CN107326039B - 一种用于转化莱茵衣藻的aanat基因植物双元表达载体及其构建方法 - Google Patents

一种用于转化莱茵衣藻的aanat基因植物双元表达载体及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种含有莱茵衣藻褪黑素合酶AANAT基因的植物双元表达载体。其将莱茵衣藻褪黑素合酶AANAT基因、博莱霉素抗性基因Ble和植物双元表达载体pRI101‑AN重组得到表达载体pRI101‑AANAT。本发明以莱茵衣藻为受体，以农杆菌介导法为方法，可以实现外源AANAT基因转入野生型具有细胞壁的莱茵衣藻的基因组，从而增加莱茵衣藻中的褪黑素含量，为研究转基因藻株中褪黑素含量变化及探索褪黑素在莱茵衣藻中的功能奠定了基础。

Description

一种用于转化莱茵衣藻的AANAT基因植物双元表达载体及其 构建方法
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种用于转化莱茵衣藻的 AANAT基因植物双元表达载体的构建。
背景技术
褪黑素(meLatonin，MT；N-乙酰基-5-甲氧基-色胺)是色氨酸的吲哚衍生物，分子式为C13H16N2O2，相对分子量为232.27，熔点116-118℃，纯品为淡黄色叶片状结晶。高亲脂性和部分亲水性的褪黑素属中性偏弱酸性，不溶于水，易溶于丙酮、乙醇、乙醚等有机溶剂，受热易破坏。褪黑素具有吲哚杂环性质，能与羟自由基（–OH）和烷过氧自由基（ROO–）等反应。
1958年，MT最早被Lerner等发现于脊椎动物脑中松果体腺(pineaL gLand)，首次从牛松果体中分离出，L963年正式被确认为激素，也称松果体腺素，普遍存在于动物、藻类、真菌和细菌中。
褪黑素作为一种动物激素，对脊椎动物生物节律和光周期反应有调控作用，同时褪黑素能与一些自由基发生反应，是一种有效的抗氧化剂；另外，褪黑素与生殖系统，免疫、内分泌系统的密切相关，可以防治老年痴呆、帕金森病、季节性抑郁症、癫病等症等。褪黑素在植物体内也有类似的功能：可以调节昼夜节律和光周期、诱导植物的成花过程；担当植物体内重要的抗氧化剂，在衰老过程中防止紫外线和臭氧的损伤，对抗光氧化并保护叶绿素，增强植物低温、高盐胁迫耐受性，抗真菌病害等等；起类似于植物激素吲哚-3-乙酸 IAA 的植物生长素作用，促进根、叶等营养生长；抑制植物细胞凋亡等。
褪黑素的合成和代谢研究目前动物体内比较清楚，以色氨酸为原料合成5-羟色胺储存于体内，再经过酶促反应生成褪黑素，即色氨酸在松果体细胞中，通过色氨酸羟化酶和5-羟色胺脱羧酶作用生成5-羟色胺，再由关键合成酶芳烷基胺N-乙酰转移酶（AryLaLkayLamine -N- AcetyLtransferase，SNAT/AANAT）作用转变为前体物N-乙酰色胺，然后进一步经羟基吲哚-O-甲基转移酶甲基化形成褪黑素。合成后的褪黑素直接以pg水平释放于血液中，约20min半衰期，在肝脏中通过三种代谢途径，由肾脏排出。
在植物中的褪黑素生物合成途径类似于动物。在藻类中，研究发现，褪黑素合成酶AANAT/SNAT在系统进化中具有保守性，褪黑素合成及代谢途径同样类似于动物体合成通路，保存了色氨酸合成能力，但SNAT/AANAT的代谢通路尚不明确。
科学界关注的藻类研究体系中，绿藻门绿藻纲团藻目绿藻科衣藻属的莱茵衣藻(ChLamydomonas reinhardtii)是一种单细胞真核绿藻，素有“绿色酵母”或者“光和酵母”之称，具有生长快、世代时间短、适应能力强和易培养(即易在平板上形成单克隆，易液体培养)，遗传背景清晰等优点，体内的细胞核、叶绿体和线粒体3套基因组均能进行相应的遗传转化，是藻类基因工程的模式植物，常被用作分子生物学遗传研究材料，高效表达来自原核和真核生物的基因。
