CN115851817A - SlPIF4作为负调控因子在提升番茄果实褪黑素含量中的应用 - Google Patents
SlPIF4作为负调控因子在提升番茄果实褪黑素含量中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了SlPIF4作为负调控因子在提升番茄果实褪黑素含量中的应用，通过在番茄中以组成型启动子35S驱动的SlPIF4基因过量表达，降低了番茄果实中褪黑素的含量；而干扰和敲除株系的褪黑素含量提高，表明SlPIF4作为负调控因子抑制褪黑素的合成，因此可以通过干扰和敲除SlPIF4基因使褪黑素合成显著提高，可应用于番茄褪黑素的合成生物学研究和遗传育种品质改良。
Description
技术领域
本发明涉及植物分子生物学与植物遗传工程领域，涉及SlPIF4作为负调控因子在提升番茄果实褪黑素含量中的应用。
背景技术
褪黑素(N-乙酰-5-甲氧基色胺，Melatonin)是一种生命必需的吲哚胺类化合物，是存在于绝大多数生物有机体中的一种功能保守的广谱生理调节剂，且已被证实是目前已知的抗氧化作用最强的内源自由基清除剂，对动植物生命进程均有重要的生理学意义。在动物中，褪黑素具有改善睡眠、延缓衰老、缓解过敏症状、调节免疫系统等功能。在植物中，褪黑素主要作为生长促进剂和抗氧化剂行使功能，具有延缓衰老、增强光合作用、调节光周期、影响种子萌发和根形态建成、调控开花及果实成熟、清除自由基、减轻胁迫损伤的活性，能够赋予植物抵抗不良环境的能力，有利于植物生存繁荣。
植物褪黑素的合成起始于自身合成前体色氨酸(Tryptophan)，需要经过四个连续的酶促反应。色氨酸脱羧酶(TDC)和色胺-5-羟化酶(T5H)是褪黑素合成前两步的关键酶，催化产生血清素(5-羟基色胺，serotonin)，血清素能够被5-羟色胺-N-乙酰转移酶(SNAT)催化生成N-乙酰血清素(N-acetylserotonin)，继而被N-乙酰基-5-羟色胺-甲基转移酶(ASMT)/咖啡酸-O-甲基转移酶(COMT)催化生成褪黑素。也存在另一条支路即血清素先被ASMT/COMT催化生成5-甲氧基色胺(5-methoxytryptamine)，再被SNAT催化生成褪黑素。
番茄褪黑素与果实品质形成密切相关，但其调控的具体分子机制并不清楚，所形成的调控网络也一直是国内外研究的热点和难点之一。以番茄为底盘对重要生长调节物质褪黑素合成和代谢途径的研究，有助于深入理解其动态积累和多种生理活性，深入揭示褪黑素参与植物不同生长期调控的分子机理。以现代生物技术手段提高番茄中褪黑素的含量，具有广泛市场价值，对优质、高效现代化农业的发展也具有重要的生产应用价值。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供敲除或干扰番茄SlPIF4基因表达在提升番茄果实褪黑素含量中的应用；本发明的目的之二在于提供用于特异性干扰番茄SlPIF4基因的片段、重组载体或转化子在提升番茄果实褪黑素含量中的应用；本发明的目的之三在于提供用于特异性敲除番茄SlPIF4基因的片段、重组载体或转化子在提升番茄果实褪黑素含量中的应用；本发明的目的之四在于提供一种提高番茄果实褪黑素含量的方法。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、敲除/干扰番茄SlPIF4基因或番茄SlPIF4基因作用位点表达在提升番茄果实褪黑素含量中的应用，所述SlPIF4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。
本发明优选的，敲除番茄SlPIF4基因的方法如下：使用CRISPR/Cas9基因编辑系统编辑番茄SlPIF4基因。
本发明优选的，所述CRISPR/Cas9的sgRNA靶序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
本发明优选的，所述CRISPR/Cas9的sgRNA序列由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示引物扩增获得。
本发明优选的，干扰番茄SlPIF4基因表达的方法如下：将番茄SlPIF4基因的干扰靶序列反向连接于载体中构建得到干扰载体。
本发明优选的，所述番茄SlPIF4基因的干扰靶序列如SEQ ID NO.49所示。
本发明优选的，所述番茄SlPIF4基因作用位点为proSlCOMT2的第二个G-Box，结构域序列为CACCTG。
2、用于特异性干扰番茄SlPIF4基因的片段、重组载体或转化子在提升番茄果实褪黑素含量中的应用，所述SlPIF4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。
