CN101765609B - 具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于增强植物中多种经济重要的产量相关性状的方法。更具体地，本发明涉及用于通过调节植物中编码GSBP样多肽(GSBP：GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白)的核酸表达而增强植物中产量相关性状的方法。本发明也涉及具有受调节地表达编码GSBP样多肽的核酸的植物，所述植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状。

Description

具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法
本发明总体上涉及分子生物学领域并涉及用于通过调节植物中编码GSBP样(GSBP：GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白)的核酸表达而改善多种植物生长特征的方法。本发明还涉及具有编码GSBP样蛋白的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或其他对照植物具有改善的生长特征。本发明也提供了在本发明方法中有用的构建体。
持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关提高农业效率的研究。常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特征的植物。但是，此类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生这样的植物，其经常含有异源的遗传组分，其可能不总是导致从亲代植物中传递的受欢迎性状。分子生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后导入该遗传物质至植物中。此种技术具有产生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。
具有特殊经济意义的性状是提高的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例如器官的数目和大小、植物构造(例如枝的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄入量、胁迫耐受性和早期生长势(earlyvigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述因素因而可以对提高作物产量有贡献。
种子产量是特别重要的性状，因为许多植物的种子对人与动物营养是重要的。作物如玉米、稻、小麦、卡诺拉油菜和大豆占超过一半的人类总热量摄入，无论通过直接消费种子本身或通过消费基于加工的种子而产生的肉产品。作物也是糖、油及工业加工中所用许多类型代谢物的来源。种子含有胚(新苗和新根的起源)和胚乳(萌发期间及籽苗早期生长期间用于胚生长的营养来源)。种子发育涉及多种基因并且需要代谢物从根、叶和茎转移至正在生长的种子中。胚乳尤其同化糖类、油和蛋白质的代谢前体并且将它们合成为贮藏大分子以灌满籽粒。
对于许多作物的另一个重要性状是早期生长势。改进早期生长势是现代稻育种计划在温带和热带稻品种上的重要目标。长根在水栽稻中对于正确土壤固定是重要的。在稻直接播种至被淹没田地的情况下，以及在植物必须从水中迅速出苗的情况下，较长的苗与生长势相关。在实施条播的情况下，较长的中胚轴和胚芽鞘对于良好出苗是重要的。将早期生长势人工改造到植物内的能力将在农业中是极其重要的。例如，不良的早期生长势已经限制了基于玉米带种质(CornBeltgermplasm)在欧洲大西洋地区引种玉米(ZeamayesL.)杂种。
又一个重要性状是改进的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界范围作物损失的主要原因，对于大多数主要作物植物而言降低平均产量超过50％(Wang等、Planta(2003)218：1-14)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高植物对非生物胁迫耐受性的能力将在世界范围对农民而言是巨大经济优势并且会允许在不利条件期间及在作物栽培否则是不可能的陆地上栽培作物。
作物产量因而可以通过优化前述因素之一而提高。
取决于最终用途，对某些产量性状的改良可能优先于其它产量性状。例如对于应用如饲料或木材生产或生物燃料资源而言，增加植物营养体部分可能是希望的，而对于应用如面粉、淀粉或油生产而言，种子参数的提高可能是特别希望的。即便在种子参数当中，某些参数可以更优先于其它参数，这取决于应用。多种机制可以对提高种子产量有贡献，无论形式为增加的种子大小或是提高的种子数目。
提高植物中产量(种子产量和/或生物量)的一种方法可以是通过调节植物的内在生长机制如细胞周期或参与植物生长或参与防御机制的多种信号传导途径。
现在已经发现可以通过调节植物中编码GSBP样(GSBP：GTP酶激活蛋白SH3结构域结合蛋白)的核酸表达来改善多种生长特征。
背景
RNA的转录后修饰在控制基因表达中发挥重要作用并影响发育过程。这种控制可以出现在多个水平或阶段上，例如，mRNA转运出细胞核、剪接、多腺苷酸化、RNA降解等。这种调节作用通过可直接作用于RNA的RNA结合蛋白实现或通过与其他蛋白质结合而间接实现。RNA结合蛋白的特征在于存在RNA结合结构域。大部分的核不均一核糖核蛋白(hnRNP)具有称作“RNA识别基序”(RRM结构域)的RNA结合结构域。另一种广泛存在的RNA结合结构域称作K同源性基序(KH结构域)并且发现存在于参与转录、mRNA稳定性、翻译沉默和mRNA定位的蛋白质中。关于多种RNA结合结构域的讨论，见Burd和Dreyfuss(Science265，615-621，1994)。
RNA结合结构域可以与其他结构域如锌指、环指结构域、RS结构域或NTF样结构域(如“核转运因子2”(NTF2)结构域)组合存在。已知具有NTF2结构域的蛋白质在胞浆与细胞核之间的大分子、离子和小分子运输方面发挥作用。
Hisashi等人(JP2005-185101)公开了超过28000个稻cDNA，其中约75％通过与拟南芥(Arabidopsisthaliana)序列的同源性而注释。据推测这些序列能够用于产生与植物的野生型等同物相比具有不同特征的植物。WO2004/035798公开了过量表达E2Fa/DPa的转基因植物中上调或下调的基因及此类序列改变植物特征的用途。这两份专利申请均公开了GSBP样蛋白，然而二者均没有教导如何通过在根中偏好地表达GSBP样蛋白而提高植物的种子产量。
概述
出人意料地，现在已经发现：调节编码GSBP样多肽的核酸表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状、尤其提高的产量和/或早期生长势的植物。
根据一个实施方案，提供了用于相对于对照植物改善植物的产量相关性状的方法，包括调节植物中编码GSBP样多肽的核酸表达。这种改善的产量相关性状包含提高的生物量、早期生长势和/或提高的种子产量。
定义
多肽/蛋白质
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可相互交换地使用并且指由肽键连接起来的任意长度聚合物形式的氨基酸。
多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列
术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可相互交换地使用并且指任意长度的聚合非分支形式的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸或这二者的组合。
对照植物
选择合适的对照植物是实验设计的例行部分并且可以包括相应的野生型植物或无目的基因的相应植物。对照植物一般是相同的植物物种或甚至是与待评估植物相同的品种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子是通过分离而丢失转基因的个体。如本文中所用的“对照植物”不仅指完整植物，也指植物部分，包括种子和种子部分。
同源物
蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质和酶，它们相对于非修饰的所讨论蛋白质具有氨基酸替换、缺失和/或插入并且与衍生它们的非修饰蛋白质具有相似的生物学活性和功能活性。
缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。
插入指一个或多个氨基酸残基被导入蛋白质中的预定位点。插入可以包含氨基端融合和/或羧基端融合以及序列内插入单个或多个氨基酸。通常，在氨基酸序列内部的插入物比氨基端融合物或羧基端融合物小约1至10个残基级别。氨基端或羧基端融合蛋白或融合肽的例子包括如酵母双杂交系统中所用的转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、(组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、蛋白A、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、Tag·100表位、c-myc表位、-表位、lacZ、CMP(钙调蛋白结合肽)、HA表位、蛋白C表位和VSV表位。
替换指以具有相似特性(如相似的疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α-螺旋结构或β-折叠结构的倾向性)的其他氨基酸替代蛋白质的氨基酸。氨基酸替换一般是单个残基的，但是根据给予多肽的功能性约束条件，可以是簇集的；插入通常是约1至10个氨基酸残基级别。氨基酸替换优选地是保守性氨基酸替换。保守性替换表是本领域熟知的(见例如Creighton(1984)Proteins.W.H.FreemanandCompany(编著)和下表1)。
表1：保守性氨基酸替换的例子
残基 保守性替换 残基 保守性替换
Ala Ser Leu Ile；Val
Arg Lys Lys Arg；Gln
Asn Gln；His Met Leu；Ile
Asp Glu Phe Met；Leu；Tyr
Gln Asn Ser Thr；Gly
Cys Ser Thr Ser；Val
Glu Asp Trp Tyr
Gly Pro Tyr Trp；Phe
His Asn；Gln Val Ile；Leu
Ile Leu，Val
氨基酸替换、缺失和/或插入可以使用本领域熟知的肽合成技术如固相肽合成法等或通过重组DNA操作轻易地进行。用于操作DNA序列以产生蛋白质的替换、插入或缺失变体的方法是本领域熟知的。例如，用于在DNA的预定位点处产生替换突变的技术是本领域技术人员熟知的并且包括M13诱变法、T7-Gen体外诱变法(USB，Cleveland，OH)、QuickChange位点定向诱变法(Stratagene，SanDiego，CA)、PCR介导的位点定向诱变或其他位点定向诱变法。
衍生物
“衍生物”包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与天然存在形式蛋白质(如目的蛋白)的氨基酸序列相比较，它们包含非天然存在的氨基酸残基对氨基酸的替换或非天然存在的氨基酸残基的添加。蛋白质的“衍生物”也包括这样的肽、寡肽、多肽，其中与所述多肽的天然存在形式的氨基酸序列相比，它们包含天然存在的改变(糖基化、酰化、异戊二烯化、磷酸化、肉豆蔻酰化、硫酸化等)的氨基酸残基或非天然存在的改变的氨基酸残基。与从中衍生出衍生物的氨基酸序列相比较，该衍生物可以也包含与所述氨基酸序列共价或非共价结合的一个或多个非氨基酸取代基或添加物(例如报道分子或其他配体)，如所结合旨在促进检测该衍生物的报道分子，和相对于天然存在的蛋白质的氨基酸序列而言，包含非天然存在的氨基酸残基。此外，“衍生物”也包括天然存在形式蛋白质与标签肽如FLAG、HIS6或硫氧还蛋白(对于标签肽的综述，见Terpe，Appl.Microbiol.Biotechnol.60，523-533，2003)的融合物。
直向同源物/旁系同源物
直向同源物和旁系同源物包括用来描述基因祖先关系的进化概念。旁系同源物是相同物种内因祖先基因复制而起源的基因；直向同源物是来自不同生物的因物种形成而起源的基因，并且也衍生于共同的祖先基因。
结构域
术语“结构域”指在进化相关性蛋白质的序列比对结果上的特定位置处保守的一组氨基酸。尽管在其他位置处的氨基酸可以在同源物之间不同，然而在特定位置处高度保守的氨基酸指示了很可能在蛋白质结构、稳定性或功能方面是必需的氨基酸。结构域因其在蛋白质同源物家族的比对序列中高保守程度而鉴定，故它们可以作为鉴定物用来确定所讨论的任意多肽是否属于先前已鉴定的多肽家族。
基序/共有序列/标签
术语“基序”或“共有序列”或“标签”指在进化相关蛋白质的序列中短的保守区域。基序往往是结构域的高度保守部分，但是也可以仅包括该结构域的部分，或可以位于保守结构域之外(若基序的全部氨基酸位于定义的结构域之外)。
杂交
如本文中所定义的术语“杂交”是其中基本上同源的互补核苷酸序列相互复性的过程。杂交过程可以完全在溶液中进行，即两种互补核酸均处于溶液中。杂交过程也可以用固定至基质如磁珠、琼脂糖凝胶(Sepharose)珠或任何其他树脂的互补核酸之一进行。杂交过程也可以用固定至固体支持物如硝酸纤维素膜或尼龙膜上或通过例如照相平版印刷术固定至例如硅玻璃支持物(后者称作核酸阵列或微阵列或称作核酸芯片)的互补核酸之一进行。为使杂交发生，核酸分子通常被热变性或化学变性，以使双链解链成两条单链和/或去除来自单链核酸的发夹或其他二级结构。
术语“严格性”指杂交发生的条件。杂交的严格性受诸条件如温度、盐浓度、离子强度和杂交缓冲液组成的影响。通常，低严格条件选择为在定义的离子强度和pH处，低于特定序列的热解链温度(Tm)约30℃。中等严格条件是当所述温度低于Tm20℃时，并且高严格条件是当所述温度低于Tm10℃时。高严格杂交条件一般用于分离与靶核酸序列具有高序列相似性的杂交序列。但是，核酸可以在序列上偏离且依旧编码基本上相同的多肽，原因是遗传密码的简并性。因而，有时候可能需要中等严格杂交条件以鉴定此类核酸分子。
Tm是在定义的离子强度和pH处的下述温度，其中50％的靶序列在所述温度与完全匹配的探针杂交。Tm取决于溶液条件和探针的碱基组成及长度。例如，较长的序列在更高温度上特异性地杂交。最大杂交速率在低于Tm约16℃直至32℃上获得。杂交溶液中一价阳离子的存在降低了两条核酸链之间的静电排斥作用，因而促进杂交体形成；这种作用对于直到0.4M的钠浓度是显而易见的(对于更高的浓度而言，可以忽略这种作用)。甲酰胺降低了DNA-DNA和DNA-RNA双链体的解链温度，每百分数的甲酰胺降低0.6至0.7℃，且添加50％甲酰胺允许在30至45℃杂交，尽管杂交速率将降低。碱基对错配降低了杂交速率和双链体的热稳定性。平均而言和对于大探针而言，Tm下降约1℃/每％碱基错配。根据杂交体的类型，Tm可以使用以下等式计算：
1)DNA-DNA杂交体(Meinkoth和Wahl，Anal.Biochem.，138：267-284，1984)：
Tm＝81.5℃+16.6×log10[Na+]a+0.41×％[G/Cb]-500×Lc]-1-0.61×％甲酰胺
2)DNA-RNA杂交体或RNA-RNA杂交体：
Tm＝79.8+18.5(log10[Na+]a)+0.58(％G/Cb)+11.8(％G/Cb)2-820/Lc
3)寡DNA杂交体或寡RNAd杂交体：
对少于20个核苷酸而言：Tm＝2(ln)
对20-35个核苷酸而言：Tm＝22+1.46(ln)
a或者用于其他一价阳离子，但是仅在0.01-0.4M范围内是精确的。
b仅对于在30％-75％范围内的％GC是精确的。
cL＝双链体的碱基对长度。
dOligo，寡核苷酸；ln，＝引物的有效长度＝2×(G/C数)+(A/T数)。
可以使用许多已知技术中任意一种技术控制非特异性结合，例如将膜以含有蛋白质的溶液封闭、添加异源RNA、异源DNA和SDS至杂交缓冲液，并且用RNA酶处理。对于非同源性探针，可以通过变换以下条件之一：(i)渐进地降低复性温度(例如从68℃至42℃)或(ii)渐进地降低甲酰胺浓度(例如从50％至0％)进行一系列杂交。技术人员了解可以在杂交期间变更并且将维持或改变所述严格条件的多个参数。
除了杂交条件之外，杂交特异性一般还取决于杂交后洗液的功能。为除去因非特异性杂交引起的背景，样品用稀释的盐溶液洗涤。此类洗液的关键因素包括最终洗涤溶液的离子强度和温度：盐浓度越低且洗涤温度越高，则洗涤的严格性越高。洗涤条件一般在杂交严格性处或低于所述杂交严格性而进行。阳性杂交产生至少两倍于背景信号的信号。通常，用于核酸杂交测定法或基因扩增检测方法的适宜严格条件如上所述。也可以选择严格性更高或更低的条件。技术人员了解可以在洗涤期间变更并且将维持或改变所述严格条件的多个参数。
例如，用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的典型高严格杂交条件包括在65℃于1×SSC中或在42℃于1×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在65℃于0.3×SSC中洗涤。用于长度大于50个核苷酸的DNA杂交体的中等严格杂交条件的例子包括在50℃于4×SSC或在40℃于6×SSC和50％甲酰胺中杂交，随后在50℃于2×SSC中洗涤。杂交体的长度是杂交核酸的预期长度。当序列已知的核酸杂交时，可以通过比对序列并鉴定本文中所述的保守区而确定杂交体长度。1×SSC是0.15MNaCl和15mM柠檬酸钠；杂交溶液和洗涤溶液可以额外地包括5×Denhardt试剂、0.5-1.0％SDS、100μg/ml变性的片段化鲑精DNA、0.5％焦磷酸钠。
