CN117384919A - 一种NtERF283基因及其编码的蛋白与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种NtERF283基因及其编码的蛋白与应用，所述NtERF283基因碱基序列如SEQ ID NO：1所示。本发明从烟草中克隆出NtERF283基因，并成功构建了重组表达载体，然后采用农杆菌浸染叶盘法将载体整合到烟草基因组中发现，NtERF283转基因株系在模拟干旱条件下的生长势显著地高于野生型对照，说明在干旱条件下，NtERF283转基因烟草生长受干旱影响较小。此外，NtERF283转基因株系遭受干旱胁迫后的存活率明显高于野生型对照。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及一种NtERF283基因及其编码的蛋白与应用。
背景技术
植物在整个生长发育过程中会遭受许多非生物逆境胁迫，如干旱、高盐、低温等。干旱胁迫是各种逆境胁迫中最普遍的因子之一，严重地影响了植物的生长发育和作物种植分布，造成农作物严重减产甚至绝收。因此，提高作物抗旱能力对农业生产具有重要的意义。
烟草属于双子叶植物，管花目，茄科，烟草属，是一种重要的叶用经济作物。烟草在生长过程中对水分要求较高，若遭受干旱胁迫会严重地影响烟叶产量和品质。我国是一个水资源相对缺乏国家，水资源时空分布不均，近年来部分烟区频繁遭受严重干旱，旱灾发生的频率和影响范围不断扩大，持续时间和遭受的损失增加，对我国烟叶生产造成了极大的威胁。通过兴修水利设施解决烟草在生长季节时遭受的干旱问题，虽有不错的效果，但是成本太高，在短期内难于实现全部烟田有配套灌溉，而且在一些烟区无法实施。因此，培育耐旱烟草新品种对烟草的优质高产具有重要的意义。传统杂交育种由于受到抗性亲本资源缺乏的限制，获得优良品种的进程缓慢。随着烟草基因组计划的全面实施，烟草完成了全基因组测序，因此，从烟草中分离、鉴定耐旱相关基因并将其应用到耐旱烟草分子育种中，对于保证烟草的品质和产量具有重要的现实意义。
为了解决以上问题，提出本发明。
发明内容
本发明第一方面提供一种NtERF283基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1所示序列具体为：
本发明第二方面提供一种本发明第一方面所述的NtERF283基因编码的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
SEQ ID NO：2所示序列具体为：
本发明第三方面提供一种与本发明第一方面所述的NtERF283基因相关的生物材料，其特征在于，包括如下任一种：
a)含有所述的NtERF283基因的重组表达载体；
b)含有所述的NtERF283基因的生物工程菌，或含有a)所述的重组表达载体的生物工程菌；
c)含有所述的NtERF283基因的转基因植物细胞系，或含有a)所述的重组表达载体的转基因植物。
可用现有的植物表达载体构建含有NtERF283基因的重组表达载体。
优选地，使用NtERF283基因构建重组表达载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)、Actin启动子等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。
优选地，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除草剂基因)等。
优选地，使用所述NtERF283基因构建重组表达载体时，构建方法如下：是将所述NtERF283基因插入pDT1载体的SpeI酶切位点，得到的所述重组表达载体。
本发明第四方面提供一种本发明第一方面所述的NtERF283基因在增强植物耐旱性中的应用。
优选地，通过如下方法中的一项或多项增强植物耐旱性，得到耐旱转基因植物：
F1)导入所述的NtERF283基因；
F2)导入所述的蛋白；
F3)导入a)和b)中所述的生物材料。
所述耐旱转基因植物的耐旱性高于野生型对照。所述耐旱转基因植物为耐甘露醇和/或耐干旱转基因植物。
优选地，方法F3中，通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、如基因枪法、花粉管通道、显微注射、电导、农杆菌介导等生物学方法将所述的生物材料转化到植物细胞或组织中。
