CN116004571A - 一种提高植物抗逆性相关蛋白α/β水解酶及其编码基因与应用 - Google Patents
一种提高植物抗逆性相关蛋白α/β水解酶及其编码基因与应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种提高植物抗逆性相关蛋白α/β水解酶及其编码基因与应用。该蛋白质为氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质或SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白。本发明进一步公开了上述蛋白质相关的生物材料及应用。本发明克隆了GmMas蛋白及其编码基因，并将GmMas蛋白的编码基因导入烟草中，显著提高转基因烟草植株的抗旱性与耐盐性。本发明的蛋白及其编码基因对培育抗逆性植物品种具有重要的应用价值，从而提高农作物产量具有重要意义；本发明将在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物抗逆性相关蛋白GmMas及其编码基因与应用，具体涉及蛋白质GmMas及其相关生物材料和应用。
背景技术
大豆（
Glycine maxL.）是主要的油料作物，其籽粒提供了主要的植物蛋白。随着气候变迁、灌溉和化肥的大量使用，土壤盐渍化问题越来越突出。世界上存在大面积的盐渍化的土地。据统计，全世界共有8亿 hm2盐碱地，在灌溉地区还有占耕地面积33%的次生盐渍化土地，土壤的盐溃化严重影响现代农业的发展。就我国而言，在全国18亿亩耕地中有近十分之一的次生盐溃化土地，另外还有2000万hm2盐碱荒地。一般来说，盐浓度在0.2~0.5%会影响作物的生长，但是盐碱地的盐分大都在0.6~10%。大面积的盐渍化土地的存在严重影响了粮食生产，成为限制农业生产的主要因素。随着世界人口的剧增及可耕地面积的逐年下降，粮食生产安全受到了严重威胁，对于人均耕地面积相对较小的中国更是日益严重的问题。
水资源短缺是当前制约全球农业生产发展的一个严峻的生态问题。干旱是长期以来影响全世界粮食安全的主要限制因素，随着全球气温升高，干旱和半干旱土地面积正在逐年增加。中国干旱半干旱耕地面积约占总耕地面积的51%，每年有将近2.5×106 hm2耕地不同程度上受到干旱的影响。目前，随着全球气候的变暖和生态平衡的破坏，水资源短缺的现象显得更为严重。作物正常生长发育和高产都必须有充足的水分提供保障。因此，干旱是影响作物产量的最重要的非生物胁迫因素之一，尤其是传统农业生产将面临严峻的挑战。
大豆品种抗逆性的提高是影响未来大豆产业发展的重大课题。盐、干旱胁迫可抑制作物生长速度，降低分蘖、分枝数量，甚至致死，最终影响作物产量，已经成为制约我国农作物生长与产量的重要因素之一。深入探究高等植物适应盐、干旱胁迫逆境的机制，有助于提高植物抗逆性性，对于作物耐逆遗传改良有重要指导意义。因此，发掘和利用大豆抗逆相关基因，并结合分子辅助育种来培育抗逆品种，被认为是目前提高大豆抗逆性的有效策略之一。
在长期的进化过程中，植物发展出了一系列的耐盐抗旱机制。随着分子生物学的迅速发展，植物耐盐抗旱生理生化机制日益明确，使得克隆与植物耐盐抗旱相关基因成为可能。加强植物耐盐抗旱生理的研究，探明植物在逆境下的生命活动规律并加以人为调控，克隆大豆α/β水解酶基因
GmMas，利用基因工程技术提高植物耐盐性和抗旱性，培育具有抵抗不良环境性状的优良品种，以提高作物的产量和品质，对于获得农业高产稳产具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为如何有效提高植物抗旱性与耐盐性。本发明的目的在于针对以上技术问题提供一种提高植物抗逆性相关蛋白α/β水解酶及其编码基因与应用。
本发明首先提供了一种蛋白质，名称为GmMas蛋白或蛋白质GmMas，来源于大豆（
Glycine maxL.），为如下（a1）或（a2）或（a3）任一所示：
（a1）氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白质；
（a2）SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
（a3）将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与（a1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。
其中，SEQ ID NO.2由407个氨基酸残基组成。
上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
上述蛋白质中，蛋白标签（protein-tag）是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost和Lambda ratio分别设置为11，1和0.85（缺省值）并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值（％）。
上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
上述蛋白质GmMas的相关生物材料也属于本发明的保护范围。所述的相关生物材料为下述（c1）-（c10）中的任一种：
（c1）编码蛋白质GmMas的核酸分子；
（c2）含有（c1）所述核酸分子的表达盒；
（c3）含有（c1）所述核酸分子的重组载体、或含有（c2）所述表达盒的重组载体；
（c4）含有（c1）所述核酸分子的重组微生物、或含有（c2）所述表达盒的重组微生物、或含有（c3）所述重组载体的重组微生物；
（c5）含有（c1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有（c2）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有（c3）所述重组载体的转基因植物细胞系；
（c6）含有（c1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有（c2）所述表达盒的转基因植物组织、或含有（c3）所述重组载体的转基因植物组织；
（c7）含有（c1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有（c2）所述表达盒的转基因植物器官、或含有（c3）所述重组载体的转基因植物器官；
