CN102260689A - 食品级异源分泌表达Ⅱa类细菌素的基因工程菌及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了食品级异源分泌表达IIa类细菌素的基因工程菌及其构建方法与应用。本发明提供了一种基因工程菌，本发明所提供的基因工程菌，为将含有DNA分子I的DNA片段导入宿主菌得到的基因工程菌；所述DNA分子I如下1)或2)或3)中任一所述的DNA分子：1)序列表中的序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；3)与1)或2)的DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。本发明所提供的生产IIa类细菌素的基因工程乳酸乳球菌，可实现II a类细菌素的超量表达、连续生产和快速检测。

Description

食品级异源分泌表达Ⅱa类细菌素的基因工程菌及其构建方法与应用

技术领域

本发明涉及基因工程菌及其应用，特别涉及食品级异源分泌表达IIa类细菌素的基因工程菌及其构建方法与应用。 

背景技术

食品在加工和保藏过程中，极易受到微生物污染而导致腐败变质，采用防腐剂抑制微生物，延缓腐败是当今食品保鲜的重要技术之一。据FDA估算，世界上每年约有20％以上的食品因微生物腐败而浪费，损失高达170亿美元。我国常用的防腐剂有30多种，年生产消耗约12万吨，价值约50多亿元，是一个相当大的产业，对国民经济发展有较大影响。按国家批准的使用范围和以1‰的比例添加，相当于预防了5000万吨食品腐败变质。然而，食品中使用的大多是化学防腐剂，影响人体健康，它的应用越来越受到众多国家的限制。天然生物防腐剂具有安全、无毒、适用性广、性能稳定等优点，因此，开发高效广谱食品生物防腐剂已成为现代食品工业的重要任务。 

细菌素是细菌在代谢过程中合成并分泌到环境中的一类具有抑菌活性的多肽或蛋白类物质，它在人体内可被降解，具有无毒、无残留，高效、耐酸、耐高温、无抗药性等特点，目前已成为天然防腐剂研究与开发的热点。 

II a类细菌素，是细菌素中数量最多且研究最为深入的一群，主要包括肠球菌素(enterocin)、片球菌素(pediocin)等小分子细菌素。这类细菌素不仅抑制某些腐败乳酸菌、索丝菌(Brochotrix spp.)、梭状杆菌(Clostridium spp.)、芽孢杆菌(Bacillus spp.)、葡萄球菌(Staphylococcus spp.)等，而且对食源性病原菌单增李斯特氏菌(Listeria monocylogenes)有强烈的抑制作用，具有很好的控制食品腐败菌及病原菌的潜在应用价值。此外，与其它细菌素相比，II a类细菌素的抑菌活性较强且具有良好的物理化学性质，是目前公认的最有希望应用于多种工业用途的细菌素。 

近年来，构建乳酸菌食品级异源表达系统，探究一些有巨大应用前景的IIa类细菌素基因在乳酸菌中的克隆和表达已成为乳酸菌细菌素分子遗传学的研究热点。然而传统的乳酸菌表达载体大多以红霉素或氯霉素等抗生素抗性基因作为筛选标记，虽然这为遗传操作时保持一定的选择压力并有效选择转化子，但是将抗生素抗性基因投放到环境中或人和动物体内，由于存在抗性因子转移的隐患，可能带来生物安全性的严重后果，所以从食品安全角度考虑，含抗生素抗性基因标记的微生物不能应用于食品生产中。而为了防止使用抗生素抗性标记所引起的危害，最有效的办法是使用对人体安全的食品级筛选标记替代抗生素抗性标记以构建食品级受体及载体系统。 

发明内容

本发明的一个目的是提供一种制备产细菌素的基因工程菌方法。 

本发明所提供的制备产细菌素的基因工程菌方法，包括如下步骤：将细菌素的编码基因导入宿主菌得到重组菌；从所述重组菌中获得表达所述细菌素的基因工程菌；所述细菌素的氨基酸序列如序列表中序列3所示。 

