CN115927445A

CN115927445A - OsPIL15基因在调控水稻节水抗旱中的应用

Info

Publication number: CN115927445A
Application number: CN202210818456.3A
Authority: CN
Inventors: 高勇; 李倩; 张冬平; 周露艳; 陈亚楠
Original assignee: Yangzhou University
Current assignee: Yangzhou University
Priority date: 2022-07-13
Filing date: 2022-07-13
Publication date: 2023-04-07

Abstract

本发明属于农业生物技术领域，公开了OsPIL15基因或其蛋白在调控水稻节水抗旱中的用途。本发明通过构建OsPIL15‑OE过表达和敲除载体，筛选获得OsPIL15过表达和敲除转基因株系。干旱胁迫后，较野生型和敲除株系，过表达株系表现出良好的节水抗旱表型，表明OsPIL15基因在提高水稻节水抗旱性上具有潜在的应用价值，对节水抗旱的遗传改良及发展节水抗旱作物新品种具有重要的理论和实际意义。

Description

OsPIL15基因在调控水稻节水抗旱中的应用

技术领域

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及OsPIL15基因或其蛋白在调控水稻节水抗旱中的应用。

背景技术

全球气候变暖和水资源短缺导致的干旱是目前农业生产面临的主要问题，水稻作为主要的粮食作物之一和农业用水的第一大户，其节水和抗旱问题一直是社会关注的重点。节水抗旱是生物节水和抗旱研究的结合，指植物在适度干旱缺水时能通过节水，保存水分，避免或延迟植株遭受干旱，保证植株正常生长，复水后产量不受影响。

相较于经典抗旱研究，节水抗旱概念提出较晚。国际上从1972年提出抗旱性划分，到1999年才开始联合评价抗旱与水分利用效率，直至2004年才提出节水与抗旱。植物的节水抗旱性状非常复杂，涉及多个重要的生理范畴，目前节水抗旱研究中超过98％的文章集中在栽培和育种领域，这些研究改进了节水抗旱栽培技术，获得了节水抗旱作物品种；但在节水抗旱基因的挖掘，基因功能鉴定、机理和分子机制方面的研究还很少，虽然发现与蒸腾相关基因，但是并没有系统探索基因的节水抗旱功能。

OsPIL15基因，是水稻中光敏色素互作因子(PIF)家族的一员，由Nakamura等人(2007)通过同源性分析在水稻基因组中鉴定获得。目前已知该基因参与到水稻的籽粒、分蘖调控和耐盐性等方面，未见其与水稻节水抗旱相关的报道。

发明内容

本发明的目的在于提供水稻OsPIL15基因的新用途，水稻中OsPIL15基因过表达后，节水抗旱性显著增加，对节水抗旱的遗传改良及发展节水抗旱作物新品种具有重要的理论和实际意义。

本发明提供了水稻OsPIL15基因或其蛋白在调控水稻节水抗旱中的应用，OsPIL15基因的序列如SEQ ID NO.7所示，OsPIL15蛋白的序列如SEQ ID NO.8所示。

进一步的，所述调控水稻抗旱能力为提高水稻节水抗旱能力。

本发明还提供了一种提高水稻节水抗旱的方法，过表达水稻OsPIL15基因的表达，和/或增加OsPIL15基因编码蛋白的活性。

进一步的，所述方法使用的试剂为过表达OsPIL15基因的试剂、使OsPIL15基因过表达的试剂或OsPIL15基因的增强剂。

进一步的，所述试剂包含SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示的核苷酸序列。

SEQ ID NO.11所示的正向引物：5’-GAAGATCTATGTCCGACGGCAAC GAC-3’。

SEQ ID NO.12所示的反向引物：5’-GGACTAGTTTATGTTTCAGCCCCA TCT-3’。

其中，它是利用过表达系统过量表达OsPIL15基因，步骤如下：

a、合成SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所述的序列，通过PCR获得含有OsPIL15基因的目的序列；

b、插入到pCAMBIA1305表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体；

c、将步骤b的重组表达载体转化水稻，鉴定并确认水稻的OsPIL15基因过表达，即可。

进一步的，构建重组表达载体采用的gDNA靶点序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，所述重组表达载体的测序引物如SEQ ID NO.4所示。