（c8）含有（c1）所述核酸分子的转基因植株、或含有（c2）所述表达盒的转基因植株、或含有（c3）所述重组载体的转基因植株；
（c9）由（c8）所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；
（c10）由（c9）所述组织培养物产生的原生质体。
其中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA或hnRNA等。
上述相关生物材料中，（c1）中编码蛋白质GmMas的核酸分子具体可为如下（d1）或（d2）或（d3）中的任意一种：
（d1）如SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
（d2）编码序列为SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
（d3）在严格条件下与（d1）或（d2）限定的DNA分子杂交，且编码蛋白质GmMas的DNA分子。
其中，SEQ ID NO. 1由1224个核苷酸组成，其开放阅读框（ORF）为自5’末端起第1位-1224位，编码氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的蛋白。
所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
含有所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
上述相关生物材料中，（c2）所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达蛋白质GmMas的DNA，该DNA不但可包括启动
GmMas基因转录的启动子，还可包括终止
GmMas基因转录的终止子。
上述相关生物材料中，（c3）所述重组载体可含有SEQ ID NO. 1所示的用于编码蛋白质GmMas的DNA分子。
可用植物表达载体构建含有所述GmMas编码基因表达盒的重组载体。所述植物表达载体可为Gateway系统载体或双元农杆菌载体等，如pGWB411、pGWB412、pGWB405、pBin438、pCAMBIA1300、pCAMBIA1302、pCAMBIA2300、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301、pBI121、pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb等。使用GmMas构建重组载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛生素基因Ubiqutin启动子（pUbi）等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。
在本发明具体的实施方式中，所述重组表达载体是在载体pCBGUS的多克隆位点间插入所述编码基因得到的重组表达载体；
所述载体pCBGUS是通过包括如下步骤的方法得到的：
（1）将pCAMBIA1301载体经过
HindIII和
EcoRI双酶切，回收载体大片段；
（2）将pBI121载体经过
HindIII和
EcoRI双酶切，回收包含
gusA基因的片段；
（3）将步骤（1）中回收的载体大片段与步骤（2）中回收的包含
gusA基因的片段连接，得到重组载体pCBGUS。
所述pCAMBIA1301载体购自CAMBIA公司；所述pBI121载体购自Clontech公司。
上述相关生物材料中，（c4）所述重组微生物具体可为酵母、细菌、藻和真菌。
上述相关生物材料中，（c7）所述转基因植物器官可为转基因植物的根、茎、叶、花、果实和种子。
上述相关生物材料中，（c9）所述组织培养物可来源于根、茎、叶、花、果实、种子、花粉、胚和花药。
上述相关生物材料中，所述转基因植物细胞系、转基因植物组织和转基因植物器官均不包括繁殖材料。
上述蛋白质GmMas或上述蛋白质GmMas相关生物材料的新用途也属于本发明的保护范围。本发明提供了上述蛋白质GmMas或上述蛋白质GmMas相关生物材料在下述（b1）-（b24）中至少一种中的应用：
（b1）提高植物耐盐性；
（b2）制备提高植物耐盐性的产品；
（b3）提高植物抗旱性；
（b4）制备提高植物抗旱性的产品；
（b5）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物的生根情况；
（b6）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物的生根情况的产品；
（b7）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物的长势；
（b8）制备干旱和/或盐胁迫条件下植物的长势的产品；
（b9）制备干旱和/或盐胁迫条件下植物的鲜重；
（b10）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物的鲜重的产品；
（b11）制备干旱和/或盐胁迫条件下植物的干重；
（b12）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物的干重的产品；
（b13）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物脱落酸含量；
（b14）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物脱落酸含量的产品；
（b15）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物脯氨酸含量；
（b16）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物脯氨酸含量的产品；
（b17）降低干旱和/或盐胁迫条件下植物丙二醛含量；
（b18）制备降低干旱和/或盐胁迫条件下植物丙二醛含量的产品；
（b19）降低干旱和/或盐胁迫条件下植物H2O2含量；
（b20）制备降低干旱和/或盐胁迫条件下植物H2O2含量的产品
（b21）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物SOD活性；
（b22）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物SOD活性的产品；