所述细菌素的编码基因为如下A)或B)所示： 

A)所述细菌素的编码基因为如下1)或2)或3)中任一所述的DNA分子： 

1)序列表中的序列1所示的DNA分子； 

2)在严格条件下与1)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子； 

3)与1)或2)的DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子； 

B)所述细菌素的编码基因为如下4)或5)或6)中任一所述的DNA分子： 

4)序列表中的序列2所示的DNA分子； 

5)在严格条件下与4)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子； 

6)与4)或5)的DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。 

所述宿主菌为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。 

所述细菌素的编码基因是通过重组表达载体导入宿主菌的。 

所述重组表达载体为将所述细菌素的编码基因插入表达载体pLEB590的BamHI和XhoI酶切位点之间得到的重组表达载体。 

由所述方法制备得到的基因工程菌也属于本发明的保护范围。 

所述基因工程菌在制备细菌素中的应用也属于本发明的保护范围。 

本发明的另一个目的是提供一种制备头细菌素的方法。 

本发明所提供的制备头细菌素的方法，包括如下步骤：发酵所述基因工程菌，即得到细菌素。 

所述发酵的培养基为GM17液体培养基； 

所述发酵的温度为30℃-37℃或37℃或30℃或34℃； 

所述发酵的时间为18小时-32小时或18小时-24小时； 

所述发酵的接种量的体积百分比为1％。 

所述方法在所述发酵之后，还包括从发酵液上清中分离纯化得到所述细菌素的步骤；所述分离纯化的方法包括以下步骤： 

(a)将发酵液上清用80％饱和度硫酸铵沉淀盐析，收集沉淀，得到细菌素粗提物； 

(b)将步骤(a)得到的细菌素粗提物进行凝胶过滤层析，用0.02mol/L磷酸缓冲液进行洗脱，收集具有抑菌活性的洗脱液，即得到为初纯细菌素样品；所述凝胶过 滤层析中采用的凝胶柱的型号为Sephadex G-10； 

(c)将步骤(b)收集的洗脱液进行阳离子交换柱层析，用含0M-1M NaCl的0.02mol/L醋酸缓冲液进行线性洗脱，收集具有抑菌活性的洗脱液，即得到细菌素；所述阳离子交换柱层析中采用的阳离子交换柱的型号为SP Sepharose Fast Flow；所述线性梯度洗脱中NaCl的浓度在40min-60min或40min或50min或60min分钟内由0M线性升至1M。 

本发明所提供的生产II a类细菌素的基因工程乳酸乳球菌，可实现II a类细菌素的超量表达、连续生产和快速检测。利用该基因工程乳酸乳球菌，可从每1000mL该基因工程乳酸乳球菌发酵液中提取纯化到5.66mg，比活力为5.12×10⁵AU/mg的细菌素enterocin P。同时，对该重组菌以选择压力物质nisin进行筛选，nisin是公认安全的天然食品防腐剂，且nisI基因来源于乳酸菌自身，这使得将nisI基因作为乳酸菌食品级筛选标记更有优势。 

附图说明

图1为重组表达质粒pLEB590-sEntP1和pLEB590-sEntP2的构建过程图。 

图2为重组表达质粒的鉴定电泳图。 

图3为重组乳酸乳球菌的生长曲线图。 

图4为纯化后细菌素的Tricine SDS-PAGE及抑菌活性检测图。 

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 

实施例1、生产细菌素的基因工程乳酸乳球菌的构建及其应用 

一、生产细菌素的基因工程乳酸乳球菌的构建 

1、Enterocin P编码基因的克隆 

1)引物设计与合成 

依据质粒pLEB590的多克隆位点(MCS)及GenBank中已知编码细菌素enterocinP的核苷酸序列(Original accession number：AF005726.1)(enterocin P的氨基酸序列如序列表中序列3所示)，在Primer 5.0上设计引物并插入两个限制性酶切位点(BamHI和XhoI)，见表1。 

表1PCR扩增enterocin P编码基因引物及产物 

a：标有下划线序列部分为BamHI和XhoI的酶切位点。 

2)PCR扩增 

以屎肠球菌(Enterococcus faecium)LM-2基因组DNA为模板，采用PCR反应试剂盒进行目的基因片段的扩增反应。PCR反应采用50μL体系进行，具体反应体系如下： 

