CN110684778A - 一个水稻超高产关键基因OsSPL4及其人工定点突变体的应用 - Google Patents

一个水稻超高产关键基因OsSPL4及其人工定点突变体的应用 Download PDF

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张业胜
黄立钰
李艳霞
胡继宏
王文
胡凤益
董树美
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    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
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    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
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Abstract

本发明公开了一个水稻超高产关键基因OsSPL4(LOC_Os02g07780,Os02g0174100)及其人工定点突变体的应用。OsSPL4基因位于水稻2号染色体上，全长4067bp，CDS长705bp，共编码235个氨基酸。OsSPL4基因人工定点突变体采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对OsSPL4基因的第1外显子进行修饰，使得第1外显子的碱基发生替换、缺失或插入而得到。本发明采用CRISPR/Cas9靶向修饰技术对OsSPL4基因的第1外显子进行人工定点突变，并筛选出能够显著提高水稻产量的突变体。本发明提供的OsSPL4基因人工定点突变体能够将水稻单株产量提高约24％，甚至杂合植株的产量也增加约8％，表明OsSPL4基因人工定点突变体的应用能够显著提高水稻产量。

Description

一个水稻超高产关键基因OsSPL4及其人工定点突变体的应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一个水稻超高产关键基因OsSPL4及其 人工定点突变体的应用。
背景技术
水稻是我国重要的粮食作物之一，稻谷产量占粮食作物的40％左右。提高 水稻产量，对保障国家粮食安全有重大的意义。中国水稻产量的提高主要有两个 时期：第一个时期是20世纪50年代，兴起了矮化育种，即“矮秆革命”或“绿色 革命”，第二个时期是20世纪70年代以来杂交水稻的广泛推广。水稻专家陈温 福认为杂种优势利用与理想株型相结合的超高产育种，必将是未来水稻产量提高 的突破点。
SPL(squamosa promoter-binding protein-like)转录因子是植物所特有的一类基因家族，广泛存在于绿色植物中，如水稻、小麦及银桦等，在植物生长发育中 具有重要作用。其中，OsSPL4基因对水稻植物开花的调控作用已被报道，但 OsSPL4基因对水稻产量的调控作用还并不清楚。充分掌握OsSPL4基因对水稻产 量的调控作用，是亟待解决的问题。
在本发明中，首次发现OsSPL4基因参与水稻产量的调控，OsSPL4基因人工 定点突变体的应用能够显著提高水稻产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一个水稻超高产关键基因OsSPL4及其人工定点突变 体的应用。详细地，采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对OsSPL4基因的第1 外显子进行修饰，使得第1外显子的碱基发生替换、缺失或插入获得OsSPL4基 因人工定点突变体，并将该突变体应用于高产水稻品种培育中。
本发明的技术方案如下：OsSPL4基因位于水稻2号染色体上，全长4067bp， CDS长705bp，共编码235个氨基酸，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
一种水稻超高产关键基因OsSPL4人工定点突变体采用CRISPR/Cas9基因靶 向修饰技术对OsSPL4基因的第1外显子进行修饰，使得第1外显子的碱基发生 替换、缺失或插入获得OsSPL4基因人工定点突变体。
一种水稻超高产关键基因OsSPL4人工定点突变体，修饰靶点位于第1外显 子的第193-213碱基处，修饰靶点序列为5’-AGGTGAGGTGCCAGGTGGAA-3’。
利用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在靶点OsSPL4基因第1外显子起始密 码子后第207-209位造成GGT 3个碱基的缺失得到OsSPL4基因人工定点突变体。
OsSPL4基因人工定点突变体运用于水稻增产实验，结果显示：纯合突变植 株的产量提高了约24％，甚至杂合突变植株的产量约增加8％，表明OsSPL4基 因人工定点突变体的应用能够显著提高水稻产量。