（b23）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物POD活性；
（b24）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物POD活性的产品。
上述的蛋白质GmMas或其相关生物材料在抗旱性与耐盐性高的植物育种或提高植物抗旱性与耐盐性中的应用也在本发明的保护范围之内。
上述应用中，植物育种中的应用具体可为将含有所述蛋白质GmMas或所述相关生物材料（如蛋白质GmMas编码基因
GmMas）的植物与其它植物进行杂交以进行植物育种。
本发明还提供了一种培育抗旱性与耐盐性高的转基因植物的方法。该方法为提高目的植物中蛋白质GmMas的编码基因的表达量和/或所述蛋白质GmMas的含量和/或所述蛋白质GmMas的活性，得到转基因植物；所述转基因植物的抗旱性与耐盐性高于所述目的植物。
上述方法中，所述提高目的植物中蛋白质GmMas的编码基因的表达量和/或所述蛋白质GmMas的含量和/或所述蛋白质GmMas的活性的方法为在目的植物中表达或过表达蛋白质GmMas。
上述方法中，所述表达或过表达的方法为将蛋白质GmMas的编码基因导入目的植物。
上述方法中，将蛋白质GmMas的编码基因导入目的植物可通过携带有本发明
GmMas基因的植物表达载体导入目的植物中。携带有本发明基因
GmMas的植物表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物细胞或组织培育成植株。
上述方法中，所述蛋白质GmMas的编码基因的核苷酸序列是SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
在本发明具体的实施方式中，所述携带有本发明基因
GmMas的植物表达载体可为pCAMBIA1301-
GmMas。具体的，pCAMBIA1301-
GmMas利用限制性内切酶
HindIII和
EcoRI将SEQID NO. 1所示的DNA分子插入至pCAMBIA1301载体得到的。
上述方法中，所述抗旱性与耐盐性高主要体现在提高植物的鲜重和干重、提高ABA含量、提高脯氨酸含量、提高SOD活性、提高POD活性、降低H2O2含量和降低丙二醛含量。
本发明中，所述植物是如下（e1）至（e5）中的任一种：
（e1）双子叶植物；
（e2）豆科植物；
（e3）茄科植物；
（e4）大豆；
（e5）烟草。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明所提供的
GmMas基因所编码的蛋白可以提高植物的抗逆性：过表达
GmMas基因显著提高烟草的抗旱性与耐盐性。抗性离体鉴定结果表明，在NaCl胁迫下，转基因植物表现出很好的生长状态，过表达转基因烟草材料的鲜重比野生型WT材料提高了105～134%；在甘露醇胁迫下，过表达转基因烟草材料的鲜重比野生型WT材料提高了105～124%。抗性盆栽试验结果表明，在盐胁迫下，转基因植物表现出很好的生长状态，过表达转基因烟草材料的鲜重和干重分别比野生型WT材料提高了190～243%和106～129%；在干旱胁迫下，过表达转基因烟草材料的鲜重和干重分别比野生型WT材料提高了178～215%和135～165%，表达出很强的耐盐性和抗旱性；具体体现在过表达转基因烟草材料增加了ABA含量、脯氨酸含量、SOD活性、POD活性、降低了丙二醛含量和H2O2含量。因此本发明的蛋白及其编码基因对培育抗逆性植物品种具有重要的应用价值，从而提高农作物产量具有重要意义，在农业领域具有广阔的应用空间和市场前景。
附图说明
图1本发明
GmMas基因在大豆品种文丰7号中的逆境胁迫表达分析。
图2本发明
GmMas基因植物表达载体简图。
图3本发明
GmMas基因过表达烟草株系的PCR检测结果图。
图4本发明
GmMas基因在过表达烟草株系和野生型烟草植株中的表达。
图5本发明
GmMas基因转基因烟草植株在200 mM NaCl和200 mM甘露醇的MS培养基上的生长和生根情况，WT为野生型烟草植株，#5、#9和#10为过表达转基因烟草植株。
图6本发明
GmMas基因转基因烟草植株的耐盐性和抗旱性盆栽鉴定，WT为野生型烟草植株，#5、#9和#10为过表达转基因烟草植株。
图7本发明
GmMas基因转基因烟草植株抗逆生理生化指标测定，WT为野生型烟草植株，#5、#9和#10为过表达转基因烟草植株。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步阐述，但不限制本发明。
下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：
大豆（
Glycine max L.）品种文丰7号，由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。
烟草（
Nicotiana tabacum L.）品种Winsconsin 38，由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。
大肠杆菌（
Escherichia coliL.）DH5α由淮阴工学院生命科学与食品工程学院江苏省植物生产与加工实践教育中心实验室保存。克隆载体PMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、10×PCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国西格玛化学公司和上海国药化学试剂公司购买。
本发明中常规的分子生物学操作具体参见《分子克隆》【Molecular Cloning. 2nded. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989】。
下述实施例中常规的基因操作参照分子克隆文献进行【Sambook J, Frets EF,Mannsdes T et al. In: Molecular Cloning. 2nd ed. Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989】。
1/2霍格兰营养液记载于如下文献中【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong,Lifeng Fu, Rihe Peng, Zhenjun Li, Quanhong Yao.