表2PCR反应体系 

瞬时离心并混匀上述混合物后，按如下反应条件进行扩增：94℃预变性5min，94℃变性45s，55℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环，72℃延伸10min。取PCR产物4μL，以DL 2000为DNA分子标记，甲基溴芬兰为染料，1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。经检测得到的PCR产物的大小与拟扩增片段理论大小(参照表1)相同。将剩余PCR产物直接通过使用DNA回收试剂盒回收并纯化，得到目的片段sEntP1和目的片段sEntP2。 

上述屎肠球菌(Enterococcus faecium)LM-2已于2011年05月09日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.4832。 

2、Enterocin P重组表达载体的构建 

1)载体和插入片段的酶切和回收 

分别将上述得到的目的片段sEntP1、目的片段sEntP2和表达载体pLEB590(购自Valio有限公司)用BamHI和XhoI双酶切；使用DNA回收试剂盒回收并纯化DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果，并将酶切后的目的片段sEntP1和目的片段sEntP2进行测序，测序结果为：目的片段sEntP1的核苷酸序列如序列表中序列1所示；目的片段sEntP2的核苷酸序列如序列表中序列2所示。 

表达载体pLEB590包含pSH 7l复制子，组成型启动子P₄₅，并以nisin免疫基因nisI为标记基因。 

2)连接 

将经BamHI和XhoI双酶切并纯化回收的目的片段sEntP1和表达载体pLEB590片段连接；同时，将经BamHI和XhoI双酶切并纯化回收的目的片段sEntP2和表达载体pLEB590片段连接；重组质粒的构建过程如图1所示。10μL重组连接体系如下表3所示： 

表3连接反应体系 

将以上反应体系中的溶液经瞬时离心混匀后，4℃过夜连接，得到重组质粒pLEB590-sEntP1和重组质粒pLEB590-sEntP2。 

3)重组表达载体的鉴定 

分别提取重组质粒pLEB590-sEntP1和重组质粒pLEB590-sEntP2，采用PCR扩增、双酶切反应以及测序分析鉴定重组质粒。PCR扩增的反应体系、反应条件及所用引物与步骤2)相同。双酶切反应体系如下所示： 

表4酶切反应体系 

37℃反应3h后，用1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图2中(a)和图2中(b)所示；图2中(a)为重组质粒pLEB590-sEntP1的鉴定结果，其中泳道M1为1Kb DNAladder，从上到下分子量依次为1000、8000、7000、6000、5000、4000、3000、2000、1000、500bp；泳道M2为Low range DNA ladder，从上到下分子量依次2000、1500、1000、800、700、600、500、400、300、200、100bp；泳道1为重组质粒pLEB590-sEntP1的未酶切产物；泳道2为质粒pLEB590的未酶切产物；泳道3为重组质粒pLEB590-sEntP1双酶切产物；泳道4为质粒pLEB590酶切产物；泳道5为重组质粒pLEB590-sEntP1的PCR产物。图2中(b)为重组质粒pLEB590-sEntP2的鉴定结果，其中泳道M1与图2中(a)相同；泳道M2与图2中(a)相同；泳道1为重组质粒pLEB590-sEntP2的未酶切产物；泳道2为质粒pLEB590的未酶切产物；泳道3为重组质粒pLEB590-sEntP2双酶切产物；泳道4为质粒pLEB590酶切产物；泳道5为重组质粒pLEB590-sEntP2的PCR产物。从图2中(a)可见，重组质粒pLEB590-sEntP1中包含311bp目的片段sEntP1；从图2中(b)可见，重组质粒pLEB590-sEntP2中包含529bp目的片段sEntP2。 

将经PCR和酶切鉴定正确的重组质粒送测序公司进行测序，应用DNAMAN(Version 5.0)软件分析测序结果。 

将重组质粒的测序结果与Genebank中原始序列比对，所克隆目的片段sEntP1和sEntP2与原始序列在编码框上同源性为100％。以上结果说明重组质粒pLEB590-sEntP1和重组质粒pLEB590-sEntP2已成功构建。 

