CN115806988B

CN115806988B - 花生fus3基因和启动子及其在提高花生含油量和耐盐性中的应用

Info

Publication number: CN115806988B
Application number: CN202211457634.0A
Authority: CN
Inventors: 隋炯明; 林顺钰; 张恒; 王晶珊; 禹山林; 朱虹; 马涛; 于恺悦; 乔利仙; 赵春梅
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2022-11-18
Filing date: 2022-11-18
Publication date: 2024-04-12
Anticipated expiration: 2042-11-18
Also published as: CN115806988A

Abstract

本发明公开了花生FUS3基因和启动子及其在提高花生含油量和耐盐性中的应用，属于基因工程技术领域。本发明所述花生FUS3基因，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因能够提高植物的含油量和耐盐性。本发明所述启动子，其核酸序列如SEQ ID NO:11所示，与普通的花生FUS3启动子相比，该启动子是一种突变的花生FUS3启动子，能够更加高效地启动基因转录和表达。将该启动子与花生FUS3基因配合，可显著提高植物的含油量和耐盐性能。

Description

花生FUS3基因和启动子及其在提高花生含油量和耐盐性中的应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及花生FUS3基因和启动子及其在提高花生含油量和耐盐性中的应用。

背景技术

花生是食用植物油的主要来源。有研究表明，花生中含油量每提高1个百分点，花生油加工企业可增加纯收入7％。然而，我国目前主要花生品种的平均含油量仅为51.4％，北方主产区种植的一些大花生品种含油量还不到50％；因此，提高含油量已成为花生品质育种最重要的目标之一。此外，盐害是农业生产上最严重的逆境危害之一，农作物长期遭受盐害会引起植株生长缓慢、甚至死亡，还会导致产量和品质严重下降。有研究表明，现有农作物品种在长期遭受盐害后会比正常情况下减产30％以上。然而，常规的花生育种技术存在效率低、周期长等缺陷，短期内难以选育出高油且耐盐品种，因此，通过基因工程的手段，挖掘花生耐盐和油脂合成相关基因，对于创制耐盐、高油新材料，培育耐盐、高油新品种具有重要价值和意义。

发明内容

本发明提供了一种花生FUS3启动子，其核酸序列如SEQ ID NO:11所示。

与普通的花生FUS3启动子相比，该启动子发生了突变，能够更加高效地启动基因转录和表达。为此，本发明还提供了上述花生FUS3启动子在提高基因转录和表达效率中的应用；所述基因为任何具有转录和表达作用的基因，例如花生FUS3基因，其核酸序列如SEQIDNO:1所示。

上述花生FUS3基因被证明与植物含油量和盐胁迫有关，具体地，上述花生FUS3基因能够提高植物的含油量以及耐盐性能，因此，当上述花生FUS3启动子与花生FUS3基因配合时，能够显著提高植物的含油量和耐盐性。基于此，本发明提供了上述花生FUS3启动子和/或花生FUS3基因在提高植物含油量和/或耐盐性中的应用。

本发明还提供了含有上述花生FUS3启动子和/或花生FUS3基因的重组表达载体、表达盒、转基因细胞系、重组菌或重组病毒。

一种提高植物含油量和/或耐盐性能的方法，是将花生FUS3启动子和/或花生FUS3基因构建到表达载体中形成重组表达载体，然后将重组表达载体转化植株，使植物携带有花生FUS3启动子和/或花生FUS3基因，并最终通过花生FUS3基因的高表达，调控植物的含油量和/或耐盐性。通过该方法可最终获得产油量高和/或盐胁迫下耐受程度大于目的植物野生型的转基因植物。

上述重组表达载体可采用现有的植物表达载体构建，其除了包含有本发明所述的花生FUS3启动子和/或花生FUS3基因外，还包含有如下克隆载体，但不局限于如下载体：双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体；例如pROKII、pBin438、pCAMBIA1300、pCAMBIA1301、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA1301-UbiN、pCAMBIA2301、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pWM101、pGreen0029、pBI121、pBin19、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb(CAMBIA公司)等，或其它衍生植物表达载体；

