CN110964728A - 控制油菜株高的基因ed1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种控制油菜株高的基因ED1及其在油菜矮杆品种选育中的应用。通过精细定位从油菜极端矮杆突变株ed1中克隆得到与株高相关的突变基因ED1，该基因位于C5染色体，与基因BnaIAA7相比，基因ED1包含一处错义的碱基突变，即在序列260处存在C至T的置换。利用植物表达载体将基因ED1转化到油菜中，可以高效准确对油菜品种进行降杆，自身启动子驱动基因ED1，杂合植株株高降低34%，纯合植株株高降低80%；当基因ED1是35S启动子驱动时，杂合株系株高会降低74%，纯合株系株高降低达89%。

Description

控制油菜株高的基因ED1及其应用

技术领域

本发明属于植物分子育种领域，具体涉及一种控制油菜株高的基因ED1及其在油菜矮秆分子育种中的应用。

背景技术

我国四大主要油料作物包括油菜、大豆、花生及向日葵，油菜居首。油菜也是我国继水稻、小麦、玉米、大豆之后的第五大农作物及国产食用油的第一大来源。菜籽油是中国传统食用油，占国产油料作物产油的比例约为57％(王汉中，2010)。建国以来，我国油菜生产成功实现了三次重大跨越，取得了显著的成就。但是，我国油菜单产仍然落后于加拿大等国家。因此，提高油菜单产则是我国油菜进一步发展的重大目标。

株高是作物重要的农艺性状之一，与植株抗倒伏性有关(Hedden et al.,2003)。然而，随着杂种优势的成功利用，株高也有所增高，抗倒伏则成为稳产保质的关键。适度矮化的作物品种不仅抗倒伏性增强，而且更适合于机械化收获。因此，矮杆性状(基因)在农作物上的重要应用价值受到了育种家的关注。20世纪50-60年代兴起的第一次“绿色革命”取得了巨大成功，矮杆品种得到大面积推广，显著提高了世界小麦和水稻的产量(Evensonand Gollin,2003；Peng et al.,1999)。

目前，科学家利用拟南芥、水稻、小麦、豌豆和番茄等矮杆突变体的研究，对作物株高调控的分子机理有了深入的认识。研究表明，矮杆性状多数与激素的合成和信号途径相关，其中赤霉素(Gibberellin,GA)和油菜素类酯(Brassinosteroid,BR)是决定株高性状最主要的两类因子。少数植物矮化突变与生长素(Indole-3-acetic acid,IAA)、独脚金内酯(strigolactones,SL)和细胞壁合成途径等有关(Tanaka et al.,2003)。矮秆基因能直接导致植株形态学或细胞学发生变化，影响细胞的大小和数目，从而引起植株的矮化表型。

与水稻、小麦和玉米等粮食作物相比，油菜植株高大、分枝以及分枝间交叉多，机械化收获困难。在油菜生产中，倒伏可造成多达10-30％的减产，且含油量显著降低。另外目前油菜株高数量性状的研究基本还停留在初步定位阶段，近来主要检测到了一些控制株高性状的QTLs。然而，油菜矮杆突变资源的利用和矮杆机理研究比较滞后，相关的报道也较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种控制油菜株高的基因ED1及其在油菜矮杆品种选育中的应用，通过将基因ED1转化到油菜中，可以高效准确对油菜品种进行降杆。

为了实现上述目的，本发明通过以下方案实现：

一种控制油菜株高的基因ED1，该基因位于C5染色体，与基因BnaIAA7(编码油菜IAA7蛋白)相比，基因ED1包含一处错义的碱基突变，即在序列260处存在C至T的置换，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸在第130位为亮氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

基因ED1在油菜矮杆品种选育中的应用：利用植物表达载体将基因ED1转化到油菜中，可根据降杆要求选择不同的启动子驱动基因ED1，实现不同的降杆需求。BnaIAA7-C5的自身启动子(SEQ ID NO.3)或CaMV35S启动子驱动基因ED1的表达，经试验证明，自身启动子(SEQ ID NO.3)驱动基因ED1，杂合植株株高降低34％，纯合植株株高降低80％；当基因ED1是35S启动子驱动时，杂合株系株高会降低74％，纯合株系株高降低达89％。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明通过精细定位从油菜极端矮杆突变株ed1(株高24cm左右)中克隆得到该突变体中株高相关的突变基因ED1，通过转基因技术，可以高效准确对油菜品种进行降杆。