4)乳酸乳球菌MG1614感受态细胞的制备 

从新鲜的GM17琼脂板上挑取一个乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1614(购自Valio有限公司)单菌落，接种于GM17液体培养基(胰蛋白胨5g/L、大豆蛋白胨5g/L、牛肉膏2.5g/L、酵母膏5g/L、抗坏血酸0.5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.25g/L、磷酸氢二钠10g/L和乳糖5g/L)中，30℃静置培养过夜；将上述培养物按体积百分比为1％的接种量接种到含3.0％甘氨酸并预热的SGM17液体培养基(含2.0％甘氨酸和0.5mol/L蔗糖的GM17培养基)中，30℃静置培养至OD600达到0.7；取出培养物，置于冰上冷却30min。期间缓慢均匀摇动，以保证培养物充分冷却；将上述培养液转移至预冷的离心管中，4℃，6000rpm离心10min后，弃上清液，用1/2原体积的预冷的电转化缓冲液清洗细胞2次，最后将细胞悬浮于用1/100培养液体积的预冷电转化缓冲液中；将细胞悬液按100μL分装于1.5mL微量离心管中，贮存在-80℃，备用。 

5)电转化乳酸乳球菌MG1614感受态细胞 

吸取50μL新鲜制备的感受态细胞悬液入0.5mL冰冷的微量无菌离心管中，冰育 5min。加入2μL待转化的重组质粒pLEB590-sEntP2，得到混合液，冰育5min；将混合液加入冰冷的2mm电击转化杯中，轻击电击杯以确保混合液位于电击杯底部，并不得产生泡沫；擦干电击槽外的冷凝水和雾水；将电击杯放入电击仪。调节电击仪，使电脉冲为25μF、电压2.5kV、电阻200Ω，进行电脉冲；电脉冲结束后，尽快从电击槽中取出电击杯，加入1mL冰冷的SGM17MC再生液体培养基；混均后转移至1.5mL微量离心管中，30℃，静置温育2h；取100-200μL培养2h的培养物，涂布于含200IU/mL乳酸链球菌素(nisin)的GM17培养基中，30℃下培养，48h内可出现菌落，即得到含有重组质粒pLEB590-sEntP2的重组乳酸乳球菌。含有重组质粒pLEB590-sEntP1重组乳酸乳球菌MG1614和含有重组质粒pLEB590-sEntP2的重组乳酸乳球菌MG1614由于包含nisin免疫基因nisI，故可以在含有nisin的培养基中生长。 

用上述同样的方法得到含有重组质粒pLEB590-sEntP1的重组乳酸乳球菌和含有质粒pLEB590的重组乳酸乳球菌，将含有质粒pLEB590的重组乳酸乳球菌作为转空载体对照重组重组乳酸乳球菌；同时设未转化的乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)MG1614为野生型对照。 

二、生产细菌素的基因工程乳酸乳球菌的应用 

方法I 

1、重组表达宿主生长及抑菌活性分析 

将含有重组质粒pLEB590-sEntP1的重组乳酸乳球菌、含有重组质粒pLEB590-sEntP2的重组乳酸乳球菌细胞和转空载体对照重组乳酸乳球菌细胞分别以体积百分比为1％(约10⁵CFU/mL)的接种量接种于GM17液体培养基中，37℃下静置培养，得到发酵液；在不同时间(0-48h)取发酵液，测OD₆₀₀和抑菌效价值，绘制菌株生长和抑菌活性曲线，并比较不同重组乳酸乳球菌转化子细胞的生长特性。 

