CN114561425B - ZmHIR3蛋白或其编码基因在调控玉米抗粗缩病能力中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及ZmHIR3蛋白或其编码基因在调控玉米抗粗缩病能力中的应用。本发明对RBSDV侵染的玉米进行了病原与寄主互作关系、抗性鉴定、和时空表达模式分析，发现了一种和与玉米抗粗缩病相关的蛋白，即ZmHIR3蛋白。本发明进一步研究发现在植物材料中过表达ZmHIR3蛋白的编码基因可以有效提高玉米材料的抗粗缩病能力，这为增强玉米等植物的粗缩病抗性的分子生物学机制研究提供可靠的数据支撑，在抗粗缩病玉米品种培育的领域具有重要意义。

Description

ZmHIR3蛋白或其编码基因在调控玉米抗粗缩病能力中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及ZmHIR3蛋白或其编码基因在调控玉米抗粗缩病能力中的应用。

背景技术

玉米粗缩病(Maize rough dwarf disease，MRDD)是在广泛范围内危害玉米最严重的病毒病害之一，其诱因之一是水稻黑条矮缩病毒(Rice Black-Streaked DwarfVirus，RBSDV)。目前针对玉米粗缩病的抗病资源和相关抗性基因缺乏，致病机理和抗性机制不清，急需从病原与寄主玉米互作的角度解析其调控分子机制，进而为遗传机制的解析和抗病品种的培育提供理论支持。

引起玉米粗缩病的病毒主要由灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)以持久性方式传播，不能经土壤、种子传播、汁液摩擦、嫁接传播。灰飞虱获毒后，可以终身带毒并传毒。在田埂地边杂草中越冬的带毒灰飞虱成虫和若虫，翌春传毒，可导致玉米粗缩病的严重危害。病毒在小麦、多年生禾本科杂草等寄主越冬，春季一代灰飞虱成虫在带毒寄主上取食获毒，从小麦陆续向玉米迁移，在小麦收获时形成迁飞高峰。苗期，特别是5叶期以前，是玉米粗缩病的易感时期，10叶期以后玉米植株的抗性增强。因此，玉米出苗至5叶期若与灰飞虱迁飞高峰期相遇就容易造成严重发病甚至绝收。灰飞虱迁飞高峰期后21天左右出现玉米粗缩病的发病高峰。第2、3、4代灰飞虱主要在水稻、玉米及田间杂草上越夏，秋季冬小麦出苗后，灰飞虱迁飞至麦田及禾本科杂草上传毒越冬，形成全年病害循环。

玉米粗缩病的发生受品种抗病性、介体灰飞虱数量、田间杂草数量、耕作制度以及气候条件等诸多因素的影响，所以此病害防治难度较大。目前，生产上主要采取以农业措施例如调整播期、加强田间管理等为主，药剂防治为辅的综合防治措施。但是上述防治措施存在费工费时、易造成环境污染且防治效果差等不足，培育和种植抗病品种是防治玉米粗缩病的有效途径。

发明内容

为了解决现有技术存在的技术问题，本发明提供ZmHIR3蛋白或其编码基因在调控玉米抗粗缩病能力中的应用。

第一方面，本发明提供ZmHIR3蛋白或其编码基因或含有ZmHIR3蛋白的编码基因的生物材料在调控玉米抗粗缩病能力中的应用。

本发明进一步提供ZmHIR3蛋白或其编码基因或含有ZmHIR3蛋白的编码基因的生物材料在培育抗粗缩病玉米品种中的应用。

进一步地，通过提高玉米中ZmHIR3蛋白的编码基因的表达水平，提高玉米的抗粗缩病能力。

进一步地，所述ZmHIR3蛋白包括如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

进一步地，所述ZmHIR3蛋白的编码基因包括如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

进一步地，所述生物材料包括表达盒、载体或转基因细胞。

第二方面，本发明提供一种调控植物抗粗缩病能力的方法，包括：调控植物中ZmHIR3蛋白的编码基因的表达水平。

进一步地，通过过表达所述植物中的ZmHIR3蛋白的编码基因，提高所述植物的抗粗缩病能力。

进一步地，通过转基因、基因编辑、杂交、回交、自交或无性繁殖中任意一种或多种方法，调控植物中ZmHIR3蛋白的编码基因的表达水平。

进一步地，所述转基因包括利用Ti质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、基因枪、电导或农杆菌介导的方法将包含所述ZmHIR3蛋白的编码基因的重组表达载体导入植物，获得转基因植物株系。

