CN116751759A - 红果酸合成酶及其相关生物材料和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了红果酸合成酶及其相关生物材料和应用，所述红果酸合成酶是如下a)或b)的蛋白质：a)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；b)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有红果酸合成酶活性的蛋白质。本发明提供了一种可作为红果酸合成酶的蛋白质及其相关生物材料，其能够催化红果酸的合成，并能够在植物中调控红果酸的合成。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体的说，涉及一种可作为红果酸合成酶的蛋白质及其相关生物材料和应用。
背景技术
DRE-TIM金属酶超家族均具有一个保守的D-R-E活性位点序列，以及一个保守的TIM桶状催化结构域。D-R-E活性位点序列被认为能够稳定催化过程中形成的烯醇中间体，而TIM桶状结构域则能够在二价金属阳离子存在时发挥其催化活性。DRE-TIM金属酶超家族成员能够催化碳-碳键的形成和断裂反应，具有包括类克莱森缩合(CC-like)酶、裂解酶、醛缩酶和羧化酶等活性。类克莱森缩合酶亚组是目前已知功能最多样化的亚组。
CC-like亚组成员酶能够催化α-酮酸与乙酰辅酶A(ac-CoA)的缩合反应，参与原生或次生代谢物的生物合成途径中，如：L-亮氨酸、L-异亮氨酸和L-赖氨酸合成。除了重要物质代谢外，这类酶家族成员还被用于工程细菌中长链碳物质的合成。目前，在CC-like亚组约4300个成员中，共鉴定出了六种具有独特的α-酮酸缩合功能的酶。根据底物特异性，这些成员酶被注释为α-异丙基丙二酸合成酶(IPMS)、柠檬酸合成酶(CMS)、高柠檬酸合成酶(HCS)、甲硫基烷基丙二酸合成酶(MAM)、R-柠檬酸合成酶(R-CS)和2-膦甲基苹果酸合成酶(PMMS)，如图1所示。目前，尚未有研究表明DRE-TIM超家族蛋白具有催化红果酸合成能力的报道。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种可作为红果酸合成酶的蛋白质及其相关生物材料和应用。
本发明提供一种蛋白质，将其命名为L1蛋白，所述L1蛋白是如下a)或b)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；
b)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有红果酸合成酶活性的蛋白质。
本发明提供与所述L1蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：
B1)编码所述L1蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。
所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)所示的核酸分子：
1)编码序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA分子或cDNA分子；
2)核酸序列是序列表中SEQ ID No.1的的DNA分子；
3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
所述L1蛋白质在作为红果酸合成酶中的应用也应在本发明的保护范围之内。
所述的生物材料在制备红果酸合成酶中的应用也应在本发明的保护范围之内。
扩增编码所述蛋白质的核酸分子片段的引物对也应在本发明的保护范围之内。
所述的蛋白质或所述的生物材料在调控豆科植物豆荚中红果酸的生物合成中的应用也应在本发明的保护范围之内。
所述的蛋白质或所述的生物材料在制备调控豆科植物豆荚中红果酸的生物合成产品中的应用也应在本发明的保护范围之内。
本发明还提供一种调控豆科植物豆荚中红果酸的生物合成产品，所述产品包括所述L1蛋白质或所述的生物材料。
进一步的，所述所述豆科植物为大豆。
本发明的效果在于：本发明提供了一种可作为红果酸合成酶的蛋白质及其相关生物材料，其能够催化红果酸的合成，并能够在植物中调控红果酸的合成。
附图说明
图1为DRE-TIM金属酶超家族中六种不同催化活性的酶。