出于定义严格性的水平的目的，可以参考Sambrook等(2001)MolecularCloning：alaboratorymanual，第三版ColdSpringHarborLaboratoryPress，CSH，NewYork或参考CurrentProtocolsinMolecularBiology，JohnWiley&Sons，N.Y.(1989和年度更新版)。
剪接变体
如本文中所用的术语“剪接变体”包括其中已经切除、替换、置换或添加所选内含子和/或外显子或其中已经缩短或加长内含子的核酸序列的变体。此类变体将是基本上保留蛋白质的生物学活性的一类变体；这可以通过选择性地保留蛋白质的功能性片段实现。此类剪接变体可以在自然界中找到或可以人工制备。用于预测和分离此类剪接变体的方法是本领域熟知的(见例如Foissac和Schiex，BMCBioinformatics.2005；6：25)。
等位变体
等位基因或等位变体是给定基因位于相同染色体位置处的备选形式。等位变体包含单核苷酸多态性(SNP)和小型插入/缺失多态性(INDEL)。INDEL的大小通常小于100bp。SNP和INDEL形成大部分生物的天然存在多态性株系中的序列变体的最大集合。
基因改组/定向进化
基因改组或定向进化由反复DNA改组，随后适当筛选和/或选择以产生编码具有改良生物学活性的蛋白质的核酸或其部分的变体而组成(Castle等人(2004)Science304(5674)：1151-4；美国专利5,811,238和6,395,547)。
调节元件/调控序列/启动子
术语“调节元件”、“调控序列”和“启动子”均在本文中可相互交换地使用并且在广泛含义上意指能够实现与它们相连接的序列表达的调节性核酸序列。术语“启动子”一般指位于基因转录起点上游并参与识别和结合RNA聚合酶和其他蛋白质，因而指导有效连接的核酸转录的核酸调控序列。前述术语包括从经典真核基因组基因(包括对于精确转录启动所需的TATA盒，具有或没有CCAAT盒序列)衍生的转录调节序列和应答发育性刺激和/或外部刺激或以组织特异性方式而改变基因表达的其它调节元件(即上游激活序列、增强子和沉默子)。本术语还包括经典原核基因的转录调节序列，在此情况下它可以包括一个-35盒序列和/或一个-10盒转录调节序列。术语“调节元件”也包含赋予、激活或增强核酸分子在细胞、组织或器官中表达的人工融合分子或衍生物。
“植物启动子”包含介导植物细胞中编码序列节段表达的调节元件。因此，植物启动子不需要是植物来源的，而可以源自病毒或微生物，例如来自侵袭植物细胞的病毒。“植物启动子”也可以源自植物细胞，例如来自用在本发明方法中待表达并在本文中描述的核酸序列转化的植物。这也适用于其他“植物”调节信号，如“植物”终止子。在本发明方法中有用的核苷酸序列上游的启动子可以通过一个或多个核苷酸替换、插入和/或缺失进行修饰，但不影响启动子、可读框(ORF)或3’调节区如终止子或远离ORF存在的其他3’调节区的功能性或活性。还有可能的是：所述启动子的活性因其序列的修饰或被更活跃的启动子、甚至来自异源生物的启动子彻底替代而提高。为了在植物中表达，如上所述，核酸分子必须有效地连接至或包含在正确的时间点并以所需空间表达模式表达基因的合适启动子。
鉴定功能性等效启动子，候选启动子的启动子强度和/或表达模式可以例如通过将此启动子有效地与报道基因连接并分析该报道基因在植物多种组织中的表达水平和模式进行分析。熟知的合适报道基因包括例如β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶。启动子活性通过测量β-葡糖醛酸酶或β-半乳糖苷酶的酶活性进行分析。启动子强度和/或表达模式随后可以与参考启动子(如在本发明方法中使用的一种启动子)的启动子强度和/或表达模式比较。备选地，启动子强度可以使用本领域已知方法如RNA印迹法及放射自显影图的密度计分析法、定量实时PCR或RT-PCR(Heid等，1996GenomeMethods6：986-994)，通过量化mRNA水平或通过将本发明方法中所用核酸的mRNA水平与持家基因(如18SrRNA)的mRNA水平比较进行分析。通常“弱启动子”意指驱动编码序列在低水平表达的启动子。“低水平”意指在每个细胞约1/10,000转录物至约1/100,000转录物、至约1/500,0000转录物的水平上。相反，“强启动子”驱动编码序列在高水平、或在每个细胞约1/10转录物至约1/100转录物、至约1/1,000转录物上表达。
有效地连接
如本文中所用的术语“有效地连接”指启动子序列与目的基因之间的功能性连接，从而该启动子序列能够起动该目的基因转录。
组成型启动子
“组成型启动子”指在生长和发育的大部分期间而无需在全部期间和在大多数环境条件下，在至少一种细胞、组织或器官中有转录活性的启动子。下表2a给出组成型启动子的例子。
表2a：组成型启动子的例子
基因来源 参考文献
肌动蛋白 McElroy等人，Plant Cell，2：163-171，1990
HMGP WO 2004/070039
CAMV 35S Odeil等人，Nature，313：810-812，1985
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WO 2004/065596
遍在蛋白 Christensen等人，Plant Mol.Biol.18：675-689，1992
稻亲环蛋白 Buchholz等人，Plant Mol Biol.25(5)：837-43，1994
玉米H3组蛋白 Lepetit等人，Mol.Gen.Genet.231：276-285，1992
苜蓿H3组蛋白 Wu等人Plant Mol.Biol.11：641-649，1988
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34S FMV Sanger等人，Plant.Mol.Biol.，14，1990：433-443
核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶小亚基 US 4,962,028
OCS Leisner(1988)Proc Natl Acad Sci USA 85(5)：2553
SAD1 Jain等人，Crop Science，39(6)，1999：1696
SAD2 Jain等人，Crop Science，39(6)，1999：1696
nos Shaw等人(1984)Nucleic Acids Res.12(20)：7831-7846
V-ATP酶 WO 01/14572
超级启动子 WO 95/14098
G盒蛋白质 WO 94/12015
遍在启动子
遍在启动子基本上在生物的全部组织或细胞中有活性。
发育调节型启动子
发育调节型启动子在某些发育阶段期间或在经历发育变化的植物的部分中有活性。
诱导型启动子
诱导型启动子在应答化学刺激(综述见Gatz1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol.，48：89-108)、环境刺激或物理刺激时具有诱导型或提高的转录启动作用，或可以是“胁迫诱导的”，即当植物暴露于多种胁迫条件时被激活，或是“病原体诱导的”，即当植物暴露于多种病原体时被激活。
器官特异性/组织特异性启动子
器官特异性或组织特异性启动子是能够偏好性地在某些器官或组织如叶、根、种子组织等中启动转录的启动子。例如，“根特异性启动子”是这样的启动子，该启动子优势地在植物根中具有转录活性，基本上在植物的任何其他部分中无活性，尽管在该植物其他这些部分中仍允许任意泄露表达。能够仅在某些细胞中启动转录的启动子在本文中称作“细胞特异性的”。
根特异性启动子的例子在下表2b中列出。
表2b：根特异性启动子的例子
基因来源 参考文献
RCc3 Plant Mol Biol.1995Jan；27(2)：237-48
拟南芥PHT1 Kovama等人，2005；Mudge等人(2002，Plant J.31：341)
苜蓿磷酸盐转运蛋白 Xiao等人，2006
拟南芥Pyk10 Nitz等人(2001)Plant Sci 161(2)：337-346
根可表达基因 Tingey等人，EMBO J.6：1，1987.
烟草植物生长激素诱导基因 Van der Zaal等人，Plant Mol.Biol.16，983，1991.
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烟草根特异性基因 Conkling等人，Plant Physiol.93：1203，1990.
欧洲油菜(B.napus)G1-3b基因 美国专利号5,401,836
SbPRP1 Suzuki等人，Plant Mol.Biol.21：109-119，1993.
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欧洲油菜BTG-26 US 20050044585
LeAMT1(番茄) Lauter等人(1996，PNAS 3：8139)
LeNRT1-1(番茄) Lauter等人(1996，PNAS 3：8139)
I类patatin基因(马铃薯) Liu等人，Plant Mol.Biol.153：386-395，1991.
KDC1(胡萝卜(Daucuscarota)) Downey等人(2000，J.Biol.Chem.275：39420)
TobRB7基因 W Song(1997)PhD Thesis，North CarolinaState University，Raleigh，NC USA
OsRAB5a(稻) Wang等人2002，Plant Sci.163：273
ALF5(拟南芥) Diener等人(2001，Plant Cell 13：1625)
NRT2；1Np(白花丹叶烟草(N.plumbaginifolia)) Quesada等人(1997，Plant Mol.Biol.34：265)
种子特异性启动子是能够优势地在种子组织中有转录活性的启动子，但无需排他性地在种子组织中有转录活性(在泄露表达的情况下)。种子特异性启动子可以在种子发育期间和/或萌发期间有活性。
如本文中所定义的绿色组织特异性启动子是优势地在绿色组织中具有转录活性的启动子，在植物的任何其它部分中基本上无活性，尽管在该植物其他这些部分中仍允许任意泄露表达。
组织特异性启动子的另一个例子是分生组织特异性启动子，其优势地在分生组织中具有转录活性，在植物的任何其它部分中基本上无活性，尽管在该植物其他这些部分中仍允许任意泄露表达。
终止子
术语“终止子”包括作为转录单元末端处DNA序列的调控序列，所述的DNA序列产生初级转录物的3’加工和多聚腺苷化及转录终止的信号。所述终止子可以从天然基因、从多种其他植物基因或从T-DNA衍生。待添加的终止子可以从例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地从另一种植物基因或较不优选地从任何其他真核基因衍生。
调节
就表达或基因表达而言，术语“调节”意指这样的过程，在所述过程中与对照植物相比较，表达水平因所述基因的表达而改变，优选地，表达水平可以提高或降低。原始、未调节的表达可以是结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA的任何类型的表达，随后是翻译。术语“调节活性”意指本发明核酸序列或所编码蛋白质的表达的任何改变，这导致植物产量提高和/或生长增加。
表达
术语“表达”或“基因表达”意指某个特定基因或多个特定基因或特定基因构建体的转录。术语“表达”或“基因表达”尤其意指某个基因或诸基因或基因构建体转录成结构性RNA(rRNA、tRNA)或mRNA，而所述RNA随后翻译或不翻译成蛋白质。该过程包括DNA的转录和所得mRNA产物的加工。
增加的表达/过量表达
如本文中所用的术语“增加的表达”或“过量表达”意指相对于原有野生型表达水平为额外的任何形式的表达。
在本领域内充分记载了用于提高基因或基因产物表达的方法并且这些方法包括例如由适宜启动子驱动的过量表达、使用转录增强子或翻译增强子。充当启动子或增强子元件的分离核酸可以导入多核苷酸的非异源形式的适宜位置(一般在上游)中，从而上调编码目的多肽的核酸表达。例如，内源性启动子可以在体内通过突变、缺失和/或替换进行改变(见Kmiec，US5,565,350；Zarling等，WO9322443)，或可以将分离的启动子以相对于本发明基因的恰当方向及距离导入植物细胞，从而控制该基因的表达。
若需要多肽表达，通常希望的是在多核苷酸编码区的3’末端处包括多聚腺苷化区。所述多聚腺苷化区可以从天然基因、从多种其他植物基因或从T-DNA衍生。待添加的3’末端序列可以从例如胭脂碱合酶或章鱼碱合酶基因或备选地从另一种植物基因或较不优选地从任何其他真核基因衍生。
也可以将内含子序列添加至5’非翻译区(UTR)或部分编码序列的编码序列以提高细胞质内聚集的成熟信使的数量。已经显示在植物和动物表达构建体的转录单位中包含可剪接内含子提高了mRNA水平和蛋白质水平上的基因表达高达1000倍(Buchman和Berg(1988)Mol.Cellbiol.8：4395-4405；Callis等(1987)GensDev1：1183-1200)。此种内含子增强基因表达的作用一般在所述内含子置于转录单位的5’末端附近时最强烈。玉米内含子Adh1-S内含子1、2和6、Bronze-1内含子的用途是本领域已知的。对于总体信息，见：《(玉米手册》，第116章，编者Freeling和Walbot，Springer，N.Y.(1994)。
内源基因
本文中对“内源的”基因的称谓不仅仅指如植物中以其天然形式(即没有人类任何干预)存在的所讨论基因，还指处于分离形式下的随后(再)导入植物(转基因)的相同基因(或基本上同源的核酸/基因)。例如，含有这种转基因的转基因植物可以出现转基因表达的大幅降低和/或内源基因表达的大幅降低。所述的分离基因可以从生物分离或可以是人造的，例如通过化学合成法人造的。
选择标记(基因)/报道基因
“选择标记”、“选择标记基因”或“报道基因”包括对细胞赋予表型的任何基因，其中所述“选择标记”、“选择标记基因”或“报道基因”在所述细胞中表达旨在促进鉴定和/或选择用本发明的核酸构建体转染或转化的细胞。这些标记基因能够借助一系列不同原理而鉴定核酸分子的成功转移。合适的标记可以选自赋予抗生素抗性或除草剂抗性、导入新代谢性状或允许目视选择的标记。选择标记基因的例子包括赋予抗生素抗性的基因(如使新霉素和卡那霉素磷酸化的nptII或使潮霉素磷酸化的hpt或赋予针对例如博来霉素、链霉素、四环素、氯霉素、氨苄青霉素、庆大霉素、遗传霉素(Geneticin)(G418)、壮观霉素或杀稻瘟菌素的抗性的基因)、赋予除草剂抗性的基因(例如提供抗性的bar；提供草甘膦抗性的aroA或gox或赋予针对例如咪唑啉酮、膦丝菌素或磺脲类的抗性的基因)或提供代谢性状的基因(如允许植物使用甘露糖作为唯一碳源的manA，或利用木糖的木糖异构酶，或抗营养性标记如2-脱氧葡萄糖抗性)。目视标记基因的表达导致颜色(例如β-葡糖醛酸酶、GUS或β-半乳糖苷酶与其有色底物例如X-Gal)、发光(如萤光素/萤光素酶系统)或荧光(绿色荧光蛋白GFP和其衍生物)的形成。这个名单仅代表少数的可能标记。技术人员熟悉此类标记。取决于生物和选择方法，优选不同的标记。
已知当核酸稳定或瞬时地整合至植物细胞时，仅少数细胞摄取了外来DNA，并且根据需要，将其整合至细胞的基因组中，这取决于所用的表达载体和所用的转染技术。为鉴定并选择这些整合体，编码选择标记的基因(如上文所述的基因)通常连同目的基因一起导入宿主细胞。这些标记可以在这些基因例如通过常规方法缺失而无功能的突变体中使用。此外，编码选择标记的核酸分子可以在包含编码本发明多肽或在本发明方法中所用多肽的序列的相同载体上，或在独立的载体上导入宿主细胞。已经用所导入核酸稳定转染的细胞可以通过选择作用鉴定(例如具有整合的选择标记的细胞存活而其他细胞死亡)。
因为所述标记基因，尤其抗生素抗性基因和除草剂抗性基因一旦已经成功地导入，则在转基因宿主细胞中是不再需要或不想要的，故而，用于导入核酸的本发明方法有利地使用能够去掉或切除这些标记基因的技术。一种这样的方法称作共转化法。共转化法同时使用两种载体用于转化，一种载体携带本发明的核酸而第二种载体携带标记基因。大比例的转化体接受或在植物情况下包含(多达40％或更多的转化体)这两种载体。在用农杆菌(Agrobacterium)转化的情况下，转化体通常仅接受载体的一部分，即侧翼存在T-DNA的序列，该序列通常代表表达盒。标记基因随后可以通过开展杂交从转化的植物中除去。在另一种方法中，整合至转座子的标记基因用来与目的核酸一起进行转化(称作Ac/Ds技术)。转化体可以与转座酶来源物杂交，或该转化体用导致转座酶表达的核酸构建体瞬时或稳定地转化。在一些情况下(大约10％)，一旦转化已经成功发生，则转座子从宿主细胞的基因组中跳出并丢失。在其他许多情况下，转座子跳到不同位置。在这些情况下，必须通过开展杂交消除标记基因。在微生物学中，开发了有可能或促进检测这类事件的技术。又一个有利的方法依赖于所谓重组系统；此方法的优势在于可以用所述的重组系统实行杂交消除作用。最知名的该类型系统称作Cre/lox系统。Cre1是除去位于loxP序列之间序列的重组酶。若所述标记基因整合在loxP序列之间，则一旦转化已经成功发生，它因重组酶表达而被除去。其他重组系统是HIN/HIX、FLP/FRT和REP/STB系统(Tribble等，J.Biol.Chem.，275，2000：22255-22267；Velmurugan等，J.CellBiol.，149，2000：553-566)。有可能将本发明核酸序列以位点特异性方式整合至植物基因组。这些方法自然也可以应用于微生物如酵母、真菌或细菌。
转基因的/转基因/重组
为本发明的目的，“转基因的”、“转基因”或“重组”例如就核酸序列而言，意指包含所述核酸序列的表达盒、基因构建体或载体，或用本发明核酸序列、表达盒或载体转化的生物，这些构建体均通过重组方法产生，其中
(a)编码在本发明方法中有用的蛋白质的核酸序列，或
(b)与本发明核酸序列有效连接的基因调控序列，例如启动子，或
(c)a)和b)
