CN114591410B

CN114591410B - 玉米miRNA的靶基因序列及其编码蛋白在抗植物粗缩病中的应用

Info

Publication number: CN114591410B
Application number: CN202210306733.2A
Authority: CN
Inventors: 周羽; 张嘉月; 邸宏; 张�林; 王振华; 卢晴; 李益晨; 曾兴; 董玲; 刘显君
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2022-03-25
Filing date: 2022-03-25
Publication date: 2022-09-20
Anticipated expiration: 2042-03-25
Also published as: CN114591410A

Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体公开了玉米miRNA的靶基因序列及其编码蛋白在抗植物粗缩病中的应用。本发明在玉米中发现了参与玉米粗缩病抗性调控的miRNA的靶基因序列。该基因能够负调控植物玉米粗缩病抗性，通过抑制该靶基因的表达量，抑制病毒的表达量，提高玉米粗缩病抗性。玉米miRNA的靶基因序列编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。miRNA的靶基因序列的克隆和功能发现为抗玉米粗缩病相关机制研究提供了重要的基因基础及理论支持，为抗病品种的培育及遗传机理的解析奠定基础。

Description

玉米miRNA的靶基因序列及其编码蛋白在抗植物粗缩病中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体地说，涉及玉米miRNA的靶基因序列及其编码蛋白在抗植物粗缩病中的应用。

背景技术

玉米粗缩病(Maize rough dwarf disease，MRDD)是世界性病毒病害，也是公认的危害玉米最严重的病害之一。玉米粗缩病有逐年加重的趋势，将对玉米生产造成重大损失。

玉米粗缩病的致病病毒有4种，分别为水稻黑条矮缩病毒(Rice black-streakeddwarf virus，RBSDV)，南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarfvirus，SRBSDV)，玉米粗缩病毒(Maize rough dwarf virus，MRDV)和马德里约柯托病毒(Mal de Río Cuarto virus，MRCV)，在植物病毒分类学上均属于植物呼肠孤病毒科(Reoviridae)、斐济病毒属(Fijivirus)第2组的成员。在亚洲导致玉米粗缩病的病原是RBSDV和SRBSDV；在欧洲，病原是MRDV；在南美洲，病原是MRCV。

玉米粗缩病寄主范围较广，主要有玉米、小麦、水稻等粮食作物和狗尾草、稗草等杂草。玉米粗缩病病毒主要由灰飞虱(Laodelphax striatellus，SBPH)或白背飞虱(Sogatella furcifera)以持久性传播。灰飞虱在田间杂草上越冬获毒，第二年春天将病毒传播至小麦和玉米上。在玉米整个生育期内都可能被侵染发病，苗期受害最为严重。典型的症状为在叶背出现白色蜡泪状脉突、手感粗糙、叶色深绿、叶片变短；植株矮化；根数少、不发次生根、且有根纵裂；常不能抽穗或雌穗极小、变形、雄花少或无花粉。

现有玉米种质中缺乏对粗缩病完全免疫的材料，高抗的种质也较少，主要集中在PB亚群和四平头亚群；且不同来源的玉米自交系间的抗性有明显差异。玉米粗缩病抗性遗传分析表明，玉米抗粗缩病为数量性状，抗病性主要由基因型决定，总体以加性效应为主，在玉米的10条染色体上均有可能存在与粗缩病抗性有关的基因座(QTLs)。

目前，通过调整播期以确保玉米幼苗期与灰飞虱大发生时期相互错开，是玉米粗缩病的主要防治方法。而了解玉米粗缩病的致病机制，选择抗病性品种将是解决玉米粗缩病更行之有效的方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种miRNA的靶基因序列在调控玉米粗缩病抗性中的应用，以期解决传统的品种抗性育种进展缓慢，无法满足当前玉米生产需要的问题。

本发明发现了一个参与玉米粗缩病调控的玉米miRNA的靶基因序列，通过试验验证了其对玉米粗缩病抗性的影响。

具体地，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供玉米miRNA的靶基因序列编码的蛋白、或含有所述玉米miRNA的靶基因序列的生物材料在抗植物粗缩病中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.3所示。

第二方面，本发明提供玉米miRNA的靶基因序列编码的蛋白、或含有所述玉米miRNA的靶基因序列的生物材料在选育抗粗缩病性能提高的转基因植物中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