图2为L1是红果酸合成酶，其中，(A)L1蛋白原核表达载体的构建；(B)l1R31C原核表达载体的构建；(C)L1蛋白及l1R31C蛋白SDS-PAGE电泳胶图；(D)L1蛋白能够催化对羟基苯丙酮酸和乙酰辅酶A合成红果酸。。
图3为L1酶促反应动力学符合米氏方程，其中，(A)红果酸标准曲线的构建；(B)不同底物浓度下，L1催化红果酸的形成；(C)L1的酶促反应动力学方程。
图4为L1基因参与大豆荚中红果酸(EucomicAcid)的生物合成，其中，(A)L1敲除及L1基因过表达转基因材料；(B)利用LC-MS对L1敲除及L1基因过表达转基因材料果荚代谢物分析；(C)C1物质的二级谱图；(D)红果酸标准品的二级谱图；(E)不同转基因材料中C1峰与红果酸代谢物在色谱柱中的保留时间对比。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的原核表达载体pCold-TF购自宝生物工程(大连)有限公司；大豆品种中品03-5373(ZP03-5373)在文献“优良品系中品03-5373系谱的遗传解析及抗大豆胞囊线虫病相关标记鉴定”中公开，大豆品种中黄13(ZH13)在“广适高产高蛋白大豆品种中黄13的选育与应用”中公开，公众可以从中科院作物获得用以重复本发明的实验。将中品03-5373(ZP03-5373)和中黄13(ZH13)进行杂交，连续自交十代后获得245个重组自交系。其中R171株系进一步分离出R171-BLk和R171-LBn两个株系，其中大豆株系R171-BLk的豆荚为黑色，大豆株系R171-LBn的豆荚为黄色。
下述实施例中的大豆天龙一号(TL1)(Li,C.et al.A domestication-associatedgene GmPRR3b regulates the circadian clock and flowering time in soybean.MolPlant13,745–759(2020))，公众可从申请人处获得该生物材料，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。下述实施例中的JRH0641-OE载体，其序列如SEQ ID No.7所示。
实施例1L1蛋白的制备
1、L1及l1R31C原核表达载体构建
分别取大豆株系R171-BLk)以及R171-LBn的种子，分别种植在含有营养土和蛭石的按1:1混合的土壤中，在短日照下生长15天。取大豆叶片2片。分别按照下述方法提取大豆株系R171-BLk以及大豆株系R171-LBn的RNA，并进一步反转录合成cDNA，使用设计好的L1过表达扩增引物(用于L1及l1基因过表达载体构建的引物为：L1-F:5’-TAGGCATATGGAGCTCATGGCAGCCAAAACATCTAC-3’；L1-R:5’-ACAAGCTTGAATTCGGATCCTTCCTTTAAATCGAGCATT-3’。)，以反转录产物为模板，进行PCR扩增，得到L1基因片段(如序列表中的序列1所示)和l1基因片段(如序列表中的序列2所示)，其中l1基因片段编辑的蛋白质(如序列表中的序列4所示)为L1基因片段编辑的蛋白质(如序列表中的序列3所示)的第31位氨基酸由R突变为C，也称为l1R31C基因。将L1基因片段(核苷酸序列如序列1所示)替换原核表达载体pCold-TF的SacI和BamHI位点之间的短序列并保持其他序列不变，得到重组质粒重组载体pCold-L1，将l1R31C基因片段(核苷酸序列如序列1所示)替换原核表达载体pCold-TF的SacI和BamHI位点之间的短序列并保持其他序列不变，得到重组质粒重组载体pCold-l1R31C。
上述提取RNA方法为：1)在研钵中加入液氮，迅速将样品充分磨碎，用RNase-Free离心管盛约30mg样品(100μl刻度处)；2)加入350μl RA1Buffer和3.5μlβ-ME，充分涡旋振荡，使其完全混匀；3)室温下8000g离心1min，将上清转移到粉色的过滤柱中，室温11000g离心1min，液体转移至新的1.5ml离心管，弃去过滤柱；4)加入350μl 70％乙醇，涡旋振荡25s，充分混匀；5)将液体转移至蓝色的吸附柱中，8000g离心30s，RNA被吸附到柱子上；6)除盐，加入350μl MDB Buffer，11000g离心1min，弃去废液；7)除DNA，向吸附柱加入95μl DNaseReaction Mixture，室温静置15min；8)清洗，加入200μl RA2 Buffer，11000g离心2min，更换新的收集管。加入600μl RA3 Buffer，11000g离心1min，弃去废液，加入250μl Buffer，11000g离心2min，弃废液；9)更换新RNase-Free H2O，11000g离心1min，重复一次，以增加洗脱率。此步骤在冰上操作。得到的RNA放于-80℃冰箱保存。