进一步的，OsPIL15基因的检测引物序列如下：

F:5’-GTTGTGATTGGAGGCTGGCA-3’；

R:5’-TTTTGTGTGTGCAGGTCCGA-3’。

进一步的，OsPIL15基因过表达的检测引物为：

F:5’-:CACCGATGGCTCATTTCC-3’；

R:5’-TCGTTGGGGTCTTTGCTCAG-3’。

本发明还提供了一种获得节水抗旱水稻的方法，过表达水稻OsPIL15基因，和/或减少增加OsPIL15基因编码蛋白的活性，获得节水抗旱水稻植株。

其中，水稻育种时，至少一个亲本为权利要求6的节水抗旱水稻。

本发明还提供了OsPIL15基因或其蛋白在筛选节水抗旱水稻中的用途。

本发明还提供了一种筛选节水抗旱水稻的试剂盒，它包括任选的用于检测OsPIL15基因或其蛋白表达水平的试剂。

本发明还提供了一种筛选节水抗旱水稻的方法，包括以下步骤：

a、检测待筛选水稻的OsPIL15基因表达量、OsPIL15蛋白的表达量，和/或OsPIL15蛋白的活性；

b、选出OsPIL15基因过量表达，OsPIL15蛋白过量表达，和/或OsPIL15基因蛋白活性增强的水稻植株。

有益效果

本发明提供了OsPIL15基因在调控水稻节水抗旱中的应用。本发明通过构建OsPIL15-OE过表达载体和OsPIL15-KO敲除载体，利用农杆菌介导法导入粳稻品种日本晴，筛选获得OsPIL15过表达转基因株系和敲除突变体；并通过试验证明水稻中OsPIL15基因过表达后，节水抗旱性显著增加，对节水抗旱的遗传改良及发展节水抗旱作物新品种具有重要的理论和实际意义，相对于现有节水抗旱作物，本发明在节水抗旱基因的挖掘，功能鉴定、机理和分子机制方面具有更好的应用前景。

附图说明

图1OsPIL15敲除水稻材料的电泳图：M：Marker DL2501；1-9:T₂代纯系鉴定PCR产物条带。

图2OsPIL15过表达水稻材料的电泳图：M：Marker DL2504；1-12:T₂代纯系鉴定PCR产物条带；13：日本晴DNA阴性对照；14：质粒阳性对照。

图3不同水稻株系的节水抗旱表型。

图4不同水稻株系的干旱胁迫后存活率。

具体实施方式

下面以实施例作进一步说明，但本发明不局限于这些实施例。

本发明所用的试剂及仪器如下：

(1)菌株和载体：

大肠杆菌DH5α，农杆菌GV3101，CRISPR/Cas9载体BGK03，均购自杭州百格生物技术有限公司。

(2)化学试剂、酶制剂及试剂盒：

诺唯赞生物科技有限公司：高保真DNA聚合酶(货号：P501-d1)；

上海捷瑞生物工程有限公司：DL 2501marker、DL 2504marker；

北京索莱宝科技有限公司：西班牙琼脂糖(货号：YZQZT)；

南京金斯瑞生物科技有限公司：DNA测序；

天根生化科技有限公司：植物基因组DNA提取试剂盒(货号：DP305-03)；康为世纪生物科技公司：Gel Extraction Kit(货号：CW2302M)。

(3)主要实验仪器：

eppendorf系列移液器；applied biosystems系列PCR仪；Tanon 2500凝胶成像系统。

(4)农杆菌转化过程所用各培养基组份如下：

实施例1OsPIL15敲除水稻材料的获得

一.构建靶向OsPIL15基因的sgRNA载体

根据Genbank公布的OsPIL15序列，选择一段23bp的序列(5’-GTGATGATGACACCGTTCCGTGG-3’)(SEQ ID NO.1)作为CRISPR/Cas9敲除的靶位点，该序列3’端PAM序列为TGG。

CRISPR/Cas9表达载体BGK03的靶序列由水稻U6启动子驱动，编码Cas9蛋白基因由加强型玉米(UBI)启动子驱动。将合成靶位点的核苷酸序列与BGK03载体相连命名为BGK03-OsPIL15。

BGK03-OsPIL15重组载体的构建使用百格公司提供的CRISPR/Cas构建试剂盒来完成。具体步骤如下：

(1)设计gDNA靶点序列：5’-GTGATGATGACACCGTTCCGTGG-3’(SEQ ID NO.1)，其中TGG为PAM序列。之后按要求合成Oligo序列:

UP：5’-TGTGTGGTGATGATGACACCGTTCCG-3’(SEQ ID NO.2)