第三方面，本发明提供玉米miRNA的靶基因序列编码的蛋白、或含有所述玉米miRNA的靶基因序列的生物材料在植物抗粗缩病种质资源改良中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明中，所述玉米miRNA的靶基因序列具有以下任一种核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或

(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换、缺失或插入获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列；

(3)在严格条件下可以与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列进行杂交的核苷酸序列。

所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

所述植物为玉米、水稻或烟草，优选为玉米。

第四方面，本发明提供一种改变植物抗粗缩病性能的方法，其通过转基因、基因敲除、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，控制植物对玉米miRNA的靶基因序列的表达，所述玉米miRNA的靶基因序列如上所述。

所述控制植物对玉米miRNA的靶基因序列的表达指使所述玉米miRNA的靶基因序列在植物中超表达或降低表达；所述植物优选为玉米。

所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含所述玉米miRNA的靶基因序列的重组表达载体导入植物，获得转基因植物株系。

所述基因敲除包括利用DNA同源重组技术、Cre/LoxP技术或CRISPR/Cas9技术将所述玉米miRNA的靶基因序列敲除，获得转基因植物株系。

作为一个具体实施方式，改变植物抗粗缩病性能的方法包括构建含靶基因的超表达载体和敲除载体，通过农杆菌侵染幼胚法将所述超表达载体和敲除载体转入植物中，筛选得到可以调控玉米粗缩病抗性的转基因材料。

本发明的有益效果至少在于：

1.本发明首次研究发现了一种miRNA的靶基因序列的表达水平与粗缩病的抗性呈现负相关，超表达转基因材料发病程度提高，病毒表达量增加；敲除转基因材料发病程度降低，病毒表达量降低，该靶基因序列表达量与病毒表达量呈正相关。

2.本发明为培育出具有粗缩病抗性的玉米新品种，探索创制抗玉米粗缩病新材提供了理论支持。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的靶基因结构图。

图2是本发明实施例2提供的超表达材料(左图)和敲除材料(右图)T2代检测结果图。其中，M为Marker，P为阳性对照，N为阴性对照，W为水，左图中的1-12和右图中的1-15为转基因阳性材料。

图3是本发明实施例2提供的超表达材料和敲除材料人工接种粗缩病鉴定图。左图为超表达材料人工接种粗缩病鉴定图，右图为敲除材料人工接种粗缩病鉴定图。其中，左图中B104为接种粗缩病受体自交系，OE-1、OE-2、OE-3为超表达转基因材料；右图中B104为接种粗缩病受体自交系，B104-CK为未接种粗缩病受体自交系，C1为敲除转基因材料，C1-CK为未接种粗缩病敲除转基因材料。

图4是本发明实施例2提供的超表达材料和敲除材料人工接种粗缩病株高图。左图为超表达材料人工接种粗缩病株高图，右图为敲除材料人工接种粗缩病株高图。其中，B104为接种粗缩病受体自交系。

图5是本发明实施例2提供的超表达材料和敲除材料人工接种粗缩病后病毒表达量分析图。其中，B104为接种粗缩病受体自交系。

图6是本发明实施例3提供的转录组测序KEGG富集图。

图7是本发明实施例3提供的超表达材料人工接种粗缩病后激素含量图。

图8是本发明实施例3提供的超表达材料和敲除材料人工接种粗缩病后接种处理下组织细胞学鉴定图。其中，B104 CK代表未接种玉米粗缩病的B104细胞，B104代表接种28d的玉米粗缩病感病自交系B104细胞。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1本发明靶基因序列基本特性分析

在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的Gene数据库搜索序列相关信息，发现本发明的靶基因(如SEQ ID NO.1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示)在Zm-B73-REFERENCE-NAM-5.0基因组中定位于玉米5号染色体的98121701..98125154(bin5.04)区域，全长3454bp，位于正链上，包含4个外显子(位置分别为：1-160；466-602；2729-2781；2891-3454)，其CDS序列为528bp(如SEQ ID NO.2所示)，起始密码子ATG位于基因487bp，终止密码子TGA于3249bp位置结束，编码蛋白的外显子有3个，长度分别为137bp、53bp、564bp(靶基因结构图参见图1)。

