CN113322265A

CN113322265A - 西瓜ClCOMT1基因及其在调控植物内源褪黑素含量中的应用

Info

Publication number: CN113322265A
Application number: CN202110505557.0A
Authority: CN
Inventors: 李好; 常静静; 张显; 郭延亮; 袁黎; 魏春华
Original assignee: Northwest A&F University
Current assignee: Northwest A&F University
Priority date: 2021-05-10
Filing date: 2021-05-10
Publication date: 2021-08-31

Abstract

本发明公开了西瓜ClCOMT1基因及其在调控植物内源褪黑素含量中的应用，属于分子生物学技术领域。本发明通过转基因手段构建西瓜ClCOMT1过表达或基因敲除材料，调控基因ClCOMT1的表达水平或编辑其序列来研究其对褪黑素合成的调控作用；通过构建拟南芥过表达ClCOMT1植株，研究其对拟南芥中褪黑素合成的调控作用。结果发现，ClCOMT1过表达和敲除分别提高和降低了西瓜愈伤组织中褪黑素的含量；拟南芥中异源过表达ClCOMT1提高了褪黑素含量。西瓜ClCOMT1基因可用于调控植物内源褪黑素的含量，为研究植物褪黑素合成及其调控植物生长发育与抗性的分子机理奠定理论基础。

Description

西瓜ClCOMT1基因及其在调控植物内源褪黑素含量中的应用

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体的说是涉及西瓜ClCOMT1基因及其在调控植物内源褪黑素含量中的应用。

背景技术

褪黑素(N-乙酰基-5-甲氧基-色胺)是生物进化中的一种保守分子，广泛存在于动物、植物和微生物中。自1995年在高等植物中发现褪黑素以来，大量研究表明，植物褪黑素在植物种子萌发、幼苗生长、形态建成、果实形成与成熟以及植物抵御低温、干旱、盐胁迫、病虫害等环境胁迫中发挥重要的调控作用。例如，外源施用适宜浓度褪黑素可以促进作物生长、提高产量和品质以及提高抗逆性。尤其是近年来植物中褪黑素受体CAND2/PMTR1的发现及其信号通路的解析，为褪黑素是一种新型植物激素提供了强有力的证据。随着植物学和农学方面的专家对褪黑素功能的关注，褪黑素在植物中的合成途径已被逐步明确，与在动物中的合成途径类似，均以色氨酸为前体，由色氨酸脱羧酶(TDC)、色胺5-羟化酶(T5H)、5-羟色胺N-乙酰转移酶(SNAT)以及N-乙酰5-羟色胺O-甲基转移酶(ASMT)参与催化合成，但植物中褪黑素合成途径更为灵活与复杂。除了一些拟南芥等模式植物，大多数作物中褪黑素合成关键基因还未被鉴定，限制了褪黑素调控机理的研究及其在分子育种的应用。

西瓜是我国乃至世界上重要的园艺作物，在我国瓜果类作物生产中占首位。据统计，全国西瓜播种面积达151.8万hm²，其中，设施栽培面积占比高达41％。由于西瓜生产周期短、见效快、效益稳，其在种植业中发展比较快，很快成为部分地区结构调整过程中的主导产业。然而，冬春低温、土壤盐碱化、旱区缺水以及连作引起的连作障碍等环境胁迫严重制约了西瓜产业的可持续发展。前人研究表明，适宜浓度外源褪黑素预处理可以提高西瓜叶片的光合作用，进而促进生长以及提高西瓜幼苗对低温、干旱、盐胁迫、枯萎病等多种不利环境的抗性。然而，关于西瓜中褪黑素合成关键基因的鉴定及其功能解析鲜见报道。鉴定西瓜中褪黑素合成关键基因，可以更加深入的研究褪黑素对西瓜蔓长、分枝、果实膨大、果皮条纹及颜色、瓤色、糖分积累等性状的调控及其机理。

因此，提供西瓜ClCOMT1基因及其在调控植物内源褪黑素含量中的应用是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了西瓜ClCOMT1基因及其在调控植物内源褪黑素含量中的应用，通过对西瓜褪黑素合成关键基因ClCOMT1的克隆以及利用转基因技术培育不同褪黑素含量的西瓜材料，在调控西瓜生长发育和逆境抗性方面，具有很好的应用前景。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

