA e semelhantes.

[0077] Em uma modalidade adicional, o promotor expressável em planta é um promotor constitutivo. Em outra modalidade, o promotor é o promotor CaMV35S do Vírus do Mosaico da Couve em Flor.

[0078] Outros exemplos de promotores constitutivos incluem o promotor do gene da actina (McElroy et al. (1990) Plant Cell 2: 163-171), o promotor CaMV19S (Nilsson et al. (1997) Physiol. Plant. 100: 456-462), o promotor GOS2 (de Pater et al. (1992) Plant. J. 2(6): 837-44), o promotor do gene de ubiquitina (Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18: 675-689), o promotor do gene de ciclofilina do arroz (Buchholz et al. (1994) Plant. Mol. Biol. 25(5): 837 43), o promotor do gene de histona H3 do milho (Lepetit et al. (1992) Mol. Gen. Genet. 231: 276-285) ou o promotor do gene de actina 2 (An et al. (1996) Plant J. 10(1): 107-121). Genes Recombinantes

[0079] Uma modalidade adicional fornece um gene recombinante que compreende o ácido nucleico que tem uma atividade de promotor preferencial em raiz induzida por estresse descrita acima operativamente ligada a uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um produto de expressão de interesse e, opcionalmente, uma sequência de transcrição e uma sequência de poliadenilação, de preferência, uma região de terminação e poliadenilação de transcrição e funcional em células vegetais de Gossypium. Em uma outra modalidade, o dito produto de interesse de expressão é um RNA capaz de modular a expressão de um gene ou é uma proteína.

[0080] A expressão "operacionalmente ligada" se refere à disposição espacial funcional de duas ou mais regiões de ácido nucleico ou sequências de ácido nucleico. Por exemplo, uma região promotora pode ser posicionada em relação a uma sequência de ácido nucleico tal que a transcrição de uma sequência de ácido nucleico seja dirigida pela região promotora. Assim, uma região promotora está "ligada operativamente" à sequência de ácido nucleico. "Funcionalmente ligado"é um termo equivalente.

[0081] O termo "produto de expressão"se refere a um produto de transcrição. O dito produto de expressão pode ser o RNA transcrito. É entendido que o RNA que é produzido é um RNA biologicamente ativo. O dito produto de expressão também pode ser um peptídeo, um polipeptídeo ou uma proteína, quando o dito ARN biologicamente ativo é um mRNA e a dita proteína é produzida por tradução do dito mRNA.

[0082] Alternativamente, o ácido nucleico heterólogo, operacionalmente ligado aos promotores da invenção, também pode codificar para um RNA capaz de modular a expressão de um gene. O dito RNA capaz de modular a expressão de um gene pode ser um RNA que reduz a expressão de um gene. O dito RNA pode reduzir a expressão de um gene, por exemplo, através do mecanismo de silenciamento de gene mediado por RNA.

[0083] O dito RNA capaz de modular a expressão de um gene pode ser um RNA de silenciamento regulando negativamente a expressão de um gene-alvo. Tal como usado no presente documento, "RNA de silenciamento" ou "molécula de RNA de silenciamento" se refere a qualquer molécula de RNA que, após a introdução em uma célula vegetal, reduz a expressão de um gene-alvo. Tal RNA de silenciamento pode ser, por exemplo, chamado "RNA antissenso", em que a molécula de RNA compreende uma sequência de pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos com 95 % de identidade de sequência com o complemento da sequência do ácido nucleico alvo, de preferência, a sequência de codificação do gene- alvo. Contudo, o RNA antissenso também pode ser dirigido para sequências reguladoras de genes-alvo, incluindo as sequências promotoras e os sinais de terminação e poliadenilação da transcrição. O RNA de silenciamento inclui ainda o chamado "RNA de sentido", em que a molécula de RNA compreende uma sequência de pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos com 95 % de identidade de sequência com a sequência do ácido nucleico alvo. Outro RNA de silenciamento pode ser "RNA não poliadenilado" compreendendo pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos com identidade de sequência de 95 % com o complemento da sequência do ácido nucleico alvo, como descrito no documento WO01/12824 ou documento US6423885 (ambos os documentos aqui incorporados por referência). Ainda outro tipo de RNA de silenciamento é uma molécula de RNA como descrito no documento WO03/076619 (incorporado no presente documento por referência) compreendendo pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos que tem 95 % de identidade de sequência com a sequência do ácido nucleico alvo ou o complemento da mesma, e compreendendo adicionalmente uma em grande parte de fita dupla, como descrito no documento WO03/076619 (incluindo regiões em grande parte de fita dupla compreendendo um sinal de localização nuclear de um viroide do tipo viroide de tubérculo de batata ou que compreende repetições de trinucleotídeos CUG). O RNA de silenciamento também pode ser RNA de fita dupla que compreende uma fita senso e antissenso como definido no presente documento, em que a fita senso e antissenso são capazes de emparelhamento de base entre si para formar uma região de RNA de fita dupla (de preferência, os ditos pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos do RNA senso e antissenso são complementares entre si). As regiões senso e antissenso também podem estar presentes dentro de uma molécula de RNA de modo que um RNA em forma de grampo (hairpin) (ARNH) possa ser formado quando as regiões senso e antissenso formarem uma região de RNA de fita dupla. O hpRNA é bem conhecido na técnica (consulte, por exemplo, o documento WO99/53050, incorporado no presente documento por referência). O hpRNA pode ser classificado como hpRNA longo, com regiões senso e antissenso longas, que podem ser amplamente complementares, mas não precisam ser inteiramente complementares (tipicamente maiores do que cerca de 200 pb, variando entre 200 a 1.000 pb). O hpRNA também pode ser bastante pequeno variando em tamanho de cerca de 30 a cerca de 42 pb, mas não muito superior a 94 pb (consulte o documento WO04/073390, incorporado no presente documento por referência). O RNA de silenciamento também pode ser moléculas artificiais de micro-RNA como descrito, por exemplo, no documento WO2005/052170, WO2005/047505 ou US 2005/0144667, ou ta-siRNAs como descrito no documento WO2006/074400 (todos os documentos aqui incorporados por referência). O dito RNA capaz de modular a expressão de um gene também pode ser uma ribozima de RNA.

[0084] O dito RNA capaz de modular a expressão de um gene pode modular, de preferência, regular negativamente, a expressão de outros genes (ou seja, genes-alvo) compreendidos dentro das raízes ou mesmo de genes presentes dentro de um patógeno ou praga que alimenta as raízes da planta transgênica, tal como vírus, fungos, insetos, nematódeos, bactérias. Um exemplo de controle de pragas usando o silenciamento de genes é descrito, por exemplo, no documento WO2007/080127.

[0085] A sequência de ácido nucleico heteróloga aos promotores de acordo com a invenção pode geralmente ser qualquer sequência de ácido nucleico que efetua um nível aumentado, alterado (por exemplo, em um órgão diferente) ou reduzido de transcrição de um gene para o qual é desejada tal modulação de expressão. A sequência de ácido nucleico pode, por exemplo, codificar uma proteína de interesse. Exemplos de genes para os quais um nível aumentado ou reduzido de transcrição pode ser desejado nas raízes são, por exemplo, ácidos nucleicos que podem fornecer uma característica importante em agricultura ou industrial em raízes. As sequências de ácido nucleico heterólogo adequadas de interesse incluem ácidos nucleicos que modulam a expressão de genes que conferem resistência a pragas radiculares, como nematódeos e doenças, genes de tolerância ao estresse, genes que codificam proteínas envolvidas na expansão celular e genes de divisão celular envolvidos na absorção de nutrientes, genes envolvidos no metabolismo ou assimilação de nutrientes, genes que codificam proteínas de transporte, como transportadores de nitrato, incluindo proteínas de transporte NRT, transportadores de amônio, incluindo proteínas AMT, e similares. Os genes exemplificadores para os quais um nível aumentado ou reduzido de transcrição pode ser desejado mediante o estresse são, por exemplo, genes que codificam fatores de proteção de macromoléculas (proteínas LEA, chaperonas), enzimas-chave para a biossíntese de osmólitos (prolina, açúcares), enzimas de desintoxicação (por exemplo, Super Óxido Dismutase), canais de água ou transportadores, fatores de transcrição (por exemplo, DREB2, AREB, MYC, bZIP, NAC) ou genes envolvidos na sinalização hormonal ou na biossíntese (exemplos de hormônios relevantes são ABA, brassinosteroide, citocinina, etileno). Genes para resistência a nematódeo também são de relevância (por exemplo, documentos WO 1995/020669, WO 2001/051627, WO 2008/139334, WO 2008/095972, WO 2006/085966, WO 2003/033651, WO 1999/060141, WO 1998/012335, WO 1996/030517, WO 1993/018170, WO2008/095886, WO2008/095887, WO2008/095888, WO2008/095889, WO2008/095910, WO2008/095911, WO2008/095916, WO2008/095919, WO2008/095969, WO2008/095970, WO2008/095972, WO2008/110522, WO2008/139334, WO2008/152008, WO2010/077858, WO 2010/091230, WO 2010/102172, WO 2010/106163, WO2011/082217, WO2011/003783, WO 2011/014749, WO 2007/147029, WO 2014/003769, WO 2010/077858).

[0086] Uma "região de terminação e poliadenilação da transcrição", tal como usado no presente documento, é uma sequência que controla a clivagem do RNA nascente, após o qual uma cauda de poli(A) é adicionada na extremidade 3' do RNA resultante, funcional em células vegetais. Os sinais de terminação e poliadenilação de transcrição funcionaos em células vegetais incluem, sem limitação, 3’nos, 3’35S, 3’his e 3’g7.

[0087] O termo "proteína"usado de forma intercambiável com o termo "polipeptídeo”, conforme usado no presente documento, descreve um grupo de moléculas que consiste em mais de 30 aminoácidos, enquanto que o termo "peptídeo"descreve moléculas que consistem em até 30 aminoácidos. As proteínas e os peptídeos podem, ainda, formar dímeros, trímeros e oligômeros superiores, isto é, constituídos por mais de uma molécula de (poli)peptídeo. Moléculas de peptídeo ou proteína formando tais dímeros, trímeros, etc. podem ser idênticas ou não idênticas. As estruturas correspondentes de ordem superior são, consequentemente, denominadas homo ou heterodímeros, homo ou heterotrômetros, etc. Os termos "proteína"e "peptídeo" também se referem a proteínas ou peptídeos naturalmente modificados, em que a modificação é efetuada, por exemplo, por glicosilação, acetilação, fosforilação e semelhantes. Tais modificações são bem conhecidas na técnica.

[0088] O termo "heterólogo"se refere à relação entre duas ou mais sequências de ácido nucleico ou proteína derivadas de diferentes fontes. Por exemplo, um promotor é heterogêneo em relação a uma região de DNA operacionalmente ligada, como uma sequência de codificação se essa combinação normalmente não for encontrada na natureza. Além disso, uma sequência particular pode ser "heteróloga"em relação a uma célula ou organismo no qual está inserido (isto é, não ocorre naturalmente na célula ou organismo particular). Por exemplo, o gene recombinante revelado no presente documento é um ácido nucleico heterólogo.

[0089] O termo "gene recombinante" se refere a qualquer gene artificial que contenha: a) sequências de DNA, incluindo sequências reguladoras e de codificação que não são encontradas juntas na natureza, ou b) sequências que codificam partes de proteínas não adjacentes naturalmente, ou c) partes de promotores que não adjacentes de forma natural. Consequentemente, um gene recombinante pode compreender sequências reguladoras e sequências de codificação que são derivadas de diferentes fontes ou compreendem sequências reguladoras e sequências de codificação derivadas da mesma fonte, mas dispostas de uma maneira diferente daquela encontrada na natureza.

[0090] Em outro aspecto, a invenção fornece um gene recombinante compreendendo (a) um promotor expressável em planta selecionado do grupo que consiste em i. promotor preferencial em raiz, ii. promotor induzível pelo estresse e iii. promotor preferencial em raiz induzido por estresse, (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína Anexina (c) e, opcionalmente, uma sequência de terminação e poliadenilação de transcrição, de preferência uma região de terminação e poliadenilação de transcrição funcional em plantas.