上述重组表达载体还可包含外源基因的3'端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3'端，如农杆菌冠瘿瘤诱导(Ti)质粒基因(如胭脂合成酶Nos基因)、植物基因(如大豆贮存蛋白基因)3'端转录的非翻译区均具有类似功能；

使用本发明所述的花生FUS3启动子和/或花生FUS3基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前还可加上其它任何一种增强型、组成型、组织特异表达型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、玉米的泛素基因Ubiquitin启动子(pUbi)、种子特异表达的启动子、胁迫诱导型启动子Rd29A等；

此外，使用本发明所述的花生FUS3启动子和/或花生FUS3基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但应当与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译；

上述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的；翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因；为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等选择性标记基因)、抗生素的标记基因(如赋予对卡那霉素和相关抗生素抗性的nptII基因，赋予对除草剂膦丝菌素抗性的bar基因，赋予对抗生素潮霉素抗性的hph基因，和赋予对methatrexate抗性的dhfr基因，赋予对草甘磷抗性的EPSPS基因)或是抗化学试剂标记基因等(如抗除莠剂基因)、提供代谢甘露糖能力的甘露糖-6-磷酸异构酶基因。如果从转基因植物的安全性考虑，也可不加任何选择性标记基因，直接以表型性状筛选转化植株。

携带有本发明所述的花生FUS3启动子和/或花生FUS3基因的重组表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导、基因枪、花粉管导入、脂质体融合等任何可将质粒导入的生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。被转化的植物宿主既可以是小麦、玉米、水稻等单子叶植物，也可以是花生、烟草、拟南芥、大豆、油菜、杨树、苜蓿等双子叶植物。

当采用农杆菌介导重组表达载体转化时，所述农杆菌可选自根癌农杆菌(例如GV3101、LBA4404以及EHA105)、发根农杆菌等。

本发明的有益效果为：

本发明挖掘了花生FUS3基因，该基因能够提高植物的含油量和耐盐性。同时，本发明还挖掘了一种突变的花生FUS3启动子，该启动子与普通的花生FUS3启动子相比，能够更加高效地启动基因转录和表达。将该启动子与花生FUS3基因配合，可显著提高植物的含油量和耐盐性能。

附图说明

图1为FUS3基因在盐胁迫处理后的表达情况；

图2为宇花9号和转基因受体花育23在授粉后种子发育35d、55d和75d后的FUS3基因表达量；

图3为转基因株系和非转基因株系的含油量；

图4为转基因株系和非转基因株系的耐盐情况；其中，左侧为WT，中间为OE-1，右侧为OE-2；

图5为转基因株系和非转基因株系的相对电导率；

图6为NBT和DAB染色结果图；

图7为转基因株系和非转基因株系的O₂ ^-积累量；

图8为转基因株系和非转基因株系的H₂O₂积累量；

图9为转基因株系和非转基因株系的MDA含量。

具体实施方式

本发明所采用的试验材料，如下：

大肠杆菌DH5α，由青岛农业大学遗传研究室实验室保存；根癌农杆菌菌株GV3101，购自北京天恩泽基因科技有限公司；根癌农杆菌菌株EHA105，购自北京天恩泽基因科技有限公司；拟南芥哥伦比亚野生型品种，青岛农业大学遗传研究室实验室提供；宇花9号，由青岛农业大学选育的高油花生品种；转基因受体花育23，青岛农业大学花生分子育种实验室提供。本发明中所使用的其它材料或者术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

实施例

1、花生FUS3基因的克隆

根据Peanutbase网站上公布的基因序列(LOC107494712)设计基因扩增引物P1和P2，扩增引物序列如下述SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。提取宇花9号和转基因受体花育23的RNA，并将RNA反转录成cDNA，以cDNA为模板，以上述P1和P2引物对，克隆花生FUS3基因。经测序分析，宇花9号和花育23的基因编码区序列无差异，其基因序列如SEQ ID NO:1所示；该基因编码产生的氨基酸，其序列如SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:1：