实施例2本发明靶基因抗玉米粗缩病功能验证

(1)转基因材料的构建

采用同源重组方法，利用BamHI酶切位点，将本发明靶基因CDS序列(如SEQ IDNO.2所示)整合到CUB-Ubi植物超表达载体(莫乔程，2012，玉米漆酶Zmlac5基因拟南芥遗转转化，第2页第3段)，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，采用同尾酶连接的方法，一次将3个含有靶位点(靶点序列：1：TGGGTGCAACAAACATGGCGGGG，2：TATAATCGTGCAGGCTGCCTTGG，3：GATGAGGGATCAGATGACAATGG，如SEQ ID NO.10-12所示)的中间载体片段连入载体Cas9(杜想想，2021，基于CRISPR/Cas9技术的水稻基因OsARF12突变体的构建,第3页第1段)，重组质粒PCR鉴定条带大小正确，测序结果证实重组质粒序列正确，无移码突变，将正确的植物超表达载体和敲除载体质粒转入农杆菌EHA105中，用于下一步对玉米的遗传转化。通过农杆菌侵染幼胚法，以玉米自交系B104为受体材料进行转化研究。

(2)T2代转基因材料分子检测

以T2代超表达转基因材料的叶片总DNA为模板，SEQ ID NO.4-5所示序列为引物进行PCR扩增，以非转基因受体自交系B104为阴性对照，以超表达载体质粒DNA为阳性对照，根据本发明超表达载体设计引物(SEQ ID NO.4-5)，扩增载体上靶基因CDS片段。结果显示，转基因T2代超表达转基因材料扩增出片段大小约1000bp的跨启动子和目的基因的条带，与阳性对照片段大小一致，阴性对照和水未扩增出条带(参见图2中的左图)。

以T2代敲除转基因材料的叶片总DNA为模板，SEQ ID NO.6-7所示序列为引物进行PCR扩增，即，根据第一个编辑靶点和第二个编辑靶点设计引物(SEQ ID NO.6-7)，扩增第二个外显子，测序结果表明敲除转基因材料在第二个外显子缺失49bp(参见图2中的右图)。

(3)转基因材料人工接种鉴定

盆栽播种玉米自交系B104、上述构建验证得到的超表达转基因材料和敲除靶基因转基因材料，待幼苗长至3叶1心期时分别按单株接种无毒灰飞虱和带毒灰飞虱(平均每株玉米1头带毒灰飞虱；对照无毒灰飞虱按相同比例接种)，并设置相同处理条件下的未接种对照组(B104-CK)，所有植株单株编号。抽丝期，对每个材料的20个单株进行抗病性鉴定，结果表明接种超表达转基因材料OE-1(49.17cm)、OE-2(47.59cm)和OE-3(47.46cm)株高均显著低于接种受体自交系B104(63.21cm)(P＜0.05)，株高降低22.2％、24.7％和24.9％；敲除转基因材料C1(31.01cm)株高显著高于接种受体自交系B104(25.43cm)(P＜0.05)，株高增加21.9％(参见图3和图4)。

(4)转基因材料人工接种粗缩病病毒表达量分析

在接种的第5d、14d和28d后取样，采用qRT-PCR的方法，根据RBSDV病毒设计引物(TGTGCGTTGCGACTCAGAAA，SEQ ID NO.8；GCTGTCTCTTGATGTCCCAGT，SEQ ID NO.9)检测病毒含量。人工接种粗缩病后，病毒表达量在超表达材料、敲除材料和受体自交系B104中均呈现一直升高的趋势；在三个时间点，超表达材料的病毒表达量最高，B104次之，敲除材料病毒表达量最低(参见图5)。

实施例3本发明靶基因的调控途径

(1)本发明靶基因调控玉米转录水平差异分析

按实施例2中的方法在超表达材料中人工接种玉米粗缩病后，在接种后2d和14d分别采集带毒和无毒灰飞虱接种的超表达材料叶片进行玉米转录组测序文库的构建和测序工作。对2d筛选到的580个DEGs和14d期筛选到的3535个DEGs进行KEGG通路富集分析。接种2d的DEGs主要富集在MAPK信号通路(MAPK signaling pathway)，植物激素信号转导(Planthormone signal transduction)、植物-病原体相互作用(Plant-pathogen interaction)；接种14d的DEGs主要富集在核糖体(Ribosome)，氧化磷酸化(Oxidativephosphorylation)、光合作用(Photosynthesis)，在玉米遭受玉米粗缩病胁迫前期或通过响应激素代谢途径来抵抗玉米粗缩病；后期通过响应相应的光合作用途径来抵抗玉米粗缩病(参见图6)。

