CN103304647A

CN103304647A - 一种稻瘟菌蛋白质及其编码基因和应用

Info

Publication number: CN103304647A
Application number: CN2013102848928A
Authority: CN
Inventors: 曾洪梅; 邱德文; 杨秀芬; 郭立华; 袁京京; 陈铭佳
Original assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Institute of Plant Protection of Chinese Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2013-07-08
Filing date: 2013-07-08
Publication date: 2013-09-18

Abstract

本发明公开了一种稻瘟菌蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，编码所述蛋白质的多核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示；本发明还涉及所述蛋白质在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用。本发明所述蛋白质可以明显的提高植物的抗性，浓度低、起效快，10μM His-N2蛋白溶液处理水稻叶片3d后再接种稻瘟菌，对稻瘟菌发病的抑制率可以达到65%左右；所述蛋白质为提高植物的抗病性提供了新的途径，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

Description

一种稻瘟菌蛋白质及其编码基因和应用

技术领域

本发明涉及具有多于20个氨基酸的肽、编码该肽段的核苷酸序列以及其应用，特别涉及一种能提高植物抗性和诱导植物防御反应来自于稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）的分泌蛋白质及编码该蛋白质的核苷酸序列及其应用。

背景技术

稻瘟病是水稻的重要病害，严重影响水稻产量。稻瘟病由病原菌稻瘟菌（Magnaportheoryzae）引起。传统的防治植物病害的手段主要为化学防治和选育品种，上世纪随着生物技术的发展，植物诱导抗性受到关注，激发子作为诱导植物抗性的主要因子，日渐受到青睐。从病原菌中寻找能诱导植物抗性的激发子已成为国内外科学家关注的热点。

稻瘟菌蛋白激发子是一种重要的效应分子。它通过识别并作用植物细胞表面或亚细胞组分的受体分子来传递病原菌的激发子信号，启动植物的防卫系统，诱导植物的局部组织产生过敏性细胞坏死，并通过局部细胞信号物质的系统传递使植物最终产生系统获得性抗性。

目前国内外研究稻瘟菌激发子并不是很多，只是从稻瘟菌中分离出一些能够引起植物抗病反应或致使植物发病的活性成分。如1995年，德国的U.Schaffrath等从稻瘟菌中分离到一个约15.6kDa的糖蛋白，将该糖蛋白注入水稻叶片中，可以有效提高水稻抗稻瘟菌的能力（U.Schaffrath等，Physiological and Molecular Plant Pathology，1995，46：293-307）；1998年，J.Koga等从稻瘟菌中分离出两种不饱和脂肪酸激发子（J.Koga等，The Journal of BiologicalChemistry,1998,48:273）；李云峰等人从稻瘟菌细胞壁中分离出一个约66kDa的糖蛋白激发子，该糖蛋白能够诱导水稻叶片过氧化物酶与苯丙氨酸解氨酶活性升高(李云锋等，植物病理学报2004,34(2):127-132)；徐锋等从稻瘟菌中获得了一个40kDa的蛋白激发子，该蛋白能够促进植物生长（华北农学报，2006，21（5）:1-5）。

所有已公开发表的文献表明，稻瘟菌确实可以产生激发子，引起植物的防御反应、提高植物的抗性。虽然该菌产生的激发子性质和种类各不相同，但是它们的蛋白质序列和基因序列报道的很少，所以寻找一种新的蛋白质激发子，明确它的序列信息，为进一步揭示激发子作用功能和提高植物抗性是非常必要的。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够提高植物抗性和诱导植物防御反应的稻瘟菌分离蛋白质及其基因序列和该蛋白及其基因的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

本发明所述的稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）菌株已经于2012年2月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC）进行了保藏，地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，登记入册编号CGMCC No：5773，分类命名为：稻瘟菌（Magnaporthe oryzae），此菌株已在专利号为201210035653.4的申请中公开。

一种稻瘟菌蛋白质，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，命名为N2蛋白质。

本发明还涉及所述蛋白质在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用。

本发明蛋白质在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用，其中，所述植物为烟草和水稻。

本发明还涉及一种分离的多核苷酸，其核苷酸序列为下列所述之一：

（1）编码氨基酸序列如SED ID NO:2的蛋白质的多核苷酸序列；

（2）与（1）中多核苷酸序列根据碱基配对原则互补的多核苷酸序列。

本发明分离的多核苷酸，其中：编码氨基酸序列如SED ID NO:2的蛋白质的多核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明还涉及一种重组载体，其含有上述分离的多核苷酸。