西瓜ClCOMT1基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步，所述的西瓜ClCOMT1基因在调控植物内源褪黑素含量中的应用。

进一步，过表达所述的西瓜ClCOMT1基因在提高植物内源褪黑素含量中的应用。

进一步，敲除所述的西瓜ClCOMT1基因在降低植物内源褪黑素含量中的应用。

本发明利用西瓜和拟南芥转基因技术对西瓜ClCOMT1基因进行过表达，其分别提高了西瓜和拟南芥转基因材料中的褪黑素含量；利用CRISPR/Cas9基因编辑系统对西瓜ClCOMT1基因进行定点敲除，降低了西瓜愈伤组织中的褪黑素含量。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了西瓜ClCOMT1基因及其在调控植物内源褪黑素含量中的应用，通过基因手段构建西瓜ClCOMT1过表达或基因突变材料以及拟南芥异源过表达ClCOMT1材料，调控基因ClCOMT1的表达水平或编辑其序列来研究其对内源褪黑素合成的调控作用。结果发现，ClCOMT1过表达提高了褪黑素含量，ClCOMT1敲除降低了褪黑素含量。本发明提供的ClCOMT1基因为培育高含褪黑素的西瓜及其他植物新品种提供了基因资源，具有较好的潜在应用价值，为研究植物褪黑素合成及其调控植物生长发育和逆境抗性的机理奠定理论基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明过表达西瓜愈伤组织中ClCOMT1基因的半定量PCR检测结果；

图2附图为本发明过表达西瓜愈伤组织中ClCOMT1基因的qRT-PCR检测结果；

图3附图为本发明ClCOMT1基因敲除西瓜材料的靶点及其附近序列的测序结果；

图4附图为本发明ClCOMT1过表达西瓜材料中褪黑素含量；

图5附图为本发明ClCOMT1敲除西瓜材料中褪黑素含量的水平；

图6附图为本发明异源过表达拟南芥中ClCOMT1基因的半定量PCR检测结果；

图7附图为本发明异源过表达拟南芥中褪黑素含量的水平；

其中，图4、图5、图7中，Fw为Fresh weight，鲜重。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1ClCOMT1基因过表达载体的构建

为鉴定西瓜中褪黑素合成关键基因，从西瓜野生型材料YL(张月乔，葛洁，田树娟，袁黎.2020.利用发根农杆菌体系检测西瓜CRISPR/Cas9系统的靶位点.中国瓜菜，33(4)：7-11.)的cDNA中克隆了ClCOMT1基因。根据Cucurbit Genomics Database中提供的ClCOMT1(Cla97C07G144540)参考序列的编码区序列，设计特异性引物，并在引物的5’端分别加上带有限制性酶切位点(BamHI和Pml I)和pCambia1305.4载体的同源臂序列，命名为ClCOMT1-F和ClCOMT1-R，具体序列如下：

ClCOMT1-F：5’-acgggggactctagaggatccatgggatcatcggtgagc-3’；SEQ ID NO.1；

ClCOMT1-R：5’-ctggtcaccaattcacacgtgctagtggtggtggtggtggtggaggcggaagaggttgtgtgtg-3’；SEQ ID NO.2。

然后以西瓜YL材料的cDNA为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：Primer STARTMax Premix(2x)25μl，cDNA 2μl，ClCOMT1-F 1μl，ClCOMT1-R 1μl，ddH₂O 21μl；PCR反应程序为：98℃10s，55℃5s，72℃10s，30个循环；72℃5min。