不位于其天然遗传环境中或已经通过重组方法被修饰，所述的修饰有可能采取例如替换、添加、倒位或插入一个或多个核苷酸残基的形式。天然遗传环境理解为意指原初植物中的天然基因组位点或染色体位点或存在于基因组文库中。在基因组文库的情况下，核酸序列的天然遗传环境优选地保留，至少部分保留。该环境分布在所述核酸序列的至少一侧并且具有至少50bp，优选至少500bp，特别优选至少1000bp，最优选至少5000bp序列长度。当天然存在的表达盒受非天然的合成(“人工”)方法(如诱变处理)被修饰时，天然存在的表达盒-例如所述核酸序列的天然启动子与编码在本发明方法中有用的多肽的相应核酸序列的天然存在组合，如上文所定义-变成转基因表达盒。合适方法例如在US5,565,350或WO00/15815中描述。
为本发明目的，如上所述，将转基因植物因此理解为意指在本发明方法中有用的核酸不处于所述植物基因组中所述核酸的天然基因座处，所述核酸有可能同源或异源地表达。但是，如所提及，转基因的还意指尽管本发明的或在本发明方法中有用的核酸处于植物基因组中所述核酸的天然位置处，然而其序列相对于天然序列而言已经被修饰，和/或所述天然序列的调节序列已经被修饰。转基因的优选地理解为意指本发明核酸在基因组的非天然基因座处表达，即，所述核酸的同源表达或优选异源表达发生。优选的转基因植物在本文中提及。
转化
如本文中提及的术语“导入”或“转化”包括外源性多核苷酸转移至宿主细胞，无论转化所用的方法是什么方法。能够后续克隆性增殖(无论通过器官发生或胚发生)的植物组织可以用本发明的基因构建体转化并且完整植物可以从中再生。所选的具体组织根据可用于并且最适于正在进行转化的具体物种的克隆性增殖系统变化。示例性靶组织包括叶盘、花粉、胚、子叶、下胚轴、大配子体、愈伤组织、现存分生组织(例如顶端分生组织、腋芽和根分生组织)和诱导性分生组织(例如子叶分生组织和下胚轴分生组织)。多核苷酸可以瞬时或稳定地导入宿主细胞并且可以非整合地维持，例如作为质粒。备选地，它可以整合至宿主基因组。所得的转化植物细胞随后可以用来按照本领域技术人员已知的方式再生出转化植物。
外来基因转移至植物基因组的过程称作转化。转化植物物种现在是极为常规的技术。有利地，几种转化方法中的任何一种方法可以用来将目的基因导入合适的祖先细胞。描述用于转化并从植物组织或植物细胞再生出植物的方法可以用于瞬时转化或稳定转化。转化方法包括使用脂质体、电穿孔法、提高游离DNA摄入的化学品、DNA直接注射至植物、粒子枪轰击法、使用病毒或花粉的转化法和显微投射法(microprojection)。转化方法可以选自用于原生质体的钙/聚乙二醇法(Krens，F.A.等，(1982)Nature296，72-74；NegrutiuI等(1987)PlantMolBiol8：363-373)；原生质体的电穿孔法(ShillitoR.D.等(1985)Bio/Technol3，1099-1102)；对植物材料的微量注射法(CrosswayA等，(1986)Mol.GenGenet202：179-185)；DNA或RNA包被的粒子轰击法(KleinTM等，(1987)Nature327：70)、(非整合性)病毒感染法等。包括转基因作物植物在内的转基因植物优选通过农杆菌介导的转化法产生。有利的转化方法是植物内(inplanta)转化法。为此目的，例如有可能将农杆菌作用于植物种子或有可能用农杆菌接种植物分生组织。根据本发明，已经证明特别有利的是将转化的农杆菌悬液作用于完整植物或至少作用于花原基。随后继续培育该植物直至获得已处理植物的种子(Clough和Bent，PlantJ.(1998)16，735-743)。用于农杆菌介导稻转化的方法包括用于稻转化的众知方法，如在以下任意文献中描述的那些方法：欧洲专利申请EP1198985A1，Aldemita和Hodges(Planta199：612-617，1996)；Chan等(PlantMolBiol22(3)：491-506，1993)，Hiei等(PlantJ6(2)：271-282，1994)，其公开内容如充分所述那样通过引用的方式并入本文。在玉米转化的情况下，优选的方法如Ishida等(Nat.Biotechnol14(6)：745-50，1996)或Frame等(PlantPhysiol129(1)：13-22，2002)描述，其公开内容如充分所述那样通过引用的方式并入本文。所述方法还例如由B.Jenes等，TechniquesforGeneTransfer，在：TransgenicPlants，第1卷，EngineeringandUtilization，编者S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress(1993)128-143及在PotrykusAnnu.Rev.PlantPhysiol.PlantMolec.Biol.42(1991)205-225)描述。待表达的核酸或构建体优选地克隆至适于转化根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)的载体，例如pBin19(Bevan等，Nucl.AcidsRes.12(1984)8711)。通过这种载体转化的农杆菌随后可以按照已知方式用于转化植物，例如作为模型使用的植物如拟南芥属植物(拟南芥在本发明范围不视为作物植物)，或作物植物，例如烟草植物，所述方式例如是通过将擦伤的叶或切碎的叶浸泡在农杆菌溶液中并随后将它们在合适培养基中培育。借助根癌农杆菌转化植物例如由和Willmitzer在Nucl.AcidRes.(1988)16，9877中描述或尤其从F.F.White，VectorsforGeneTransferinHigherPlants；在TransgenicPlants，第1卷，EngineeringandUtilization，编者S.D.Kung和R.Wu，AcademicPress，1993，第15-38页中获知。
除了转化随后必需再生成完整植物的体细胞之外，还可转化植物分生组织的细胞，并且尤其是发育成配子的那些细胞。在这种情况下，转化的配子遵循天然植物发育过程，从而产生转基因植物。因此，例如用农杆菌处理拟南芥属植物的种子并且从正在发育的植物中获得种子，其中一定比例的所述植物被转化并且因此是转基因的[Feldman，KA和MarksMD(1987)MolGenGenet208：274-289；FeldmannK(1992)，在：编者CKoncz，N-HChua和JShell，MethodsinArabidopsisResearch.WordScientific，Singapore，第274-289页]。备选方法基于反复除去花序并将莲座丛中心内的切除部位与转化的农杆菌温育，因而同样可以在较晚的时间点上获得转化的种子(Chang(1994)PlantJ.5：551-558；Katavic(1994)MolGenGenet，245：363-370)。但是，特别有效的方法是改良真空渗入法，如“花器浸蘸”法。在拟南芥属植物真空渗入法的情况下，在减压下用农杆菌悬液处理完整植物[Bechthold，N(1993)。CRAcadSciParisLifeSci，316：1194-1199]，而在”花器浸蘸法”的情况下，将正在发育的花组织与经表面活性剂处理的农杆菌悬液短暂温育[Clough，SJ和Bent，AF(1998)ThePlantJ.16，735-743]。在这两种情况下均收获某个比例的转基因种子，并且这些种子可以通过在如上所述的选择条件下培育与非转基因种子区分。此外，质体的稳定转化是有利的，因为质体在大部分作物中母系地遗传，这降低或消除了经过花粉的转基因流动风险。叶绿体基因组的转化一般通过在Klaus等，2004[NatureBiotechnology22(2)，225-229]中已示意性展示的方法实现。简而言之，将待转化的序列连同选择标记基因一起克隆至同源于叶绿体基因组的侧翼序列之间。这些同源侧翼序列指导进入原质体的位点特异性整合。已经对许多不同植物物种描述了质体转化并且Bock(2001)基础研究和植物生物技术中的转基因质体(Transgenicplastidsinbasicresearchandplantbiotechnology).JMolBiol.2001年9月21日；312(3)：425-38或Maliga，P(2003)质体转化技术商业化进展(Progresstowardscommercializationofplastidtransformationtechnology)，TrendsBiotechnol.21，20-28进行了综述。其他生物技术进展最近已经以无标记质体转化体的形式进行报道，其中所述的无标记质体转化体可以通过瞬时共整合性标记基因产生(Klaus等，2004，NatureBiotechnology22(2)，225-229)。
T-DNA活化标签技术(T-DNAactivationtagging)
T-DNA活化标签技术(Hayashi等Science(1992)1350-1353)涉及以启动子指导靶向的基因表达的方式在目的基因的基因组区域内或基因的编码区上游或下游10kb处插入通常含有启动子(也可以是翻译增强子或内含子)的T-DNA。一般，靶向基因的天然启动子对该靶向基因表达的调节被破坏，并且所述基因处于新导入的启动子控制下。该启动子一般嵌入T-DNA中。这种T-DNA随机地插入植物基因组，例如借助农杆菌感染，并且导致在插入的T-DNA附近的基因表达受到调节。所得的转基因植物因在导入的启动子附近的基因表达受到调节而显示显性表型。
TILLING
术语“TILLING”是“基因组中定向诱导的局部损伤法”的缩写并且指用于产生和/或鉴定核酸的诱变技术，其中所述的核酸编码具有改良表达和/或活性的蛋白质。TILLING还允许选择携带此类突变变体的植物。这些突变变体可以表现在强度或在位置或在时间方面改良的表达(例如若所述突变影响启动子)。这些突变变体可以显示比其天然形式基因所表现活性更高的活性。TILLING将高密度诱变与高通量筛选方法组合。在TILLING中一般遵循的步骤是：(a)EMS诱变(RedeiGP和KonczC(1992)在MethodsinArabidopsisResearch，KonczC，ChuaNH，SchellJ，Singapore编辑，WorldScientificPublishingCo，第16-82页；Feldmann等，(1994)在MeyerowitzEM，SomervilleCR编辑，Arabidopsis.ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NY，第137-172页；LightnerJ和CasparT(1998)在JMartinez-Zapater，JSalinas编者，MethodsonMolecularBiology第82卷.HumanaPress，Totowa，NJ，第91-104页)；(b)个体的DNA制备和汇集；(c)目的区域的PCR扩增；(d)变性和复性以使得异双链体形成；(e)DHPLC，其中异双链体在汇集物中的存在作为色谱图中一个额外的峰被检测到；(f)鉴定突变个体；和(g)对突变PCR产物的测序。用于TILLING的方法是本领域熟知的(McCallum等，(2000)NatBiotechnol18：455-457；综述见Stemple(2004)NatRevGenet5(2)：145-50)。
同源重组
同源重组允许在基因组中定义的所选位置处导入选择的核酸。同源重组是在生物科学中例行用于低等生物如酵母或小立碗藓属(Physcomitrella)苔藓的标准技术。已经对模式植物(Offringa等(1990)EMBOJ9(10)：3077-84)和作物植物例如稻(Terada等(2002)NatBiotech20(10)：1030-4；Iida和Terada(2004)CurrOpinBiotech15(2)：132-8)描述了用于植物中开展同源重组的方法。
产量
术语“产量”通常意指经济价值的可测量结果，一般与特定作物、与面积并与时间段有关。单个植物部分基于它们的数目、大小和/或重量而直接有助于对产量，或实际产量是对于某种作物和一年的每平方米产量，这通过总产量(包括收获的和评估的产量)除以种植的平方米数而确定。术语植物的“产量”可以涉及该植物的营养生物量(根和/或苗生物量)、涉及繁殖器官和/或涉及繁殖体(如种子)。
早期生长势
“早期生长势”指活跃、健康、充分平衡的生长，尤其是植物生长早期期间，并且可以因植物适应性提高引起，其中所述的植物适应性提高原因在于例如该植物更好地适应环境(即优化能量来源的用途和苗与根之间的分配)。具有早期生长势的植物也显示籽苗存活提高和作物建立更佳，这往往产生高度均一的田块(作物以均一方式生长，即大多数植物在基本上相同的时间达到各个发育期)和往往形成更好及更高的产量。因而，早期生长势可以通过测量多种因子如千粒核重(ThousandKernelWeight)、萌发百分数、出苗百分数、籽苗生长、籽苗高度、根长度、根和苗生物量和许多其他因素等确定。
提高/改善/增强
术语“提高”、“改善”或“增强”是相互可交换的并且在应用含义上应当意指与如本文中定义的对照植物相比较，至少3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％或10％、优选至少15％或20％、更优选地25％、30％、35％或40％更多的产量和/或生长。
种子产量
提高的种子产量自身可以表现为以下一个或多个指标：a)种子生物量(种子总重量)增加，这可以基于单粒种子基础和/或每株植物和/或每平方米；b)提高的每株植物花数目；c)提高的(充实)种子数；d)提高的种子充实率(其表述为充实种子数与种子总数之间的比率)；e)提高的收获指数，其表述为可收获部分(如种子)产量与总生物量的比率；和f)提高的千粒核重(TKW)，这从计数的充实种子数及其总重量中外推出来。提高的TKW可以因增加的种子大小和/或种子重量引起，并且也可以因胚和/或胚乳大小的增加引起。
种子产量的提高也可以表现为种子大小和/或种子体积的增长。此外，种子产量的提高自身也可以表现为种子面积和/或种子长度和/或种子宽度和/或种子周长的提高。提高的产量也可以产生改良的构造，或可以因改良的构造而出现。
绿度指数
从植物的数字图像计算如本文中所用的“绿度指数”。对属于图像上植物目标的每个像素计算绿色值与红色值的比率(在编码颜色的RGB模式中)。绿度指数表述为绿色/红色比超过给定阈值的像素百分数。在正常生长条件下，在盐胁迫生长条件下和在营养可用性降低的生长条件下，在开花前的最后成像中测量植物的绿度指数。相反，在干旱胁迫生长条件下，在干旱后的首次成像中测量植物的绿度指数。
植物
本文中所用的术语“植物”包括完整植物、植物的祖先及子代和包括种子、苗、茎、叶、根(包括块茎)、花和组织、器官在内的植物部分，其中每种前述对象包含目的基因/核酸。术语“植物”也包括植物细胞、悬浮培养物、愈伤组织、胚、分生组织区、配子体、孢子体、花粉和小孢子，同样每种前述对象包含目的基因/核酸。
在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木，其中所述植物选自包含以下物种的名单：槭树属物种(Acerspp.)、猕猴桃属物种(Actinidiaspp.)、秋葵属物种(Abelmoschusspp.)、剑麻(Agavesisalana)、冰草属物种(Agropyronspp.)、匍匐剪股颖(Agrostisstolonifera)、葱属物种(Alliumspp.)、苋属物种(AmaranthussPP.)、欧洲海滨草(Ammophilaarenaria)、凤梨(Ananascomosus)、番荔枝属物种(Annonaspp.)、旱芹(Apiumgraveolens)、蜘蛛兰属物种(Arachisspp.)、木波罗属物种(Artocarpusspp.)、石刁柏(Asparagusofficinalis)、燕麦属物种(Avenaspp.)(例如燕麦(Avenasativa)、野燕麦(Avenafatua)、比赞燕麦(Avenabyzantina)、野燕麦原变种(Avenafatuavar.sativa)、杂种燕麦(Avenahybrida)、阳桃(Averrhoacarambola)、箣竹属(Bambusasp.)、冬瓜(Benincasahispida)、巴西栗(Bertholletiaexcelsea)、甜菜(Betavulgaris)、芸苔属物种(Brassicaspp.)(例如欧洲油菜(Brassicanapus)、芜青物种(Brassicarapassp.)[卡诺拉油菜、油菜(oilseedrape)、蔓青(turniprape)])、Cadabafarinosa、茶(Camelliasinensis)、美人蕉(Cannaindica)、大麻(Cannabissativa)、辣椒属物种(Capsicumspp.)、Carexelata、番木瓜(Caricapapaya)、大果假虎刺(Carissamacrocarpa)、山核桃属物种(Caryaspp.)、红花(Carthamustinctorius)、栗属物种(Castaneaspp.)、美洲木棉(Ceibapentandra)、苦苣(Cichoriumendivia)、樟属物种(Cinnamomumspp.)、西瓜(Citrulluslanatus)、柑桔属物种(Citrusspp.)、椰子属物种(Cocosspp.)、咖啡属物种(Coffeaspp.)、芋头(Colocasiaesculenta)、非洲梧桐属物种(Colaspp.)、黄麻属(Corchorussp.)、芫荽(Coriandrumsativum)、榛属物种(Corylusspp.)、山楂属物种(Crataegusspp.)、番红花(Crocussativus)、南瓜属物种(Cucurbitaspp.)、香瓜属物种(Cucumisspp.)、菜蓟属物种(Cynaraspp.)、胡萝卜、山马蝗属物种(Desmodiumspp.)、龙眼(Dimocarpuslongan)、薯蓣属物种(Dioscoreaspp.)、柿树属物种(Diospyrosspp.)、稗属物种(Echinochloaspp.)、油棕属(Elaeis)(例如油棕(Elaeisguineensis)、美洲油棕(Elaeisoleifera))、穇子(Eleusinecoracana)、埃塞俄比亚画眉草(Eragrostistef)、蔗茅属物种(Erianthussp.)、枇杷(Eriobotryajaponica)、桉属物种(Eucalyptussp.)