附图说明

图1为野生型N370、矮杆突变体ed1及杂交子代F1的成熟植株图。

图2为植物表达载体35S-ED1的图谱。

图3为油菜转基因植株35S-ED1表型图。

图4为1植物表达载体PIAA7-C5-ED1图谱。

图5为油菜转基因植株PIAA7-C5-ED1表型图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步说明。

以下实施例中，如无特殊说明为《分子克隆实验指南》(科学出版社，2002年)所记载方法。

实施例1控制油菜株高基因ED1的获得

1、油菜矮杆突变体ed1

以高杆品种N370为母本，极端矮秆材料ed1为父本进行杂交，收获的种子为F1，同时种植N370、ed1及F1，待植株成熟进行农艺性状统计，见表一。数据统计表明ed1可有效对高杆品种进行降杆，F1株高仅为高杆品种的的36％左右。

表一亲本植株及杂种一代的农艺性状表型

2、基因ED1的开发

以甘蓝型油菜矮杆突变体ed1为研究对象，与高杆亲本Y96构建F2精细定位群体；利用60k SNP芯片结合GWAS初步定位该基因，再对ed1和Y96进行转录组测序，获得目标区间的SNP信息，进一步开发SNP标记，结合F2群体中的正常高杆单株进行该基因的精细定位。利用生物信息学对目标区间内基因进行功能注释，根据功能预测候选基因并对其进行测序，比较ed1和N370之间的差异，最终确定候选基因ED1。该基因位于C5染色体，与基因BnaIAA7(编码油菜IAA7蛋白)相比，基因ED1包含一处错义的碱基突变，即在序列260处存在C至T的置换，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码的氨基酸在第130位为亮氨酸，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

实施例2利用35S启动子获得极端矮秆材料35S-ED1

1.植物总RNA的提

本实验使用Takara公司植物总RNA提取试剂盒，实验用研钵和药匙均用95％乙醇擦拭并高温处理，枪头和离心管为RNA提取专用的RNase-Free产品。具体操作步骤如下：

(1)加入450μL RL和9μL 50×DTT于2.0mL离心管中；

(2)在研钵中加入液氮和适量新鲜ed1油菜叶片，迅速磨碎，防止冻融，将样品粉末加入上一步准备好的离心管中，样品粉末量在0.03～0.1g之间为宜；

(3)震荡混匀后，4℃条件下离心机11500rpm离心4min；

(4)将上清移入1.5mL离心管中，加入220μL无水乙醇，混匀后将其转入RNA SpinColumn；

(5)11500rpm离心1min，弃去滤液，再加入500μL Buffer RWA，11500rpm离心35s，弃去滤液；

(6)加入650μL Buffer RWB，11500rpm离心30s，弃去滤液；

(7)配制Dnase消化反应液，向1.5mL离心管中分别加入5μL 10×DNaseⅠ缓冲液、4μLDNA消化酶和41μLRNase free dH₂O，混匀后将反应液加入RNA Spin Column，室温放置15min；

(8)加入355μl Buffer RWB，11500rpm离心35s，弃去滤液；

(9)加入650μL Buffer RWB，11500rpm离心35s，弃去滤液，11500rpm离心3min；

(10)将柱子取出置于干净1.5mL离心管中，向膜中央加入60μLRNase free dH₂O，室温下静置5min；

(11)11500rpm离心3min，收集洗脱的RNA，保存于-80℃。

2.逆转录合成cDNA

本实验使用Takara公司的反转录试剂盒，实验过程在冰上操作：

(1)将RNA置于冰上融化，配制DNA消化体系，如下：

将体系混匀后短暂离心，42℃条件下孵育2min后置于冰上；

(2)配制反转录体系，如下：

将体系混匀后，在37℃条件下反应15min，再在85℃条件下反应5s，得到cDNA，稀释5倍，置于-20℃冰箱待用。

3.基因ED1的克隆

(1)根据油菜参考基因组的目的基因序列设计引物，引物序列如下：

引物名称 序列

ED1-F(5′-3′)：atgatcggacagcttattaacc

ED1-R(5′-3′)：tcaggatctgttcttgcagt

(2)用KOD-Neo-Plus高保真酶对目的基因进行PCR扩增，反应体系如下：

(3)将体系混匀后，按如下程序进行PCR：98℃预变性3min；然后98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸30s，35个循环；4℃保存；