LOW:5’-AAACCGGAACGGTGTCATCATCACCA-3(SEQ ID NO.3)。

(2)将合成的Oligo序列加水溶解至10μl，按Buffer Aneal 18μl、UP Oligo1μl、Low Oligo 1μl反应体系混合后，95℃加热3分钟，然后以约0.2℃/秒缓慢降至20℃。

(3)将Oligo二聚体构建至CRISPR/Cas9载体。配置反应体系：H₂O 6μl、CRISPR/Cas9 Vector 2μl、Oligo二聚体1μl、Enzyme Mix 1μl，在冰上混合各个组分，混匀后室温(20℃)反应1小时，即可得到重组载体。

(4)将得到的重组载体转化大肠杆菌DH5α，取5μl反应液加到至少50μl的感受态细胞中，混匀后冰浴静置30分钟(期间切勿晃动，严格保持静置)；轻轻取出，42℃热激60秒，立即置于冰上2分钟；加入500μl SOB/LB，37℃ 200rpm培养1小时；取菌液涂布于含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置过夜培养。之后挑取单菌落扩摇提质粒并测序(测序引物为：5’-CCCAGTCACGACGTTGTAAA-3’，SEQ ID NO.4)，验证构建的重组载体。获得测序正确的BGK03-OsPIL15重组载体。

二.敲除水稻中的OsPIL15

首先将验证后的BGK03-OsPIL15重组载体转化农杆菌GV3101，方法如下：

(1)取感受态农杆菌细胞200μl，加入质粒2-5μl后，于冰上放置10min；

(2)从冰中取出后立即置于液氮中，速冻10min；

(3)拿出后置于37℃，300rpm，10min；

(4)加入800μl LB液体培养基，28℃，350rpm，3h；

(5)6000rpm离心，吸去上清800μl，涂板；

(6)于28℃培养48h；

(7)挑取转化子，提取质粒BGK03-OsPIL15，用BGK03序列引物进行PCR鉴定，将鉴定的阳性条带送去测序，确保无误后可用于转化水稻。

再用常规的农杆菌浸染法，将验证过的含重组载体的农杆菌GV3101转化水稻日本晴品种，获得T1代敲除株系的幼苗。

三、OsPIL15敲除水稻材料的鉴定以及敲除位点分析

本发明根据OsPIL15基因的敲除靶位点序列设计如下检测引物，扩增大小为474bp：

F:5’-GTTGTGATTGGAGGCTGGCA-3’(SEQ ID NO.5)，

R:5’-TTTTGTGTGTGCAGGTCCGA-3’(SEQ ID NO.6)。

采用天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取OsPIL15敲除植株的DNA，具体步骤如下：

1.取植物新鲜组织约100mg或干重组织30mg，加入液氮充分碾磨。

2.将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700μl 65℃预热缓冲液GP1的离心管中(实验前在预热的GP1中加入巯基乙醇，使其终浓度为0.1％)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65℃水浴20min，水浴过程中颠倒离心管以混合样品数次。

3.加入700μl氯仿，充分混匀，12,000rpm(～13,400×g)离心5min。注：若提取富含多酚或淀粉的植物组织，可在第3步前，用酚:氯仿/1:1进行等体积抽提。

4.小心地将上一步所得上层水相转入一个新的离心管中，加入700μl缓冲液GP2，充分混匀。

5.将混匀的液体转入吸附柱CB3中，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，弃掉废液。(吸附柱容积为700μl左右，可分次加入离心)

6.向吸附柱CB3中加入500μl缓冲液GD(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

7.向吸附柱CB3中加入600μl漂洗液PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，12,000rpm(～13,400×g)离心30sec，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

8.重复操作步骤7。

9.将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。注意：这一步的目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，漂洗液中乙醇的残留会影响后续的酶反应(酶切、PCR等)实验。

10.将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μl洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm(～13,400×g)离心2min，将溶液收集到离心管中，即可获得基因组DNA。

对获得的基因组DNA用检测引物进行PCR扩增，PCR扩增的体系为：

Super-Fidelity DNA Polymerase 0.5μl，5×SF Buffer(with 10mMMgSO4)5μl，5×PCR Enhancer 3μl，dNTP Mix(10mM each)0.5μl，上下游引物各1μl，DNA 1μl。PCR反应程序为：95℃5min；95℃30sec，58℃30sec，72℃1min，40个循环；72℃5min，16℃保存。

将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(图1)，并切胶回收，送测序。

将PCR产物测序与敲除位点用软件SnapGene进行序列比对，若比对结果为双峰且有突变则为杂合突变，还需进行T1代的筛选(筛选方法与T0代的筛选过程相同)，若比对结果是单峰且有突变位点则为纯合突变。

