CN117659147A - 水稻qST5蛋白在调控植物苗期耐盐性中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了水稻qST5蛋白在调控植物苗期耐盐性中的应用，涉及生物领域。该蛋白质为下述任一种：A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质，A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。本发明的OsCHX11过表达株系的在盐胁迫下的存活率显著提高，由此可见OsCHX11正向调控水稻耐盐性。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及水稻qST5蛋白在调控植物苗期耐盐性中的应用。
背景技术
水稻是世界上最重要的主粮作物之一，但是水稻生产频繁遭受到多种逆境胁迫，其中土壤盐渍化是限制水稻生长发育，造成水稻减产的主要非生物胁迫之一。土壤盐渍化，通常指土壤中含有过量的可溶性盐，在不同程度上抑制作物的生长发育。盐胁迫会影响水稻植株地上部生物量的积累，并伴随叶片黄化、叶尖枯黄等症状的出现。
来自全球的水稻种质资源具有丰富的遗传多样性，耐盐性水平也存在广泛的变异。基于20世纪初期开始的耐盐水稻种质筛选工作，已完成了数千份种质资源的耐盐性评价，获得了一批公认的水稻耐盐种质，如籼稻Pokkali及其后代FL478、Nona Bokra、BRI等；国内研究者也筛选出一批耐盐材料，如韭菜青、黄粳糯、长毛谷等地方品种，尤其是近几年在广东湛江发现的耐盐种质海稻86引起国内外研究者的广泛关注。
因此，提高水稻耐盐性，扩大盐碱地水稻种植面积，对增加粮食总产和确保国家粮食安全具有重要意义。目前，耐盐主效基因数目有限，造成耐盐育种中可利用的优异基因较为单一，缺乏对全球水稻种质资源耐盐性的系统评价。因此，利用具有丰富遗传多样性的全球水稻种质资源挖掘耐盐新基因，是当前水稻种质资源研究面临的重要课题。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何提高水稻的耐盐性。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
为解决上述技术问题，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了蛋白质或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控蛋白质活性和/或含量的物质在下述任一种中的用途：
所述蛋白质为下述任一种，
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述用途为下述任一种，
D1)增加水稻耐盐性；
D2)制备提高水稻耐盐性的产品；
D3)培育耐盐性提高的水稻；
D4)制备培育耐盐性提高的水稻的产品；
D5)改良高耐盐性水稻或制备高耐盐性水稻的产品；
D6)水稻育种。
为了使A1)中的蛋白质便于纯化或检测，可在由序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接标签蛋白。
所述标签蛋白包括但不限于：GST(谷胱甘肽巯基转移酶)标签蛋白、His6标签蛋白(His-tag)、MBP(麦芽糖结合蛋白)标签蛋白、Flag标签蛋白、SUMO标签蛋白、HA标签蛋白、Myc标签蛋白、eGFP(增强型绿色荧光蛋白)、eCFP(增强型青色荧光蛋白)、eYFP(增强型黄绿色荧光蛋白)、mCherry(单体红色荧光蛋白)或AviTag标签蛋白。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化或点突变的方法，对本发明的编码蛋白质OsCHX11的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明分离得到的蛋白质OsCHX11的核苷酸序列75％或75％以上同一性的核苷酸，只要编码蛋白质OsCHX11且具有蛋白质OsCHX11功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。
本文中，同一性是指氨基酸序列或核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索以对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
本文中，所述80％以上的同一性可为至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
进一步地，所述物质为生物材料，所述生物材料为下述任一种：
B1)、编码前述蛋白质的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)、抑制或降低或下调所述蛋白质的编码基因的表达的核酸分子或抑制或降低或下调所述蛋白质的活性或含量的核酸分子；
B9)、表达B8)所述核酸分子的基因；
B10)、含有B9)所述基因的表达盒；
B11)、含有B9)所述基因的重组载体、或含有B10)所述表达盒的重组载体；
B12)、含有B9)所述基因的重组微生物、或含有B10)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B13)、含有B9)所述基因的转基因植物细胞系、或含有B10)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B11)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B14)、含有B9)所述基因的转基因植物组织、或含有B10)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；
B15)、含有B9)所述基因的转基因植物器官、或含有B10)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B11)所述重组载体的转基因植物器官。
上述生物材料中，所述含有编码OsCHX11的核酸分子的表达盒(OsCHX11基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达OsCHX11的DNA，该DNA不但可包括启动OsCHX11转录的启动子，还可包括终止OsCHX11转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子、组织、器官和发育特异的启动子及诱导型启动子。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子。
可用现有的表达载体构建含有所述OsCHX11基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等。如pAHC25、pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1305、pCAMBIA1300、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等。所述植物表达载体还可包含外源基因的3′端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3′端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂碱合成酶基因Nos)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3′端转录的非翻译区均具有类似功能。使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对氨甲喋呤抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