(2)超表达转基因材料响应玉米粗缩病的激素含量分析

按实施例2中的方法在超表达材料中人工接种玉米粗缩病后2d、5d和14d(图中，2DAI、5DAI、14DAI)取样20株，采用高效液相色谱-串联质谱法测定GA3和ABA含量，超表达转基因材料和受体自交系B104的GA3含量，结果如图7的左图所示，其表明接种2d后，超表达材料与受体自交系差异不显著(P＞0.05)；接种5d后，超表达材料极显著低于受体自交系(P＜0.01)；随时间的增长，接种14d后，超表达材料显著低于受体自交系(P＜0.05)；ABA含量在接种2d后自交系B104中含量极显著高于超表达材料(P＜0.01)(参见图7中的右图)。

(3)转基因材料接种玉米粗缩病后组织细胞学鉴定

按实施例2中的方法进行玉米粗缩病接种，取28d未接种的玉米粗缩病感病自交系B104(B104 CK，作为对照)，接种28d的玉米粗缩病感病自交系B104，超表达材料和敲除材料叶片进行组织细胞形态观察，结果表明，未接种玉米粗缩病的B104细胞形态完整，叶绿体形态完整呈梭形，数量较多且排列整齐，分布在细胞膜内侧；接种28d的B104和超表达材料细胞内出现淀粉粒，叶绿体数量减少，叶绿体形态发生变化，叶绿体膜破碎；超表达材料叶绿体解体严重，细胞壁和细胞膜发生破碎；敲除材料叶绿体形态变化程度较轻，叶绿体膜完整且数量较多(参见图8)。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> 玉米miRNA的靶基因序列及其编码蛋白在抗植物粗缩病中的应用

<130> KHP221111283.1

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3454

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cgcatacggc aactcctctc tccgctgttg ctctcttccc gtcgcgcttt ctcctcgtgc 60