3、用于特异性敲除番茄SlPIF4基因的片段、重组载体或转化子在提升番茄果实褪黑素含量中的应用，所述SlPIF4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。
4、一种提高番茄果实褪黑素含量的方法，将在番茄中SlPIF4基因敲除/干扰表达或敲出番茄SlPIF4基因作用位点，得到的转基因番茄为果实褪黑素含量高的番茄，所述SlPIF4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。
本发明的有益效果在于：本发明公开了番茄SlPIF4基因在调控番茄果实褪黑素含量的应用。研究发现SlPIF4能够抑制褪黑素合成途径相关基因表达，干扰或敲除该基因能够显著提升下游途径褪黑素的含量，表明SlPIF4转录因子对于合成生物学应用研究和遗传育种品质改良具有重要的指导意义，对于番茄褪黑素的合成生物学研究和遗传育种品质改良具有重要的指导意义和广阔的市场前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为重组质粒zmpl-IF4-Cas9载体结构图。
图2为实时荧光定量PCR检测SlPIF4过表达和RNAi干扰株系番茄果实中SlPIF4基因和SlCOMT2基因的表达情况(A：SlPIF4基因；B:SlCOMT2基因)。
图3为通过实时荧光定量PCR检测SlCOMT2过表达和RNAi干扰株系番茄果实中SlCOMT2基因的表达情况。
图4为通过LC-MS/MS测定的SlPIF4过表达、RNAi干扰株系和敲除株系中褪黑素含量。
图5为通过LC-MS/MS测定的SlCOMT2的过表达、RNAi干扰株系和敲除株系中褪黑素含量。
图6为通过酵母单杂验证SlPIF4结合proSlCOMT2的第二个G-Box结构域P2，及通过烟草Dual-LUC验证SlPIF4结合proSlCOMT2，从而转录激活SlCOMT2的表达(A:proSlCOMT2；B:酵母单杂验证验证；C:烟草Dual-LUC验证结果)。
图7为EMSA及番茄原生质体Dual-LUC验证SlPIF4结合proSlCOMT2的第二个G-Box结构域P2，从而转录激活SlCOMT2的表达(A:EMSA检测结果；B：LUC与REN比值)。
图8为通过LC-MS/MS测定的Cas9-proSlCOMT2株系中褪黑素的含量。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、番茄SlPIF4和SlCOMT2的基因克隆
参考植物RNA提取试剂盒v1.5(BIOFIT)的方法，提取番茄果实的总RNA，随后进行琼脂糖凝胶电泳检测，以确保RNA质量，然后通过NanoDrop 2,000测定RNA浓度。进一步，参考反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT regent kit,TaKaRa)描述的方法，将番茄果实总RNA(1μg)反转录成第一链cDNA。根据SlPIF4和SlCOMT2基因序列设计PCR扩增引物，引物序列见表1。
表1、番茄SlPIF4和SlCOMT2的克隆引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| SlPIF4-F | ATGGGATTTGATCATGAGCTAGT(SEQ ID NO.1) |
| SlPIF4-R | AGTGGCAGGTGCATTACTATTAG(SEQ ID NO.2) |
| SlCOMT2-F | ATGGAGAATGCAAATGGGGAACCAA(SEQ ID NO.3) |
| SlCOMT2-R | TGACTTGTGAAATTCAAGAATCGTAA(SEQ ID NO.4) |
以获得的cDNA为模板进行PCR扩增，程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，52℃退火20s，72℃延伸30s，重复34个循环；72℃终延伸5min；保存4℃。以表1中的SlPIF4基因和SlCOMT2基因引物进行PCR扩增，PCR扩增产物进行胶回收纯化并测序，获得番茄SlPIF4和SlCOMT2基因序列。测序结果显示，获得的SlPIF4基因全长1,488bp，其核苷酸序列如SEQ IDNO.44所示；所述获得的SlPIF4基因编码495个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.45所示。获得的SlCOMT2基因全长1,086bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO.46所示；SlCOMT2基因编码361个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO.47所示。
