CN116064577B - OsRAC3基因在调控水稻籽粒大小中的应用 - Google Patents
OsRAC3基因在调控水稻籽粒大小中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116064577B CN116064577B CN202211031817.6A CN202211031817A CN116064577B CN 116064577 B CN116064577 B CN 116064577B CN 202211031817 A CN202211031817 A CN 202211031817A CN 116064577 B CN116064577 B CN 116064577B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- osrac3
- gene
- grain
- rice
- application
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 235000013339 cereals Nutrition 0.000 title claims abstract description 98
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 66
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 title claims abstract description 60
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 title claims abstract description 60
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 title description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 title 1
- 241000209094 Oryza Species 0.000 claims abstract description 63
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 43
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 20
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 18
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 12
- 239000012620 biological material Substances 0.000 claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 claims 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 19
- 238000009395 breeding Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 abstract description 5
- 238000003976 plant breeding Methods 0.000 abstract description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 abstract description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N cytokinin Natural products C1=NC=2C(NCC=C(CO)C)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(CO)O1 UQHKFADEQIVWID-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004062 cytokinin Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 4
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 4
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 4
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N (+)-Abscisic acid Chemical compound OC(=O)/C=C(/C)\C=C\[C@@]1(O)C(C)=CC(=O)CC1(C)C JLIDBLDQVAYHNE-YKALOCIXSA-N 0.000 description 2
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N Epihygromycin Natural products OC1C(O)C(C(=O)C)OC1OC(C(=C1)O)=CC=C1C=C(C)C(=O)NC1C(O)C(O)C2OCOC2C1O YQYJSBFKSSDGFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 2
- 241000746966 Zizania Species 0.000 description 2
- 235000002636 Zizania aquatica Nutrition 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 2
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 238000003208 gene overexpression Methods 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 2