优选地，所述植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物为烟草或拟南芥。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明从烟草中克隆出NtERF283基因，并成功构建了重组表达载体，然后采用农杆菌浸染叶盘法将载体整合到烟草基因组中发现，NtERF283转基因株系在模拟干旱条件下的生长势显著地高于野生型对照，说明在干旱条件下，NtERF283转基因烟草生长受干旱影响较小。此外，将NtERF283转基因株系、erf283突变体和对照在营养土中种植，常规条件生长4周后开始断水。断水两周后复水，复水20天后统计存活率，结果发现NtERF283转基因株系遭受干旱胁迫后的存活率明显高于野生型对照。
附图说明
图1NtERF283基因的克隆；
图2NtERF283基因编辑材料鉴定和转基因株系表达水平鉴定；
图3NtERF283转基因植物的耐旱性分析。其中，A模拟干旱时，NtERF283转基因株系、erf283突变体和野生型对照的生物量比较；B干旱胁迫时NtERF283转基因株系、erf283突变体和对照的表型分析；C存活率分析；D叶绿素含量分析；E脯氨酸含量分析。
具体实施方式
下面对本发明通过实施例作进一步说明，不仅限于本实施例。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件所用的通用设备、材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、过量表达载体构建
1、NtERF283基因克隆
①RNA提取
正常生长条件下生长4周的栽培烟草红花大金元(HD)取材后迅速在液氮中研磨成粉末状，取约100mg粉末状材料置于盛有1.0mL TRIzol(Invitrogen)的1.5mL离心管中，置-80℃保存备用。采用TRIzol试剂提取法:将-80℃保存备用的样品取出，室温解冻后，加入200μL氯仿，振荡混匀，离心后，小心取出上层水相，转入另一离心管中，加入500μL异丙醇，沉淀、离心分离出RNA，再经75％酒精洗涤，室温微干后，加入适当体积的RNase-free H2O，充分溶解。所提RNA经DNA酶(Fermentas)处理。
②反转录反应
取2μg RNA进行反转录，加入0.5μg/μL Oligo(dT)1μL，加入去离子水补足到12μL，70℃保温5min后，依次加入5×RT buffer 4μL，20U/μL RNase抑制剂1μL，10mmol/L dNTP 2μL，37℃保温5min后加入200U/μL M-MLV反转录酶1μL，反应终体积为20μL。42℃反应60min，70℃加热10min终止反应。
③PCR扩增
PCR扩增参考了Clontech公司的In-fisuon无缝连接法，人工合成一对引物，并在其5’端分别加上15-20bp载体互补序列。上游引物及下游引物如下，下划线标注区域为载体接头序列：
NtERF283-F：5′-TGACCTCGAGACTAGTATGGAGCATAATGAAAAGGG-3′
NtERF283-R：5′-TACCGTCGCACCATACTAGTCATGTAATCCGGCGGTGGAA-3′
以上述HD cDNA作为模板，以NtERF283-F和NtERF283-R为引物，采用高保真GXL DNA Polymerase(TaKaRa)进行PCR扩增。在灭菌的PCR管中建立如下反应体系。单位：μL
反应程序:98℃,10s,52℃,15s,68℃,3min,35个循环，最后72℃延伸10min，反应结束后，电泳检测PCR结果(图1)。
④PCR产物纯化
电泳后，在紫外光照射下进行切胶回收，利用凝胶回收试剂盒(TAKARA)回收目的基因片断。
⑤重组载体构建
参照Clontech公司的In-fusion无缝连接说明书，按试剂盒要求建立连接反应体系。单位：μL
50℃连接15min后，放冰上，用于下一步的转化。
⑥连接产物转化大肠杆菌感受态细胞(热激法)
无菌条件下取5μL连接产物加到感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴30min。42℃热激90s，将离心管迅速转到冰浴中放置2-3min。加无抗生素的LB培养基800μL，37℃摇床温和摇振1h左右。取200μL培养液涂于含50μg/mL卡那霉素的LB固体培养基上，37℃倒置培养12-16h。
⑦表达载体的鉴定
挑取培养基中长出白色菌斑，分别接种于含有50μg/mL Kam的LB液体培养基中振荡培养12-16h利用碱裂解法小量提取质粒DNA(TAKARA)，所得质粒经Bam HI和Hind III双酶切，结果正确的阳性克隆送公司测序。
实施例2、NtERF283基因编辑载体构建
为进一步了解NtERF283基因在抗旱中的功能，本发明构建了用于敲除NtERF283基因的CRISPR/Cas9表达载体，下面就构建过程简要介绍如下：首先在NtERF283基因序列上设计20bp长度的靶位点(图2A)，设计敲除引物序列NtERF283-K-F和NtERF283-K-R，下划线部分为接头：