上述反转录合成cDNA方法为：
cDNA第一链的反转录合成
1)在冰上向nuclease-free PCR管中依次加入下列试剂：
Total RNA 6μl(0.1ng-5μg)
Oligo(dT)18primer 1μl
nuclease-free 5μl
置于PCR仪中65℃反应5min。
2)然后再加入以下试剂：
轻轻混匀，在PCR仪中45℃反应60min。
3)PCR仪中，70℃5min，终止反应。
上述L1及l1 CDS序列扩增步骤中的反应体系和反应程序分别为：
1)反应体系：
2)反应程序
预热98℃3min；变性98℃15s，退火56℃15s，延伸72℃30s(30-60s/kb)，35个循环；终延伸72℃5min；4℃保存。
2.pCold-L1和pCold-l1R31C载体大肠杆菌转化
将pCold-L1和pCold-l1R31C载体转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞(康为世纪)中，使用引物pCold-F1：5’-ACGCCATATCGCCGAAAGG-3’和pCold-R1：5’-GGCAGGGATCTTAGATTCTG-3’进行菌落PCR鉴定。挑选阳性克隆的菌落(转化成功)，提取质粒得到纯化重组载体质粒pCold-L1和pCold-l1R31C，所述重组载体质粒pCold-L1的结构如图2A所示、所述重组载体质粒pCold-l1R31C的结构如图2B所示。
上述将pCold-L1和pCold-l1R31C载体转化到大肠杆菌TOP10感受态细胞的步骤为：1)从-80℃取出TOP10感受态细胞(康为世纪)置于冰盒中，待感受态细胞稍微融化后，取50μL到1.5mL EP管中，用移液枪分别将2.5μL In-fusion反应后的重组载体pCold-L1、pCold-l1R31C加入其中，轻弹管壁使二者充分混匀，将其在冰中静置约30min；
2)将离心管置于42℃水浴锅中热激90s，然后迅速冰浴2min；
3)在每个离心管加入600μL不含抗生素的LB培养基，混匀后置于37℃摇床，200rpm振荡培养1h；
4)12000rpm瞬时离心，在超净工作台中，取出离心管，去除大部分上清LB培养基，留下约50μL，移液器吹打混匀；
5)将菌液均匀涂在加入卡那霉素抗生素的LB平板培养基上，待平板干了之后，倒置于37℃恒温箱中培养过夜。
上述鉴定pCold-L1和pCold-l1R31C阳性克隆的步骤为：用牙签挑取2.1.6中37℃恒温过夜平板上的单克隆，在含有抗生素的LB平板划线，然后将牙签在含有PCR反应混合物的管中轻轻搅动几下，使用引物pCold-F1：5’-ACGCCATATCGCCGAAAGG-3’和pCold-R1：5’-GGCAGGGATCTTAGATTCTG-3’进行菌落PCR鉴定。可以挑取多个单克隆，并在平板上做好标记，以增加获得阳性克隆的概率。之后将平板置于37℃过夜培养。
1)反应体系：(2×Taq MasterMix购自康为公司)
2)反应程序：
预热95℃2min；变性95℃30s，退火57℃30s，延伸72℃30s(2kb/min)，35个循环；终延伸72℃5min；12℃保存。
PCR产物经电泳检测含有目的片段的克隆，把对应平板上的划线，送菌液测序，测序结果含有序列表中的序列1所示的核苷酸，则对应的单克隆转化菌为L1阳性单克隆菌。测序结果含有序列表中的序列2所示的核苷酸，则对应的单克隆转化菌为L1R31C阳性单克隆菌。
质粒提取的步骤为，对于测序正确的阳性单克隆，扩摇菌液，用试剂盒提取质粒，步骤如下：
1)取2mL培养过夜的菌液，12000g离心1min，弃尽上清。
2)加250μL Buffer S1(含有RNase)用移液器吹打悬浮细菌沉淀，一定要保证均匀。