进一步地，所述基因编辑包括利用DNA同源重组技术或CRISPR/Cas9技术针对植物中所述ZmHIR3蛋白的编码基因进行基因编辑，获得转基因植物株系。

进一步地，所述植物为单子叶植物或双子叶植物，优选为玉米。

本发明具备如下有益效果：

本发明对RBSDV侵染的玉米进行了抗性鉴定和时空表达模式分析，发现ZmHIR3是参与玉米粗缩病调控的重要因子，其可能与玉米抗粗缩病相关。进一步研究发现玉米超敏性反应蛋白ZmHIR3的表达水平与玉米对粗缩病的抗性呈现正相关，在玉米中过表达该基因时，可以有效提高玉米的抗粗缩病能力，这对于玉米抗粗缩病功能的分子生物学机制的研究具有重要意义。

本发明发现的ZmHIR3蛋白在玉米抗粗缩病中的应用为创制抗玉米粗缩病新材料提供了新的途径，也为后续研究奠定了遗传材料基础，为玉米抗粗缩病基因资源储备提供了良好的信息平台。

附图说明

图1是本发明实施例1提供的重组质粒pCUB-ZmHIR3-eGFP-3×FLAG鉴定图；其中，M为Marker，1为阴性对照，2-3为重组农杆菌阳性质粒。

图2是本发明实施例2提供的ZmHIR3基因过表达株系T2代的检测结果图；其中，上图为ZmHIR3基因的检测结果，下图为Bar基因的检测结果；图中M为Marker，CK+为阳性对照，CK-为阴性对照，W为水，1-21为转基因阳性株系。

图3为本发明实施例2提供的ZmHIR3基因过表达株系T2代幼苗的基因检测结果图；其中，CK-为阴性对照，1-21为转基因阳性株系。

图4是本发明实施例3提供的ZmHIR3基因编辑株系T2代检测结果图；左图为ZmHIR3基因的检测结果，右图为Bar基因的检测结果；其中，M为Marker，CK+为阳性对照，CK-为阴性对照，W为水，1-6为转基因阳性株系。

图5为本发明实施例3提供的ZmHIR3基因编辑株系T2代幼苗的检测结果图；其中，CK-为阴性对照，1-6为转基因阳性株系。

图6是本发明实施例4提供的转基因阳性株系T2代人工接种鉴定图。

图7是本发明实施例4提供的转基因阳性株系T2代人工接种鉴定株高分析图。

图8是本发明实施例5提供的ZmHIR3基因过表达株系接种处理下ZmHIR3基因在叶片中的表达量图。

图9是本发明实施例6提供的ZmHIR3基因编辑株系接种处理下ZmHIR3基因在叶片中的表达量图。

图10是本发明实施例7提供的转ZmHIR3基因株系接种处理下病毒P5-2蛋白在叶片中的表达量图。

图11是本发明实施例7提供的转ZmHIR3基因株系接种处理下病毒P10蛋白在叶片中的表达量图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂如无特别说明，均为市售常规试剂；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法

实施例1 ZmHIR3基因过表达载体和编辑载体构建及转化

本发明中过表达采用的载体为pCUB-eGFP-3×FLAG，是在pCUB载体(宋攀，2015，玉米ZmPOT基因TALEN敲除和过表达载体的构建及遗传转化)基础上利用BamHI酶切位点，将GFP蛋白和3×FLAG标签插入到pCUB载体上的启动子和终止子之间构建而成。

将ZmHIR3基因(核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，可以编码得到如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列)插入到pCUB-eGFP-3×FLAG载体上的启动子和GFP标签蛋白之间。进行转化，挑单斑，测序，采用热激法将过表达载体质粒pCUB-ZmHIR3-eGFP-3×FLAG转化农杆菌EHA105感受态细胞，挑取重组农杆菌单菌落扩繁，提取质粒DNA进行PCR鉴定。

