CN116555290A - OsPIL1基因在提高水稻籼稻品种产量和抗性的方法及应用 - Google Patents

OsPIL1基因在提高水稻籼稻品种产量和抗性的方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体是一种OsPIL1基因在提高水稻籼稻品种产量和抗性的方法及应用，OsPIL1基因序列如SEQ ID No.1所示，将OsPIL1基因通过农杆菌介导的遗传转化法使其在水稻籼稻品种中的表达量达到野生型水稻表达量1.1倍时，显著提高了水稻生长、谷粒长度、产量和抗性，可为OsPIL1基因在提高其他农作物生长、产量和抗性方面提供参考。本方法将OsPIL1基因在水稻籼稻品种中过量表达，实现了水稻籼稻品种生长量、谷粒长度、产量和抗性提高，因此本方法亦可以用于水稻籼稻品种的改良或新品种选育。

Description

OsPIL1基因在提高水稻籼稻品种产量和抗性的方法及应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种OsPIL1基因在提高水稻籼稻品种产量和抗性的方法及应用。
背景技术
水稻是世界上大多数国家的主要粮食作物之一。水稻病害的发生和流行严重威胁着全球的水稻产量和品质，化学防治和抗病品种等病害管理措施在降低水稻产量损失方面具有一定的作用，然而化学防治面临环境污染和稻米农残等影响稻米品质的问题。抗病品种很难达到高产、优质和抗病的目的，其原因在于农作物的生长、产量、品质和抗性等农艺性状之间存在负相关关系。因此，现有水稻抗病育种中如何协调生长、产量和抗性之间的平衡是一项艰巨的挑战，但是培育高产、优质和高抗性水稻品种是最佳的水稻病害管理策略。
许多广谱抗性基因或免疫力较强且无产量损失的基因型正在被整合到农作物品种中，提升了农作物抗性，且不影响农作物生长或产量。例如稻瘟菌CP蛋白MoSM1在水稻中过量表达，增强了水稻对稻瘟菌和黄单胞杆菌抗性，而且对水稻生长和产量没有负面影响。NLR受体基因PigmR6过表达的转基因水稻株系抗瘟性提高，同样地对水稻生长和产量没有负面影响。携带Xa4+xa5+Xa21基因型的水稻对来自韩国的18株水稻黄单胞菌具有较高的抗性，且对水稻生长和产量没有负面影响。在拟南芥和水稻中过量表达P450蛋白BSR2（BROADSPECTRUM RESISTANCE2）增强了拟南芥和水稻对立枯丝核菌的抗病性，虽然略微减缓了水稻生长速度，但增长了水稻谷粒。理想株型基因IPA1（IDEAL PLANT ARCHITECTURE1）转基因水稻株系抗瘟性增强，并且对水稻生长和产量没有负面影响。四肽重复序列（TPR）结构域RNA结合蛋白BSR-K1的突变株表现出广谱抗性，且关键农艺性状仍然保持良好。但是这些基因或基因型导入或整合到农作物品种中提高了农作物抗性，但对农作物生长或产量没有影响。
发明内容
本发明的目的是提供一种OsPIL1基因在提高水稻籼稻品种产量和抗性的方法及应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
本发明以水稻光敏色素互作类因子OsPIL1基因为对象，从水稻月亮谷中提取基因组DNA并反转录成cDNA，用PCR技术扩增出OsPIL1基因的CDS区序列1266bp编码区，基因序列如SQE ID No.1所示，编码的氨基酸序列如SQE ID No.2所示。通过构建OsPIL1基因过表达载体，采用农杆菌LBA4404介导的遗传转化方法，将过表达载体导入正常籼稻品种月亮谷中，得到OsPIL1基因过表达植株，当OsPIL1基因的表达量超过1.1倍时，其生长量、谷粒长度、产量和抗性显著提高于野生型水稻月亮谷。通过CRISPR/Cas9技术编辑敲除月亮谷中OsPIL1基因，得到了OsPIL1敲除水稻株敲除株，其生长量、谷粒长度、产量和抗性显著低于野生型水稻月亮谷。这些结果表明，通过提高 OsPIL1基因的表达量，可以促使水稻生长量、谷粒长度、产量增加，同时提高水稻抗性。