纯化回收后得到含有pCambia1305.4载体同源臂的ClCOMT1片段，将得到的纯化产物与BamHI和Pml I限制性内切酶酶切过的pCambia1305.4线性化载体进行连接，获得过表达载体pCambia1305.4-ClCOMT1。ClCOMT1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

atgggatcatcggtgagcgatgaggaagcccagctgtttgctatgcaaatggctagcgcgtctgtgcttccaatggtgctgaaggcggcgattgagctggatttgctggaaatcattgggaggggcggggagggggctgtgttatccccatcccaaatcgcttcccagctatcaggggttaaaaacccagaggcccacgtgatgctagaccgcatgttgcgcctgctggccagctactccatcctcacttactccctcaataccctccccgatggcaccgtggagaggctctatggcctcgcccctgtctccaagttcttgatcaacaatgaagacggtgtctctattgcccctctttgtctcatgaatcaagataaagtccttatggagagctggtaccatttgaaagatgcagtacttgaaggagggattcccttcaacagagcctacggaatgggggcgttccaataccatggaacagatccaagattcaacaaggtgttcaacaagggaatgtccgaccattccaccattaccatgaagaagattctggagacctacaaagggtttgaagggcttaattcagtggtggatgttgggggtggcaccggagcggttctccacatgatagtttccaagtacccttctattaggggcatcaacttcgacctccctcatgtcattgaggatgcccctgcctacccaggcgtggaacatgttgggggcgacatgtttgacagcgttccaaagggggatgccattttcatgaagtggatctgccacgattggagcgaccaccactgcctcaagttcttgaagaattgctacgatgcgctgccgcagcagggcaaggtgattgtggcggaatgcattcttccggtagcaccggacagcagcctcgccaccaagggagtcattcacatcgacctcataatgctggctcacaaccccggaggcaaagaaaggaccgagaatgagtttcaagccttgtctaaggctgcaggatttcatggtttcaaggtccactgctgtgcttttaacacttatgtcatggaatttctcaagacaccttag；SEQ ID NO.3。

结果表明，所克隆的ClCOMT1 cDNA序列与Cucurbit Genomics Database中公布的97103全基因组测序材料的cDNA序列(Cla97C07G144540)在570(C—T)和855(A—G)位点有2个单碱基突变，但两者的氨基酸序列一致。

其中，本发明所用pCambia1305.4载体是以pCambia1305载体为基础改造而成，具体改造过程如下：

(1)用GFP标签代替原有的GUSPlus标签，其中GFP序列来自于PBI221-GFP载体，设计特异性引物，并在引物的5’端分别加上pCambia1305载体的同源臂序列，命名为GFP-F和GFP-R，具体序列如下：

GFP-F：5’-acgggggactcttgaccatggatgggtaagggagaagaacttt-3’；SEQ ID NO.4；

GFP-R：5’-gagctggtcaccaattcacacttatttgtatagttcatccatgcc-3’；SEQ IDNO.5。

然后以PBI221-GFP载体为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：Primer START MaxPremix(2x)25μl，PBI221-GFP 2μl，GFP-F 1μl，GFP-R 1μl，ddH₂O 21μl；PCR反应程序为：98℃10s，55℃5s，72℃10s，30个循环；72℃5min。

纯化回收后得到含有pCambia1305载体同源臂的GFP片段，将得到的纯化产物与Nco I和Pml I限制性内切酶酶切过的pCambia1305线性化载体(切除GUSPlus)进行连接，获得含有GFP标签的pCambia1305-GFP载体。GFP的核苷酸序列如下：

atgggtaagggagaagaacttttcactggagttgtcccaattcttgttgaattagatggtgatgttaatgggcacaaattttctgtcagtggagagggtgaaggtgatgcaacatacggaaaacttacccttaaatttatttgcactactggaaagcttcctgttccttggccaacacttgtcactactcttacttatggtgttcaatgcttttcaagatacccagatcatatgaagcggcacgacttcttcaagagcgccatgcctgagggatacgtgcaggaaaggaccatcttcttcaaggacgacgggaactacaagacacgtgctgaagtcaagtttgagggagacacccttgtcaacaggatcgagcttaagggaatcgatttcaaggaggacggaaacatcctcggccacaagttggaatacaactacaactcccacaacgtatacatcatggcagacaaacaaaagaatggaatcaaagttaacttcaaaattagacacaacattgaagatggaagcgttcaactagcagaccattatcaacaaaatactccaattggcgatggccctgtccttttaccagacaaccattacctgtccacacaatctgccctttcgaaagatcccaacgaaaagagagaccacatggtccttcttgagtttgtaacagctgctgggattacacatggcatggatgaactatacaaataa；SEQ ID NO.6；