5'-ATGATGATGGATCAGGGACAAGGAAGAGAAAACTTGCTTCTTCAGAAAACCGAGGCCTGTGCCTTCGTGGCAGGTGTTGACGCTCACGACCTTCTTCCCTCTTCTGTCACCGTTCAAGGGAACAACACCAACACCAACAGGATCATAACTACTACCATTCTCCATAACGGGTCATCATCGGAACCGGGTCGGATCCTCCATCATCATGATATTCAGTACCAGCAGGAGCAGGAGCAGGAGCAGGAGGTTGGGCTTGTTGCCACCTTTGGAAACGTGCATAGGAAGAGGAGAATGGCTAGGATGAGGAGGAGGTCCTCACCAACACTGATGCACCTTCAGTTCCACGCTAACACCACCACCCCCACCACTACTCTTTTTCCACCTCTTTCTTCTTCAGGGCAATCTTCTGATACACCACCACCACCACCACCACCGACACTTTCTCCTCCTCCTCTTCTTCTTCCTTCTGCTGCTGTTGGTCCTTCCACTACTACTAATACCTCCCCTCACGTGCCTACTCATAATCCCGCACGTGTAATTGATCATACAAGCTTGAGATTCCTTTTTCAAAAGGAGTTAAAGAACAGTGATGTTAGTTCTCTCAGGAGGATGGTATTGCCAAAGAAAGCAGCAGAGGCTTTTCTTCCTCCTCTTGAATCAAAGGAAGGAATTCTTATCAGCATGGATGACCTCGATGGCATTCATGTTTGGAGTTTTAAGTACAGATTTTGGCCCAACAATAATAGTCGCATGTACGTCCTTGAAAACACTGGAGAATTTGTTAACGCACATGCTCTTCGGATGGGAGATTCTATTATGGTTTACCAAGATAGTCGAAATCATAATTATGTCATTCAAGCAAAGAAAGTTTCTGATCAAGATGAATTTATGGAAGAAACTAGCGACATGGCAAATGATATCTTCCTTAATGATTACGAAGTTAGCAAACCTGGTTGTTTCAGCTTGACTTACCCAGCTTTGAATGACACTACAGGCATGTCATTCATATATGAGACTACATTCTCAAATGATAGTCCTCTTGACTTTTTGGGCGGATCAATGACTAATTTTTCAAGGATCGGCCCAACTGAAACCTTTGGTTCTGTTGAAAATTTGTCACTTGATGACTTCTACTAA-3'

SEQ ID NO:2：

MMMDQGQGRENLLLQKTEACAFVAGVDAHDLLPSSVTVQGNNTNTNRIITTTILHNGSSSEPGRILHHHDIQYQQEQEQEQEVGLVATFGNVHRKRRMARMRRRSSPTLMHLQFHANTTTPTTTLFPPLSSSGQSSDTPPPPPPPTLSPPPLLLPSAAVGPSTTTNTSPHVPTHNPARVIDHTSLRFLFQKELKNSDVSSLRRMVLPKKAAEAFLPPLESKEGILISMDDLDGIHVWSFKYRFWPNNNSRMYVLENTGEFVNAHALRMGDSIMVYQDSRNHNYVIQAKKVSDQDEFMEETSDMANDIFLNDYEVSKPGCFSLTYPALNDTTGMSFIYETTFSNDSPLDFLGGSMTNFSRIGPTETFGSVENLSLDDFY

扩增引物序列如下：

P1：5'-ATGATGATGGATCAGGGACAA-3'(SEQ ID NO:3)；

P2：5'-TTAGTAGAAGTCATCAAGT-3'(SEQ ID NO:4)。

2、盐胁迫对花生FUS3基因表达的影响

用300mM NaCl处理宇花9号幼苗，在不同时间段(处理后的0h、6h、12h、24h和48h)取幼苗叶片，立即在液氮中冷冻处理后备用。分别取0.05g不同时间段胁迫处理的花生幼叶，液氮速冻并研磨成粉末状，用RNA提取试剂盒提取RNA。抽提后的总RNA用DNase I处理，并进行纯化。