、红仔果(Eugeniauniflora)、荞麦属物种(Fagopyrumspp.)、水青冈属物种(Fagusspp.)、苇状羊茅(Festucaarundinacea)、无花果(Ficuscarica)、金桔属物种(Fortunellaspp.)、草莓属物种(Fragariaspp.)、银杏(Ginkgobiloba)、大豆属(Glycinespp.)(例如大豆(Glycinemax)、大豆(Sojahispida)或大豆(Sojamax))、陆地棉(Gossypiumhirstum)、向日葵属(Helianthusspp.)(例如向日葵(Helianthusannuus))、长管萱草(Hemerocallisfulva)、木槿属物种(Hibiscusspp.)、大麦属(Hordeumspp.)(例如大麦(Hordeumvulgare))、甘薯(Ipomoeabatatas)、核桃属物种(Juglansspp.)、莴苣(Lactucasativa)、山黧豆属物种(Lathyrusspp.)、兵豆(Lensculinaris)、亚麻(Linumusitatissimum)、荔枝(Litchichinensis)、百脉根属物种(Lotusspp.)、棱角丝瓜(Luffaacutangula)、羽扇豆属物种(Lupinusspp.)、Luzulasylvatica、番茄属物种(Lycopersiconspp.)(例如番茄(Lycopersiconesculentum)、番茄(Lycopersiconlycopersicum)、番茄(Lycopersiconpyriforme))、硬皮豆属物种(Macrotylomaspp.)、苹果属物种(Malusspp.)、凹缘金虎尾(Malpighiaemarginata)、牛油果(Mammeaamericana)、芒果(Mangiferaindica)、木薯属物种(Manihotspp.)、人心果(Manilkarazapota)、苜蓿(Medicagosativa)、草木樨属物种(Melilotusspp.)、薄荷属物种(Menthaspp.)、芒(Miscanthussinensis)、苦瓜属物种(Momordicaspp.)、黑桑(Morusnigra)、芭蕉属物种(Musaspp.)、烟草属物种(Nicotianaspp.)、木犀榄属物种(Oleaspp.)、仙人掌属物种(Opuntiaspp.)、鸟足豆属物种(Ornithopusspp.)、稻属物种(Oryzaspp.)(例如稻、阔叶稻(Oryzalatifolia))、稷(Panicummiliaceum)、柳枝稷(Panicumvirgatum)、鸡蛋果(Passifloraedulis)、欧防风(Pastinacasativa)、狼尾草属物种(Pennisetumsp.)、鳄梨属物种(Perseaspp.)、欧芹(Petroselinumcrispum)、虉草(Phalarisarundinacea)、菜豆属物种(Phaseolusspp.)、猫尾草(Phleumpratense)、刺葵属物种(Phoenixspp.)、南方芦苇(Phragmitesaustralis)、酸浆属物种(Physalisspp.)、松属物种(Pinusspp.)、阿月浑子(Pistaciavera)、豌豆属物种(Pisumspp.)、早熟禾属物种(Poaspp.)、杨属物种(Populusspp.)、牧豆草属物种(Prosopisspp.)、李属物种(Prunusspp.)、番石榴属物种(Psidiumspp.)、石榴(Punicagranatum)、西洋梨(Pyruscommunis)、栎属物种(Quercusspp.)、萝卜(Raphanussativus)、波叶大黄(Rheumrhabarbarum)、茶藨子属物种(Ribesspp.)、蓖麻(Ricinuscommunis)、悬钩子属物种(Rubusspp.)、甘蔗属物种(Saccharumspp.)、柳属物种(Salixsp.)、接骨木属物种(Sambucusspp.)、黑麦(Secalecereale)、胡麻属物种(Sesamumspp.)、白芥属物种(Sinapissp.)、茄属(Solanumspp.)(例如马铃薯(Solanumtuberosum)、红茄(Solanumintegrifolium)或番茄)、两色蜀黍(Sorghumbicolor)、菠菜属物种(Spinaciaspp.)、蒲桃属物种(Syzygiumspp.)、万寿菊属物种(Tagetesspp.)、酸豆(Tamarindusindica)、可可树(Theobromacacao)、车轴草属物种(TrifoliumsPP.)、鸭茅状摩擦禾(Tripsacumdactyloides)、Triticosecalerimpaui、小麦属(Triticumspp.)(例如普通小麦(Triticumaestivum)、硬粒小麦(Triticumdurum)、圆柱小麦(Triticumturgidum)、Triticumhybernum、马卡小麦(Triticummacha)、普通小麦(Triticumsativum)或普通小麦(Triticumvulgare))、小金莲花(Tropaeolumminus)、金莲花(Tropaeolummajus)、越桔属物种(Vacciniumspp.)、野碗豆属物种(Viciaspp.)、豇豆属物种(Vignaspp.)、香堇(Violaodorata)、葡萄属物种(Vitisspp.)、玉米(Zeamays)、Zizaniapalustris、枣属物种(Ziziphusspp.)及其他。
发明详述
出人意料地，现在已经发现：调节植物中编码GSBP样多肽的核酸表达产生了相对于对照植物具有增强的产量相关性状的植物。根据第一个实施方案，本发明提供了用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括调节植物中编码GSBP样多肽的核酸表达。
用于调节(优选地提高)编码GSBP样多肽的核酸表达的一个优选方法是在植物中导入并表达编码GSBP样多肽的核酸。
下文任何对“在本发明方法中有用的蛋白质”的谈及意指如本文中定义的GSBP样多肽。下文任何对“在本发明方法中有用的核酸”的谈及意指能够编码这种GSBP样多肽的核酸。待导入植物(并且因而在实施本发明方法中有用)的核酸是编码现在将描述的蛋白质类型的任意核酸，下文也称作“GSBP样核酸”或“GSBP样基因”。
如本文中定义的“GSBP样多肽”指包含位于蛋白质氨基半端部分的NTF2结构域(Pfam登录号PF02136，InterPro登录号IPR002075)和位于该蛋白质羧基半端部分的RRM结构域(Pfam登录号PF00076，InterPro登录号IPR000504)的任意多肽。推测RRM结构域存在于RNA结合蛋白中，而NTF2结构域存在于参与核转运的蛋白质中。另外，该蛋白质从RRM结构域末端(即保守的EE残基之后)开始的羧基端部分富含Arg和Gly残基：虽然平均蛋白质组成具有12.22％的R/G含量(2004年7月第44发布版Swiss-Prot蛋白质序列数据库的氨基酸组成)，GSBP样蛋白的羧基端部分(以增加的优选顺序)具有多于20％、25％、30％的R/G含量。任选地，GSBP样多肽包含在RRM结构域羧基端的N-糖基化基序(RGD三肽)。
此外，GSBP样多肽以增加的优选顺序包含以下保守基序中的1、2、3、4、5或更多个保守基序：
基序1，SEQIDNO：34：GIQVR；
基序2，SEQIDNO：35：(V/I)EE(K/R)(R/K)
基序3，SEQIDNO：36：(C/F/N)(F/Y/I)(G/A)F(I/V)(E/A/V)(F/Y)(E/D)
基序4，SEQIDNO：37：
F(K/R/Q)(K/S/A/N)(F/Y)G(A/L/T/P/R/N)(I/V)(K/R/V)
基序5，SEQIDNO：38：
(S/A/Q)(V/I/L)(F/Y)(V/L/I)(K/R/A/G)(S/H/N/G)L(P/S)
基序6，SEQIDNO：39：
(Y/F)(V/F/Y)V(L/F/H)(N/S)D(I/M/V/T)(F/L)(R/Q/K)(F/Y/L)
基序7，SEQIDNO：40：
F(T/S/A/V/M)Q(S/T)(F/M)(F/L/V)L(A/V)(P/S)
基序8，SEQIDNO：41：(G/A)(V/L/Y)X(I/V/T/M)(V/L/M/Q)V(T/M)G
其中X可以是任意氨基酸，但是优选地是L、H、T、I、V、M或Q中之一。
优选地，基序2是VEEK(R/K)。
优选地，基序3是C(F/Y)GF(I/V)EFE。
优选地，基序4是
F(K/R/Q)(K/S/A/N)(F/Y)G(A/L/T/P/R/N)(I/V)(K/R/V)。
优选地，基序5是(S/A)(V/I)(F/Y)(V/L)(K/R)(S/H/N)LP。
优选地，基序6是Y(V/F)V(L/F)ND(I/M/V)(F/L)R(F/Y)。
优选地，基序7是F(T/S/A)Q(S/T)FFLAP。
优选地，基序8是G(V/Y)(L/H/T/I/V/M)(I/V)(V/L)VTG。
优选地，所述多肽序列在构建进化系统树如图3中所绘制的一个进化系统树中使用时，与包含SEQIDNO：2所代表氨基酸序列的GSBP样多肽组(最终指文献中定义的特定组)而不与任何其他组聚类。
术语“结构域”和“基序”在本文中的“定义”部分定义。存在用于鉴定结构域的专业数据库，例如，SMART(Schultz等人(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95，5857-5864；Letunic等人(2002)NucleicAcidsRes30，242-244)、InterPro(Mulder等，(2003)Nucl.Acids.Res.31，315-318)、Prosite(Bucher和Bairoch(1994)，用于生物分子序列基序的概括特征结构及其在自动化序列解读中的功能(Ageneralizedprofilesyntaxforbiomolecularsequencesmotifsanditsfunctioninautomaticsequenceinterpretation).(在)ISMB-94；第二届分子生物学智能系统国际会议文集.AltmanR.，BrutlagD.，KarpP.，LathropR.，SearlsD.编辑，第53-61页，AAAIPress，MenloPark；Hulo等，Nucl.Acids.Res.32：D134-D137，(2004)或Pfam(Bateman等，NucleicAcidsResearch30(1)：276-280(2002))。一组用于计算机方式分析蛋白质序列的工具可在ExPASY蛋白质组服务器上获得(瑞士生物信息研究所维护(Gasteiger等，ExPASy：用于深入认识和分析蛋白质的蛋白质组服务器(Theproteomicsserverforin-depthproteinknowledgeandanalysis)，NucleicAcidsRes.31：3784-3788(2003))。结构域也可以使用常规技术如通过序列比对进行鉴定。
用于比对序列以进行比较的方法是本领域熟知的，此类方法包括GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。GAP使用Needleman和Wunsch算法((1970)JMolBiol48：443-453)以找到使匹配数最大化并使空位数最小化的两个序列的总体(即覆盖完整序列的)比对结果。BLAST算法(Altschul等人(1990)JMolBiol215：403-10)计算序列同一性百分数并在两个序列之间开展相似性的统计分析。用于开展BLAST分析的软件是通过国家生物技术信息中心(NCBI)可公开获得的。同源物可以使用例如ClustalW多重序列比对算法(1.83版本)，以默认配对比对参数和百分数评分方法轻易地鉴定。相似性和同一性的总体百分数也可以使用MatGAT软件包中的可用方法之一确定(Campanella等，BMCBioinformatics.2003年7月10日；4：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一种应用(anapplicationthatgeneratessimilarity/identitymatricesusingproteinorDNAsequences))。如本领域技术人员显而易见，可以进行少许手工编辑以优化保守基序之间的比对。此外，作为使用全长序列以鉴定同源物的替代，也可以使用特定结构域。利用上文提及的程序，使用默认参数可以在完整核酸或氨基酸序列范围或保守基序范围内确定序列同一性值。
另外，GSBP样多肽(至少以它们的天然形式)一般具有RNA结合活性。用于测量RNA结合活性的工具和方法是本领域已知的。另外，当在稻GOS2启动子(SEQIDNO：3)控制下或在稻RCc3启动子控制下在稻中表达时，GSBP样多肽具有提高至少总种子产量(表述为种子总重量)的作用。
本发明通过用SEQIDNO：1所代表的核酸序列转化植物进行说明，其中所述核酸序列编码SEQIDNO：2的多肽序列。但是，本发明的实施不限于这些序列；本发明的方法可以有利地使用如本文中定义的编码GSBP样蛋白的任意核酸或GSBP样多肽实施。
编码GSBP样多肽的核酸的例子在本文实施例1的表A中给出。此类核酸用于实施本发明的方法中。在实施例1的表A中给出的氨基酸序列是由SEQIDNO：2所代表的GSBP样多肽的直向同源物和旁系同源物的示例序列，术语“直向同源物”和“旁系同源物”如本文中定义。其他直向同源物和旁系同源物可以通过开展所谓交互性blast搜索轻易地鉴定。通常，这包括第一BLAST，其中所述的第一BLAST包括将查询序列(例如使用实施例1的表A中列出的任意序列)针对任意序列数据库，如可公开获得的NCBI数据库进行BLAST。当从核苷酸序列开始时，一般使用BLASTN或TBLASTX(使用标准默认值)，并且当从蛋白质序列开始时，使用BLASTP或TBLASTN(使用标准默认值)。可以任选地筛选BLAST结果。筛选结果或非筛选结果的全长序列随后针对来自生物的序列进行反向BLAST搜索(第二BLAST)，其中查询序列从所述的生物中衍生(在查询序列是SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的情况下，第二BLAST因而将针对稻序列进行)。随后比较第一BLAST和第二BLAST的结果。若来自第一blast的高阶位命中是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到旁系同源物，随后一个反向BLAST理想地在最高命中当中产生该查询序列；若在第一BLAST中的高阶位命中不是源自与衍生查询序列的物种相同的物种，则鉴定到直向同源物，并且在反向BLAST时，优选地产生属于最高命中当中的该查询序列。
高阶位命中是具有低E-值的那些命中。E-值越低，评分越显著(或换句话说，偶然发现该命中的几率越低)。E-值的计算是本领域熟知的。除了E-值外，比较过程也通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在大型家族的情况下，可以使用ClustalW，随后使用邻接树法，以帮助观察相关基因的聚集和鉴定直向同源物和旁系同源物。
核酸变体也可以用于实施本发明的方法中。此类变体的例子包括编码在实施例1的表A中所给出任一氨基酸序列的同源物和衍生物的核酸，术语“同源物”和“衍生物”如本文中定义。还用于本发明方法中的是这样的核酸，其编码在实施例1的表A中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的同源物和衍生物。用于本发明方法中的同源物和衍生物与衍生它们的未修饰蛋白质具有基本上相同的生物学活性和功能活性。
在实施本发明方法中有用的其他核酸变体包括编码GSBP样多肽的核酸的部分、与编码GSBP样多肽的核酸杂交的核酸、编码GSBP样多肽的核酸的剪接变体、编码GSBP样多肽的核酸的等位变体和通过基因改组获得的编码GSBP样多肽的核酸的变体。术语“杂交序列”、“剪接变体”、“等位变体”和“基因改组作用”如本文中所述。
编码GSBP样多肽的核酸不必须是全长核酸，因为本发明方法的实施不取决于全长核酸序列的使用。根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A中给出的任一核酸序列的一部分或编码实施例1表A中所给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的一部分。
核酸的一部分可以例如通过对所述核酸产生一个或多个缺失而制备。所述部分可以以分离的形式使用或它们可以与其他编码(或非编码)序列融合，例如旨在产生联合有几种活性的蛋白质。与其他编码序列融合时，在翻译后产生的所得多肽可以比对于该蛋白质部分所预测的多肽更大。
在本发明方法中有用的部分编码如本文中定义的GSBP样多肽，并且基本上具有如实施例1的表A中所给出氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，此部分是在实施例1的表A中给出的任一核酸的一部分，或是编码在实施例1的表A中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸的一部分。优选地，该部分的长度是至少600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700个连续核苷酸，所述连续核苷酸属于实施例1的表A中给出的任一核酸序列或属于编码在实施例1的表A中所给出任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸。最优选地，该部分是SEQIDNO：1的核酸的一部分。优选地，该部分编码下述氨基酸序列的片段，其中所述氨基酸序列在构建进化系统树(如图3中所绘制的一个进化系统树)中使用时，与包含如SEQIDNO：2所代表的氨基酸序列的GSBP样多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