莱茵衣藻基因工程发展较快，衣藻遗传转化主要集中在细胞核转化和叶绿 体转化方面，细胞核转化相对较简单，转化的DNA分子进入衣藻细胞核，可以随机地、非同源地整合到核基因组的不同位点。目前核转化常用方法有许多，其中源于高等植物遗传转化方法的农杆菌介导法，简单有效、成本低、转化率高，已经应用于微藻基因工程。诸如雨生红球藻、绿藻、斜生栅藻、海水藻、和硅藻等一系列农杆菌介导转化的应用实例证实，农杆菌介导法越来成为微藻基因工程的一个优选转化方法。然而，莱茵衣藻基因工程研究资料中，还未见到褪黑素研究的相关报道。基于此，我们拟以莱茵衣藻作为受体，借助基因工程技术，构建pRI101-AANAT载体，并最终筛选可遗传的莱茵衣藻。
发明内容
本发明以模式藻-莱茵衣藻作为受体，通过微藻基因工程技术，将褪黑素生物合成途径中的关键合酶基因AANAT，用农杆菌介导法导入莱茵衣藻的核基因组，经过Ble抗性筛选培养、分子生物学鉴定得到褪黑素过量表达的转基因莱茵衣藻。
本发明实现过程如下：
一种含有莱茵衣藻AANAT基因的双元表达载体，所述载体的构建方法包括以下步骤：
（1）AANAT 基因为序列表中 SEQ ID No.5 所示 DNA 分子，来自莱茵衣藻的CDNA序列，并在目的基因两端增加NdeI和EcoRI酶切位点，其引物序列为序列表中SEQ ID No.1和 SEQ ID No.2 所示的 DNA 分子；
（2）以pUCK-AANAT质粒为模板，PCR扩增含有Nde I和EcoR I位点的目的基因AANAT后，同时与PDBLe质粒进行双酶切回收，回收产物用T4 DNA连接酶连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，Amp 100mg/L抗性的LB平板筛选培养，挑取单克隆扩大培养，进行菌液PCR验证及质粒双酶切验证，将阳性重组质粒命名为pDBLe-AANAT；
（3）将重组质粒pDBLe-AANAT与质粒pRI101-AN使用BamH I和Kpn I 双酶切，回收产物连接，热激转化DH5α的感受态细胞，Kana 50mg/L抗性的LB平板筛选培养，挑取单克隆扩大培养，将阳性重组质粒命名为pRI101-AANAT。
所述双元表达载体为 pRI101-AANAT。
所述含有莱茵衣藻AANAT基因的双元表达载体的构建方法，包括以下步骤：
（1）AANAT 基因为序列表中 SEQ ID No.5 所示 DNA 分子，来自莱茵衣藻的CDNA序列，并在目的基因两端增加NdeI和EcoRI酶切位点，其引物序列为序列表中SEQ IDNo.1和 SEQ ID No.2 所示的 DNA 分子；
（2）以pUCK-AANAT质粒为模板，PCR扩增含有Nde I和EcoR I位点的目的基因AANAT后，同时与PDBLe质粒进行双酶切回收，回收产物用T4 DNA连接酶连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，Amp 100mg/L抗性的LB平板筛选培养，挑取单克隆扩大培养，进行菌液PCR验证及质粒双酶切验证，将阳性重组质粒命名为pDBLe-AANAT；
（3）将重组质粒pDBLe-AANAT与质粒pRI101-AN使用BamH I和Kpn I 双酶切，回收产物连接，热激转化DH5α的感受态细胞，Kana 50mg/L抗性的LB平板筛选培养，挑取单克隆扩大培养，将阳性重组质粒命名为pRI101-AANAT。
所述含有莱茵衣藻AANAT基因的双元表达载体的遗传转化方法，包括以下步骤：
（1）制备农杆菌LBA4404感受态，然后将重组质粒pRI101-AANAT通过电击法转化到农杆菌LBA4404中，得到含有AANAT基因的根癌农杆菌 LBA4404；
（2）将获得的阳性农杆菌 LBA4404 侵染莱茵衣藻FACHB479获得转AANAT基因莱茵衣藻；
（3）提取莱茵衣藻基因组DNA和RNA通过PCR及RT-PCR鉴定阳性转基因藻株；
（4）将鉴定成功的藻株进行继代培养，保证实验材料的充足与保存。
上述的双元表达载体在携带外源 AANAT 基因进入野生型具有细胞壁的莱茵衣藻基因组中的应用，是利用携带双元表达载体的农杆菌 LBA44044 侵染野生型具有细胞壁的莱茵衣藻 FACHB-479，在乙酰丁香酮的作用下将目的基因转入莱茵衣藻 FACHB-479 的基因组中，并用 PCR、RT-PCR验证。