- 101150084750 1 gene Proteins 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- 241000219194 Arabidopsis Species 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930192334 Auxin Natural products 0.000 description 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 240000008467 Oryza sativa Japonica Group Species 0.000 description 1
- 101000942309 Oryza sativa subsp. japonica Cytokinin dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101100523499 Oryza sativa subsp. japonica RAC3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710185494 Zinc finger protein Proteins 0.000 description 1
- 102100023597 Zinc finger protein 816 Human genes 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000009418 agronomic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 239000002363 auxin Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N desoxyabscisic acid Natural products OC(=O)C=C(C)C=CC1C(C)=CC(=O)CC1(C)C FCRACOPGPMPSHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004392 genitalia Anatomy 0.000 description 1
- 210000002768 hair cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N indole-3-acetic acid Chemical compound C1=CC=C2C(CC(=O)O)=CNC2=C1 SEOVTRFCIGRIMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091006026 monomeric small GTPases Proteins 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000008054 signal transmission Effects 0.000 description 1
- 102000030938 small GTPase Human genes 0.000 description 1
- 238000009331 sowing Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/10—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in agriculture
- Y02A40/146—Genetically Modified [GMO] plants, e.g. transgenic plants
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明公开了OsRAC3基因在调控水稻籽粒大小中的应用，涉及植物分子生物学和植物育种领域。本发明所述OsRAC3基因为如SEQ ID NO：1所示的全基因序列，或如SEQ ID NO：2所示的基因片段。通过构建OsRAC3基因活性形式和非活性形式的过表达植株，分析各类型植株后发现OsRAC3基因活性形式过表达使水稻籽粒变大，粒长粒宽均有所增大，千粒重更重；而OsRAC3基因非活性形式过表达使水稻籽粒变小，粒长粒宽均有所减小，千粒重更轻；说明该基因能够调控水稻籽粒的大小，可为作物育种提供基因资源，将水稻OsRAC3基因应用于水稻育种中，对植物育种与应用具有重要的理论和实践意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子生物学和植物育种领域，特别是涉及OsRAC3基因在调控水稻籽粒大小中的应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的粮食作物之一，也是我国的主要粮食作物，其产量主要与粒重、穗粒数和有效穗数有关，而水稻籽粒的大小影响着粒重，因此水稻籽粒的大小与水稻产量紧密相关。在水稻种，內稃和外稃组成的小穗外壳限制了种子的发育从而最终决定种子的大小，细胞分裂素(CTKs)可以调控小穗的形成和颖壳的分化，有研究表明，外源用CTKs进行处理，可以增加小穗的数量。细胞分裂素是调控茎尖分生组织(SAM)的主要激素，对于植株在分支上的发生起着重要的作用。在水稻的生殖分生组织中，锌指蛋白DST能够促进作物的遗传改良。该蛋白影响了基因OsCKX2的表达，提高细胞分裂素水平，促进分生组织活动，增加了圆锥花序的分支，这在粮食产量提高方面具有重要意义。