本发明还提供所述一个水稻超高产关键基因OsSPL4及其人工定点突变体 在杂交水稻育种和基因组编辑水稻育种中的应用。本发明的机理如下：本发明通 过采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对水稻超高产关键基因OsSPL4的第1 外显子设计靶点进行定点突变，造成部分基因片段缺失，阻碍第1外显子的正常 翻译，弱化基因功能，进而提高水稻产量。
本发明通过表型分析研究OsSPL4基因人工定点突变体对水稻产量的影响， 筛选出表现优异的突变类型。结果表明：优异的纯合突变类型能够将水稻产量提 高约24％，甚至杂合突变类型能够将水稻产量提高约8％，显著优于自然界中的 突变类型。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明采用CRISPR/Cas9基 因靶向修饰技术对水稻超高产关键基因OsSPL4的第1外显子进行人工定点突变， 筛选出能够显著提高水稻产量的突变体。本发明提供的OsSPL4基因人工定点纯 合突变体能够将水稻产量提高到约24％，甚至杂合突变体也能够将水稻产量提高 到约8％，优于自然界的突变类型。
附图说明
图1为OsSPL4基因碱基序列图；
图2为野生型OsSPL4基因第1外显子碱基序列图；
图3为突变型OsSPL4基因第1外显子碱基序列靶点位置示意图，其中，框 线处为靶点位置；
图4为突变型OsSPL4基因第1外显子碱基序列缺失位点示意图，其中，框 线处为缺失位点；
图5为OsSPL4基因发生突变的植株和野生型植株的株型与穗型照片；
图6为OsSPL4基因纯合突变植株、杂合突变植株和野生型植株的穗长柱状 对比图；
图7为OsSPL4基因纯合突变植株、杂合突变植株和野生型植株的穗数柱状 对比图；
图8为OsSPL4基因纯合突变植株、杂合突变植株和野生型植株的千粒重柱 状对比图；
图9为OsSPL4基因纯合突变植株、杂合突变植株和野生型植株的单株产量 柱状对比图；
其中，Ⅰ为野生型植株；Ⅱ为杂合突变植株；Ⅲ为纯合突变植株。
具体操作方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
实施例
OsSPL4基因位于水稻2号染色体上，全长4067bp，CDS长705bp，共编 码235个氨基酸，其碱基序列如SEQ ID No.1所示，如图1所示。
野生型OsSPL4基因第1外显子，长341bp，碱基序列如SEQ ID No.2所 示，如图2所示。
本实施例基于CRISPR/Cas9技术对水稻超高产关键基因OsSPL4进行人工定 点修饰，修饰靶点位于第1外显子的第193-213碱基处，修饰靶点序列为Oligo： 5’-AGGTGAGGTGCCAGGTGGAA-3’，如图3所示，其中，框线处为靶点位置。
利用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在OsSPL4基因第1外显子起始密码子 后第207-209位造成GGT 3个碱基的缺失。突变型OsSPL4基因第1外显子碱基 序列如SEQ IDNo.3所示，如图4所示，其中，框线处为缺失位点。
本实施例使用含有cas9表达盒(35S启动子启动)和guide RNA表达盒(水 稻OsU3启动子)的双元载体Pcambia1300为骨架载体进行载体构建，将靶点序 列插入骨架载体中，具体做法为：将Oligo进行退火磷酸化，使用限制性内切酶 AarⅠ对骨架载体进行酶切，然后使用T4连接酶将退火磷酸化后的靶点序列连入 骨架载体OsU3启动子与sgRNA-scaffold序列之间，完成载体构建。
将构建好的载体通过电穿孔导入根癌土壤杆菌菌株EHA105中，用阳性农杆 菌侵染水稻日本晴愈伤组织。经过筛选，分化，生根过程后获得T0代植株，采 取T0代植株叶片并提取DNA。在OsSPL4基因靶点外围设计检测引物进行PCR 检测，检测引物为OsSPL4-Primer:AGGTGAGGTGCCAGGTGGAAGGG。
将PCR产物进行T1代测序，确认发生突变的T0代植株并将其收种进行T1 代种植。采取T1代植株叶片进行DNA提取，设计潮霉素引物确定外源载体 T-DNA片段是否存在。同时使用上述检测引物进行检测，确定T1植株中OsSPL4 基因突变类型为纯合突变或是杂合突变。筛选出OsSPL4突变类型为纯合突变或 杂合突变且潮霉素检测为阴性的植株进行收种。潮霉素引物序列为：
HYG-F:5'-TCCACTATCGGCGAGTACTTCT-3'，
HYG-R:5'-CACTACATGGCGTGATTTCAT-3'。
为了验证OsSPL4基因人工定点突变体是否具有增加产量的功能，将纯合突 变的和杂合突变的T1代种子分别在云南桃园和景洪进行T2代种植。两个地区 使用相同的田间管理模式(相同的种植面积，种植密度及相同量的施肥量等)。 设置了3-4个重复的15平方米的地块，并在整个生长期间进行了仔细的表型分 析。根据需要进行严格的田间管理避免产量损失，包括水份的控制，杂草的拔除 以及病虫害的防治。为了保证实验的准确性，随机筛选部分植株进行了基因型检 测，证明T2代植株确实为纯合突变植株或杂合突变植株。