上述生物材料中，所述载体是本领域技术人员公知的，包括但不限于：质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)、Ti质粒或病毒载体。具体可为pEXT06/g。
上述生物材料中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
具体而言，上述用途中所述B1)所述核酸分子为编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子。
具体而言，上述用途中所述B9)所述核酸分子靶向于编码链的编码序列是SEQ IDNo.2所示的DNA分子。
本发明还提供了一种培育耐盐性提高的转基因水稻的方法，包括上调或增强或提高目的水稻中前述蛋白质的编码基因的表达量或所述蛋白质的含量得到耐盐性水稻，所述耐盐性水稻的耐盐性高于所述目的水稻。
进一步地，上述方法中所述上调或增强或提高目的水稻中前述蛋白质的编码基因的表达量或所述蛋白质的含量为将前述蛋白质的编码基因导入所述目的水稻。
本发明还提供了前述的蛋白质。
本发明还提供了生物材料，所述生物材料为下述任一种：
B1)、编码前述蛋白质的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)、抑制或降低或下调所述蛋白质的编码基因的表达的核酸分子或抑制或降低或下调所述蛋白质的活性或含量的核酸分子；
B6)、表达B5)所述核酸分子的基因；
B7)、含有B6)所述基因的表达盒；
B8)、含有B6)所述基因的重组载体、或含有B7)所述表达盒的重组载体；
B9)、含有B6)所述基因的重组微生物、或含有B7)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物。
进一步地，上述生物材料中B1)所述核酸分子为编码序列是SEQ ID No.2的cDNA分子或DNA分子。
本发明对已重测序的2655份水稻种质资源进行苗期耐盐性评价，利用GWAS发掘与水稻苗期耐盐性显著关联的主效数量性状新位点qST5，通过候选基因的转基因耐盐功能验证，确定一个编码Na+/H+逆转运蛋白基因OsCHX11作为qST5的重要候选基因，利用RT-qPCR、亚细胞定位、组织GUS染色分析和钠钾离子浓度测定等实验技术明确了OsCHX11调控盐胁迫响应的生理机制和基因表达特性。主要结论如下：
(1)本发明基于已重测序的2655份水稻材料的苗期耐盐性表型评价，发现籼稻的耐盐性普遍强于粳稻，GWAS检测到位于第5号染色体的一个主效耐盐位点qST5，该区间长度～136kb且区间内尚未克隆与耐盐性相关的基因。
(2)结合日本晴参考基因组注释和基因单倍型分析在qST5内筛选出4个耐盐候选基因(LOC_Os05g31720、LOC_Os05g31730、LOC_Os05g31830和LOC_Os05g31890)，对候选基因转基因敲除材料的苗期耐盐表型鉴定，结果发现LOC_Os05g31730(OsCHX11)敲除株系与野生型之间的耐盐性存在显著差异，因此，将OsCHX11作为qST5的重要候选基因。
(3)盐胁迫处理下，与野生型相比，OsCHX11敲除株系的耐盐性显著下降，而OsCHX11过表达株系的耐盐性显著提高，表明OsCHX11正向调控水稻耐盐性。
(4)盐胁迫处理下，与野生型相比，OsCHX11敲除株系地上部的Na+和K+浓度均显著增加，根部的Na+浓度显著增加，而K+浓度无显著变化，推测OsCHX11具有调节水稻钠钾离子稳态的作用。
(5)RT-qPCR分析表明OsCHX11受到盐胁迫诱导上调表达，且主要在根部表达。GUS染色分析发现OsCHX11主要在根中柱中表达；亚细胞定位显示OsCHX11在细胞膜上表达。
附图说明
图1为2655份水稻种质苗期耐盐性表型评价；在admix、Aus、Basmati、GJ和XI群体的SSD、SST和VGI的箱线图(如左图所示)，在GJ-adm、GJ-sbtrp、GJ-tmp、GJ-trp、XI-1A、XI-1B、XI-2、XI-3和XI-adm亚群的SSD、SST和VGI的箱线图(如右图所示)，不同的字母代表存在显著差异(n代表材料数，p<0.05，Duncan检验)。
图2为苗期耐盐性相关性状在总群体中的GWAS结果。(a)SST、SSD和VGI的GWAS结果的曼哈顿图和QQ图；(b)总群体、籼稻群体和粳稻群体检测到显著关联SNPs的韦恩图；(c)总群体、籼稻群体和粳稻群体检测到显著关联SNPs所在基因的韦恩图；(d)耐盐位点qST5的局部LD分析。
图3为候选基因转基因敲除株系靶点突变类型。(a)LOC_Os05g31720的转基因敲除株系靶点的突变类型；(b)LOC_Os05g31830的转基因敲除株系靶点的突变类型；(c)LOC_Os05g31890的转基因敲除株系靶点的突变类型；(d)以A173为背景的LOC_Os05g31730转基因敲除株系靶点的突变类型；(e)以SE327为背景的LOC_Os05g31730转基因敲除株系靶点的突变类型。
图4为用潮霉素筛选转基因过表达株系的琼脂糖凝胶电泳图和转基因过表达株系基因的表达水平情况。
图5为qST5候选基因的转基因敲除株系耐盐表型鉴定。(a)LOC_Os05g31720转基因敲除株系耐盐表型评价及存活率；其中，a图中左起一图和二图为第一种突变类型KO-1的耐盐表型及存活率，左起三图和四图为第二种突变类型KO-2的耐盐表型及存活率。(b)LOC_Os05g31830转基因敲除株系耐盐表型评价及存活率，其中b图的表型图中三种水稻植株依次为WT、KO-1和KO-2；(c)LOC_Os05g31890转基因敲除株系耐盐表型评价及存活率，其中c图的表型图中三种水稻植株依次为WT、KO-1和KO-2。数据代表3次重复的平均值±标准差，相同字母代表无显著性差异，不同字母代表显著性差异，p<0.05，Duncan检验，标尺＝10cm。
图6为盐胁迫处理13dLOC_Os05g31730(OsCHX11)转基因敲除和过表达材料的表型评价。(a)A173背景敲除株系KO-1与野生型表型及存活率；(b)A173背景敲除株系KO-2与野生型表型及存活率；(c)SE327背景敲除株系KO-1与野生型表型及存活率；(d)SE327背景敲除株系KO-2与野生型表型及存活率；(e)SE210背景过表达株系OE-1与野生型表型及存活率；(f)SE210背景过表达株系OE-2与野生型表型及存活率；数据代表3次重复的平均值±标准差，相同字母代表无显著差异，不同字母代表显著性差异，p<0.05，Duncan检验，标尺＝10cm。
图7为OsCHX11响应盐胁迫的表达模式。(a)OsCHX11在地上部的表达模式；(b)OsCHX11在根部表达模式；数据代表3次重复的平均值±标准差。
图8为载体构建示意图。(a)目的基因OsCHX11的克隆；(b)亚细胞定位pYBA113235sPro-C EGFP植物瞬时表达载体示意图；(c)OsCHX11基因启动子扩增片段；(d)启动子分析载体pBWA(V)HG-启动子-GUS的示意图。
图9为OsCHX11亚细胞定位结果。
图10为OsCHX11和OsMCA1共定位结果
图11为水稻组织GUS染色结果图。(a)水稻幼苗在盐处理0h和24h的GUS染色情况，标尺＝1cm；(b)水稻主根GUS染色情况，标尺＝500μm；水稻根部横切面(c)和放大后的维管束部分(d)的GUS染色情况，标尺＝50μm。