本发明重组载体，其中所述载体为在载体pET30-TEV/LIC中插入了上述分离的多核苷酸的重组载体。

一种遗传工程的宿主细胞，其含有上述重组载体。

本发明遗传工程的宿主细胞，其中所述宿主细胞为含有上述重组载体的大肠杆菌CodenPlus。

本发明的蛋白质，是指来自稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）的培养液、培养液的上清液或菌体的蛋白质。

本发明的有益效果为：所述蛋白质可以明显的提高植物的抗性，浓度低、起效快，10μMHis-N2蛋白溶液处理水稻叶片3d后再接种稻瘟菌，对稻瘟菌发病的抑制率可以达到65%左右；所述蛋白质为提高植物的抗病性提供了新的途径，因而在农业生产上具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为粗蛋白通过HP Q HiTrap^TM阴离子交换柱的色谱图，实线为吸收值，虚线为NaCl浓度；

图2为N2蛋白的Native-PAGE电泳图；

图3为N2蛋白处理的烟草悬浮细胞的活性氧值变化；

图4为本发明所得克隆表达的N2蛋白序列，其中下划线部分为通过质谱获得的肽段序列。

具体实施方式

下面通过具体实例进一步对本发明所述N2蛋白及其编码序列及应用进行说明。

实施例1稻瘟菌的培养及发酵液制备

将稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）菌株划线菌块接种于西红柿燕麦片培养基平板，28℃培养2周，挑去菌落边缘处接种于200mL盛有YPD液体培养基的500ml三角瓶中，26℃、130r/min培养14天，得到稻瘟菌的发酵液。其中，西红柿燕麦片培养基的制备方法为：取燕麦片30克，加水800毫升煮沸30分钟，滤去燕麦残渣；另取鲜榨西红柿汁150毫升加入燕麦滤液中，补足水至1000毫升，加琼脂15克，溶化后分装，121℃灭菌30分钟；YPD液体培养基的制备方法为：10g酵母膏，20g蛋白胨，20g葡萄糖，加去离子水至1L，121℃灭菌30分钟。

实施例2粗蛋白质激发子的制备和监测

取实施例1中所得的发酵液，在4℃、5000rpm条件下离心1h（或13000rpm，30min），收集上清液，用0.45mm的滤膜（Whatman产）抽滤两次，直至没有菌体，得到发酵上清液。加入硫酸铵粉末,使发酵上清液中硫酸铵终浓度为80%来沉淀目标蛋白质，4℃透析48h，得到除盐后的胞外蛋白质并冻干，即粗蛋白。最后将获得的胞外蛋白质溶解到Mes-NaOH缓冲液（20mM,pH6.0）中，得粗蛋白溶液，其中胞外蛋白质终浓度为10μmol/L。蛋白质含量用BCA^TM protein assay kit（Thermo Scientific）经酶标仪在波长590nm处测定。

生物活性的监测：以生长2个月，具有5-7片真叶的烟草为材料，分别以0.2mM、pH6.0的Mes-NaOH缓冲液和10μmol/L牛血清蛋白溶液为对照，粗蛋白溶液浓度为10μmol/L，利用1mL不带针头的注射器，将30μLMes-NaOH缓冲液、30μL BSA溶液、30μL粗蛋白溶液从叶子背面分别注射进叶片中去。经过24h观察是否有坏死斑形成。

结果：注射粗蛋白溶液的叶片，注射部位6h后出现水渍斑，12h后注射处叶片变得透明较薄一些，24h后可以呈现典型的过敏反应，有坏死斑形成。对照并无任何反应，和正常叶片一样。

实施例3粗蛋白溶液中蛋白质激发子的分离纯化及生物活性测定

使用

explore10（GE Healthcare）蛋白质纯化仪对所得的粗蛋白进行进一步纯化，样品首先通过HP Q HiTrap^TM阴离子交换柱（GE Healthcare），用NaCl进行线性洗脱（0%-100%，30min)，获得到蛋白质洗脱峰，将各蛋白质洗脱峰组分进行生物活性的检测，所应用的各组分中使蛋白质浓度为10μmol/L，结果表明，其中蛋白质峰X1可以强烈的引起烟草的过敏反应（如图1所示）；将该峰的组分再通过15%Native-PAGE、割胶纯化和电洗脱的进一步纯化，得到有活性的单一蛋白质N2（如图2，以下简称N2蛋白）。以上纯化过程均监测蛋白质激发子的活性，监测方法是按实施例2中生物活性的监测方法进行的，所述纯化所得单一蛋白质经15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测为单一带，说明蛋白质纯度高，所述蛋白质表观分子量为16.3kD（pI＝4.72）。用实施例2中生物活性的监测方法对不同浓度的N2蛋白（50μM，30μM，10μM，5μM，1μM，0.5μM，0.1μM）进行活性监测，10μM的N2蛋白能够引起典型过敏性反应，能引起过敏反应的最低蛋白浓度为5μM。