样品在ABI 7500FAST型荧光定量PCR仪上反应，进行FUS3基因定量。反应体系共20μL，包括：10μL 2×SybrGreen qPCR Master Mix，20μmol/L正反向引物各0.25μL，20ng反转录产物。扩增程序为：先94℃预变性2min；接着进入40个循环反应，每个循环中94℃变性30s，58℃复性30s，72℃延伸30s；循环结束后，缓慢升至94℃，制备熔解曲线。每个反应设3个复孔。

上述FUS3基因定量PCR的引物为：

正向引物序列：5'-AGCAAACCTGGTTGTTTCAGC-3'(SEQ ID NO:5)；

反向引物序列：5'-TCAGTTGGGCCGATCCTTGAA-3'(SEQ ID NO:6)。

本试验以花生Actin基因为内标，内标基因的引物为：

正向引物序列：5'-GTGGCCGTACAACTGGTATCGT-3'(SEQ ID NO:7)；

反向引物序列：5'-ATGGATGGCTGGAAGAGAACT-3'(SEQ ID NO:8)。

经过上述试验，测得FUS3基因在盐胁迫处理前后表达量变化情况，试验结果如图1所示。由图1可知，FUS3基因在盐胁迫处理后表达量明显发生变化，表明其受盐胁迫诱导，从而确定FUS3基因与植物的耐盐性有关。

3、花生FUS3启动子的克隆及其作用研究

选取高油品种宇花9号和转基因受体花育23两个品种在授粉35d、55d和75d后的种子，提取RNA，送交诺禾致源公司进行转录组测序，每个处理包括3个重复。对转录组测序数据进行分析发现：在授粉35d、55d和75d后的种子中，FUS3基因在宇花9号的表达量均高于花育23，特别在75d时达到显著差异，如图2所示。

提取宇花9号和转基因受体花育23的DNA，克隆花生FUS3启动子。启动子扩增引物序列如下：

P3：5′-CTTTGAGAAGAAATTAGAAGTCGAA-3′(SEQ ID NO:9)；

P4：5′-TTTCCTTTTCTTTCTTTTTTTGGGG-3′(SEQ ID NO:10)。

经测序发现，宇花9号的FUS3启动子序列(SEQ ID NO:11)和转基因受体花育23的FUS3启动子序列(SEQ ID NO:12)存在很大差异，上述差异表达的原因是由于启动子的突变，导致了FUS3基因转录和表达效率不同。由此可见，SEQ ID NO:11所示启动子在提高FUS3基因转录和表达方面具有重要作用。