图12为以SE327为背景的OsCHX11敲除株系在正常条件下和盐胁迫处理11d的表型测定。(a)正常条件下和盐处理条件下敲除株系和其野生型的地上部高度；(b)主根长度；(c)地上部鲜重；(d)根部鲜重；(e)地上部干重；(f)根部干重；数据为3次重复的平均值±标准差，相同字母代表无显著差异，不同字母代表显著性差异，p<0.05，Duncan检验。
图13为以SE327为背景的OsCHX11敲除株系在正常条件下和盐处理11d的钠钾离子浓度测定。(a)地上部Na+浓度；(b)根部Na+浓度；(c)地上部K+浓度；(d)根部K+浓度；(e)地上部Na+/K+比值；(f)植株根部Na+/K+比值；数据代表3次重复的平均值±标准差，相同字母代表无显著差异，不同字母代表显著性差异，p<0.05，Duncan检验。
图14为OsCHX11敲除株系和野生型SE327的钠钾离子吸收速率测定。(a)地上部Na+净吸收速率；(b)地上部K+净吸收速率；(c)根部Na+净吸收速率；(d)K+净吸收速率；数据为3次重复的平均值±标准差，相同字母代表无显著差异，不同字母代表显著性差异，p<0.05，Duncan检验。
图15为WMC025-pCBSG032敲除载体图谱。
图16为pEXT06/g过表达载体图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
下述实施例采用R软件对数据进行处理，实验结果以平均值±标准偏差表示，相同字母代表无显著差异，不同字母代表显著性差异，p<0.05，Duncan检验。
PIN GAEW 56::IRGC 7887-1(后续简称PIN或PIN水稻)、KAM PAI::IRGC 78245-1(后续简称KAM或KAM水稻)、ALAGUSAMBA::IRGC 8944-2(后续简称A173或A173水稻)、Yueguang(后续简称SE327或SE327水稻)、感盐粳稻材料M 3122(后续简称SE210)：记载于非专利文献“WANG W S,MAULEON R,HU Z Q,CHEBOTAROV D,TAI S S,WU Z C,LI M,ZHENG TQ,FUENTES R R,ZHANG F,MANSUETO L,COPETTID,SANCIANGCO M,PALIS K C,XU J L,SUNC,FU B Y,ZHANG H L,GAO Y M,ZHAO X Q,SHEN F,CUI X,YU H,LI Z C,CHEN M L,DETRASJ,ZHOUY L,ZHANG XY,ZHAO Y,KUDRNA D,WANG C C,LI R,JIA B,LU J Y,HE X C,DONG ZT,XU J B,LI Y H,WANG M,SHI J X,LI J,ZHANG D B,LEE S,HU W S,POLIAKOV A,DUBCHAKI,ULAT V J,BORJA F N,MENDOZA J R,ALI J,LI J,GAO Q,NIU YC,YUE Z,NAREDO M E B,TALAG J,WANG X Q,LI J J,FANG X D,YIN Y,GLASZMANN J C,ZHANG J W,LI J Y,HAMILTON R S,WING R A,RUAN J,ZHANG G Y,WEI C C,ALEXANDROV N,MCNALLY K L,LI ZK,LEUNG H,2018.Genomic variation in 3,010 diverse accessions of Asiancultivated rice.Nature,557(7703):43-49.DOI:
10.1038/s41586-018-0063-9.”的附表中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。
实施例1、水稻苗期耐盐性全基因组关联分析
1材料与方法
1.1水稻自然群体材料
本实施例基于对3000份水稻基因组(3000 rice genomes project 2014，3K RGP)中的2655份水稻材料进行苗期精准耐盐性评价，这些水稻种质源自全球89个国家，其中包括1577份籼稻(Xian/indica,XI)，748份粳稻(Geng/japonica,GJ)、85份Admix，184份Aus和61份Basmati。
1.2水稻苗期耐盐性表型鉴定
2019年在北京中国农业科学院作物科学研究所的温室中对水稻苗期耐盐性进行评价，温室条件设置为白天28℃，晚上22℃，相对湿度设置为60％-68％。使用塑料材质的盒子和10×13孔的泡沫板培养水稻幼苗，在每个泡沫板底部粘上尼龙网，以防止种子掉落。本实施例选取2655份水稻材料，在每份材料中挑选饱满的水稻种子置于50℃烘箱中烘两天，打破休眠，保证种子的发芽率，用5％的次氯酸钠溶液浸泡20-25min对种子进行消毒，用蒸馏水仔细清洗后，浸种24h、催芽24h至种子露白，挑选两粒露白整齐一致的种子放入泡沫板的孔中，每份材料播10个孔，设置3次生物学重复，先用pH值为5.0的自来水培养2d，在第3天时，施用pH值为5.1-5.5的Yoshida营养液，每5d更换一次营养液，在三叶期时，施用含70mMNaCl的营养液，培养2d后，增加营养液中NaCl的浓度至140mM NaCl继续培养，直至最后一颗水稻幼苗死亡。
当盐处理后出现第一棵水稻幼苗死亡时，开始记录水稻幼苗的存活天数(Seedling survival days，SSD)，当水稻自然群体出现明显的耐盐表型分化时，按照水稻标准评价系统(CHAUDHARY,1996)评价每份材料的盐害级别(Score of salt toxicity，SST)，根据幼苗受到盐胁迫的损伤程度划分为1-9个级别(表1)，以SSD和SST的比值，作为营养指数(Vegetative index，VGI)，用于综合评价水稻苗期的耐盐性。
表1水稻苗期耐盐性标准评价体系
| 盐害级别 | 受害症状 |
| 1 | 幼苗正常生长，且叶片几乎没有受到盐胁迫的损伤 |
| 3 | 幼苗叶片出现干枯、发黄率≤30％ |
| 5 | 幼苗叶片干枯、发黄率介于30％～60％之间 |
| 7 | 大部分幼苗死亡 |
| 9 | 几乎所有幼苗都死亡或接近死亡 |
1.3全基因组关联分析(Genome-wide association study，GWAS)
从Rice SNP Seek数据库(http://snp-seek.irri.org/)(ALEXANDROV et al.,2015)中下载3KRGP的4.8M高密度SNP数据集利用Plink软件(PURCELL et al.,2007)提取上述2655份材料的SNP基因型，保留缺失率小于20％和最小等位基因频率大于5％的SNPs，最终获得2988765，2023171，1464275个SNPs分别用于总群体、籼稻群体和粳稻群体的GWAS。使用EMMAX(Efficient mix-model association expedited)(KANG et al.,2010)检测SNP与耐盐性相关性状之间的关联。亲缘矩阵的计算首先使用Plink进行连锁不平衡SNPs的过滤(参数indep-pairwise 50 10 0.1)，然后利用EMMAX计算亲缘矩阵(参数emmax-kin-v-h-d10)。基于GCTA软件(YANG et al.,2011)的make-grm模块生成GRM矩阵，进行主成分分析，并提取前3个主成分作为协变量用于控制群体结构。利用GEC软件(LI et al.,2012)计算有效独立SNP数目N，并使用Bonferroni校正法计算suggestive p-value的显著阈值(1/N)，确定p＝1.98E-6、2.71E-6和5.48E-6分别为总群体、籼稻群体和粳稻群体的显著阈值。使用R语言的“qqman”包(TURNER,2014)进行曼哈顿图和QQ图的绘制。根据3K水稻种质资源群体的LD衰减距离(WANG et al.,2018)，将300kb以内的显著SNP归为一个关联位点，一个关联位点中p值最小的SNP被定义为lead SNP。
