CN115418410A - 黑暗接种稻瘟菌诱导OsPIL1转基因水稻株系防御响应及鉴定方法 - Google Patents

黑暗接种稻瘟菌诱导OsPIL1转基因水稻株系防御响应及鉴定方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体来说是一种黑暗接种稻瘟菌诱导OsPIL1转基因水稻株系防御响应及鉴定方法，方法包括：水稻培养、稻瘟病菌孢子悬浮液制备、稻瘟病菌接种、转基因水稻防御相关基因表达验证和病害调查。本发明通过OsPIL1过表达水稻株系在黑暗条件下接种稻瘟菌，诱导水稻防御响应，从而提高转基因水稻抗稻瘟病能力，提升转基因水稻品质和产量。

Description

黑暗接种稻瘟菌诱导OsPIL1转基因水稻株系防御响应及鉴定 方法
技术领域
本发明涉及植物基因工程技术领域，具体来说是一种黑暗接种稻瘟菌诱导OsPIL1转基因水稻株系防御响应及鉴定方法。
背景技术
稻瘟病是由真菌(Magnaporthe oryzae)引起，是水稻最重要的病害之一，该病害分布在全国乃至世界各稻区，可引起水稻大幅度减产，甚至颗粒无收。控制这个病害最经济有效的方法是利用新的广谱持久抗病资源进行选育广谱抗病新品种。
光敏色素相互作用因子样蛋白(OsPIL1)在干旱条件下作为水稻节间伸长减少的关键调控因子。在非胁迫条件下，水稻幼苗OsPIL1mRNA水平呈昼夜振荡，在光周期中期达到峰值。在干旱胁迫条件下，OsPIL1的表达在光照期受到抑制。通过启动子-葡萄糖醛酸酶(Gus)分析，发现OsPIL1在茎的节点部分高表达。在转基因水稻植株中过表达OsPIL1促进了节间伸长。相关文献报道：OsPIL1表达由光诱导，促进水稻细胞壁相关基因的表达，促进细胞伸长、水稻节间变长。OsPIL1的表达在水分亏缺条件下严重下调，在干旱胁迫下降低了光照条件下OsPIL1的表达，导致细胞壁相关基因的表达降低。这一过程抑制了细胞的伸长，导致了细胞矮化。在水稻中过量表达OsPIL1可能是在干旱胁迫条件下提高水稻生长量的一个可靠的形态适应系统。
目前技术研究了干旱胁迫下上调OsPIL1对水稻表型(株高、穗长、细胞长度、粒重、节间长度、节数)的影响，没有研究OsPIL1在水稻抗稻瘟病中的作用。基于此背景，本方案致力于研究黑暗条件下接种稻瘟菌诱导OsPIL1转基因水稻株系防御响应，从而提高转基因水稻抗瘟性。
发明内容
本发明的目的是提供一种黑暗接种稻瘟菌诱导OsPIL1转基因水稻株系的防御响应及鉴定方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：一种黑暗接种稻瘟菌诱导OsPIL1转基因水稻株系的防御响应及鉴定方法，包括如下步骤：
(1)水稻培养：水稻种子先于75％酒精中表面消毒5-10min，随后无菌水冲洗三遍，再用1.5％次氯酸钠二次消毒5min，无菌水沖洗至种子表面无消毒液，消毒过的水稻种子浸泡于无菌水中放置在28℃恒温培养箱中催芽，待种子发芽后，将种子移植于提前装好士的育苗盘中，每盘50株水稻，在温室进行培育，水稻长至三叶一心期备用；
(2)稻瘟病菌孢子悬浮液制备；
(3)稻瘟病菌接种：三叶一心苗期转基因水稻黑暗中保温保湿处理6h，按10-15mL/100株水稻喷雾接种步骤(2)获得的稻瘟病菌孢子悬浮液；
(4)转基因水稻防御相关基因表达验证：接种稻瘟菌后，分别在12h、18h、24h、36h、42h、48h、60h、66h、72h、96h、120h取样，提取总样品RNA，RNA反转录合成cDNA，qRT-PCR分析基因表达，计算、作图分析防御相关基因表达情况，通过绝对定量PCR检测水稻稻瘟病菌相对生长量，按照2[CT(MoPot2)-CT(OsUBQ)]×100计算水稻相对生长量；