ggctactggg taaccgccgc cgctgccgcc ctacgccagg ttctcaggtc attgtcagtc 120

cccttacttc gccggctcat tcggcggcga cgagcaccag gtatccccac cccttctctt 180

cccttcctgc cgtacgaaac cgaacacccg aaccctaact taagctactt gtattcggat 240

ctgatctact aagtttatac ggccccagtg tatacgtgca tactaacttc tatttttatg 300

ccattttttg ggtgtatatg agtacactca tgtccttact tggtccgccc ctgatcctga 360

ccgtaggttc taccgtagat ttcgctttag ctccaaaact tccaattttc tgccatcttt 420

tttctgtttt ctattattcg tgtactgaat ttctgtctgc ttgtagaaat cctagctgct 480

ttgagtatgg aggcgctgtt tgggtgcaac aaacatggcg gggacaaggc cgctgatttg 540

gcctcgttta taatcgtgca ggctgccttg gaggtgccaa ggttacttgg gctccttgcc 600

atggtaaaag tttcttcttt cctcacgcct tacaataaat cttgttacag aattacaata 660

tatctctgtg cagtagctgt gttgctgtat tctgtaaggt cagtagatct tgatatgtga 720

ggggcatttt tccccctgtg tggggtgcga gggttggggg gggggtatga agttagagcg 780

ttatgtgtga ttattattgc gaatgggcct ctagctggtt tggttagatc gctctagtag 840

cactcagatc ctaggtttga ctccccatag aacgaatttt aggctggggt taaaataatt 900

ttgtctatct cacgtcaaag cacagatgta aggtctgatc taggtcatgt ggtcgttctc 960

acaagtgcta tggtgttgct gtgtactgtt ggggcaggag tttggttttt ttttacctgc 1020

ttgagaaggt cttagcaaaa tgcttgggta ggctgtctta cctcttgcag gtcgtgtttt 1080

tttattgtat gattattccc tggtggtcct aaggaatctg gtatcttttg tttcgtttac 1140

cgtaattatc ttttgttttg tttgccgtaa ttatcttttg tatgctcgtg ccatcaatgc 1200

aacatggata tggctatttg tacagatatg acattttcca aaaaaaggac tgttcttttg 1260

gacacattaa gtatttttaa taaataaata aataataaaa catattaaaa atctaaaagc 1320

actagcagcc aagccttgca ttctggccat tgtgttgttt gctcatccta tccttatttc 1380

catctagcga acgccccaca gacatgcctc ccaagcatcc ccattcagtc ctcaaaatct 1440

gattaagaat gtataggtgc ttagtgctga agttgaagcc ctcaatttaa aggaggattt 1500

gattattcaa ttaattatat cacaatgctg cagctgtata atatcaatat tccgagagaa 1560

attaataaaa aaatgggcca gagaaagagg aaagtgggga agctcactga ggcagtgtaa 1620

ctgctgacca ccaagcaata tgcagcactc tggttgcctt gcctcccttt gcttggagca 1680

gcagtgtggc atggctcagt gggcggagag acagccgcca gaggatgtag gaggccttgc 1740

catggcctat gtgaagcaac tgaccctatg acatgtctga cacttgtggc ccctactatg 1800

gttgtcttgc accatggctg tctagcatga gcacaaccgt tactctacct tctgcagtag 1860

catgatgtga cactgctcgg ccacgaggat ttcgccggcc ttgcctccac aggaactaca 1920

cagttgggtg gaggaccttg cctttgcctt cgcttgacca tggaggagtt atcaagcatg 1980

ggtgtagggg gtgttgtggt ggctatggcc tgtgtagggt tatgggagga gggatgcagc 2040

aggcgtgggg agtctgggag ttatccaaca agctgttggt tggctgggcc gtatcagacg 2100

agtctagcgt accagtaaag agtatcctaa ttgttggtaa tttatttttt atagatactt 2160

cactgataca tatccactgt gtatccatgc tgtattattg gatatttagc caatacagga 2220

tatgccttta tcctggcatg tcggggtaat gtaactcacc attacaaaat aagctgaggc 2280

aagcatgcgt gacaaacttg ttaattgtat tgcttggata acagactttt gcggttactc 2340

agtttagaga tgaattggta ctatttgatg tgctcctctg aggtttaacc agtgaacctc 2400

ttttgccttc aagatcaata aaagcaggtt tgtcggaggt gtttggtttg gtagtttggt 2460

ctgaaaatgc tatgtgtttt cttgcccaag agcttgatgt ttacagtcta cctagcggtg 2520

tttgtatcaa gccaactgat atgacgtgtt tgaatgtctt ttgtgctaat gatgaaattg 2580

caaggatcta ccatttattt tcttcctcat acgtgtctta tgtcctttaa agcccgggaa 2640

taaccattgt tgcattgttc gtgcactttt aattggaaat atacctcgtc ttagctaata 2700

ctgtgtactg ttttgacttt cttgtgcaga ttcttcataa tgaaatcttt acatctggtg 2760

gagatcagaa tttgattaat aggtaatgcc cactggtgca taatgtcaaa acatgtacca 2820

catcattatt gccatgggca tttcttttcg tctcccaaag ctgaggattg tttgtttcct 2880

tctccacaag gattctgagc aaaaacaaaa atgcaactga tttcgagaac aaggatgatg 2940

gagagtctga tgatgataat gatgaggagg gagacgatga ggatgctgaa aaccaagaag 3000

atgatggtgg tgatgaggga tcagatgaca atgggaatga ggaggaagat gacgacgacg 3060

atgataacga tcctgcagcc aacggtgaag gaggaagtga cgacgatgat gatggtggag 3120

aggatgaaga ggaggatgat gacgacgatg atgatgggga tggtgacaat gaggaagatg 3180

aggaggaaga agaggaagag gatgatgacg atgatgtccc ccaaccacct actaagaaga 3240

ggaaatgata gatggctgtg atttggttgg ctggttgctt acatgcagga atgctccctg 3300

ttcgcccctg cctagcagtc tcctgtttag tgggtagggg gttttagctt gatcgtggac 3360

aattcatagc ctagcttgga aacaaaaaga aacatttaat tgtgcatgta ctattaaacc 3420

attcctttaa tcatgtatct cagattgcta ccaa 3454

<210> 2

<211> 528

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atggaggcgc tgtttgggtg caacaaacat ggcggggaca aggccgctga tttggcctcg 60