实施例2、番茄proSlCOMT2的启动子序列2000bp的扩增
参考植物基因组的SDS提取方法，提取番茄果实DNA。具体如下，将新鲜样品置于1.5mL离心管中，加入400μL DNA提取缓冲液(0.2M Tris-HCl pH8.0，0.4M LiCl，25mM EDTA和1％SDS)，研磨后65℃水浴10min，13000rpm离心10min。取上清液300μL转移到新的离心管中，加入300μL异丙醇混合均匀，-20℃静置1h。13000rpm离心10min，弃上清。加入200μL75％的乙醇，13000rpm离心5min，弃废液。加入200μL无水乙醇重复离心一次，弃废液。晾干后，加入65℃预热的ddH2O 30μL以溶解基因组DNA。根据proSlCOMT2启动子2000bp序列设计PCR扩增引物，引物序列见表2。
表2、番茄proSlCOMT2的扩增引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| proSlCOMT2-F | GAGTACCCATATATGTCCTAGTAATT(SEQ ID NO.5) |
| proSlCOMT2-R | GAAGTTATTGGCCAAGTATGGCCACT(SEQ ID NO.6) |
以获得的DNA为模板进行PCR扩增，程序为：95℃预变性3min；95℃变性20s，52℃退火20s，72℃延伸30s，重复34个循环；72℃终延伸5min；保存4℃。将PCR扩增产物进行胶回收纯化并测序，获得番茄proSlCOMT2的启动子序列。测序结果显示，获得的proSlCOMT2启动子序列全长2,000bp，其序列如SEQ ID NO.32所示。
实施例2、植物过表达的载体构建
植物过表达的载体构建载体为pCAMBIA1306，采用双酶切的构建方法，过表达SlPIF4载体将SlPIF4基因用BamHⅠ和AccⅠ连入pCAMBIA1306载体上；过表达SlCOMT2载体将SlCOMT2基因用Sac I和AccⅠ连入pCAMBIA1306载体上，SlPIF4基因和SlCOMT2基因用序列表3所示引物扩增。连接载体转化后进行测序，比对正确的质粒进行后续转化。过表达SlPIF4和SlCOMT2基因均为35S组成型启动子。
表3、番茄过表达载体的扩增引物
实施例3、植物干扰(RNAi)和植物基因敲除(Knockout)的载体构建
植物干扰载体的构建采用InvitrogenTM开发的Gateway同源重组技术，选择基因特异性较高的片段用于构建干扰载体，得到干扰质粒RNAi-SlPIF4，RNAi-SlCOMT2，构建使用的干扰序列如SEQ ID NO.49和SEQ ID NO.50。
植物基因敲除载体的构建首先通过在线软件CRISPR-P2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2)设计基因编辑靶位点，采用双靶位点策略。利用50μL的PCR扩增体系，酶切连接后进行转化和菌斑PCR鉴定。SlPIF4和SlCOMT2的靶位点序列见表4，扩增引物见表5，构建成功的菌液PCR鉴定引物见表6。其中Cas9-SlPIF4是由SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16扩增获得的序列插入到含有CRISPR/Cas9基因编辑功能的植物转化质粒，获得重组质粒zmpl-IF4-Cas9(该载体以由武汉伯远生物科技有限公司构建，载体结构如图1所示)；Cas9-SlCOMT2由SEQ ID NO.17和SEQ ID NO.18扩增获得的序列插入到含有CRISPR/Cas9基因编辑功能的植物转化质粒，获得重组质粒Zmpl-SlCOMT2-Cas9(该载体以由武汉伯远生物科技有限公司构建，由zmpl-IF4-Cas9中的IF4替换为SlCOMT2)。
表4、靶位点设计信息
表5、Cas9构建的扩增引物
表6、菌液PCR鉴定引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| RNAi-35S-F | TTCATTTGGAGAGAACACGGGGGAC(SEQ ID NO.19) |
| RNAi-JY-R | CAAGACCGGCAACAGGATTCAATC(SEQ ID NO.20) |
| Cas9-F | GCAACGCTCTGTCATCGTTACAAT(SEQ ID NO.21) |