测定抑菌效价值的方法如下： 

①制备双层琼脂平板：首先取6mL TSYE固体培养基(胰蛋白胨17g/L、大豆胨3g/L、酵母浸粉6g/L、NaCl 5g/L、K₂HPO₄ 2.5g/L、葡萄糖2.5g/L和琼脂13g/L)平铺于9cm直径的平皿中，置于水平台面上使琼脂层形成均匀厚度，然后取在TSYE液体培养基(胰蛋白胨17g/L、大豆胨3g/L、酵母浸粉6g/L、NaCl 5g/L、K₂HPO₄2.5g/L和葡萄糖2.5g/L)中新鲜培养并稀释到5.0×10⁷CFU/mL的单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)NICPBP 54002(购自中国药品生物制品检定所)(指示菌)100μL加入温热的10mL TSYE琼脂试管中，轻轻混匀后倒于平皿中，置于水平台面上保持培养基厚度一致。 

②准备待测样品：取上述不同时间(0-48h)的发酵液在8000rpm，4℃低温离心10min，去除菌体沉淀，收集发酵上清液为待测样品，存放于4℃冰箱中备用。 

③二倍稀释法测定抑菌效价：将样品用pH 6.5的PBS磷酸缓冲液进行二倍稀释，取样100μL进行抑菌试验，将观察不到抑菌圈出现的最高稀释度定义为一个活力单位(1AU)，其倒数的10倍即是细菌素样品的效价值(AU/mL)。 

抑菌试验的方法如下：打开平皿盖置于无菌空气中晾30min，并用无菌镊子将牛津杯(6mm×7.8mm×10mm，购自河南新乡美乐食品机械厂购自)轻轻放置于平板上，中间保持一定距离，向其中各自加入待测样品，在保持水平的状态下将平板轻轻放于4℃冰箱中扩散过夜，然后置于37℃下培养，直至抑菌圈出现。 

菌体的OD₆₀₀和抑菌效价值结果见图3，从图中的菌体细胞生长OD₆₀₀值曲线可见，含有重组质粒pLEB590-sEntP1的重组乳酸乳球菌细胞和含有重组质粒pLEB590-sEntP2重组乳酸乳球菌细胞与转空载体对照重组乳酸乳球菌细胞均可在37℃下生长，具有几乎相同的细胞密度的生长曲线；野生型对照乳酸乳球菌细胞生长OD₆₀₀值曲线与转空载体对照重组乳酸乳球菌细胞无显著差异。这表明携带目的片段sEntP1和目的片段sEntP2的重组质粒转化进入乳酸乳球菌MG1614之后，并没有对其生长产生不利影响。而抑菌效价的分析结果显示：转空载体对照菌株在整个生长过程中不显示任何抑菌活性，而含重组质粒pLEB590-sEntP1的重组乳酸乳球菌和含有重组质粒pLEB590-sEntP2的重组乳酸乳球菌从对数生长中期(约6h)开始产生细菌素，在稳定中期(约18-36h)达到最高水平，这表明细菌素enterocin P能通过食品级载体pLEB590在乳酸乳球菌中获得表达。此外，结果还发现含有重组质粒pLEB590-sEntP2的重组乳酸乳球菌所产细菌素抑菌活性明显高于含重组重组质粒pLEB590-sEntP1的重组乳酸乳球菌，这表明enterocin P免疫基因的共表达可以明显增强该细菌素在乳酸乳球菌异源表达系统中的分泌表达水平。选择以含有重组质粒pLEB590-sEntP2的重组乳酸乳球菌为下一步试验菌株。 

2、细菌素的提取纯化 

细菌素的提取纯化提取纯化采用三步纯化程序：包括硫酸铵沉淀浓缩、凝胶过滤层析及阳离子交换树脂层析，纯化过程中以单核细胞增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)NICPBP 54002为指示菌，并采用琼脂扩散法对每步纯化样品抑菌活性进行分析。具体方法如下： 