在本发明方法中有用的另一种核酸变体是能够在降低的严格条件下、优选地在严格条件下与编码如本文中定义的GSBP样多肽的核酸或与如本文中定义的部分杂交的核酸。
根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达能够与实施例1的表A中给出的任一核酸杂交的核酸，或包括在植物中导入并表达这样的核酸，其中所述核酸能够与编码在实施例1的表A中给出的任意核酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸杂交。
在本发明方法中有用的杂交序列编码如本文中定义的GSBP样多肽，其基本上具有实施例1的表A中所给出氨基酸序列相同的生物学活性。优选地，该杂交序列能够与实施例1的表A中给出的任一核酸或与这些序列中任意序列的一部分杂交，所述的一部分如上文定义，或所述杂交序列能够与编码在实施例1的表A中给出的任一氨基酸序列的直向同源物或旁系同源物的核酸杂交。最优选地，该杂交序列能够与SEQIDNO：1所代表的核酸或与其一部分杂交。
优选地，该杂交序列编码具有氨基酸序列的多肽，其中当所述氨基酸序列是全长并且在构建进化系统树(如图3中所绘制的一个进化系统树)中使用时，它与包含SEQIDNO：2所代表的氨基酸序列的GSBP样多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
在本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义的GSBP样多肽的剪接变体，剪接变体如本文中定义。
根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A中给出的任一核酸序列的剪接变体或编码实施例1表A中所给出任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的剪接变体。
优选的剪接变体是由SEQIDNO：1所代表的核酸的剪接变体，或是编码SEQIDNO：2的直向同源物或旁系同源物的核酸的剪接变体。优选地，由所述剪接变体编码的氨基酸序列在构建进化系统树(如图3中所绘制的一个进化系统树)中使用时，与包含如SEQIDNO：2所代表的氨基酸序列的GSBP样多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
在实施本发明方法中有用的另一种核酸变体是编码如上文所定义GSBP样多肽的核酸的等位变体，等位变体如本文中定义。
根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达实施例1的表A中给出的任一核酸的等位变体，或包括在植物中导入并表达编码在实施例1的表A中所给出任一氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物的核酸的等位变体。
在本发明方法中有用的等位变体基本上具有SEQIDNO：2的GSBP样多肽和实施例1的表A中所述任意氨基酸相同的生物学活性。等位变体存在于自然界中，并且在本发明的方法中包括这些天然等位基因的用途。优选地，所述等位变体是SEQIDNO：1的等位变体或编码SEQIDNO：2的直向同源物或旁系同源物的核酸的等位变体。优选地，由所述等位变体编码的氨基酸序列在构建进化系统树(如图3中所绘制的一个进化系统树)中使用时，与包含SEQIDNO：2所代表的氨基酸序列的GSBP样多肽聚类，而不与任何其他组聚类。
基因改组或定向进化也可以用来产生编码如上文定义的GSBP样多肽的核酸的变体；术语“基因改组”如本文中定义。
根据本发明，提供了用于增强植物中产量相关性状的方法，包括在植物中导入并表达在实施例1的表A中给出的任一核酸序列的变体，或包括在植物中导入并表达核酸的变体，所述的核酸编码在实施例1的表A中给出的任意氨基酸序列的直向同源物、旁系同源物或同源物，其中所述的变体核酸通过基因改组获得。
优选地，由通过基因改组获得的变体核酸编码的氨基酸序列在构建进化系统树(如图3中所绘制的一个进化系统树)中使用时，与包含SEQIDNO：2所代表的氨基酸序列的GSBP样多肽组聚类，而不与任何其他组聚类。
另外，核酸变体也可以通过位点定向诱变获得。几种方法可用于实现位点定向诱变，最常见的是基于PCR的方法(CurrentProtocolsinMolecularBiology.Wiley编辑)。
编码GSBP样多肽的核酸可以衍生自任何天然来源或人工来源。该核酸可以通过人类有意操作，在组成和/或基因组环境方面从其天然形式中修饰而来。优选地，编码GSBP样多肽的核酸来自植物，进一步优选地来自单子叶植物，更优选地来自禾本科(Poaceae)，最优选地该核酸来自稻(Oryzasativa)。
本发明方法的实施产生了具有增强的产量相关性状的植物。尤其，本发明方法的实施产生了相对于对照植物具有提高的产量、尤其提高的种子产量的植物。另外，本发明的方法产生具有提高的早期生长势的植物。术语“产量”、“种子产量”和“早期生长势”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
本文中谈及的增强的产量相关性状意指植物的一个或多个部分的生物量(重量)增加，所述的部分可以包括地上(可收获的)部分和/或(可收获的)地下部分。尤其，此类可收获部分是地上部分生物量和种子，并且本发明方法的实施导致了相对于对照植物的生物量和种子产量具有提高的地上部分生物量和提高的种子产量的植物。如本文中使用的术语“产量相关性状”也包括早期生长势。
以谷物(corn)为例，产量提高可以表现为以下一个或多个指标：每公顷或英亩已建立的植物数目增加、每株植物花序数的提高、行数、每行核粒数、核粒重、千粒核重、花序长度/直径的提高、种子充实率(即充实种子数除以种子总数并乘以100)提高，及其他。以稻为例，产量提高可以自身表现为下列一种或多种指标的提高：每公顷或英亩植物数、每株植物的花序数、每花序的小穗数、每个花序的花(小花)数目(其表述为充实种子数对原发花序数的比)、种子充实率(即充实种子数除以种子总数并乘以100)提高、千粒核重提高及其他。
本发明提供了用于相对于对照植物提高植物的产量、尤其地上部分生物量、种子产量，和/或早期生长势的方法，所述方法包括调节植物中编码如本文中定义的GSBP样多肽的核酸表达，优选地增加该核酸表达。
由于本发明的转基因植物具有提高的产量，故相对于对照植物的生长速率，这些植物有可能在其生活周期的对应阶段(在其生活周期的至少部分期间)表现提高的生长速率。
提高的生长速率可以是植物的一个或多个部分(包括种子)特有的，或可以基本上遍及整个植物。具有提到的生长速率的植物可以具备较短的生活周期。植物的生活周期可以意指从干燥成熟种子成长直至植物已经产生与起始材料相似的干燥成熟种子的阶段所需要的时间。这个生活周期可以受以下因素影响，如早期生长势、生长速率、绿度指数、开花时间和种子成熟速度。生长速率的提高可以在植物生活周期的一个或多个阶段上或在基本上整个植物生活周期期间发生。提高的生长速率在植物生活周期的早期期间可以反映增强的生长势。生长速率的提高可以改变植物的收获周期，从而允许植物较晚播种和/或较早收获，而这本来是不可能的(相似效果可以随较早的开花时间获得)。若生长速率充分提高，则可以允许进一步播种相同植物物种的种子(例如播种并收获稻植物，随后播种并收获其他稻植物，全部稻植物均处于一个常规生长时期中)。类似地，若生长速率充分地提高，可以允许进一步播种不同植物物种的种子(例如播种并收获谷物植物，随后例如播种并任选收获大豆、马铃薯或任何其他合适的植物)。在一些作物植物的例子中，来自相同根状茎的额外收获次数也可以是可能的。改变植物的收获周期可以导致每英亩一年生物量生产提高(原因在于可以培育并收获任何具体植物的次数(即在一年中)提高)。生长速率的提高也可以允许转基因植物在比其野生型对应物更广泛的地理区域内培育，因为培育作物的地域限制往往由栽种时期(早季)或在收获时期(晚季)的不利环境条件决定。这类不利条件可以避开，若缩短收获周期。生长速率可以通过从生长曲线获得多个参数而确定，此类参数可以是：T-Mid(植物达到50％最大植物大小所花费的时间)和T-90(植物达到90％最大植物大小所花费的时间)，以及其他。
根据本发明的优选特征，本发明方法的实施产生了相对于对照植物而言，具有提高的生长速率的植物。因此，根据本发明，提供了用于提高植物生长速率的方法，所述方法包括在植物中调节、优选地提高编码如本文中定义的GSBP样多肽的核酸表达。
与对照植物相比较，无论所述植物处于非胁迫条件下或无论所述植物暴露于多种胁迫，产量和/或生长速率的提高均出现。植物一般通过生长得更慢而应答于胁迫暴露。在严重胁迫条件下，植物甚至可以完全停止生长。另一方面，轻度胁迫在本文中定义为植物所暴露的任何下述胁迫，其中所述的胁迫未导致植物完全停止生长，但同时不能恢复生长。与非胁迫条件下的对照植物相比较，轻度胁迫在本发明意义中导致受胁迫植物的生长降低小于40％、35％或30％、优选地小于25％、20％或15％、更优选地小于14％、13％、12％、11％或10％或更低。由于农业实践(灌溉、施肥、杀虫剂处理)的进步，在栽培作物植物中并不经常遇到严重胁迫。因此，由轻度胁迫诱导的受损生长对于农业往往是不受欢迎的特征。轻度胁迫是植物所暴露的常见生物胁迫和/或非生物(环境)胁迫。非生物胁迫可以因干旱或过量的水、缺氧胁迫、盐胁迫、化学毒性、氧化胁迫和热、寒冷或冰冻温度所致。非生物胁迫可以是因水胁迫(尤其因为干旱)、盐胁迫、氧化胁迫或离子胁迫引起的渗透胁迫。生物胁迫一般是由病原体如细菌、病毒、真菌和昆虫引起的那些胁迫。
具体而言，本发明的方法可以在非胁迫条件下或在轻度干旱条件开展以产生相对于对照植物具有提高的产量的植物。如Wang等人(Planta(2003)218：1-14)中报道，非生物胁迫导致一系列不利地影响植物生长及生产量的形态学、生理学、生物化学和分子变化。干旱、盐度、极端温度和氧化胁迫已知是相互联系的并可以通过相似机制诱导生长损害及细胞损害。Rabbani等人(PlantPhysiol(2003)133：1755-1767)描述了干旱胁迫与高盐度胁迫之间极高程度的“交互作用”。例如，干旱和/或盐化作用主要表现为渗透胁迫，从而导致细胞内稳态和离子分布的破坏。经常伴随高温或低温、盐度或干旱胁迫的氧化胁迫可以引起功能性蛋白和结构蛋白变性。因此，这些多样的环境胁迫常常激活相似的细胞信号传导途径和细胞应答，如产生胁迫蛋白、上调抗氧化物质、积累兼容性溶质和生长停滞。如本文中所用的术语“非胁迫”条件是允许植物最佳生长的那些环境条件。本领域技术人员清楚对于给定地点的正常土壤条件和气候条件。
相对于在可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物提高的产量。因此，根据本发明，提供了用于在非胁迫条件下或在轻度干旱条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括增加植物中编码GSBP样多肽的核酸表达。
相对于在可比较条件下培育的对照植物，本发明方法的实施赋予在营养缺乏条件下、尤其在缺氮条件下培育的植物提高的产量。因此，根据本发明，提供了用于在营养缺乏条件下培育的植物中提高产量的方法，所述方法包括增加植物中编码GSBP样多肽的核酸表达。营养缺乏可以因营养素如氮、磷酸盐和其他含磷化合物、钾、钙、镉、镁、锰、铁和硼等缺少所致。
本发明包括通过本发明方法可获得的植物或其部分(包括种子)。所述植物或其部分包含编码如上文定义的GSBP样多肽的核酸转基因。
本发明也提供了基因构建体和载体以促进在植物中导入和/或表达编码GSBP样多肽的核酸。所述基因构建体可以插入适于转化至植物并适于在转化细胞中表达目的基因的载体，所述载体可以是市售的。本发明也提供了如本文中定义的基因构建体在本发明方法中的用途。
更具体地，本发明提供了构建体，其包含：
(a)编码如上文定义的GSBP样多肽的核酸；
(b)能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
(c)转录终止序列。
优选地，编码GSBP样多肽的核酸如上文定义。术语“调控序列”和“终止序列”如本文中的定义。
用包含任意上述核酸的载体转化植物。技术人员非常了解必须存在于所述载体上以便成功转化、选择和增殖含有目的序列的宿主细胞的遗传元件。该目的序列有效地与一个或多个调控序列(至少与启动子)连接。
有利地，任意类型的启动子，无论是天然的或人工的，可以用来驱动所述核酸序列的表达。组成型启动子是在所述方法中特别有用的。优选地，该组成型启动子至少在根中有活性，更优选地，该组成型启动子是遍在启动子。对于多种启动子类型的定义，见本文中的“定义”部分。在本发明方法中也有用的是根特异性启动子。
应当明白本发明的应用不限于由SEQIDNO：1代表的编码GSBP样多肽的核酸，本发明的应用也不限于当被组成型启动子驱动时或被根特异性启动子驱动时编码GSBP样多肽的核酸的表达。
组成型启动子优选地是GOS2启动子，优选地是来自稻的GOS2启动子。还优选地，所述组成型启动子由基本上与SEQIDNO：3相似的核酸序列代表，最优选地该组成型启动子如SEQIDNO：3所代表。对于组成型启动子的其他例子，见本文“定义”部分中的表2。
根据本发明的另一个优选特征，编码GSBP样多肽的核酸有效连接至根特异性启动子。该根特异性启动子优选地是RCc3启动子(PlantMolBiol.1995年1月；27(2)：237-48)，该RCc3启动子更优选地来自稻，RCc3启动子进一步优选地由基本上与SEQIDNO：4相似的核酸序列代表，该启动子最优选地由SEQIDNO：4代表。也可以用来实施本发明方法的其他根特异性启动子的例子在上文“定义”部分中的表3中显示。
任选地，可以在被导入植物的构建体中使用一个或多个终止子序列。额外的调节元件可以包括转录增强子以及翻译增强子。本领域技术人员将知道可能适用于实施本发明的终止子和增强子序列。如定义部分中描述，内含子序列也可以添加至5’非翻译区(UTR)或编码序列中，以提高细胞质内聚集的成熟信使的数量。(除启动子、增强子、沉默子、内含子序列、3’UTR和/或5’UTR区域之外的)其他调控序列可以是蛋白质/或RNA稳定元件。此类序列将是已知的或可以由本领域技术人员轻易获得。
本发明的基因构建体还可以包括对于在特定细胞类型中维持和/或复制所需要的复制起点序列。一个例子是当需要基因构建体作为游离型遗传元件(例如质粒或粘粒分子)在细菌细胞中维持时的复制起点。优选的复制起点包括但不限于f1-ori和colE1。
为检测如用于本发明方法中的核酸序列的成功转移和/或选择包含这些核酸的转基因植物，使用标记基因(或报道基因)是有利的。因此，所述基因构建体可以任选地包含选择标记基因。选择标记在本文的“定义”部分中更详细地描述。一旦不再需要所述标记基因时，可以从转基因细胞中去掉或切除它们。用于移出标记的技术是本领域已知的，有用的技术在上文定义部分中描述。
本发明也提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物相对于对照植物具有增强的产量相关性状，其中所述方法包括在植物中导入并表达编码如上文所定义的GSBP样多肽的任意核酸。
更具体地，本发明提供了用于产生转基因植物的方法，所述转基因植物具有增加的增强产量相关性状、尤其提高的生物量和/或(种子)产量，和/或提高的早期生长势，其中所述方法包括：
(i)在植物或植物细胞中导入并表达编码GSBP样多肽的核酸；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
(i)的核酸可以是能够编码如本文中定义的GSBP样多肽的任意核酸。
所述核酸可以直接导入植物细胞或导入植物自身(包括导入组织、器官或植物的任何其他部分)。根据本发明的优选特征，该核酸优选地通过转化作用导入植物。术语“转化”在本文的“定义”部分中更详细地描述。
可以通过技术人员熟悉的全部方法再生基因修饰的植物细胞。合适的方法可以在上文提及的S.D.Kung和R.Wu，Potrykus或和Willmitzer的出版物中找到。
通常在转化后，对植物细胞或细胞群体选择一个或多个标记的存在性，其中所述标记由随同目的基因一起共转移的植物可表达基因编码，随后将转化材料再生成完整植物。为了选择转化植物，在所述转化中获得的植物材料原则上经历选择性条件，从而转化植物可以与非转化植物区分。例如，可以将以上述方式获得的种子播种，并且在初始培育期间后，通过喷洒进行合适的选择。另一种可能性在于根据需要消毒后，在使用合适选择剂的琼脂板上培育种子，从而仅转化的种子可以长成植物。备选地，对所述转化植物筛选选择标记(如上文所述的选择标记)的存在性。
在DNA转移和再生后，推定转化的植物也可以例如使用DNA印迹分析对目的基因的存在性、拷贝数和/或基因组构造进行评价。备选地或额外地，新导入的DNA的表达水平可以使用RNA印迹分析和/或蛋白质印迹分析或这两种分析法监测，这两项技术均是本领域普通技术人员熟知的。
产生的转化植物可以通过多种方法繁殖，如通过克隆繁殖法或经典育种技术。例如，第一世代(或T1)转化植物可以进行自交并且选择纯合的第二世代(或T2)转化体，并且T2植物随后可以通过经典育种技术进一步繁殖。产生的转化生物可以采取多种形式。例如，它们可以是转化细胞和非转化细胞的嵌合体；克隆性转化体(例如，被转化以含有表达盒的全部细胞)；转化组织和非转化组织的移植体(例如在植物中，与未转化接穗嫁接的转化根状茎)。
本发明明确地扩展至由本文中所述的任意方法产生的任意植物细胞或植物，并扩展至全部植物部分及其繁殖体。本发明进一步扩展以包括已经由前述任意方法产生的原代转化或转染细胞、组织、器官或完整植物的子代，唯一要求是子代表现与如本发明方法中的亲代相同的基因型和/或表型特征。
本发明也包括含有编码如本文以上所定义GSBP样多肽的分离核酸的宿主细胞。本发明的优选宿主细胞是植物细胞。对于本发明方法中所用核酸或载体、表达盒或构建体或载体的宿主植物原则上有利地是能够合成在本发明方法中所使用多肽的全部植物。