(2)在pCambia1305-GFP载体的基础上，用CaMV 35S启动子代替lac启动子，其中CaMV 35S启动子序列来自于PBI121载体，设计特异性引物，并在引物的5’端分别加上pCambia1305的同源臂序列，命名为35S-F和35S-R，具体序列如下：

35S-F：5’-acgagagtgtcgtgctccaccatgagattagccttttcaatttcag-3’；SEQ IDNO.7；

35S-R：5’-cttgcatgcctgcaggtcgacggatcctctagagtcccccgtg-3’；SEQ ID NO.8。

然后以PBI121载体为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：Primer START MaxPremix(2x)25μl，PBI1212μl，35S-F 1μl，35S-R 1μl，ddH₂O 21μl；PCR反应程序为：98℃10s，55℃5s，72℃10s，30个循环；72℃5min。

纯化回收后得到含有pCambia1305载体同源臂的CaMV 35S片段，将得到的纯化产物与BstXI和SalI限制性内切酶酶切过的pCambia1305-GFP线性化载体(切除lac启动子)进行连接，获得含有CaMV 35S启动子和GFP标签的pCambia1305-35S-GFP载体。CaMV 35S的核苷酸序列如下：

agattagccttttcaatttcagaaagaatgctaacccacagatggttagagaggcttacgcagcaggtctcatcaagacgatctacccgagcaataatctccaggaaatcaaataccttcccaagaaggttaaagatgcagtcaaaagattcaggactaactgcatcaagaacacagagaaagatatatttctcaagatcagaagtactattccagtatggacgattcaaggcttgcttcacaaaccaaggcaagtaatagagattggagtctctaaaaaggtagttcccactgaatcaaaggccatggagtcaaagattcaaatagaggacctaacagaactcgccgtaaagactggcgaacagttcatacagagtctcttacgactcaatgacaagaagaaaatcttcgtcaacatggtggagcacgacacacttgtctactccaaaaatatcaaagatacagtctcagaagaccaaagggcaattgagacttttcaacaaagggtaatatccggaaacctcctcggattccattgcccagctatctgtcactttattgtgaagatagtggaaaaggaaggtggctcctacaaatgccatcattgcgataaaggaaaggccatcgttgaagatgcctctgccgacagtggtcccaaagatggacccccacccacgaggagcatcgtggaaaaagaagacgttccaaccacgtcttcaaagcaagtggattgatgtgatatctccactgacgtaagggatgacgcacaatcccactatccttcgcaagacccttcctctatataaggaagttcatttcatttggagagaacacgggggactctagaggatcc；SEQ ID NO.9；

(3)在pCambia1305-35S-GFP载体的基础上，在CaMV 35S启动子后面添加NOSterminator，其中NOS terminator序列来自于pCambia1305载体，设计特异性引物，并在引物的5’端分别加上pCambia1305的同源臂序列，命名为NOS-F和NOS-R，具体序列如下：

NOS-F：5’-gactctagaggatccgtcgactcaccatcacgtgtgaattggt-3’；SEQ ID NO.10；

NOS-R：5’-aacgacggccagtgccaagctgatctagtaacatagatgacaccg-3’；SEQ IDNO.11。

然后以pCambia1305载体为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：Primer START MaxPremix(2x)25μl，pCambia13052μl，NOS-F 1μl，NOS-R 1μl，ddH₂O 21μl；PCR反应程序为：98℃10s，55℃5s，72℃10s，30个循环；72℃5min。

纯化回收后得到含有pCambia1305载体同源臂的NOS terminator片段，将得到的纯化产物与Sal I和Hind III限制性内切酶酶切过的pCambia1305-35S-GFP线性化载体进行连接，获得含有CaMV 35S启动子和GFP标签的pCambia1305载体，命名为pCambia1305.4。NOS terminator的核苷酸序列如下：

ccatcacgtgtgaattggtgaccagctcgaatttccccgatcgttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgattatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgacgttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgatagaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgttactagatc；SEQID NO.12；

pCambia1305.4的结构为：(CaMV 35S)-(MCS)-(NOS terminator)-(CaMV35S)-(GFP)。

实施例2ClCOMT1基因编辑载体的构建

ClCOMT1基因编辑采用的是PBSE401载体(Jie Zhang,Shaogui Guo,Gaojie Ji,etal.2019.A unique chromosome translocation disrupting ClWIP1 leads to gynoecyin watermelon.The Plant Journal,101:265–277)，具有两个靶位点，具体载体构建步骤如下。利用CRISPR-P网站(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计2个长度为19bp的ClCOMT1基因的靶点序列:

Target1：5’-GGATCATCGGTGAGCGATG-3’；SEQ ID NO.13；

Target2：5’-GCAAATCCAGCTCAATCGC-3’；SEQ ID NO.14；

将设计的靶点序列的5’和3’两端加上pCBC-DT1T2(Cm)载体上的同源臂序列，最终得到的引物序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。

5’-atatatggtctcgattgggatcatcggtgagcgatggttttagagctagaaatagc-3’；SEQ IDNO.15；

5’-attattggtctcgaaacgcaaatccagctcaatcgccaatctcttagtcgactctac-3’；SEQID NO.16。

合成的引物以pCBC-DT1T2(Cm)为模板扩增长度为726bp的PCR片段(Target-1)-(gRNA-Sc)-(U6-26t)-(U6-29p)-(Target-2)，纯化回收的PCR产物利用T4 DNA连接酶连接到PBSE401载体的Bsa I位点上，通过测序确定连接方向正确，获得西瓜ClCOMT1基因的编辑载体PBSE401-(Target-1)-(gRNA-Sc)-(U6-26t)-(U6-29p)-(Target-2)-Cas9。

实施例3西瓜ClCOMT1转基因愈伤组织的构建与检测

(1)将过表达载体pCambia1305.4-ClCOMT1和基因编辑载体PBSE401-(Target-1)-(gRNA-Sc)-(U6-26t)-(U6-29p)-(Target-2)-Cas9转化根癌农杆菌EHA105，并对利用西瓜子叶制备的外植体进行侵染，在含有2,4-D的M519固体培养基中诱导愈伤组织。过表达载体转化的外植体利用潮霉素筛选，编辑载体转化的外植体利用除草剂BASTA筛选，每两周继代一次，6-8周时检测阳性转基因组织。

(2)利用半定量PCR和qRT-PCR验证ClCOMT1过表达的转基因愈伤组织，β-actin作为内参，所用引物序列如下：

ClCOMT1-1F：5’-TCGCCACCAAGGGAGTCATTCA-3’；SEQ ID NO.17；

ClCOMT1-1R：5’-GCACAGCAGTGGACCTTGAAAC-3’；SEQ ID NO.18；

β-actin-F：5’-CCATGTATGTTGCCATCCAG-3’；SEQ ID NO.19；

β-actin-R：5’-GGATAGCATGGGGTAGAGCA-3’；SEQ ID NO.20。

半定量PCR检测结果见图1；qRT-PCR检测结果见图2。图1和图2结果显示过表达的转基因愈伤组织中ClCOMT1基因相对表达量显著高于野生型YL；图2结果显示过表达转基因系#1、#2和#3中ClCOMT1基因的表达量分别为野生型组织的11.7、4.8和6.6倍。

(3)利用PCR和深度测序验证ClCOMT1基因编辑愈伤组织，所用引物序列如下：

ClCOMT1-2F：5’-GGAGTGAGTACGGTGTGCGTACTATCCACTCCAA TCCACT-3’；SEQ IDNO.21；

ClCOMT1-2R：5’-GAGTTGGATGCTGGATGGGCTGGGAAGCGATTTG GGATG-3’；SEQ IDNO.22。

结果见图3，发现4个编辑系(#1-#4)在靶位点2上发生突变，1个编辑系(#5)在靶位点1上发生突变。

5个编辑系(#1-#5)均为杂合体，有2-4种突变类型；其中，#1有三种突变型，分别在靶位点2上缺失2、4、7个碱基，编辑率分别为26.2％、24.5％、12.5％；#2有三种突变型，分别在靶位点2上缺失长片段(图3中未完全展现缺失片段)、4、5个碱基，编辑率分别为47.5％、27.0％、11.0％；#3有4种突变型，在靶位点2附近分别缺失2、35、24、36个碱基，编辑率分别为30.1％、28.2％、11.0％、10.4％；#4有两种突变型，分别在靶位点2上缺失40个碱基和长片段(图3中未完全展现缺失片段)，编辑率分别为37.2％、36.8％；#5有两种突变型，分别在靶位点1上缺失19、10个碱基，编辑率分别为54.2％、45.8％。由于N端序列发生碱基突变，导致蛋白翻译提前终止。#1-#5编辑系细胞的编辑率分别为63.2％、85.5％、79.7％、74.0％、100％。