采用80％饱和度硫酸铵盐析进行含有重组质粒pLEB590-sEntP2的重组乳酸乳球菌的发酵18小时的发酵上清液中细菌素的粗提，收集沉淀并将其复溶于原体积1/10的0.02mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)中，制备所得为细菌素粗提液。结果可从1000mL发酵上清液中获得100mL、比活力2.17×10⁴AU/mg的细菌素粗提液；接着通过Sephadex G-10凝胶过滤层析进行纯化，上样1mL细菌素粗提样品，采用pH 6.0、0.02mol/L磷酸缓冲液洗脱，流速为0.5mL/min，同时监测各管洗脱液的OD₂₈₀值。根据 OD₂₈₀值图形波峰波谷的情况，将所有峰的洗脱液分别进行合并后进行抑菌活性检测。收集有活性的样品作为初纯细菌素样品，4℃冰箱贮存备用。结果可获得150mL、比活力4.91×10⁵AU/mg的初纯细菌素样品；最后，使用SP Sepharose Fast Flow阳离子交换树脂层析进一步纯化，上样1.5mL初纯细菌素样品，以含0-1M NaCl、pH 6.5的0.02mol/L醋酸缓冲液线性梯度洗脱，线性梯度洗脱的时间是40min，所述线性梯度洗脱中NaCl的浓度在40min内由0M线性升至1M)，流速为0.5mL/min，同时检测洗脱液在280nm处的紫外吸收值，并根据OD₂₈₀值图形波峰波谷的情况，将所有峰的洗脱液分别进行合并后进行抑菌活性检测。收集有活性的样品作为纯化细菌素，最终获得50mL、比活力5.12×105AU/mg的纯化细菌素样品(表5)。 

表5重组细菌素的纯化 

由表5可以看出，通过以上三步纯化程序(硫酸铵沉淀、凝胶过滤柱层析及阳离子交换树脂层析)，每1000mL含有重组质粒pLEB590-sEntP2的重组乳酸乳球菌的发酵液可最终获得5.66mg，比活力为5.12×10⁵AU/mg的细菌素。 

总蛋白：采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自碧云天生物技术研究所，产品货号：P0012)对各样品中总蛋白质含量进行测定； 

总活力的定义为：细菌素样品所具有的总抑菌活力单位数； 

比活力的定义为：每毫克细菌素蛋白所具有的抑菌活力单位数； 

总活力(AU)＝细菌素样品效价值(AU/mL)×样品总体积(mL)； 

比活力(AU/mg)＝细菌素样品总活力(AU)/样品总蛋白含量(mg)； 

纯化倍数＝纯化后细菌素样品比活力(AU/mg)/纯化前细菌素样品比活力(AU/mg)； 

回收率(％)＝纯化后细菌素样品总活力(AU)/纯化前细菌素样品总活力(AU)×100％。 

3、纯化后细菌素的活性检测 

Tricine SDS-PAGE电泳检测纯化后细菌素：取14μL纯化细菌素样品与7μL上样缓冲液混合，上样前在65℃预煮15min。同样处理的两块胶同时进行电泳，电泳结束后，其中一块胶用考马斯亮蓝染液染色，另一块胶用25％异丙醇(体积百分比)、10％ 乙酸(体积百分比)固定凝胶20min，再用磷酸盐缓冲液(5mmol/L，pH 6.5)冲洗1h用于检测抑菌活性。 

同时，将含有重组质粒pLEB590-sEntP2的重组乳酸乳球菌细胞分别以体积百分比为1％(约10⁵CFU/mL)的接种量接种于GM17液体培养基中，37℃下静置培养18小时，然后将该发酵液在8000rpm，4℃低温离心10min，去除菌体沉淀，收集发酵上清液为待测样品，存放于4℃冰箱中备用，用与上述检测纯化后细菌素相同的方法检测发酵上清液中的细菌素。 

抑菌活性检测：将新鲜培养的对数生长中期的指示菌细胞接种于10mL、含1％低电渗琼脂糖和0.02％吐温-20的TSYE培养基中，并使最终指示菌浓度约为4.0×10⁶CFU/mL，迅速混匀后倒入平板，将待检测的电泳胶置于其上，37℃培养3h后移去电泳胶，用10mL的无菌琼脂培养基覆盖(含TSYE双倍营养成分，并添加0.8％低电渗琼脂糖)，37℃培养并观察抑菌圈的出现。 