经统计，田间试验结果显示：纯合突变株系的植株高度略有增加，并表现出 穗长和每穗粒数均高于野生型植株(图5A)；产量方面，与野生型相比纯合突 变植株的产量约增加了24％；甚至杂合植株的产量也约增加了8％(图5B和图 5C)。因此，不论是从株高还是从产量方面来看，OsSPL4基因人工定点突变体 的应用，均显著促进水稻的优良性状，具体见图6-9。
SEQUENCE LISTING
<110> 保山华大智慧农业科技股份有限公司
<120> 一个水稻超高产关键基因OsSPL4及其人工定点突变体的应用
<130> 20190823
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 4067
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
attccccaat gacttcttct tcctcctcct ctccacagtc cacactgttc atctcctcct 60
cccctccctc ccaattcgat tcccaaatcc caaaattgac cacccaaatc cgcgccaatc 120
catggattgg atgcctcctc cgaagcccac ctcgccgcgc tcccctcccc tcctctggga 180
ctgggccgac gccgccgtgc cgggctcctc ctccggcgag gtatccgccg ccgccgccgc 240
cgccgcggct catccgggaa ggcggcggaa ggagaagcga ggcagggcgg aggaaggagg 300
aggtggtggt ggggaggtga ggtgccaggt ggaagggtgc ggggtggagc tcgtcggcgt 360
caaggactac caccggaagc accgcgtgtg cgaggcccac tccaagttcc cccgcgtcgt 420
cgtcgccggc caggagcgcc gcttctgcca gcagtgcagc cggtgagctc gccggagtcg 480
cgcctcctct tcctcttcct ctctctctat attgcaaaaa aaaaaaaatc aatggaagca 540
cacagctcca agctcgtgcg tgccttcctt ctcctcgatt actttctgca aaaagattcc 600
cttctcttct ttggttcttc gaattacaat tacaatttac agtttaatca cacgattggt 660
tgctgattaa tttgcgcgaa gctcgtgctt ttttacgtgg gtggtgaatt tttctggtgt 720
ccgtacggat tttccatttc cgtatatggg aggcagagat gctatctttc cactattggt 780
actgtgtgtg tgtgcgagtg gtggatcctg ctgcatggct gagtgactct gcaatgggtt 840
ttttttttcc agttttagta tggtacttgt cctgtgcctt catttttggg attgggcctt 900
gctgtgcagt gagcctgtga ttactgtgtt tcaatcttta aaattattac tgtgtgtata 960
gtattttttt taaagataat ggaaatgatt tacacctccg gtctctctgc caacaagcat 1020
acggccaagg agtcgagaaa agataaataa aaatactcga ggttatggga caaaccccta 1080
tctacgccct gattatatcc agctgattac tgtgtgtaga gtagaatcat cttctgtgta 1140
tatgtacttt tttttttgta tgtgggattt tttgtgtatc ctgcgagtag tttatgcaac 1200
agtgtgctaa tttggttttg gtgaatgttt gggatcaggt tccatgcgct ctcggagttt 1260
gatcagaaga agaggagctg caggagacgc ctgtatgacc acaacgctcg tcggcggaag 1320
ccccagaccg acgtgttctc ctatgcatcg gcaaggccgc cgtcgtcatt attatttggt 1380
aatttgtctg taccttaaat ggatttgcaa cagcagttac ttttcactat ttagcttgat 1440
gtatatgatg tatgtgaaaa atggtaaatt gttggtgata agatctttat aaggttactc 1500
ctcggcaacc tccacctacc ttatccttaa gcacttgcat gttcttactt gatcgatggg 1560
actgagctta catgtgaaaa ttattttcag ttcgaaaatt cttggttgta agttcgactc 1620