经鉴定得到两个纯合的敲除株系，分别命名为15-2与15-3。其中，15-2株系为起始密码子后291bp位点发生缺失突变，15-3株系为起始密码子后289bp位点发生大片段缺失突变，突变后均导致基因编码的蛋白质提前终止，其突变位点示意如下：

WT：ATGATGACACCGTTCCGTGGATCCATT

15-2：ATGATGACACCGT-CCGTGGATCCATT

15-3：ATGATGACACC-----------------ATT

各自序列如下：

WT中OsPIL15全序列为：(SEQ ID NO.7)

ATGTCCGACGGCAACGACTTCGCCGAGCTGCTGTGGGAGAACGGCCAGGCGGTGGTGCACGGGAGGAAGAAGCACCCGCAGCCGGCCTTCCCGCCGTTCGGCTTCTTCGGTGGCACCGGCGGTGGCGGCGGCGGCAGCAGTAGTAGAGCCCAGGAGAGGCAGCCCGGCGGCATCGATGCGTTCGCCAAGGTGGGGGGCGGCTTCGGCGCCTTGGGCATGGCTCCGGCGGTGCACGACTTCGCTTCTGGCTTCGGCGCCACCACGCAGGACAACGGTGATGATGACACCGTTCCGTGGATCCATTACCCCATAATTGACGATGAAGACGCCGCCGCCCCTGCTGCTCTCGCAGCAGCGGACTATGGCTCCGACTTCTTCTCCGAGCTCCAGGCGGCGGCGGCTGCCGCGGCGGCCGCCGCGCCGCCGACCGATCTCGCCTCTCTGCCAGCCTCCAATCACAACGGCGCCACCAATAACAGAAATGCTCCGGTTGCCACCACCACCACCAGGGAACCCTCCAAGGAAAGCCACGGCGGCCTGTCGGTTCCCACCACCCGAGCCGAGCCGCAGCCGCAGCCACAGCTCGCCGCAGCCAAGCTGCCTCGGTCGAGCGGCAGCGGCGGCGGCGAGGGCGTGATGAACTTCTCGCTCTTCTCCCGCCCGGCCGTCCTGGCGAGGGCGACGCTGGAGAGCGCGCAGAGGACGCAGGGCACCGACAATAAGGCGTCCAATGTCACCGCGAGCAACCGCGTCGAGTCGACGGTCGTGCAGACGGCGAGCGGGCCAAGGAGCGCACCGGCGTTCGCCGATCAGAGGGCGGCGGCGTGGCCGCCGCAGCCGAAGGAGATGCCGTTCGCGTCCACGGCAGCCGCTCCCATGGCCCCGGCCGTTAACCTGCACCACGAGATGGGCCGTGACAGGGCAGGCCGAACCATGCCTGTCCACAAAACCGAGGCGAGGAAGGCACCTGAGGCCACGGTCGCGACATCGTCGGTGTGCTCCGGCAACGGAGCTGGGAGTGACGAGCTGTGGCGCCAGCAGAAGCGGAAGTGCCAGGCCCAGGCAGAGTGCTCAGCTAGCCAAGACGATGATCTTGACGATGAACCTGGAGTATTGAGAAAATCTGGAACCAGGAGCACGAAACGCAGCCGCACAGCTGAGGTTCACAATTTATCAGAAAGGAGGAGAAGGGACAGGATCAATGAAAAGATGCGCGCTCTGCAAGAACTCATTCCCAACTGCAACAAGATTGATAAAGCCTCGATGCTGGATGAAGCTATAGAGTACCTCAAAACCCTTCAGCTTCAAGTACAGATGATGTCCATGGGAACTGGGCTGTGCATTCCTCCAATGCTATTACCAACAGCCATGCAGCACTTGCAAATTCCACCGATGGCTCATTTCCCTCATCTCGGCATGGGATTGGGGTACGGGATGGGCGTCTTCGACATGAGCAACACTGGAGCACTTCAGATGCCACCCATGCCTGGTGCTCACTTTCCCTGCCCAATGATCCCAGGTGCGTCACCACAAGGTCTTGGGATCCCTGGCACAAGCACCATGCCAATGTTTGGGGTTCCTGGGCAAACAATTCCTTCGTCAGCGTCTAGTGTACCACCATTTGCATCTTTGGCTGGTCTTCCTGTTAGGCCAAGCGGGGTCCCTCAAGTATCAGGCGCCATGGCTAACATGGTGCAAGACCAGCAACAAGGCATAGCGAATCAACAGCAGCAATGTCTGAACAAGGAAGCTATACAGGGAGCAAATCCAGGTGATTCACAAATGCAGATCATCATGCAGGGTGACAACGAGAATTTTAGGATACCCTCTTCAGCCCAAACAAAAAGCAGTCAATTTTCAGATGGTACCGGCAAGGGGACCAACGCTAGAGAGAGAGATGGGGCTGAAACATAA

