CN105177145A - 一种检测稻瘟菌基因增强稻瘟病菌株致病力的方法 - Google Patents

一种检测稻瘟菌基因增强稻瘟病菌株致病力的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种检测稻瘟菌基因增强稻瘟病菌株致病力的方法，它涉及植物保护和生物技术领域，调查水稻抗感反应、real-time？RT-PCR分析水稻早期响应的防御相关基因表达以及qPCR检测病斑的真菌相对生长量。基因的原核表达产物按照1.0μg/ml~6.0？μg/ml浓度喷雾水稻叶片24h再接种强/弱致病菌株，调查抗感反应以及real-time？RT-PCR分析水稻防御相关基因表达；再利用该基因的过表达菌株离体接种水稻叶片，调查抗感反应、real-time？RT-PCR分析水稻防御相关基因表达以及qPCR分析病斑上的真菌相对生长量。它可全面准确地明确病原菌效应蛋白基因提高病原菌侵染力，最终达到为今后测定病原菌效应蛋白提高病原菌侵染力的方法提供准确全面的方法的目的。

Description

一种检测稻瘟菌基因增强稻瘟病菌株致病力的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测稻瘟菌基因体外原核表达和菌株内过表达提高菌株侵染力的方法，属于植物保护和生物技术领域。
背景技术：
植物受到病原细菌侵染时是通过识别Ⅲ型效应蛋白引发免疫反应，Ⅲ型效应蛋白是通过Ⅲ型分泌途径(T3SE)分泌进入寄主细胞，T3SE具有多种功能，能将效应蛋白转运到寄主细胞中并参与到其中的多个代谢途径，例如诱导防御相关基因表达、下游防御信号激活、特定蛋白修饰以及SA、JA和Et信号分子的产生等。众所周知，Ⅲ型效应蛋白绝大多数为无毒蛋白，通常与寄主植物的HR反应有关，诱发寄主植物ETI产生以阻断病原菌侵染。病原细菌Ⅲ型效应蛋白基因在植物中过表达能改变植物对病原菌的响应，或是引起植物感病或是诱导植物防御响应。有研究表明，从细菌性疮痂病菌中鉴定到的AvtaBsT是YopJ家族中第一个被鉴定到的Ⅲ型效应蛋白，YopJ家族效应蛋白主要是抑制寄主ETI响应，而AvrBsT是抗病植株受到病原菌侵染时诱导HR响应所必需的。在细菌性疮痂病菌侵染寄主植物时，AvrBsT被转运至植物细胞中以引发防御反应响应。Hwang等人利用纯化的10μg/mlGST-AvrBsT融合蛋白处理拟南芥幼苗引起叶片细胞死亡，表明AvrBsT本身能诱导拟南芥幼苗细胞死亡，与此相类似的是，AvrBsT在烟草和辣椒种瞬时表达也诱导了烟草和辣椒叶片过敏性细胞死亡。而利用纯化的1μg/ml和5μg/ml的GST-AvrBsT融合蛋白处理拟南芥幼叶时明显地降低了拟南芥绒毛状霉菌病菌的侵染力。因此可以看出，效应蛋白AvrBsT体外具有降低病菌侵染力的特性，是否是因诱导了基本防御响应而增强了拟南芥的抗性，其机制尚不清楚。
尽管植物病理学家数十年来一直致力于稻瘟病的防治研究，但水稻稻瘟病一直以来仍然是制约全球粮食生产和粮食安全的重要病害之一。大量研究表明，当真菌在活体寄生期成功侵入或被植物识别和阻断时，由侵染菌丝(infectedhyphae,IH)分泌的效应蛋白在稻瘟病菌侵染穿透早期具有重要作用。在真菌活体寄生期侵入时表达上调的基因大多为编码活体寄生相关的分泌(biotrophy-associatedsecretedproteins,BAS)蛋白。BAS1是一个在水稻与稻瘟病菌亲和互作时活体寄生期分泌的效应蛋白，在侵染菌丝(infectedhyphae,IH)中表达上调100倍。通过构建该基因的原核表达载体，利用其原核表达产物喷雾感病水稻叶片能够诱导水稻叶片胼胝质和ROS产生。通过进一步研究发现，利用该基因的过表达菌株侵染感病水稻叶片，也能提高菌株侵染力。
目前，对病原菌效应蛋白基因的研究集中在仅通过单一的利用基因原核表达产物处理植物以明确其对病菌侵染力的影响，并未通过较为全面系统的方法检测病原菌效应蛋白基因对病菌侵染力影响的报道。
发明内容：
针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种检测稻瘟菌基因增强稻瘟病菌株致病力的方法。
本发明的一种检测稻瘟菌基因增强稻瘟病菌株致病力的方法，它结合效应蛋白基因的原核表达产物处理水稻叶片24h再接种强致/弱致病菌株以及利用过表达菌株接种水稻，调查水稻抗感反应、real-timeRT-PCR分析水稻早期响应的防御相关基因表达以及qPCR检测病斑的真菌相对生长量，基因的原核表达产物按照1.0μg/ml～6.0μg/ml浓度喷雾水稻叶片24h再接种强/弱致病菌株，调查抗感反应以及real-timeRT-PCR分析水稻防御相关基因表达；再利用该基因的过表达菌株离体接种水稻叶片，调查抗感反应、real-timeRT-PCR分析水稻防御相关基因表达以及qPCR分析病斑上的真菌相对生长量。