1.4候选基因的预测
基于GWAS结果，将3个耐盐相关性状的显著关联SNPs进行整理，在qST5内筛选注释为错义突变和启动子区域突变的显著关联SNPs所在基因，根据日本晴参考基因组IRGSP1.0(KAWAHARA et al.,2013)和funRiceGenes数据库(https://funricegenes.github.io)(YAO W,LI G,YU Y,OUYANG Y,2018.FunRiceGenes dataset for comprehensiveunderstanding and application of rice functional genes.GigaScience,7(1):1-9.DOI:10.1093/gigascience/gix119.)中基因功能注释和非生物胁迫相关已克隆基因信息，结合基因单倍型分析、GO(Gene Ontology)注释以及Plant Public RNA-seq Database(http://ipf.sustech.edu.cn/pub/ricerna/)分析筛选耐盐候选基因。使用LDBlockShow软件(DONG et al.,2021)推测候选基因的局部LD区域。
1.5转基因材料的构建
1.5.1转基因敲除材料的载体构建
根据候选基因进行gRNA的靶点设计，靶点选择位于基因的外显子上，且尽量靠近蛋白前端或重要功能domin区，PAM序列为NGG，设计出合适的靶点后确保该靶点具有特异性。靶点序列见表2。
表2靶点信息
注：靶点位置是指该靶点在该基因的核苷酸序列上的位置，如靶点T31720的靶点位置位于LOC_Os05g31720基因核苷酸序列(CDS)(CDS序列NCBI genbank:BAS93775.1)的980到1002位。
参照非专利文献“MA X,ZHANG Q,ZHU Q,LIU W,CHEN Y,QIU R,WANG B,YANG Z,LIH,LIN Y,XIE Y,SHEN R,CHEN S,WANG Z,CHEN Y,GUO J,CHEN L,ZHAO X,DONG Z,LIU Y G,2015.A Robust CRISPR/Cas9 system for convenient,hi gh-efficiency multiplexgenome editing in monocot and dicot plants.Molecular Plant,8(8):1274-84.DOI:10.1016/j.molp.2015.04.007”进行CRISPR-Cas9载体构建：
以含有上述靶点的sgRNA序列(含有靶点序列和sgRNA骨架)替换载体WMC025-pCBSG032敲除载体(图谱见图15，常州新米生物科技有限公司)的第1157到1292位碱基之间的核苷酸序列，得到重组敲除载体Cas9/T31720-sgRNA、Cas9/T31890-sgRNA、Cas9/T31830-1-sgRNA、Cas9/T31830-2-sgRNA、Cas9/T31730-1-sgRNA、Cas9/T31730-2-sgRNA、Cas9/T31730-3-sgRNA和Cas9/T31730-4-sgRNA，各sgRNA对应的重组敲除载体表达靶向于各靶点的sgRNA和Cas9蛋白。
1.5.2T0代转基因敲除植株的构建
将候选基因LOC_Os05g31720的重组敲除载体Cas9/T31720-sgRNA以PIN作为敲除材料的受体材料，候选基因LOC_Os05g31830的重组敲除载体Cas9/T31830-1-sgRNA、Cas9/T31830-2-sgRNA以及LOC_Os05g31890的重组敲除载体Cas9/T31890-sgRNA均以KAM作为敲除材料的受体材料；候选基因LOC_Os05g31730的重组敲除载体Cas9/T31730-1-sgRNA、Cas9/T31730-2-sgRNA选择粳稻材料SE327作为转基因敲除株系的受体材料，而该基因的重组敲除载体Cas9/T31730-3-sgRNA和Cas9/T31730-4-sgRNA选择籼稻材料A173作为转基因敲除株系的受体材料。具体转化方法如下：将重组敲除载体转至农杆菌感受态细胞，得到各含重组敲除载体的重组菌，再通过农杆菌介导的遗传转化法转化前述受体材料，经PCR验证为阳性植株后，获得T0代转基因敲除植株，包括候选基因LOC_Os05g31720的T0代转基因敲除植株，候选基因LOC_Os05g31830的T0代转基因敲除植株、LOC_Os05g31890的T0代转基因敲除植株以及以A173和SE327为背景候选基因LOC_Os05g31730的T0代转基因敲除植株。
1.5.3 T3代转基因敲除植株的鉴定
收集前述T0代转基因敲除植株的种子，在北京顺义、海南三亚进行进行繁种加代，得到T3代转基因敲除植株。提取T3代转基因敲除植株的每个单株取叶片的DNA。以前述DNA为模板，利用下表中的引物(引物由擎科生物科技(北京)有限公司合成)进行PCR并测序，用DNAMAN和BioEdit软件对靶点序列进行比对，比较野生型和转基因敲除材料的序列差异，对每个候选基因至少挑选两种纯合突变类型单株进行收种留用。
表3转基因敲除植株所用引物及相关信息
1.6转基因过表达材料的构建及表型验证
1.6.1过表达载体构建
LOC_Os05g31730的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，共453aa，LOC_Os05g31730的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2，共1362bp。
扩增LOC_Os05g31730的耐盐材料的编码序列(CDS)(核苷酸序列是SEQ ID No.2)，将扩增得到的目的片段利用同源重组酶连接至载体pEXT06/g(载体图谱见图16，含潮霉素抗性基因(Hyg)，常州新米生物科技有限公司)的第2266到第2267位碱基之间，得到过表达载体pEXT06-OsCHX11，过表达载体pEXT06-OsCHX11是以SEQ ID No.2替代pEXT06载体的第2266到第2267位碱基之间的序列得到的重组表达载体，该重组表达载体表达候选基因LOC_Os05g31730。
1.6.2转基因过表达水稻的获得
将过表达载体pEXT06-OsCHX11转至农杆菌感受态细胞EHA105，得到重组菌EHA105/pEXT06-OsCHX11。
通过农杆菌介导的遗传转化法转化SE210水稻，获得OsCHX11基因过表达的SE210水稻。具体转化方法如下：
1、愈伤诱导与继代
挑选成熟SE210水稻种子(最好是当年新收种)，剥离颖壳，倒入50ml离心管中，加入75％乙醇消毒1min，倒掉乙醇，无菌水冲洗一遍，倒掉，再加入30％次氯酸钠消毒20min，倒掉次氯酸钠后用无菌水冲洗5-6遍。移液枪吸去多余的水份(可用灭菌过的滤纸吸干)，将种子转移到诱导培养基上，每皿20-25颗种子。
愈伤长出后可用原胚直接做转化，原胚旁边长出的小颗粒可挑取到新的诱导培养基上进行继代培养，长到适宜的大小时同样可以进行转化。
诱导培养基配方：N6基本培养基+300mg/L脯氨酸+600mg/L水解酪蛋白+2.5mg/L2,4-D+30g/L蔗糖+3g/L Phytagel(pH 5.8)，溶剂为水。
2、农杆菌培养
将含有目的基因载体的农杆菌EHA105在含有相应抗生素的平板上划线，28℃黑暗培养2天至出现单菌落。
3、农杆菌侵染
准备侵染液，用移液器吸取侵染液将平板上的农杆菌冲洗下来即共培养转化水稻用的农杆菌悬浮液。