(4)将PCR产物通过1％的琼脂糖凝胶对其进行电泳，对目的条带进行切胶回收；

(5)回收产物加A：2μL 10×buffer，0.2μL LA taq，dATP 1μL，回收产物6.8μL；72℃30min。

4.TOPO克隆

本研究采用Life technologies公司TOPO克隆试剂盒，步骤如下：

(1)将凝胶回收得到的目的片段连接入门TOPO载体，反应体系如下：回收的目的片段2μL，Salt solution 0.5μL，TOPO vector 0.5μL；

(2)将配好的反应体系混匀，短暂离心，室温下放置20min，转化大肠杆菌，将菌液涂布在加有50mg/L壮观霉素的LB固体培养基上，倒扣放置于37℃培养箱内过夜培养；

(3)对过夜培养长出的单菌落挑菌并进行菌落PCR鉴定，ED1F/R+TOPO-R(5′-3′：TTGTACAAGAAAGCTGGGTC)，选取正向连接的阳性克隆送测；

(4)序列比对，挑取测序完全正确的阳性克隆加入到含有50mg/L壮观霉素的LB液体培养基中，37℃摇床内，200rpm，过夜培养提取质粒。

5.Gateway重组

本研究使用Life technologies公司Gateway重组试剂盒。在前期目的片段与入门载体进行连接后，对转化后的大肠杆菌单菌落进行PCR鉴定，并送生物公司测序，测序正确的克隆即为构建好的载体。单菌落摇菌提质粒，待进行Gateway重组时使用。

(1)将测序正确的质粒与pEarleryGate-100表达载体重组，反应体系如下：

(2)将反应体系混匀并短暂离心，室温下静置反应1h；

(3)转化大肠杆菌的感受态，转化后菌液涂布于加有50mg/L卡那霉素抗生素的LB固体培养基上，倒置于37℃培养箱内过夜培养；

(4)对长出的单菌落进行菌落鉴定，挑取阳性克隆加入到含有50mg/L卡那霉素的LB液体培养基中，37℃，200rpm，过夜培养，提取质粒，得到载体35S-ED1(图2)，转化农杆菌GV3101。

6.遗传转化

携带质粒35S-ED1的农杆菌GV3101菌液浸染下胚轴，在23℃下，浸染过的下胚轴在共培养培养基上共培2d，用无菌水清洗2次，无菌纸上晾干，转移到筛选培养基上，23℃～25℃，16h光照/8h暗下培养；每隔15d更换一次新的筛选培养基，直至分化出的新的叶芽；将分化出的幼苗转移到生根培养基，23℃～25℃培养15d，再将生根的幼苗移入装有蛭石小钵中炼苗约7～9d，最后移栽至土壤中培育。共培养培养基：MS 4.4g/L，蔗糖30g/L，甘露醇18g/L，2,4-D1mg/L，KT 0.3mg/L；筛选培养基(1L)：MS 4.4g，葡萄糖10g，木糖0.25g，MES 0.6g，IAA0.1mg，琼脂糖7g。

7.阳性苗的检测

所用载体的筛选标记是除草剂草铵膦，先用20％的除草剂稀释1000倍喷洒转基因苗，两天后，对除草剂没有反应的植株进行取样。加400微升无菌水研磨后用除草剂试纸条检测(购自中国农科院油料作物研究所转基因工程与安全评价研究室)，显示两条带的为阳性苗，获得极端矮秆的转基因植株35S-ED1(图3)。种植两代后对转基因成熟植株进行株高性状考察，见表二。利用35S启动子杂合株系其株高会降低74％，纯合株系株高降低达89％。