结果：分离纯化的N2蛋白可以使烟草形成过敏反应的坏死斑。

分离纯化得到的N2蛋白对植物引起的一些反应：

（1）氧爆发的测定

氧爆发指的是活性氧物质的积累，活性氧物质包括H₂O₂。本实验通过监测H₂O₂的积累来说明氧爆发的过程。氧爆发（Reactive Oxygen Species，ROS）在激发子诱导的植物抗病防卫反应中起着非常重要的作用,它们都参与调控气孔运动，促进细胞编程性死亡,直接或间接杀死入侵的病原菌，作为第二信使可在转录水平上激活和调控植物体内各种防卫相关基因的表达以及参与系统获得性抗性(Systemic acquired resistance,SAR)的建立等。

a、对烟草悬浮细胞的作用

烟草悬浮细胞（tobacco BY-2）来自Nicotiana tabacum cv.Xanthi,由中国农业大学生命科学学院赠送。烟草悬浮细胞培养基：MS液体培养基（MS+100mg/ml,肌醇;0.2%,KH₂PO₄;0.2mg/ml,2,4-D;1mg/ml,VB1;3%蔗糖），121℃高压蒸汽灭菌15min，室温保存。悬浮细胞在25°C、130rpm的摇床中培养，使细胞保持在指数增长期。

取上述所得烟草悬浮细胞培养液，离心收集重悬于缓冲液（缓冲液配方为：175mM甘露醇，0.5mM氯化钙，0.5mM硫酸钾，10mM羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，Sigma）pH5.75）中，使烟草细胞浓度为0.1g/mL（细胞湿重/体积）,孵育1h在24°C，150rpm。然后取250μL悬浮细胞加入HEPES缓冲液（缓冲液配方为：175mM甘露醇，0.5mM氯化钙，0.5mM硫酸钾，10mM羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES，Sigma）pH5.75，同时添加0.3mM发光氨（Luminol））中，同时加入N2蛋白使其终浓度为10μM，开始用化学发光检测仪（Promega），检测细胞所生成的活性氧（如图3所示）。

b、对烟草叶片的作用

烟草叶片处理方法如实施例2生物活性监测中的方法，N2蛋白浓度为10μM，经过24h观察；取处理的叶片用蒸馏水洗净后将其置于2mL管中,取适量DAB（3,3’-Diaminbenzidine）（Sigma）染液(1mg.mL^-1,pH3.8)，用NaOH调pH值至5.8后,将染液加入预处理的叶片,室温避光保存8小时；随后去除各管中染液,加入95%乙醇,沸水浴数分钟,去除各管液体,再加入无水乙醇并沸水浴直至叶片绿色完全脱去为止,再次吸出各管液体,将脱去绿色的叶片浸泡在70%甘油中，赶出细胞间气泡，用显微镜观察。

结果：a、N2蛋白处理约30min后，烟草悬浮细胞出现氧爆发现象；b、在N2蛋白处理的烟草叶片部位有明显的褐色沉积物质出现，并且处理部位的气孔上的保卫细胞也出现红褐色沉淀。

（2）细胞培养基的碱化

钙离子流动普遍被认为是激发子的早期反应之一，而钙离子的流动势必会改变细胞环境的pH值变化，本实验检测了激发子处理后细胞培养基的碱化情况。

取浓度为0.1g/mL的烟草悬浮细胞，重新转接到新的烟草悬浮细胞培养基（培养基配方见氧爆发的测定中对烟草悬浮细胞的作用部分）中，25℃，150r/min培养3天后，加入蛋白质激发子N2蛋白处理，使N2蛋白终浓度为10μM，继续摇培，以水处理为对照，此后每过10min用pH计测定培养基的pH，直到处理后180min。