SEQ ID NO:11：

5'-CTTTGAGAAGAAATTAGAAGTCGAAGAAACTATAATGTTTAAGATTATTAATTTGCTATTATTTATGACTTTAAGATAAAAAATAAAAAATAATAACTTATAGTATATTATTATCCTGTTATTATTTACTAAAATTTATTATATATTATAAACCTGTATATTTAGAGAGATAAAATTGATTAAAATTTTATTAAAATATTTCAATGTAAAAATATAAAGAAATAGATATTTTAGGAGTTTAAATACTTAGTATAAAAAATTCCAAACTTCCTTTTCTTTCGAATAATATTTTATAATTTCTTTCTCTTTAGAATAATAATAAATTCTTGAATAAAATCAAACTCTTTAAAGATTTTTGTTTTTTTTTTCAAAACTTTAGTGTATATATATACATAAACCAAATTCTTGATGAACACACCTTCAATAACTCCAATTTGGTATTCTGTGTATGTGGACACTCCATCTAACAGGAAAGTTATTAAAAAATGATATTTTGGCATTTCAATTAATATCTTCACCTTTATACACTTCACTTATAATAATTAATTAGTAAATTATTCTTTCTATGTATTTTTATTTCTCTCTTTTTTCTAAAAAAATTAAATTAATCTCTCAAATAAATAAAAAATAATTTAATTGTAAAAATATAATATAAGTATTAAGTAGTGAGGAGCATAAAGGGATTTTTTTTTCCACAAAAACACACTTGCAACCGCATAATAAAAATCACACCGTGTTAGTTAAAACTTGAGCCACATGGCAAACTTCTGCGTGTAGCACTGTAACGGTTGGTACATGCAAACACAGGATCTCTCTCTTCCCTTAATACTACAACAACAGTTACGCCAACTCGTAATATAGGCAGCTACCTGTTTTTTTGTGTCGTCCATACCATGCACCCTGGTTTTCATTCTCTCATCAAAACTTTAAAACACAGGAGCATCTTCCCGTTGTTGTTCAATACCCCCACTTTTCTTCCACCATTCCTCCTAAAGTTAAGCAAATGTCTCTATTTAATTTCATTTTGAAAATGCGAGAGAAATAATAATAAAGCTAAGCTAAGAGAGTGTATAGTATATGGTAGTGAGTGAGTGTGGGGAATATTAATGCGTGCAAAGGCAAAAACACCCTCACTCTTCACGTCCCATTGATTTCAATTCTGTGAATGGGGGGGATGTGTAGAGATCAGAACTTTTGCAACAGGTGGAGTGGATTCTGAAGCCCCATGTTTCGGCAGAATCCACCATACATCCGTCATAAGCTGTTTGGGCATTCTCTAACCACCACCACCACCGCACTAACCCCTATGCCAACCCTGGTTCCATTCTTACACCAACCCATATTCACCACACCATTCTTCTAGCTAGTTTAGTTTAGTTAACCCCCTTTCCCTGCTTTCTTTTAATTTTCTCTATCTGTCCTCGTTATTATTTATTAGAAAGAGAAAAAAGAGAGAGCAGAGGGTAAGGGTAAAGAAAGAGCCAAAAGAAACTAGCCAACATTTAACCATCTAAGCGTGAACCTTCCTCACATTTTGCAACCAAAACTCCTATGATATGATATGATCCAAACCCCATTACCCATAACCCATTTACAAATAAAAATCTGTCAAGAGAGAGAAAGAGAGAATTTATGTTGTGGTAAAAAAAAGTAAAAGTGGGTGGAGTAGTAGAGGTAGAGTGGGAGAGAGGATTGGAATTGGGAGAATGCAGGATGCACAAATGTCATAAAAACCAGTCCCTGTAATCAACACACTCAAAAAAACCCTTGCCTAAAATAGAAAAATTCCCCAAAAAAAAAAAAAGAAATAGAAGATAAAGAGAAGGGGTGTGTGTGTGTTGAACCGAGTGTGAAAGACAGTCCACCATTGATCTGTTTGAACACCAAACCCCACACCCGTTCGTGATTGCCGAGCGTCCTTATAACACCCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCATTCATTCTATCATCATCTATCCATATTTGCACAAACACTCACACTCGTAGAGAGAGAGAGAACAGAAAACCAAAAGCCACTTCCACTGTTTATAGAGAGAGACACCCCAAAAAAAGAAAGAAAAGGAAA-3'