AtMYB12 regulates flavonoidsaccumulation and abiotic stress tolerance in transgenic
Arabidopsis thaliana.Molecular Genetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】。
1. 参照Jia等（2017）【Tengjiao Jia, Jing An, Zhen Liu, Bingjun Yu,Jianjun Chen. Salt stress induced soybean GmIFS1 expression andisoflavoneaccumulation and salt tolerance in transgenic soybeancotyledonhairy roots and tobacco.Plant Cell, Tissue and Organ Culture,2017,128:469-477】的方法，将大豆品种文丰7号叶片材料取下，液氮速冻，-80℃保存。
取文丰7号叶片约2.0 g，在液氮中研磨成粉状，加入10 mL离心管，用Applygen植物RNA提取试剂盒（Applygen Technologies Inc，Beijing）提取甘薯块根总RNA，试剂盒中包括：Plant RNA Reagent，植物组织裂解、分离RNA、去除植物多糖和多酚；ExtractionReagent，有机抽提去除蛋白质、DNA、多糖和多酚；Plant RNA Aid，去除植物多糖多酚和次生代谢产物。利用QIAGEN Oligotex Mini mRNA Kit（QIAGEN，GmbH，Germany）从总RNA中纯化mRNA。最后，取1 μL于1.2% 琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，另取2 μL稀释至500 μL，用紫外分光光度计检测其质量（OD260）和纯度（OD260/OD280），提取文丰7号叶片总RNA，经非变性胶琼脂糖凝胶电泳检测，28S和18S条带清晰，且二者亮度比值为1.5～2：1，表明总RNA没有降解，纯化所得mRNA符合实验要求，可用于大豆GmMas蛋白cDNA全长的克隆。
以NCBI（National Center for Biotechnology Information）上的
GmMas的cDNA序列设计引物进行GmMas蛋白cDNA的全长克隆。
引物序列如下：
GmMas-GC-F：5’-ATGAAAGGCGTCTTTTCGGC-3’
GmMas-GC-R：5’-TTACACAACTTGCCTAAATTCCAA-3’
以文丰7号叶片总RNA经Oligo（dT）反转录为模板，用高保真的FastPfu酶，进行PCR扩增，PCR条件为95℃ 1min，随后95℃ 20 s，53℃ 20s和72℃ 1min，进行36个循环，最后72℃延伸5 min。琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，获得1224 bp长度的扩增片段。
综合上述步骤的结果，获得了目的cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列SEQID NO.1所示。序列表中序列SEQ ID NO. 1由1224个碱基组成，自5’端第1位-第1224位碱基为其开放阅读框，编码具有序列表中序列SEQ ID NO. 2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列SEQ ID NO.2由407个氨基酸残基组成。将该基因命名为
GmMas，将其编码的蛋白命名为GmMas。
实施例2
GmMas基因的逆境胁迫表达分析
将文丰7号的圆润饱满、种皮完整的健康种子，种植在装有蛭石的育苗小盆（直径17 cm）中，以水浸润。种子萌发后，继续培养，至真叶完全展开时，用水洗掉蛭石，将幼苗转移至Hoagland营养液中，正常生长2 w后，开始以下胁迫处理。
NaCl处理：将大豆幼苗从营养液中转移到含有200 mMNaCl的溶液中，分别在0、3、6、12、24、48 h 取大豆的根和叶；
甘露醇处理：处理方法同NaCl处理，甘露醇溶液的浓度是200 mM，分别在0、3、6、12、24、48 h 取大豆的根和叶；
ABA 处理：处理方法同NaCl处理，ABA 溶液的浓度是100 mM，分别在0、3、6、12、24、48 h 取大豆的根和叶；
对照处理：直接取未经任何处理的幼苗根和叶作为对照（0 h）。
所有样品取样后立即经液氮冷冻，-80℃保存。
提取RNA，鉴定
GmMas在大豆不同胁迫处理后的表达特征。
分别提取上述步骤中的各处理根和叶总RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR分析，鉴定
GmMas基因在大豆不同胁迫处理后的表达特征。