WT中OsPIL15蛋白序列为：(SEQ ID NO.8)

MSDGNDFAELLWENGQAVVHGRKKHPQPAFPPFGFFGGTGGGGGGSSSRAQERQPGGIDAFAKVGGGFGALGMAPAVHDFASGFGATTQDNGDDDTVPWIHYPIIDDEDAAAPAALAAADYGSDFFSELQAAAAAAAAAAPPTDLASLPASNHNGATNNRNAPVATTTTREPSKESHGGLSVPTTRAEPQPQPQLAAAKLPRSSGSGGGEGVMNFSLFSRPAVLARATLESAQRTQGTDNKASNVTASNRVESTVVQTASGPRSAPAFADQRAAAWPPQPKEMPFASTAAAPMAPAVNLHHEMGRDRAGRTMPVHKTEARKAPEATVATSSVCSGNGAGSDELWRQQKRKCQAQAECSASQDDDLDDEPGVLRKSGTRSTKRSRTAEVHNLSERRRRDRINEKMRALQELIPNCNKIDKASMLDEAIEYLKTLQLQVQMMSMGTGLCIPPMLLPTAMQHLQIPPMAHFPHLGMGLGYGMGVFDMSNTGALQMPPMPGAHFPCPMIPGASPQGLGIPGTSTMPMFGVPGQTIPSSASSVPPFASLAGLPVRPSGVPQVSGAMANMVQDQQQGIANQQQQCLNKEAIQGANPGDSQMQIIMQGDNENFRIPSSAQTKSSQFSDGTGKGTNARERDGAET*

15-2株系基因组中OsPIL15全序列为：(SEQ ID NO.9)

ATGTCCGACGGCAACGACTTCGCCGAGCTGCTGTGGGAGAACGGCCAGGCGGTGGTGCACGGGAGGAAGAAGCACCCGCAGCCGGCCTTCCCGCCGTTCGGCTTCTTCGGTGGCACCGGCGGTGGCGGCGGCGGCAGCAGTAGTAGAGCCCAGGAGAGGCAGCCCGGCGGCATCGATGCGTTCGCCAAGGTGGGGGGCGGCTTCGGCGCCTTGGGCATGGCTCCGGCGGTGCACGACTTCGCTTCTGGCTTCGGCGCCACCACGCAGGACAACGGTGATGATGACACCGT-CCGTGGATCCATTACCCCATAATTGACGATGAAGACGCCGCCGCCCCTGCTGCTCTCGCAGCAGCGGACTATGGCTCCGACTTCTTCTCCGAGCTCCAGGCGGCGGCGGCTGCCGCGGCGGCCGCCGCGCCGCCGACCGATCTCGCCTCTCTGCCAGCCTCCAATCACAACGGCGCCACCAATAACAGAAATGCTCCGGTTGCCACCACCACCACCAGGGAACCCTCCAAGGAAAGCCACGGCGGCCTGTCGGTTCCCACCACCCGAGCCGAGCCGCAGCCGCAGCCACAGCTCGCCGCAGCCAAGCTGCCTCGGTCGAGCGGCAGCGGCGGCGGCGAGGGCGTGATGAACTTCTCGCTCTTCTCCCGCCCGGCCGTCCTGGCGAGGGCGACGCTGGAGAGCGCGCAGAGGACGCAGGGCACCGACAATAAGGCGTCCAATGTCACCGCGAGCAACCGCGTCGAGTCGACGGTCGTGCAGACGGCGAGCGGGCCAAGGAGCGCACCGGCGTTCGCCGATCAGAGGGCGGCGGCGTGGCCGCCGCAGCCGAAGGAGATGCCGTTCGCGTCCACGGCAGCCGCTCCCATGGCCCCGGCCGTTAACCTGCACCACGAGATGGGCCGTGACAGGGCAGGCCGAACCATGCCTGTCCACAAAACCGAGGCGAGGAAGGCACCTGAGGCCACGGTCGCGACATCGTCGGTGTGCTCCGGCAACGGAGCTGGGAGTGACGAGCTGTGGCGCCAGCAGAAGCGGAAGTGCCAGGCCCAGGCAGAGTGCTCAGCTAGCCAAGACGATGATCTTGACGATGAACCTGGAGTATTGAGAAAATCTGGAACCAGGAGCACGAAACGCAGCCGCACAGCTGAGGTTCACAATTTATCAGAAAGGAGGAGAAGGGACAGGATCAATGAAAAGATGCGCGCTCTGCAAGAACTCATTCCCAACTGCAACAAGATTGATAAAGCCTCGATGCTGGATGAAGCTATAGAGTACCTCAAAACCCTTCAGCTTCAAGTACAGATGATGTCCATGGGAACTGGGCTGTGCATTCCTCCAATGCTATTACCAACAGCCATGCAGCACTTGCAAATTCCACCGATGGCTCATTTCCCTCATCTCGGCATGGGATTGGGGTACGGGATGGGCGTCTTCGACATGAGCAACACTGGAGCACTTCAGATGCCACCCATGCCTGGTGCTCACTTTCCCTGCCCAATGATCCCAGGTGCGTCACCACAAGGTCTTGGGATCCCTGGCACAAGCACCATGCCAATGTTTGGGGTTCCTGGGCAAACAATTCCTTCGTCAGCGTCTAGTGTACCACCATTTGCATCTTTGGCTGGTCTTCCTGTTAGGCCAAGCGGGGTCCCTCAAGTATCAGGCGCCATGGCTAACATGGTGCAAGACCAGCAACAAGGCATAGCGAATCAACAGCAGCAATGTCTGAACAAGGAAGCTATACAGGGAGCAAATCCAGGTGATTCACAAATGCAGATCATCATGCAGGGTGACAACGAGAATTTTAGGATACCCTCTTCAGCCCAAACAAAAAGCAGTCAATTTTCAGATGGTACCGGCAAGGGGACCAACGCTAGAGAGAGAGATGGGGCTGAAACATAA