本发明的方法有利地适用于任意植物。在本发明方法中特别有用的植物包括属于植物界(Viridiplantae)超家族、尤其单子叶和双子叶植物的全部植物，包括饲用或饲料豆科植物、观赏植物、粮食作物、树或灌木。根据本发明的一个优选实施方案，所述植物是作物植物。作物植物的例子包括大豆、向日葵、卡诺拉油菜、苜蓿、油菜、棉花、番茄、马铃薯和烟草。还优选地，所述植物是单子叶植物。单子叶植物的例子包括甘蔗。更优选地，所述植物是谷物植物。谷物植物的例子包括稻、玉米、小麦、大麦、谷子、黑麦、小黑麦属(triticale)、高粱和燕麦。
本发明也扩展至植物的可收获部分，例如但不限于种子、叶、果实、花、茎、根状茎、块茎和球茎。本发明进一步涉及了衍生自、优选直接衍生自此种植物的可收获部分的产品，如干燥颗粒或粉末、油、脂肪和脂肪酸、淀粉或蛋白质。
根据本发明的一个优选特征，受调节的表达是增加的表达。用于增加核酸或基因或基因产物表达的方法是本领域中充分经文献报道的并且在定义部分中提供了例子。
如上所述，用于调节(优选地增加)编码GSBP样多肽的核酸表达的优选方法是通过在植物中导入并表达编码GSBP样多肽的核酸；但是，实施本方法的效果，即增强产量相关性状，也可以使用包括但不限于T-DNA活化标签法、TILLING、同源重组在内的其他熟知技术实现。在定义部分中提供了对这些技术的描述。
本发明也包括编码如本文中所述GSBP样多肽的核酸的用途，和这些GSBP样多肽的用途，用于增强植物中任意的前述产量相关性状。
编码本文中所述GSBP样多肽的核酸或GSBP样多肽自身可以用于育种程序中，在所述育种程序中鉴定到可以遗传地与编码GSBP样多肽的基因连锁的DNA标记。所述核酸/基因或GSBP样多肽自身可以用来定义分子标记。这种DNA或蛋白质标记随后可以在育种程序中用来在本发明的方法中选择具有如上文所定义的增强的产量相关性状的植物。
编码GSBP样多肽的核酸/基因的等位变体也可以用于标记辅助的育种程序中。此类育种程序有时需要使用例如EMS诱变法通过对植物进行诱变处理而导入等位变异；备选地，所述程序可以从收集并非故意造成的所谓“自然”源性等位变体开始。随后进行等位变体的鉴定，例如通过PCR法。此后是步骤：选择所讨论和导致产量提高的序列的优异等位变体。选择一般通过监测含有所讨论序列的不同等位变体的植物的生长性能而实施。生长性能可以在温室或在田间监测。其他任选步骤包括将其中鉴定到优异等位变体的植物与另一种植物杂交。这可能用来例如产生感兴趣的表型特征组合。
编码GSBP样多肽的核酸也可以作为探针用于遗传地或物理地绘制所述探针构成其一部分的基因并且用作与这些基因连锁的性状的标记。此类信息可以用于植物育种中，以开发具有所希望表型的品系。编码GSBP样多肽的核酸的这种用途仅需要具有至少15个核苷酸长度的核酸序列。编码GSBP样多肽的核酸可以用作限制性片段长度多态性(RFLP)标记。限制性消化的植物基因组DNA的DNA印迹物(SambrookJ，FritschEF和ManiatisT(1989)MolecularCloning，ALaboratoryManual)可以用编码GSBP样蛋白的核酸探测。所得的结合图式随后可以使用计算机程序如MapMaker(Lander等人(1987)Genomics1：174-181)进行遗传分析以构建遗传图。此外，该核酸可以用来探测含有一组个体的限制性核酸内切酶处理的基因组DNA的DNA印迹物，其中所述的一组个体代表具有定义的遗传杂交的亲代和子代。DNA多态性的分离是明显的并用来计算编码GSBP样多肽的核酸在先前使用这个群体获得的遗传图中的位置(Botstein等人(1980)Am.J.Hum.Genet.32：314-331)。
在Bernatzky和Tanksley(1986)PlantMol.Biol.Reporter4：37-41中描述了植物基因来源的探针的产生及其在遗传作图中的用途。许多出版物描述了使用以上概述的方法学或其变例对特定cDNA克隆的遗传作图。例如，F2互交群、回交群、随机交配群、邻近纯合系和其他个体群体可以用于作图。此类方法学是本领域技术人员熟知的。
所述核酸探针也可以用于物理作图(即序列在物理图上的排列；见Hoheisel等在：Non-mammalianGenomicAnalyasis：APracticalGuide，Academicpress1996，第319-346页及其中引用的参考文献)。
在另一个实施方案中，所述核酸探针可以在直接荧光原位杂交(FISH)作图法(Trask(1991)TrendsGenet.7：149-154)中使用。尽管当前的FISH作图法支持使用大的克隆(几个kb至几百个kb；见Laan等人(1995)GenomeRes.5：13-20)，然而灵敏度的改善可以允许使用更短探针进行FISH作图。
用于遗传作图及物理作图的多种基于核酸扩增的方法可以使用所述核酸而实施。方法例子包括等位基因特异性扩增法(Kazazian(1989)J.Lab.Clin.Med11：95-96)、PCR扩增片段的多态性(CAPS；Sheffield等人(1993)Genomics16：325-332)、等位基因特异性连接(Landegren等人(1988)Science241：1077-1080)、核苷酸延伸反应(Sokolov(1990)NucleicAcidRes.18：3671)、放射杂交作图(Walter等人(1997)Nat.Genet.7：22-28)和Happy作图法(Dear和Cook(1989)NucleicAcidRes.17：6795-6807)。对于这些方法，使用一种核酸的序列来设计并产生在扩增反应或在引物延伸反应中使用的引物对。此类引物的设计是本领域技术人员熟知的。在使用基于PCR遗传作图的方法中，可能需要在对应于当前核酸序列的区域中鉴定作图交叉的亲代之间的DNA序列差异。但是，这通常对作图法而言不是必需的。
如前文所述，本发明方法产生了具有增强的产量相关性状的植物。这些性状也可以与经济上有利的其他性状组合，如其他的产量增强性状、针对其他非生物胁迫和生物胁迫的耐受性、调节多种构造性特征和/或生物化学特征和/或生理学特征的性状。
附图简述
本发明现在将参考以下图进行描述，其中：
图1显示了一种GSBP样蛋白(在此为SEQIDNO：2)的结构域结构。用Pfam鉴定的NTF2结构域以粗体显示，(用SMART鉴定的)RRM结构域加下划线。两个RGD基序加下划线并以斜体表示。
图2表示在本发明方法中有用的多种GSBP样蛋白的多重比对结果。星号表示绝对保守的氨基酸，冒号指示高度保守的替换并且点号指示保守性较小的替换。
图3显示在本发明方法中有用的GSBP样蛋白的进化系统树。对每种蛋白质给出数据库登录号；SEQIDNO：2表示为NP_001050377。括号阐述了来自外组(outgroup)的GSBP样蛋白组。
图4表示用于稻中增加在稻GOS2启动子(pGOS2)控制下编码GSBP样蛋白的核酸表达的双元载体。用在RCc3启动子控制下的稻GSBP样蛋白创建了相似的构建体。
图5详述了在实施本发明方法中有用的诸序列的例子。
实施例
本发明现在参考如下实施例进行描述，所述实施例仅是示意性的。以下实施例不意图完全限定或限制本发明的范围。
DNA操作：除非另外说明，重组DNA技术根据(Sambrook(2001)MolecularCloning：alaboratorymanual，第3版ColdSpringHarborLaboratoryPress，CSH，NewYork)或Ausubel等人(1994)，CurrentProtocolsinMolecularBiology，CurrentProtocols第1卷和第2卷中描述的标准方案进行。用于植物分子研究工作的标准材料和方法在BIOS科学出版有限责任公司(BIOSScientificPublicationsLtd(英国))和Blackwell科学出版社(BlackwellScientificPublications(英国))出版的R.D.D.Croy的PlantMolecularBiologyLabfax(1993)中描述。
实施例1：鉴定与本发明方法中所用核酸序列相关的序列
用数据库搜索工具如基本局部比对工具(BLAST)(Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215：403-410；和Altschul等人(1997)NucleicAcidsRes.25：3389-3402)，在国家生物技术信息中心(NCBI)的Entrez核苷酸数据库中维护的那些序列中鉴定到与本发明方法中所用核酸序列相关的(全长cDNA、EST或基因组)序列。使用该程序通过将核酸序列或多肽序列与序列数据库比较并且计算匹配的统计显著性来找到序列之间的局部相似性区域。由与本发明方法中所用核酸编码的多肽用于TBLASTN算法，采用默认设置和过滤程序以忽略低复杂性序列启动(setoff)。这种分析的结果通过配对比较进行观察，并根据概率评分(E-值)进行评级，其中所述的评分反映特定比对结果因偶然发生的概率(E-值越低，命中的显著性越高)。除了E-值外，比较过程也可以通过同一性百分数评分。同一性百分数指两个所比较的核酸(或多肽)序列之间特定长度范围内相同的核苷酸(或氨基酸)的数目。在一些情况下，可以调整默认参数以修改搜索的严格性。例如，可以提高E-值以显示更少的严格匹配。以这种方式，可以鉴定到几乎完美的短匹配。
表A提供了与本发明方法中所用核酸序列相关的核酸序列名单。
表A：GSBP样多肽的例子：
植物来源 核酸SEQ ID NO： 蛋白质SEQ ID NO：
稻 1 2
稻 7
稻 8
稻 9 10
稻 11
拟南芥 12 13
拟南芥 14 15
稻 16 17
红车轴草(Trifolium pratense) 18 19
拟南芥 20 21
猕猴(Macaca mulatta) 22 23
红车轴草 24 25
稻 26 27
蒺藜苜蓿 28 29
(Medicago truncatula)
智人(Homo sapiens) 30＊ 31
稻 32 33
＊：DNA序列缺少蛋白质序列的氨基末端
在一些情况下，相关序列已经由研究机构如基因组研究机构(TIGR)初步地汇编并且公开地公开。可以使用真核生物基因直向同源物(EGO)数据库来鉴定此类相关序列，这可通过关键词搜索或通过使用BLAST算法以目的核酸或多肽序列进行。
实施例2：GSBP样多肽序列的比对
多肽序列的比对使用来自VectorNTI(Invitrogen)的AlignmentX程序进行，其中所述AlignmentX程序基于受欢迎的累进比对Clustal算法(Thompson等人(1997)NucleicAcidsRes25：4876-4882；Chenna等人(2003)，NucleicAcidsRes31：3497-3500)。空位开口罚分的默认值是10，空位延伸罚分0.1并且所选的权重矩阵是Blosum62(若比对多肽)。进行少许手工编辑以优化该比对。诸GSBP样多肽当中的序列保守性分布在整个蛋白质序列范围内，但是特别发现存在于NTF2结构域和RRM结构域中。另外，从比对结果中轻易可识别出R和G残基在羧基端部分富集。在图2中比对了诸GSBP样多肽。
使用如VectorNTI(Invitrogen)的AlignX程序中所提供的邻接法聚类算法构建GSBP样多肽的进化系统树(图3)。
实施例3：在实施本发明方法中有用的多肽序列之间的总体同一性百分数的计算
使用现有技术领域可获得的方法之一，即MatGAT(矩阵总体比对工具)软件(BMCBioinformatics.20034：29.MatGAT：使用蛋白质序列或DNA序列产生相似性/同一性矩阵的一项应用(anapplicationthatgeneratessimilarity/identitymatricesusingproteinorDNAsequences)，CampanellaJJ，BitinckaL，SmalleyJ；该软件由LedionBitincka维护)确定在实施本发明方法中有用的全长多肽序列之间的总体相似性和同一性百分数。MatGAT软件对DNA序列或蛋白质序列产生相似性/同一性矩阵，无需预先比对数据。该程序使用Myers和Miller总体比对算法(空位开口罚分12和空位延伸罚分2)执行一系列配对比对，使用例如Blosum62(对于多肽而言)计算相似性和同一性并且随后将结果置于距离矩阵内。在分割线下半部分显示序列相似性，和在对角分割线的上半部分显示序列同一性。
比较中使用的参数是：
评分矩阵Blosum62
第一空位：12
延伸空位：2
表B中显示在多肽序列的全长范围内总体相似性和同一性的软件分析结果。在对角线上方以粗体给出同一性百分数而在对角线下方(正常字体)给出相似性百分数。
与SEQIDNO：2相比较，在实施本发明方法中有用的GSBP样多肽序列之间的百分数同一性可以低至yy％氨基酸同一性。
实施例4：鉴定在实施本发明方法中有用的多肽序列中所包含的结构域
蛋白质家族、结构域和位点的集成资源(InterPro)数据库是针对基于文本及基于序列的搜索法的常用特征标识数据库的集成界面。InterPro数据库合并了这些数据库，所述数据库使用不同的方法学及不同程度的有关充分表征的蛋白质的生物学信息以获得蛋白质特征标识(proteinsignatures)。合作数据库包括SWISS-PROT、PROSITE、TrEMBL、PRINTS、ProDom和Pfam、Smart和TIGRFAM。Pfam是覆盖许多常见蛋白质结构域和家族的多重序列比对结果和隐匿马尔科夫模型的庞大集合。Pfam在英国Sanger研究所服务器上维护。Interpro由英国欧洲生物信息学研究所维护。
在表C中呈现了SEQIDNO：2所代表的多肽序列的InterPro扫描结果。
表C：SEQIDNO：2所代表的多肽序列的InterPro扫描结果(主要登录号)
数据库 登录号 登录名称 在SEQ IDNO 2上的氨基酸坐标
PFAM PF00076 RRM_1 302-372
SMART SM00360 RRM 301-373
PROFILE PS50102 RRM 300-377
PFAM PF02136 NTF2 17-133
PROFILE PS50177 NTF2_DOMAIN 17-133
GENE3D G3DSA：3.30.70.330 无描述 261-408
GENE3D G3DSA：3.10.450.50 无描述 8-139
PANTHER PTHR10693 结合RNA的RAS-GAPSH3结合蛋白相关的 24-460
实施例5：在实施本发明方法中有用的多肽序列的拓扑结构预测
TargetP1.1预测真核生物蛋白的亚细胞定位。基于任何氨基端前序列：叶绿体转运肽(cTP)、线粒体靶向肽(mTP)或分泌途径信号肽(SP)的预测存在性进行定位指派。作为最终预测基础的评分并不真正是概率，并且它们不是必需地加合成一体。但是，根据TargetP，具有最高评分的定位是最可能的，并且评分之间的关系(可靠性级别)可以指示该预测具有多大确定性。可靠性级别(RC)范围从1至5，其中1表示最可靠的预测。TargetP在丹麦技术大学(TechnicalUniversityofDenmark)的服务器上维护。
对于预测含有氨基端前序列的序列而言，也可以预测潜在的切割位点。
可以选择许多参数，如生物组别(非植物或植物)、临界值集合(无、预定义的临界值集合或用户指定的临界值集合)和切割位点预测的计算(是或否)。
在表D中呈现了SEQIDNO：2所代表的多肽序列的TargetP1.1分析的结果。选择“植物”生物组别，未定义临界值，并且对转运肽的预测长度提出要求。如SEQIDNO：2所代表的多肽序列的亚细胞定位可以是细胞质或细胞核，没有预测到转运肽。
表D：如SEQIDNO：2所代表的多肽序列的TargetP1.1分析结果
长度(AA) 488
叶绿体转运肽 0.076
线粒体转运肽 0.179
分泌途径信号肽 0.124
其他亚细胞定位 0.672
预测位置 /
可靠性级别 3
预测的转运肽长度 /
许多其他算法可以用来进行此类分析，包括：
·在丹麦技术大学服务器上维护的ChloroP1.1；
·在澳大利亚布里斯班昆士兰大学生物科学研究所的服务器上维护的ProteinProwler亚细胞定位预测者1.2版；
·在加拿大阿伯特省埃德蒙顿市阿尔伯塔大学的服务器上维护的PENCE蛋白组分析专家PA-GOSUB2.5；
·在丹麦技术大学服务器上维护的TMHMM。
实施例6：在本发明方法中所用的核酸序列的克隆
本发明方法中所用的核酸序列通过PCR，使用定制的稻幼苗cDNA文库(在pCMVSport6.0中；Invitrogen，Paisley，UK)作为模板进行扩增。使用HifiTaqDNA聚合酶，在标准条件下利用在50μlPCR混合物中的200ng模板进行PCR。所用的引物是prm8784(SEQIDNO：5；有义，起始密码子为粗体字)：
5’ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggcttaaacaatggcagtgcaagctggaa3’
和prm8783(SEQIDNO：6；反义，互补)：
5’ggggaccactttgtacaagaaagctgggtcatcattgccctcctctatgc3’，
其中所述引物包括用于Gateway重组的AttB位点。也使用标准方法纯化扩增的PCR片段。随后进行Gateway方法的第一步骤，即BP反应，在此期间根据Gateway术语学，所述PCR片段与pDONR201质粒在体内重组以产生“进入克隆”，pGSBP样。质粒pDONR201作为技术的部分从Invitrogen购买。
包含SEQIDNO：1的进入克隆随后在LR反应中与用于稻转化法的目的载体一起使用。这种载体含有在T-DNA边界内部的植物选择标记、筛选标记表达盒和意图与已经克隆在该进入克隆中的目的核酸序列发生LR体内重组的Gateway盒作为功能性元件。用于根特异性表达的稻GOS2启动子(SEQIDNO：3)位于该Gateway盒上游。
在所述LR重组步骤后，所得表达载体pGOS2::GSBP样(图4)根据本领域熟知的方法转化入农杆菌菌株LBA4044。
用RCc3启动子(SEQIDNO：4)控制下的GSBP样蛋白编码序列产生第二构建体(pRCc3::GSBP样)，但是其他方面与pGOS2::GSBP样载体相同，并且将所述载体用于植物转化。
实施例7：植物转化
稻转化