| Cas9-R | GCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGG(SEQ ID NO.22) |
实施例3、根癌农杆菌介导的番茄稳定遗传转化
将所述获得的分别SlPIF4和SlCOMT2的过表达载体、干扰SlPIF4(RNAi-SIPIF4)表达载体和敲除载体的植物转化质粒分别导入根癌农杆菌EHA105，用于浸染番茄。具体步骤如下：
a.农杆菌准备和检测:取1μL质粒加入50μL EHA105根癌农杆菌感受态细胞中，充分混匀后吸取至电转杯中，电转后加1mL YEB液体培养基，充分混匀后吸取至1.5mL离心管中，于摇床30℃、180rpm振荡培养30min，将活化好的农杆菌菌液吸取50μL接种于YEB固体培养基上，28℃暗培养48h。配制PCR扩增体系，完成配制后充分混匀，使用PCR仪进行扩增，扩增程序根据引物信息等进行相应设置，引物见表1；扩增后,制备1％琼脂糖凝胶进行凝胶电泳检测，阳性对照及样品的电泳条带清晰、大小正确，且阴性对照均无条带的情况下，表明该样品可进入下一步骤。
b.番茄遗传转化:萌发的番茄组培苗，待子叶完全展开，用手术刀切为约0.5cm小段接种于预培养基，23℃预培养1～2d。挑取农杆菌于侵染液中，制备OD600＝0.5的农杆菌重悬液；侵染10min，将晾干的外植体接于共培培养基中，23℃暗培养2d。将共培后的外植体用1g/L的头孢水清洗两次，15min/次，接种于恢复培养基中，23℃、16h/8h光照/黑暗培养3～5d。将恢复培养的愈伤接种于筛选培养基，23℃、16h/8h光照/黑暗培养15-30d；筛选出的愈伤接种于分化培养基，23℃、16h/8h光照/黑暗培养30-40d。待分化的丛生芽生长至2-3cm左右，将其从愈伤上切除，接种于含有1mg/L IAA的生根培养基上，23℃、16h/8h光照/黑暗培养10-15d。待番茄幼苗完成生根，用镊子夹住轻轻取出，小心洗去根部残留的培养基，在1/3开口的组培瓶中炼苗1-2天，用ddH2O覆盖幼苗根部防止失水，随后移栽至营养土中，待植物长势健壮之后，揭开保鲜膜正常培养。
通过PCR鉴定T0代阳性植株(鉴定引物见表7)，并继续自交一代获得T1代阳性植物，用于后续实验和相关化合物含量测定。
表7、阳性植株PCR鉴定引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| 35S-F | TGCCGACAGTGGTCCCAAAG(SEQ ID NO.23) |
| SlPIF4-OX-F | CAGTTTAGCCACGCGACAGT(SEQ ID NO.24) |
| RNAi-SlPIF4-F | AAGCTGATGAGCTAGAATCAGCTG(SEQ ID NO.25) |
| RNAi-SlCOMT2-F | GGATGCTATTTTCATGAAGT(SEQ ID NO.26) |
| RNAi-YX-R | CGATGGTCTCAGCCCGGGCTCTGTAACTATC(SEQ ID NO.27) |
| Cas9-SlPIF4-F | GAGCTAGTGGAGTTGTTGTG(SEQ ID NO.28) |
| Cas9-SlPIF4-R | GCTTGAACCAACTGTCATCA (SEQ ID NO.29) |
| Cas9-SlCOMT2-F | AAGTGTACCTATGTCCCTTAAT(SEQ ID NO.30) |
| Cas9-SlCOMT2-R | AACATGTCACCACCAACGTGCT(SEQ ID NO.31) |
然后通过荧光定量PCR番茄植物中SlPIF4和SlCOMT2基因表达情况，检测引物如表8。
表8、qPCR鉴定引物
| 引物名称 | 引物序列(5’-3’) |
| qPCR-SlPIF4-F | TGCAACTGCAGATGATGTGG(SEQ ID NO.32) |
| qPCR-SlPIF4-R | GTAGTGTTGGACACCAGGGA(SEQ ID NO.33) |
| qPCR-SlCOMT2-F | TGTCTGGAGTTTCTGTGCCA(SEQ ID NO.34) |
| qPCR-SlCOM2-R | CAACCACCTCAGGCAAATCA(SEQ ID NO.35) |
检测结果如图2所示。结果显示，RNAi-SlPIF4干扰株系的番茄果实中SlPIF4基因表达量显著降低，而SlCOMT2基因的表达量显著上调，说明SlPIF4能够抑制SlCOMT2基因的表达。