GmActin基因为内参：
GmActin-F：5’-CTTCCCTCAGCACCTTCCAA-3’和
GmActin-R：5’-GGTCCAGCTTTCACACTCCAT-3’；
GmMas引物序列为：
GmMas-F：5’-AGTTGCACCTTAGGCGTGTT-3’和
GmMas-R：5’-AACTATCGAGGGGCTGCTTG-3’。
结果如图1所示，
GmMas基因能被NaCl、甘露醇和ABA诱导表达，表明
GmMas基因与植物耐盐性和抗旱性相关。
实施例3大豆
GmMas基因过表达载体的构建及过表达烟草植株的获得
1. 大豆
GmMas基因过表达载体的构建
将实施例1中测序鉴定正确的含有序列表SEQ ID NO. 1所示核苷酸的DNA片段用
HindIII和
EcoRI进行双酶切，用1%琼脂糖凝胶回收DNA片段，通过T4 DNA连接酶将回收的
GmMas基因片段与
HindIII和
EcoRI酶切的pCAMBIA1301载体连接，酶切鉴定和序列分析测定获得了含有大豆
GmMas基因的重组过表达载体pCAMBIA1301-
GmMas。该表达载体还包含
gusA报告基因和带内含子卡那霉素抗性标记基因，载体如图2所示。
2. 过表达
GmMas基因转化烟草
将构建的大豆
GmMas基因的过表达载体pCAMBIA1301-
GmMas转化烟草，具体方法如下：
步骤（1）将pCAMBIA1301-
GmMas用电击法转化根癌农杆菌EHA105菌株（BiovectorCo., LTD），得到含有pCAMBIA1301-
GmMas的重组农杆菌，将重组农杆菌命名为EHA105/pCB-
GmMas，并涂布于含有卡那霉素抗性的平板筛选转化子。
步骤（2）挑取农杆菌单菌接种于5mL LB 液体培养基（利福平 50 μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250rpm培养20h。
步骤（3）取1 mL菌液转接入20-30 mL LB液体培养基（利福平 50 μg/mL，氯霉素100μg/mL）中，28℃，250rpm培养约12h，测OD 600≈1.5。
步骤（4）8000rpm，4℃，10min离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液（5% 蔗糖，0.05% Silwet L-77）并稀释至OD 600≈0.8。
步骤（1）取经过继代培养4-6 w的烟草无菌苗叶片，在超净台中，切下5×5mm的烟草叶盘（去掉主叶脉），切5×5 mm的烟草叶盘，不含主脉。
步骤（2）放置在再生培养基上预培养2 d，背面贴培养基（黑暗，28℃）。
步骤（3）悬浮于上述步骤制备好的农杆菌菌液中，10 min后将菌液吸出，将侵染过的烟草叶盘接种培养在固体培养基（1.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA的MS）上。28℃、黑暗，共培养3 d。
步骤（4）将共培养3 d后的烟草叶盘用含有500 mg/L Carb、1.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA的MS液体培养基洗涤2次后，将烟草叶盘转至含有1.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、25mg/L潮霉的固体MS培养基上进行选择培养，培养条件为27±1℃、每日13 h、3000 lx的光照。
步骤（5）培养2-4 w后，将不定芽转移至含有1.0mg/L 6-BA、0.1mg/L NAA、25 mg/L潮霉素的1/2MS固体培养基上进行不定根诱导，培养条件为27±1℃、每日13 h、3000 Lux的光照。4-8 w后，形成完整的再生植株，即分别得到转化
GmMas基因的烟草拟转基因植株和转空载体对照烟草植株。设未转化的烟草品种Wisconsin38为野生型对照烟草植株。
3. 过表达
GmMas基因烟草植株PCR检测
用CTAB法提取T2烟草转基因植株和野生型植株的基因组DNA。用常规方法进行PCR检测，所使用的
hpt II基因引物为：
hpt II-PCR-F：5’-ACAGCGTCTCCGACCTGATGCA-3’和
hptII-PCR-R：5’-AGTCAATGACCGCTGTTATGCG-3’。在0.2 mL Eppendorf 离心管中加入10×PCRbuffer 2μL、4dNTP（10 mol/L）1μL、引物（10μmol/L）均为1μL、模板DNA（50ng/uL）2μL、TaqDNA聚合酶 0.25μL，加ddH2O至总体积20μL。反应程序为94℃预变性5min，94℃变性30 s，55℃复性30 s，72 ℃延伸2 min，共35个循环。
电泳检测扩增结果见图3【图3中，泳道M：Maker；泳道W：水；泳道P：阳性对照（重组质粒pCAMBIA1301-
GmMas）；泳道WT：野生型烟草植株；泳道#1-#12：为转化pCAMBIA1301-