cctgattaaa tttattttga tagtatcagg attactcgca aagaaactct acaatatcag 1680
atgttctatc aagttttcta taattatacc ctattttccc tttcaattaa gattttcctt 1740
cacaccaaaa ttgaaatgcc actgcagatg ataaccgaca aataagtttt gtctggaaca 1800
aagctccact cagccatgta aggcctttcg caatttctcc atgggaaagc tcatctgaag 1860
ttgggacaac tgatggacat atttatttgg ataaatctca catatccaaa tctctcccag 1920
catttaacac cgacatagat gagctcttac caatgaaagg tatgattttc caaagatgta 1980
agttttcgtg aaaaatgtca tcaattaaga ctactttcat ggttcagcac attgcataga 2040
tctttgaaaa aattcaacct atacactgta ccaaatgcca aattcagatg ctgttttgtc 2100
attgttgttg tttgttaaaa aaagtatcct ggagttgtgc acacccatga aaaaaaatta 2160
gacccttgag cacatttggg tttagaaaat aagatggtgt gcagtgtgct gctaagctta 2220
tgtcactata gttgacgaag tgtttcaaac ataaaagaca acagagtttt tagtaagatt 2280
ctaattggaa aagaaaaaaa ataccgtgtt ttgtgtgata gtaaacatcc tacagtttca 2340
actatataag tagttctctt gtggtcattg ggcagagaat tacttctcca gttagcaata 2400
caagttgttt tgatttaact tgcaggtata caacaaagaa tgatgttggg cattcttttg 2460
gtcctttgct ctcttttgcc caaattagtt atgttagatg cttttaacta cagttaatat 2520
gtgcttggaa gtggagcatg caccaaaaaa tggatagcaa atgccacaag tttccatatg 2580
aggctttggc gctaatatcg catcaatgat gtgttagttt ttgtgtttgg tacaagtatc 2640
tgtacaaggt tttggtgcca acattgcatc attaatgcgc agctagttgt ttcatttggt 2700
gtgagattgt atataacggc agcaattatt ttcatgtaat agtattccaa cagggattta 2760
acaggggcag tattgtacca aaaaccataa cttaatgcta tgtgcttatt agtctacaac 2820
gacttcgaag tgctgactag agggggtaat tatatttatg ctatgttttg ttagataatg 2880
gaatgctatg gattttgata acaagaaaaa aaaatgcaaa gtgattccag atagctgtga 2940
ttcttatctc tgacaaaacg agggaattcc aatacttagc acaatatgcg aaagtcagct 3000
caggaatgcc ctaaatttac cttattatgc ctgttcccta aactctccgc atgcgggaga 3060
actagttacc atgctaaaat tctacatact accaagcata ctgcaatttc ttggataacc 3120
ttgctaattt tatgctaaat tctcaaaata tatttcaaat gaatatgagc cattcaatcc 3180
atttccattg cagacttctc tgcagccact atttggatgt tcttcggtgt cctttttatc 3240
cgaactgcgc aggagagctg catgtcattt cattaaggag aaaacaatgt acatattttg 3300
atggaagaat gaccattatt ccattttgca ggtccggacg catctttaac tgcttcaaaa 3360
tttgatggag caccggatct tcagcgtgct ctctctcttc tgtcatctag ttcttgtgga 3420
ttacctgatc ctgtacagca agcatctcgc gtcatccaat tcacaggcgc cagccaaaac 3480