3)加入250μL Buffer S2，温和地上下翻转数次混合均匀，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液。此步骤不宜超过5min，以防质粒DNA被裂解。
4)加入350μL Buffer S3，温和并充分地混合数次，12000g离心10min。
5)吸取上清转移到制备管(置于2mL离心管中)，12000g离心1min，弃滤液。
6)将制备管放回2mL离心管中，加500μLBufferW1，12000g离心1min，弃滤液。
7)将制备管放回离心管，加700μL BufferW2，12000g离心1min，弃滤液；重复一次。
8)将制备管放回2mL离心管中，12000g离心1min。
9)将制备管移入干净的1.5mL离心管中，在吸附管膜中央加40μL ddH2O，室温静置1min。12000g离心1min，洗脱质粒DNA，可得到纯化重组载体质粒pCold-L1或pCold-l1R31C。
3L1及l1R31C原核表达及蛋白纯化
分别将重组载体质粒pCold-L1和pCold-l1R31C转化原核表达大肠杆菌菌株BL21中，利用蛋白质原核表达系统获得L1蛋白(氨基酸序列如序列表中序列3所示)及l1R31C蛋白(氨基酸序列如序列表中序列4所示)。
具体步骤如下：
1)将构建完成的pCold载体转化原核表达大肠杆菌菌株BL21(DE3)，挑取阳性单克隆接种于含有Amp抗性的LB培养基中进行活化，使OD600至0.6-1.0之间；
2)将活化的菌液接种于50ml新鲜的LB培养基中，37℃摇床培养到OD600至0.6左右。加入100mM IPTG母液至终浓度为1mM，37℃继续培养2-3h；
3)将三角瓶放置于冰上5min，后4000rpm 4℃离心15min去除上清后，收集菌体；
4)用XB buffer重悬菌体(50ml菌液使用5ml XB buffer进行重悬)，置于冰中30min使菌液充分的裂解；
5)将重悬液置于冰中进行超声破碎。设置为28％10s on/50s off，6-8次至菌液透明。
6)将裂解液15000rpm，4℃离心60min，保留上清；
7)取0.5ml的Ni-Agarose，700rpm离心1min后，弃上清，后利用XB buffer平衡beads 3次；
8)向上清液中加入清洗后的Ni-Agarose 4℃颠倒孵育过夜；
9)将以上混合液700rpm 4℃离心5min，小心地吸去上清液。后向沉淀的beads中加入1ml的WB buffer重悬。将重悬液700rpm 4℃离心1min，吸去上清液，再次使用WB buffer重悬；
10)重复以上操作5次，以充分去除蛋白与beads的非特异结合；
11)使用0.5ml的EB buffer重悬beads，置于4℃旋转摇床洗脱5min；
12)700rpm 4℃离心，吸取上清至新的预冷的1.5ml离心管中；
13)再次使用EB buffer洗脱beads 2次，以获取足够多的表达蛋白。
XB buffer：
WB buffer：
500mM NaCl
50mM Tris,pH 7.5
20mM 咪唑
EB buffer：
500mM 咪唑
500mM NaCl
50mM Tris,pH 7.5
4L1具有红果酸合成酶活性的验证
分别将纯化的L1蛋白及l1R31C蛋白按照下述方法进行酶活性验证，具体反应如下：
(1)150μL的反应体系含1nmol纯化蛋白(L1蛋白或l1R31C蛋白)，500μM乙酰辅酶A，1mM 4-羟基苯丙酮酸(4HPP)，4mM氯化镁和100mM Tris-HCl，pH 8.0。在37℃下孵育10分钟，后加入50μL乙醇终止反应。以不加纯化蛋白的反应作为对照。
(2)离心15,000×g 20分钟后，将5μL上清液进行LC-QQQ-MS(Agilent1290-6460)分析，配备ACQUITYUPLC HSS T3柱(1.8μm，2.1mm ID×100mm，Waters)，流速为0.4mL/min。移动相A为水/甲酸(1000/1，V/V)，移动相B为乙腈/甲酸(1000/1，V/V)。使用以下方案进行UPLC分离：(1)0-1min，5％B；(2)5min，25％B；(3)7-9min，100％B；(4)9.1-12min，5％B。所有变化都是线性的，并且流速设置为0.4mL/min。
结果如图2D所示，结果表明，L1蛋白具有红果酸合成酶活性，能够催化对羟基苯丙酮酸和乙酰辅酶A发生聚合反应，生成红果酸。而蛋白突变后(l1R31C)则活性丧失。