15-3株系基因组中OsPIL15全序列为：(SEQ ID NO.10)

ATGTCCGACGGCAACGACTTCGCCGAGCTGCTGTGGGAGAACGGCCAGGCGGTGGTGCACGGGAGGAAGAAGCACCCGCAGCCGGCCTTCCCGCCGTTCGGCTTCTTCGGTGGCACCGGCGGTGGCGGCGGCGGCAGCAGTAGTAGAGCCCAGGAGAGGCAGCCCGGCGGCATCGATGCGTTCGCCAAGGTGGGGGGCGGCTTCGGCGCCTTGGGCATGGCTCCGGCGGTGCACGACTTCGCTTCTGGCTTCGGCGCCACCACGCAGGACAACGGTGATGATGACACC-----------------ATTACCCCATAATTGACGATGAAGACGCCGCCGCCCCTGCTGCTCTCGCAGCAGCGGACTATGGCTCCGACTTCTTCTCCGAGCTCCAGGCGGCGGCGGCTGCCGCGGCGGCCGCCGCGCCGCCGACCGATCTCGCCTCTCTGCCAGCCTCCAATCACAACGGCGCCACCAATAACAGAAATGCTCCGGTTGCCACCACCACCACCAGGGAACCCTCCAAGGAAAGCCACGGCGGCCTGTCGGTTCCCACCACCCGAGCCGAGCCGCAGCCGCAGCCACAGCTCGCCGCAGCCAAGCTGCCTCGGTCGAGCGGCAGCGGCGGCGGCGAGGGCGTGATGAACTTCTCGCTCTTCTCCCGCCCGGCCGTCCTGGCGAGGGCGACGCTGGAGAGCGCGCAGAGGACGCAGGGCACCGACAATAAGGCGTCCAATGTCACCGCGAGCAACCGCGTCGAGTCGACGGTCGTGCAGACGGCGAGCGGGCCAAGGAGCGCACCGGCGTTCGCCGATCAGAGGGCGGCGGCGTGGCCGCCGCAGCCGAAGGAGATGCCGTTCGCGTCCACGGCAGCCGCTCCCATGGCCCCGGCCGTTAACCTGCACCACGAGATGGGCCGTGACAGGGCAGGCCGAACCATGCCTGTCCACAAAACCGAGGCGAGGAAGGCACCTGAGGCCACGGTCGCGACATCGTCGGTGTGCTCCGGCAACGGAGCTGGGAGTGACGAGCTGTGGCGCCAGCAGAAGCGGAAGTGCCAGGCCCAGGCAGAGTGCTCAGCTAGCCAAGACGATGATCTTGACGATGAACCTGGAGTATTGAGAAAATCTGGAACCAGGAGCACGAAACGCAGCCGCACAGCTGAGGTTCACAATTTATCAGAAAGGAGGAGAAGGGACAGGATCAATGAAAAGATGCGCGCTCTGCAAGAACTCATTCCCAACTGCAACAAGATTGATAAAGCCTCGATGCTGGATGAAGCTATAGAGTACCTCAAAACCCTTCAGCTTCAAGTACAGATGATGTCCATGGGAACTGGGCTGTGCATTCCTCCAATGCTATTACCAACAGCCATGCAGCACTTGCAAATTCCACCGATGGCTCATTTCCCTCATCTCGGCATGGGATTGGGGTACGGGATGGGCGTCTTCGACATGAGCAACACTGGAGCACTTCAGATGCCACCCATGCCTGGTGCTCACTTTCCCTGCCCAATGATCCCAGGTGCGTCACCACAAGGTCTTGGGATCCCTGGCACAAGCACCATGCCAATGTTTGGGGTTCCTGGGCAAACAATTCCTTCGTCAGCGTCTAGTGTACCACCATTTGCATCTTTGGCTGGTCTTCCTGTTAGGCCAAGCGGGGTCCCTCAAGTATCAGGCGCCATGGCTAACATGGTGCAAGACCAGCAACAAGGCATAGCGAATCAACAGCAGCAATGTCTGAACAAGGAAGCTATACAGGGAGCAAATCCAGGTGATTCACAAATGCAGATCATCATGCAGGGTGACAACGAGAATTTTAGGATACCCTCTTCAGCCCAAACAAAAAGCAGTCAATTTTCAGATGGTACCGGCAAGGGGACCAACGCTAGAGAGAGAGATGGGGCTGAAACATAA