实施例4西瓜ClCOMT1基因转基因愈伤组织内褪黑素变化的检测

检测野生型YL、ClCOMT1过表达及ClCOMT1编辑愈伤组织中的褪黑素含量。褪黑素用上海岚派生物科技有限公司的ELISA kit测定。其中褪黑素提取和测定的具体方法为：取0.3g新鲜的阳性愈伤组织在2ml的提取液(丙酮：甲醇：水＝89：10：1)中研磨均匀，匀浆样品在冰上充分混匀后4℃4,500g离心10min。取1ml上清液转移至新的2ml离心管中并按照2：1的比例加入1％的三氯乙酸用于沉淀蛋白质，然后4℃4,500g离心10min，上清液用ELISAkit测定褪黑素含量。

ClCOMT1过表达愈伤组织中褪黑素含量结果见表1和图4。

表1

表1和图4结果显示，ClCOMT1过表达愈伤组织中褪黑素含量增加2.2-7.0倍，且ClCOMT1表达量越高褪黑素含量越高。

ClCOMT1编辑愈伤组织中褪黑素含量结果见表2和图5。

表2

表2和图5结果显示，ClCOMT1编辑愈伤组织中褪黑素含量下降33.7％–56.3％，并且褪黑素含量与细胞编辑率显著负相关。由此可见，ClCOMT1基因调控植物内源褪黑素合成。

实施例5拟南芥异源过表达ClCOMT1转基因材料的构建与检测

为了验证ClCOMT1基因是否可以用于调控其他植物中褪黑素的合成，构建了拟南芥异源过表达ClCOMT1转基因材料。根据Cucurbit Genomics Database中提供的ClCOMT1(Cla97C07G144540)参考序列，设计带有pGREEN载体上限制性酶切位点(Xho I和EcoR V)同源臂序列的特异性引物ClCOMT1-3F和ClCOMT1-3R，具体引物序列如下：

ClCOMT1-3F：5’-gaggacagcccaagctacgcgtctcgagatgggatcatcggtgagc-3’；SEQID NO.23；

ClCOMT1-3R：5’-atcccccgggctgcaggaattcgatatcaggtgtcttgagaaattcc-3’；SEQID NO.24。

以西瓜YL材料的cDNA为模板PCR扩增得到片段长度为1074bp、含有pGREEN载体同源臂的ClCOMT1片段。将ClCOMT1片段与Xho I和EcoR V限制性内切酶双酶切过的pGREEN线性化载体进行连接，获得重组质粒pGREEN-ClCOMT1。将pGREEN-ClCOMT1通过热激法转化根癌农杆菌菌株GV3101，并用蘸花法侵染没有开放的拟南芥花序。收获的T0代拟南芥利用BASTA筛选抗性植株。采集野生型Columbia和具有BASTA抗性植株的叶片提取DNA，利用PCR检测出ClCOMT1过表达阳性转基因植株(#1-#5)，AtACTIN2作为内参，PCR所用引物序列如下：

AtACTIN2-F：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；SEQ ID NO.25；

AtACTIN2-R：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’；SEQ ID NO.26；

ClCOMT1-4F：5’-ATGGGATCATCGGTGAGC-3’；SEQ ID NO.27；

ClCOMT1-4R：5’-AGGTGTCTTGAGAAATTCC-3’；SEQ ID NO.28。

结果见图6，结果显示野生型没有DNA条带，而过表达株系有ClCOMT1的DNA条带。

获得的阳性ClCOMT1基因过表达株系，进行单株收种，并连续自交3代进行纯化。褪黑素含量检测结果见表3和图7。

表3

表3和图7结果显示，与野生型相比，ClCOMT1过表达植株中褪黑素含量增加了2.3-4.1倍。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110> 西北农林科技大学