挑选足够数量的愈伤组织(愈伤状态良好，颜色鲜黄，质地圆润坚硬，颗粒直径在3mm左右为宜)放入100ml无菌三角瓶中，加入适量农杆菌悬浮液(保证有足够的菌液与材料接触即可)，室温放置侵染20分钟，并不时晃动。倒掉菌液，将愈伤组织放在无菌滤纸上吸去多余菌液，随即转移到铺有一层无菌滤纸的固体共培养基上，26℃黑暗培养3天。
4、筛选培养
共培养3天后的愈伤组织要进行清洗步骤，用1ml的蓝枪头将共培养基上的愈伤播到已灭菌的三角瓶中，加入无菌水冲洗两边，第三遍用含有500ul/L羧苄青霉素的无菌水冲洗一遍，移液枪吸掉多余水分后将愈伤转移到无菌滤纸上利用超净台的风吹干愈伤上的水，吹风时间控制在30min左右，待愈伤吹干后转移到筛选培养基上进行筛选培养，培养条件28-30度，暗培养。筛选时长3-4周。
共培养基配方：1/2N6基本培养基+2,4-D 2.0mg/L+20g/L蔗糖+10g/L葡萄糖+200mg/L乙酰丁香酮+7g/L Agar(pH 5.2)，溶剂为水。
筛选培养基配方：N6基本培养基+2.5mg/L 2,4-D+30g/L蔗糖+7g/L Agar+50mg/L潮霉素+250mg/L羧苄青霉素(pH5.8)，溶剂为水。
5、分化再生
筛选一个月后，可见颜色鲜黄的阳性愈伤长出，此时可将阳性愈伤挑取到分化培养基上进行分化再生。每个分化皿上放16颗阳性愈伤，置于28-30度温室中光照培养。一般10天左右可将愈伤冒出绿点，在经过10天左右会有幼苗分化出。
分化培养基配方：MS基本培养基+2.0mg/L 6-BA+2.0mg/L KT+0.2mg/L NAA+0.2mg/L IAA+30g/L蔗糖+3g/L Phytagel(pH 6.0)，溶剂为水。
6、幼苗生根
待分化出的幼苗长到2-3cm左右，有明显根系的时候就可以将幼苗转移到生根培养基上让幼苗长大，生根培养基要倒在比较高的瓶子或管子里，生根后的苗子才有足够的空间长高，生根培养条件28-30度，无菌光照培养。收集前述T0代转基因敲除植株的种子，繁种加代至T3代，得到T3代转OsCHX11基因水稻。
生根培养基配方：MS基本培养基+20g/L蔗糖+3g/L Phytagel(pH 5.8)
1.6.3 PCR验证
采用TPS法提取T3代过表达OsCHX11基因水稻株系和野生型对照水稻(SE210水稻)的叶片基因组DNA，取少量水稻植株叶片置于2mL离心管中，加入2个钢珠，用打样机将水稻叶片打成粉末，加入1mL的TPS提取液，放置65℃烘箱中30min，裂解水稻样品，离心12000rpm，10min后吸取上清液，并加入0.5mL的异丙醇至1.5mL离心管中，放置-20℃冰箱1h，然后12000rpm，离心6min，弃上清后加入200μL的75％的乙醇洗涤，放到通风橱中吹干，加入0.2mL的ddH2O。
表4 TPS的配方
以水为空白对照。每个株系随机取8株。以前述DNA为模板，利用引物HYG-F和HYG-RPCR扩增潮霉素抗性基因(Hyg)基因，检测前述植株是否为转基因阳性植株。
HYG-F：5'-TTGGCGACCTCGTATTGGGAA-3'；
HYG-R：5'-CAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACT-3'；
阳性植株评价标准：以T3代转基因过表达植株的叶片DNA为模板，利用HYG-F和HYG-R进行PCR得到500bp的潮霉素抗性基因(Hyg)核苷酸片段的植株为阳性植株。将T3代过表达OsCHX11基因水稻株系中验证为阳性植株的水稻命名为SE210背景过表达株系OE-1和SE210背景过表达株系OE-2(分别简称OE-1和OE-2)。对阳性纯合单株和野生型测定表达量，选择比野生型表达量高的两种过表达单株作为后续实验验证的材料。
对野生型SE210、OE-1和OE-2分别测定表达量，分析结果发现，OE-1的表达量较野生型SE210的表达量高出2997.351倍，而OE-2的表达量较野生型高出7.762倍，结果如图4(b)和(c)所示。
1.6.4转基因材料的苗期耐盐性评价
含140mM NaCl的Yoshida营养液：在Yoshida营养液中加入NaCl，使NaCl的含量为140mM得到的液体。
Yoshida营养液：制备方法参考文献为“YOSHIDA S,FORNO DA,COCK J,1976.Laboratory manual for physiological studies of rice.The InternationalRice Research Institute,Manila,Philippine:IRRI,1976:1-83.”
实验重复3次取平均值，每次重复如下：
分别取饱满的SE210种子及其对应过表达株系OE-1和OE-2的种子各100粒，置于50℃烘箱中烘两天，打破休眠，保证种子的发芽率，用5％的次氯酸钠溶液浸泡20-25min对种子进行消毒，用蒸馏水仔细清洗后，浸种24h、催芽24h至种子露白，挑选两粒露白整齐一致的种子播种在黑色水培盒中。将黑色水培盒置于人工气候室的条件设置为28℃光照16h，25℃黑暗8h，相对湿度60％-80％的人工气候室中。先用pH值为5.0的自来水培养2d，在第3天时，将植株根系完全浸于pH值为5.1-5.5的Yoshida营养液培养，每5d更换一次Yoshida营养液，培养18天至水稻幼苗生长至三叶期。将三叶期的水稻幼苗的根系完全浸于含140mMNaCl的Yoshida营养液中培养，每隔5d更换一次含140mM NaCl的Yoshida营养液，以施用含140mM NaCl的Yoshida营养液的当天为第0天，至第13天观察表型，拍照并记录存活率。存活率＝存活的水稻幼苗数/总幼苗数×100％。
共设置两个相同的SE210组，分别用做OE-1组和OE-2组的对照。
2结果分析
2.1 2655份水稻种质资源苗期耐盐性评价
对2655份水稻种质资源的苗期耐盐性评价结果发现，盐胁迫对水稻幼苗的影响在不同水稻材料间的差异很大，总群体SST分布在2.8～9.0之间，SSD分布在2.52～13.78d之间。与籼稻相比，粳稻具有较高的SST和较低的SSD，粳稻亚群的平均SST为6.28，平均SSD为8.53，而籼稻亚群的平均SST为6.10，平均SSD为8.94，这表明籼稻比粳稻更耐盐，其中以地方品种为主的东亚籼稻亚群(XI-1A)的耐盐性显著强于现代籼稻品种亚群(XI-1B)(图1)，推测在籼稻育种过程中品种的耐盐性可能伴随着对主要农艺性状的选择而间接降低。
2.2水稻苗期耐盐性相关性状的全基因组关联分析
基于2655份水稻种质资源的苗期耐盐性表型评价结果，采用混合线性模型对SSD、SST和VGI进行GWAS(图2中a)。p值小于suggestive p-value的SNPs被认为是与耐盐性显著关联的SNPs。结果在总群体、籼稻、粳稻中分别检测到394、514、39个显著关联的SNPs，共涉及612个不同的SNPs。其中有335个SNPs在总群体和籼稻亚群中被共同定位到，而籼粳亚群间没有共同定位到的SNPs(图2中b)。进一步分析发现籼稻群体与粳稻群体中检测到的显著SNP所在基因之间也没有重叠(图2中c)。另外，为了减少不同性状关联的冗余，将300kb以内的相邻SNP定义为一个locus，结果在3个性状中共检测到28个locus(表5)。
表5水稻苗期耐盐性相关性状GWAS结果
表5(续)
2.3苗期耐盐候选基因分析
通过GWAS检测到612个显著关联的SNPs位于98个基因上或基因间，其中有85％(521个)的SNPs落在第5号染色体上，且在该染色体上的显著关联SNPs有95％落在一个～136kb的LD区间内(图2中d)。基于日本晴参考基因组IRGSP 1.0，在这612个SNPs中选择注释为错义突变和启动子区域突变的显著关联SNPs所在基因，结果在qST5区域内共发现17个注释基因，其中有4个假定蛋白，4个转座子/反转录转座子，通过基因单倍型分析从剩余9个基因中筛选出LOC_Os05g31720、LOC_Os05g31730、LOC_Os05g31830、LOC_Os05g31890作为候选基因(表6)。