使用含有所述表达载体的农杆菌来转化稻植物。将稻粳型栽培品种Nipponbare的成熟干燥种子脱壳。通过如下方式实施消毒：在70％乙醇中孵育1分钟，随后在0.2％HgCl2中孵育30分钟，随后用无菌蒸馏水洗涤6次15分钟。无菌的种子随后在含有2，4-D的培养基(愈伤组织诱导培养基)上萌发。在黑暗中孵育4周后，将胚发生的盾片衍生的愈伤组织切下并在相同的培养基上增殖。2周后，将所述愈伤组织通过在同一种培养基上传代培养另外2周进行繁殖或增殖。胚发生的愈伤组织片在新鲜培养基上传代培养3日，随后共培育(以助长细胞分裂活性)。
将含有所述表达载体的农杆菌菌株LBA4404用于共培育。农杆菌接种在含有适宜抗生素的AB培养基上并在28℃培养3日。随后收集细菌并在液体共培育培养基中悬浮至密度(OD600)约1。该悬液随后转移至培养皿内并将所述愈伤组织浸没于此悬液中15分钟。该愈伤组织随后在滤纸上蘸干并转移至固化的共培育培养基，并在25℃于黑暗中孵育3日。共培育的愈伤组织在含2，4-D的培养基上在28℃于黑暗中在选择剂存在下培育4周。在此期间，迅速生长的抗性愈伤组织团发育。将这种材料转移至再生培养基并在光照下孵育后，释放了胚发生潜能并且苗在随后4至5周内发育。将苗从愈伤组织上切下并且在含有植物生长素的培养基上孵育2至3周，将苗从所述培养基转移至土壤。硬化的苗在温室中于高湿度和短日照下培育。
对于一个构建体，产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养箱转移至温室。在定量PCR分析验证T-DNA插入物的拷贝数后，仅保留针对所述选择剂显示抗性的单拷贝转基因植物用于收获T1种子。种子随后在移栽后3至5个月收获。该方法以超过50％的比例产生单基因座转化体(Aldemita和Hodges1996，Chan等1993，Hiei等1994)。
玉米转化
玉米(Zeamays)的转化用Ishida等人(1996).NatureBiotech14(6)：745-50所述方法的改良方法进行。在玉米中，转化是基因型依赖的并且仅特定基因型适合于转化和再生。近交系A188(明尼苏达大学)或以A188作为亲本的杂交体是用于转化的供体材料的良好来源，但是其他基因型也可以成功地使用。谷穗在授粉后大约11日(DAP)从玉米植物收获，此时不成熟胚的长度是大约1至1.2mm。不成熟的胚与含有所述表达载体的根癌农杆菌共培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。切下的胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在玉米再生培养基上培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但是可以使用不同的选择标记)。培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至苗发育。将源自每个胚的绿色苗转移至玉米生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。生根的苗移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
小麦转化
小麦的转化用Ishida等人(1996)NatureBiotech14(6)：745-50描述的方法进行。栽培品种Bobwhite(可从墨西哥CIMMYT获得)通常用于转化中。不成熟的胚与含有所述表达载体的根癌农杆菌培育，并且转基因植物通过器官发生过程回收。在与农杆菌培育后，所述胚在愈伤组织诱导培养基上、随后在再生培养基上体外培育，其中所述的培养基含有选择剂(例如咪唑啉酮，但是可以使用不同的选择标记)。培养板在25℃于光照下孵育2-3周，或直至苗发育。将源自每个胚的绿色苗转移至生根培养基并在25℃孵育2-3周，直至根发育。将生根的苗移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
大豆转化
根据对TexasA&M美国专利5,164,310中所述方法的改良方法转化大豆。几个商业大豆品种适合于通过这种方法转化。栽培品种Jack(从Illinois种子基金会可获得)通常用于转化。对大豆种子消毒以便体外播种。将下胚轴、胚根和一片子叶从7日龄年幼籽苗中切下。进一步培育上胚轴和剩余子叶以使腋生节发育。切下这些腋生节并与含有所述表达载体的根癌农杆菌孵育。在共培育处理之后，洗涤外植体并转移至选择培养基。切下再生的苗并置于苗伸长培养基上。将长度不超过1cm的苗置于生根培养基上直至根发育。生根的苗移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
油菜籽/卡诺拉油菜转化
使用5-6日龄年幼籽苗的子叶柄和下胚轴作为用于组织培养的外植体并且根据Babic等人(1998，PlantCellRep17：183-188)进行转化。商业品种Westar(AgricultureCanada)是用于转化的标准品种，但是其他品种也可以使用。对卡诺拉油菜种子进行表面消毒以便体外播种。从所述体外籽苗切下附带子叶的子叶柄外植体，并且通过将此叶柄外植体的切口末端浸入细菌悬液以(含有所述表达载体的)农杆菌接种。所述外植体随后在23℃，16小时光照下于含有3mg/lBAP、3％蔗糖、0.7％植物琼脂的MSBAP-3培养基上培养2日。与农杆菌共培育2日后，将所述叶柄外植体转移至含有3mg/lBAP、头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀(300mg/l)的MSBAP-3培养基上培养7日，并且随后在含有头孢噻肟、羧苄青霉素或特美汀和选择剂的MSBAP-3培养基上培养，直至苗再生。当苗长度是5-10mm时，切下这些苗并转移至苗伸长培养基(MSBAP-0.5，含有0.5mg/lBAP)。将长度大约2cm的苗转移至生根培养基(MS0)用于根诱导。将生根的苗移植至温室中的土壤内。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
苜蓿转化
使用(McKersie等，1999PlantPhysiol119：839-847)的方法转化苜蓿的再生性克隆。苜蓿的再生和转化是基因型依赖性的并且因而需要再生性植物。已经描述了获得再生性植物的方法。例如，这些再生性植物可以选自栽培品种Rangelander(AgricultureCanada)或如BrownDCW和AAtanassov(1985.PlantCellTissueCulture4：111-112)所述的任何其他商业苜蓿品种。备选地，已经选择RA3品种(威斯康星大学)用于组织培养(Walker等，1978AmJBot65：654-659)。叶柄外植体与含有所述表达载体的根癌农杆菌C58C1pMP90(McKersie等，1999PlantPhysiol119：839-847)或LBA4404的过夜培养物共培育。所述外植体在黑暗中于含有288mg/LPro、53mg/L硫代脯氨酸、4.35g/LK2SO4和100μm乙酰丁香酮的SH诱导培养基上共培育3日。所述外植体在浓度减半的Murashige-Skoog培养基(Murashige和Skoog，1962)中洗涤并铺种在不含乙酰丁香酮而含有合适选择剂和抑制农杆菌生长的合适抗生素的相同SH诱导培养基上。几周后，将体细胞胚转移至不含生长调节剂、不含抗生素和含有50g/L蔗糖的BOi2Y发育培养基中。体细胞胚随后在半浓度的Murashige-Skoog培养基上萌发。生根的籽苗移植至花钵内并且在温室中培育。从针对所述选择剂显示耐受性并且含有单拷贝T-DNA插入物的植物产生T1种子。
实施例8：表型评价方法
8.1评价建立
产生大约35个独立的T0稻转化体。将原代转化体从组织培养室转移至温室以培育和收获T1种子。保留5个事件(对于pGOS2::GSBP-样构建体)或6个事件(对于pRCc3::GSBP-样构建体)，其中所述事件的T1子代对于存在/不存在转基因以3∶1分离。对于这些事件中的每一个事件，通过监测目视标记表达而选出大约10株含有该转基因的T1籽苗(杂合子和纯合子)和大约10株缺少该转基因的T1籽苗(失效合子)。转基因植物和相应的失效合子以随机的位置并排培育。温室条件是短日照(12小时光照)，在光照下28℃和在黑暗中22℃，和70％相对湿度。
pGOS2::GSBP-样构建体的5个T1事件在T2世代中按照如对T1世代相同的评价方法进一步评估，但是每个事件采用更多个体。植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
干旱筛选
来自T2种子的植物在盆栽土壤中在正常条件下培育直至它们达到抽穗期。随后将它们转移至其中减少灌溉的“干燥”区域。将湿度探针插入随机选择的花钵内，以监测土壤水分含量(SWC)。当SWC下降低于某个阈值时，自动地对所述植物连续地再灌溉直至再次达到正常水平。随后将植物再次转移至正常条件。其余的培育(植物成熟、种子收获)与不在非生物胁迫条件下培育的植物相同。如对正常条件下详述那样记录生长和产量参数。
氮使用效率筛选
源自T2种子的稻植物在盆栽土壤中于正常条件下培育，除了营养溶液之外。从移植至成熟期间用氮(N)浓度降低、通常7至8倍之间降低的特定营养溶液浇灌所述花钵。其余的培育(植物成熟、种子收获)与并不在非生物胁迫下培育的植物相同。如对正常条件下详述那样记录生长和产量参数。
统计分析：F-检验
使用两因素ANOVA(变量分析)作为整体评价植物表型特征的统计模型。对于用本发明基因转化的全部事件的全部植物的全部所测量参数实施F检验。实施F检验以检查该基因对全部转化事件的影响并验证该基因的整体作用(又称作基因总体作用)。真实基因总体作用显著性的阈值对于所述F检验设置在5％概率水平上。显著性F检验值指出基因作用，这意味不仅仅是基因的存在或位置才造成表型上的差异。
因为实施了具有重叠事件的两个实验，故而进行联合分析。这用于检验对这两个实验影响的一致性，并且若是一致的，则用于积累来自两个实验的证据以提高结论的可信度。所用方法是考虑数据的多重水平结构的混合模型法(即实验-事件-分离子)。通过比较似然比检验与卡方分布(chisquaredistribution)获得P-值。
8.3测量的参数
生物量相关的参数测量
植物从播种期至成熟期数次通过数字成像室。在每个时间点上，从至少6个不同角度拍摄每株植物的数字图像(2048x1536像素，1600万颜色)。
植物地上部分面积(或叶生物量)通过计数来自植物地上部分的数字图像上区别于背景的像素总数而确定。该值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值(physicalsurfacevalue)。实验证实以这种方式测量的地上部分植物面积与地上植物部分的生物量相关。地上部分面积是植物已经实现其最大叶生物量的时间点上所测量的面积。早期生长势是萌发后3周的植物(籽苗)地上部分的面积。
早期生长势通过计数来自植物部分的区别于背景的像素总数确定。该值对相同时间点上从不同角度拍摄的画面进行平均化并且转化成通过校正以平方mm表述的物理表面值。下述结果针对萌发后3周的植物。
种子相关的参数测量
将成熟的原发花序收获、计数、装袋、加条形码标记并且随后在干燥箱内于37°干燥3日。随后将所述花序脱粒，并且收集和计数全部种子。充实粒使用吹气装置与空粒分开。弃去空粒并且再次计数剩余部分。充实粒在分析天平上称重。充实种子数通过计数所述分离步骤后仍留下的充实粒的数目来确定。种子总产量通过称量从一株植物收获的全部充实粒而测量。每株植物的种子总数通过计数从一株植物收获的壳数目测量。从计数的充实种子数及其总重量外推出千粒核重(TKW)。收获指数(HI)在本发明中定义为种子总产量与地上部分面积(mm2)之间的比率，乘以系数106。如本发明中定义的每花序总花数是种子总数与成熟原发花序之间的比例。如本发明中定义的种子充实率是充实种子数对种子(或小花)总数的比例(表述为％)。
实施例9：转基因植物的表型评价结果
对于用pGOS2::GSBP样构建体或pRCc3::GSBP样构建体转化并在非胁迫条件下培育的植物，观察到地上部分生物量(AreaMax)、总种子产量、充实种子数和每花序花数目中至少之一提高大于5％。
对于用pGOS2::GSBP样构建体或pRCc3::GSBP样构建体转化并在干旱胁迫条件下培育的植物，观察到地上部分生物量(AreaMax)、出苗生长势(早期生长势)、总种子产量、充实种子数、充实率、收获指数中至少之一提高大于5％，并且观察到千粒核重提高大于2％。
植物功能基因组中心
<120>具有增强的产量相关性状的植物和用于制备该植物的方法
<130>PF59395
<160>41
<170>PatentIn版本3.3
<210>1
<211>1515
<212>DNA
<213>稻(Oryzasativa)
<400>1
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gcccccaagtgattagtggtgcatttgttcagcaatattaccacattctacatgagacac120
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cttctaatgatgagcaaggttactcagtttttgtgaagagtttgcctcacaatgtgacag960
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ggaggttcacccgagtcaacggccctaggcaaacaccggttgcggcatagaggagggcaa1500
tgatgacccagcttt1515
<210>2
<211>488
<212>PRT
<213>稻
<400>2
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151015
IleSerGlyAlaPheValGlnGlnTyrTyrHisIleLeuHisGluThr
202530
ProAspGlnValTyrLysPheTyrGlnAspAlaSerIleValGlyArg
354045
ProAspSerAsnGlyValMetLysTyrValSerThrThrAlaAspIle
505560
AsnLysThrIleLeuSerMetAspPheSerAsnTyrLeuThrGluIle
65707580
GluThrAlaAspAlaGlnLeuSerHisGlnAspGlyValLeuIleVal
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ValThrGlySerLeuThrSerGluGlyIleCysArgArgPheThrGln
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115120125
AspIlePheArgPheIleValGluArgProProValAlaIleSerGln
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ValSerGlnGluAsnGluAsnAsnGlnAsnThrAlaThrLeuProGlu
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ThrAspProAsnProAlaGlyAspGlyMetIleSerGluProValAla
165170175
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195200205
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245250255
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ProArgGlnThrProValAlaAla
485
<210>3
<211>2194
<212>DNA
<213>稻
<400>3
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<210>4
<211>1264
<212>DNA
<213>稻
<400>4
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cgggcggagatcaaggcggtggacgcgcaggagtcgctgggcgggggcgtcacggtgctc120
gtcacgggccacctcaccgggagcgacgacgtgcgcagggagttctcgcagtccttcttc180
ctcgcgccgcaggagaagggatacttcgtgctcaacgacatcctgcgctacgtcgggggg240
gagggggatcaggaggtggagccggagccggagctggagctgtcgtttccgccgtcgcag300
cagccggattcggtgcctgctccttcggcgaatggcactagcgtgccgcgggaacaggag360
gccttctcgcagccggagcagcatgtggctgatcctgcacccaatgctcaggaggctgat420
ctcaacggcgaggaggtttataacccaccgaacaacacagaggggcctgttgtggaggaa480
acgccgattcctgaagttatagatgaagtgccaaataacgtagctgtggctatgccgact540
ccgtctgccctgcccctgcccctgcccctgtaccacaagaggaggcccccaagaagtcgt600
atgcttcaattgccggcaccaccaaaacaagagaagcaagttgctcctgcacctgttgct660
ccggttgctgatgctccaactttcagtcctaatcctgaaagcagcaacattcaagaggct720
gaagttgatgcacatgcgatatatgtacggaatctgcctttaagtgccacgcctgaacaa780
ttagaagaagcattcaagaaatttggcgctatcaagccggacggaatccaagttagaagt840