本发明以具有细胞壁的野生型莱茵衣藻 FACHB479 作为受体细胞，成功构建了用于转化莱茵衣藻的 AANAT 基因农杆菌双元表达载体pRI101-AANAT。农杆菌转化衣藻可以减少以缺壁型微藻为受体的依赖，为将来研究转基因藻株中褪黑素含量变化及功能奠定了基础。
附图说明
图1是植物双元表达载体构建流程图；
图2是PUCK-AANAT质粒鉴定图，A PCR：M 15kb Marker，1-4 pUCK-AANAT，5空白对照；B Nde I、EcoR I双酶切验证：M 10kb Marker，1空白对照，2-3 pUCK-AANAT；
图3是pDBle-AANAT重组质粒PCR验证及双酶切验证图，A PCR：M 15kb Marker，1-6pDBle-AANAT，7空载体对照；B Nde I、EcoR I双酶切验证图：M 15kb Marker，1空白对照，2-3 pDBle-AANAT；
图4是pDBle-AANAT重组质粒的AANAT测序结果比对图；
图5是pRI101-AANAT重组质粒PCR验证及双酶切验证图，A PCR：M 10kb Marker，1-5 pRI101-AANAT，6空载体对照，7阳性对照，8空白对照；B BamHI、KpnI双酶切验证图：M15kb Marker，1空白对照，2-3 pRI101-AANAT；
图6是pRI101-AANAT重组质粒的AANAT测序结果比对图；
图7是pRI101-AANAT重组质粒转化LBA4404菌落图及PCR验证图，A菌落图；B PCR：M10kb Marker，1-8 pRI101-AANAT转化LBA4404；9-10阳性对照，11阴性对照；
图8是含有乙酰丁香酮的TAP平板上出现的草坪般藻落图；
图9是转化藻株在Ble抗性TAP平板上的培养图；
图10是莱茵衣藻在液体TAP中对Ble的抗压浓度筛选图；
图11是莱茵衣藻在固体TAP平板上对Ble的抗压浓度筛选图；
图12是不同藻株中AANAT基因的分子生物学分析图，A PCR，B RT-PCR：M 10kbMarker，1-8 转化藻株，9阳性对照，10空载体转衣藻对照，11野生型衣藻，12空白对照；
图13是不同藻株中AANAT-Ble 1000bp片段的分子生物学分析图，A PCR，B RT-PCR：M 5000bp Marker，1-8 转化藻株，9阳性对照，10空载体转衣藻对照，11野生型衣藻，12空白对照；
图14是转化衣藻在抗性TAP平板上的继代培养图，A是附加5.0μg/mL Ble TAP平板转化衣藻继代培养图；B是附加10.0μg/mL Ble TAP平板转化衣藻培养图。
具体实施方式
1、AANAT基因莱茵衣藻双元表达载体pRI101-AANAT的构建方法
根据AANAT基因序列（NCBI GenBank，序列号：AB474787.1 ），在上下游增加NdeI和EcoR I酶切位点，由公司合成，即PUCK-AANAT，宿主菌是DH5α（注：由于目的基因含有与EcoRI酶切位点GAATTC相同的序列，故根据密码子的简并性将目的基因的第87位碱基A换成碱基C，而且不会改变所合成的氨基酸）。用OLigo7软件设计引物，序列为序列表中序列 1 和序列 2，由公司合成。为了以后的实验做准备，进行目的基因AANAT PCR最适退火温度的选择，最终选择的退火温度是59℃ 。PCR体系为20μL，含有上下游引物（20μM）各0.5μL，PremixTaqTM10μL，模板1μL，无菌双蒸水补足体系。扩增程序为预变性95℃8min，变性95℃ 1min，退火59℃ 1min，延伸72℃ 1min，30个循环，72℃ 10min。获得目的基因后进行了PCR及Nde I和EcoR I双酶切鉴定（图2）。