GmMas的过表达烟草转基因植株】。从图中可见，转化pCAMBIA1301-
GmMas的烟草拟转基因植株和阳性对照扩增出591 bp的目标条带，表明
GmMas基因已经整合到烟草的基因组中，并证明这些再生植株为转基因植株；野生型烟草植株没有扩增出591 bp的目标条带。转基因植株为后续功能分析。
4. 过表达
GmMas基因烟草植株qRT-PCR检测
提取阳性过表达
GmMas烟草株系总RNA，反转录得到cDNA，进行qRT-PCR分析，以未转化的烟草野生型为对照。
NtActin基因为内参：
NtActin-F：5’-CACTGGTGTTATGGTTGGTATG-3’和
NtActin-R：5’-TCGTCCCAGTTGCTTACTATTC-3’；
GmMas引物序列为：
GmMas-F：5’-AGTTGCACCTTAGGCGTGTT-3’和
GmMas-R：5’-AACTATCGAGGGGCTGCTTG-3’。
结果如图4所示，WT为野生型烟草植株，#1、#2、#3、#4、#5、#6、#7、#7、#8、#9、#10、#11和#12均为阳性过表达
GmMas烟草植株，表明
GmMas在转基因烟草植株中有不同程度的表达，选取表达量最高的过表达株系#5、#9和#10用于后续分析。
实施例4
GmMas基因转基因烟草植株抗旱性与耐盐性鉴定
将PCR鉴定为阳性的转基因烟草株系和野生型植株分别继代于含200 mM NaCl和200mM甘露醇的1/2 MS培养基上胁迫培养，培养条件为25±1℃，每天13 h、 3000 Lux光照，4周后观察并记录植株生长情况及表型变化，不同处理的苗长势开始出现差异，进行照相和生长势统计，包括鲜重数据，鉴定其耐盐性和抗旱性。
结果显示，在盐胁迫、甘露醇处理条件下，结果见图5，过表达烟草材料和野生型材料均因为盐胁迫、甘露醇胁迫条件的存在，植株变小；但是过表达烟草材料和野生型WT相比，生长状态相对较好，生长势数据统计显示，在NaCl胁迫下，过表达转基因烟草材料的鲜重比野生型WT材料提高了105～134%；在甘露醇胁迫下，过表达转基因烟草材料的鲜重比野生型WT材料提高了105～124%。表明过表达
GmMas基因显著提高转基因烟草植株的耐盐性和抗旱性。
为了验证转基因烟草材料的耐盐性和抗旱性，将过表达烟草材料和野生型烟草植株移栽到盆中培养2周后，进行盐、干旱胁迫处理。用含有200 mM NaCl的1/2霍格兰营养液每个2 d灌溉1次，每次200 mL，处理4 w，观察其表型，进行照相并测量其鲜重和干重；干旱处理4 w后，观察其表型，进行照相并测量其鲜重和干重。
结果显示，通过耐盐性和抗旱性盆栽鉴定，结果见图6，盐胁迫处理4 w，转基因植株的生长状态显著优于野生型植株，转基因植株的鲜重和干重显著优于野生型植株，过表达转基因烟草材料的鲜重和干重分别比野生型WT材料提高了190～243%和106～129%；干旱胁迫处理4 w，过表达转基因烟草材料的鲜重和干重分别比野生型WT材料提高了178～215%和135～165%。表明过表达
GmMas基因显著提高转基因烟草植株的耐盐性和抗旱性。
实施例5
GmMas基因转基因烟草植株抗逆生理生化指标的测定
脱落酸（ABA）在植物逆境胁迫反应中具有重要作用。ABA可以提高植物的耐盐性，缓解盐分过多造成的渗透胁迫和离子胁迫，维持水分平衡，诱导植物渗透调剂物质脯氨酸大量积累，维持细胞膜结构的稳定性，提高保护性酶的活性。旱害胁迫时，ABA能明显减少叶片水分蒸发，降低叶片细胞膜透性，增加叶片细胞可溶性蛋白质含量，诱导生物膜系统保护酶形成，降低膜脂过氧化程度，增强抗氧化能力，提高植物的抗旱性。因此，ABA可以作为植物抗逆性的一项生化指标。
测定方法参考文献【Shang Gao, Li Yuan, Hong Zhai, Chenglong Liu,Shaozhen He, Qingchang Liu. Transgenic sweetpotato plants expressing an
LOS5gene are tolerant to salt stress. Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 2011,107: 205-213】，检测烟草植株的ABA含量。烟草植株为空白对照中处理2 w的烟草植株、盐胁迫2 w的烟草植株、干旱胁迫2 w的烟草植株。实验需重复三次，结果取平均值。
烟草植株ABA含量测定实验结果见图7中A（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，过表达烟草#5植株、#9植株和#10植株的ABA含量显著高于野生型烟草植株。
植物在正常条件下，游离脯氨酸含量很低，但遇到干旱、盐等胁迫时，游离的氨基酸便会大量积累，并且积累指数和植物的抗逆性有关。因此，脯氨酸可以作为植物抗逆性的一项生化指标。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao.
AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stresstolerance in transgenic
Arabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测烟草植株的脯氨酸含量。烟草植株为空白对照中处理2 w的烟草植株、盐胁迫2 w的烟草植株、干旱胁迫2 w的烟草植株。实验需重复三次，结果取平均值。
烟草植株脯氨酸含量测定实验结果见图7中B（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因烟草#5植株、#9植株和#10植株的脯氨酸含量显著高于野生型烟草植株。
植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度，即MDA的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao.
AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stresstolerance in transgenic
Arabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测烟草植株的MDA含量。烟草植株为空白对照中处理2 w的烟草植株、盐胁迫2 w的烟草植株、干旱胁迫2 w的烟草植株。实验需重复三次，结果取平均值。
烟草植株MDA含量测定实验结果见图7中C（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因烟草#5植株、#9植株和#10植株的MDA含量显著低于野生型烟草植株。
4. H2O2含量测定
植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。因此，H2O2的含量越高，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao.
AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stresstolerance in transgenic
Arabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测烟草植株的H2O2含量。烟草植株为空白对照中处理2 w的烟草植株、盐胁迫2 w的烟草植株、干旱胁迫2 w的烟草植株。实验需重复三次，结果取平均值。
烟草植株H2O2含量测定实验结果见图7中D（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因烟草#5植株、#9植株和#10植株的H2O2含量显著低于野生型烟草植株。
超氧化物歧化酶（SOD）活性可以作为植物抗逆性的一项生理生化指标。SOD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao.
AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stresstolerance in transgenic
Arabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测烟草植株的SOD活性。烟草植株为空白对照中处理2 w的烟草植株、盐胁迫2 w的烟草植株、干旱胁迫2 w的烟草植株。实验需重复三次，结果取平均值。
烟草植株SOD活性测定实验结果见图7中E（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因烟草#5植株、#9植株和#10植株的SOD活性显著高于野生型烟草植株。
过氧化物酶（POD）活性可以作为植物抗逆性的一项生理生化指标。POD的活性越低，植物遭受逆境伤害的程度越大。
测定方法参考文献【Feibing Wang, Weili Kong, Gary Wong, Lifeng Fu, RihePeng, Zhenjun Li, Quanhong Yao.