(5)病害调查：稻瘟菌接种144h后病害调查情况。
本发明方法步骤(2)中稻瘟病菌孢子悬浮液制备方法为：稻瘟菌菌株于PDA固体培养基上活化，置于28℃恒温培养箱中活化培养4-5天，用打孔器取活化好的菌丝块于PDA培养基上28℃恒温培养箱进行继代培养，培养4-5天；再用打孔器打取PDA培养基边缘活力好的菌块于PDB液体培养基中，置于28℃恒温摇床中培养3-4天，用移液器吸取500ul菌丝培养液于西梅汁培养基上进行产孢，涂布棒涂抹均匀后置于28℃恒温光照培养箱中黑暗培养3-4天后再光照/黑暗交替12h培养5-6天，待西梅汁培养基上的菌丝由白转黑时，刮去表面菌丝，无菌水沖洗孢子，制成孢子悬浮液，在显微镜下用血球计数板将悬浮液孢子浓度调整为1×105个/mL，所述所述稻瘟菌菌株是菌株95234I-1b。
进一步的，步骤(3)中，所述保温保湿条件为温度28℃、相对湿度为≥95％。
发明中防疫相关基因包括：ROS相关基因OsRbohB，POD基因OsPOX1，水杨酸信号通路相关基因OsWRKY45、OsPR1a和OsNPR1，茉莉酸信号通路基因OsAOS2、OsMYC2、OsLOX3和OsJAZ8。
通过接种144h后病害调查情况，ROS相关基因OsRbohB、POD基因OsPOX1、水杨酸信号通路相关基因OsWRKY45、OsPR1a和OsNPR1、茉莉酸信号通路基因OsAOS2、OsMYC2、OsLOX3和OsJAZ8表达情况，以及稻瘟菌接种致伤的OsPIL1转基因水稻单个病斑真菌相对生长量分析，发现黑暗处理后的OsPIL1转基因水稻稻瘟病发病情况明显减轻，黑暗条件接种可诱导OsPIL1转基因水稻株系防御响应，从而提高转基因水稻抗瘟性。
本发明的有益技术效果：本发明方法通过OsPIL1过表达基因水稻黑暗中保温保湿处理6h，按10-15mL/100株水稻喷雾接种稻瘟病菌孢子悬浮液，通过分析防御相关基因表达和病害调查分析明确其能诱导水稻防御响应，从而提高转基因水稻抗稻瘟病能力，提升转基因水稻品质和产量。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明的黑暗处理OsPIL1转基因水稻6h后，再接种稻瘟病菌的转基因水稻中防御相关基因表达视图；
图2是本发明的光照处理OsPIL1转基因水稻6h后，再接种稻瘟病菌的转基因水稻中防御相关基因表达视图；
图3是本发明的黑暗或光照处理6h后稻瘟菌接种144h后水稻叶片病害调查情况视图；
图4是本发明的黑暗或光照处理6h稻瘟菌接种144h后水稻叶片发病率视图；
图5是本发明的野生型和转基因水稻株系单个病斑的病斑长度视图；
图6是本发明的野生型和转基因水稻株系单个病斑的病斑长度的统计和相对生长量表达视图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明方法实施例中，任何涉及有关水稻育苗、稻瘟病菌株产孢、病害调查以及发病率统计的方法，均为本领域常规处理方法。
实施例1
黑暗接种稻瘟菌诱导OsPIL1转基因水稻株系的防御响应及鉴定方法，包括如下步骤：
(1)水稻培养：水稻种子先于75％酒精中表面消毒5min，随后无菌水冲洗三遍，再用1.5％次氯酸钠二次消毒5min，无菌水沖洗至种子表面无消毒液，消毒过的水稻种子浸泡于无菌水中放置在28℃恒温培养箱中催芽，待种子发芽后，将种子移植于提前装好士的育苗盘中，每盘50株水稻，在温室进行培育，水稻长至三叶一心期备用；