作为优选，本发明中基因克隆、原核表达、过表达载体构建和过表达菌株获得的方法与目前现有的方法相同，包括喷雾接种、离体接种、抗感反应调查、引物设计、PCR方法、real-timeRT-PCR检测水稻早期响应的防御相关基因及qPCR检测病斑相对生物量的方法均与常规相同。
本发明的有益效果为：它可全面准确地明确病原菌效应蛋白基因提高病原菌侵染力。克服了已有单一地通过病原菌效应蛋白基因原核表达产物处理寄主植物了解病菌侵染力的弊端，最终达到为今后测定病原菌效应蛋白提高病原菌侵染力的方法提供准确全面的方法的目的。
具体实施方式：
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明了，下面通过示出的具体实施例来描述本发明。但是应该理解，这些描述只是示例性的，而并非要限制本发明的范围。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本发明的概念。
本具体实施方式采用以下技术方案：它结合效应蛋白基因的原核表达产物处理水稻叶片24h再接种强致/弱致病菌株以及利用过表达菌株接种水稻，调查水稻抗感反应、real-timeRT-PCR分析水稻早期响应的防御相关基因表达以及qPCR检测病斑的真菌相对生长量，基因的原核表达产物按照1.0μg/ml～6.0μg/ml浓度喷雾水稻叶片24h再接种强/弱致病菌株，调查抗感反应以及real-timeRT-PCR分析水稻防御相关基因表达；再利用该基因的过表达菌株离体接种水稻叶片，调查抗感反应、real-timeRT-PCR分析水稻防御相关基因表达以及qPCR分析病斑上的真菌相对生长量。
进一步的，本发明中基因克隆、原核表达、过表达载体构建和过表达菌株获得的方法与目前现有的方法相同，包括喷雾接种、离体接种、抗感反应调查、引物设计、PCR方法、real-timeRT-PCR检测水稻早期响应的防御相关基因及qPCR检测病斑相对生物量的方法均与常规相同。
本发明是全面而准确的检测病原菌效应蛋白基因提高病菌侵染力。采用病原菌效应蛋白基因的原核表达产物喷雾处理感病水稻品种丽江新团黑谷叶片24h，再利用强/弱致病菌株接种处理叶片，调查水稻抗感反应、real-timeRT-PCR检测防御相关基因表达；病原菌效应蛋白基因的过表达菌株离体接种感病水稻丽江新团黑谷叶片，测量病斑面积、real-timeRT-PCR检测防御相关基因表达、qPCR检测病斑的真菌相对生长量。可全面准确地明确病原菌效应蛋白基因提高病原菌侵染力。克服了已有单一地通过病原菌效应蛋白基因原核表达产物处理寄主植物了解病菌侵染力的弊端，最终达到为今后测定病原菌效应蛋白提高病原菌侵染力的方法提供准确全面的方法的目的。具体表现在通过结合原核表达产物处理植物再接种病菌和过表达菌株接种植物来明确效应蛋白基因对病菌侵染力的影响，与已有的仅通过基因的原核表达产物处理植物后再接种菌株确定基因对病菌侵染力有区别。可全面准确地了解效应蛋白基因对病菌侵染力的影响，克服已有单一测定效应蛋白基因对病菌侵染力影响的弊端。
实施例一：
将基因的原核表达产物于4℃离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液(20mMTris-HCl,pH7.4；200mMNaCl；1mMEDTA；10mMβ-巯基乙醇)悬浮菌体。在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清。处理是①将基因的原核表达产物按照1.0μg/ml的浓度喷雾接种到水稻品种丽江新团黑谷叶片上24h，再接种强/弱致病菌株，7天时调查抗感反应、real-timeRT-PCR分析水稻防御相关基因表达；②利用基因的过表达菌株接种水稻品种丽江新团黑谷叶片，7天测量病斑面积，qPCR分析病斑的真菌相对生长量。对照是①将空载体的原核表达产物按照1.0mg/ml的浓度接种到致伤的水稻叶片上，再接种致病菌株，7天时调查抗感反应、real-timeRT-PCR分析水稻防御相关基因表达；②利用野生型菌株接种水稻品种丽江新团黑谷叶片，7天测量病斑面积，qPCR分析病斑的真菌相对生长量。
表1基因原核表达产物喷雾丽江新团黑谷叶片24h再接种强/弱致病菌株7天发病症状及防御相关基因表达倍数
表2基因过表达菌株离体接种丽江新团黑谷叶片7天病斑面积及病斑真菌相对生长量
类别 7天病斑面积(mm) 病斑真菌相对生长量
处理 9.9 2710.71
对照 5.7 1052.35
实施例二：