SEQ ID NO:12：

5'-CTTTGAGAAGAAATTAGAAGTCGAAGAAACTATAATGTTTAAGATTATTAATTTGCTATTATTTATGAATTTAAAATAAAAAATAAAAAATAATAACTTATAGTATATTATTATCCTGTTATTATTTACTAAAATTTATTATATATTATAAACCTTTATATTTAGAGAGATAAAATTGATTAAAATTTTATTAAAATATTTCAATGTAAAAATATAAAGAAATAGATATTTTAGGAGTTTAAATACTTAGTATAAAAAATTCCAAACTTCCTTTTCTCTGAATAATATTTTATAATTTCTTTCTCTTTAAAATAATAATAAATTCTTGAATAAAATCAAACTCTTTAAAGATTTTTGTTTTTTTTTTCAAAATTTTGGTGTATATATATACATAAACCAAATTCTTGATGAACACTCCTTCAATAACTCCATTTTGGTATTCTGTGGATGTGGACCCTCCATCTAACAGGAAAGTTATTAAAAAATGATATTTTGGCATTTCAATTAATATCTTCACCTTTATACCCTTCACTTATAATAATTAATTAATAAATTATTCTTTCTATGTATTTTTATTTCTCTCTTTTTTCTAAAAAAATTAAATTAATCTCTCAAATAAATAAAAAATAATTTAATTGAAAAAATATAATATATTTATTAAGTAGGGAGGAGCATAAAAGGATTTTTTTTTCCACAAAAACACACTTGCAACCGCATAATAAAAATCACACCGTGTTAGTTAAAACTTGAGCCACATGGCAAACTCCTGCGTGTAGCACTGTAACGGTTGGTACATGCAAACACAGGATCTCTCTCTTCCCTTAATACTACAACAACAGTTACGCCAACTCGTAATATAGGCAGCTACCTGTTTTTTTGTGTCGTCCATACCATGCACCCTGGTTTTCATTTTCCCATCAAAACTTTAAAACACAGGAGCATCTTCCCGTTGTTGTTCAATACCCCCACTTTTCTTCCACCATTCCTCCTAAAGTTAAGCAAATGTCTCTATTTAATTTCATTTTGAAAATGCGAGAGAAATAATAATAAAGCTAAGCTAAGAGAGTGTATAGTATATGGTAGTGAGTGAGTGTGGGGAATATTAATGCGTGCAAAGGCAAAAACACCCTCACTCTTCACGTCCCATTGATTTCAATTCTGTGAATGGGGGGGTGTGTAGAGATCAGAACTTTTGCAACAGGTGGAGTGGATTCTGAAGCCCCATGTTTCGGCAGAATCCACCATACATCCGTCATAAGCTGTTTGGGCATTCTCTAACCACCACCACCACCGCACTAACCCCTATGCCAACCCTGGTTCCATTCTTACACCAACCCATATTCACCACACCATTCTTCTAGCTAGTTTAGTTTAGTTAACCCCCTTTCCCTGCTTTCTTTTAATTTTCTCTATCTGTCCTCGTTATTATTTATTAGAAAGAGAAAAAAGAGAGAGCAGAGGGTAAGGGTAAAGAAAGAGCCAAAAGAAACTAGCCAACATTTAACCATCTAAGCGTGAACCTTCCTCACATTTTGCAACCAAAACTCCTATGATATGATATGATCCAAACCCCATTACCCATAACCCATTTACAAATAAAAATCTGTCAAGAGAGAGAAAGAGAGAATTTATGTTGTGGTAAAAAAAAGTAAAAGTGGGTGGAGTAGTAGAGGTAGAGTGGGAGAGAGGATTGGAATTGGGAGAATGCAGGATGCACAAATGTCATAAAAACCAGTCCCTGTAATCAACACACTCAAAAAAACCCTTGCCTAAAATAGAAAAATTCCCCAAAAAAAAAAAAAGAAATAGAAGATAAAGAGAAGGGGTGTGTGTGTGTTGAACCGAGTGTGAAAGACAGTCCACCATTGATCTGTTTGAACACCAAACCCCACACCCGTTCGTGATTGCCGAGCGTCCTTATAACACCCTTTCTTTCTTTCTTTCTTTCATTCATTCTATCATCATCTATCCATATTTGCACAAACACTCACACTCGTAGAGAGAGAGAGAACAGAAAACCAAAAGCCACTTCCACTGTTTATAGAGAGAGACACCCCAAAAAAAGAAAGAAAAGGAAA-3'