AtMYB12 regulates flavonoids accumulation andabiotic stresstolerance in transgenic
Arabidopsis thaliana. MolecularGenetics and Genomics, 2016, 291:1545-1559】，检测烟草植株的POD活性。烟草植株为空白对照中处理2 w的烟草植株、盐胁迫2 w的烟草植株、干旱胁迫2 w的烟草植株。实验需重复三次，结果取平均值。
烟草植株POD活性测定实验结果见图7中F（Normal为空白对照，Salt stress为盐胁迫，Drought stress为干旱胁迫）。结果表明，转基因烟草#5植株、#9植株和#10植株的POD活性显著高于野生型烟草植株。
生理生化指标的测定结果表明，过表达
GmMas基因显著提高转基因烟草植株的耐盐性和抗旱性。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
Claims (10)
1.蛋白质，为如下（a1）或（a2）或（a3）任一所述的蛋白质：
（a1）氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示的蛋白质；
（a2）SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列的N端或/和C端连接蛋白标签得到的融合蛋白；
（a3）将SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与（a1）所示的蛋白质具有90％以上的同一性且功能相同的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白质的相关生物材料，其特征在于：该相关生物材料为如下（c1）-（c10）中任一所示：
（c1）编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子；
（c2）含有（c1）所述核酸分子的表达盒；
（c3）含有（c1）所述核酸分子的重组载体、或含有（c2）所述表达盒的重组载体；
（c4）含有（c1）所述核酸分子的重组微生物、或含有（c2）所述表达盒的重组微生物、或含有（c3）所述重组载体的重组微生物；
（c5）含有（c1）所述核酸分子的转基因植物细胞系、或含有（c2）所述表达盒的转基因植物细胞系、或含有（c3）所述重组载体的转基因植物细胞系；
（c6）含有（c1）所述核酸分子的转基因植物组织、或含有（c2）所述表达盒的转基因植物组织、或含有（c3）所述重组载体的转基因植物组织；
（c7）含有（c1）所述核酸分子的转基因植物器官、或含有（c2）所述表达盒的转基因植物器官、或含有（c3）所述重组载体的转基因植物器官；
（c8）含有（c1）所述核酸分子的转基因植株、或含有（c2）所述表达盒的转基因植株、或含有（c3）所述重组载体的转基因植株；
（c9）由（c8）所述转基因植株的可再生细胞产生的组织培养物；
（c10）由（c9）所述组织培养物产生的原生质体。
3.根据权利要求2所述的相关生物材料，其特征在于：编码权利要求1中所述蛋白质的核酸分子为如下（d1）或（d2）或（d3）中的任意一种：
（d1）如SEQ ID NO. 1所示的DNA分子；
（d2）编码序列为SEQ ID NO. 1所示的DNA分子；
（d3）在严格条件下与（d1）或（d2）限定的DNA分子杂交，且编码权利要求1中所述的蛋白质的DNA分子。
4.权利要求1所述的蛋白质或权利要求2或3所述的相关生物材料在下述任（b1）-（b24）中至少一种的应用：
（b1）提高植物耐盐性；
（b2）制备提高植物耐盐性的产品；
（b3）提高植物抗旱性；
（b4）制备提高植物抗旱性的产品；
（b5）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物的生根情况；
（b6）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物的生根情况的产品；
（b7）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物的长势；
（b8）制备干旱和/或盐胁迫条件下植物的长势的产品；
（b9）制备干旱和/或盐胁迫条件下植物的鲜重；
（b10）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物的鲜重的产品；
（b11）制备干旱和/或盐胁迫条件下植物的干重；
（b12）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物的干重的产品；
（b13）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物脱落酸含量；
（b14）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物脱落酸含量的产品；
（b15）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物脯氨酸含量；
（b16）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物脯氨酸含量的产品；
（b17）降低干旱和/或盐胁迫条件下植物丙二醛含量；
（b18）制备降低干旱和/或盐胁迫条件下植物丙二醛含量的产品；
（b19）降低干旱和/或盐胁迫条件下植物H2O2含量；
（b20）制备降低干旱和/或盐胁迫条件下植物H2O2含量的产品；
（b21）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物SOD活性；
（b22）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物SOD活性的产品；
（b23）提高干旱和/或盐胁迫条件下植物POD活性；
（b24）制备提高干旱和/或盐胁迫条件下植物POD活性的产品。
5.权利要求1中所述的蛋白质或权利要求2或3中所述的相关生物材料在抗旱性与耐盐性高的植物育种或提高植物抗旱性与耐盐性中的应用。
6.一种培育抗旱性与耐盐性高的转基因植物的方法，其特征在于：该方法为提高目的植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达量和/或所述蛋白质的含量和/或所述蛋白质的活性，得到转基因植物；所述转基因植物的抗旱性与耐盐性高于所述的目的植物。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述提高目的植物中权利要求1所述蛋白质的编码基因的表达量和/或所述蛋白质的含量和/或所述蛋白质的活性的方法为在目的植物中表达或过表达权利要求1所述蛋白质。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述表达或过表达的方法为将权利要求1所述蛋白质的编码基因导入目的植物。
9. 根据权利要求8所述的方法，其特征在于：权利要求1所述蛋白质的编码基因的核苷酸序列是如SEQ ID NO.1所示的DNA分子。
10.根据权利要求4或5中所述的应用，或权利要求6-9中任一所述的方法，其特征在于：所述的植物是如下（e1）至（e5）中的任一种：
（e1）双子叶植物；
（e2）豆科植物；
（e3）茄科植物；
（e4）大豆；
（e5）烟草。
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