表6 qST5区域内耐盐候选基因的筛选分析
2.4转基因株系纯合植株的选择
(1)转基因敲除株系的纯合植株的选择
对LOC_Os05g31720候选基因靶点位置产生的突变类型进行统计，挑选两个纯合的突变类型，一种突变类型为一个G碱基的插入(插入位置为LOC_Os05g31720的CDS序列(参见NCBI genbank:BAS93775.1)的第985和986位碱基之间)，另一种突变类型为一个T碱基的插入(插入位置为LOC_Os05g31720的CDS序列(参见NCBI genbank:BAS93775.1)的第985和986位碱基之间)(图3中a)；对候选基因LOC_Os05g31830的突变类型进行统计，此基因的转基因材料为双靶点敲除，第一个类型是第一个靶点缺失5个碱基(缺失位置为LOC_Os05g31830的CDS序列(参见NCBI genbank:BAS93789.1)的第42到46位碱基)，第二个靶点一个T碱基插入(插入位置为LOC_Os05g31830的CDS序列(参见NCBI genbank:BAS93789.1)第983和984位碱基之间)，第二个突变类型是第一个靶点为一个碱基C插入(插入位置为LOC_Os05g31830的CDS序列(参见NCBI genbank:BAS93789.1)的第43和44位碱基之间)，第二个靶点为多碱基的缺失(缺失位置为LOC_Os05g31830的CDS序列(参见NCBI genbank:BAS93789.1)的第978到1024位碱基)(图3中b)；对候选基因LOC_Os05g31890的突变类型进行统计，为单靶点敲除，一种类型是一个碱基的替换(将LOC_Os05g31890的CDS序列(参见NCBI genbank:BAS93794.1)的第414位碱基G替换为A)和两个碱基的缺失(缺失位置为LOC_Os05g31890的CDS序列(参见NCBI genbank:BAS93794.1)的第415到416位碱基)，另一种突变类型是一个碱基C的缺失(缺失位置为LOC_Os05g31890的CDS序列(参见NCBI genbank:BAS93794.1)的第418位碱基)(图3中c)。
候选基因LOC_Os05g31730以A173为背景的转基因敲除材料两个突变类型均为双靶点敲除，一种突变类型是一个碱基A插入(插入位置为SEQ ID No.2的第113和114位碱基之间)，和多个碱基缺失(缺失位置为SEQ ID No.2的第221到252位碱基之间)，另一种突变类型是两个靶点均是T插入(插入位置为SEQ ID No.2的第113和.114位碱基之间、SEQ IDNo.2的第233和234位碱基之间)(图3中d)。而以SE327为背景的转基因敲除材料两个突变类型均为双靶点敲除，一种突变类型是两个靶点均是A插入(插入位置为SEQ ID No.2的第113和114位碱基之间、SEQ ID No.2的第233和234位碱基之间)，另一种突变类型是两个靶点均是T插入(插入位置为SEQ ID No.2的第112和113位碱基之间、SEQ ID No.2的第233和234位碱基之间)(图3中e)，这两个背景的两种突变类型的转基因敲除株系，均由于第一个靶点位置碱基的插入导致蛋白提前终止。
(2)转基因过表达株系的选择
由于潮霉素选择会有一定的假阳性，因此从野生型株系SE210中随机选择8个单株作为对照。结果如图4所示，其中，第一排中前8列的泳道为野生型株系SE210的8个单株，且野生型无条带，图中其他条带均为SE210背景过表达单株，其中有条带的，且条带大小在500bp的为转基因过表达阳性植株，挑选同一份材料的不同单株均有条带的为纯合材料，用于后续实验。OE-1和OE-2均是从纯合的转基因过表达材料中挑选的单株。
2.5候选基因的苗期耐盐性功能验证
对候选基因LOC_Os05g31720、LOC_Os05g31830、LOC_Os05g31890的转基因敲除材料进行苗期耐盐性表型评价，结果如图5所示，LOC_Os05g31830、LOC_Os05g31890这两个候选基因的转基因敲除株系与野生型的长势情况无显著差异(图5中b和c)，LOC_Os05g31830野生型的存活率为94％，转基因敲除株系KO-1和KO-2的存活率分别为88％和84％(图5中b图)；LOC_Os05g31890野生型的存活率为50％，转基因敲除株系KO-1和KO-2的存活率为54％和67％(图5中c图)；LOC_Os05g31720的第一种突变类型KO-1(SEQ ID No.3的第985和986位碱基之间插入一个G)的存活率为71％，对应野生型的存活率为79％，二者之间无显著差异，但是第二个突变类型KO-2(SEQ ID No.3的第985和986位碱基之间插入一个T)的存活率为67％，对应野生型株系的存活率为90％，二者之间存在显著差异(图5中a图)。
LOC_Os05g31730的转基因敲除材料进行苗期耐盐性表型评价结果如图6中a-d所示。如图6中a图和b图所示，LOC_Os05g31730以籼稻耐盐材料A173为背景的两种突变类型在140mMNaCl条件下的存活率分别为64％(KO-1)和67％(KO-2)，相较于野生型的存活率(93％和88％)显著降低(P<0.05)。类似的，以粳稻耐盐材料SE327为背景的两种突变类型在140mMNaCl条件下的存活率分别为58％(KO-1)和71％(KO-2)，相较于野生型的存活率(81％和92％)也显著降低，图6中c图和d图。
以粳稻敏盐材料SE210为背景的过表达株系OE-1和OE-2的在140mM NaCl条件下的存活率分别为82％和59％，显著高于野生型的存活率(28％和33％)(图6中e图和f图)。
由此可见，LOC_Os05g31730转基因敲除材料和过表达材料与野生型之间的耐盐性差异最显著。综上，将OsCHX11(LOC_Os05g31730)作为qST5的重要候选基因开展后续研究。
实施例2、水稻耐盐基因OsCHX11的生理机制和表达特性分析
下述引物由擎科生物科技(北京)有限公司合成，引物序列见表7。
表7转基因材料所用引物及相关信息
1.1 OsCHX11基因诱导表达模式分析
将日本晴水稻幼苗培养至三叶一心期，施用含140mM NaCl的营养液培养，同时以不施用NaCl的营养液培养的水稻幼苗作为对照，处理和对照均设置3个生物学重复，分别在盐处理0h、0.5h、1h、2h、3h、4h、6h、8h、12h时取样，每个重复随机取5株长势一致的幼苗，将地上部和根部分别用锡纸包裹，快速置于液氮中冷冻，保存至-80℃冰箱，采用Trizol法分别提取植株地上部分和根部的RNA，利用实时荧光定量PCR(Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR)定量检测OsCHX11基因地上部及根部的表达情况。
利用天根(TIANGEN)生化科技(北京)有限公司的试剂盒(SYBR Green I)进行荧光定量PCR分析，引物为OsCHX11-RT-F和OsCHX11-RT-R。反应体系及反应条件均按照SYBRGreen Ⅰ试剂盒标准。
每个样品进行3个生物学重复，3个技术性重复，得到每个基因的相对定量，以UBQ为内参(引物为UBQ-F/UBQ-R)，在ABI 7500软件上进行定量分析，并参考2-ΔΔCT法计算基因的相对表达量。
1.2植物瞬时表达载体的构建