因此，本发明请求保护OsPIL1基因的如下用途：
如SEQ ID No.1所示OsPIL1基因或编码的蛋白在提高水稻籼稻品种生长量中的应用。
如SEQ ID No.1所示OsPIL1基因或编码的蛋白在提高水稻籼稻品种谷粒长度中的应用。
如SEQ ID No.1所示OsPIL1基因或编码的蛋白在提高水稻籼稻品种产量中的应用。
如SEQ ID No.1所示OsPIL1基因或编码的蛋白在提高水稻籼稻品种抗病性中的应用。
如SEQ ID No.1所示OsPIL1基因或编码的蛋白在提高水稻籼稻品种改良或育种中的应用。
本发明还请求保护SEQ ID No.1所示OsPIL1基因或编码的蛋白在提高水稻籼稻品种生长量、谷粒长度、产量和抗病性的方法，步骤包括：
（1）从野生型水稻月亮谷中提取基因组DNA；
（2）用PCR技术扩增出目的基因OsPIL1，所述目的基因OsPIL1序列如SEQ ID No.1所示；
（3）将基因OsPIL1片段连接到表达载体上，得到过量表达OsPIL1目的基因的质粒pBWA(V)HS-OsPIL1-osgfp；
（4）将质粒pBWA(V)HS-OsPIL1-osgfp导入农杆菌；
（5）含有质粒pBWA(V)HS-OsPIL1-osgfp的农杆菌与籼稻品种水稻株共培养即可得到生长量、谷粒长度、产量和抗病性正相关的水稻株系。
进一步的，步骤（2）中，用于扩增所述目的基因OsPIL1的引物序列为OsPIL1-F和OsPIL1-R：
OsPIL1-F:5¢-AACACGGGGACTTTGCAACATGGATGGCAATGCGAGATCGGCGG-3¢，
OsPIL1-R:5¢-TCCTCGCCCTTCACGATACAAATTCCATCAGAGGTTGGTGGTTGT-3¢。
本方法将OsPIL1目的基因在水稻籼稻品种中过量表达，实现了水稻籼稻品种生长量、谷粒长度、产量和抗性提高，因此本方法亦可以用于水稻籼稻品种的改良或新品种选育也属于本发明的保护范围。
本发明的有益技术效果是：本发明克服了现有基因或基因型整合到农作物品种仅仅提高抗性的缺点，通过将光敏色素互作类因子（OsPIL1）导入水稻显著提高了水稻生长、产量和抗性，可为光敏色素互作类因子（OsPIL1）在提高其他农作物生长、产量和抗性方面提供参考，此外，本方法将OsPIL1目的基因在水稻籼稻品种中过量表达，实现了水稻籼稻品种生长量、产量和抗性提高，因此本方法亦可以用于水稻籼稻品种的改良或新品种选育。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例2水稻种子、根、茎和叶中的OsPIL1基因表达量；
图2为实施例3中水稻OsPIL1基因过表达对胚芽鞘长度影响的结果图；
图3为实施例3中水稻OsPIL1基因过表达对水稻植株高度影响的结果图；
图4为实施例3中水稻OsPIL1基因过表达对水稻节间长度影响的结果图；
图5为实施例3中水稻OsPIL1基因过表达对水稻穗长度影响的结果图；
图6为实施例3中水稻OsPIL1基因过表达对水稻根长度影响的结果图；
图7为实施例3中水稻OsPIL1基因过表达对水稻谷粒重和谷粒长度影响的结果图；
图8为实施例4中水稻OsPIL1基因过表达对水稻病情指数影响的结果图；
图9为实施例4中水稻OsPIL1基因过表达对水稻病斑长度和病斑生物量影响的结果图；