实施例2OsPIL15过表达水稻材料的获得

一、OsPIL15基因的克隆及过表达载体构建

首先根据OsPIL15基因的序列设计如下引物：

F：5’-GAAGATCTATGTCCGACGGCAACGAC-3’(SEQ ID NO.11)，

R:5’-GGACTAGTTTATGTTTCAGCCCCATCT-3’(SEQ ID NO.12)。

利用RT-PCR技术从水稻日本晴总cDNA中扩增得到OsPIL15基因全长cDNA(开放阅读框部分)，经测序表明为PIFs家族转录因子，OsPIL15的全长cDNA为1914bp(SEQ IDNO.7)，编码一个由638个氨基酸组成的蛋白。具体步骤如下：

取四叶期日本晴水稻幼苗，液氮速冻，放置-70℃冰箱中保存以备提取总RNA。总RNA抽提采用TaKaRa公司的RNAiso Plus试剂盒提取.水稻cDNA的合成按Fermentas公司的Revert Aid TM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书操作进行第一链合成。

以上述试剂盒合成的cDNA第一链为扩增模板，以设计的F和R引物，利用RT-PCR进行cDNA扩增，扩增条件为：94℃预热5min；94℃,40s,57℃,40s,72℃,2min,共35个循环；72℃,10min。PCR结束后进行电泳分析，采用百泰克公司的DNA回收试剂盒回收约1500bp的扩增片段。将扩增片段连接到TaKaRa公司的pMD19-T载体，转化感受态细胞，挑取白色菌落进行菌落PCR以鉴定阳性克隆，将阳性克隆送到华大公司测序。

根据序列测序结果，到NCBI数据库里进行序列比对，发现克隆到的基因序列为OsPIL15基因。

然后将含OsPIL15基因的质粒经BglII+SpeI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收1914bp的OsPIL15 DNA片段，将此片段与相应酶切的pCAMBIA1305载体相连，获得的载体命名为pCAMBIA1305-OsPIL15。