取日本晴材料的cDNA进行OsCHX11的扩增，利用同源重组的方法，根据PYBA-1132-GFP载体上的BamHI和EcoRI两个酶切位点设计引物，去除目的基因的终止密码子，以保证目的基因与GFP融合，OsCHX11的扩增引物为OsCHX11-F/OsCHX11-R。使用高保真KOD酶两步法扩增目的基因，同时用BamHI和EcoRI对载体在37℃的条件下进行酶切，对正确的目的基因条带和载体片段进行回收，采用同源重组酶50℃，连接15min，转化大肠杆菌，涂在LB固体培养基上，并对培养基上的单克隆菌落进行测序，检测载体构建成功的测序引物为1132-F/1132-R。将测序正确的菌液按照1:1的比例加入50％的甘油，放在-80℃冰箱里长期保存，并将前述菌液命名为含pYBA-1132-OsCHX11-GFP载体的大肠杆菌。
1.3无内毒素质粒的提取
取已构建成功的含OsCHX11-GFP载体的大肠杆菌的菌液按照1:1000的比例取25μL菌液至250mL的LB液体培养基中，震荡培养16h左右。然后用试剂盒提取无内毒素质粒，并测定其浓度，放到-20℃冰箱中保存。
1.4水稻原生质体的转化
水稻原生质体的转化方法和所用溶液参照非专利文献“Sang-Dong Yoo,Young-Hee Cho&Jen Sheen.Arabidopsis mesophyll protoplasts:a versatile cell systemfor transient gene expression analysis.Nature Protocols 2,1565-1572(2007).”中所示方法进行下述处理：
①将OsCHX11-GFP载体(实验组，即pYBA-1132-OsCHX11-GFP载体)、GFP载体(对照组，即PYBA-1132-GFP载体)分别转入水稻原生质体，激光共聚焦显微镜拍照观察。
②将OsMCA1-makte载体(制备方法参见“KURUSU T,NISHIKAWA D,YAMAZAKI Y,GOTOH M,NAKANO M,HAMADA H,YAMANAKA T,IIDA K,NAKAGAWA Y,SAJI H,SHINOZAKI K,IIDA H,KUCHITSU K,2012.Plasma membrane protein OsMCA1 is involved inregulation of hypo-osmotic shock-induced Ca2+influx and modulates generationof reactive oxygen species in cultured rice cells.BMC Plant Biology,12:11.DOI:10.1186/1471-2229-12-11.”KURUSU et al.,2012)和OsCHX11-GFP载体共转染水稻原生质体作为实验组、OsMCA1-makte载体和GFP载体共转染水稻原生质体作为对照组，激光共聚焦显微镜拍照观察。
1.5植物启动子分析表达载体的构建
以OsCHX11-gus-F/OsCHX11-gus-R为引物，水稻日本晴材料的基因组DNA为模板，扩增OsCHX11的起始密码子ATG上游2460bp的序列。将起始密码子ATG上游2460bp的序列作为启动子序列，通过同源重组的方法连接到pBWA(V)HG-ccdB-GUS载体(载体构建由武汉伯远生物有限公司完成，参考文献ASHOK C,ANITAD D,NAYAN T S,2019.Isolation,cloningand expression of CCA1 gene in transgenic progeny plants of Japonica riceexhibiting altered morphological traits.PLoS One,14(8):e0220140.DOI:10.1371/journal.pone.0220140.)的35S和GUS之间，得到重组表达载体，将该重组表达载体利用农杆菌介导的遗传转化法转化水稻日本晴材料，培育至获得T0代种子，后续在海南三亚及北京顺义的转基因地进行繁种。
1.6 OsCHX11转基因材料表型数据测定
将野生型(SE327)和转基因材料(SE327背景敲除株系KO-1、SE327背景敲除株系KO-2和SE327背景敲除株系KO-3)按照实施例1中1.2的方法培养至三叶期，然后用140mMNaCl的营养液进行盐胁迫处理，以正常营养液培养的水稻幼苗作为对照组，对照和处理各设置3次生物学重复，在盐处理第5天和第11天时，在每份材料中随机选取3颗长势一致的幼苗测量株高(Shoot length,SL)、主根长度(Primary root length,PRL)、地上部鲜重(Shoot fresh weight,SFW)、地下部鲜重(Root fresh weight,RFW)，将植株的地上部和根部分别装入浸种袋内，放到烘箱80℃烘干数天，称量地上部干重(Shoot dry weight,SDW)和地下部干重(Root dry weight,RDW)。
1.7 OsCHX11转基因材料钾钠离子浓度测定
将1.6称量干重后的转基因植株和野生型植株的地上部和根部分别转移至50mL的离心管中，向离心管中加入适量(地上部加入20mL，根部10mL)的冰醋酸溶液(蒸馏水：冰醋酸＝2000:11.43)，放在90℃的恒温震荡水浴锅中，浸提2h，取出后冷却至室温，然后将上清液转移至2mL离心管中进行稀释，离心待测定。
利用S2型火焰原子吸收光谱仪(Thermo Electron Corporation)测定离子含量。在波长589nm下测定Na+浓度，在766.5nm下测定K+浓度。测定样品之前，先用1000μg/mL的K+和Na+标准液配置标准样品离子浓度梯度(分别为1ppm、5ppm、10ppm、15ppm、20ppm、25ppm)，获得标准曲线；
离子浓度计算公式：离子浓度的计算公式：X＝c×V×N/(M×1000)，其中：X：样品中元素的质量分数，单位为毫克每千克(mg/g)，c：上机测定试样的元素浓度，单位为毫克每升(mg/L)，V：试样提取液的定容体积，单位为毫升(mL)，N：稀释倍数，M：样品的质量，单位为克(g)。
地上部钠钾浓度比＝地上部钠离子浓度/地上部钾离子浓度。
根部钠钾浓度比＝根部钠离子浓度/根部钾离子浓度。
离子净吸收速率：(C2-C1)/[t×(R2-R1)/2]，其中：C1代表第一次取样测定的离子浓度；C2代表第二次取样测定的离子浓度；t代表的是两次取样的时间间隔，6d；R1代表第一次取样时称量的干重；R2代表第二次取样时称量的干重。
2结果分析
2.1候选基因OsCHX11盐胁迫诱导表达分析
通过RT-qPCR分析确定OsCHX11的表达水平是否响应盐胁迫。如图7所示，在施用含140mMNaCl的营养液培养后，OsCHX11在地上部基本不表达，但在盐胁迫处理3h时，OsCHX11在根部的表达量相对0h增加到7倍，在盐胁迫处理4h时，OsCHX11在根部的表达水平进一步增加，相对0h的表达量增加到14倍。由此可见，OsCHX11受到盐胁迫诱导上调表达。
2.2植物表达载体及启动子分析载体的构建
扩增OsCHX11基因结果如图8中a图，在1500bp左右处出现条带，与预期结果一致，回收OsCHX11基因的条带，用同源重组的方法融合至pYBA-1132的载体上(图8中b图)。扩增OsCHX11基因起始密码子ATG上游2460bp的片段，作为启动子序列，扩增后在2500bp左右处出现条带(图8中c图)，同样将正确的条带采用同源重组的方法连接到pBWA(V)HG-ccdB-GUS载体上(图8中d图)。
2.3 OsCHX11蛋白亚细胞定位分析
OsCHX11蛋白亚细胞定位如图8和图10，以仅携带绿色荧光蛋白(Greenfluorescent pr otein,GFP)标签的空载体作为阴性对照，OsCHX11荧光信号主要分布在细胞膜上。以已被报道定位在细胞膜上的OsMCA1作为阳性对照，OsCHX11的绿色荧光与OsMCA1的红色荧光完全重合，因此，进一步确定OsCHX11定位在细胞膜上。