<120> 西瓜ClCOMT1基因及其在调控植物内源褪黑素含量中的应用

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

acgggggact ctagaggatc catgggatca tcggtgagc 39

<210> 2

<211> 64

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 2

ctggtcacca attcacacgt gctagtggtg gtggtggtgg tggaggcgga agaggttgtg 60

tgtg 64

<210> 3

<211> 1074

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

atgggatcat cggtgagcga tgaggaagcc cagctgtttg ctatgcaaat ggctagcgcg 60

tctgtgcttc caatggtgct gaaggcggcg attgagctgg atttgctgga aatcattggg 120

aggggcgggg agggggctgt gttatcccca tcccaaatcg cttcccagct atcaggggtt 180

aaaaacccag aggcccacgt gatgctagac cgcatgttgc gcctgctggc cagctactcc 240

atcctcactt actccctcaa taccctcccc gatggcaccg tggagaggct ctatggcctc 300

gcccctgtct ccaagttctt gatcaacaat gaagacggtg tctctattgc ccctctttgt 360

ctcatgaatc aagataaagt ccttatggag agctggtacc atttgaaaga tgcagtactt 420

gaaggaggga ttcccttcaa cagagcctac ggaatggggg cgttccaata ccatggaaca 480

gatccaagat tcaacaaggt gttcaacaag ggaatgtccg accattccac cattaccatg 540

aagaagattc tggagaccta caaagggttt gaagggctta attcagtggt ggatgttggg 600

ggtggcaccg gagcggttct ccacatgata gtttccaagt acccttctat taggggcatc 660

aacttcgacc tccctcatgt cattgaggat gcccctgcct acccaggcgt ggaacatgtt 720

gggggcgaca tgtttgacag cgttccaaag ggggatgcca ttttcatgaa gtggatctgc 780

cacgattgga gcgaccacca ctgcctcaag ttcttgaaga attgctacga tgcgctgccg 840

cagcagggca aggtgattgt ggcggaatgc attcttccgg tagcaccgga cagcagcctc 900

gccaccaagg gagtcattca catcgacctc ataatgctgg ctcacaaccc cggaggcaaa 960

gaaaggaccg agaatgagtt tcaagccttg tctaaggctg caggatttca tggtttcaag 1020

gtccactgct gtgcttttaa cacttatgtc atggaatttc tcaagacacc ttag 1074

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 4

acgggggact cttgaccatg gatgggtaag ggagaagaac ttt 43

<210> 5

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 5

gagctggtca ccaattcaca cttatttgta tagttcatcc atgcc 45

<210> 6

<211> 717

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 6

atgggtaagg gagaagaact tttcactgga gttgtcccaa ttcttgttga attagatggt 60

gatgttaatg ggcacaaatt ttctgtcagt ggagagggtg aaggtgatgc aacatacgga 120

aaacttaccc ttaaatttat ttgcactact ggaaagcttc ctgttccttg gccaacactt 180

gtcactactc ttacttatgg tgttcaatgc ttttcaagat acccagatca tatgaagcgg 240

cacgacttct tcaagagcgc catgcctgag ggatacgtgc aggaaaggac catcttcttc 300

aaggacgacg ggaactacaa gacacgtgct gaagtcaagt ttgagggaga cacccttgtc 360

aacaggatcg agcttaaggg aatcgatttc aaggaggacg gaaacatcct cggccacaag 420

ttggaataca actacaactc ccacaacgta tacatcatgg cagacaaaca aaagaatgga 480

atcaaagtta acttcaaaat tagacacaac attgaagatg gaagcgttca actagcagac 540

cattatcaac aaaatactcc aattggcgat ggccctgtcc ttttaccaga caaccattac 600

ctgtccacac aatctgccct ttcgaaagat cccaacgaaa agagagacca catggtcctt 660

cttgagtttg taacagctgc tgggattaca catggcatgg atgaactata caaataa 717

<210> 7

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 7

acgagagtgt cgtgctccac catgagatta gccttttcaa tttcag 46

<210> 8

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 8

cttgcatgcc tgcaggtcga cggatcctct agagtccccc gtg 43

<210> 9

<211> 853

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 9

agattagcct tttcaatttc agaaagaatg ctaacccaca gatggttaga gaggcttacg 60

cagcaggtct catcaagacg atctacccga gcaataatct ccaggaaatc aaataccttc 120

ccaagaaggt taaagatgca gtcaaaagat tcaggactaa ctgcatcaag aacacagaga 180

aagatatatt tctcaagatc agaagtacta ttccagtatg gacgattcaa ggcttgcttc 240