(2)稻瘟病菌孢子悬浮液制备：稻瘟菌菌株95234I-1b于PDA固体培养基上活化，置于28℃恒温培养箱中活化培养4天，用打孔器取活化好的菌丝块于PDA培养基上28℃恒温培养箱进行继代培养，培养4天；再用打孔器打取PDA培养基边缘活力好的菌块于PDB液体培养基中，置于28℃恒温摇床中培养3天，用移液器吸取500uL菌丝培养液于西梅汁培养基上进行产孢，涂布棒涂抹均匀后置于28℃恒温光照培养箱中黑暗培养3天后再光照/黑暗交替12h培养5天，待西梅汁培养基上的菌丝由白转黑时，刮去表面菌丝，无菌水沖洗孢子，制成孢子悬浮液，在显微镜下用血球计数板将悬浮液孢子浓度调整为1×105个/mL；
(3)稻瘟病菌接种：三叶一心苗期转基因水稻黑暗中保温(28℃)保湿(相对湿度96％)处理6h，按100株水稻喷雾接种10mL步骤(2)获得的稻瘟病菌孢子悬浮液，持续喷施直至水稻叶片上菌液呈水雾状且不往下滴落即可；
(4)转基因水稻防御相关基因表达验证：接种稻瘟菌后，分别在12h、18h、24h、36h、42h、48h、60h、66h、72h、96h、120h取样，提取总样品RNA，RNA反转录合成cDNA，qRT-PCR分析基因表达，计算、作图分析ROS相关基因OsRbohB，POD基因OsPOX1，水杨酸信号通路相关基因OsWRKY45、OsPR1a和OsNPR1，茉莉酸信号通路基因OsAOS2、OsMYC2、OsLOX3和OsJAZ8表达情况，通过绝对定量PCR检测水稻稻瘟病菌相对生长量，按照2[CT(MoPot2)-CT(OsUBQ)]×100计算水稻相对生长量，具体步骤如下：
1)RNA的提取：GenStar(北京康润诚润生物科技有限公司)试剂盒提取水稻总RNA，操作步骤见试剂盒说明书；
2)RNA反转录合成cDNA
利用TransScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix forqPCR
表1 cDNA反转录成分
Figure BDA0003877716540000051
Cone-step gDNA Removal)-AT341逆转录试剂盒进行逆转录，根据试剂盒说明书配成cDNA逆转录体系，总体系配好分装于PCR管，再加入目的RNA，轻轻混匀，置于PCR仪中先42℃孵育15min，再85℃加热5s使TransScript RT/RI和gDNA Remover失活，取出所得的cDNA置于4℃冰箱。
3)利用NCBI网站设计防御相关基因引物，如表2所示
表2引物序列
Figure BDA0003877716540000061
4)qRT-PCR分析基因表达
采用GenStar试剂盒进行实时荧光定量PCR(qRT-PCR)，反应体系20uL，上、下游引物各0.8uL，cDNA模板0.5uL，荧光染料10uL，ddH2O补足至20uL；扩增程序：94℃30s；94℃5s，60℃30s，进行42次循环；65℃5s，95℃5s，获取溶解曲线。用SPSS26.0(StatisticalProduct and Service Solutions)软件，使用2-ΔΔCt法对基因表达水平进行计算分析，得到基因表达量的平均值与标准误，再用prism软件作图即得到基因的相对表达量。
黑暗处理OsPIL1转基因水稻6h后，再接种稻瘟病菌的转基因水稻中防御相关基因表达结果为：ROS相关基因OsRbohB、POD基因OsPOX1、水杨酸信号通路相关基因OsWRKY45、OsPR1a和OsNPR1、茉莉酸信号通路基因OsAOS2、OsMYC2、OsLOX3和OsJAZ8表达量均显著高于稻瘟菌接种黑暗处理6h的野生型水稻中的这些基因表达量(如图1所示)，表明黑暗处理激活了稻瘟菌侵染OsPIL1转基因水稻中防御相关基因的表达。