2.4 GUS组织化学染色分析OsCHX11的表达模式
携带OsCHX11启动子-GUS的载体的转基因幼苗的GUS染色分析结果如图11，OsCHX11在植株地上部没有检测到GUS染色信号，在根部检测到强烈的GUS染色信号，表明OsCHX11在植株的地上部不表达，仅在植株的根部表达(图11中a图)，且在盐处理0h的染色信号要比盐处理24h的染色信号浅，进一步证明OsCHX11受到盐胁迫诱导上调表达，这与RT-qPCR测定的表达量结果一致，并且OsCHX11在不定根和侧根中表达更为强烈(图11中b图)，观察其主根的横截面，发现OsCHX11主要在根中柱(木质部薄壁细胞)中表达(图11中c图和d图)。
2.5 OsCHX11敲除材料的耐盐表型分析
耐盐表型分析结果如图12，正常条件下，OsCHX11敲除株系(SE327背景敲除株系KO-1、SE327背景敲除株系KO-2和SE327背景敲除株系KO-3，分别为图3-6中KO-1、KO-2和KO-3)和野生型SE327的根长、苗高和鲜重比较接近，生长状况相似。盐处理11d后，OsCHX11敲除材料相较于野生型苗高和根长显著降低，无论是在地上部还是根部，鲜重和干重也均显著降低，以上结果表明OsCHX11正向调控水稻耐盐性。
2.6候选基因OsCHX11钾钠离子分析
在盐处理第5天和第11天分别取样，先测定第11天幼苗的地上部及根部的钠钾离子浓度并计算Na+/K+比值(如图13所示)，相比野生型，OsCHX11敲除株系(SE327背景敲除株系KO-1和SE327背景敲除株系KO-2)的地上部和根部均积累了更多的Na+，同时地上部积累更多的K+，但根部K+浓度没有显著变化，Na+/K+比值均显著升高。以上结果表明，OsCHX11具有对维持水稻钠钾离子平衡的作用。
为了确定OsCHX11是否会影响K+、Na+的吸收，比较了OsCHX11敲除株系(SE327背景敲除株系KO-1和SE327背景敲除株系KO-2)和野生型的K+、Na+净吸收速率。在盐胁迫下，OsCHX11敲除株系的Na+净吸收速率显著高于野生型，而OsCHX11敲除株系相比野生型表现出显著的K+负吸收速率，由此可见，OsCHX11对维持水稻Na+/K+的稳态和提高耐盐性具有重要作用(如图14所示)。
一般认为植株地上部的生长发育情况与根部的形态、根的活力等根的生长是密切相关的，因此也会影响植株产量的形成，是评价水稻是否耐盐的指标之一。本发明通过实验证明，盐胁迫条件下，OsCHX11转基因过表达材料相比野生型生长状况好，且存活率显著提高，而OsCHX11敲除株系则表现出相反的情况(如图5)。此外，在盐胁迫条件下，OsCHX11敲除株系的苗高、根长、鲜重、干重等形态性状均较野生型显著降低(如图12)，表明OsCHX11正向调控水稻耐盐性。为水稻在耐盐方面的研究提供了可靠理论依据。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。
Claims (9)
1.蛋白质或调控所述蛋白质的编码基因表达的物质或调控蛋白质活性和/或含量的物质在下述任一种中的用途：
所述蛋白质为下述任一种，
A1)氨基酸序列是SEQ ID No.1的蛋白质；
A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所示的蛋白质具有80％以上的同一性且具有相同功能的蛋白质；
A3)在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质；
所述用途为下述任一种，
D1)增加水稻耐盐性；
D2)制备提高水稻耐盐性的产品；
D3)培育耐盐性提高的水稻；
D4)制备培育耐盐性提高的水稻的产品；
D5)改良高耐盐性水稻或制备高耐盐性水稻的产品；
D6)水稻育种。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述物质为生物材料，所述生物材料为下述任一种：
B1)、编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
B6)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物组织、或含有B2)所述表达盒的转基因植物组织；
B7)、含有B1)所述核酸分子的转基因植物器官、或含有B2)所述表达盒的转基因植物器官；
B8)、抑制或降低或下调所述蛋白质的编码基因的表达的核酸分子或抑制或降低或下调所述蛋白质的活性或含量的核酸分子；
B9)、表达B8)所述核酸分子的基因；
B10)、含有B9)所述基因的表达盒；
B11)、含有B9)所述基因的重组载体、或含有B10)所述表达盒的重组载体；
B12)、含有B9)所述基因的重组微生物、或含有B10)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物；
B13)、含有B9)所述基因的转基因植物细胞系、或含有B10)所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有B11)所述重组载体的转基因植物细胞系；
B14)、含有B9)所述基因的转基因植物组织、或含有B10)所述表达盒的转基因植物组织、或含有B4)所述重组载体的转基因植物组织；
B15)、含有B9)所述基因的转基因植物器官、或含有B10)所述表达盒的转基因植物器官、或含有B11)所述重组载体的转基因植物器官。
3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，B1)所述核酸分子为编码序列是SEQ IDNo.2的cDNA分子或DNA分子。
4.根据权利要求2所述的用途，其特征在于，B9)所述核酸分子靶向于编码链的编码序列是SEQ ID No.2所示的DNA分子。
5.一种培育耐盐性提高的转基因水稻的方法，包括上调或增强或提高目的水稻中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量或所述蛋白质的含量得到耐盐性水稻，所述耐盐性水稻的耐盐性高于所述目的水稻。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述上调或增强或提高目的水稻中权利要求1中所述蛋白质的编码基因的表达量或所述蛋白质的含量为将权利要求1中所述蛋白质的编码基因导入所述目的水稻。
7.权利要求1中所述的蛋白质。
8.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
B1)、编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)、含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)、含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)、含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)、抑制或降低或下调所述蛋白质的编码基因的表达的核酸分子或抑制或降低或下调所述蛋白质的活性或含量的核酸分子；
B6)、表达B5)所述核酸分子的基因；
B7)、含有B6)所述基因的表达盒；
B8)、含有B6)所述基因的重组载体、或含有B7)所述表达盒的重组载体；
B9)、含有B6)所述基因的重组微生物、或含有B7)所述表达盒的重组微生物、或含有B4)所述重组载体的重组微生物。
9.根据权利要求8所述的生物材料，其特征在于，B1)所述核酸分子为编码序列是SEQID No.2的cDNA分子或DNA分子。
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