以大肠杆菌阳性质粒作为阳性对照，结果如图1所示：阳性对照和重组农杆菌质粒中均能扩增出约1036bp的目的片段，而阴性对照pCUB-eGFP-3×FLAG载体则无该特异条带，证明靶基因过表达载体质粒已成功转入农杆菌中，可以用于后续对玉米的遗传。

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，将预测的3个靶标序列(SEQ ID NO.3-5)插入pOs-cas9(原文霞，2017，利用CRISPR/Cas9技术靶向编辑水稻基因)载体上构建基因编辑载体pOs-cas9-ZmHIR3。

转化：通过农杆菌介导将所构建的过表达载体pCUB-ZmHIR3-eGFP-3×FLAG和基因编辑载体pOs-cas9-ZmHIR3分别转入玉米自交系B104中获得过表达转基因植株和基因编辑转基因植株。

实施例2 ZmHIR3基因过表达T2代株系分子检测

T1代转基因株系中挑选PCR及试纸条检测均为阳性的植株严格自交，收获籽粒，第二年按穗行种植得到T2代株系。以T2代转基因植株的叶片总DNA，根据启动子加目的基因加终止子序列设计特异引物(SEQ ID NO.6-7)，以受体对照玉米叶片DNA为阴性对照，质粒DNA为阳性对照，进行两轮PCR检测。结果如图2所示：阳性转基因植株有21个和质粒均能够扩增出2104bp的基因片段和429bp的Bar基因片段，阴性对照和水对照未见扩增条带。

对不同玉米T2代转基因玉米株系幼苗叶片进行取样，提取总RNA为模板进行反转录，玉米Actin为内参基因，分析ZmHIR3和Bar基因的转录情况。结果如图3所示：21个T2代PCR阳性株系中能够能正常转录，阴性对照中未扩增出目的条带。

实施例3 ZmHIR3基因编辑T2代株系分子检测

以CTAB法提取获得的T2代基因编辑转基因植株两叶期叶片总DNA。根据编辑靶位点设计特异引物(SEQ ID NO.8-9)，对T1代基因编辑植株进行严格自交收获果穗，第二年按穗行全部种植得到T2代植株，根据靶点位序列设计特异引物，以野生型玉米叶片DNA为阴性对照，质粒DNA为阳性对照，进行两轮PCR检测。检测结果如图4所示：阳性转基因植株和质粒均能够扩增出包括3个靶点在内的共618bp的片段，进行测序鉴定，共有6种类型稳定遗传的纯和变异。

对T2代转基因株系幼苗叶片进行取样，提取总RNA为模板进行反转录，玉米Actin为内参基因，分析ZmHIR3和Bar基因的转录情况。结果如图5所示：6个T2代PCR阳性株系，能够能正常转录，阴性对照中未扩增出目的条带。

实施例4 ZmHIR3基因阳性株系人工接种鉴定

采用网箱集团接种结合移栽的方法，按照平均每株玉米2.5头带毒灰飞虱的比例(每株幼苗：带毒灰飞虱＝1：2.5)对转基因后代和高感自交系B104进行玉米粗缩病人工接种鉴定，同时无毒灰飞虱也按照同样的比例接种相同的材料作为阴性对照。

结果如图6和图7所示：第36d时，接种的感病自交系发病率约为70％。无毒灰飞虱接种玉米后，转基因材料和B104受体对照均没有粗缩病发病症状，带毒灰飞虱接种玉米后，转基因材料和B104受体对照均出现节间变短，植株矮化，叶色深绿，叶背部叶脉处有明显的白色蜡状凸起，具有典型的玉米粗缩病症状，株高显著低于无毒接种组，其中接种处理后的过表达株系高于同处理B104对照，基因编辑材料则略低于同处理的B104对照，发病严重。