近些年，利用基因工程手段改良农作物的农艺性状已经是一种比较常见的技术手段，这也为农作物产量的提高提供了一种新的解决途径。小G蛋白Rac/Rop是植物中特有的信号蛋白，在花粉和根毛细胞的极性生长，生长素与脱落酸信号传输和免疫应答反应等方面具有重要的作用。Rac/Rop家族成员的功能性探索在拟南芥中多有研究，但是在水稻发育中的功能却很少有相关报道。因此进一步挖掘与水稻籽粒相关的基因具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供OsRAC3基因在调控水稻籽粒大小中的应用，以解决上述现有技术存在的问题，通过构建OsRAC3基因活性形式和非活性形式的过表达植株，发现该基因可以调控水稻籽粒大小，这为作物育种提供了基因资源，对植物育种与应用具有重要的理论和实践意义。
为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
本发明提供OsRAC3基因或其相关生物材料在调控水稻籽粒大小中的应用，所述OsRAC3基因包括如SEQ ID NO：1所示的全基因序列，或如SEQ ID NO：2所示的基因片段；
所述相关生物材料包括如SEQ ID NO：2所示核苷酸序列编码的蛋白质或含有所述OsRAC3基因序列的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
进一步地，所述水稻籽粒大小包括水稻籽粒的粒长、粒宽和千粒重。
本发明还提供CA-OsRAC3基因或相关生物材料在促进水稻籽粒发育中的应用，所述CA-OsRAC3基因为如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列在第50个碱基处发生突变，使G变成T；
所述相关生物材料包括所述CA-OsRAC3基因编码的蛋白质或含有所述CA-OsRAC3基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
进一步地，所述促进水稻籽粒发育包括促进水稻籽粒的粒长、粒宽和千粒重增加。
DN-OsRAC3基因或相关生物材料在抑制水稻籽粒发育中的应用，所述DN-OsRAC3基因为如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列在第65个氨基酸处发生突变，使C变成A；
所述相关生物材料包括所述DN-OsRAC3基因编码的蛋白质或含有所述DN-OsRAC3基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
进一步地，所述抑制水稻籽粒发育包括抑制水稻籽粒的粒长、粒宽和千粒重增加。
本发明还提供一种增大水稻籽粒大小的方法，将所述的CA-OsRAC3基因转入水稻后过量表达，获得的转基因植株籽粒增大。
本发明还提供一种减小水稻籽粒大小的方法，将所述的DN-OsRAC3基因转入水稻后过量表达，获得的转基因植株籽粒减小。
本发明公开了以下技术效果：
本发明通过构建OsRAC3基因活性形式和非活性形式的过表达植株，发现基因OsRAC3活性形式过表达后水稻籽粒变大，粒长粒宽均有所增大，千粒重更重；将该基因非活性形式过表达后可以使水稻籽粒变小，粒长粒宽均有所减小，千粒重更轻，说明该基因调控水稻籽粒的大小。本发明为作物育种提供了基因资源，可将水稻OsRAC3基因应用于水稻育种中，对植物育种与应用具有重要的理论和实践意义。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为用于构建CA-OsRAC3过表达和DN-OsRAC3过表达载体的图谱；
图2为野生型植株ZH11、CA-OsRAC3和DN-OsRAC3转基因植株中OsRAC3的相对表达量；
图3为用于构建OsRAC3pro:GUS载体的图谱；
图4为OsRAC3在水稻生殖器官中的组织化学染色结果，其中A为花序分生组织中的染色结果，B为发育中小穗中的染色结果，C为去掉外稃和内稃的小花中的染色结果；
图5为野生型植株ZH11、CA-OsRAC3和DN-OsRAC3转基因植株的成熟期以及穗子大小的对比图，其中A为不同植株成熟期的对比图，B为不同植株穗子大小的对比图；
图6为野生型植株ZH11、CA-OsRAC3和DN-OsRAC3过表达植株水稻粒长、粒宽和千粒重情况，其中A为不同植株水稻粒长情况，B为不同植株水稻粒宽情况，C为不同植株水稻千粒重情况，星号代表各样品与ZH11间差异(Ordinary one-way ANOVA)，ns表示无显著差异，*表示差异显著(p<0.05)，**表示差异极显著(p<0.01)，***表示差异极显著(p<0.001)，****表示差异极显著(p<0.0001)；
图7为野生型植株ZH11、CA-OsRAC3和DN-OsRAC3过表达植株水稻穗一级分支、穗二级分支和每一穗上的总穗粒数情况，其中A为不同植株水稻穗一级分支情况，B为不同植株水稻穗二级分支情况，C为不同植株水稻每一穗上的总穗粒数情况，星号代表各样品与ZH11间差异(Ordinary one-way ANOVA)，ns表示无显著差异，*表示差异显著(p<0.05)，**表示差异极显著(p<0.01)，***表示差异极显著(p<0.001)，****表示差异极显著(p<0.0001)。
具体实施方式
现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。
除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。
关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。
实施例1基因克隆
根据基因座位号Os02g0742200在NCBI数据库中查询OsRAC3基因(如SEQ IDNO:1所示，该基因位于水稻2号染色体上)，根据OsRAC3基因的cDNA序列信息设计引物：
F(SEQ ID NO:3)：5’-ATGGCGTCCAGCGCCTCCCGGTTCA-3’；
R(SEQ ID NO:4)：5’-TCAGGATTTGAAGCATGACATTTTC-3’。
以粳稻品种中花11(ZH11)的一周苗龄全苗所提取的基因组DNA为模板，用常规PCR方法克隆得到OsRAC3基因。经过扩增后得到OsRAC3基因的序列如SEQ ID NO：2所示。将扩增后的PCR产物回收。
实施例2含CA-OsRAC3基因过表达载体和含DN-OsRAC3基因过表达载体的构建及遗传转化
1.持续性激活形式的OsRAC3基因的制备