4、植物表达载体的构建

参照宇花9号中FUS3启动子和基因的cDNA序列，人工合成FUS3启动子和基因的编码区，在两端分别加上KpnI和SacI的酶切位点，并连接到克隆载体pMD18-T，连接产物转化大肠杆菌DH5α。用KpnI和SacI对上述重组载体进行双酶切，回收含FUS3启动子和基因的酶切片段，并克隆到植物表达载体pBI121的对应酶切位点中，获得含有FUS3启动子和基因的植物表达载体pBI121-P-FUS3。

4、转化

将植物表达载体pBI121-P-FUS3转化花生，步骤如下：

a、农杆菌重组菌株的制备、活化及菌液制备

将pBI121-P-FUS3重组质粒利用液氮冻融法转化农杆菌菌株EHA105感受态细胞，筛选出含有重组质粒的重组菌株。挑取重组菌株单菌落，接种到YEB液体培养基(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)中，28℃、180rpm培养至OD₆₀₀＝0.5～0.8时，取2mL菌液转移到50mL YEB培养基(利福平50mg/L，卡那霉素50mg/L)中，培养到OD₆₀₀＝0.6。将菌液于5000rpm离心10min后，用相同体积的液体MSB₅悬浮备用。

b、花生外植体的分离

选取饱满的花育23号种子，在70％酒精中浸泡1min，0.1％升汞浸泡20min，无菌水冲洗3-5次，将每片子叶纵向切成2半。

c、农杆菌介导的遗传转化

将切好的外植体浸于已备好的农杆菌菌液中，28℃、90rpm温和震荡侵染10min，用无菌滤纸将残留菌液吸干，接入SIM诱导培养基上在暗中共培养3d。转移到添加250mg/L头孢霉素的SIM诱导培养基，将外植体切口端嵌入培养基，培养2w左右，诱导丛生芽，培养条件：光强为1500～2000lx、光照12h、温度为26±1℃。

将形成丛生芽的外植体转移外到SEM培养基(250mg/L头孢霉素、100mg/L卡那霉素)上筛选抗性芽，培养2w，培养条件：光强为1500～2000lx、光照12h、温度为26±1℃。培养2w后，切下不定芽部分转移到SEM培养基(250mg/L头孢霉素、100mg/L卡那霉素)上，进行抗性芽的筛选及诱导芽伸长，培育转基因植株幼苗。培养4w左右，期间继代培养2～3次。

d、转基因植株的PCR检测

提取再生植株的基因组DNA，利用上述pBI121-P-FUS3载体上的特异序列设计引物，引物序列如下：

P5：5′-AATGTCATACCACTTGTCCGC-3′(SEQ ID NO:13)；

P6：5′-GATCGAAAAATACCGCTGC-3′(SEQ ID NO:14)。

进行PCR扩增，验证植物表达载体pBI121-P-FUS3是否成功转化至植株体内。PCR反应程序为：95℃、5min；95℃、50s，58℃、50s，72℃、1min，30个循环；72℃、10min。琼脂糖凝胶电泳结果显示，存在PCR扩增产物，且长度约600bp。这表明，植物表达载体pBI121-P-FUS3已成功转化至植株体内。

5、功能验证

(1)植物含油量测定

以15d左右苗龄的无菌实生苗为砧木，切除距子叶节约2cm以上的主茎部分，用手术刀将砧木上端垂直劈开，切口深约1cm。当转基因植株幼苗长到约3cm时，从芽丛基部切下再生小苗做接穗，下端切成长约1cm的V形伤口，切口平整。将接穗插入砧木中，使砧木和接穗的形成层紧密接触，然后用封口膜缠绕接口，松紧适度。将嫁接苗置于MSB₅培养基中无菌培养3～4d；然后移栽于灭菌的育苗基质中进行驯化2w，之后移栽到基质土中，至收获荚果。