含有重组质粒pLEB590-sEntP2的重组乳酸乳球菌发酵上清液组分及纯化所得细菌素样品的Tricine SDS-PAGE电泳并用考马斯亮蓝染色的结果，如图4中(a)所示(泳道1为标准分子量蛋白；泳道2为发酵上清液；泳道4为纯化后细菌素)，抑菌活性检测结果如图4中(b)所示(泳道4为发酵上清液；泳道5为纯化后细菌素)。从图中可见，发酵上清液及纯化样品中均可见4500Da左右的活性蛋白条带。虽然由于表达量较低，Tricine SDS-PAGE电泳目的条带较暗淡，但是电泳琼脂糖凝胶扩散试验仍可检测到明显的抑菌活性，这说明利用食品级表达载体pLEB590异源分泌表达生物活性enterocin P是可行有效的。 

方法II 

1、重组表达宿主生长及抑菌活性分析 

除发酵温度为30℃以外，其余方法均与方法I相同。 

结果与方法I无显著差异。 

2、细菌素的提取纯化 

除阳离子交换树脂层析中线性梯度洗脱的时间是50min以外，其余方法与方法I相同。 

结果与方法I无显著差异。 

方法III 

1、重组表达宿主生长及抑菌活性分析 

除发酵温度为34℃以外，其余方法均与方法I相同。 

结果与方法I无显著差异。 

2、细菌素的提取纯化 

除阳离子交换树脂层析中线性梯度洗脱的时间是60min以外，其余方法与方法I相同。 

结果与方法I无显著差异。 

Claims (10)

1.一种制备产细菌素的基因工程菌方法，包括如下步骤：将细菌素的编码基因导入宿主菌得到重组菌；从所述重组菌中获得表达所述细菌素的基因工程菌；所述细菌素的氨基酸序列如序列表中序列3所示。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

所述细菌素的编码基因为如下A)或B)所示：

A)所述细菌素的编码基因为如下1)或2)或3)中任一所述的DNA分子：

1)序列表中的序列1所示的DNA分子；

2)在严格条件下与1)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；

3)与1)或2)的DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子；

B)所述细菌素的编码基因为如下4)或5)或6)中任一所述的DNA分子：

4)序列表中的序列2所示的DNA分子；

5)在严格条件下与4)的DNA分子杂交且具有相同功能的DNA分子；

6)与4)或5)的DNA分子具有90％以上同源性且具有相同功能的DNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：

所述宿主菌为乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。

4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：

所述细菌素的编码基因是通过重组表达载体导入宿主菌的。

5.根据权利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：

所述重组表达载体为将所述细菌素的编码基因插入表达载体pLEB590的多克隆位点得到的重组表达载体。

6.由权利要求1-5中任一所述的方法制备得到的基因工程菌。

7.权利要求6所述的基因工程菌在制备细菌素中的应用。

8.一种制备细菌素的方法，包括如下步骤：发酵权利要求6所述的基因工程菌，即得到细菌素。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于：

所述发酵的温度为30℃-37℃或37℃或30℃或34℃；

所述发酵的时间为18小时-32小时或18小时-24小时；

所述发酵的接种量的体积百分比为1％。

10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于：

所述方法在所述发酵之后，还包括从发酵液上清中分离纯化得到所述细菌素的步骤；所述分离纯化的方法包括以下步骤：

(a)将发酵液上清用80％饱和度硫酸铵沉淀盐析，收集沉淀，得到细菌素粗提物；

(b)将步骤(a)得到的细菌素粗提物进行凝胶过滤层析，用0.02mol/L磷酸缓冲液进行洗脱，收集具有抑菌活性的洗脱液，即得到为初纯细菌素样品；所述凝胶过滤层析中采用的凝胶柱的型号为Sephadex G-10；

(c)将步骤(b)收集的洗脱液进行阳离子交换柱层析，用含0M-1M NaCl的0.02mol/L醋酸缓冲液进行线性洗脱，收集具有抑菌活性的洗脱液，即得到细菌素；所述阳离子交换柱层析中采用的阳离子交换柱的型号为SP Sepharose Fast Flow；所述线性梯度洗脱中NaCl的浓度在40min-60min或40min或50min或60min内由0M线性升至1M。

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