以实施例1中回收的PCR产物为模板，利用引物(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)扩增第一段片段，利用引物(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)扩增第二段片段，分别回收后，将两者混为一管，以混合物为模板，利用引物(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8)扩增，将扩增的目的片段进行测序分析，若第50个碱基处发生突变，使G突变为T(相应的密码子GGC(甘氨酸G)变成GUC(缬氨酸V))，则此为最终目的片段，即持续性激活形式的OsRAC3基因片段(CA-OsRAC3)。
2.非持续性激活形式的OsRAC3基因的制备
以实施例1中回收的PCR产物为模板，利用引物(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:11)扩增第一段片段，利用引物(SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:8)扩增第二段片段，分别回收后，将两者混为一管，以混合物为模板，利用引物(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:8)扩增，将扩增的目的片段进行测序分析，若第65个氨基酸处发生突变，使C突变为A(相应的密码子ACC(苏氨酸T)变成AAC(天冬酰胺N))，造成OsRAC3被持续性抑制，则此为最终目的片段，即非持续性激活形式的OsRAC3基因片段(DN-OsRAC3)。
3.Ubipro:CA-osrac3载体以及Ubipro:DN-osrac3载体的构建
利用同源重组的方式构建Ubipro:CA-osrac3以及Ubipro:DN-osrac3载体。使用NEB(New England Biolabs)公司的限制性核酸内切酶对pOX质粒(该质粒是将pCAMBIA1300载体的Camv35S启动子更换为polyubiquitin(GI:248336)启动子获得，质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示)进行酶切，酶切成功后回收。使用北京擎科生物科技有限公司的TreliefTMSoSoo Cloning Kit(TSV-S2)对目的片段(CA-OsRAC3)和酶切质粒进行同源重组，使得在pOX载体的KpnI和HindIII处插入目的片段。最终获得Ubipro:CA-osrac3重组载体；对目的片段(DN-OsRAC3)和酶切质粒进行同源重组，使得在pOX载体的KpnI和HindIII处插入目的片段。最终获得Ubipro:CA-osrac3重组载体(图1)。
4.转基因植株构建
通过农杆菌EHA105介导的遗传转化将Ubipro:CA-osrac3载体和Ubipro:DN-osrac3载体分别导入野生型水稻ZH11植株中，通过潮霉素筛选，分别获得CA-osrac3基因过表达和DN-osrac3基因过表达的转基因植株阳性苗。
将OsRAC3基因的序列导入网站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/，设计qRT-PCR引物(SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10)，选取不同的过量表达株系，用叶片作为材料提取mRNA，野生型(ZH11)中的表达量设定为1，以OsACTIN1作为内参，通过qRT-PCR进行转录表达水平的检测，检测结果显示，在CA-osrac3转基因植株L11和L32中CA-OsRAC3的表达水平明显高于ZH11；在DN-osrac3转基因植株L20和L15中DN-OsRAC3的表达水平明显高于ZH11(图2)，因此，选取CA-OsRAC3的表达水平明显高于ZH11的转基因植株L11和L32以及DN-OsRAC3的表达水平明显高于ZH11的转基因植株L20和L15用于观察后续表型。
实施例3 OsRAC3在水稻生殖器官中的GUS组织化学染色
为了研究OsRAC3在水稻整个生长发育过程中的时空表达模式，在起始密码子AUG上游取244bp的序列作为OsRAC3的启动子序列，设计引物(SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14)，用常规PCR的方法扩出目的片段，使用NEB(New England Biolabs)公司的限制性核酸内切酶对pCAMBIAl305.1质粒进行酶切，酶切成功后回收。使用北京擎科生物科技有限公司的TreliefTMSoSoo Cloning Kit(TSV-S2)对目的片段和酶切质粒进行同源重组，使得在pl305.1载体的KpnI和BamHI处插入目的片段，获得启动子融合GUS的表达载体：OsRAC3pro:GUS(图3)。然后，通过农杆菌EHA105介导的遗传转化，将OsRAC3pro:GUS载体导入野生型水稻ZH11植株中，通过潮霉素筛选转基因植株。然后对水稻各组织进行固定、清洗、染色和透明后，通过显微镜观察分析显示，OsRAC3在花序分生组织、小穗的外稃和内稃中特异性表达，在柱头、雌蕊和雄蕊中也有表达，推测OsRAC3的表达能够参与水稻籽粒的发育，影响水稻籽粒的大小(图4)。
实施例4野生型、CA-OsRAC3和DN-OsRAC3过表达植株表型观察
取同一时期收获，统一烘干的种子进行萌发播种，通过对野生型、CA-OsRAC3和DN-OsRAC3过表达植株成熟期观察、拍照。结果发现，CA-OsRAC3过表达植株比野生型植株高大，DN-OsRAC3过表达植株比野生型植株矮小(见图5A)；在穗子表型方面，CA-OsRAC3比野生型大，而DN-OsRAC3比野生型小(见图5B)。
实施例5野生型、CA-OsRAC3和DN-OsRAC3过表达植株之间粒长、粒宽和千粒重的比较
取同一时期收获，统一烘干的种子进行粒长、粒宽及千粒重的记录、统计和拍照。统计籽粒表型，使用ImageJ软件测量籽粒长度与宽度，再使用Graphpad prism进行统计数据分析。结果发现：CA-OsRAC3各株系籽粒比ZH11大，在粒宽、粒长和千粒重上都有所增大，且均具有极显著差异；DN-OsRAC3各株系籽粒都比ZH11小，在粒宽、粒长和千粒重上也都有所减小，均具有极显著差异。(见图6)。