NtERF283-K-F:5’-GATTTGGGGGAGATATGCTGCTGA-3’，
NtERF283-K-R:5’-AAACTCAGCAGCATATCTCCCCCA-3’；
设计反应体系，以获得靶位点的DNA双链(退火)，20μL反应体系设计如下：
Annealing Buffer for DNA Oligos(5×)，4μL；
上下游引物(NtERF283-K-F、NtERF283-K-R)，各4μL(50μmoL/μL)；
Nuclease-free water补充至20μL；
反应程序为：95℃5min，每8s下降0.1℃，降至25℃；反应产物4℃保存备用，或者直接进行后续反应。
将上述将退火产物与BsaⅠ酶切后的CRISPR/Cas9载体进行连接，并筛选获得用于敲除NtERF283基因的CRISPR/Cas9表达载体，20μL连接体系设计如下：
退火产物，6μL；
酶切产物(BsaⅠ酶切后的CRISPR/Cas9载体)，3μL；
10×T4 DNA Ligase Buffer，2μL；
T4 DNA Ligase，1μL；
灭菌水补充至20μL，37℃连接3h。
然后将连接产物转化至大肠杆菌感受态细胞中，通过挑取阳性克隆、扩大培养，提取质粒后，经PCR确认载体构建成功后，低温保存，用于农杆菌转化。
实施例3、NtERF283过量表达转基因烟草和erf283突变体获得
1)表达载体转化农杆菌
分别将过量表达载体pDT1-NtERF283和基因编辑载体CRISPR/Cas9-NtERF283利用热激法转化农杆菌GV3101(购于天根生化科技(北京)有限公司)，抽提质粒并进行测序鉴定。
2)烟草遗传转化
遗传转化所使用的受体材料为红花大金元。采用农杆菌浸染叶盘法将载体整合到烟草基因组中。将测序正确的单菌落扩大培养，28℃恒温培养箱225rpm振荡培养8-9h。接着，取800μL菌液于6～8mL LB(Kan+/Rif+)液体培养基中过夜培养。次日，取过夜培养的菌夜2mL于50mL LB(Kan+/Rif+)液体培养基中扩大培养5-6h。待OD＝0.6～0.8，用50mL的离心管收集菌液，4℃，5000rpm离心10-15min。去掉上清液后，用1mL MS清洗菌体一次，接着用适量液体MS重悬菌体至OD＝0.2～0.3。组织培养流程简单如下：将红花大金元无菌苗叶片剪成0.5-1cm2的正方形叶盘，放入菌液中侵染8-10min，取出叶片置于无菌滤纸上吸去残留的菌液。待叶盘上的菌液除去后，转移至MS平板。22-25℃(以暗培养结束后不长农杆菌为准)暗培养2d后移入分化MS(Kan+)培养基，在培养条件为相对湿度60％，光照16h/28℃，黑暗8h/25℃的光照培养箱中培养，每隔7-10d更换新鲜分化MS(Kan+)培养基，进行继代培养，直至出现阳性不定芽。待不定芽生长至1cm左右时，切取不定芽并转入伸长培养基，培养2周左右后移入生根培养基进行生根培养。
3)erf283基因编辑植株的检测
利用PCR扩增法检测组织培养筛选得到的植株，测序后用于鉴定sgRNA序列的突变类型。反应体系(25μL)：基因上下游引物(10μM)各1μL、DNA样品1μL、10ⅹTaq Buffer(Mg2+)2.5μL、2.5mmol/L dNTPs 2μL、Taq DNA polymerase 0.25μL，加ddH2O补足至25μL。PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保温。测序结果发现，erf283突变体中存在“GG”两个碱基缺失，造成NtERF283氨基酸编码提前终止(图2A)。通过加代，获得erf283纯合突变体，用于研究NtERF283抗旱性研究。
4)过量表达转基因植株NtERF283基因表达水平检测
对PCR检测阳性的转基因株系采用定量实时PCR分析方法，检测目的基因在不同T0代转基因株系中的表达水平。qRT-PCR采用FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)试剂盒在LightCycler 96PCR仪上进行，每个样品重复3次。qPCR反应体系(20μL)：2×SYBR Green Master 10μL、10μmol/L正反向引物各0.5μL、cDNA模板2μL，最终补水至20μL。qPCR反应条件：95℃10min；95℃10s，62℃15s，72℃20s，共45个循环；95℃5s，65℃1min，以0.1℃/s升温至97℃。反应结束后，根据得到的Ct值，用2-ΔCT方法计算基因的相对表达量，用2-ΔΔCT计算目的基因的变化倍数。ΔΔCt＝(CalibratorΔCt)-(未知样品ΔCt)，未知样品ΔCt＝(内参基因Ct)-(目的基因Ct)，CalibratorΔCt＝(参比样内参基因Ct)-(参比样目的基因Ct)。L25(Ribosomal protein L25)基因作为内参基因。