[0091] Qualquer um dos promotores e sequências de ácido nucleico heterólogo acima descrito pode ser fornecido em um vector recombinante. Um vetor recombinante compreende tipicamente, em uma orientação 5' a 3': um promotor para direcionar a transcrição de uma sequência de ácido nucleico e uma sequência de ácido nucleico. O vector recombinante pode ainda compreender um terminador transcricional 3 ', um sinal de poliadenilação 3', outras sequências de ácido nucleico não traduzidas, sequências de ácido nucleico de trânsito e alvo, marcadores, intensificadores e operadores selecionáveis, conforme desejado. A expressão "5' UTR" se refere à região não traduzida do DNA a montante, ou 5 'da região de codificação de um gene e "3' UTR" se refere à região não traduzida de DNA a jusante, ou 3 'da região de codificação de um gene. Meios para preparar vetores recombinantes são bem conhecidos na técnica. Os métodos para produzir vectores recombinantes particularmente adequados para a transformação da planta são descritos nos documentos US4971908, US4940835, US4769061 e US4757011. Os vectores típicos úteis para a expressão de ácidos nucleicos em plantas superiores são bem conhecidos na técnica e incluem vectores derivados do plasmídeo indutor de tumor (Ti) de Agrobacterium tumefaciens. Um ou mais promotores adicionais podem também ser fornecidos no vector recombinante. Estes promotores podem estar ligados operativamente, por exemplo, sem limitação, a qualquer uma das sequências de ácido nucleico descritas acima. Alternativamente, os promotores podem estar operativamente ligados a outras sequências de ácido nucleico, como aqueles que codificam peptídeos de trânsito, proteínas marcadoras selecionáveis ou sequências antissenso. Estes promotores adicionais podem ser selecionados com base no tipo de célula em que o vector será inserido. Além disso, os promotores que funcionam em bactérias, leveduras e plantas são todos bem ensinados na técnica. Os promotores adicionais também podem ser selecionados com base em suas características regulatórias. Exemplos de tais características incluem o aprimoramento da atividade transcricional, a indutabilidade, a especificidade do tecido e a especificidade do estágio do desenvolvimento.

[0092] O vector recombinante também pode conter uma ou mais sequências de ácido nucleico adicionais. Estas sequências de ácido nucleico adicionais podem geralmente ser quaisquer sequências adequadas para uso em um vector recombinante. Tais sequências de ácido nucleico incluem, sem limitação, qualquer uma das sequências de ácido nucleico, e suas formas modificadas, descritas acima. As sequências de ácido nucleico estrutural adicionais também podem estar operacionalmente ligadas a qualquer um dos promotores descritos acima. As uma ou mais sequências de ácido nucleico estrutural podem estar, cada uma, operativamente ligadas a promotores separados. Alternativamente, as sequências de ácido nucleico estrutural podem estar operacionalmente ligadas a um único promotor (isto é, um único operon). Anexinas

[0093] Adequados para a invenção são ácidos nucleicos, que codificam uma proteína Anexina, que compreende uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, ou pelo menos 60 %, ou pelo menos 70 %, ou pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 % ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 98 % de identidade de sequência com o gene descrito no presente documento e também são ditos como variantes. O termo "variante" em relação às sequências de nucleotídeos SEQ ID NO: 12 e SEQ ID NO: 14 da invenção se destina a significar sequências substancialmente similares. As variantes alélicas de ocorrência natural, como estas, podem ser identificadas com as técnicas conhecidas de biologia molecular, como, por exemplo, com reação em cadeia da polimerase (PCR) e técnicas de hibridização como descrito no presente documento anteriormente. As sequências de nucleotídeos variantes também incluem sequências de nucleotídeos sinteticamente derivadas, como aquelas geradas, por exemplo, usando mutagênese sítio-dirigida de qualquer uma das SEQ ID NO: 12 ou 14. Geralmente, as variantes da sequência de nucleotídeos da invenção terão pelo menos 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, por exemplo, preferencialmente 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, para 79 %, geralmente pelo menos 80 %, por exemplo, 81 % a 84 %, pelo menos 85 %, por exemplo, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % e 99 % de identidade de sequência de nucleotídeos com a sequência de nucleotídeos nativa (tipo selvagem ou endógena). Os derivados das moléculas de DNA revelados no presente documento podem incluir, sem limitação, deleções de sequência, mutações de ponto único ou múltiplos, alterações em um sítio de enzima de restrição particular, adição de elementos funcionais ou outros meios de modificação molecular. As técnicas para obter tais derivados são bem conhecidas na técnica (consulte, por exemplo, J. F. Sambrook, D. W. Russell, e N. Irwin (2000) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a edição, Volumes 1, 2 e 3. Cold Spring Harbor Laboratory Press). Os versados na técnica estão familiarizados com os materiais de recursos padrão que descrevem condições e procedimentos específicos para a construção, manipulação e isolamento de macromoléculas (por exemplo, moléculas de DNA, plasmídeos, etc.), bem como a geração de organismos recombinantes e a triagem e o isolamento de moléculas de DNA.

[0094] O termo "porcentagem de identidade de sequência" é usado nesta seção como definido acima.

[0095] Um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 pode assim ser um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos com pelo menos 80 %, ou pelo menos 85 %, ou pelo menos 90 %, ou pelo menos 95 %, ou pelo menos 98 %, ou 100 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14, respectivamente.

[0096] Em uma modalidade preferencial, a sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína Anexina compreende (a) uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14; (b) uma sequência de nucleotídeos pelo menos 80 % idêntica a SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14 (c) uma sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico capaz de hibridizar sob condições estringentes para a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14, (d) uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15 (e) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos tendo 80 % de identidade com SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15, (f) uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína que compreende quatro ou mais domínios de repetição de anexina.

[0097] SEQ ID NO: 12 representa a sequência de nucleotídeos do gene AnnBj1, SEQ ID NO: 14 representa a sequência de nucleotídeos do gene GhAnn1, SEQ ID NO: 13 representa a sequência de aminoácidos da proteína AnnBj1 e SEQ ID NO: 15 representa a sequência de aminoácidos da proteína GhAnn1.

[0098] As anexinas são definidas por sua dobra altamente conservada consistindo em quatro ou mais repetições de uma chamada sequência de assinatura de domínio de anexina repetida. Os domínios de repetição de anexina são conhecidos no banco de dados Pfam como PF00191, no banco de dados Interpro como IPR001464 e no banco de dados inteligente como SM00335. Cada repetição consiste em um fardo de cinco hélices. Uma dobra de endonexina pode ser identificada no início de cada repetição. A ligação de cálcio ocorre nos locais de ligação de tipo II estabelecidos nas regiões de dobra de endonexina da primeira e quarta repetições. Outros aminoácidos particulares são essenciais para a função de Anexina: um triptofano e uma histidina na primeira dobra de endonexina, um triptofano no final do primeiro domínio de repetição de anexina e uma isoleucina-arginina-isoleucina na terceira dobra de endonexina (Figura 2).

[0099] Embora a invenção de preferência use ácido nucleico que codifica o AnnBj1 de Brassica juncea, ácidos nucleicos que codificam outras anexinas podem ser usados. Exemplos de tais proteínas são: Q67EX8, E0ZQA2, D2JYA7, A0A078HJR9, X2JGY9, A0A078CEH0, D9J167, M4F009, D7KLX8, Q9SYT0, D2JYA6, R0GQT5, A0A078HYS1, M4F6Q4, A0A087G1V1, A0A078DR00, V4LGL7, A0A061FNB4, A0A067GQH6, V4T729, M4N630, O82090, S5GFP3, P93157, A9PA39, G3E7M9, M4MZ02, M5XRZ4, A9PH68, A0A059BS83, A0A067KYU4, M4FEQ6, K9JGF9, I3SZS2, A0A067LQJ4, B9RJJ1, O22341, S5G971, A0A059B7W7, A0A061DJJ7, A5BTZ8, G7KB73, A0A059B7M2, A0A059B7C5, Q9XEN8, A0A068TXQ7, K4BSR4, A0A059B8A3, A0A059B8Z0, Q42657, M5W098, Q9SB88, Q9ZRU7, P93158, A0A059BRT1, O24131, B9HFG8, M0ZNV9, B9H529, C6TFT8, I3RZY7, M4MX74, Q69DC2, L0AU94, L0ASQ7, V7B5V0, Q9M3H3, O81536, O24132, M4MX50, A0A068TYU6, R0G7S3, O81535, A0A022R8D3, A0A067ERS2, A0A078FJE4, M4E6E2, I3Y171, Q2XTE7, V7CRX1, A5B479, Q9XEE2, Q42922, A9X4R2, D7MT72, A0A072TF84, V4MJ15, A0A078H8V3, W9QYY2, M4ESW0, A0A087GE86, X2JPM6, Q9LX07, V4VZP8, B3TLY9, Q4ABP7, A0A078BZL8, A9X4R1, V4KSN9, B7U9R9.

[0100] Além disso, é claro que as variantes das proteínas Anexina, em que um ou mais resíduos de aminoácidos foram deletados, substituídos ou inseridos, também podem ser usados para o mesmo efeito nos métodos de acordo com uma invenção, desde que os domínios de repetição Anexina não sejam afetados pela deleção, substituição ou inserção de aminoácidos. Estas variantes de proteínas Anexina podem ter cerca de 95 % de identidade de sequência com qualquer uma das proteínas Anexina mencionadas no presente documento.

[0101] Exemplos de substituições são as substituições conservativas, isto é, substituições de um aminoácido por outro com propriedades fisicoquímicas semelhantes. Essas substituições são conhecidas por não afetar a estrutura de uma proteína. Tais substituições são conseguidas substituindo um aminoácido por outro aminoácido pertencente ao mesmo grupo da seguinte maneira: Grupo 1: Cisteína (C); Grupo 2: Fenilalanina (F), Triptofano (W) e Tirosina (Y); Grupo 3: Histidina (H), Lisina (K) e Arginina (R); Grupo 4: Ácido aspártico (D), Ácido glutâmico (E), Asparagina (N) e Glutamina (Q); Grupo 5: Isoleucina (I), Leucina (L), Metionina (M) e Valina (V); Grupo 6: Alanina (A), Glicina (G), Prolina (P), Serina (S) e Treonina (T).

Células hospedeiras e plantas

[0102] Ainda outras modalidades fornecem uma célula hospedeira, como uma célula de E. coli, uma célula de Agrobacterium, uma célula de levedura ou uma célula vegetal, que compreende o ácido nucleico isolado de acordo com a invenção, ou os genes recombinantes de acordo com a invenção.

[0103] Outras sequências de ácido nucleico podem também ser introduzidas na célula hospedeira juntamente com o promotor e a sequência de ácido nucleico estrutural, por exemplo, também em conjunto com o vetor da invenção. Estas outras sequências podem incluir terminadores de transcrição 3', sinais de poliadenilação 3', outras sequências de ácido nucleico não traduzidas, sequências de trânsito ou alvo, marcadores, intensificadores e operadores selecionáveis. As sequências de ácido nucleico preferenciais da presente invenção, incluindo vetores recombinantes, sequências de ácidos nucleicos estruturais, promotores e outros elementos reguladores, estão descritas acima.

[0104] Em modalidades adicionais, é fornecida uma planta compreendendo qualquer um dos genes recombinantes de acordo com a invenção. Uma outra modalidade fornece partes de plantas e sementes obteníveis a partir da planta de acordo com a invenção. Estas partes e sementes de plantas compreendem os genes recombinantes descritos acima. Em outra forma de realização, as plantas, partes de plantas ou sementes de acordo com a invenção são plantas, partes de plantas ou sementes de algodão, soja ou trigo.

[0105] A célula vegetal ou planta que compreende qualquer um dos genes recombinantes de acordo com a invenção pode ser uma célula vegetal ou uma planta que compreende um gene recombinante do qual o promotor ou a sequência de ácido nucleico heteróloga ligada operacionalmente ao dito promotor são heterólogos em relação à célula vegetal. Tais células de plantas ou plantas podem ser plantas transgênicas nas quais o gene recombinante é introduzido por transformação. Alternativamente, a célula vegetal da planta pode compreender o promotor de acordo com a invenção derivada da mesma espécie operacionalmente ligada a um ácido nucleico que também é derivado da mesma espécie, ou seja, nem o promotor nem o ácido nucleico ligado operativamente são heterólogos em relação à célula da planta, mas o promotor está operacionalmente ligado a um ácido nucleico ao qual não está ligado na natureza. Um gene recombinante pode ser introduzido na planta ou célula vegetal por transformação, de modo que tanto o promotor como nucleotídeo ligado operacionalmente estejam em uma posição no genoma em que não ocorrem naturalmente. Alternativamente, o promotor de acordo com a invenção pode ser integrado de forma direcionada ao genoma da planta ou célula vegetal a montante de um ácido nucleico endógeno que codifica um produto de expressão de interesse, isto é, para modular o padrão de expressão de um gene endógeno. O promotor que está integrado de forma direta a montante de um ácido nucleico endógeno pode ser integrado em células de uma espécie de planta a partir da qual a mesma é originalmente derivada, ou em células de uma espécie vegetal heteróloga. Alternativamente, um ácido nucleico heterólogo pode ser integrado de forma direcionada ao genoma da planta ou célula vegetal a jusante do promotor de acordo com a invenção, de modo que o dito ácido nucleico heterólogo seja expresso preferencialmente e seja induzível por estresse. O dito ácido nucleico heterólogo é um ácido nucleico que é heterólogo em relação ao promotor, isto é, a combinação do promotor com o dito ácido nucleico heterólogo não é normalmente encontrada na natureza. O dito ácido nucleico heterólogo pode ser um ácido nucleico que é heterólogo às ditas espécies de plantas em que está inserido, mas também pode ocorrer naturalmente nas ditas espécies de plantas em um local diferente no genoma da planta. O dito promotor ou o dito ácido nucleico heterólogo podem ser integrados de forma direcionada no genoma da planta através da inserção de sequência direcionada, utilizando, por exemplo, os métodos conforme descrito no documento WO2005/049842.