aaccgggaac ttcctccact taatggaggg aattctgctt cagcatcatg tgccaatgta 3540
caaactatag cacaaccggc tcagctggtt cgttttacca tgaatgctag cagcaatgct 3600
tgtcagtcca atttcttcgg tttaaaccag ataaactaaa ggcctggact gaaagcccgt 3660
cgtcgatttc gaccaatatc caccaaggtg gccttgagaa gatacaagaa ttgcttctat 3720
caactatcag agtgcaaaca atgtcacagt taatgttgtc atcataaata tcggtattgg 3780
tctcccctga actaaaatcg aacggagtga tggcttgctt gtgttttcga taatcgttat 3840
gcagttctaa ttttttttct attgttttct gccaatgtac cgattttcaa actgtgggtc 3900
ttgtcattta tacttgtaca acctaatgtc aaaatgtcat gtatctttga aactgttttt 3960
gatggatttg ggacatggtt tcgcttgtat gattgttgtt ttggcagcgg catgtggttt 4020
cagtggtggt ggtatgcttt ggcgccataa cgtgctgttt tttcccc 4067
<210> 2
<211> 341
<212> DNA
<213> 水稻
<400> 2
atggattgga tgcctcctcc gaagcccacc tcgccgcgct cccctcccct cctctgggac 60
tgggccgacg ccgccgtgcc gggctcctcc tccggcgagg tatccgccgc cgccgccgcc 120
gccgcggctc atccgggaag gcggcggaag gagaagcgag gcagggcgga ggaaggagga 180
ggtggtggtg gggaggtgag gtgccaggtg gaagggtgcg gggtggagct cgtcggcgtc 240
aaggactacc accggaagca ccgcgtgtgc gaggcccact ccaagttccc ccgcgtcgtc 300
gtcgccggcc aggagcgccg cttctgccag cagtgcagcc g 341
<210> 3
<211> 338
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
atggattgga tgcctcctcc gaagcccacc tcgccgcgct cccctcccct cctctgggac 60
tgggccgacg ccgccgtgcc gggctcctcc tccggcgagg tatccgccgc cgccgccgcc 120
gccgcggctc atccgggaag gcggcggaag gagaagcgag gcagggcgga ggaaggagga 180
ggtggtggtg gggaggtgag gtgccaggaa gggtgcgggg tggagctcgt cggcgtcaag 240
gactaccacc ggaagcaccg cgtgtgcgag gcccactcca agttcccccg cgtcgtcgtc 300
gccggccagg agcgccgctt ctgccagcag tgcagccg 338

Claims (5)

1.一个水稻超高产关键基因OsSPL4，其特征在于，该基因位于水稻2号染色体上，全长4067bp，CDS长705bp，共编码235个氨基酸，其碱基序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种水稻超高产关键基因OsSPL4人工定点突变体，其特征在于，采用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术对OsSPL4基因第1外显子进行修饰，使得第1外显子的碱基发生替换、缺失或插入获得OsSPL4基因人工定点突变体。
3.根据权利要求2所述的一种水稻超高产关键基因OsSPL4人工定点突变体，其特征在于，修饰靶点位于第1外显子的第193-213碱基处，修饰靶点序列为5’-AGGTGAGGTGCCAGGTGGAA-3’。
4.根据权利要求2所述的一种水稻超高产关键基因OsSPL4人工定点突变体，其特征在于，利用CRISPR/Cas9基因靶向修饰技术在OsSPL4基因第1外显子起始密码子后第207-209位造成GGT 3个碱基的缺失，得到OsSPL4基因的人工定点突变体。
5.一种水稻超高产关键基因OsSPL4人工定点突变体在提高水稻产量中的应用。
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