qPCR结果显示，NtERF283在不同转基因株系中均呈现表达水平升高趋势，但在不同转基因株系存在差异，其中L32和L51两个株系中NtERF283的表达水平最高(图2B)，我们选取了这两个株系用于后续的耐旱性鉴定。
实施例4、NtERF283过量表达烟草的耐旱性鉴定
同期收获的NtERF283转基因株系、对照和erf283突变体种子消毒后点种到1/2MS培养基上，置于光照培养箱中，常规生长条件培养(16h/8h,光期/暗期；26℃)，8天后将长势一致的幼苗转移到含有200mM甘露醇的1/2MS培养基上，继续生长9天后，称量苗子鲜重。结果发现，NtERF283转基因株系在模拟干旱条件下的生长势显著地高于对照，而erf283突变体的长势弱于对照植株(图3A)，说明在干旱条件下，NtERF283转基因烟草生长受干旱影响较小。将NtERF283转基因株系、erf283突变体和对照在营养土中种植，常规条件生长4周后开始断水。断水两周后复水，复水20天后统计存活率，植株出现新生叶片视为存活。结果如图3B所示，NtERF283转基因株系遭受干旱胁迫后的存活率明显高于对照，而erf283突变体的耐旱性最差。随后的研究发现，叶绿素和脯氨酸含量在NtERF283转基因烟草中含量最高，野生型对照次之，erf283突变体最低(图3D，3E)。综上所述：在干旱/模拟干旱胁迫下，增加NtERF283基因的表达量可显著提高烟草的耐旱性。
以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种NtERF283基因，其特征在于，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种权利要求1所述的NtERF283基因编码的蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQID NO：2所示。
3.一种与权利要求1所述的NtERF283基因相关的生物材料，其特征在于，包括如下任一种：
a)含有所述的NtERF283基因的重组表达载体；
b)含有所述的NtERF283基因的生物工程菌，或含有a)所述的重组表达载体的生物工程菌；
c)含有所述的NtERF283基因的转基因植物细胞系，或含有a)所述的重组表达载体的转基因植物。
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，使用所述NtERF283基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前加上增强型、组成型、组织特异型或诱导型的启动子，所述启动子选自花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素(Ubiquitin)基因启动子(pUbi)、Actin启动子。
5.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，使用所述NtERF283基因构建重组表达载体时使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，所述增强子区域是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子。
6.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，使用所述NtERF283基因构建重组表达载体时，构建方法如下：将所述NtERF283基因插入pDT1载体的SpeI酶切位点，得到所述重组表达载体。
7.一种权利要求1所述的NtERF283基因在增强植物耐旱性中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，通过如下方法中的一项或多项增强植物耐旱性：
F1)导入如权利要求1所述的NtERF283基因；
F2)导入如权利要求2所述的蛋白；
F3)导入如权利要求3中a)和b)中所述的生物材料。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，方法F3中，通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、基因枪法、花粉管通道、显微注射、电导、农杆菌介导生物学方法将所述的生物材料转化到植物细胞或组织中。
10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述植物为双子叶植物或单子叶植物，所述双子叶植物为烟草或拟南芥。
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