acaaaccaag gcaagtaata gagattggag tctctaaaaa ggtagttccc actgaatcaa 300

aggccatgga gtcaaagatt caaatagagg acctaacaga actcgccgta aagactggcg 360

aacagttcat acagagtctc ttacgactca atgacaagaa gaaaatcttc gtcaacatgg 420

tggagcacga cacacttgtc tactccaaaa atatcaaaga tacagtctca gaagaccaaa 480

gggcaattga gacttttcaa caaagggtaa tatccggaaa cctcctcgga ttccattgcc 540

cagctatctg tcactttatt gtgaagatag tggaaaagga aggtggctcc tacaaatgcc 600

atcattgcga taaaggaaag gccatcgttg aagatgcctc tgccgacagt ggtcccaaag 660

atggaccccc acccacgagg agcatcgtgg aaaaagaaga cgttccaacc acgtcttcaa 720

agcaagtgga ttgatgtgat atctccactg acgtaaggga tgacgcacaa tcccactatc 780

cttcgcaaga cccttcctct atataaggaa gttcatttca tttggagaga acacggggga 840

ctctagagga tcc 853

<210> 10

<211> 43

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 10

gactctagag gatccgtcga ctcaccatca cgtgtgaatt ggt 43

<210> 11

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 11

aacgacggcc agtgccaagc tgatctagta acatagatga caccg 45

<210> 12

<211> 291

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 12

ccatcacgtg tgaattggtg accagctcga atttccccga tcgttcaaac atttggcaat 60

aaagtttctt aagattgaat cctgttgccg gtcttgcgat gattatcata taatttctgt 120

tgaattacgt taagcatgta ataattaaca tgtaatgcat gacgttattt atgagatggg 180

tttttatgat tagagtcccg caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc 240

gcgcaaacta ggataaatta tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat c 291

<210> 13

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 13

ggatcatcgg tgagcgatg 19

<210> 14

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 14

gcaaatccag ctcaatcgc 19

<210> 15

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 15

atatatggtc tcgattggga tcatcggtga gcgatggttt tagagctaga aatagc 56

<210> 16

<211> 57

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 16

attattggtc tcgaaacgca aatccagctc aatcgccaat ctcttagtcg actctac 57

<210> 17

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 17

tcgccaccaa gggagtcatt ca 22

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 18

gcacagcagt ggaccttgaa ac 22

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 19

ccatgtatgt tgccatccag 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 20

ggatagcatg gggtagagca 20

<210> 21

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 21

ggagtgagta cggtgtgcgt actatccact ccaatccact 40

<210> 22

<211> 39

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 22

gagttggatg ctggatgggc tgggaagcga tttgggatg 39

<210> 23

<211> 46

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 23

gaggacagcc caagctacgc gtctcgagat gggatcatcg gtgagc 46

<210> 24

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 24

atcccccggg ctgcaggaat tcgatatcag gtgtcttgag aaattcc 47

<210> 25

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 25

ggtaacattg tgctcagtgg tgg 23

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 26

aacgacctta atcttcatgc tgc 23

<210> 27

<211> 18

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 27

atgggatcat cggtgagc 18

<210> 28

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 28

aggtgtcttg agaaattcc 19

Claims

1.西瓜ClCOMT1基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.权利要求1所述的西瓜ClCOMT1基因在调控植物内源褪黑素含量中的应用。

3.过表达权利要求1所述的西瓜ClCOMT1基因在提高植物内源褪黑素含量中的应用。

4.敲除权利要求1所述的西瓜ClCOMT1基因在降低植物内源褪黑素含量中的应用。