实施例2L1酶动力学参数测定
1.建立不同浓度红果酸的标准曲线，结果如图3A所示，图3A为浓度由5.0ppb-10.0ppm的红果酸的标准曲线。
2.按照实施例1中步骤4中所述的L1具有红果酸合成酶活性的验证方法，将1mM4-羟基苯丙酮酸(4HPP)替换为0.1μM、1.0μM、4.0μM、6.0μM、10μM、40μM、60μM、100μM、200μM、600μM、1mM的4HPP，分别测定利用不同底物浓度的对羟基苯丙酮酸，测定了L1酶的活性，结果如图3B所示，并进一步得到L1的酶促反应动力学方程(如图3C所示)，发现其酶动力学符合经典的米氏方程(图3C)。酶催化反应速率最大值(Vmax)为0.55μmol/min。Km为53.19μmol/L。
实施例3L1蛋白参与大豆中红果酸(Eucomic Acid)的生物合成
(一)重组载体的构建
1.CRISPR/Cas9基因编辑载体L1-gRNA的构建
靶序列的设计：
根据L1基因序列设计1个gRNA位点，相应靶位点的核苷酸序列如下：5’-TGGAAACCATGGAGGCTCCG-3’，对应于L1基因的序列表中SEQ ID No.1的第129-151位核苷酸。
U6-gRNA的获得：
引物序列用于扩增包含gRNA(guide RNA)序列的引物如下：
L1-F：5’-TGTGCCACCACATGGATTGTGGAAACCATGGAGGCTCCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3’；
gRNA-XbaI-R：5’-GCTCGGCAACGCGTTCTAGAAAAAAAAGCACCGACTCGGT-3’；
用于扩增U6启动子片段的引物序列为：
U6-Xbal-F：5’-GGAAGCTTAGGCCTAAAATAAATGGTAAAATGTC-3’；
U6-R：5’-AATCCATGTGGTGGCACAT-3’。
以JRH0645载体(包含GmU6启动子序列及gRNA序列)为模板，利用U6-XbaI-F与U6-R组成的引物对进行PCR扩增，所得扩增产物即为U6启动子片段；以JRH0645载体为模板，利用L1-F和gRNA-XbaI-R组成的引物对进行PCR扩增，所得扩增产物即为gRNA的编码DNA片段。
以扩增产物U6启动子片段和gRNA的编码DNA片段的混合物为模板，分别利用U6-XbaI-F与gRNA-XbaI-R组成的引物对进行扩增，所得扩增产物将U6启动子与gRNA的编码DNA片段连在一起，将扩增产物记为U6-gRNA1(其序列为序列表中SEQ ID No.5)。
CRISPR-Cas9重组载体L1-gRNA的连接：
酶切：分别利用StuI和XbaI酶切JRH0645载体，将酶切产物回收即得到线性化的pJRH0645载体。
In-fusion连接：利用HD Cloning Plus(Clontech,638909)连接步骤2得到的U6-gRNA1与线性化的pJRH0645载体，所得的序列正确的重组载体即为CRISPR-Cas9重组载体L1-gRNA。该重组载体含有目的片段U6-gRNA1(SEQ ID No.5所示的DNA分子)，能表达靶向SEQ ID No.1的第129-151位的gRNA，还能表达Cas9。
2.L1-0641过表达载体的构建
取大豆黑荚材料R171-BLk的叶片，提取总RNA并反转录得到cDNA，以所得cDNA为模板利用L1OE-F与L1OE-R进行PCR扩增，得到PCR产物，所用引物如下(下划线为L1基因上的序列)：
L1OE-F：5’-GGAGAGCCACCATGCTCGAGATGGCAGCCAAAACATCTAC-3’；
L1OE-R：5’-CCACTAGTCCCGGGCTCGAGTCATTCCTTTAAATCGAGCATT-3’。
将JRH0641-OE载体利用XholI酶切后，回收载体骨架，将所得载体骨架与所得PCR产物利用HD Cloning Plus(Clontech,638909)进行连接，所得序列正确的重组载体即为0641-L1过表达载体。0641-L1过表达载体含有序列表中SEQ ID No.1所示的DNA片段，能表达SEQ ID No.3所示的L1蛋白质。
(二)转基因大豆植株的获得
将CRISPR-Cas9重组载体L1-gRNA分别导入转化农杆菌K599(ZOMANBIO，货号ZC1506)与EHA105中，分别得到重组农杆菌K599/L1-gRNA和EHA105/L1-gRNA；将0641-L1过表达载体导入农杆菌EHA105中，得到重组农杆菌EHA105/0641-L1。