用限制性核酸内切酶Nde I和EcoR I ，37℃ 3h分别酶切质粒PUCK-AANAT和pDBle，回收产物进行连接，热激转化DH5α感受态细胞，在Amp（100mg/L）抗性的LB平板上进行筛选培养。阳性单克隆菌落经酶切鉴定命名为重组质粒pDBle-AANAT。经验证，质粒pDBle-AANAT通过PCR及NdeI和EcoR I双酶切可以得到576bp的预期条带（图3）。测序验证载体的AANAT序列正确（图4，图中黑色方框所标注的位置即是目的基因更换碱基的位置）。
进行pDBle-AANAT与pRI101-AN质粒的QuickCut™ BamH I和QuickCut™ KpnI 37℃ 7min双酶切，回收产物进行连接，热激转化DH5α感受态细胞，Kana（100mg/L）抗性的LB平板筛选培养，阳性单菌落酶切鉴定命名为pRI101-AANAT。构建成功的质粒pRI101-AANAT用QuickCut™ BamH I和QuickCut™ KpnI 37℃ 7min进行双酶切得到4345bp条带（图5），通过PCR得到576bp的预期条带（图5）。测序验证载体的AANAT序列正确（图6，图中黑色方框所标注的位置即是目的基因更换碱基的位置）。
2、pRI101-AANAT电转化农杆菌LBA4404
取植物双元表达载体pRI101-AANAT 点击法转化到农杆菌LBA4404的感受态细胞，在含有链霉素（Sm100mg/L）和Kana（50mg/L）的YEB平板上进行筛选培养。挑取单克隆菌落扩大培养后经菌液PCR（图7）可以扩增出预期的576bp的目的条带。同时以空载体pRI101-AN以相同条件转化LBA4404的感受态细胞，培养得到空载体转化农杆菌。
上述电击转化方法如下：
1)Agrobacterium tumefaciens LBA4404 Electro-Cells使用前在冰上融化；
2)在冰上含有20 μL感受态细胞的1.5 mL tube中加入1 μL (1 ng)的双元载体DNA，轻微混合；
3)将0.1 cm电转杯（Bio-Rad）置于冰中预冷；
4)设置Gene PuLser II为25 μF， 200 Ω，2.5 kV；
5)将感受态细胞和步骤2制备的 DNA 转入电转杯，收集底部混合物。将电转杯放入Gene PuLser II中进行电冲击；
6)取出电转杯，添加1 mL SOC培养基，移入14 mL的圆底tube (FaLcon tubes等)；
7)30℃振荡培养1小时（100 rpm）。将50-100 μL 的细胞涂于含有50 μg/mL Kana的和100 μg/mLSm的LB平板。30℃保温48小时；
8)挑取单克隆以扩大培养后进行菌液 PCR，用 1.0％琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示在576bp处出现特异性的目标条带。
3. 莱茵衣藻的遗传转化
将FACHB479藻液200μL涂布于TAP平板，挑取单藻落接种于TAP液体培养基中活化培养至对数生长期。取处于对数生长期的藻液涂布在含有100μmoL/L乙酰丁香酮的TAP平板上，培养3~4天，出现草坪般藻落（图8）。将转入重组质粒的农杆菌LBA4404接种于 YEB 液体培养基中，28℃过夜培养，离心收集菌落，重悬于含有 100μmoL/L乙酰丁香酮的 TAP 液体培养基，取200μL涂布在FACHB479平板上。同步进行FACHB479的含空载体的农杆菌转化培养。在23±2℃，1500-2000Lx，光暗16:8条件共培养48h，收获藻细胞后，用含有500mg/L头孢噻肟TAP进行清洗，重悬于TAP，涂布在含5μg/mL博来霉素（Ble）和 500mg/L头孢噻肟的TAP平板上，以上述培养条件进行培养，约在一周后转化成功的藻落已长出（图9）。挑取藻落接种于含有2μg/mL Ble的TAP液体培养基中扩大培养，可以收集到大量的不同转化株系的藻细胞。而野生型FACHB-479和空载体PRI101-AN转化藻FACHB-479均不能生长。
上述野生型莱茵衣藻对Ble的敏感性探究具体实验步骤如下：