实施例6野生型和CA-OsRAC3、DN-OsRAC3过表达植株之间穗一级分支、穗二级分支和每一穗的总穗粒数的比较
取同一成熟期的各植株，对其穗一级分支、穗二级分支数量记录统计，使用Graphpad prism进行统计数据分析，测量数据是10个生物学重复的平均值和标准误，误差线为SD。结果发现：CA-OsRAC3和DN-OsRAC3各株系穗一级分支都比ZH11多，CA-OsRAC3 L11和DN-OsRAC3 L15的穗一级分支比ZH11具有极显著差异，其他株系与ZH11无显著差异。CA-OsRAC3和DN-OsRAC3各株系穗二级分支都比ZH11多，除了DN-OsRAC3 L20与ZH11无显著差异，其余均与ZH11具有极显著差异。在每一穗的总穗粒数上，可以发现CA-OsRAC3各株系均比ZH11多，且具有显著差异；DN-OsRAC3各株系比ZH11稍多，没有显著差异(见图7)。由结果推测OsRAC3基因在活性形式和非活性形式下可能会影响水稻籽粒的产量和重量。
以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。
Claims (6)
1.CA-OsRAC3基因或相关生物材料在促进水稻籽粒发育中的应用，其特征在于，所述CA-OsRAC3基因为如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列在第50个碱基处发生突变，使G变成T；
所述相关生物材料选自所述CA-OsRAC3基因编码的蛋白质或含有所述CA-OsRAC3基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述促进水稻籽粒发育包括促进水稻籽粒的粒长、粒宽和千粒重增加。
3.DN-OsRAC3基因或相关生物材料在抑制水稻籽粒发育中的应用，其特征在于，所述DN-OsRAC3基因为如SEQ ID NO:2所示核苷酸序列在第65个氨基酸处发生突变，使C变成A；
所述相关生物材料选自所述DN-OsRAC3基因编码的蛋白质或含有所述DN-OsRAC3基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述抑制水稻籽粒发育包括抑制水稻籽粒的粒长、粒宽和千粒重增加。
5.一种增大水稻籽粒大小的方法，其特征在于，将权利要求1中所述的CA-OsRAC3基因转入水稻后过量表达，获得的转基因植株籽粒增大。
6.一种减小水稻籽粒大小的方法，其特征在于，将权利要求3中所述的DN-OsRAC3基因转入水稻后过量表达，获得的转基因植株籽粒减小。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211031817.6A CN116064577B (zh) | 2022-08-26 | 2022-08-26 | OsRAC3基因在调控水稻籽粒大小中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211031817.6A CN116064577B (zh) | 2022-08-26 | 2022-08-26 | OsRAC3基因在调控水稻籽粒大小中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116064577A CN116064577A (zh) | 2023-05-05 |
| CN116064577B true CN116064577B (zh) | 2023-11-14 |
Family
ID=86173783
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211031817.6A Active CN116064577B (zh) | 2022-08-26 | 2022-08-26 | OsRAC3基因在调控水稻籽粒大小中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116064577B (zh) |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106434690A (zh) * | 2016-09-18 | 2017-02-22 | 河南师范大学 | 水稻OsRhoGAP2基因在改变水稻粒形中的应用 |
| CN109385431A (zh) * | 2017-08-09 | 2019-02-26 | 中国农业科学院生物技术研究所 | OsERF2基因调控水稻籽粒大小的应用 |
| CN111534536A (zh) * | 2019-02-02 | 2020-08-14 | 湖南杂交水稻研究中心 | 提高水稻稻瘟病抗性的方法及其相关生物材料 |
| CN113073102A (zh) * | 2020-05-18 | 2021-07-06 | 华南农业大学 | 自噬基因atg9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用 |
| WO2021243528A1 (zh) * | 2020-06-01 | 2021-12-09 | 中国农业科学院生物技术研究所 | Drw1蛋白调控水稻株高和种子大小的应用 |
| CN114805509A (zh) * | 2022-01-20 | 2022-07-29 | 上海交通大学 | 蛋白质OsGATA6在调控植物开花时间、穗型、粒形和千粒重中的应用 |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR101255415B1 (ko) * | 2007-07-27 | 2013-04-18 | 재단법인 작물유전체기능연구사업단 | 향상된 수확량 관련 형질을 갖는 식물 및 이의 제조 방법 |
| CN101993482B (zh) * | 2009-08-24 | 2013-04-03 | 夏新界 | 与水稻长粒卷叶相关的蛋白及其编码基因与应用 |