1.大豆发根检测CRISPR载体编辑效率
利用重组农杆菌K599/L1-gRNA转化大豆，步骤如下：
(1)种子消毒：挑选出健康，饱满，无病斑的大豆天龙一号(TL1)种子。用4mL浓盐酸和100mL消毒水(花王Bleach)反应出的氯气对豆子进行灭菌，16-18小时左右，拿出，在超净工作台中吹干净氯气。
(2)种子催芽：将豆子均匀摆放在催芽培养基上，每皿摆6-8颗左右。(如果其中某一颗豆子染菌，则一板豆子都不要)温室中光照培养三天左右。
(3)切豆子，调菌液OD值：切子叶，取萌发4-7天(5-6天最好)的大豆种子，自下胚轴0.3-0.5cm处切下，将子叶一分为二切开，去除顶芽。取出摇好的重组农杆菌菌液(K599/L1-gRNA，OD600nm值＝0.6-0.8，一般切豆子前两天小摇，前一天晚上大摇，当天上午可以用)离心(4000rpm，10min)，收集菌体，将所得菌体利用液体共培培养基(含有MS盐，AS，蔗糖，MES)重悬，使菌液OD600nm值＝0.6-0.8，将豆子加入调好的菌液中，隔几分钟用手摇一次，共浸染15min，取出吹10min左右。
(4)共培养：在固体共培培养基(向液体共培养培养基中加入琼脂得到)中铺上已灭菌滤纸，然后将菌液浸染过的种子均匀的摆放在培养基中，黑暗条件下培养三天，温度26℃左右。
(5)诱导培养：暗培养3天后，胚芽长长，用无菌水和加入激素的液体诱导培养基各洗4-5次，确保将农杆菌洗净。胚芽朝上斜插入固体诱导培养基(向诱导培养基中加入琼脂得到)中，放入温室中光照培养。在温室培养15天左右，有的豆瓣开始生根。
(6)取根检测：取豆瓣伤口处长出的根，2-3根/管，一般取3个重复，CTAB法提取DNA，进行PCR检测和测序，确定gRNA靶位点的编辑效果。检测靶位点的引物为L1-CF:5’-AAACAACAATCTCTTCCCT-3’和L1-CR:5’-TACAAAGAAAGCGATAGAAC-3’，测序结果显示gRNA靶位点处的碱基为双峰，表明CRISPR-Cas9重组载体L1-gRNA能够在靶位点位置对大豆基因组发生有效编辑。
2.利用重组农杆菌EHA105/L1-gRNA与EHA105/0641-L1转化大豆
利用EHA105/L1-gRNA转化大豆黑荚材料R171-BLk，利用EHA105/0641-L1转化大豆材料天龙一号(TL1)，步骤如下：
(1)用浓盐酸和次氯酸钠反应出的氯气灭菌的大豆材料的种子。
(2)将豆子对半切开，去掉一部分胚尖，在豆子的分生区部分划伤口，泡在无菌水中。下午取出摇好的重组农杆菌菌液，离心(4000rpm，10min)，收集菌体重悬在侵染培养基(infection medium)中，调菌，使菌液OD600nm值＝0.4-0.6，将豆子中的无菌水倒掉，加入重组农杆菌菌液，放在摇床中摇30min(28℃，200rpm左右)，取出吹10min左右，平铺在共培培养基(cocultivation medium)中暗培养3天。
(3)3天后，胚芽伸长，用无菌水和加入激素的液体诱导培养基(liquid shootinduction(SI)medium)进行脱菌处理，一般清洗4-5次，确保将农杆菌洗净。
(4)将长出的胚芽切掉，只保留3-4mm长度，胚芽朝下，有伤口的一面朝上斜插入固体诱导培养基中，放入温室中光照培养。
(5)在温室培养10天后，有的豆瓣开始出芽，有芽的从桩部将芽切掉并转到新的固体诱导培养基中，没长芽的扔掉。
(6)温室中培养10天后，将长芽的继代到新的固体诱导培养基中，没有长芽的豆瓣扔掉，温室培养10天。豆瓣在固体诱导培养基中继代培养四周。
(7)将长好的愈伤组织与豆瓣分离，扔掉豆瓣，把愈伤组织上黑色表面刮掉，转到固体伸长培养基(shoot elongation(SE)medium)中，每20天更换一次新的固体伸长培养基，一般继代3-4次，合计60-80天。
(8)愈伤在伸长培养的同时也在筛选，在筛选的过程中会有苗长出来。
(9)当苗长到超过100mL刻度的时候从愈伤上切下来，移到生根培养基(rootingmedium)中。
(10)苗子在培养基中培养20-30天左右，长得壮实有发达根系的苗子就可以开始放在背光处炼苗了，一般炼苗五天。