结果：蛋白质激发子N2蛋白能够引起细胞培养基的碱化，在处理后10min培养基的pH明显提高。

（3）胼胝质的沉积、酚类物质和木质素的积累

胼胝质的沉积、酚类物质和木质素的积累被认为是典型激发子引起的宿主细胞的次级反应，这些次级代谢物的生成或者积累与宿主防御系统相关。胼胝质、酚类物质和木质素的积累可以增强植物细胞壁的韧性，抵御病原菌的入侵。

a、对烟草叶片作用

烟草叶片处理方法如实施例2生物活性监测中的的方法，经10μM的N2蛋白处理24h后的叶片，将叶片放入缓冲液（1%戊二醛，5mM柠檬酸，90mM磷酸氢二钠，pH7.4）过夜；然后放入无水乙醇中煮10min，在放入50%乙醇中，接着转入缓冲液（67mM磷酸氢二钾，pH12）；在染色液（0.1%苯胺蓝（Sigma），67mM磷酸氢二钾，pH12）染色1h，放入70%甘油固定观察。

b、对烟草悬浮细胞的作用

取0.5g烟草悬浮细胞，加入N2蛋白使其终浓度为10μM，处理108h后，用6mol/L的2.5w/v%间苯三酚（Sigma）处理，立即观察。

结果：a、用N2蛋白处理的烟草叶片，细胞壁出现胼胝质星状的积累；b、处理过的烟草悬浮细胞有木质素的积累。

实施例4N2蛋白肽段序列的获得

纯化的N2蛋白经双向电泳检测为单点，切取蛋白质单点分别经10ng/μl测序级修饰胰蛋白质酶（Sequencing Grade Modified Trypsin，Promega）30℃、pH7.5酶解30min～1h，ESI-MS/MS为英国Micromass公司的Q-TOF2正交加速电喷雾串联质谱仪，配备纳升喷雾源，所有测定均在正离子方式下进行。质谱仪用Glu-fib的串联质谱碎片校正，质量准确度小于0.1Da；雾化气为氮气，碰撞气体为氩气；源温80℃，锥孔电压50V；TOF加速电压9.1kV；MCP检测器电压为2150V；毛细管电压800V。获得该蛋白质的两个肽段序列，肽段序列如下所示：（1）LQAGQTF；（2）GQTFSEDFR。

实施例5N2蛋白编码基因的克隆

根据质谱测序结果和密码子的简并性设计引物为N2蛋白-正向5’-ATGAAGTTCACCTCCACC-3’和N2蛋白-反向5’-TTAGGCGCAGAGGGTAGC-3’，并以稻瘟菌株抽提的mRNA为模板，选用HiFi反转录聚合酶进行PT-PCR（94°C3min；94°C30s，65°C30s，72°C30s，35cycles；72°C10min；4°C∝），扩增出的DNA片段包括459bp的完整开放阅读框，将其命名为N2基因，该基因的顺序如SEQ ID NO:1所示。表达SEQ ID NO:1可得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示的蛋白质。如图4所示，SEQ ID NO:2包含有实施例4中获得的肽段序列。

实施例6N2蛋白的原核表达和纯化

（1）表达载体的构建

分析蛋白激发子基因N2，预测其信号肽，设计特异性引物，正向引物：5’-TACTTCCAATCCAATGCCCAGCAGGCTATCGTCCAC-3’，反向引物：5’-TTATCCACTTCCAATGCTATTAGGCGCAGAGGGTAGCC-3’，扩增除信号肽外的N2基因片段（94°C4min；94°C30s，65°C30s，72°C30s，35cycles；72°C10min；4°C∝)，并将其克隆至表达载体pET30-TEV/LIC(Novagen,Darmstadt,Germany)。

（2）诱导表达

将步骤（1）中所获得的表达载体转化到E.coli Coden Plus感受态细胞中；质粒提取及转化表达宿主菌株的方法同（1），验证正确后，进行表达；将验证正确的重组表达菌株过夜活化，同时取空质粒pET30-TEV/LIC的菌株作为对照；分别取1mL过夜培养液加入到含有100μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基中（1%接种量），37℃，200r/min振荡培养2～3h培养至OD₆₀₀为0.6～0.8；加入诱导剂IPTG（终浓度为0.2mmol/L），16℃，220r/min继续振荡培养16h，诱导表达目的蛋白。高速离心，收集菌体加入缓冲液；经超声破碎菌体后，4℃高速离心，收集上清，得到重组蛋白液。取20μL上清液，加入5μL5×SDS上样缓冲液（变性）重悬菌体，沸水浴中加热10min，13000r/min离心10min，取上清进行SDS-PAGE检测，考马斯亮兰R250染色，观察表达情况。