参照油料种子含油量测定(残余法)(NY/T 1285-2007)进行花生籽仁含油量测定。称取T₃代转基因花生籽仁和非转基因籽仁10g以上样品，将其放入烘箱中100±2℃烘干约2h，利用组织破碎机将花生籽仁破碎至均匀粉状。称取花生样品1.5g以上放入烘干的滤纸筒中，将滤纸筒与样品放入105±2℃烘箱中干燥3h，然后放入干燥器中冷却至室温。将滤纸筒放入萃取剂中浸泡过夜，取出后对样品抽提8h。称重计算得出含油量，每份样品重复测定3次。

试验结果如图3所示：

与非转基因花生籽仁的含油量(53.4％)相比，5个转基因花生籽仁含量分别达到58.4％、58.9％、58.1％、58.3％、58.2％，含油量可提高4.7～5.5个百分点。

(2)植物耐盐性测定

将上述转化步骤获得的转基因花生幼苗(生长2w左右)用200mM NaCl溶液浇灌，3d后用300mM NaCl溶液持续浇灌幼苗15d，观察转基因株系及非转基因对照的表型变化。

试验结果如图4～9所示：

经NaCl处理之后，转基因花生株系(OE-1和OE-2，分别代表两个转基因花生株系)表现出较强的耐盐性，非转基因花生植株(WT)萎蔫严重(图4)。与非转基因对照相比，2个转基因花生株系(OE-1和OE-2)的相对电导率分别减少39.72％和43.42％(图5)。正常情况下，植物细胞膜对物质具有选择通透性的能力，当植物受到逆境环境的影响，细胞膜遭到破坏，膜通透性增大，从而使得细胞内的电解质外渗，导致细胞浸提取液的电导率增大。转基因株系的相对电导率减少，表示细胞膜通透性受影响小，细胞膜的损伤也较小。

为了检测盐胁迫处理后过转基因花生株系和非转基因对照叶片的活性氧积累情况，利用NBT和DAB对其测定进行染色，如图6所示；其中，在NBT染色结果中，叶片蓝色部分越多，说明了O₂ ^-积累量越多；转基因花生株系(OE-1和OE-2)比非转基因对照(WT)叶片的蓝色部分少，说明了O₂ ^-积累量少；在DAB染色结果中，叶片棕色部分越多，说明了H₂O₂积累量越多；转基因花生株系(OE-1和OE-2)比非转基因对照(WT)叶片的棕色部分少，说明了H₂O₂积累量少。本发明进一步测定了转基因花生株系和非转基因对照叶片的H₂O₂和O₂ ^-积累量和MDA含量，结果如图7～9所示；与非转基因对照相比，两个转基因花生株系(OE-1和OE-2)的O₂ ^-积累量分别减少35.47％、41.33％(图7)；H₂O₂积累量分别减少48.05％、42.76％(图8)；MDA含量分别减少46.58％、45.46％(图9)。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims

1.花生FUS3启动子在提高基因转录和表达效率中的应用；所述花生FUS3启动子的核酸序列如SEQ ID NO:11所示；所述基因为花生FUS3基因，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.花生FUS3启动子和花生FUS3基因共同在提高花生含油量和/或耐盐性中的应用；所述花生FUS3启动子的核酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述花生FUS3基因的核酸序列如SEQID NO:1所示。

3.一种提高花生含油量和/或耐盐性能的方法，其特征在于，步骤如下：

将花生FUS3启动子和花生FUS3基因构建到表达载体中形成重组表达载体，然后将重组表达载体转化花生植株，使花生植株携带有花生FUS3启动子和花生FUS3基因，并最终通过花生FUS3基因的高表达，调控花生的含油量和/或耐盐性；

所述花生FUS3启动子的核酸序列如SEQ ID NO:11所示，所述花生FUS3基因的核酸序列如SEQ ID NO:1所示。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述表达载体选自双元农杆菌载体或可用于植物微弹轰击的载体。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述转化是，使用植物病毒载体或农杆菌介导的生物学方法将重组表达载体导入花生植株的细胞或组织。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述农杆菌选自根癌农杆菌或发根农杆菌。