实施例5过表达转基因阳性株系中ZmHIR3基因表达分析

以T2代转基因株系中三个材料为试材，人工接种玉米粗缩病。结果如图8所示：随着接种时间的延长，叶片中ZmHIR3的表达量均逐渐升高，受体对照在接种病毒后2d达到峰值，3个株系ZmHIR3的表达量分别为17.690、15.686和17.485，三个转基因受体与对照比，分别上调3.93、1.92和3.72；利用SPSS.20.0软件中LSD法对转基因株系与受体对照的基因表达量进行显著性分析，株系HIR3OE-1中ZmHIR3的表达量在4个时间点显著高于受体对照(P<0.05)；株系HIR3OE-2中ZmHIR3基因的表达量在4个时间点显著高于受体对照(P<0.05)；株系HIR3OE-3中ZmHIR3基因的表达量在2个时间点显著高于受体对照(P<0.05)。

实施例6编辑转基因阳性株系中ZmHIR3基因表达分析

以T2代转基因株系中三个材料为试材，人工接种玉米粗缩病。结果如图9所示：随着接种时间的延长，叶片中ZmHIR3的表达量均逐渐升高，受体对照在接种病毒后2d达到峰值，3个株系ZmHIR3的表达量分别为8.468、12.187和12.030，三个转基因受体与对照比，分别下调5.30、1.58和1.38；利用SPSS.20.0软件中LSD法对转基因株系与受体对照的基因表达量进行显著性分析得出，株系HIR3CRI-1中ZmHIR3的表达量在3个时间点显著低于受体对照(P<0.05)；株系HIR3CRI-2中ZmHIR3基因的表达量在3个时间点显著低于受体对照(P<0.05)；株系HIR3CRI-3中ZmHIR3基因的表达量在2个时间点显著低于受体对照(P<0.05)。

实施例7转基因阳性株系中病毒表达量分析

玉米粗缩病病害程度与病毒表达含量成正相关。本研究分别提取ZmHIR3基因过表达、基因编辑株系和高感自交系B104在接种带毒灰飞虱后第14d、28d和36d叶片总RNA，反转录获得cDNA，Actin基因作为内参，利用Real-time PCR方法分析RBSDV P5-2和P10病毒表达变化。结果如图10和图11所示，在第14d时，P5-2和P10几乎不表达或者表达量较低；在接种第28d时，病毒表达量显著升高；第36d时，病毒表达量达到峰值，过表达材料中P5-2病毒相对表达量低于B104中P5-2病毒相对表达量，基因编辑材料中P5-2病毒相对表达量则显著高于B104，过表达材料中P10病毒相对表达量极显著高于野生型B104中P10病毒相对表达量，基因编辑材料中P10病毒相对表达量则显著高于B104，说明ZmHIR3基因正向调控玉米粗缩病抗性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 东北农业大学

<120> ZmHIR3蛋白或其编码基因在调控玉米抗粗缩病能力中的应用

<130> KHP221110671.1

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 287

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Asn Leu Cys Cys Cys Val Gln Val Asp Gln Ser Thr Val Ala