[0106] “Plantas” abrange “plantas monocotiledôneas” e “plantas dicotiledôneas”.

[0107] As "plantas monocotiledôneas", também conhecidas como "plantas monocotadas" ou "monocotilédones", são bem conhecidas na técnica e são plantas das quais a semente tipicamente tem um cotilédone. Exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas, como prado (grama azul, Poa), ervas forrageiras, como festuca, lolium, capim temperado, como Agrostis e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo e maís (milho).

[0108] As "plantas dicotiledôneas", também conhecidas como "plantas dicotadas" ou "dicotiledóneas", são bem conhecidas na técnica e são plantas das quais a semente tipicamente tem dois cotilédones. Exemplos de famílias de plantas dicotiledôneas são Brassicaceae, Solanaceae, Fabaceae, Malvaceae.

[0109] “Malvaceae” conforme usado no presente documento, se refere a plantas pertencentes à família de plantas de Malvaceae, também chamado de família de malváceas. Exemplos de Malvaceae são, sem limitação, espécies de Gossypium, como Gossypium hirsutum, Gossypium barbadense, Gossypium arboreum e Gossypium herbaceum ou progenitura de cruzamentos de tais espécies com outras espécies ou cruzamentos entre essas espécies.

[0110] "Algodão"ou "planta de algodão", conforme usado no presente documento, pode ser qualquer variedade útil para o cultivo de algodão. As variedades de algodão mais usadas são Gossypium barbadense, G. hirsutum, G. arboreum e G. herbaceum. Variedades adicionais incluem G. africanum e G. raimondii. Também estão incluídas progenituras de cruzamentos de qualquer uma das espécies acima mencionadas com outras espécies ou cruzamentos entre essas espécies.

[0111] O seguinte é uma lista não limitativa de genótipos de algodão que podem ser usados para transformação: Coker 312, Coker310, Coker 5Acala SJ-5, GSC25110, Siokra 1-3, T25, GSA75, Acala SJ2, Acala SJ4, Acala SJ5, Acala SJ-C1, Acala B1644, Acala B1654-26, Acala B1654-43, Acala B3991, Acala GC356, Acala GC510, Acala GAM1, Acala C1, Acala Royale, Acala Maxxa, Acala Prema, Acala B638, Acala B1810, Acala B2724, Acala B4894, Acala B5002, Acala 1517-88, Acala 1517-91, Acala 1517-95, não Acala "picker" Siokra, variedade "stripper" FC2017, Coker 315, STONEVILLE 506, STONEVILLE 825, STONEVILLE 324, STONEVILLE 453, STONEVILLE 474, STONEVILLE KC 311, STONEVILLE LA 887, STONEVILLE 4145, STONEVILLE 4288, STONEVILLE 4498, STONEVILLE 4554, STONEVILLE 4747, STONEVILLE 4946, STONEVILLE 5032, STONEVILLE 5115, STONEVILLE 5289, STONEVILLE 5445, STONEVILLE 5458, STONEVILLE 6182, STONEVILLE 6448, Daytona, Cobalt, DP20, DP20B, DP NUCOTN 33B, DP NUCOTN 35B, DP41, DP50, DP51, DP61, DP90, DP77, DP161, DP340, DP357, DP358, DP360, DP744, DP0912, DP0920, DP0924, DP0935, DP0949, DP0920, DP1028, DP1034, DP1044, DP1050, DP1133, DP1137, DP1212, DP1219, DP1252, DP1311, DP1321, DP1359, DP1410, DP1441, DP1454, DP5409, DP5415, DP5461, DP5690, DP5816, MON/DP 09R303, MON/DP 09R549, MON/DP 09R550, MON/DP 09R555, MON/DP 09R573, MON/DP 09R605, MON/DP 09R615, MON/DP 09R619, MON/DP 09R621, MON/DP 09R623, MON/DP 09R627, MON/DP 09R643, MON/DP 09R796, MON/DP 09R999, MON/DP 10R013, MON/DP 10R020, MON/DP 10R030, MON/DP 10R051, MON/DP 10R052, MON/DP 11R112, MON/DP 11R124, MON/DP 11R130, MON/DP 11R136, MON/DP 11R154, MON/DP 11R158, MON/DP 11R159, MON/DP 12R224, MON/DP 12R242, MON/DP 12R244, MON/DP 12R249, MON/DP 12R251, 12R254, MON/DP 13R310, MON/DP 13R348, MON/DP 13R352, MON/DP 14R1455, MON/DP 14R1456, DP Suregrow, Suregrow 125, Suregrow 248, Suregrow 404, Suregrow 501, Suregrow 1001, DES119, McN235, HBX87, HBX191, HBX107, FC 3027, CHEMBRED A1, CHEMBRED A2, CHEMBRED A3, CHEMBRED A4, CHEMBRED B1, CHEMBRED B2, CHEMBRED B3, CHEMBRED C1, CHEMBRED C2, CHEMBRED C3, CHEMBRED C4, CHEMBRED CB407, PAYMASTER 145, HS26, HS46, Hyperformer 44, Hyperformer HS46, SICALA, PIMA S6 ORO BLANCO PIMA, PIMA S7, HA01, HA02, HA03, HA04, HA05, HA195, HA211, HA195, HA222, White PIMA, PHY72, PHY222, PHY333, PHY339, PHY367, PHY375, PHY417, PHY427, PHY495, PHY499, PHY565, PHY575, PHY725, PHY755, PHY800, PHY802, PHY804, PHY805, PHY811, PHY830, FM5013, FM5015, FM5017, FM989, FM832, FM966, FM958, FM989, FM958, FM832, FM991, FM819, FM800, FM960, FM966, FM981, FM1320, FM1740, FM1773, FM1830, FM1845, FM1880, FM1900, FM1944, FM2007, FM2011, FM2322, FM2324, FM2334, FM2484, FM2989, FM5035, FM5044, FM5045, FM5013, FM5015, FM5017, FM5024, FM8270, FM9058, FM9160, FM9170, FM9180, FM9250 e plantas com genótipos derivados dos mesmos.

[0112] “Fabaceae” conforme usado no presente documento, se refere à planta vulgarmente conhecida como plantas de leguminosas, ervilhas ou plantas de feijão. Exemplos de Fabaceae são, sem limitação, Glycine max (soja), Phaseolus (feijão), Pisum sativum (ervilha), Cicer arietinum (grão de bico), Medicago sativa (alfalfa), Arachis hypogaea (amendoim), Lathyrus odoratus (ervilha doce), Ceratonia siliqua (alfarrobeira), e Glycyrrhiza glabra (alcaçuz).

[0113] “Partes de plantas", conforme usado no presente documento, são partes da planta, que podem ser células, tecidos ou órgãos, como sementes, partes cortadas, como raízes, folhas, flores, pólen, fibras etc.

[0114] As plantas de acordo com a invenção podem, adicionalmente, conter um endógeno ou um transgene, que confere resistência ao herbicida, como o gene bar ou pat, que conferem resistência ao glufosinato de amônio (Liberty®, Basta® ou Ignite®) [documentos EP 0 242 236 e EP 0 242 246 incorporados por referência]; ou qualquer gene EPSPS modificado, como o gene 2mEPSPS de milho [documentos EP0 508 909 e EP 0 507 698 incorporados por referência], ou glifosato acetiltransferase, ou glifosato oxidoredutase, que conferem resistência ao glifosato (RoundupReady®) ou bromoxinitril nitrilase para conferir tolerância a bromoxinitrilo ou qualquer gene AHAS modificado, o que confere tolerância a sulfonilureias, imidazolinonas, sulfonilaminocarboniltriazolinonas, triazolopirimidinas ou pirimidil (oxi/tio) benzoatos, como mutantes tolerantes à imidazolinona de colza PM1 e PM2, atualmente comercializados como canola Clearfield®. Além disso, as plantas de acordo com a invenção podem, adicionalmente, conter um endógeno ou um transgene que confira um teor de óleo aumentado ou uma composição de óleo melhorada, como um aumento de 12:0 ACP tioesterase para obter um laureato alto, que confere controle de polinização, tal como barnase sob controle de um promotor específico da antera para obter esterilidade masculina, ou barstar sob o controle de um promotor específico da antera para conferir restauração da esterilidade masculina, ou como a esterilidade masculina citoplasmática Ogura e restaurador nuclear de fertilidade.

[0115] As plantas ou sementes das plantas de acordo com a invenção podem ser tratadas adicionalmente com um composto químico, como um composto químico selecionado das seguintes listas: Herbicidas: Diuron, Fluometuron, MSMA, Oxifluorfen, Prometrin, Trifluralin, Carfentrazona, Cletodim, Fluazifop-butila, Glifosato, Norflurazon, Pendimetalina, Pirithiobac-sódico, Trifloxisulfuron, Tepraloxidim, Glufosinato, Flumioxazin, Tidiazuron; inseticidas de algodão como Acefato, Aldicarbe, Clorpirifos, Cipermetrina, Deltametrina, Abamectina, Acetamipride, Benzoato de Emamectina, Imidaclopride, Indoxacarbe, Lambda- Ci-halotrina, Espinosade, Tiodicarbe, Gama-Ci-halotrina, Espiromesifena, Piridalil, Flonicamide, Flubendiamida, Triflumuron, Rinaxipir, Beta-Ciflutrina, Espirotetramate, Clotianidina, Tiametoxam, Tiaclopride, Dinetofurano, Flubendiamida, Ciazipir, Espinosade, Espinotoram, gama Ci- halotrina, 4- [ [(6-Clorpiridin-3-il)metil](2,2- difluoretil)amino]furan-2(5H)-on, Tiodicarbe, Avermectina, Flonicamide, Piridalil, Espiromesifeno, Sulfoxaflor; e fungicidas de algodão como Azoxistrobin, Bixafen, Boscalid, Carbendazim, Clorotalonil, Cobre, Ciproconazol, Difenoconazol, Dimoxistrobin, Epoxiconazol, Fenamidona, Fluazinam, Fluopiram, Fluoxastrobin, Fluxapiroxad, Iprodiona, Isopirazam, Isotianil, Mancozeb, Maneb, Metominostrobin, Pentiopirad, Picoxistrobin, Propineb, Protioconazol, Piraclostrobin, Quintozeno, Tebuconazol, Tetraconazol, Tiophanato-metila, Trifloxistrobin, Clopiralid, Diclofop, Etametsulfuron, Fluazifop, Metazaclor, Quinmerac, Quizalofop. Fungicidas / PGRs: Azoxistrobin, N- [9-(diclorometileno)-1,2,3,4-tetraidro-1,4-metanonaftalen- 5-il]-3-(difluorometil)-1-metil-1H-pirazol-4-carboxamida (Benzovindiflupir, Benzodiflupir), Bixafen, Boscalid, Carbendazim, Carboxin, Clormequat-cloreto, Coniothryrium minitans, Ciproconazol, Ciprodinil, Difenoconazol, Dimetomorf, Dimoxistrobin, Epoxiconazol, Famoxadona, Fluazinam, Fludioxonil, Fluopicolida, Fluopiram, Fluoxastrobin, Fluquinconazol, Flusilazol, Fluthianil, Flutriafol, Fluxapiroxad, Iprodiona, Isopirazam, Mefenoxam, Mepiquat-cloreto, Metalaxil, Metconazol, Metominostrobin, Paclobutrazol, Penflufen, Pentiopirad, Picoxistrobin, Procloraz, Protioconazol, Piraclostrobin, Sedaxano, Tebuconazol, Tetraconazol, Tiofanato-metila, Tiram, Triadimenol, Trifloxistrobin, Bacillus firmus, cepa I-1582 de Bacillus firmus, Bacillus subtilis, cepa GB03 de Bacillus subtilis, cepa QST 713 de Bacillus subtilis, Bacillus pumulis, cepa GB34 de Bacillus pumulis. Inseticidas: Acetamiprid, Aldicarb, Azadiractin, Carbofuran, Clorantraniliprol (Rinaxipir), Clotianidin, Ciantraniliprol (Ciazipir), (beta-)Ciflutrin, gama-Cihalotrin, lambda- Cihalotrin, Cipermetrin, Deltametrin, Dimetoato, Dinetofuran, Etiprol, Flonicamid, Flubendiamida, Fluensulfona, Fluopiram,Flupiradifurona, tau-Fluvalinato, Imiciafos, Imidacloprid, Metaflumizona, Metiocarb, Pimetrozina, Pirifluquinazon, Spinetoram, Spinosad, Spirotetramato, Sulfoxaflor, Tiacloprid, Tiametoxam, 1-(3- cloropiridin-2-il)-N- [4-ciano-2-metil-6- (metilcarbamoil)fenil]-3-{ [5-(trifluorometil)-2H-tetrazol- 2-il]metil}-1H-pirazol-5-carboxamida, 1-(3-cloropiridin-2- il)-N- [4-ciano-2-metil-6-(metilcarbamoil)fenil]-3-{ [5- (trifluorometil)-1H-tetrazol-1-il]metil}-1H-pirazol-5- carboxamida, 1-{2-fluoro-4-metil-5- [(2,2,2- trifluoretil)sulfinil]fenil}-3-(trifluorometil)-1H-1,2,4- triazol-5-amina, (1E)-N- [(6-cloropiridin-3-il)metil]-N'- ciano-N-(2,2-difluoroetil)etanimidamida, Bacillus firmus, cepa I-1582 de Bacillus firmus, Bacillus subtilis, cepa GB03 de Bacillus subtilis, cepa QST 713 de Bacillus subtilis, Metarhizium anisopliae F52.