表二转基因油菜植株株高性状统计

实施例3利用自身启动子获得矮秆材料PIAA7-C5-ED1

1.DNA的提取

本研究使用爱思进公司植物DNA提取试剂盒，提取步骤参照说明书。

2.启动子扩增

(1)启动子引物序列：

PIAA7-C5-F(5′-3′)：gaaaccgataggaaatacaag

PIAA7-C5-R(3′-5′)：ctataatctattacaggtaac

(2)用KOD-Neo-Plus高保真酶对目的基因进行PCR扩增，反应体系如下：

(3)将体系混匀后，按如下程序进行PCR：98℃预变性3min；然后98℃变性10s，55℃退火30s，68℃延伸120s，35个循环；4℃保存；

3.载体pCAMBIA3301酶切

电泳，切胶回收。

4.多片段重组

使用诺唯赞公司的ClonExpress MultiS One Step Cloning Kit(货号C113)

37度30min，冰浴5min；重组产物转化大肠杆菌感受态，铺板鉴定等同实施例二的5-(3-4)，构建好的载体图谱如图4

5.遗传转化及阳性苗的检测同实施例1的步骤相同，得到自身启动子驱动的ED1转基因苗PIAA7-C5-ED1，表型如图5。第三代转基因植株表型考察结果说明，自身启动子驱动时，杂合植株株高降低34％，纯合植株株高降低80％(表二)。

序列表

<110> 中国农业科学院油料作物研究所 江苏省农业科学院

<120> 控制油菜株高的基因ED1及其应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 729

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgatcggac agcttattaa cctcaaggca acggagctct gtctcggcct ccccggcggc 60

gctgaggcca acgagaatct ggcaaaatcg gcggtgggaa acaagagagg cttctcagag 120

accgttgatc tcatgctcaa tcttcaatcc aacaaagaag gagccgtcga tcttaacaac 180

gtcgcctcag cttccaaaga gacaactctt ctcaaagacc ctgctaagcc tcctgctaaa 240

gcccaagttg tgggatggct acctgtgagg aactacagga agaacatcat cacacagcag 300

aagacaagcg gcaaggagga ggccagcagc gagaaggctg gaaatagcgg cggaggagct 360

tccggagctg cattggtgaa ggtatccatg gacggagctc cctacctaag gaaagtggac 420

cttaagatgt acaaaagcta tcaggatctc tctgatgctt tggctaaaat gttcagctcc 480

tttactatgg gaaactatgg agcacaagga atgatagatt tcatgaacga gagcaagcta 540

atggatctgc ttaatagttc tgattacgtt ccaagctacg aggacaaaga tagcgattgg 600

atgctcgtcg gggatgtccc atgggaaatg tttgtcgact catgcaaacg tttgcgcatt 660

atgaagggag ctgaagcaat tggacttgct ccgagagcaa tggagaagta ctgcaagaac 720

agatcctga 729

<210> 2

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Met Ile Gly Gln Leu Ile Asn Leu Lys Ala Thr Glu Leu Cys Leu Gly

1 5 10 15

Leu Pro Gly Gly Ala Glu Ala Asn Glu Asn Leu Ala Lys Ser Ala Val

20 25 30

Gly Asn Lys Arg Gly Phe Ser Glu Thr Val Asp Leu Met Leu Asn Leu

35 40 45

Gln Ser Asn Lys Glu Gly Ala Val Asp Leu Asn Asn Val Ala Ser Ala

50 55 60

Ser Lys Glu Thr Thr Leu Leu Lys Asp Pro Ala Lys Pro Pro Ala Lys

65 70 75 80

Ala Gln Val Val Gly Trp Pro Pro Val Arg Asn Tyr Arg Lys Asn Ile

85 90 95

Ile Thr Gln Gln Lys Thr Ser Gly Lys Glu Glu Ala Ser Ser Glu Lys

100 105 110

Ala Gly Asn Ser Gly Gly Gly Ala Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Val

115 120 125

Ser Leu Asp Gly Ala Pro Tyr Leu Arg Lys Val Asp Leu Lys Met Tyr

130 135 140

Lys Ser Tyr Gln Asp Leu Ser Asp Ala Leu Ala Lys Met Phe Ser Ser

145 150 155 160

Phe Thr Met Gly Asn Tyr Gly Ala Gln Gly Met Ile Asp Phe Met Asn

165 170 175

Glu Ser Lys Leu Met Asp Leu Leu Asn Ser Ser Asp Tyr Val Pro Ser

180 185 190

Tyr Glu Asp Lys Asp Ser Asp Trp Met Leu Val Gly Asp Val Pro Trp

195 200 205

Glu Met Phe Val Asp Ser Cys Lys Arg Leu Arg Ile Met Lys Gly Ala

210 215 220

Glu Ala Ile Gly Leu Ala Pro Arg Ala Met Glu Lys Tyr Cys Lys Asn

225 230 235 240

Arg Ser

<210> 3

<211> 1888

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaaccgata ggaaatacaa gttcaggtcc gtgatcggaa aaatacctat tgaatttttt 60