1 5 10 15

Ile Arg Glu Gln Phe Gly Lys Phe Asp Ser Val Leu Glu Pro Gly Cys

20 25 30

His Cys Met Pro Trp Phe Ala Gly Lys Arg Val Ala Gly Gln Leu Thr

35 40 45

Leu Arg Leu Gln Gln Leu Asp Val Arg Cys Glu Thr Lys Thr Lys Asp

50 55 60

Asn Val Phe Val Asn Val Val Ala Ser Ile Gln Tyr Arg Ala Leu Ala

65 70 75 80

Asp Lys Ala Ser Asp Ala Phe Tyr Lys Leu Ser Asn Thr Arg Ser Gln

85 90 95

Ile Gln Ala Tyr Val Phe Asp Val Ile Arg Ala Ser Val Pro Lys Leu

100 105 110

His Leu Asp Asp Ala Phe Glu Gln Lys Asp Glu Ile Ala Arg Ala Val

115 120 125

Glu Glu Glu Leu Glu Lys Ala Met Ser Ala Tyr Gly Phe Glu Ile Val

130 135 140

Gln Thr Leu Ile Val Asp Ile Glu Pro Asp Glu His Val Lys Arg Ala

145 150 155 160

Met Asn Glu Ile Asn Ala Ala Ala Arg Leu Arg Ala Ala Ala Asn Glu

165 170 175

Lys Ala Glu Ala Glu Lys Ile Val Gln Ile Lys Arg Ala Glu Gly Glu

180 185 190

Ala Glu Ala Lys Tyr Leu Ser Gly Leu Gly Ile Ala Arg Gln Arg Gln

195 200 205

Ala Ile Val Asp Gly Leu Arg Asp Ser Val Leu Gly Phe Ser Val Asn

210 215 220

Val Pro Gly Thr Thr Ala Lys Asp Val Met Asp Met Val Leu Ile Thr

225 230 235 240

Gln Tyr Phe Asp Thr Met Lys Glu Ile Gly Ala Ser Ser Lys Ala Ser

245 250 255

Ser Val Phe Ile Pro His Gly Pro Gly Ala Val Arg Asp Ile Ala Thr

260 265 270

Gln Ile Arg Asp Gly Leu Leu Gln Gly Ser Ser Val Ala Lys His

275 280 285

<210> 2

<211> 864

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggcaacc tgtgctgctg tgttcaagtc gaccagtcga ctgtggccat cagggagcag 60

tttggcaagt ttgacagcgt gcttgagcca ggatgccact gcatgccttg gttcgccggc 120

aagcgtgtag ctgggcaact cacactcagg ctgcagcaac tggatgtgcg ctgtgagaca 180

aaaacaaagg acaatgtttt cgtgaatgtg gtggcatcta ttcagtaccg cgctctggct 240

gacaaagcaa gtgacgcttt ctacaaactg agcaacacaa ggtcccagat ccaagcctac 300

gtctttgacg tgatcagagc aagcgttccc aagctccatt tggacgatgc tttcgagcag 360

aaggacgaga tcgcaagggc ggtggaggaa gagcttgaga aggccatgtc ggcttatggc 420

tttgagatcg tgcagactct catcgtggac atcgagccag acgagcatgt gaagcgcgca 480

atgaacgaga tcaacgcagc tgcgaggctc agggcggctg caaacgagaa ggcggaggcg 540

gagaagatcg tgcagatcaa gcgcgcggag ggggaggcag aagccaagta cctgtccggg 600

ctgggcattg cgcgccagcg gcaggccatc gtggacgggc tcagggacag cgtgctgggg 660

ttctccgtca acgtgccggg caccaccgcc aaggacgtca tggacatggt gctcatcacc 720

cagtacttcg acaccatgaa ggagatcggc gcgtcgtcca aggcgtcctc ggtgttcatc 780

ccgcatggcc ccggagcggt gcgcgacatt gccacgcaga tccgcgacgg cctcctgcag 840

ggatcctctg tcgccaaaca ctaa 864

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atccaagcct acgtctttga cgg 23

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggacgatgct ttcgagcaga agg 23

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

tcaacgcagc tgcgaggctc agg 23

<210> 6

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

tcctagtttg cgcgct 16

<210> 7

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gccctgcctt catacg 16

<210> 8

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgccttggt tcgcc 15

<210> 9

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cttctgcctc cccct 15

Claims (8)

1.ZmHIR3蛋白或其编码基因或含有ZmHIR3蛋白的编码基因的生物材料在调控玉米抗粗缩病能力中的应用；

所述ZmHIR3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.ZmHIR3蛋白或其编码基因或含有ZmHIR3蛋白的编码基因的生物材料在培育抗粗缩病玉米品种中的应用；

所述ZmHIR3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，通过提高玉米中ZmHIR3蛋白的编码基因的表达水平，提高玉米的抗粗缩病能力。

4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述ZmHIR3蛋白的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述生物材料包括表达盒、载体或转基因细胞。

6.一种调控植物抗粗缩病能力的方法，其特征在于，包括：调控植物中ZmHIR3蛋白的编码基因的表达水平；

所述植物为玉米；

所述ZmHIR3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过过表达所述植物中的ZmHIR3蛋白的编码基因，提高所述植物的抗粗缩病能力。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，通过转基因、基因编辑、杂交、回交、自交或无性繁殖中任意一种或多种方法，调控植物中ZmHIR3蛋白的编码基因的表达水平。

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