[0116] Sempre que se faça referência a uma "planta" ou "plantas" de acordo com a invenção, entende-se que também as partes da planta (células, tecidos ou órgãos, vagens de sementes, sementes, partes cortadas, como raízes, folhas, flores, pólen, etc.), progênie das plantas que retém as características distintivas dos pais, como semente obtida por autocruzamento ou cruzamento, por exemplo, uma semente híbrida (obtida cruzando duas linhas parentais endogâmicas), plantas híbridas e partes de plantas derivadas a partir delas são abrangidas no presente documento, a menos que seja indicado de outra forma.

[0117] Em algumas modalidades, as células vegetais da invenção, bem como as células vegetais geradas de acordo com os métodos da invenção, podem ser células que não se propagam.

[0118] Em algumas modalidades, como células vegetais da invenção, bem como células vegetais geradas de acordo com métodos de invenção, podem ser células que não se propagam. As plantas obtidas podem ainda ser usadas para criar material de propagação. As plantas de acordo com a invenção podem ser usadas para produzir gametas, sementes (incluindo sementes trituradas e bolos de semente), óleo de semente, fibras, fios, embriões, seja zigóticos ou somáticos, progênies ou híbridos de plantas obtidos por métodos da invenção. As sementes obtidas das plantas de acordo com a invenção também são abrangidas pela invenção.

[0119] "Criação de material de propagação", conforme usado no presente documento, se refere a qualquer meio conhecido na técnica para produzir outras plantas, partes de plantas ou sementes e inclui, entre outros, métodos de reprodução vegetativa (por exemplo, camadas de ar ou solo, divisão, enxerto de brotos, micropropagação, estolhos ou trepadeiras, órgãos de armazenamento como bulbos, cormos, tubérculos e rizomas, golpeando ou cortando, mensuração gemelar), reprodução sexual (cruzamento com outra planta) e reprodução assexuada (por exemplo, apomixia, hibridização somática).

Métodos e usos

[0120] Contudo, outras modalidades fornecem um método de produção de uma planta transgênica que compreende os passos de (a) introdução ou fornecimento de qualquer dos genes recombinantes de acordo com a invenção a uma célula vegetal para criar células transgênicas; e (b) regenerar plantas transgênicas da dita célula transgênica.

[0121] "Introduzir" em conjunto com o presente pedido se refere à colocação de informações genéticas em uma célula vegetal ou planta por meios artificiais. Isto pode ser efetuado por qualquer método conhecido na técnica para a introdução de RNA ou DNA em células vegetais, protoplastos, calos, raízes, tubérculos, sementes, hastes, folhas, mudas, embriões, pólen e microsporos, outros tecidos vegetais ou plantas inteiras. A "introdução" também compreende a integração estável ao genoma da planta. A introdução do gene recombinante pode ser realizada por transformação ou por cruzamento com uma planta obtida por transformação ou seu descendente (também conhecido como "introgressão").

[0122] O termo "fornecer" pode se referir à introdução de uma molécula de DNA exógeno a uma célula vegetal por transformação, seguida, opcionalmente, da regeneração de uma planta a partir da célula vegetal transformada. O termo também pode se referir à introdução da molécula de DNA recombinante por cruzamento de uma planta transgênica que compreende a molécula de DNA recombinante com outra planta e selecionar plantas de progenitura que herdaram a molécula de DNA recombinante ou transgene. Ainda outro significado alternativo de fornecer se refere à introdução da molécula de DNA recombinante por técnicas tais como a fusão de protoplastos, seguido opcionalmente pela regeneração de uma planta dos protoplastos fusionados.

[0123] O gene recombinante pode ser introduzido em uma célula vegetal por métodos bem conhecidos na técnica.

[0124] O termo "transformação"se refere no presente documento à introdução (ou transferência) de ácido nucleico para um hospedeiro receptor, tal como uma planta ou qualquer parte ou tecido de planta, incluindo células de plantas, protoplastos, calos, raízes, tubérculos, sementes, hastes, folhas, fibras, mudas, embriões e pólen. As plantas contendo a sequência de ácido nucleico transformado são referidas como "plantas transgênicas". Transformados, transgênicos e recombinantes se referem a um organismo hospedeiro tal como uma planta na qual uma molécula de ácido nucleico heteróloga (por exemplo, um cassete de expressão ou um vector recombinante) foi introduzida. O ácido nucleico pode ser integrado de forma estável ao genoma da planta.

[0125] Conforme usado no presente documento, a expressão "planta transgênica"se refere a uma planta que tem um ácido nucleico integrado de forma estável a um genoma da planta, por exemplo, os genomas nucleares ou plastídeos. Em outras palavras, as plantas que contêm a sequência de ácido nucleico transformado são referidas como "plantas transgênicas"e incluem plantas obtidas diretamente da transformação e seus descendentes (gerações Tx). Transgênico e recombinante se referem a um organismo hospedeiro tal como uma planta na qual uma molécula de ácido nucleico heteróloga (por exemplo, o promotor, o gene recombinante ou o vector tal como descrito no presente documento) foi introduzida. O ácido nucleico pode ser integrado de forma estável ao genoma da planta.

[0126] Será claro que os métodos de transformação usados são de menor relevância para a presente invenção. A transformação de plantas é agora uma técnica de rotina. Vantajosamente, qualquer um dos vários métodos de transformação pode ser usado para introduzir o ácido nucleico/gene de interesse em uma célula ancestrais adequada. Os métodos de transformação incluem o uso de lipossomas, eletroporação, produtos químicos que aumentam a absorção de DNA livre, a injeção do DNA diretamente na planta, bombardeio de pistola de partículas, transformação usando vírus ou pólen e microprojeção. Os métodos podem ser selecionados do método de cálcio/polietileno glicol para protoplastos (Krens et al. (1982) Nature 296: 72-74; Negrutiu et al. (1987) Plant. Mol. Biol. 8: 363-373); eletroporação de protoplastos (Shillito et al. (1985) Bio/Technol. 3: 1099-1102); microinjeção em material vegetal (Crossway et al. (1986) Mol. Gen. Genet. 202: 179 185); bombardeamento de partículas revestidas com DNA ou RNA (Klein et al. (1987) Nature 327: 70) infecção com vírus (não integrativos) e similares.

[0127] Os métodos para transformar plantas de algodão também são bem conhecidos na técnica. A transformação de algodão mediada por Agrobacterium foi descrita, por exemplo, na patente US 5.004.863 ou na patente US 6.483.013 e a transformação de algodão por bombardeamento de partículas é relatada, por exemplo, no documento WO 92/15675. Outros processos de transformação de algodão adequados são divulgados, por exemplo, nos documentos WO 00071733 e US 5.159.135, cujas divulgações são incorporadas por referência no presente documento como se fossem expostas completamente. Métodos para transformar soja são descritos, por exemplo, no documento WO2014/150449.

[0128] Podem ser estabelecidos diferentes sistemas de transformação para vários cereais: a eletroporação de tecido, a transformação de protoplastos e a transferência de DNA por bombardeamento de partículas em tecidos e células regeneráveis (para uma visão geral, consulte Jane, Euphytica 85 (1995), 35-44). A transformação do trigo foi descrita várias vezes na literatura (para uma visão geral, consulte Maheshwari, Critical Reviews in Plant Science 14 (2) (1995), 149-178, Nehra et al., Plant J. 5 (1994), 285297). Yuji Ishida et al. 2015, Methods in Molecular Biology, 1223: 189-198 descreve um método recente para obter plantas de trigo transgênicas.

[0129] As moléculas de DNA recombinantes de acordo com a invenção podem ser introduzidas em plantas de forma estável ou de maneira transitória usando métodos bem conhecidos na técnica. Os genes recombinantes podem ser introduzidos nas plantas, ou podem ser gerados dentro da célula da planta como descrito, por exemplo, no documento EP 1339859.

[0130] Além disso, são fornecidos métodos de efetuação de expressão preferencial em raiz, induzível por estresse e induzida por estresse preferencial em raiz, de um ácido nucleico que compreende a introdução de um gene recombinante de acordo com a invenção que compreende uma atividade de promotor preferencial em raiz, induzível por estresse ou induzido por estresse preferencial em raiz promotor no genoma de uma planta, ou fornecer a planta de acordo com a invenção. Também é fornecido um método para alterar a tolerância ao estresse biótico ou abiótico, a arquitetura de raiz, a eficiência do uso de nutrientes, a resistência aos nematódeos ou o rendimento de uma planta, incluindo a introdução do gene recombinante de acordo com a invenção no genoma de uma planta, ou fornecer a planta de acordo com a invenção. Em outra modalidade, a dita planta é uma planta de algodão, soja ou trigo.

[0131] Também é fornecido o uso do ácido nucleico isolado de acordo com a invenção para regular a expressão de um ácido nucleico operacionalmente ligado em uma planta e o uso do ácido nucleico isolado de acordo com a invenção, ou o gene recombinante que compreende o ácido nucleico tendo atividade de promotor preferencial em raiz, induzida por estresse e induzida por estresse preferencial em raiz para alterar a tolerância ao estresse biótico ou abiótico, arquitetura radicular, eficiência de uso de nutrientes ou rendimento em uma planta. Em uma modalidade adicional, a dita planta é uma planta de algodão, soja ou trigo. Também é fornecido o uso do ácido nucleico isolado de acordo com a invenção para identificar outros ácidos nucleicos compreendendo atividade de promotor preferencial em raiz, induzível por estresse ou induzida por estresse preferencial em raiz.

[0132] Ainda outra modalidade fornece um método de produzir alimentos, ração ou um produto industrial que compreende (a) obter a planta ou uma parte dela, de acordo com a invenção; e (b) preparar o alimento, ração ou produto industrial da planta ou parte do mesmo. Em outra modalidade, o dito alimento ou alimento é óleo, farinha, sementes moídas ou trituradas, flocos de soja, grãos, amido, farinha ou proteína, ou o dito produto industrial é biocombustível, fibra, produtos químicos industriais, um produto farmacêutico ou nutracêutico. Esses alimentos, rações ou produtos industriais contêm o promotor preferencial em raiz, induzível pelo stress e induzido por estresse preferencial em raiz descrito no presente documento.

[0133] Em outra modalidade, a invenção fornece um método para aumentar o rendimento, como rendimento de fibras e rendimento de sementes, de uma planta, como uma planta de algodão, soja e trigo, em comparação com uma planta de controle sob condição de estresse compreendendo (a) fornecer a células da dita planta um gene recombinante que compreende (i) um promotor expressável em planta heteróloga, (ii) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína de Anexina (iii) opcionalmente, uma sequência de terminação e poliadenilação de transcrição, de preferência, uma região de terminação e poliadenilação e de transcrição funcional em plantas, e (b) regenerar a dita planta.

[0134] Em modalidades adicionais, o estresse é como um estresse por seca, ocorrendo durante o estágio reprodutivo da planta, em plantas cultivadas no campo.

[0135] A presente invenção fornece um método para aumentar o rendimento de fiapo e um método para aumentar o rendimento de semente. Em uma modalidade adicional, o rendimento aumentado em comparação com uma planta de controle é pelo menos 5 %.

[0136] "Planta de controle", conforme usado no presente documento, se refere a uma planta que se parece geneticamente com a planta testada, mas que não transporta o gene recombinante, como plantas de tipo selvagem ou plantas segregantes nulas.

[0137] Além disso, espera-se que o método divulgado produza resultados semelhantes em outras espécies de plantas. Particularmente, espera-se que aumente o rendimento em milho sob o estresse por seca em condições de campo. Isso também pode levar a um aumento de rendimento em Brassica napus sob condições de estresse no campo.

[0138] De acordo com a presente invenção, o método forneceu um rendimento mais consistentemente aumentado quando o dito promotor expressável em planta é um promotor preferencial em raiz, induzível por estresse ou induzido por estresse preferencial em raiz, preferencialmente o promotor Pbtg-26GhD10, comparado a quanto o dito promotor expressável em planta é um promotor constitutivo, preferencialmente o promotor CaMV35S.