图10为实施例5中水稻OsPIL1基因过表达对水稻生长、产量和抗性相关基因表达影响的结果图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下述实施例所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；所用的实验方法均为常规方法，并可按照已描述的重组技术（参见分子克隆，实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约）完成；所用的材料、试剂等，均可从商业途径得到。
实施例1
OsPIL1基因过表达转基因植株的构建，步骤包括：
1、从野生型水稻月亮谷中提取基因组DNA：
2、用PCR技术扩增出关键基因OsPIL1的1266bp编码区(SEQ ID No.1所示)，采用酶切位点引物：
F:5¢-AACACGGGGACTTTGCAACATGGATGGCAATGCGAGATCGGCGG-3¢(SEQ ID No.3)，
R:5¢-TCCTCGCCCTTCACGATACAAATTCCATCAGAGGTTGGTGGTTGT-3¢(SEQ ID No.4)。
用1%琼脂糖凝胶电泳，5v/cm电压，20分钟，将：1266bp的电泳片段在紫外灯下切取出来，放在一个体系中进行溶胶回收,回收程序见具体厂家的试剂盒说明书,用总体积40μL的水溶解回收DNA（回收产物标记为：rDNAG1)，检测无误后与载体进行重组。
3、载体酶切
将载体pBWA(V)HS-OsPIL1-osgfp酶切物用PCR纯化试剂盒纯化(纯化产物标记为pBWA(V)HS-ccdb-osgfp(D))用于下一步的体外或者体内重组反应。
载体构建主要采用同源重组和golden gate无缝克隆方法，构建完成后目标片段两端不含有酶切位点，因此无法通过双酶切得到目标基因片段和载体骨架片段。但为确保重组质粒的准确性，我们在测序之外采用EcoRV内切酶酶切重组质粒，验证重组质粒实际片段大小是否与理论值一致。因此，该酶切验证图不是双酶切验证图，是重组质粒准确性质控图。
4、重组反应，将连接产物转化感受态细胞。
5、转化
将5-10μL连接产物转化大肠杆菌感受态(见大肠杆菌感受态转化标准方法)转化涂(卡纳霉素)抗性平皿，37℃培养12小时，进行菌斑PCR鉴定。
6、菌斑PCR鉴定
挑取10个菌斑同时进行1.5mlEP管接菌和PCR鉴定,引物：pBWA(V)HS-ccdb-osgfp鉴定引物35seq(G),Noseq(G)。
7、农杆菌转化水稻
（1）OsPIL1过表达质粒转化水稻愈伤组织：将上述构建的OsPIL1过表达质粒转化根癌农杆菌（LBA4404），然后将该转化有OsPIL1过表达质粒的根癌农杆菌菌种在含有利福平和潮霉素的YEP培养基上进行培养，250r/min 28℃过夜培养。取过夜培养液 300ul于3ml的含相应抗生素的YEP液体培养基中,在250r/min 28℃的条件下避光振动培养，至菌液达OD600=0.5，即制备得到根癌农杆菌浸染液，可用于侵染。
选择生长状态良好的水稻颗粒状胚性愈伤组织，用无菌镊子将其适当夹小，创造伤口，然后放在菌液中浸泡，一般浸染时间为 10-30 min，菌液浓度不大时可浸染时间长些液浓度大时侵染几分钟即可，浸染时要不时摇动，之后放入有滤纸的平皿中吸干多余菌液。
将吸干菌液的愈伤组织置于 NBco 固体培养基上，共培养培养基上放 1 层纸，滤纸上放愈伤组织。25-27℃暗培养 2-3 天，直至愈伤组织上出现少量菌斑为止。
（2）愈伤组织的脱菌与筛选：共培养的愈伤组织放在广口瓶中，用无菌水清洗至清澈，再浸泡于含 Cef(头抱霉素)500mg/L NBco液体培养基中，在摇床上中速振荡 30-60min，弃液，将愈伤组织用无菌滤纸吸干或在超净工作台上吹干后接放在一筛培养基上暗培养三周，再转入二筛培养基上暗培养三周，温度控制在 25-27℃。
（3）抗性愈伤组织的分化与生根：选择两次筛选后新长出的抗性愈伤组织接种到预分化培养基上，暗培养 10天再转到分化培养基上光照培养，用日光灯每天照明 12 小时，温度控制在 25-27℃，1-2个月，获得2-3cm高的幼苗。
将幼苗转到生根培养基上培养，当根长到2-2.5cm高时取出，洗净根部的培养基，移栽于大田土壤中，在温室培养一段时间后转到适于水稻的室外环境。
实施例2
OsPIL1在水稻种子、根、茎和叶中的表达水平
qRT-PCR检测OsPIL1在OsPIL1过表达转基因水稻种子、根、茎和叶中的表达水平，结果表明，与野生型水稻(WT)相比，OsPIL1在水稻种子中的表达量是野生型水稻(WT)的1.7倍，OsPIL1在30天水稻根、茎和叶中的表达量分别为2.87倍、1.09倍、1.28倍，而在60天水稻根、茎和叶中的表达量分别为2.1倍、6.0倍、1.59倍。因此，OsPIL1在水稻种子、根、茎和叶中的表达量超过野生型水稻中的1.09倍以上即可促进水稻生长、产量和抗性（图1）。
实施例3
OsPIL1促进水稻植株表型和谷粒大小
（1）水稻植株表型：观察并统计了过表达水稻株系OsPIL1 OE（#1、#2、#6,#1、#2、#6是OsPIL1转基因过表达水稻的三个株系）的表型（包括株高、茎长、胚芽鞘长度、穗长、根长、百粒重和种子垂直长度），结果发现三个OsPIL1过表达转基因水稻的胚芽鞘长度显著长于WT的（图2），OsPIL1 过表达植株的高度显著高于野生型水稻的的（图3），进一步测量成株期OsPIL1 和WT植株每一节间的长度，发现OsPIL1 过表达植株的每一节间的长度显著长于WT的（图4），OsPIL1过表达植株的穗长显著长于WT的（图5），OsPIL1过表达植株的根长显著长于WT的（图6），OsPIL1过表达的百粒重以及谷粒长度明显高于WT的（图7）。
实施例4
OsPIL1过表达转基因水稻抗瘟性鉴定
（1）稻瘟菌接种OsPIL1过表达转基因水稻稻瘟病症状观察和统计
稻瘟菌接种OsPIL1过表达转基因水稻喷雾接种稻瘟病菌（95234I-1b），接种144hpi后调查病情指数。结果发现，与WT株系相比，OsPIL1过表达转基因株系的病情指数显著降低（图8）。对OsPIL1过表达转基因水稻punch接种稻瘟病菌（95234I-1b），接种144hpi后测量病斑长度以及病斑生物量，结果发现OsPIL1过表达转基因株系的病斑长度和病斑生物量都显著低于WT的（图9）。
实施例5
RNA-seq解析OsPIL1对水稻生长、产量和抗性相关基因转录调控
（1）RNA-seq鉴定OsPIL1调控水稻生长、产量和抗性相关基因
RNA-seq筛选到稻瘟菌接种OsPIL1过表达转基因水稻中与根生长相关的基因OsRPC53、BRX、OsBRL1、OsPIN10a、OsAAO2；茎生长相关的基因ONI3、BRX；与分蘖数相关的基因OscZOG1；叶绿素合成相关基因相关基因peptidyl-tRNA hydrolase(LOC_Os03g22610)；与叶片角度相关基因OsIAA12、SLG、OsBC1、OsBUL1、与生长相关的其他基因：锚蛋白基因(LOC_Os09g03750)、蛋白扩张前体家族基因、锌指蛋白家族基因、OsRopGEF10、RALFL26等基因，产量相关基因（RGH1A家族基因、谷粒成熟品质相关基因LTPL26、谷粒大小相关基因OsAK3、植物器官大小基因ARGOS、延迟开花时间，增加株高和粮食产量相关OsCOL16，应激反应中的信号转导相关的钙调素结合蛋白家族基因，以及抗性相关基因（OsJMT1、CBS结构域的膜蛋白家族基因、OsDof28、OsWRKY89）等基因上调。
（2）RT-qPCR验证上述基因在水稻植株、谷粒和稻瘟菌侵染水稻植株中的表达
我们选择了11个基因OsRPC53（LOC_Os04g32350）、扩张蛋白前体（LOC_Os02g44108）、钙调蛋白结合蛋白（LOC_Os11g44600）、锚定蛋白（LOC_Os09g03750）、玉米素邻葡萄糖基转移酶1（OscZOG1）、OsJMT1、OsAAO2、RGH1A、LTPL26、RALFL26、OsCOL16进行RT-qPCR验证，验证它们在野生型和OsPIL1 过表达株系的谷粒、根、茎、叶和受稻瘟菌侵染48h和72h的表达情况。结果发现，与野生型相比，OsRPC53在谷粒、叶片和受侵染水稻植株中表达下调，但在OsPIL1 OE的根和茎中表达上调；锚定蛋白（LOC_Os09g03750）和OscZOG1在谷粒、根和茎中表达下调，而在叶片和受侵染OsPIL1过表达幼苗中表达显著上调。OsJMT1仅在受侵染的OsPIL1过表达植株中表达上调，而在谷粒、根、茎和叶中未检测到。OsAAO2在谷粒、根、茎和受侵染的OsPIL1过表达植株中表达下调，而在OsPIL1过表达植株叶片中表达上调。RGH1A、RALFL26和OsCOL16在谷粒、根、茎和叶片中表达显著上调，但在受侵染的OsPIL1过表达植株中未检测到。LTPL26在谷粒和受侵染的OsPIL1过表达植株中表达上调，但在根、茎和叶中表达下调。钙调蛋白结合蛋白（LOC_Os11g44600）的基因在谷粒、根、茎、叶和受侵染的OsPIL1过表达植株中表达上调（图10）。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (8)

1.如SEQ ID No.1所示OsPIL1基因或编码的蛋白在提高水稻籼稻品种生长量中的应用。
2.如SEQ ID No.1所示OsPIL1基因或编码的蛋白在提高水稻籼稻品种谷粒长度中的应用。
3.如SEQ ID No.1所示OsPIL1基因或编码的蛋白在提高水稻籼稻品种产量中的应用。
4.如SEQ ID No.1所示OsPIL1基因或编码的蛋白在提高水稻籼稻品种抗病性中的应用。
5.如SEQ ID No.1所示OsPIL1基因或编码的蛋白在提高水稻籼稻品种改良或育种中的应用。
6. SEQ ID No.1所示OsPIL1基因或编码的蛋白在提高水稻籼稻品种生长量、谷粒长度、产量和抗病性的方法，其特征在于，步骤包括：
（1）从野生型水稻月亮谷中提取基因组DNA；
（2）用PCR技术扩增出目的基因OsPIL1，所述目的基因OsPIL1序列如SEQ ID No.1所示；
（3）将基因OsPIL1片段连接到表达载体上，得到过量表达OsPIL1目的基因的质粒pBWA(V)HS-OsPIL1-osgfp；
（4）将质粒pBWA(V)HS-OsPIL1-osgfp导入农杆菌；
（5）含有质粒pBWA(V)HS-OsPIL1-osgfp的农杆菌与籼稻品种水稻株共培养即可得到生长量、谷粒长度、产量和抗病性正相关的水稻株系。
7.根据权利要求6所述方法，其特征在于，步骤（2）中，用于扩增所述目的基因OsPIL1的引物序列为OsPIL1-F和OsPIL1-R：
OsPIL1-F:5¢-AACACGGGGACTTTGCAACATGGATGGCAATGCGAGATCGGCGG-3¢，
OsPIL1-R:5¢-TCCTCGCCCTTCACGATACAAATTCCATCAGAGGTTGGTGGTTGT-3¢。
8.根据权利要求6-7任一项所述方法在水稻品种改良或育种中的应用。
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