tttataatcg tgcaggctgc cttggaggtg ccaaggttac ttgggctcct tgccatgatt 120

cttcataatg aaatctttac atctggtgga gatcagaatt tgattaatag gattctgagc 180

aaaaacaaaa atgcaactga tttcgagaac aaggatgatg gagagtctga tgatgataat 240

gatgaggagg gagacgatga ggatgctgaa aaccaagaag atgatggtgg tgatgaggga 300

tcagatgaca atgggaatga ggaggaagat gacgacgacg atgataacga tcctgcagcc 360

aacggtgaag gaggaagtga cgacgatgat gatggtggag aggatgaaga ggaggatgat 420

gacgacgatg atgatgggga tggtgacaat gaggaagatg aggaggaaga agaggaagag 480

gatgatgacg atgatgtccc ccaaccacct actaagaaga ggaaatga 528

<210> 3

<211> 175

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Met Glu Ala Leu Phe Gly Cys Asn Lys His Gly Gly Asp Lys Ala Ala

1 5 10 15

Asp Leu Ala Ser Phe Ile Ile Val Gln Ala Ala Leu Glu Val Pro Arg

20 25 30

Leu Leu Gly Leu Leu Ala Met Ile Leu His Asn Glu Ile Phe Thr Ser

35 40 45

Gly Gly Asp Gln Asn Leu Ile Asn Arg Ile Leu Ser Lys Asn Lys Asn

50 55 60

Ala Thr Asp Phe Glu Asn Lys Asp Asp Gly Glu Ser Asp Asp Asp Asn

65 70 75 80

Asp Glu Glu Gly Asp Asp Glu Asp Ala Glu Asn Gln Glu Asp Asp Gly

85 90 95

Gly Asp Glu Gly Ser Asp Asp Asn Gly Asn Glu Glu Glu Asp Asp Asp

100 105 110

Asp Asp Asp Asn Asp Pro Ala Ala Asn Gly Glu Gly Gly Ser Asp Asp

115 120 125

Asp Asp Asp Gly Gly Glu Asp Glu Glu Glu Asp Asp Asp Asp Asp Asp

130 135 140

Asp Gly Asp Gly Asp Asn Glu Glu Asp Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu

145 150 155 160

Asp Asp Asp Asp Asp Val Pro Gln Pro Pro Thr Lys Lys Arg Lys

165 170 175

<210> 4

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgatggcat atgcagca 18

<210> 5

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gagggtgggc cagggc 16

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

taagctactt gtattc 16

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gcaacaccat agcact 16

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgtgcgttgc gactcagaaa 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctgtctctt gatgtcccag t 21

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tgggtgcaac aaacatggcg ggg 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

tataatcgtg caggctgcct tgg 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

gatgagggat cagatgacaa tgg 23

Claims

1.玉米miRNA的靶基因序列编码的蛋白、或含有所述玉米miRNA的靶基因序列的生物材料在抗植物粗缩病中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述植物为玉米。

2.玉米miRNA的靶基因序列编码的蛋白、或含有所述玉米miRNA的靶基因序列的生物材料在选育抗粗缩病性能提高的转基因植物中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；所述植物为玉米。

3.玉米miRNA的靶基因序列编码的蛋白、或含有所述玉米miRNA的靶基因序列的生物材料在植物抗粗缩病种质资源改良中的应用，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述植物为玉米。

4.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述玉米miRNA的靶基因序列具有以下任一种核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，或

(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经过一个或多个核苷酸的替换获得的具有相同功能蛋白的编码核苷酸序列。

5.根据权利要求1-3任一所述的应用，其特征在于，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

6.改变植物抗粗缩病性能的方法，其特征在于，通过转基因、基因敲除、杂交、回交、自交或无性繁殖的方法，控制植物对玉米miRNA的靶基因序列的表达，所述玉米miRNA的靶基因序列如权利要求4中所述。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述控制植物对玉米miRNA的靶基因序列的表达指使所述玉米miRNA的靶基因序列在植物中超表达或降低表达。

8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含所述玉米miRNA的靶基因序列的重组表达载体导入植物，获得转基因植物株系。

9.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述基因敲除包括利用DNA同源重组技术、Cre/LoxP技术或CRISPR/Cas9技术将所述玉米miRNA的靶基因序列敲除，获得转基因植物株系。