[0139] A expressão "aumento mais consistente do rendimento", como usado neste pedido, significa que uma proporção maior das plantas obtidas exibe o aumento do rendimento ao usar o promotor preferencial em raiz, induzível por estresse ou induzido por estresse preferencial em raiz em comparação com a proporção de plantas exibindo um rendimento aumentado ao usar um promotor constitutivo. Por exemplo, a proporção pode ser aumentada em pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos 90 % ou mesmo 100 %.

[0140] Além disso, espera-se que o método divulgado produza resultados semelhantes em outras espécies de plantas. Particularmente, espera-se que aumente mais consistentemente o rendimento em milho sob o estresse por seca em condições de campo. Isso também pode levar a um aumento mais consistente de rendimento em Brassica napus sob condições de estresse no campo.

[0141] As células e plantas de plantas transformadas obtidas pelos métodos descritos no presente documento podem ser adicionalmente usadas em procedimentos de reprodução bem conhecidos na técnica, como cruzamento, autocruzamento e retrocruzamento. Os programas de reprodução podem envolver o cruzamento para gerar uma geração de F1 (primeiro filial), seguida de várias gerações de autocruzamento (gerando F2, F3, etc.). O programa de reprodução também pode envolver etapas de retrocruzamento (BC), em que a prole é retrocruzada com uma das linhas parentais, denominada pai recorrente.

[0142] Consequentemente, também é revelado no presente documento um método para a produção de plantas que compreendem o gene recombinante revelado no presente documento compreendendo a etapa de cruzar a planta descrita no presente documento com outra planta ou com ela própria e selecionar a prole incluindo o dito gene recombinante.

[0143] As células e plantas de plantas transformadas obtidas pelos métodos descritos no presente documento podem também ser adicionalmente usadas em procedimentos de transformação subsequentes, por exemplo, para introduzir um gene recombinante adicional.

Definições de estresse e rendimento

[0144] O rendimento, conforme usado no presente documento, pode compreender o rendimento da planta ou parte da planta que é colhida, como fiapos, biomassa ou semente, incluindo o teor de óleo de semente, o peso da semente, o número de sementes. O rendimento aumentado pode aumentar o rendimento por planta, e o rendimento aumentado por unidade de superfície da terra cultivada, como rendimento por hectare. O rendimento pode ser aumentado através da modulação, por exemplo, da absorção de água nas raízes, ou indiretamente, aumentando a tolerância às condições biológicas e abióticas de estresse.

[0145] "Estresse" se refere a condições ambientais não ideais, como estresse biótico e estresse abiótico.

[0146] A tolerância ao estresse abiótico, conforme usado no presente documento, pode compreender a resistência a fatores de estresse ambiental tais como a seca, inundação, temperaturas extremas (altas ou baixas), salinidade do solo ou metais pesados, hipoxia, anoxia, estresse osmótico, estresse oxidativo, baixos níveis de nutrientes, como nitrogênio ou fósforo.

[0147] A tolerância ao estresse biótico tal como usado no presente documento pode compreender resistência à praga, como resistência ou patógenos fúngicos, bacterianos, bacterianos ou virais ou nematódeos ou insetos.

[0148] A seca utilizada no presente pedido se refere à escassez ou à ausência de água disponível para uma planta por um tempo específico. Essa escassez ou ausência de água pode durar apenas alguns dias, como pelo menos ou até 2, pelo menos ou até 3, pelo menos ou até 4, pelo menos ou até 5, pelo menos ou até 6, pelo menos ou até 7, pelo menos ou até 8, pelo menos ou até 9, pelo menos ou até 10, pelo menos ou até 15 ou pelo menos ou até 20 dias. Pode também ser por um período mais longo, como pelo menos ou até 3 semanas, pelo menos ou até 4 semanas, pelo menos ou até 5 semanas, pelo menos ou até 6 semanas, pelo menos ou até 2 meses, pelo menos ou até 3 meses, pelo menos ou até 4 meses, pelo menos ou até 5 meses ou pelo menos ou até 6 meses. Em algumas partes do mundo, a seca pode durar mais de 6 meses, como 7, 8, 9, 10, 11, 12, 15, 18 ou 24 meses.

[0149] O estresse por seca pode ser aplicado à planta simplesmente privando-a ou reduzindo seu abastecimento de água, seja colocando-a em uma região exposta naturalmente à seca ou reduzindo o abastecimento de água no campo. Por exemplo, o abastecimento de água pode ser reduzido em pelo menos 10 %, pelo menos 20 %, pelo menos 30 %, pelo menos 40 %, pelo menos 50 %, pelo menos 60 %, pelo menos 70 %, pelo menos 80 %, pelo menos, pelo menos 90 % ou mesmo 100 % durante um tempo desejado que esteja dentro dos descritos acima em relação ao estresse por seca.

Definições gerais

[0150] "Ácido nucleico isolado", usado de forma intercambiável com "DNA isolado", conforme usado no presente documento, se refere a um ácido nucleico que não ocorre no seu contexto genômico natural, independentemente do seu comprimento e sequência. O DNA isolado pode, por exemplo, se referir ao DNA que é fisicamente separado do contexto genômico, como um fragmento de DNA genômico. O DNA isolado também pode ser um DNA produzido artificialmente, como um DNA sintetizado quimicamente, ou como o DNA produzido através de reações de amplificação, como reação em cadeia da polimerase (PCR) bem conhecida na técnica. O DNA isolado pode ainda se referir ao DNA presente em um contexto de DNA em que não ocorre naturalmente. Por exemplo, o DNA isolado pode se referir a um pedaço de DNA presente em um plasmídeo. Além disso, o DNA isolado pode se referir a um pedaço de DNA presente em outro contexto cromossômico do que o contexto em que ocorre naturalmente, como, por exemplo, em outra posição no genoma além da posição natural, no genoma de outra espécie além da espécie em que ocorre naturalmente, ou em um cromossomo artificial.

[0151] A hibridação ocorre quando as duas moléculas de ácido nucleico se revinem entre si em condições apropriadas. A hibridação de ácido nucleico é uma técnica bem conhecida dos versados na técnica de manipulação de DNA. A propriedade de hibridação de um dado par de ácidos nucleicos é uma indicação de sua similaridade ou identidade. Outra indicação de que duas sequências de ácido nucleico são substancialmente idênticas é que as duas moléculas se hibridizam entre si em condições estringentes. A expressão "hibridizar especificamente para" se refere à ligação, duplexação ou hibridização de uma molécula apenas para uma sequência de nucleotídeos particular sob condições estringentes quando essa sequência está presente em um DNA ou RNA de mistura complexa (por exemplo, celular total). "Ligar(em)-se substancialmente" se refere a hibridização complementar entre um ácido nucleico de sonda e um ácido nucleico alvo e abrange pequenos desajustes que podem ser acomodados reduzindo a rigidez do meio de hibridização para atingir a detecção desejada da sequência de ácido nucleico alvo. "Condições de hibridização estringentes" e "condições de lavagem de hibridização estringentes" no contexto de experimentos de hibridização de ácido nucleico, como a hibridização do Sul e do Norte são dependentes da sequência e são diferentes em diferentes parâmetros ambientais. Um exemplo de condições de lavagem altamente estringentes é NaCl 0,15 M a 72 °C por cerca de 15 minutos. Um exemplo de condições de lavagem estringentes é uma lavagem de SSC 0,2 X a 65 °C durante 15 minutos. Também podem ser alcançadas condições estringentes com a adição de agentes desestabilizantes, tais como a formamida. Em geral, uma relação sinal-ruído de 2X (ou superior) do que aquela observada para uma sonda não relacionada no ensaio particular de hibridização indica a detecção de uma hibridização específica. Ácidos nucleicos que não hibridizam entre si sob condições estringentes ainda são substancialmente idênticas se as proteínas que as mesmas codificam são substancialmente idênticas. Isto ocorre, por exemplo, quando uma cópia de um ácido nucleico é criada usando a degeneração de códon máxima permitida pelo código genético.

[0152] As expressões "DNA", "sequência de DNA", "sequência de ácido nucleico", "molécula de ácido nucleico", "sequência de nucleotídeos"e "ácido nucleico" se referem a uma estrutura física que compreende uma disposição ordenada de nucleotídeos. A sequência de DNA ou a sequência de nucleotídeos podem estar contidas em uma molécula de nucleotídeo maior, vetor ou semelhante. Além disso, a disposição ordenada de ácidos nucleicos nestas sequências pode ser representada na forma de uma lista de sequências, figura, tabela, meio eletrônico ou similar.

[0153] Conforme usado no presente documento, "compreendendo" deve ser interpretado como especificando a presença dos recursos, números inteiros, etapas ou componentes declarados conforme referido, mas não impede a presença ou adição de um ou mais recursos, números inteiros, etapas ou componentes ou grupos do mesmo. Assim, por exemplo, um ácido nucleico ou proteína que compreende uma sequência de nucleotídeos ou aminoácidos, pode compreender mais nucleotídeos ou aminoácidos do que os citados de fato, isto é, ser incorporados em um ácido ou proteína nucleica maior. Um gene recombinante que compreende um ácido nucleico, que é funcional ou estruturalmente definido, pode compreender regiões de DNA adicionais, etc. No entanto, no contexto da presente divulgação, o termo "compreendendo"também inclui "constituído por".

[0154] A listagem de sequências contidas no arquivo nomeado „BCS15-2008WO_ST25.txt“, que tem 118 quilobytes (tamanho conforme medido no Microsoft Windows®), contém 31 sequências SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 31 é depositada por meio de envio eletrônico e é incorporado por referência no presente documento.

[0155] Na descrição e exemplos, é feita referência às seguintes sequências: LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS SEQ ID NO: 1 sequência de nucleotídeos do T-DNA Pbtg- 26Bn::GUS. SEQ ID NO: 2 sequência de nucleotídeos do iniciador KVA07- 32. SEQ ID NO: 3 sequência de nucleotídeos do iniciador KVA07- 34. SEQ ID NO: 4 sequência de nucleotídeos da variante de genoma A de btg-26Gh. SEQ ID NO: 5 sequência de nucleotídeos da variante de genoma D de btg-26Gh. SEQ ID NO: 6 sequência de nucleotídeos do promotor de cerca de 1 kb de comprimento da variante de genoma A de Pbtg-26Gh. SEQ ID NO: 7 sequência de nucleotídeos do promotor de cerca de 1 kb de comprimento da variante de genoma D de Pbtg-26Gh. SEQ ID NO: 8 sequência de nucleotídeos do T-DNA Pbtg- 26GhA0.6::GUS. SEQ ID NO: 9 sequência de nucleotídeos do T-DNA Pbtg- 26GhA10::GUS. SEQ ID NO: 10 sequência de nucleotídeos do T-DNA Pbtg- 26GhD0.6::GUS. SEQ ID NO: 11 sequência de nucleotídeos do T-DNA Pbtg- 26GhD10::GUS. SEQ ID NO: 12: sequência de nucleotídeos de AnnBj1. SEQ ID NO: 13: sequência de aminoácidos de AnnBj1. SEQ ID NO: 14: sequência de nucleotídeos de GhAnn1. SEQ ID NO: 15: sequência de aminoácidos de GhAnn1. SEQ ID NO: 16: sequência de nucleotídeos de AtAnn1. SEQ ID NO: 17: sequência de aminoácidos de AtAnn1. SEQ ID NO: 18: sequência de nucleotídeos do T-DNA P35S::AnnBj1. SEQ ID NO: 19: sequência de nucleotídeos do T-DNA Pbtg- 26GhD10::AnnBj1. SEQ ID NO: 20: qRT-PCR iniciador direto AnnBj1. SEQ ID NO: 21: qRT-PCR iniciador reverso AnnBj1. SEQ ID NO: 22: qRT-PCR iniciador direto PP2A. SEQ ID NO: 23: qRT-PCR iniciador reverso PP2A. SEQ ID NO: 24: sequência de nucleotídeos de Axmi196. SEQ ID NO: 25: sequência de aminoácidos de Axmi196. SEQ ID NO: 26: sequência de nucleotídeos de Axmi031. SEQ ID NO: 27: sequência de aminoácidos de Axmi031. SEQ ID NO: 28: sequência de nucleotídeos de Axmi277. SEQ ID NO: 29: sequência de aminoácidos de Axmi277. SEQ ID NO: 30: sequência de nucleotídeos de Axn-2. SEQ ID NO: 31: sequência de aminoácidos de Axn-2.

EXEMPLOS Exemplo 1 - Geração de construtos de expressão com o promotor Pbtg-26Bn de Brassica napus ligado operativamente ao gene repórter GUS (Pbtg-26Bn::GUS)

[0156] A sequência promotora do promotor btg-26 de Brassica napus (número de acessão EMBL S77096, posição 5' a 3’ 4474 a 4148 da SEQ ID NO:1), o gene GUS (ß-glucuronidase) com íntron (posição 5' a 3’ 4101 a 2101 da SEQ ID NO: 1) e um fragmento da região não traduzida 3’ (UTR) do gene CaMV 35S (posição 5' a 3’ 2031 a 1827 da SEQ ID NO: 1) foram montados em um vetor que contém o cassete de marcador selecionável por barra (posição 1720 a 56 da SEQ ID NO: 1) para resultar no Pbtg-26Bn::GUS de T-DNA (SEQ ID NO: 1).