(11)每种一棵转基因苗标上豆子品种，基因名称，生根日期和土培日期。加入适量水，绿肥和缓释肥，盖上一层薄膜放在光照下，使其适应强光，3天后去膜。得到T0代转基因株系单株。
其中，所用侵染培养基、共培养培养基、加入激素的液体诱导培养基、固体诱导培养基、伸长培养基和生根培养基均记载于如下文献中：Paz,M.M.,J.C.Martinez,A.B.Kalvig,T.M.Fonger and K.Wang(2006)."Improved cotyledonary node methodusing an alternative explant derived from mature seed for efficientAgrobacterium-mediated soybean transformation."Plant Cell Rep 25(3):206-213。
3.转基因植株的鉴定
3.1l1纯合突变体的鉴定
为了确定转基因阳性植株，取利用EHA105/L1-gRNA转化大豆黑荚材料R171-BLk得到的T0代转基因材料的叶片，提取DNA，进行PCR扩增，检测其是否含有Basta抗性基因片段、Cas9蛋白编码基因片段和U6启动子。并对其gRNA靶序列的上下游进行PCR扩增和测序，扩增引物为L1-CF和L1-CR组成的引物对。各引物如下：
检测Basta抗性基因片段引物：JRH0912-Basta-CF：5’-TCCGCAGCCATTAACGACTT-3’；JRH0912-Basta-CR：5’-ACAGATAAAGCCACGCACATT-3’。
检测Cas9蛋白编码基因片段引物：JRH0912-CAS9-CF：5’-CAGCTCGTCCAAACCTAC-3’；JRH0912-CAS9-CR：5’-CTGTGCCATCCATCTTCT-3’。
检测U6启动子引物：JRH0912-GmU6-CF：5’-GCGGTGTCATCTATGTTACTA-3’；JRH0912-GmU6-CR：5’-TTCAAGTTGATAACGGACTA-3’。
PCR检测结果和测序结果显示，得到T0代转基因大豆植株中发生基因编辑的植株4株。将T0代基因编辑发生的植株分别自交两代，得到T2代基因编辑的植株(即由导入L1-gRNA得到的T0代转基因大豆植株自交2代得到的T2代基因编辑的植株)。之后按照上述PCR方法检测T2代基因编辑的植株的突变类型。共获得2个独立的纯合突变体株系：CR-1和CR2。
与野生型相比，CR-1突变体中L1基因存在1bp核苷酸的插入，插入位置为SEQ IDNo.1的第135-136位间，插入核苷酸为A(反向互补序列上位T)。野生型L1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，CR-1突变体中突变后的L1蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.6所示。
3.2L1过表达株系的鉴定
为了确定过表达转基因阳性植株，取利用EHA105/0641-L1转化大豆材料天龙一号(TL1)得到的T0代转基因材料的叶片，提取DNA，利用JRH0912-Basta-CF/JRH0912-Basta-CR为引物，进行PCR检测。检测其含有Basta抗性基因片段。将获得的含有Basta抗性基因片段的T0代转基因植株自交2代，得到T2代L1基因过表达转基因株系OE-1与OE-2。
以2040-QF/2040-QR为引物检测T2代L1基因过表达转基因株系中L1基因的表达，以GmActin-qF(L838)/GmActin-qR(L838)为引物检测大豆内参Actin的表达。利用大豆材料天龙一号(TL1)作为对照。引物如下：
2040-QF：5’-GATGAAGAAGTTGAGAGT-3’；
2040-QR：5’-ATAGTTGCTGTTGAAGAA-3’；
GmActin-qF(L838)：5’-CGGTGGTTCTATCTTGGCATC-3’；
GmActin-qR(L838)：5’-GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA-3’。
后使用ΔCT方法计算基因相对表达量。
结果表明，L1基因过表达转基因株系(OE-1与OE-2)中L1基因的表达量均显著高于野生型TL1。
(三)验证实验