结果：经过SDS-PAGE检测，获得一个分子量约18-kDa的包含C-末端6个组氨酸标签的融合表达蛋白（His-N2蛋白）。

（3）重组蛋白的纯化

利用explorer10蛋白纯化仪进行重组蛋白的纯化；选用Hitrap chelating Column柱进行亲和层析，先用清洗缓冲液平衡亲和柱；取步骤（2）中获得的重组蛋白液5mL进样，流速为1mL/min，淋洗至基线后，洗脱缓冲液进行洗脱；收集的各洗脱峰，在大量体积的磷酸盐缓冲液中4℃透析过夜，随后进行SDS-PAGE电泳和考马斯亮兰染色检测蛋白的纯度。

生物活性测定：采用实施例2中方法测定重组蛋白质激发子对烟草的活性。

结果：获得纯化的约18KD的融合表达蛋白（His-N2蛋白）。

实施例7重组蛋白(His-N2蛋白)在烟草上引起的反应

用1mL不带针头的注射器，将约30mL，10μM融合表达蛋白(His-N2蛋白)从叶子背面分别注入烟草叶片中，同时，以相同浓度的pET30-TEV/LIC空质粒表达蛋白及Mes-NaOH（20mM，pH6.0）溶液作为对照，分别从叶子背面注入不同的烟草叶片中。24h后观察叶片上的反应。

如实施例3中（1）的方法，观察重组蛋白诱导H₂O₂在处理叶片上的积累；如实施例3中（2）的方法，观察重组蛋白引起烟草细胞培养基的碱化。

结果：重组蛋白(His-N2蛋白)能够引起烟草叶片发生过敏反应；His-N2蛋白使处理烟草叶片获得H₂O₂积累，产生红褐色沉淀；His-N2蛋白使处理的烟草悬浮细胞培养基碱化，培养基pH最高的时间和天然纯化的N2蛋白引起的基本一致。

实施例8重组蛋白（His-N2蛋白）在水稻上引起的反应

（1）如实施例3中（1）的方法，定量检测重组蛋白诱导H₂O₂在处理水稻叶片上的积累。

结果：重组蛋白His-N2诱导水稻叶片产生活性氧物质的化学发光值与天然纯化的N2蛋白诱导的基本一致。

（2）诱导减少稻瘟菌对水稻的危害

将10mL、纯化后的His-N2蛋白(10μM)溶液均匀喷洒在15株水稻叶片上，三天后接种稻瘟菌，以喷洒Mes-NaOH缓冲液并三天后接种稻瘟菌的15株水稻叶片作对照，将该实验重复3次。稻瘟菌的接种方法为：取预先制备好的稻瘟菌孢子加缓冲液，该缓冲液中含1%Tween20，使稻瘟菌孢子浓度为2×10⁵个孢子/mL，均匀喷洒在水稻植株上。7天后统计植株发病数。

接种稻瘟菌7天后，调查发病植株数量，计算发病率和发病抑制率。

抑制率(%)=[(对照组发病植株数-处理组发病植株数)/对照组发病植株数]×100

发病率（%）=（发病植株数/植株总数）×100

结果如下表。

表中*表示在ρ＜0.05水平时，与对照组相比，处理组具有显著差异性。

上述结果表明，重组蛋白质激发子His-N2蛋白可以诱导减少稻瘟菌对水稻的危害，在用10μM His-N2蛋白溶液处理水稻叶片3d后再接种稻瘟菌，对发病的抑制率可以达到65%左右。

以上实施例仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims

1.一种稻瘟菌蛋白质，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

2.权利要求1所述的蛋白质在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用。

3.根据权利要求2所述的蛋白质在提高植物抗性和诱导植物防御反应中的应用，其特征在于，所述的植物为烟草和水稻。

4.一种多核苷酸，其特征在于，其核苷酸序列为下列所述之一：

（1）编码氨基酸序列如SED ID NO:2的蛋白质的多核苷酸序列；

5.一种根据权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，编码氨基酸序列如SED ID NO:2的蛋白质的多核苷酸序列，如SEQ ID NO:1所示。

6.一种重组载体，其特征在于，含有权利要求4或5所述的多核苷酸。

7.根据权利要求6所述的重组载体，其特征在于，所述载体为在载体pET30-TEV/LIC中插入了权利要求4或5所述的多核苷酸的重组载体。

8.一种遗传工程的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求6或7所述的重组载体。

9.根据权利要求8所述的遗传工程的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为含有权利要求6或7所述的重组载体的大肠杆菌Coden Plus。

10.根据权利要求1所述的蛋白质，其特征在于，所述蛋白质分离自稻瘟菌的培养液、培养液的上清液或菌体。