Exemplo 2 - Geração de plantas transgênicas que compreendem Pbtg-26Bn::GUS

[0157] Em uma etapa seguinte, o vetor recombinante compreendendo o cassete de expressão do exemplo 1, isto é, iPbtg-26Bn::GUS, foi usado para transformar de forma estável Coker 312 de Gossypium hirsutum usando o protocolo de transformação de caule embriogênico.

Exemplo 3 - Padrão de expressão de Pbtg-26Bn::GUS em Gossypium hirsutum

[0158] A atividade de ß-glucuronidase de plantas transformadas com btg-26Bn::GUS foi monitorada in planta com o substrato cromogênico X-Gluc (ácido 5-bromo-4-cloro- 3-indolil-p-D-glucurônico) durante os ensaios de atividade correspondentes ( Jefferson RA et al (1987) EMBO J. 20;6(13):3901-7). Para a determinação da atividade de promotor, o tecido da planta foi dissecado, incorporado, manchado e analisado como descrito (por exemplo, Pien S. et al (2001) PNAS 98(20):11812-7). Assim, a atividade da beta-glucuronidase nas plantas transformadas foi testemunhada pela presença da cor azul devido ao metabolismo enzimático do substrato X-Gluc.

[0159] Depois de cultivar a progênie de plantas T0 independentes em condições de crescimento ideais, as plantas foram examinadas para a expressão de GUS. A partir dessas amostras de folhas de plantas do primeiro par de folhas, amostras de raiz e hastes foram retiradas e testadas para a expressão de genes-repórter GUS. (por exemplo, Pien S. et al (2001) PNAS 98(20):11812-7).

[0160] Surpreendentemente, o promotor de Brassica napus não conseguiu conferir a expressão preferencial em raiz em Gossypium hirsutum (consulte a Tabela 1 para o resultado) embora tenha sido demonstrado na técnica anterior que esse promotor manteve a sua atividade preferencial em raiz mesmo na espécie de cevada mais distante e, por conseguinte, sugeriu um alto grau de conservação em todas as dicotiledôneas e monocotiledôneas.

Exemplo 4 - Isolamento dos alelos específicos de subgenoma D e A de Gossypium hirsutum que codificam os genes ortólogos de btg-26 de Brassica napus

[0161] As sequências de codificação dos genes btg-26 de Brassica napus (número de acesso EMBL S77096), arroz (número de acesso EMBL AF32358) e Arabidopsis thaliana (At1g54100) foram usadas para pesquisar por blast em uma base de dados de sequência genômica de Gossypium hirsutum. Com base no resultado obtido, uma sonda de 656 pb foi amplificada usando o iniciador KVA07-32 (SEQ ID NO: 2) e KVA07-34 (SEQ ID NO: 3) para triar uma biblioteca BAC contendo clones de DNA genômico da variedade FiberMax de Gossypium hirsutum. A sequência de nucleotídeos de fragmentos genômicos para cada uma das variantes alélicas foi identificada e está representada na SEQ ID NO: 4 (genoma A) e SEQ ID NO: 5 (genoma D).

[0162] Para a variante do genoma A (SEQ ID NO: 4), uma caixa TATA poderia ser identificada nas posições 1986 a 1999; um sítio de iniciação da transcrição na posição 1219. O líder não traduzido 5’ se estende do nucleotídeo 1219 a 1483; o códon de iniciação de tradução está situado nas posições 1484 a 1486.

[0163] Para a variante do genoma D (SEQ ID NO: 5), uma caixa TATA poderia ser identificada nas posições 2789 a 2803; um sítio de iniciação da transcrição na posição 2822. O líder não traduzido 5’ se estende do nucleotídeo 2822 a 3089; o códon de iniciação de tradução está situado nas posições 3090 a 3092.

[0164] A Figura 1 mostra um alinhamento da sequência de nucleotídeos dos primeiros promotores A e D de cerca de 1 kb. Surpreendentemente, os dois fragmentos de promotor compartilham cerca de 78 % de identidade de sequência, enquanto os primeiros 600 pb são quase idênticos, compartilhando aproximadamente 94 % de identidade de sequência.

Exemplo 5 - Geração de construtos de expressão com os promotores Pbtg-26Gh de Gossypium hirsutum ligados operativamente ao gene repórter GUS (Pbtg-26GhA0.6::GUS, Pbtg-26GhA10::GUS, Pbtg-26GhD0.6::GUS, Pbtg-26GhD10::GUS)

[0165] A sequência curta promotora (cerca de 600 bp) do promotor btg-26 de Gossypium hirsutum do subgenoma A (Pbtg- 26GhA0.6, posição 5' a 3’ 4650 a 4086 da SEQ ID NO:8), o gene GUS com o íntron (posição 5' a 3’ 4082 a 2082 da SEQ ID NO: 8) e um fragmento da região não traduzida 3’ (UTR) do gene CaMV 35S (posição 5' a 3’ 2012 a 1808 da SEQ ID NO: 8) foram montados em um vetor que contém o cassete de marcador selecionável por barra (posição 1720 a 56 da SEQ ID NO: 8) para resultar no Pbtg- 26GhA0.6::GUS de T-DNA (SEQ ID NO: 8).

[0166] A sequência longa promotora (cerca de 1 kp) do promotor btg-26 de Gossypium hirsutum do subgenoma A (Pbtg- 26GhA10, posição 5' a 3’ 5094 a 4086 da SEQ ID NO:9), o gene GUS com o íntron (posição 5' a 3’ 4082 a 2082 da SEQ ID NO: 9) e um fragmento da região não traduzida 3’ (UTR) do gene CaMV 35S (posição 5' a 3’ 2012 a 1808 da SEQ ID NO: 9) foram montados em um vetor que contém o cassete de marcador selecionável por barra (posição 1720 a 56 da SEQ ID NO: 9) para resultar no Pbtg- 26GhA10::GUS de T-DNA (SEQ ID NO: 9).

[0167] A sequência curta promotora (cerca de 600 bp) do promotor btg-26 de Gossypium hirsutum do subgenoma D (Pbtg- 26GhD0.6, posição 5' a 3’ 4654 a 4083 da SEQ ID NO:10), o gene GUS com o íntron (posição 5' a 3’ 4082 a 2082 da SEQ ID NO: 10) e um fragmento da região não traduzida 3’ (UTR) do gene CaMV 35S (posição 5' a 3’ 2012 a 1808 da SEQ ID NO: 10) foram montados em um vetor que contém o cassete de marcador selecionável por barra (posição 1720 a 56 da SEQ ID NO: 10) para resultar no Pbtg- 26GhD0.6::GUS de T-DNA (SEQ ID NO: 10).

[0168] A sequência longa promotora (cerca de 1 kp) do promotor btg-26 de Gossypium hirsutum do subgenoma D (Pbtg- 26GhD10, posição 5' a 3’ 5104 a 4083 da SEQ ID NO:11), o gene GUS com o íntron (posição 5' a 3’ 4082 a 2082 da SEQ ID NO: 11) e um fragmento da região não traduzida 3’ (UTR) do gene CaMV 35S (posição 5' a 3’ 2012 a 1808 da SEQ ID NO: 11) foram montados em um vetor que contém o cassete de marcador selecionável por barra (posição 1720 a 56 da SEQ ID NO: 11) para resultar no Pbtg- 26GhD10::GUS de T-DNA (SEQ ID NO: 11).

Exemplo 6 - Geração de plantas transgênicas que compreendem cassetes de Pbtg-26Gh::GUS diferentes

[0169] Em uma próxima etapa, o vetor recombinante que compreende os cassetes de expressão do Exemplo 5, isto é, Pbtg-26GhA0.6::GUS, Pbtg-26GhA10::GUS, Pbtg-26GhD0.6::GUS e Pbtg-26GhD10::GUS, foram usados para transformar de maneira estável coker 312 de Gossypium hirsutum com o uso do protocolo de transformação de calo embriogênico.

[0170] O vetor recombinante que compreende o cassete de expressão Pbtg-26GhD10::GUS é usado para transforma de maneira estável trigo com o uso do método descrito em Yuji Ishida et al. 2015, Methods in Molecular Biology, 1223: 189-198.

[0171] O vetor recombinante que compreende o cassete de expressão Pbtg-26GhD10::GUS é usado para transformar de maneira estável soja com o uso do método descrito no Pedido de Patente n° WO2014/150449. Exemplo 7 - Padrão de expressão do Pbtg-26Gh::GUS diferente em Gossypium hirsutum

[0172] A atividade de ß-glucuronidase de plantas transformadas com Pbtg-26GhA0.6::GUS, Pbtg-26GhA10::GUS, Pbtg-26GhD0.6::GUS e Pbtg-26GhD10::GUS foi monitorada conforme descrito no Exemplo 3.

[0173] A Tabela 1 mostra o perfil médio de expressão de todos os eventos produzidos por construto nos tecidos selecionados (raízes, folhas e caules). A intensidade do manchamento foi quantificada em uma escala de 0 a 5, 0 correspondendo à ausência de manchamento.

[0174] Observou-se inesperadamente que apenas a versão longa do promotor pbtg-26D leva a uma expressão preferencial de GUS nas raízes. De fato, os fragmentos de promotor curto e longo do subgenoma A, bem como o fragmento de promotor curto do subgenoma D, geram níveis de expressão similares em todos os tecidos testados, com o promotor D curto e o promotor A longo conduzindo uma expressão ligeiramente inferior nas raízes. Tabela 1:

[0175] Pode ainda ser concluído a partir destes resultados que o fragmento de promotor mais curto de D não influencia a atividade preferencial em raiz do fragmento de promotor mais longo (SEQID NO: 7) e pode, por exemplo, ser substituído pela sequência do promotor A curto na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7 sem afetar sua atividade.

Exemplo 8 - análise de sequências do promotor Pbtg-26GhD10

[0176] A Figura 1 mostra a sequência de nucleotídeos dos promotores Pbtg-26 de Gossypium hirsutum anotados com os elementos CIS previstos relevantes para a expressão induzível por estresse, bem como a posição da caixa TATA e do sítio de iniciação da transcrição.

[0177] Quatro motivos do tipo responsivos a ABA (do tipo ABRE) poderiam ser previstos do promotor btg-26 do subgenoma D, mas esses motivos não são conservados na sequência promotora do subgenoma A. Esses motivos sugerem que apenas a sequência promotora do subgenoma D é capaz de responder ao estresse.

Exemplo 9 - indutibilidade ao estresse do gene de BTG-26D endógeno ao algodão

[0178] Plantas de Gossypium hirsutum da variedade Cocker foram cultivadas em uma câmara de crescimento e foram regadas até o estágio de desenvolvimento de 2 folhas. As amostras de folhas foram, então, coletadas em triplicado no último dia de rega (amostras de controle) e após 7 dias sem rega (amostras D7).

[0179] O RNA foi extraído usando o kit de extração de RNA da planta Sigma e analisado por sequenciamento. A Tabela 2 mostra os valores de expressão obtidos para o gene endógeno BTG-26D nas diferentes amostras. BTG-26D é significativamente induzido por estresse por seca e seu nível de expressão é cerca de 1,9 vez maior após 7 dias de seca do que na condição de controle. Conforme previsto, o promotor BTG26-D, portanto, possui atividade induzível por estresse, como demonstrado com a aplicação do estresse por seca. A funcionalidade dos elementos do tipo ABRE no promotor é, assim, confirmada. Tabela 2:

Exemplo 10 - Análise da atividade promotora do promotor Pbtg-26GhD10 em Soja e Trigo

[0180] A atividade de ß-glucuronidase de plantas de soja e trigo transformadas com Pbtg-26GhD10::GUS é monitorada como descrito no Exemplo 3.

[0181] Os resultados indicam que o promotor Pbtg-26GhD10 tem atividade promotora preferencial em raiz na soja. Os mesmos também indicam que o promotor tem atividade promotora induzível por estresse na soja. Além disso, o promotor tem atividade promotora induzida por estresse preferencial em raiz na soja.

[0182] Os resultados indicam que o promotor Pbtg-26GhD10 tem atividade promotora preferencial em raiz no trigo. Os mesmos também indicam que o promotor tem atividade promotora induzível por estresse no trigo. Além disso, o promotor tem atividade promotora induzida por estresse preferencial em raiz no trigo. Exemplo 11 - Construção de um gene recombinante que codifica uma Anexina para expressão preferencial em raiz e expressão constitutiva em células de algodão

[0183] Uma molécula de DNA que tem a sequência de ácidos nucleicos de acordo com a SEQ ID NO: 12 foi sintetizada por Entelechon GmbH.