收集大豆材料R171-BLK和R171-LBn，L1基因编辑材料(l1-cr1)，TL1和L1-OE1等大豆材料未成熟豆荚，将其冷冻干燥、研磨，然后在4℃旋转器中用溶剂(水：甲醇：乙腈＝1：2：2)提取过夜(图4A)。离心15,000×g 20分钟后，上清液通过3kDa蛋白滤膜超滤，并进行UPLC-QTOF-MS分析(Thermo Vanquish F-AB SCIEX 6600)，该设备配备有ACQUITYUPLC HSST3柱(1.8μm，2.1毫米ID×100毫米，Waters)，流速为0.4ml/min。移动相A为水/甲酸(1000/1，v/v)，移动相B为乙腈/甲酸(1000/1，v/v)。使用以下方案进行UPLC分离：每个样品25分钟，分为以下步骤：(1)0-1min，5％B；(2)5min，25％B；(3)15-18min，100％B；(4)18.1-25min，5％B。所有更改都是线性的，并且流速设置为0.4ml/min。使用SCIEX OS 2.0.1软件对LC-MS数据进行有针对性的代谢组分析(图4B)。
LC-MS结果表明，在黑荚野生型R171-BLk和过表达L1-OE1过表达材料中，存在C1峰。而在浅褐荚R171-LBn、l1-cr1以及TL1中，则不存在C1峰。
进一步对C1二级谱图进行分析，结果表明，C1可能是红果酸(图4C)。为了进一步验证，对红果酸标准品进行了质谱分析。结果显示，无论是二级谱图还是色谱柱保留时间，C1物质与红果酸标准品完全相同(图4D、E)。即在L1基因存在时，在大豆果荚内能够检测到红果酸的存在，而当L1基因突变或者利用基因编辑敲除后，大豆果荚内检测不到红果酸的存在。因此，可以得出结论，L1基因参与大豆果荚内红果酸的生物合成。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.蛋白质，是如下a)或b)的蛋白质：
a)氨基酸序列是SEQ ID No.3的蛋白质；
b)将SEQ ID No.3所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有红果酸合成酶活性的蛋白质。
2.与权利要求1所述蛋白质相关的生物材料，为下述B1)至B8)中的任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；
B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；
B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；
B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；
B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物。
3.根据权利要求2所述的生物材料，其特征在于：所述核酸分子为如下1)或2)或3)或4)或5)所示的核酸分子：
1)编码序列是序列表中SEQ ID No.1的DNA分子或cDNA分子；
2)核酸序列是序列表中SEQ ID No.1的的DNA分子；
3)与1)或2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子；
4)在严格条件下与1)或2)限定的核苷酸序列杂交，且编码权利要求1所述蛋白质的cDNA分子或基因组DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质在作为红果酸合成酶中的应用。
5.权利要求2所述的生物材料在制备红果酸合成酶中的应用。
6.扩增编码权利要求1所述蛋白质的核酸分子片段的引物对。
7.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的生物材料在调控豆科植物豆荚中红果酸的生物合成中的应用。
8.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的生物材料在制备调控豆科植物豆荚中红果酸的生物合成产品中的应用。
9.一种调控豆科植物豆荚中红果酸的生物合成产品，所述产品包括权利要求1所述的蛋白质或权利要求2所述的生物材料。
10.根据权利要求7或8所述的应用或者权利要求9所述的产品，其特征在于，所述所述豆科植物为大豆。
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