cacaagattcaagggttctgctatgggtttgtagagtttgaagatcccagttcagttcaa900
agtgcaattgcgggttctcctgtgacgattagtgaccggcaatgttatgtggaggaaaag960
agaactgctggttcacgtggtggtggcagaggaaggtttgctcctggtagaggtggtaac1020
ttccgaggtgaaggcatgagaggccgcgggaattacaccggagggaggggctatggaagg1080
ggtgagttcaattatcgatccgactatggaggcagaggcgctggtagaggtggttcatca1140
cgtggtggtgatgttggctaccagcgggttgaccactctgctggtcgtgctgctcgggcg1200
ccatcgggcactagtgccgttgcaaagtga1230
<210>33
<211>409
<212>PRT
<213>稻
<400>33
MetAspThrValThrThrMetGluAlaIleAsnAlaLysIleValSer
151015
MetAspIleValArgAlaGluIleLysAlaValAspAlaGlnGluSer
202530
LeuGlyGlyGlyValThrValLeuValThrGlyHisLeuThrGlySer
354045
AspAspValArgArgGluPheSerGlnSerPhePheLeuAlaProGln
505560
GluLysGlyTyrPheValLeuAsnAspIleLeuArgTyrValGlyGly
65707580
GluGlyAspGlnGluValGluProGluProGluLeuGluLeuSerPhe
859095
ProProSerGlnGlnProAspSerValProAlaProSerAlaAsnGly
100105110
ThrSerValProArgGluGlnGluAlaPheSerGlnProGluGlnHis
115120125
ValAlaAspProAlaProAsnAlaGlnGluAlaAspLeuAsnGlyGlu
130135140
GluValTyrAsnProProAsnAsnThrGluGlyProValValGluGlu
145150155160
ThrProIleProGluValIleAspGluValProAsnAsnValAlaVal
165170175
AlaMetProThrProSerAlaLeuProLeuProLeuProLeuTyrHis
180185190
LysArgArgProProArgSerArgMetLeuGlnLeuProAlaProPro
195200205
LysGlnGluLysGlnValAlaProAlaProValAlaProValAlaAsp
210215220
AlaProThrPheSerProAsnProGluSerSerAsnIleGlnGluAla
225230235240
GluValAspAlaHisAlaIleTyrValArgAsnLeuProLeuSerAla
245250255
ThrProGluGlnLeuGluGluAlaPheLysLysPheGlyAlaIleLys
260265270
ProAspGlyIleGlnValArgSerHisLysIleGlnGlyPheCysTyr
275280285
GlyPheValGluPheGluAspProSerSerValGlnSerAlaIleAla
290295300
GlySerProValThrIleSerAspArgGlnCysTyrValGluGluLys
305310315320
ArgThrAlaGlySerArgGlyGlyGlyArgGlyArgPheAlaProGly
325330335
ArgGlyGlyAsnPheArgGlyGluGlyMetArgGlyArgGlyAsnTyr
340345350
ThrGlyGlyArgGlyTyrGlyArgGlyGluPheAsnTyrArgSerAsp
355360365
TyrGlyGlyArgGlyAlaGlyArgGlyGlySerSerArgGlyGlyAsp
370375380
ValGlyTyrGlnArgValAspHisSerAlaGlyArgAlaAlaArgAla
385390395400
ProSerGlyThrSerAlaValAlaLys
405
<210>34
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>保守基序1
<400>34
GlyIleGlnValArg
15
<210>35
<211>5
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>保守基序2
<220>
<221>变体
<222>(1)..(1)
<223>/替换＝″Ile″
<220>
<221>变体
<222>(4)..(4)
<223>/替换＝″Arg″
<220>
<221>变体
<222>(5)..(5)
<223>/替换＝″Lys″
<400>35
ValGluGluLysArg
15
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<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>保守基序3
<220>
<221>变体
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<220>
<221>变体
<222>(2)..(2)
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<220>
<221>变体
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<220>
<221>变体
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<220>
<221>变体
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<220>
<221>变体
<222>(7)..(7)
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<220>
<221>变体
<222>(8)..(8)
<223>/替换＝″Glu″
<400>36
CysPheGlyPheIleGluPheGlu
15
<210>37
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>保守基序4
<220>
<221>变体
<222>(2)..(2)
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<220>
<221>变体
<222>(3)..(3)
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<220>
<221>变体
<222>(4)..(4)
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<220>
<221>变体
<222>(6)..(6)
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″Arg″/替换＝″Asn″
<220>
<221>变体
<222>(7)..(7)
<223>/替换＝″Val″
<220>
<221>变体
<222>(8)..(8)
<223>/替换＝″Arg″/替换＝″Val″
<400>37
PheLysLysPheGlyAlaIleLys
15
<210>38
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>保守基序5
<220>
<221>变体
<222>(1)..(1)
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<220>
<221>变体
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<220>
<221>变体
<222>(3)..(3)
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<220>
<221>变体
<222>(4)..(4)
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<220>
<221>变体
<222>(5)..(5)
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<220>
<221>变体
<222>(6)..(6)
<223>/替换＝″His″/替换＝″Asn″/替换＝″Gly″
<220>
<221>变体
<222>(8)..(8)
<223>/替换＝″Ser″
<400>38
SerValPheValLysSerLeuPro
15
<210>39
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>保守基序6
<220>
<221>变体
<222>(1)..(1)
<223>/替换＝″Phe″
<220>
<221>变体
<222>(2)..(2)
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<220>
<221>变体
<222>(4)..(4)
<223>/替换＝″Phe″/替换＝″His″
<220>
<221>变体
<222>(5)..(5)
<223>/替换＝″Ser″
<220>
<221>变体
<222>(7)..(7)
<223>/替换＝″Met″/替换＝″Val″/替换＝″Thr″
<220>
<221>变体
<222>(8)..(8)
<223>/替换＝″Leu″
<220>
<221>变体
<222>(9)..(9)
<223>/替换＝″Gln″/替换＝″Lys″
<220>
<221>变体
<222>(10)..(10)
<223>/替换＝″Tyr″/替换＝″Leu″
<400>39
TyrValValLeuAsnAspIlePheArgPhe
1510
<210>40
<211>9
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>保守基序7
<220>
<221>变体
<222>(2)..(2)
<223>/替换＝″Ser″/替换＝″Val″/替换＝″Met″
<220>
<221>变体
<222>(4)..(4)
<223>/替换＝″Thr″
<220>
<221>变体
<222>(5)..(5)
<223>/替换＝″Met″
<220>
<221>变体
<222>(6)..(6)
<223>/替换＝″Leu″/替换＝″Val″
<220>
<221>变体
<222>(8)..(8)
<223>/替换＝″Val″
<220>
<221>变体
<222>(9)..(9)
<223>/替换＝″Ser″
<400>40
PheThrGlnSerPhePheLeuAlaPro
15
<210>41
<211>8
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>保守基序8
<220>
<221>变体
<222>(1)..(1)
<223>/替换＝″Ala″
<220>
<221>变体
<222>(2)..(2)
<223>/替换＝″Leu″/替换＝″Tyr″
<220>
<221>不确定的
<222>(3)..(3)
<223>Xaa可以是任一天然存在的氨基酸，但是优选地是Leu，His，Thr，Ile，Val，Met，或Gln之一
<220>
<221>变体
<222>(4)..(4)
<223>/替换＝″Val″/替换＝″Thr″/替换＝″Met″
<220>
<221>变体
<222>(5)..(5)
<223>/替换＝″Leu″/替换＝″Met″/替换＝″Gln″
<220>
<221>变体
<222>(7)..(7)
<223>/替换＝″Met″
<400>41
GlyValXaaIleValValThrGly
15

Claims (30)

1.用于相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包括
增加植物中编码GSBP样多肽的核酸表达，其中所述GSBP样多肽是SEQIDNO：2所示多肽序列，或者由能够在高严格杂交条件下与编码SEQIDNO：2所示多肽序列的核酸杂交的核酸编码且具有SEQIDNO：2相同的生物学活性的多肽，其中所述核酸与GOS2启动子或RCc3启动子有效连接，
并且其中所述增强的产量相关性状选自早期生长势、提高的产量和提高的生物量。
2.根据权利要求1的方法，其中所述的GSBP样多肽包含一个或多个以下基序：
(i)基序1，SEQIDNO：34；
(ii)基序2，SEQIDNO：35；
(iii)基序3，SEQIDNO：36；
(iv)基序3，SEQIDNO：37；
(v)基序3，SEQIDNO：38；
(vi)基序3，SEQIDNO：39；
(vii)基序3，SEQIDNO：40；
(viii)基序3，SEQIDNO：41。
3.根据权利要求1的方法，其中所述增加的表达是通过在植物中导入并表达编码GSBP样多肽的核酸而实现的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述提高的产量是相对于对照植物而言提高的种子产量。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述增强的产量相关性状是在非胁迫条件下获得的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述增强的产量相关性状是在干旱胁迫条件下获得的。
7.根据权利要求1的方法，其中所述GOS2启动子是来自稻的GOS2启动子。
8.根据权利要求1的方法，其中所述RCc3启动子是来自稻的RCc3启动子。
9.根据任一前述权利要求所述的方法，其中所述编码GSBP样多肽的核酸是植物来源的。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述编码GSBP样多肽的核酸来自双子叶植物。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述编码GSBP样多肽的核酸来自禾本科(Poaceae)。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述编码GSBP样多肽的核酸来自稻属(Oryza)。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述编码GSBP样多肽的核酸来自稻(Oryzasativa)。
14.通过根据任一前述权利要求所述的方法能够获得的植物的植物细胞，其中所述的植物细胞包含与GOS2启动子或RCc3启动子有效连接的编码权利要求1或2中定义的GSBP样多肽的重组核酸，且其中所述植物细胞是不能繁殖的。
15.构建体，其包含：
(i)编码权利要求1或2中定义的GSBP样多肽的核酸；
(ii)选自GOS2启动子或RCc3启动子的能够驱动权利要求1或2中定义的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地
(iii)转录终止序列。
16.根据权利要求15的构建体，其中所述GOS2启动子是来自稻的GOS2启动子。
17.根据权利要求15的构建体，其中所述RCc3启动子是来自稻的RCc3启动子。
18.根据权利要求15至17中任一项所述的构建体的用途，用于制备相对于对照植物具有提高的产量和/或早期生长势的植物的方法中。
19.用根据权利要求15或17中任一项所述的构建体转化的植物细胞，其中所述植物细胞是不能繁殖的。
20.用于产生转基因植物的方法，所述的转基因植物相对于对照植物具有提高的产量和/或早期生长势，所述方法包括：
(i)在植物中导入并表达编码权利要求1或2中定义的GSBP样多肽的核酸，其中所述核酸与GOS2启动子或RCc3启动子有效连接；和
(ii)在促进植物生长和发育的条件下培养植物细胞。
21.根据权利要求20的用于产生转基因植物的方法，其中所述提高的产量是增加的生物量和/或提高的种子产量。
22.来自植物的转基因植物细胞，其因编码权利要求1或2中定义的GSBP样多肽的核酸的表达增加而相对于对照植物具有提高的产量和/或早期生长势，所述核酸与GOS2启动子或RCc3启动子有效连接，其中所述植物细胞是不能繁殖的。
23.根据权利要求22的来自植物的转基因植物细胞，其中所述提高的产量是增加的生物量和/或提高的种子产量。
24.根据权利要求14、19或22的转基因植物细胞，其中所述的植物细胞来自作物植物。
25.根据权利要求14、19或22的转基因植物细胞，其中所述的植物细胞来自单子叶植物。
26.根据权利要求14、19或22的转基因植物细胞，其中所述的植物细胞来自谷物植物。
27.根据权利要求14、19或22的转基因植物细胞，其中所述的植物细胞来自稻、玉米、小麦、大麦、谷子、黑麦、小黑麦、高粱和燕麦。
28.产物，其衍生自根据权利要求24的植物细胞，所述植物细胞包含编码权利要求1或2中定义的GSBP样多肽的核酸，所述核酸与GOS2启动子或RCc3启动子有效连接。
29.编码GSBP样多肽的核酸的用途，用于在植物中相对于对照植物赋予早期生长势、提高产量，其中所述编码GSBP样多肽的核酸是权利要求1或2中定义的核酸。
30.根据权利要求29的编码GSBP样多肽的核酸的用途，其中所述提高产量是提高种子产量和/或苗生物量。
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