将基因的原核表达产物于4℃离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液(20mMTris-HCl,pH7.4；200mMNaCl；1mMEDTA；10mMβ-巯基乙醇)悬浮菌体。在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清。处理是①将基因的原核表达产物按照1.0μg/ml的浓度喷雾接种到水稻品种丽江新团黑谷叶片上24h，再接种强/弱致病菌株，7天时调查抗感反应、real-timeRT-PCR分析水稻防御相关基因表达；②利用基因的过表达菌株接种水稻品种丽江新团黑谷叶片，7天测量病斑面积，qPCR分析病斑的真菌相对生长量。对照是①将空载体的原核表达产物按照2.0mg/ml的浓度接种到致伤的水稻叶片上，再接种致病菌株，7天时调查抗感反应、real-timeRT-PCR分析水稻防御相关基因表达；②利用野生型菌株接种水稻品种丽江新团黑谷叶片，7天测量病斑面积，qPCR分析病斑的真菌相对生长量。
表1基因原核表达产物喷雾丽江新团黑谷叶片24h再接种强/弱致病菌株7天发病症状及防御相关基因表达倍数
表2基因过表达菌株离体接种丽江新团黑谷叶片7天病斑面积及病斑真菌相对生长量
类别 7天病斑面积(mm) 病斑真菌相对生长量
处理 12.9 2990.71
对照 5.5 1112.36
实施例三：
将基因的原核表达产物于4℃离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液(20mMTris-HCl,pH7.4；200mMNaCl；1mMEDTA；10mMβ-巯基乙醇)悬浮菌体。在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清。处理是①将基因的原核表达产物按照1.0μg/ml的浓度喷雾接种到水稻品种丽江新团黑谷叶片上24h，再接种强/弱致病菌株，7天时调查抗感反应、real-timeRT-PCR分析水稻防御相关基因表达；②利用基因的过表达菌株接种水稻品种丽江新团黑谷叶片，7天测量病斑面积，qPCR分析病斑的真菌相对生长量。对照是①将空载体的原核表达产物按照2.0mg/ml的浓度接种到致伤的水稻叶片上，再接种致病菌株，7天时调查抗感反应、real-timeRT-PCR分析水稻防御相关基因表达；②利用野生型菌株接种水稻品种丽江新团黑谷叶片，7天测量病斑面积，qPCR分析病斑的真菌相对生长量。
表1基因原核表达产物喷雾丽江新团黑谷叶片24h再接种强/弱致病菌株7天发病症状及防御相关基因表达倍数
表2基因过表达菌株离体接种丽江新团黑谷叶片7天病斑面积及病斑真菌相对生长量
类别 7天病斑面积(mm) 病斑真菌相对生长量
处理 26.7 3925.71
对照 7.7 982.41
实施例四：
将基因的原核表达产物于4℃离心机离心收集菌体，用新鲜配制的缓冲液(20mMTris-HCl,pH7.4；200mMNaCl；1mMEDTA；10mMβ-巯基乙醇)悬浮菌体。在冰水浴上进行超生破碎细胞后离心收集上清。处理是①将基因的原核表达产物按照1.0μg/ml的浓度喷雾接种到水稻品种丽江新团黑谷叶片上24h，再接种强/弱致病菌株，7天时调查抗感反应、real-timeRT-PCR分析水稻防御相关基因表达；②利用基因的过表达菌株接种水稻品种丽江新团黑谷叶片，7天测量病斑面积，qPCR分析病斑的真菌相对生长量。对照是①将空载体的原核表达产物按照2.0mg/ml的浓度接种到致伤的水稻叶片上，再接种致病菌株，7天时调查抗感反应、real-timeRT-PCR分析水稻防御相关基因表达；②利用野生型菌株接种水稻品种丽江新团黑谷叶片，7天测量病斑面积，qPCR分析病斑的真菌相对生长量。
表1基因原核表达产物喷雾丽江新团黑谷叶片24h再接种强/弱致病菌株7天发病症状及防御相关基因表达倍数
表2基因过表达菌株离体接种丽江新团黑谷叶片7天病斑面积及病斑真菌相对生长量
类别 7天病斑面积(mm) 病斑真菌相对生长量
处理 29.8 3987.31
对照 7.8 998.78
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (1)

1.一种检测稻瘟菌基因增强稻瘟病菌株致病力的方法，其特征在于：它结合效应蛋白基因的原核表达产物处理水稻叶片24h再接种强致/弱致病菌株以及利用过表达菌株接种水稻，调查水稻抗感反应、real-timeRT-PCR分析水稻早期响应的防御相关基因表达以及qPCR检测病斑的真菌相对生长量，基因的原核表达产物按照1.0μg/ml~6.0μg/ml浓度喷雾水稻叶片24h再接种强/弱致病菌株，调查抗感反应以及real-timeRT-PCR分析水稻防御相关基因表达；再利用该基因的过表达菌株离体接种水稻叶片，调查抗感反应、real-timeRT-PCR分析水稻防御相关基因表达以及qPCR分析病斑上的真菌相对生长量。
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