按照相同的方法，同时转化含SlCOMT2(OX-SICOMT2)和干扰SlCOMT2(RNAi-SlCOMT2)的质粒，然后检测SlCOMT2基因的表达情况，结果如图3所示。结果显示，在OX-SICOMT2株系中，SlCOMT2基因表达量上升，而RNAi-SlCOMT2株系，SlCOMT2基因表达量下降。
实施例4、通过LC-MS/MS测定番茄果实褪黑素的含量
液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)能够满足褪黑素测定准确定性和定量的要求。其分析流程简单描述如下：
(1)褪黑素的提取
a.磨样(液氮速冻的新鲜样品或存储在负80摄氏度的冷冻干燥的样品)，用低温研磨仪(50Hz,磨3次，每次1min)至粉末状；
b.用1mL含0.1％甲酸的80％甲醇/水(V/V)提取1g新鲜样品或100mg冻干样品，将混合物涡旋30s，4℃超声30min，再涡旋30s；20000g离心10min，过0.22μm有机滤膜后于棕色瓶中保存，用于LC-MS/MS分析。
(2)色谱质谱采集
褪黑素检测与数据采集系统主要包括：超高效液相色谱(Ultra PerformanceLiquid Chromatography,UPLC)(ExionLCTMAD,https://sciex.com.cn/)和串联质谱(Tandem Mass Spectrometry,MS/MS)(
6500+,https://sciex.com.cn/)。
检测结果如图4和图5所示。结果显示，SlPIF4的超表达株系褪黑素含量相对野生型有所降低，但SlPIF4的植物干扰(RNAi)和基因敲除(Knockout)株系褪黑素含量显著提高。而SlCOMT2的超表达株系褪黑素含量显著提高，但SlCOMT2的植物干扰(RNAi)和基因敲除(Knockout)株系褪黑素含量显著降低。这说明SlPIF4能够抑制褪黑素的合成，其缺失对褪黑素合成有显著影响；SlCOMT2是有效的褪黑素合成酶基因，促进褪黑素的合成。
实施例5、SlPIF4和proSlCOMT2互作情况及作用位点验证
将上述克隆获得的SlPIF4和上游2000bp的proSlCOMT2序列构建至载体上。pB42AD、pGREEN II 0800-LUC、pGEXT4载体的构建参考Sangon Biotech的无缝克隆试剂盒(NO.B632219)，只需插入的DNA片段末端与载体末端具有15-20个同源碱基序列就可以在载体的任意位点完成克隆重组。首先采用酶切或PCR扩增的方法将载体线性化，进行目的DNA片段的PCR扩增，将目的DNA片段与线性化载体以一定的摩尔比加到PCR管中进行重组反应。将转化成功并测序正确的质粒进行后续实验。pCAMBI1302载体的构建是采用双酶切的构建方法，将相应的酶切位点加在上下游引物上，将目的基因和片段分别进行双酶切，连接转化后进行测序，比对正确的质粒进行后续转化。其它提到的片段序列及其载体构建均为人工合成构建完成。利用成熟的酵母单杂体系、Dual-LUC及EMSA验证其互作情况。其中酵母单杂交体系是利用EGY48的酵母感受态系统，用到的载体为pLacZi和pB42AD，能够在涂了X-gal的三缺板上变蓝的菌斑即能确定DNA与蛋白之间存在相互作用。Dual-LUC在烟草叶片和番茄原生质体中都进行了验证，通过荧光信号判定DNA与蛋白的结合情况。EMSA采用的是碧云天公司EMSA探针生物素标记试剂盒和Thermo Scientific公司的化学发光核酸检测模块试剂盒，通过生物素标记EMSA探针、验证DNA探针与蛋白的结合等步骤进行，主要是依据DNA-蛋白质复合体在聚丙烯酰胺凝胶电泳中的不同迁移率，来判定DNA是否与蛋白质相互作用。通过设计竞争和突变探针的结合实验，还可以区分DNA与蛋白质的相互作用是否具有特异性。载体及引物信息见表6。
表9、载体及引物信息
结果如图6和图7所示，SlPIF4能够结合在SlCOMT2的启动子上，抑制其表达，继而进一步证明了SlPIF4是结合在proSlCOMT2的第二个G-Box(CACCTG)结构域上，突变该结构域番茄果实褪黑素含量显著升高。