[0184] Usando técnicas padrão de DNA recombinante, a região promotora constitutiva CaMV 35S de acordo com a sequência da posição nucleotídica 89 a 506 de SEQ ID NO: 18, a sequência de 5’UTR incluindo a sequência de iniciação do gene de proteína de ligação a/b de clorofila de híbrido de Petúnia de acordo com a sequência da posição nucleotídica 511 a 568 da SEQ ID NO: 18, o fragmentos de DNA que codifica AnnBj1 de acordo com a sequência SEQ ID NO: 12 ou com a sequência da posição nucleotídica 577 a 1530 da SEQ ID NO: 18, e a sequência não traduzida 3' do gene de histona H4 de Arabidopsis thaliana de acordo com a sequência da posição nucleotídica 1542 a 2202 da SEQ ID NO: 18) foram montados em um vetor que contém o cassete de marcador selecionável por 2mepsps (posição 2252 a 6080 da SEQ ID NO: 18) para resultar no T-DNA P35S::AnnBj1 (SEQ ID NO: 18).

[0185] Usando técnicas padrão de DNA recombinante, a região promotora preferencial em raiz Pbtg-26GhD10 de acordo com a sequência da posição nucleotídica 89 a 1107 de SEQ ID NO: 19, o fragmentos de DNA que codifica AnnBj1 de acordo com a sequência SEQ ID NO: 12 ou com a sequência da posição nucleotídica 1111 a 2064 da SEQ ID NO: 19, e a sequência não traduzida 3' do gene de histona H4 de Arabidopsis thaliana de acordo com a sequência da posição nucleotídica 2076 a 2736 da SEQ ID NO: 19) foram montados em um vetor que contém o cassete de marcador selecionável por 2mepsps (posição 2786 a 6614 da SEQ ID NO: 19) para resultar no Pbtg-26GhD10::AnnBj1 de T-DNA (SEQ ID NO: 19).

Exemplo 12 - Geração de plantas de algodão transgênico expressando AnnBj1

[0186] Os vetores de T-DNA do Exemplo 11 foram introduzidos em cepas de Agrobacterium tumefaciens contendo um plasmídeo Ti auxiliador e usados na transformação de algodão essencialmente como descrito no documento WO00/71733. As plantas homozigotas e seus segregantes nulos foram analisadas adicionalmente como descrito nos seguintes Exemplos.

Exemplo 13 - Avaliação de rendimento de fiapo e semente de plantas de algodão transgênico expressando AnnBj1 em teste de campo

[0187] Testes de campo foram realizados nos Estados Unidos em 12 eventos da transformação com o Pbtg- 26GhD10::AnnBj1 de e 15 eventos da transformação com o P35S::AnnBj1 de T-DNA usando um projeto de trama dividida com 3 blocos. Os eventos foram alocados em todo o gráfico dentro de um bloco e a zigosidade (Homozigoto e Nulo) foi alocada no sub-bloco em todo o gráfico.

[0188] O tratamento de irrigação deficiente foi aplicado a partir do estágio de quadrado. Foram aplicados insumos agronômicos típicos para algodão convencionalmente cultivado para a área, seguindo as melhores práticas agronômicas locais.

[0189] Os parâmetros obtidos foram o rendimento de fiapos e o rendimento do algodão de sementes. Os dados obtidos foram analisados usando modelo misto linear e software AsREML (Gilmour et al. 1999). A parte fixa do modelo consiste no efeito principal do evento, efeito principal da zigosidade e sua interação. Os termos aleatórios do modelo foram bloco, todo o gráfico e efeitos de sub-bloco para ajustar a heterogeneidade de campo.

[0190] Sob condições de controle, não foi observado nenhum rendimento de semente nem rendimento de fiapos para os eventos testados. No entanto, sob o estresse da seca, a expressão de AnnBj1 conduz a um rendimento aumentado de fiabilidade e/ou semente. Os resultados para a condição de seca são mostrados na Tabela 3.

[0191] Dos 12 eventos testados para Pbtg-26GhD10::AnnBj1, 9 têm um rendimento aumentado de sementes em comparação com seu segregador nulo de pelo menos 5 %, o que significa que três quartos dos eventos produzidos exibem o efeito positivo do transgene. Em comparação, dos 15 eventos de P35S::AnnBj1, apenas 8 têm um rendimento aumentado de pelo menos 5 % em comparação com seu segregador nulo, o que significa que metade dos eventos produzidos exibe o efeito positivo do transgene. A expressão do gene AnnBj1 sob o controle do promotor Pbtg-26GhD10 em oposição ao promotor constitutivo resulta, assim, na obtenção de 50 % mais eventos com um rendimento aumentado de semente de pelo menos 5 % comparado aos seus nulos.

[0192] Em relação ao rendimento de fiapos, 8 dos 12 eventos produzidos com a transformação com o Pbtg- 26GhD10::AnnBj1 de T-DNA têm um aumento de pelo menos 5 % em relação aos seus nulos, ou seja, três quartos dos eventos exibem o efeito positivo do transgene. Em contrapartida, apenas 7 dos 15 eventos testados da transformação com o 35S::AnnBj1 de T-DNA têm um aumento do rendimento de pelo menos 5 % em relação aos seus nulos, ou seja, metade dos eventos exibem o efeito positivo do transgene. A expressão do gene AnnBj1 sob o controle do promotor Pbtg-26GhD10 em oposição ao promotor constitutivo resulta, assim, na obtenção de 50 % mais eventos com um rendimento aumentado de semente de pelo menos 5 % comparado aos seus nulos.

[0193] Em conclusão, a expressão constitutiva de AnnBj1 em algodão resulta em um aumento tanto no rendimento de sementes como no rendimento de fiapos de pelo menos 5 % em relação aos segregadores nulos respectivos. Em conclusão, a expressão preferencial em raiz induzida por estresse de AnnBj1 em algodão resulta em um aumento tanto no rendimento de sementes como no rendimento de fiapos de pelo menos 5 % em relação aos segregadores nulos respectivos. Além disso, ao usar o promotor preferencial em raiz Pbtg-26GhD10 em algodão, o efeito da superexpressão de AnnBj1 é mais penetrante com mais eventos exibindo o rendimento aprimorado em comparação com o uso do promotor constitutivo 35S sob condições de seca no campo. Tabela 3: % de aumento de rendimento de homozigoto em relação a seu respectivo segregador nulo - condição de estresse por seca.

Exemplo 14 - Avaliação de rendimento de semente e fiapos de plantas de algodão transgênico selecionadas do Exemplo 13 em teste de campo

[0194] Testes de campo foram novamente realizados em 6 eventos da transformação com o Pbtg-26GhD10::AnnBj1 de e 4 eventos da transformação com o P35S::AnnBj1 de T-DNA. Os eventos foram selecionados com base no seu desempenho no teste de campo anterior. O teste de campo foi projetado, executado e os resultados analisados conforme descrito no Exemplo 13.

[0195] Sob condições de controle, não foi observada penalidade de rendimento significativa para os eventos testados. No entanto, sob o estresse da seca, a expressão de AnnBj1 leva a um rendimento aumentado de fiapos em comparação com as plantas Coker do tipo selvagem. Os resultados para a condição de seca são mostrados na Tabela 4. Tabela 4: % de aumento de rendimento de fiapos de homozigoto em relação a Coker do tipo selvagem - condição de estresse por seca. O resultado do teste de campo do primeiro ano é adicionado como referência.

Exemplo 15 - Atividade de promotor preferencial em raiz induzida por estresse do promotor Pbtg-26GhD10 em algodão

[0196] Para confirmar ainda mais o padrão de expressão conferido pelo promotor Pbtg-26GhD10, as sementes de algodão de 8 eventos contendo transgente Pbtg- 26GhD10::AnnBj1 e sementes de algodão transgênico do tipo selvagem foram esterilizadas na superfície, semeadas e cultivadas in vitro, quer em meio de controle ou meio contendo 250 mM de manitol (ou seja, meio de estresse). O manitol é bem conhecido na técnica para imitar o estresse por seca. Os tecidos de raízes e folhas foram coletados, respectivamente, 16 e 27 dias após a semeadura das plantas cultivadas em meio de controle e meio de estresse.

[0197] O RNA dos tecidos de raiz e folhas amostrados foram extraídos utilizando o kit de RNA total da planta Spectrum da Sigma com o protocolo A. O gene PP2A foi usado como um gene de referência. A PCR Q-RT foi realizada e analisada usando o método descrito no manual de Applied Biosystems com os iniciadores SEQ ID NO: 20 e SEQ ID NO: 21 para o transcrito AnnBj1 e SEQ ID NO: 22 e SEQ ID NO: 23 para o transcrito PP2A. A Tabela 5 mostra os resultados obtidos. Tabela 5:

[0198] Embora o nível de expressão na folha não tenha sido aumentado pelo tratamento de estresse aplicado, a expressão na raiz é aumentada pelo menos 4 vezes na condição de estresse em comparação com a condição de controle. O promotor Pbtg-26GhD10 tem, portanto, sob alto estresse, uma atividade de promotor preferencial em raiz induzida por estresse.

[0199] Um experimento similar foi realizado com uma menor concentração de manitol (200 mM em vez de 250 mM) nos mesmos eventos. Os eventos que levaram duas cópias do transgene Pbtg-26GhD10::AnnBj1 também confirmaram a atividade de promotor preferencial em raiz induzido por estresse do promotor Pbtg-26GhD10 sob condição de estresse mais suave.

Exemplo 16 - Construção de um gene recombinante que codifica genes de resistência a nematódeo para expressão preferencial em raiz induzida por estresse em células de soja

[0200] Usando técnicas padrão de DNA recombinante, a região de promotor preferencial em raiz induzido por estresse Pbtg-26GhD10 como descrito acima, o fragmento de DNA que codifica Axmi196 de acordo com uma sequência SEQ ID NO: 24 são montados em um vetor que contém um cassete marcador selecionável para resultar no Pbtg- 26GhD10::Axmi196 de T-DNA.

[0201] A região de promotor preferencial em raiz induzido por estresse Pbtg-26GhD10 como descrito acima, o fragmento de DNA que codifica Axmi031 de acordo com uma sequência SEQ ID NO: 26 são montados em um vetor que contém um cassete marcador selecionável para resultar no Pbtg- 26GhD10::Axmi031 de T-DNA.

[0202] A região de promotor preferencial em raiz induzido por estresse Pbtg-26GhD10 como descrito acima, o fragmento de DNA que codifica Axmi277 de acordo com uma sequência SEQ ID NO: 28 são montados em um vetor que contém um cassete marcador selecionável para resultar no Pbtg- 26GhD10::Axmi277 de T-DNA.

[0203] A região de promotor preferencial em raiz induzido por estresse Pbtg-26GhD10 como descrito acima, o fragmento de DNA que codifica Axmi-2 de acordo com uma sequência SEQ ID NO: 30 são montados em um vetor que contém um cassete marcador selecionável para resultar no Pbtg- 26GhD10::Axmi-2 de T-DNA.

Exemplo 17 - Geração de plantas de soja transgênica expressando genes de resistência a nematódeo

[0204] Os vetores de T-DNA do Exemplo 16 são introduzidos em cepas de Agrobacterium tumefaciens contendo um plasmídeo Ti auxiliador e usados na transformação de soja essencialmente como descrito no pedido de patente WO2014/150449. As plantas homozigotas e seus segregantes nulos são analisadas adicionalmente como descrito nos seguintes Exemplos.

Exemplo 18 - Avaliação da resistência a nematódeo de plantas de soja transgênica expressando Axmi196, Axmi031, Axmi277 ou Axn-2 sob controle do promotor Pbtg-26GhD10

[0205] A resistência a nematódeo das plantas transgênicas foi avaliada de acordo com o método descrito nos documentos WO 2011/014749, WO 2007/147029, WO 2014/003769, WO 2010/077858.