将200μL衣藻FACHB479细胞涂布于TAP平板上待其长出单藻落，再挑取藻落于TAP液体扩大培养至对数生长期。分别在附加不同Ble浓度梯度（0、0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、2.0、5.0、7.0、10.0、15.0、20.0μg/mL）的TAP液体，120 rpm/min培养，23±2℃，1500-2000Lx，光暗16:8的条件下进行培养。每组平行重复3次，培养观察记录（图10），培养20d后，附加有2.0μg/mLBle的TAP衣藻培养液呈现白色（绿色全部丧失），而附加有1.0μg/mLBle的衣藻培养液呈弱的黄绿色。故最终确定用于衣藻FACHB479的遗传转化的液体TAP培养基Ble筛选压为2.0μg/mL；取对数生长期的藻液500μL分别涂布于附加不同Ble浓度梯度（0、0.5、1.0、1.5、2.0、5.0、7.0、10.0μg/mL）的TAP固体平板上，于23±2℃，1500-2000Lx，光暗16:8的条件下进行培养。每组平行重复3次，培养观察记录（图11），培养20d后，观察到5.0μg/mLBle平板已经没有藻落长出，故将平板培养的最小Ble筛选浓度定为5.0μg/mL。
4. 转化莱茵衣藻藻株的阳性鉴定
取培养至对数生长中期(细胞浓度106个/mL)的转化藻株，采用改良的CTAB法提取藻细胞基因组DNA，PCR检测AANAT的整合。TrizoL法提取藻细胞RNA，用 TaKaRa 的PrimeScriptTMⅡ 1 st Strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒反转录cDNA，RT-PCR检测AANAT的表达。由于衣藻本身含有AANAT基因，故使用Oligo7 软件针对目的基因及Ble片段的连接部分序列1000bp片段设计引物，引物序列为序列表中序列 3 和序列4，由公司合成，并将此片段命名为AANAT-Ble。AANAT反应体系为20μL，含有上下游引物（20μM）各0.5μL，Premix TaqTM10μL，模板1μL，无菌双蒸水补足体系。扩增程序为预变性95℃ 8min，变性95℃1min，退火59℃ 1min，延伸72℃ 1min，30个循环，72℃ 10min。AANAT-Ble反应体系为20μL，含有上下游引物（10μM）各0.5μL，Premix TaqTM10μL，模板0.5μL，无菌双蒸水补足体系。扩增程序为预变性95℃ 8min，变性95℃ 1min，退火64℃ 1min，延伸72℃ 1min，33个循环，72℃10min。
筛选到的抗性藻株，显示部分抗性藻株可扩增出约576 bp的AANAT基因目的条带（图12）和1000bp的AANAT-Ble片段条带（图13），而野生型FACHB-479、及空载体pRI101-AN转化藻株均未扩增出目的条带（图12，13）。提取藻株的总RNA，反转录PCR（RT-PCR）检测到部分转化藻株的AANAT基因目标576 bp条带清晰可见（图12），与野生型衣藻对比是过量表达的，其中T3、T7的目的基因片段较弱，可能是外源AANAT基因没有转进去。提取藻株的总RNA，反转录PCR（RT-PCR）检测到部分转化藻株的AANAT-Ble片段1000bp条带清晰可见（图13），对照组都没有目标片段所在。最终确定T1、T2、T4、T5、T6、T8为转基因藻株。
上述CTAB法具体步骤如下：
取 0.2g 莱茵衣藻鲜重，液氮充分研磨，加 650μL 2×CTAB（2×CTAB在用前加入0.2%巯基乙醇）于65℃水浴1h（可将2×CTAB提前于65℃水浴中预热）， 期间每隔 10 min缓和翻转；水浴后冷却至室温加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)，室温放置 30 min，15℃以上离心，12 000 rpm 10min，取上清(用剪过的枪头，避免破坏基因组 DNA)；重复一次；上清加入 2 倍体积-20℃预冷的无水乙醇，沉淀 2h 以上，12 000 rpm 离心 10 min，弃上清；用70%的无水乙醇洗涤沉淀两次，12 000 rpm 离心 10 min，彻底吸干残余乙醇，置于超净工作台风干后加入 200μL的ddH2O，4℃过夜溶解，置-20℃保存备用。