按照实施例3的方法构建proSlCOMT2的第二个G-Box敲除(Knockout)载体，然后转化番茄，并通过LC-MS/MS测定的Cas9-proSlCOMT2株系中褪黑素的含量，结果如图8所示。结果显示，Cas9-proSlCOMT2株系中褪黑素的含量提高，表明可以通过敲除proSlCOMT2的第二个G-Box来提高褪黑素的含量。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.敲除/干扰番茄SlPIF4基因或番茄SlPIF4基因作用位点表达在提升番茄果实褪黑素含量中的应用，其特征在于：所述SlPIF4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：敲除番茄SlPIF4基因的方法如下：使用CRISPR/Cas9基因编辑系统编辑番茄SlPIF4基因。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述CRISPR/Cas9的sgRNA靶序列如SEQ IDNO.11和SEQ ID NO.12所示。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述CRISPR/Cas9的sgRNA序列由SEQ IDNO.15和SEQ ID NO.16所示引物扩增获得。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：干扰番茄SlPIF4基因表达的方法如下：将番茄SlPIF4基因的干扰靶序列反向连接于载体中构建得到干扰载体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述番茄SlPIF4基因的干扰靶序列如SEQID NO.49所示。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述番茄SlPIF4基因作用位点为proSlCOMT2的第二个G-Box，结构域序列为CACCTG。
8.用于特异性干扰番茄SlPIF4基因的片段、重组载体或转化子在提升番茄果实褪黑素含量中的应用，其特征在于：所述SlPIF4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。
9.用于特异性敲除番茄SlPIF4基因的片段、重组载体或转化子在提升番茄果实褪黑素含量中的应用，其特征在于：所述SlPIF4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。
10.一种提高番茄果实褪黑素含量的方法，其特征在于：将在番茄中SlPIF4基因敲除/干扰表达或敲出番茄SlPIF4基因作用位点，得到的转基因番茄为果实褪黑素含量高的番茄，所述SlPIF4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示。
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|---|---|
| CN (1) | CN115851817B (zh) |
Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1472325A (zh) * | 2002-07-31 | 2004-02-04 | 四川大学 | 心房肽基因转染细胞微囊 |
| CN102686604A (zh) * | 2009-08-19 | 2012-09-19 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 |
| CN109456394A (zh) * | 2018-11-19 | 2019-03-12 | 浙江大学 | 番茄SlPIF4基因、蛋白及其在提高植物耐低温性中的应用 |
| CN113061614A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-07-02 | 四川大学 | 番茄SlWRKY35基因在提高番茄类胡萝卜素类化合物或/和叶绿素含量中的应用 |
| CN113322265A (zh) * | 2021-05-10 | 2021-08-31 | 西北农林科技大学 | 西瓜ClCOMT1基因及其在调控植物内源褪黑素含量中的应用 |
| US20230062179A1 (en) * | 2019-11-06 | 2023-03-02 | Qingdao Kingagroot Chemical Compound Co., Ltd. | Methods for generating new genes in organism and use thereof |
| CN116640195A (zh) * | 2023-05-10 | 2023-08-25 | 西南大学 | 柑橘CsPIF4基因及其编码的蛋白与应用 |
| CN117070530A (zh) * | 2023-08-30 | 2023-11-17 | 浙江大学 | Pif4基因在调控番茄丛枝菌根共生作用中的应用 |
-
2022
- 2022-11-08 CN CN202211391519.8A patent/CN115851817B/zh active Active