tgaacccgcg ggtctctgtt tgagtccgag taaccaaaat acccaaattt tgtgaatact 120

acgttaattg ggtatttaat atatgttttc agtatacaat ttttttttaa agttttgttt 180

cgccttttcg gttataattt taggttccag acgaaatttc aaattttaaa aaatatattt 240

cgggtattta gataaaactt tggatgtttt tggttcctcg ggtaaaattt tgggtctttt 300

ggatatttga atattttcag gtaattgttt gattttcggg catttttttg tggtccggct 360

tttcagtttt cgtgtacttt gagtctcttt tggtcctaaa tacccaaacc gagtcggtct 420

catttggtat aaaattacat gtatgttaca ggtagtcgaa ttatggactc ggactattcc 480

ggatccaaaa gaaatcgacc cgaacccgaa ccaatttttt ttcaaatacc tagttggatg 540

caaatgtcga ggatccggat aaatcagacc tgaattgtac cagacgtcga agacacaaat 600

acccaaacct attctctctt gttatatttt gtgtgtattt tataaaagtt acatttgttg 660

agttaatgaa atttaatact taatttggaa ccatggtttt tgtttatcag ttttctctca 720

gagaatacat gatatctaaa ctggtgcata aagtttacaa attttatatg ctaactttga 780

aaatataaaa tagtcgtaga gtgtaaatta tacaaaatag atggattcat atgtgatata 840

tttcgtatcc taaaatcaat ggattatttc ttcagtgaaa ttacattttc aagttgtcgt 900

agatggtaga ttgagtttaa aaaaacactt gtagacgttt ttaattttta attttgatag 960

taatttcatc acaaagtatt tttcataggt atacatgtat attaatagca tgttttataa 1020

ttttacattt ttggcttttc aataaattag tataggtctg actggtgaca attctggaaa 1080

caaaaggaac gaatagaaaa agaacgtaga agaataaaat agcaggaatg aaaaggaatg 1140

gttgttcgtt ttcaaattta acaaggaata attttgttct ttatttctct acagaaaaaa 1200

aaagaatgag aaataaaaca ttattccttg tgaatggtga ttttttgtag gaacgtcaga 1260

gaatgcatta ttccccatca tttcttagtc accattcatt atgacttttt aagatagtgc 1320

aagagtaacc aatgtctaaa atagtcaaaa attggtttta tggcaaaaaa gacaatgggt 1380

agattagttg ttcattgcta ggaaatatcc ccttttaaat tcagtatatt agagtatgag 1440

gaaactggga ctaaaaattc aaattttttt ggttatcaga acaaaagaaa tttactaaaa 1500

taatccaaat agttttaagt tgatactaat ttttaattcc gtccctttac tttatagcta 1560

gacaaaatca ttcattgtca atcaccaatc aaaagtttta actagaaaat tattgatcat 1620

catgaaacaa agaaccaaag ctagtaaaaa tgatttatta acatctaata atcataagtt 1680

acaaagaaaa aaaaacatct aataatccca agtggcaaaa accccacaca tgaagaaaaa 1740

aagtgcaaag gacatgcaca tgcacttcat acaccccacc accatcctat ctccttatat 1800

tattattgcc cccttcctct cccttcttcc cctcttacca aatcagagag agagagagaa 1860

ataacatcta taatctatta caggtaac 1888

Claims (4)

1.控制油菜株高的基因ED1，其特征在于，核苷酸序列为SEQ ID NO.1。

2.权利要求1所述基因ED1编码的蛋白质，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO.2。

3.权利要求1所述的基因ED1在油菜矮杆品种选育中的应用，其特征在于，将基因ED1转化到油菜中。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，基因ED1由BnaIAA7-C5的自身启动子驱动，核苷酸序列为SEQ ID NO.3，或由35S启动子驱动。

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