上述TrizoL法具体步骤如下：
取 0.2g 莱茵衣藻鲜重，液氮充分研磨，迅速转入预冷的 1.5mL 的 EP 管中，加入1mL TRIzoL 试剂混匀；15~30℃放置 5min，使核酸蛋白复合物完全分离；4℃，10 000rpm 离心10min，取上清；每使用1mL TRIzoL加 0.2mL 氯仿，盖好管盖，剧烈震荡 15s，室温放置 3min；4℃，10 000 rpm 离心15 min，样品分为三层(底层有机相/中间相/上层无色水相)，RNA 存在于最上层水相，转移水相至新 EP 管；加入 0.5mL 异丙醇，混匀，室温放置10min，4℃，10 000 rpm 离心 10 min，弃上清；加1mL 75%乙醇（用DEPC处理过的水配制）洗涤沉淀，4℃，7 500 rpm 离心5min，弃上清；室温放置晾干，沉淀为 RNA，加 25~200μL DEPC水，55~60℃放置 10min 溶解，置-80℃保存备用。
对转化藻株经过分子生物学分析鉴定后，得到转基因藻株。通过附加有5.0μg/mLBle的TAP固体平板进行转基因藻株的继代培养，保证实验材料的充足与保存。将转基因藻落在含5.0μg/mL Ble的TAP平板上进行划线继代培养，可以得到转基因藻落（图14）。 进一步将转基因藻落在附加10.0μg/mL Ble的TAP平板上进行划线培养，也可以得到转基因藻落（图14）。
说明书核苷酸和氨基酸序列表
SEQUENCE LISTING
<110> 西北大学
<120> 一种用于转化莱茵衣藻的AANAT基因植物双元表达载体及其构建方法
<130> 2017
<160> 5
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 引物
<400> 1
catatggccg aggaatcact agacg 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 引物
<400> 2
gaattcctag gcttccgccg cct 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 引物
<400> 3
attcgagcct acaccgcctt cgt 23
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> artificial sequence
<220>
<223> 引物
<400> 4
gcaagatgtt gagtgacttc tcttg 25
<210> 5
<211> 576
<212> DNA
<213> Chlamydomonas reinhardtii
<400> 5
atggccgagg aatctctaga cgccagtgta cagccactag gctctaccgt tttctttggc 60
ccggtgcagc cagagatgct ggaccgaatt catgaacttg aagctgcctc ttacccagaa 120
gacgaggccg ctacttacga gaagctaaag ttcaggatcg aaaacgcgtc gaacgtgttc 180
ctggtcgcgc tgtcggcgga gggcgacggg gagcccaagg tcgtcgggtt tgtgtgcggc 240
acgcaaacgc gcgcgtctaa gctgacacac gagtccatgt caacgcacga tgccgacggc 300
gcactactgt gcatccactc ggtggtggtg gacgccgcgc tgcgccggcg cggcctggcc 360
acccgcatgc tccgagccta caccgccttc gtggccgcca cctccccggg cctgaccggg 420