[0206] Conclusão, o promotor Pbtg-26GhD10 pode ser usado na soja para conferir tolerância a estresse biótico, como resistência a nematódeo. Modalidades preferenciais são resumidas nos parágrafos a seguir: 1. Ácido nucleico isolado caracterizado por ter atividade de promotor preferencial em raiz, induzível por estresse ou induzida por estresse preferencial em raiz selecionado a partir do grupo consistindo em: a. um ácido nucleico compreendendo uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7 ou um fragmento funcional do mesmo compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7 da posição nucleotídica 351 para a posição nucleotídica 755; b. um ácido nucleico que compreende uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos cerca de 95 % de identidade de sequência com SEQ ID NO: 7, ou um fragmento funcional do mesmo; e c. o ácido nucleico de um promotor funcional capaz de hibridizar em condições estringentes para a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 7, ou um fragmento funcional do mesmo em que o dito fragmento funcional compreende pelo menos cerca de 400 nucleotídeos consecutivos a montante do início da transcrição da SEQ ID NO: 7. 2. Um gene recombinante que compreende o ácido nucleico de acordo com o parágrafo 1 ligado operativamente a uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um produto de expressão de interesse e, opcionalmente, uma sequência de terminação e de poliadenilação de transcrição, de preferência, uma região de terminação e poliadenilação de transcrição funcional em plantas. 3. O gene recombinante de acordo com o parágrafo 2, em que o produto de expressão de interesse é uma molécula de RNA capaz de modular a expressão de um gene ou é uma proteína. 4. Uma célula hospedeira compreendendo o ácido nucleico isolado de acordo com o parágrafo 1, ou o gene recombinante de acordo com o parágrafo 2 ou 3. 5. A célula hospedeira do parágrafo 4 que é uma célula de E. coli, uma célula de Agrobacterium, célula de levedura ou uma célula vegetal. 6. Uma planta compreendendo o gene recombinante do parágrafo 2 ou 3, de preferência, integrada de maneira estável ao genoma da dita planta. 7. Partes de planta e sementes obteníveis da planta de acordo com o parágrafo 6 que compreendem o gene recombinante de acordo com o parágrafo 2 ou 3. 8. A planta ou célula vegetal ou parte de planta ou semente de acordo com qualquer um dos parágrafos 5 a 7, que é uma planta de algodão, ou uma célula vegetal de algodão ou planta de algodão ou semente de algodão. 9. A planta ou célula vegetal ou parte de planta ou semente de acordo com qualquer um dos parágrafos 5 a 7, que é uma planta de soja, ou uma célula vegetal de soja ou uma parte de planta de soja ou semente de soja. 10. A planta ou célula vegetal ou parte de planta ou semente de acordo com qualquer um dos parágrafos 5 a 7, que é uma planta de trigo, ou uma célula vegetal de trigo ou parte de planta de trigo ou semente de trigo. 11. Método de produção de uma planta transgênica compreendendo as etapas de: a. introduzir ou fornecer o gene recombinante de acordo com o parágrafo 2 ou 3 para uma célula vegetal para criar células transgênicas; e b. regenerar as plantas transgênicas da dita célula transgênica. 12. Método de efetuação de expressão preferencial em raiz de um ácido nucleico compreendendo introduzir o gene recombinante de acordo com o parágrafo 2 ou 3 no genoma de uma planta, ou fornecer a planta de acordo com o parágrafo 6. 13. Método de efetuação de expressão induzível por estresse de um ácido nucleico compreendendo introduzir o gene recombinante de acordo com o parágrafo 2 ou 3 no genoma de uma planta, ou fornecer a planta de acordo com o parágrafo 6. 14. Método de efetuação de expressão induzida por estresse de um ácido nucleico preferencialmente nas raízes compreendendo introduzir o gene recombinante de acordo com o parágrafo 2 ou 3 no genoma de uma planta, ou fornecer a planta de acordo com o parágrafo 6. 15. Método para alterar tolerância ao estresse biótico ou abiótico, arquitetura de raiz, eficiência no uso de nutriente, ou rendimento de uma planta, em que o dito método compreende introduzir o gene recombinante de acordo com o parágrafo 2 ou 3 no genoma de uma planta, ou fornecer a planta de acordo com o parágrafo 6. 16. Uso do ácido nucleico isolado de acordo com o parágrafo 1 para regular a expressão de um ácido nucleico ligado operativamente em uma planta. 17. Uso do ácido nucleico isolado de acordo com o parágrafo 1, ou do gene recombinante de acordo com o parágrafo 2 ou 3 para alterar a tolerância ao estresse biótico ou abiótico, arquitetura de raiz, eficiência no uso de nutriente, ou rendimento em uma planta. 18. Uso do ácido nucleico isolado de acordo com o parágrafo 1 para identificar outros ácidos nucleicos compreendendo atividade de promotor preferencial em raiz. 19. Uso do ácido nucleico isolado de acordo com o parágrafo 1 para identificar outros ácidos nucleicos compreendendo atividade de promotor induzível por estresse. 20. Uso do ácido nucleico isolado de acordo com o parágrafo 1 para identificar outros ácidos nucleicos compreendendo atividade de promotor preferencial em raiz induzida por estresse. 21. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 15, ou o uso de acordo com o parágrafo 17 a 19, em que a dita planta é uma planta de algodão. 22. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 15, ou o uso de acordo com o parágrafo 17 a 19, em que a dita planta é uma planta de soja. 23. O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 11 a 15, ou o uso de acordo com o parágrafo 17 a 19, em que a dita planta é uma planta de trigo. 24. Um método de produção de alimento, ração ou um produto industrial compreendendo a) obter a planta ou uma parte da mesma, de qualquer um dos parágrafos 6 a 10; e b) ) preparar o alimento, ração ou produto industrial da planta ou parte do mesmo. 25. O método do parágrafo 24 em que a) o alimento ou ração é óleo, farelo, grão, amido, farinha ou proteína; ou b) o produto industrial é biocombustível, fibra, produtos químicos industriais, um produto farmacêutico ou nutracêutico. 26. Um gene recombinante compreendendo: (a) um promotor expressável em planta selecionado de i. promotor preferencial em raiz; ii. promotor induzível por estresse; ou iii. promotor preferencial em raiz induzido por estresse; (b) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína Anexina; (c) e, opcionalmente, uma sequência de terminação e poliadenilação de transcrição, de preferência, uma região de terminação e poliadenilação de transcrição funcional em plantas; 27. O gene recombinante do parágrafo 26, em que o dito promotor expressável em planta é o promotor Pbtg-26GhD10. 28. O gene recombinante do parágrafo 26 ou 27, em que o dito ácido nucleico que codifica uma proteína Anexina compreende: a. uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14; b. uma sequência de nucleotídeos pelo menos 80 % idêntica a SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14; c. uma sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico capaz de hibridizar sob condições estringentes para a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14; d. uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15; e. uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos tendo 80 % de identidade com SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15; f. uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína que compreende quatro ou mais domínios repetidos de anexina. 29. Um método para aumentar o rendimento de uma planta sob condição de estresse compreendendo: a. fornecer para células da dita planta um gene recombinante compreendendo: i. um promotor heterólogo expressável em planta; ii. uma sequência de ácido nucleico que codifica uma proteína Anexina; iii. e, opcionalmente, uma sequência de terminação e poliadenilação de transcrição, de preferência, uma região de terminação e poliadenilação de transcrição funcional em plantas; b. regenerar a dita planta; em que o aumento no rendimento é comprado ao rendimento em uma planta de controle. 30. O método do parágrafo 29, em que o dito promotor expressável em planta é selecionado do grupo consistindo em: a. um promotor preferencial em raiz; b. um promotor induzível por estresse; e c.um promotor preferencial em raiz induzido por estresse. 31. O método do parágrafo 29 ou 30, em que o dito promotor expressável em planta é o promotor Pbtg-26GhD10. 32. O método do parágrafo 29, em que o dito promotor expressável em planta é um promotor constitutivo. 33. O método do parágrafo 29 ou 32, em que o dito promotor expressável em planta é o promotor CaMV35S. 34. O método de qualquer um dos parágrafos 29 a 33, em que o dito ácido nucleico que codifica uma proteína Anexina compreende: a. uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14; b. uma sequência de nucleotídeos pelo menos 80 % idêntica a SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14; c. uma sequência de nucleotídeos de um ácido nucleico capaz de hibridizar sob condições estringentes para a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 12 ou SEQ ID NO: 14; d. uma sequência de nucleotídeos que codifica a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15; e. uma sequência de nucleotídeos que codifica uma sequência de aminoácidos tendo 80 % de identidade com SEQ ID NO: 13 ou SEQ ID NO: 15; f. uma sequência de nucleotídeos que codifica uma proteína que compreende quatro ou mais domínios repetidos de anexina. 35. O método de qualquer um dos parágrafos 29 a 34, em que a dita planta é algodão. 36. O método de qualquer um dos parágrafos 29 a 34, em que a dita planta é soja. 37. O método de qualquer um dos parágrafos 29 a 34, em que a dita planta é trigo. 38. O método de qualquer um dos parágrafos 29 a 37, em que a dita condição de estresse é condição de seca. 39. O método de qualquer um dos parágrafos 29 a 37, em que a dita condição de estresse está ocorrendo durante o estágio reprodutivo da planta. 40. O método de qualquer um dos parágrafos 29 a 37, em que a dita condição de estresse está ocorrendo em plantas cultivadas em campo. 41. O método de qualquer um dos parágrafos 29 a 35, em que a dita planta é algodão e o dito rendimento é rendimento de fiapos. 42. O método de qualquer um dos parágrafos 29 a 37, em que o dito rendimento é rendimento de semente. 43. O método de qualquer um dos parágrafos 29 a 42, em que o dito rendimento é aumentando em pelo menos 5 %. 44. O método do parágrafo 43, em que o dito aumento de rendimento é obtido de maneira mais consistente com o método dos parágrafos 30 ou 31 em comparação com o método dos parágrafos 32 ou 33. 45. Uma célula vegetal compreendendo um gene recombinante conforme definido em qualquer um dos parágrafos 26 a 28. 46. Uma planta consistindo essencialmente nas células vegetais do parágrafo 45. 47. Partes de planta ou sementes obteníveis da planta de acordo com o parágrafo 46. 48. A planta, célula vegetal, parte de planta ou semente de acordo com qualquer um dos parágrafos 45 a 47, que é uma planta de algodão, uma célula vegetal de algodão, parte de planta de algodão ou semente de algodão. 49. A planta, célula vegetal, parte de planta ou semente de acordo com qualquer um dos parágrafos 45 a 47, que é uma planta de soja, ou uma célula vegetal de soja, uma parte de planta de soja ou semente de soja. 50. A planta, célula vegetal, parte de planta ou semente de acordo com qualquer um dos parágrafos 45 a 47, que é uma planta de trigo, célula vegetal de trigo, parte de planta de trigo ou semente de trigo.

Claims

1. Gene recombinante compreendendo um ácido nucleico isolado tendo atividade de promotor preferencial em raiz, induzível por estresse ou induzida por estresse preferencial em raiz, compreendendo uma sequência de nucleotídeos identificada pela SEQ ID NO: 7, caracterizado por o referido gene recombinante ser ligado operativamente a uma sequência de ácido nucleico heteróloga que codifica um produto de expressão de interesse e, opcionalmente, uma sequência de terminação e de poliadenilação de transcrição, de preferência, uma região de terminação e poliadenilação de transcrição funcional em plantas.

2. Gene recombinante, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o produto de expressão de interesse é uma molécula de RNA capaz de modular a expressão de um gene ou é uma proteína.

3. Célula hospedeira compreendendo o gene recombinante, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizada por a referida célula hospedeira ser uma célula de E. coli, uma célula de Agrobacterium ou célula de levedura.

4. Método de produção de uma planta transgênica caracterizado por compreender as etapas de: a. introduzir ou fornecer o gene recombinante, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, para uma célula vegetal para criar células transgênicas; e b. regenerar as plantas transgênicas da dita célula transgênica.

5. Método de efetuação de expressão preferencial em raiz de um ácido nucleico caracterizado por compreender introduzir o gene recombinante, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, no genoma de uma planta.

6. Método para alterar a tolerância ao estresse biótico ou abiótico, arquitetura de raiz, eficiência no uso de nutriente, ou rendimento de uma planta, em que o dito método é caracterizado por compreender introduzir o gene recombinante, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, no genoma de uma planta.

7. Uso de um ácido nucleico isolado tendo atividade de promotor preferencial em raiz, induzível por estresse ou induzida por estresse preferencial em raiz, compreendendo uma sequência de nucleotídeos identificada pela SEQ ID NO: 7, caracterizado por ser para regular a expressão de um ácido nucleico ligado operativamente em uma planta.

8. Uso de um ácido nucleico isolado tendo atividade de promotor preferencial em raiz, induzível por estresse ou induzida por estresse preferencial em raiz, compreendendo uma sequência de nucleotídeos identificada pela SEQ ID NO: 7, ou do gene recombinante, conforme definido na reivindicação 1 ou 2, caracterizado por ser para alterar a tolerância ao estresse biótico ou abiótico, arquitetura de raiz, eficiência no uso de nutriente, ou rendimento em uma planta.

9. Uso de um ácido nucleico isolado tendo atividade de promotor preferencial em raiz, induzível por estresse ou induzida por estresse preferencial em raiz, compreendendo uma sequência de nucleotídeos identificada pela SEQ ID NO: 7, caracterizado por ser para identificar outros ácidos nucleicos compreendendo atividade de promotor preferencial em raiz, para identificar outros ácidos nucleicos compreendendo atividade de promotor induzível por estresse ou para identificar outros ácidos nucleicos compreendendo atividade de promotor induzida por estresse preferencial nas raízes.

10. Método, de acordo com a reivindicação 4 ou 5, ou uso, de acordo com a reivindicação 7 ou 8, caracterizado pelo fato de que a dita planta é uma planta de algodão, soja ou trigo.