二、OsPIL15过表达载体经农杆菌介导转化水稻

农杆菌菌株为根癌农杆菌EHA105菌株。质粒pCAMBIA1305-OsPIL15经电击法导入农杆菌中。挑取单菌到25ml YEB培养基(50mg/l利福平)培养过夜，取5ml菌液转接到100mlYEB培养基(50mg/l利福平)，培养至OD600＝0.7-0.8，菌液冰上放置10min，5000rpm离心10min，4℃，收集菌体，加入100ml无菌双蒸水清洗两次。加入4ml 10％甘油悬浮菌体，转到50ml离心管。5500rpm离心10min，4℃。收集菌体，加入500μl 10％甘油悬浮菌体，转到1.5ml离心管。取70μl感受态细胞，加入1μl重组质粒pCAMBIA1305-OsPIL15。用去头的枪头混匀，转到0.1cm电击杯中。电击参数：200Ω，1.7KV，2.5F，电击后立即加入800μl SOC培养液。培养1小时后，取100μl涂抗性板筛选转化子，28℃培养。

植物转化采用农杆菌介导法取在超低温保存的根癌农杆菌菌种于含50mg/L卡那霉素(Kanamycin，Km)的LB固体培养基上活化后，挑取单菌落接种到3ml含50mg/L Km的LB液体培养基中，于28℃振摇培养过夜；再按1/100(v/v)接种量接种于AB液体培养基中。当培养至对数生长期时，离心收集农杆菌并重悬于10-15ml AAM(含100-400μmol/l乙酰丁香酮)液体培养基中，立即用于水稻受体材料的共培养。将已培养好的未成熟胚或成熟胚来源的初生愈伤组织浸泡于此农杆菌菌液中。侵染20min后将愈伤组织放在无菌滤纸上吸干过多的菌液，然后将愈伤组织转入N6D2C培养基上于28℃黑暗条件下共培养3天。将经农杆菌浸染后的愈伤组织转入含25mg/l潮霉素和600mg/l头孢霉素的选择培养基CCD2S1培养基上进行第一轮筛选培养；两周后将长出的新鲜抗性愈伤组织再转入含50mg/l潮霉素和300mg/l头孢霉素的选择培养基CCD2S2上继续筛选2代(2周/代)。愈伤组织经过连续3代筛选后，选择生长旺盛的新鲜抗性愈伤组织转移到预分化培养基MSPR上进行预分化。2周后再将预分化的抗性愈伤组织转移到分化培养基MSR上，于12hr光照/天、28℃条件下进行分化。再生的小苗在1/2MS0培养基上生根壮苗，最后移到田间或温室栽培。转基因水稻按常规方法进行栽培管理。利用50mg/mL潮霉素对转化植株叶片进行初筛，再通过PCR进一步鉴定，获得T₀代转基因植株，用同样的方法筛选获得T₁代转基因阳性植株及T₂代转基因纯合材料。

三、OsPIL15过表达水稻株系的鉴定

采用天根公司的植物基因组DNA提取试剂盒提取OsPIL15过表达植株的DNA。取1μl转基因水稻DNA作为模板，以检测引物F:5’-:CACCGATGGCTCATTTCC-3’(SEQ ID NO.13)，

R:5’-TCGTTGGGGTCTTTGCTCAG-3’(SEQ ID NO.14)进行PCR扩增，

扩增条件为：94℃预热5min；94℃,40s,58℃,40s,72℃,2min，共35个循环；72℃,10min。

扩增出长度为1165bp的目的片段(见图2)，经测序证明该片段为重组载体pCAMBIA1305-OsPIL15的片段，证明重组载体已转化入水稻中。

筛选阳性，并在T2代的时候得到两个纯系株系，分别命名为OE5、OE6和OE10。

实施例3OsPIL15调控水稻节水抗旱的效果验证

将鉴定出来的OsPIL15过表达株系OE5、OE5、OE10和敲除株系15-2、15-3，分别种植在装有相同重量和类型的土壤混合物的黑色矩形盆中。每盆每株苗密度和苗数相同。将每6个种植相同株系的黑色矩形盆放入一个大小合适的长盆中。水饱和沥干后，每个长盆中加入800ml水后不再浇水。如图3所示，不浇水12天后，敲除株系15-2、15-3与WT水稻相比表现出更明显的失水表型，叶片卷曲和枯萎，而过表达株系OE5、OE6、OE10显示出轻微的失水表型。复水五天后，大部分敲除株系都以已死亡，超过一半的WT水稻死亡。然而，大部分过表达株系发育良好，叶片仍然保持绿色。同时统计各株系存活率。统计数据采用软件为prism5.0进行分析，分析方法为单因素方差分析(One-way ANOVA)。统计结果如图4所示，OsPIL15过表达株系在干旱胁迫后的存活率显著高于野生型对照，而敲除株系则显著低于对照。

综上，OsPIL15基因能够显著调控水稻节水抗旱功能，可用于节水抗旱的遗传改良及节水抗旱水稻培育。