Patent Citations (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1472325A (zh) * | 2002-07-31 | 2004-02-04 | 四川大学 | 心房肽基因转染细胞微囊 |
| CN102686604A (zh) * | 2009-08-19 | 2012-09-19 | 巴斯夫植物科学有限公司 | 具有增强的产量相关性状的植物和用于产生该植物的方法 |
| CN109456394A (zh) * | 2018-11-19 | 2019-03-12 | 浙江大学 | 番茄SlPIF4基因、蛋白及其在提高植物耐低温性中的应用 |
| US20230062179A1 (en) * | 2019-11-06 | 2023-03-02 | Qingdao Kingagroot Chemical Compound Co., Ltd. | Methods for generating new genes in organism and use thereof |
| CN113061614A (zh) * | 2021-03-30 | 2021-07-02 | 四川大学 | 番茄SlWRKY35基因在提高番茄类胡萝卜素类化合物或/和叶绿素含量中的应用 |
| CN113322265A (zh) * | 2021-05-10 | 2021-08-31 | 西北农林科技大学 | 西瓜ClCOMT1基因及其在调控植物内源褪黑素含量中的应用 |
| CN116640195A (zh) * | 2023-05-10 | 2023-08-25 | 西南大学 | 柑橘CsPIF4基因及其编码的蛋白与应用 |
| CN117070530A (zh) * | 2023-08-30 | 2023-11-17 | 浙江大学 | Pif4基因在调控番茄丛枝菌根共生作用中的应用 |
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| DANIELE ROSADO等: "Downregulation of PHYTOCHROME-INTERACTING FACTOR 4 Influences Plant Development and Fruit Production", PLANT PHYSIOLOGY, vol. 181, no. 3, 13 September 2019 (2019-09-13), pages 1360 * |
| GAOFENG LIU等: "Melatonin biosynthesis and signal transduction in plants in response to environmental conditions", J EXP BOT, vol. 73, no. 1, 30 September 2022 (2022-09-30), pages 5818 - 5827 * |
| YANNA SHI等: "Transcription factors involved in tomato fruit quality improvement", FOOD QUALITY AND SAFETY, 19 October 2023 (2023-10-19), pages 1 - 10 * |
| ZIXIN ZHANG等: "Understanding the mechanism of red light-induced melatonin biosynthesis facilitates the engineering of melatonin-enriched tomatoes", NAT COMMUN, vol. 14, no. 1, 30 September 2023 (2023-09-30), pages 1 - 12 * |
| 杜天浩等: "褪黑素处理对盐胁迫下番茄果实品质及挥发性物质的影响", 食品科学, vol. 35, no. 15, 4 March 2016 (2016-03-04), pages 69 - 76 * |
| 舒心媛;严旭;蒲烨弘;王超;潘建伟;: "CRISPR/Cas系统的作用原理及其在作物遗传改良中的应用", 浙江大学学报(农业与生命科学版), no. 03, 25 May 2018 (2018-05-25), pages 13 - 22 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
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