光照处理OsPIL1转基因水稻6h后，再接种稻瘟病菌的转基因水稻中防御相关基因表达结果为：ROS相关基因OsRbohB、POD基因OsPOX1、水杨酸信号通路相关基因OsWRKY45、OsPR1a和OsNPR1、茉莉酸信号通路基因OsAOS2、OsMYC2、OsLOX3和OsJAZ8表达量均显著低于稻瘟菌接种光照处理6h的野生型水稻中的这些基因表达量(如图2所示)，表明光照处理抑制了稻瘟菌侵染OsPIL1转基因水稻中防御相关基因的表达。
(5)病害调查：稻瘟菌接种144h后病害调查情况，将水稻叶片剪下贴在A4纸上，根据病害发生的轻重，将病害分为0-5级，0级：无病。1级：仅有小的针尖大小的褐点。2级：较大褐点。3级：小而圆以至稍长的褐色的坏死灰斑，直径1-2毫米。4级：典型的稻瘟病斑或椭圆型，1-2厘米，常限于两条叶脉间，病斑面积不足叶面积的2％。5级：典型的稻瘟病斑，病斑跨越叶片中间主脉。每个叶片发病级数按最大病斑的发病级数来算，最后根据公式：病情指数＝Σ(各级病叶数×各级代表值)×100/(调查总叶数×最高一级代表值)，结果如图3所示，图3所示黑暗条件下接种稻瘟菌的水稻叶片发病率要比光照条件下低，如图4所示黑暗条件接种稻瘟菌野生型株系发病率比过表达株系高。
实施例2
稻瘟菌接种致伤的OsPIL1转基因水稻单个病斑真菌相对生长量分析实验
(1)、水稻叶片单个病斑DNA提取
用液氮预冷灭过菌的研钵，取3片嫩叶置于研钵中，加液氮研磨直至磨碎叶片成粉末状；将粉末置于1.5mL的离心管中，后用移液器取入750μL配置好的CTAB液体，混匀，65℃水浴30min后离心11000rpm，5min，取上清液加入同体积的氯仿:异戊醇(24:1)，轻摇3min；离心11000rpm，5min，取上清液加入同体积的冰异丙醇，混匀，置于-20℃静置30min；离心11000rpm，5min，弃上清液；用75％的乙醇离心11000rpm，2min，洗两次，超净台下吹干，并加入TE溶液60μL稀释，置于冰箱保存。
(2)、稻瘟病菌DNA的绝对定量
冰上配制PCR反应体系，然后再分装到96孔PCR板，加入稻瘟病菌DNA模板，进行qRT-PCR反应。
参数设置：扩增循环参数：95℃预变性3min；95℃变性20s；59℃退火延伸20s；65℃采集荧光信号；循环数为44次；溶解曲线参数：从58℃开始升温，温度每升高0.5℃为一个循环采集荧光信号，共80个循环。每个样品设置3次重复，记录Ct值，计算相对表达水平。
qRT-PCR数据处理，按照2[CT(MoPot2)-CT(OsUBQ)]×100计算水稻相关抗性基因的表达量水平，然后用SPSS26.0(Statistical Product and Service Solutions)软件统计分析，再用prism作图。
如图5所示，成株期(45天)水稻叶片单个病斑DNA提取，稻瘟病菌DNA的绝对定量，病斑长度的测量，结果显示野生型水稻株系单个病斑的病斑长度和相对生长量均大于OsPIL1转基因水稻株系(如图6所示)，表明OsPIL1基因能有效防御稻瘟病的发生，证明OsPIL1转基因水稻株系比野生型水稻株系抗稻瘟病能力更强。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换，而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (6)

1.黑暗接种稻瘟菌诱导OsPIL1转基因水稻株系防御响应及鉴定方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)水稻培养：水稻种子先于75％酒精中表面消毒5-10min，随后无菌水冲洗三遍，再用1.5％次氯酸钠二次消毒5min，无菌水沖洗至种子表面无消毒液，消毒过的水稻种子浸泡于无菌水中放置在28℃恒温培养箱中催芽，待种子发芽后，将种子移植于提前装好士的育苗盘中，每盘50株水稻，在温室进行培育，水稻长至三叶一心期备用；
(2)稻瘟病菌孢子悬浮液制备；
(3)稻瘟病菌接种：三叶一心苗期转基因水稻黑暗中保温保湿处理6h，按10-15mL/100株水稻喷雾接种步骤(2)获得的稻瘟病菌孢子悬浮液；
(4)转基因水稻防御相关基因表达验证：接种稻瘟菌后，分别在12h、18h、24h、36h、42h、48h、60h、66h、72h、96h、120h取样，提取总样品RNA，RNA反转录合成cDNA，qRT-PCR分析基因表达，计算、作图分析防御相关基因表达情况，通过绝对定量PCR检测水稻稻瘟病菌相对生长量，按照2[CT(MoPot2)-CT(OsUBQ)]×100计算水稻相对生长量；
(5)病害调查：稻瘟菌接种144h后病害调查情况。
2.根据权利要求1所述黑暗接种稻瘟菌诱导OsPIL1转基因水稻株系防御响应及鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中稻瘟病菌孢子悬浮液制备方法为：稻瘟菌菌株于PDA固体培养基上活化，置于28℃恒温培养箱中活化培养4-5天，用打孔器取活化好的菌丝块于PDA培养基上28℃恒温培养箱进行继代培养，培养4-5天；再用打孔器打取PDA培养基边缘活力好的菌块于PDB液体培养基中，置于28℃恒温摇床中培养3-4天，用移液器吸取500uL菌丝培养液于西梅汁培养基上进行产孢，涂布棒涂抹均匀后置于28℃恒温光照培养箱中黑暗培养3-4天后再光照/黑暗交替12h培养5-6天，待西梅汁培养基上的菌丝由白转黑时，刮去表面菌丝，无菌水沖洗孢子，制成孢子悬浮液，在显微镜下用血球计数板将悬浮液孢子浓度调整为1×105个/mL。
3.根据权利要求2所述黑暗接种稻瘟菌诱导OsPIL1转基因水稻株系防御响应及鉴定方法，其特征在于，所述稻瘟菌菌株是菌株95234I-1b。
4.根据权利要求1所述黑暗接种稻瘟菌诱导OsPIL1转基因水稻株系防御响应及鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中，所述保温保湿条件为温度28℃、相对湿度为≥95％。
5.根据权利要求1所述黑暗接种稻瘟菌诱导OsPIL1转基因水稻株系防御响应及鉴定方法，其特征在于，步骤(4)中，所述防御相关基因包括：ROS相关基因OsRbohB，POD基因OsPOX1，水杨酸信号通路相关基因OsWRKY45、OsPR1a和OsNPR1，茉莉酸信号通路基因OsAOS2、OsMYC2、OsLOX3和OsJAZ8。
6.根据权利要求1-5任一项所述方法在水稻育种中的应用。
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CN116555290A (zh) * 2023-07-03 2023-08-08 云南农业大学 OsPIL1基因在提高水稻籼稻品种产量和抗性的方法及应用
CN116555290B (zh) * 2023-07-03 2023-09-12 云南农业大学 OsPIL1基因在提高水稻籼稻品种产量和抗性的方法及应用

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