atacggctgc tgaccaagca gaacctgatc ccgctgtacg agggcgcggg cttcactctg 480
cttggcccct cggacgtcga gcacggcgcc gacctgtggt acgaatgcgc catggagctg 540
gaggcggagg aggaggcgga ggcggcggaa gcctag 576

Claims (4)

1.一种含有莱茵衣藻AANAT基因的双元表达载体，其特征在于：所述载体的构建方法包括以下步骤：
（1）AANAT 基因为序列表中 SEQ ID No.5 所示 DNA 分子，来自莱茵衣藻的cDNA序列，并在目的基因两端增加NdeI和EcoRI酶切位点，其引物序列为序列表中SEQ ID No.1 和SEQ ID No.2 所示的 DNA 分子；
（2）以pUCK-AANAT质粒为模板，PCR扩增含有Nde I和EcoR I位点的目的基因AANAT后，同时与PDBLe质粒进行双酶切回收，回收产物用T4 DNA连接酶连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，Amp 100mg/L抗性的LB平板筛选培养，挑取单克隆扩大培养，进行菌液PCR验证及质粒双酶切验证，将阳性重组质粒命名为pDBLe-AANAT；
（3）将重组质粒pDBLe-AANAT与质粒pRI101-AN使用BamH I和Kpn I 双酶切，回收产物连接，热激转化DH5α的感受态细胞，Kana 50mg/L抗性的LB平板筛选培养，挑取单克隆扩大培养，将阳性重组质粒命名为pRI101-AANAT。
2.权利要求 1 所述含有莱茵衣藻AANAT基因的双元表达载体的构建方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）AANAT 基因为序列表中 SEQ ID No.5 所示 DNA 分子，来自莱茵衣藻的cDNA序列，并在目的基因两端增加NdeI和EcoRI酶切位点，其引物序列为序列表中SEQ IDNo.1 和 SEQID No.2 所示的 DNA 分子；
（2）以pUCK-AANAT质粒为模板，PCR扩增含有Nde I和EcoR I位点的目的基因AANAT后，同时与PDBLe质粒进行双酶切回收，回收产物用T4 DNA连接酶连接，转化感受态大肠杆菌DH5α，Amp 100mg/L抗性的LB平板筛选培养，挑取单克隆扩大培养，进行菌液PCR验证及质粒双酶切验证，将阳性重组质粒命名为pDBLe-AANAT；
（3）将重组质粒pDBLe-AANAT与质粒pRI101-AN使用BamH I和Kpn I 双酶切，回收产物连接，热激转化DH5α的感受态细胞，Kana 50mg/L抗性的LB平板筛选培养，挑取单克隆扩大培养，将阳性重组质粒命名为pRI101-AANAT。
3.权利要求 1 所述含有莱茵衣藻AANAT基因的双元表达载体的遗传转化方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）制备农杆菌LBA4404感受态，然后将重组质粒pRI101-AANAT通过电击法转化到农杆菌LBA4404中，得到含有AANAT基因的根癌农杆菌 LBA4404；
（2）将获得的阳性农杆菌 LBA4404 侵染莱茵衣藻FACHB479获得转AANAT基因莱茵衣藻；
（3）提取莱茵衣藻基因组DNA和RNA通过PCR及RT-PCR鉴定阳性转基因藻株；
（4）将鉴定成功的藻株进行继代培养，保证实验材料的充足与保存。
4.权利要求 1 所述的双元表达载体在携带外源 AANAT 基因进入野生型具有细胞壁的莱茵衣藻基因组中的应用，利用携带双元表达载体的农杆菌 LBA44044 侵染野生型具有细胞壁的莱茵衣藻 FACHB-479，在乙酰丁香酮的作用下将目的基因转入莱茵衣藻 FACHB-479 的基因组中，并用 PCR、RT-PCR验证。
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