| CN111676234B (zh) * | 2020-04-15 | 2022-06-10 | 浙江师范大学 | 一种水稻穗粒数控制基因OsCKX11及其应用 |
-
2022
- 2022-08-26 CN CN202211031817.6A patent/CN116064577B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106434690A (zh) * | 2016-09-18 | 2017-02-22 | 河南师范大学 | 水稻OsRhoGAP2基因在改变水稻粒形中的应用 |
| CN109385431A (zh) * | 2017-08-09 | 2019-02-26 | 中国农业科学院生物技术研究所 | OsERF2基因调控水稻籽粒大小的应用 |
| CN111534536A (zh) * | 2019-02-02 | 2020-08-14 | 湖南杂交水稻研究中心 | 提高水稻稻瘟病抗性的方法及其相关生物材料 |
| CN113073102A (zh) * | 2020-05-18 | 2021-07-06 | 华南农业大学 | 自噬基因atg9在水稻育种和/或水稻粒型机制研究中的应用 |
| WO2021243528A1 (zh) * | 2020-06-01 | 2021-12-09 | 中国农业科学院生物技术研究所 | Drw1蛋白调控水稻株高和种子大小的应用 |
| CN114805509A (zh) * | 2022-01-20 | 2022-07-29 | 上海交通大学 | 蛋白质OsGATA6在调控植物开花时间、穗型、粒形和千粒重中的应用 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| OsORC3 is required for lateral root development in rice;Xinai Chen等;《The Plant Journal》;第74卷(第2期);第339-350页 * |
| OsRAC3 调控水稻籽粒性状的功能分析;刘慧丽等;《华南农业大学学报》;第1-11页 * |
| Preliminary Characterization of Function of Rac /Rop GEF1 in Arabidopsis;NIE Fang等;《Agricultural Science ＆ Technology》;第11卷(第4期);第12-14页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116064577A (zh) | 2023-05-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US20210324397A1 (en) | A gene osckx11 for controlling rice grain number and use thereof | |
| EP2371841B1 (en) | Methods for enhancing stress tolerance in plants and compositions thereof | |
| WO2020156367A1 (zh) | 提高水稻产量和/或稻瘟病抗性的方法及其所用蛋白质 | |
| AU2018220084A1 (en) | Method for plant improvement | |
| CN108642065B (zh) | 一种水稻胚乳粉质相关基因OsSecY2及其编码蛋白质和应用 | |
| CN113024644A (zh) | ZmICE1蛋白及其编码基因在调控玉米耐受低温胁迫中的应用 | |
| CN105985954B (zh) | 水稻miR160b基因在调控分蘖角度中的应用 | |
| CN105504034A (zh) | Myb37蛋白及其编码基因在调控植物抗旱性中的应用 | |
| Dong et al. | Characterization of the molecular mechanism underlying the dwarfism of dsh mutant watermelon plants | |
| CN112521469B (zh) | 一种植物谷蛋白分选相关蛋白OsD15及其编码基因与应用 | |
| CN112280786B (zh) | 一种养分高效利用耐除草剂玉米连hh2823转化事件及其特异性鉴定方法和应用 | |
| CN116064577B (zh) | OsRAC3基因在调控水稻籽粒大小中的应用 | |
| US20080172763A1 (en) | Nod-Factor Perception | |
| CN106432444A (zh) | 一个植物谷蛋白转运储藏相关蛋白gpa4及其编码基因与应用 | |
| CN112159464B (zh) | 一种小麦TaSEP基因及其在调控生长和发育中的应用 | |
| CN100457904C (zh) | 针对胞质雄性不育辣椒的特异性dna片段及其应用 | |
| CN112239762B (zh) | 一种植物花粉管生长基因及应用 | |
| CN111534536B (zh) | 提高水稻稻瘟病抗性的方法及其相关生物材料 | |
| CN109082437B (zh) | 一种提高大麦分蘖数量的方法 | |
| CN106349353B (zh) | 一种调控植物淀粉合成相关蛋白OsFSE及其编码基因与应用 | |
| CN110684778A (zh) | 一个水稻超高产关键基因OsSPL4及其人工定点突变体的应用 | |
| US6858774B2 (en) | MDR-like ABC transporter gene from plants | |
| CN113817755B (zh) | 水稻长粒基因log1及其应用 | |
| CN117448346B (zh) | OsABCI8基因或其编码的蛋白在水稻育种中的应用 | |
| CN110078808B (zh) | 棉花GhKNAT7-A03蛋白及其编码基因和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |