CN104046584B

CN104046584B - 一种青春双歧杆菌细菌素及其生产方法与专用生产菌株

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Publication number: CN104046584B
Application number: CN201410276051.7A
Authority: CN
Inventors: 刘国荣; 王成涛; 许朵霞; 任丽; 任桂美
Original assignee: Beijing Technology and Business University
Current assignee: Beijing Technology and Business University
Priority date: 2014-06-19
Filing date: 2014-06-19
Publication date: 2017-10-20
Anticipated expiration: 2034-06-19
Also published as: CN104046584A

Abstract

本发明公开了一种青春双歧杆菌细菌素及其生产方法与专用生产菌株。本发明提供的双歧杆菌细菌素，是发酵青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL‑8CGMCC№.7791，得到的细菌素。本发明提供了青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)代谢产细菌素的最佳培养基组成和培养条件。本发明还提供了青春双歧杆菌细菌素的提取纯化方法，即通过硫酸铵盐析沉淀粗提，凝胶过滤层析及阳离子交换树脂层析纯化得到细菌素纯品。本发明所提供的双歧杆菌细菌素分子量为829.23Da，是一种新型双歧杆菌细菌素，具有非常良好的食品加工特性，抑菌谱广，安全性高，可用于天然食品生物防腐剂的开发。

Description

一种青春双歧杆菌细菌素及其生产方法与专用生产菌株

技术领域

本发明涉及一种青春双歧杆菌细菌素及其生产方法与专用生产菌株，属于食品生物技术领域。

背景技术

食品在加工运输储藏的过程中极易受到微生物污染腐败变质进而引发各种食品安全事件，开发新型绿色食品防腐保鲜剂是当今食品工业急需解决的重要问题之一，近年来无毒、无副作用、无耐药性、可在人体内降解的天然微生物防腐剂的出现为解决该问题提供了一个新思路。

乳酸菌细菌素是乳酸菌在代谢过程中通过核糖体合成机制产生的具有抑菌活性的多肽或蛋白类物质，可抑制或杀死部分食品腐败菌和致病菌的生长，具有耐受一定热和酸碱以及在人体内可降解、无毒无残留的特点。此外，将乳酸菌细菌素的产生菌株添加到食品中，还可以改善发酵产品的感官品质和功能性。这些都显示出乳酸菌细菌素及其产生菌作为天然生物防腐剂在食品工业中的巨大应用前景。

双歧杆菌是乳酸菌的一个重要分支，因其调节肠道平衡，提高免疫力等众多生理功能受到大众的关注，被广泛添加到食品和药物制剂中，可改善产品品质及功能特性，抗菌消炎，提高人体免疫力等。业已发现，极少数双歧杆菌属菌株也可产生细菌素，如两歧双歧杆菌(B.bifidum)NCFB1454、嗜热双歧杆菌(B.thermophilum)RBL67、婴儿双歧杆菌(B.infants)BCRC14602等。截至目前，国内外还未见有产细菌素青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)的报道。

双歧杆菌是人体肠道健康的重要指标，在食品工业中也占有重要地位，其所产细菌素也越来越受到人们的重视，必将成为天然食品生物防腐剂的开发热点。

发明内容

本发明的目的是提供一株具有广谱抑菌效果的产细菌素双歧杆菌。

本发明所提供的双歧杆菌，是青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL-8，已于2013年06月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为：CGMCC№.7791。

本发明的第二个目的是提供一种双歧杆菌细菌素及其生产方法。

本发明所提供的双歧杆菌细菌素，是发酵青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentis)BL-8CGMCC№.7791得到的细菌素。

所述方法中，用于培养青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL-8CGMCC№.7791的培养基优选组成为：乳糖2％、胰蛋白胨2％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、磷酸氢二钾0.2％、柠檬酸二胺0.2％、乙酸钠0.5％、吐温80 0.1％、七水合硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％、玉米浆0.35％、L-半胱氨酸盐酸0.035％，pH6.5，所述百分数均为质量百分比。

所述方法中，用于培养青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL-8CGMCC№.7791的培养时间优选为32h，培养基起始pH值优选为6.5，培养温度优选为37℃。

所述方法中，得到的细菌素可按照以下步骤进行纯化：首先采用60-80％硫酸铵饱和度从发酵液中盐析提取细菌素粗品；进一步通过凝胶过滤层析及阳离子交换树脂层析纯化，最后经冷冻干燥得到细菌素纯品。

其中，上述硫酸铵沉淀法的最佳硫酸铵饱和度为80％。

上述凝胶过滤层析以Sephadex G-25为凝胶填料，流速0.5mL/min，收集保留时间为72-80min的蛋白峰为细菌素活性峰。

上述阳离子交换树脂层析以SP Sepharose Fast Flow为凝胶填料，用pH5.5含0-1M NaCl的0.02M醋酸缓冲液在60min内进行线性梯度洗脱，流速0.8mL/min，收集保留时间为8-18min的蛋白峰为细菌素活性峰。

上述纯化得到的细菌素分子量为829.23Da。

上述方法得到的双歧杆菌细菌素也属于本发明的保护范围。

本发明的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL-8CGMCC№.7791是一种产细菌素的青春双歧杆菌，该细菌素是一种新型双歧杆菌细菌素，其具有良好的食品加工特性和安全性，抑菌谱广，可用于天然食品生物防腐剂的开发。

附图说明

图1为细菌素的凝胶过滤层析洗脱曲线图。

图2为细菌素的阳离子交换树脂层析洗脱曲线图。

图3为细菌素的MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)分析图。

具体实施方式

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。应理解，这些实施仅用于说明本发明而不仅限于本发明。

实施例1、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL-8CGMCC№.7791的分离和鉴定

1、菌株的筛选

无菌称取新疆吐鲁番地区长寿老人粪便25g，迅速放入225mL缓冲蛋白胨水中，再将其10倍梯度稀释至活菌数10^-6-10^-10cfu/mL，然后吸取0.2mL进行亨盖特厌氧滚管，放于37℃恒温箱培养48-72h。挑选菌落特征为乳白色或微带黄色、边缘整齐、凸圆、光滑、质地柔软的中小菌落接种于改良MRS液体培养基中，厌氧培养24-48h，进行革兰氏染色。挑选革兰氏染色观察有双歧杆菌形态特征的、白色或微黄色、边缘光滑整齐、周围有透明圈的菌落接种于改良MRS培养基，于37℃分别在有氧和厌氧环境下培养24h，同时进行生理生化检验。最终选取在厌氧条件生长、有氧条件不生长、KOH试验阴性、吲哚试验阴性、过氧化氢酶试验阴性、能代谢葡萄糖但不产气的菌初步确定为筛选出的双歧杆菌。以大肠杆菌(Escherichiacoli)1.90为指示菌，采用牛津杯琼脂平板扩散法进行抑菌实验，筛选得到具有较强抑菌活性的菌株为产细菌素的可疑菌株9株。

为确定上述可疑菌株所产抑菌物质为细菌素，需要排除有机酸、H₂O₂、菌体细胞等干扰因素后对产细菌素的可疑菌株进行进一步鉴定。具体包括：(1)排除有机酸的干扰：将可疑菌株发酵上清液用1mol/L NaOH调pH值为6.5～7左右，进行抑菌实验，对比排酸前后的抑菌圈直径。(2)排除H₂O₂的干扰：在37℃条件下用过氧化氢酶处理可疑菌株发酵液2h，以未处理发酵液作对照进行抑菌实验，对比抑菌圈直径差异。(3)排除菌体细胞的干扰：将发酵液于4℃，8000rpm离心10min，取上清液过微孔滤膜(尺寸Φ25，孔径0.22μm)的细菌过滤器过滤，进行抑菌实验。(4)用硫酸铵沉淀法粗提细菌素后经1000Da透析袋透析除盐，加入蛋白酶K(20U/mL)，37℃反应1h，以确定细菌素为蛋白类物质。排除这9株可疑菌株发酵液中有机酸、H₂O₂及菌体细胞等干扰因素的影响并经硫酸铵沉淀、透析处理后检测抑菌活性，发现仅有菌株BL-8仍具有较高抑菌活性。向透析液中加入蛋白酶K(20U/mL)，37℃作用1h后发现抑菌活性消失，具体结果见表1。综合以上，基本确定菌株BL-8所产抑菌物质为细菌素，并选择该菌株为筛选所得优良菌株。

表1 不同处理对菌株BL-8发酵液抑菌活性的影响

2、菌株的鉴定

目标菌株BL-8的鉴定主要是通过形态学观察、API20A生理生化反应和16S rDNA序列分析进行的。菌株BL-8在有氧条件下无明显生长，在厌氧环境下的改良固体MRS中生长良好，菌落呈白色或微黄色，圆形，边缘较光滑；挑取菌落进行革兰氏染色后进行显微镜观察，发现：BL-8菌株为G⁺菌，无芽孢，菌体细胞形态部分为Y或V字形等分叉杆状，不规则排列。运用API20A厌氧鉴定系统，参考API细菌鉴定标准对菌株BL-8进行20种糖醇发酵试验。查表分析试剂条反应结果，初步确定BL-8属于双歧杆菌属(Bifodobacterium spp.)。提取菌株BL-8的DNA基因组，经PCR扩增得到1258bp的DNA序列片段(见序列表)，并将其回收纯化，交由北京六合华大基因科技有限公司测序。将测序结果在NCBI上的Genebank中进行同源性比对，使用Mega3.1软件构建系统发育树。由系统发育树可知，菌株BL-8与Bifodobacteriumadolescentis处于同一个小分支，相似度高达98.9％，亲缘关系最近；结合形态学观察和API20A生化鉴定结果，确定菌株BL-8为青春双歧杆菌(Bifodobacterium adolescentis)。

青春双歧杆菌(Bifodobacterium adolescentis)BL-8已于2013年06月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记号为：CGMCC№.7791。

实施例2、利用青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL-8CGMCC№.7791生产细菌素

1、细菌素活性检测方法

(1)选择标准曲线范围：将500mg nisin(乳酸链球菌素)标准品(10⁶AU/g)溶于50mL无菌的0.02mol/L的盐酸稀释溶液中，配成10⁴AU/mL的标准液备用。用0.02mol/L HCl依次将10⁴AU/mL的nisin标准液稀释成5000，2500，1000，750，500，250，100，75，50，25，10AU/mL的标准溶液。分别取100μL依次加于已制备好平板的牛津杯中，每个浓度重复3个平板，做抑菌试验，以抑菌圈直径的校正值为横坐标，nisin效价的对数为纵坐标，绘制标准曲线。确定抑菌圈直径与效价对数值有较好的线性关系时的nisin效价范围。其中，以大肠杆菌(Escherichia coli)1.90为指示菌，nisin标准品购于Sigma公司。

(2)制作效价值标准曲线：根据上一步确定的nisin效价范围，以大肠杆菌(Escherichia coli)1.90为指示菌，做抑菌试验，制作Nisin效价标准曲线。用0.02mol/LHCl依次将10⁴AU/mL的nisin标准液稀释成1000，750，500，250，100，75和50AU/mL，依次取100μL分别加入平板(已制备好)中相互间隔的3个牛津杯中，同时将100μL中心浓度的nisin溶液加入另外间隔的3个中，每个梯度重复3个平板，将对应的效价值对数为纵坐标，对应抑菌圈直径的差数为横坐标，进行标准曲线的绘制。

(3)确定样品的效价值：将不同样品稀释适当倍数后，取100μL分别加入相互间隔的3个牛津杯中，将对照(nisin效价曲线的中间浓度)加入另外间隔的3个牛津杯中，重复3次试验。将抑菌圈直径与对照抑菌圈直径的差值代入标准曲线中计算，可得到样品的效价值

结果显示，当nisin效价在100～2000AU/mL时，效价对数值与抑菌圈直径差值呈较好的线性关系，拟合曲线的线性程度较高，说明该标准曲线对于效价测定有较高的精确度和灵敏度，因此确定其作为测定样品效价的标准曲线，得到其回归方程为y＝0.1778x+2.4557(R²＝0.9966)，其中y表示相对抑菌效价的对数值；x表示抑菌圈直径/mm，将待测细菌素样品的抑菌圈直径代入即可得到该细菌素的抑菌效价。

2、双歧杆菌细菌素产生培养基的优化

选取改良MRS培养基为基础培养基(配方为蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、磷酸氢二钾0.2％、柠檬酸二胺0.2％、乙酸钠0.5％、葡萄糖2％、吐温80 0.1％、七水合硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％、玉米浆0.35％、L-半胱氨酸盐酸0.035％，pH6.5，所述百分数均为质量百分比)，以10⁴cfu/mL为接种量，以pH6.5为起始pH，将青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL-8CGMCC№.7791在37℃下培养30h，测定细菌素活性，比较不同碳源、氮源、刺激因子及磷酸盐缓冲液对青春双歧杆菌产生细菌素的影响，确定最佳培养基组成。

(1)不同碳源的影响：分别选择木糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、纤维二糖取代改良MRS培养基中的葡萄糖成分，以2％(质量比)的含量添加，在上述条件下培养，测定细菌素效价，结果如表2所示：青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL-8CGMCC№.7791可以利用多种碳源。当培养基中碳源为乳糖时，细菌素活性最强，效价高达275.65AU/mL，显著高于葡萄糖(233.67AU/mL)等其它碳源(P＜0.05)，选其作为培养基的最佳碳源。

表2 不同碳源对菌株BL-8代谢产细菌素的的影响

(2)不同氮源的影响：分别选取有机氮源：胰蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨、蛋白胨、酪蛋白，无机氮源：硝酸钠作为培养基中的氮源，以1％含量添加，在上述条件下培养，测定所产细菌素效价得表3。结果显示，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL-8CGMCC №.7791可以利用大多数的有机氮源，对无机氮源利用率相对较低，对各种氮源的利用率差异显著(P＜0.05)。有机氮源中胰蛋白胨(264.34AU/mL)和牛肉膏(253.70AU/mL)无显著差异(P＞0.05)，均明显高于大豆蛋白胨、蛋白胨和酪蛋白。鉴于复合氮源的使用可以大大提高发酵效率，故选择胰蛋白胨和牛肉膏作为发酵培养基的混合氮源，进行下一步实验。

表3 不同氮源对菌株BL-8代谢产细菌素的的影响

(3)不同刺激因子的影响：在培养基中分别添加0.1％(质量比)含量的刺激因子：吐温80、吐温20和聚乙二醇，将菌株BL-8在上述条件下培养后测定细菌素抑菌活性，比较活性差异，结果如表4：不同刺激因子对细菌素产量影响差异显著(P＜0.05)，以吐温80为刺激因子时效价较高，可达281.92AU/mL，说明其能更好刺激细菌素产生，选择其作为培养基中的刺激因子。

表4 不同刺激因子对菌株BL-8代谢产细菌素的的影响

(4)不同磷酸盐缓冲液的影响：分别将四种磷酸盐：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠和磷酸二氢钠添加到培养基中，按培养基0.2％的质量比例添加，在上述条件下培养，比较含不同磷酸盐培养基中细菌素的抑菌效果，结果如表5：四种磷酸盐对细菌素产量影响的差异不显著(P＜0.05)，磷酸氢二钾和磷酸二氢钾相差不多，明显高于磷酸氢二钠和磷酸二氢钠。其中，以磷酸氢二钾作为培养基磷酸盐缓冲液时，细菌素效价高达285.14AU/mL。

表5 不同磷酸盐缓冲液对菌株BL-8代谢产细菌素的的影响

由培养基优化实验结果可知，碳源、氮源及刺激因子作为培养基组分对细菌素的产生影响较为显著(P＜0.05)，磷酸盐缓冲液影响不显著(P＞0.05)。故选择乳糖为最优碳源、胰蛋白胨和牛肉膏为最优复合氮源、吐温80为最优刺激因子，以单因素确定的最优因素水平为中心值，设计四因素三水平系列正交优化试验(表6)。结果表明，碳源、氮源和刺激因子的最优组合为乳糖2％、胰蛋白胨2％、牛肉膏1％、吐温80为1％。故正交试验优化后得到的最优培养基配方为：胰蛋白胨2％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、磷酸氢二钾0.2％、柠檬酸二胺0.2％、乙酸钠0.5％、乳糖2％、吐温80 0.1％、七水合硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％、玉米浆0.35％、L-半胱氨酸盐酸0.035％，pH6.5，所述百分数均为质量百分比。采用此优化后培养基发酵得到的细菌素效价达到532.79AU/mL。

表6 四因素三水平正交设计因素水平表

3、双歧杆菌细菌素产生条件的优化

采用上述优化所得最优培养基，10⁵cfu/mL接种量，37℃下厌氧培养60h，并分别于0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、54、60h取样测定青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL-8CGMCC№.7791的生长量及其细菌素的产量，确定最优培养时间。并分别对比不同接种量(10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷cfu/mL)、培养起始pH值(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、8.0)、培养温度(25℃、30℃、37℃、40℃、45℃)对细菌素产量的影响，以得到最优培养条件。

通过单因素试验，以细菌素效价为评价指标，分确定最优培养时间为32h、接种量为10⁴cfu/mL、培养起始pH为6.5、培养温度为37℃，在此培养条件下，细菌素效价可达到749.45AU/mL，是优化前(532.79AU/mL)的提1.41倍。

实施例3、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL-8CGMCC№.7791所产细菌素的提取纯化

1、硫酸铵盐析沉淀法提取

最佳硫酸铵饱和度的确定：以实施案例2所得最优培养基组成及培养条件，培养青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL-8CGMCC№.7791，并将获得的发酵液于4℃，8000rpm离心10min，保留上清液并分别添加20-80％硫酸铵搅拌2h，4℃放置过夜。取出4℃12000rpm离心10min，将沉淀复溶于1/5发酵液原体积的25mM磷酸盐缓冲液PBS(pH6.5)，得到细菌素粗提物，以含有同等硫酸铵饱和度的PBS为对照。最后，将获得的细菌素粗提取物用1000Da透析袋透析除盐后用聚乙二醇吸水浓缩至原体积，分析比较抑菌活性，确定最适硫酸铵盐析饱和度。抑菌活性检测采用琼脂平板扩散法，以大肠杆菌(Escherichiacoli)1.90为指示菌进行。

结果显示，当硫酸铵浓度为80％时得到的细菌素产量显著高于其他硫酸铵饱和度，故将其作为最佳硫酸铵饱和度。即每100mL发酵液通过硫酸铵盐析沉淀法可获得20mL，效价2699.7AU/mL的细菌素粗品。

2、细菌素的纯化

细菌素的纯化采用凝胶过滤层析和阳离子交换树脂层析，纯化过程以大肠杆菌(Escherichia coli)1.90为指示菌，采用琼脂平板扩散法对每步纯化样品抑菌活性进行分析。具体方法如下：将硫酸铵盐析沉淀法提取得到的细菌素粗提物经凝胶过滤层析进行纯化，所述分离条件为：以Sephadex G-25为凝胶填料，上样1mL，流速0.5mL/min，用超纯水进行洗脱，每2min接收1管，同时监测各管洗脱液的A₂₈₀值。根据A₂₈₀值图形波峰波谷的情况，分别检测各管洗脱液的抑菌活性(图1)，收集保留时间为72-80min(即第36-40管)的蛋白峰为细菌素活性峰，经冷冻干燥浓缩复溶于pH7.0磷酸缓冲液中，作为初纯细菌素样品，4℃冰箱贮存备用。结果可获得10mL，效价3911.2AU/mL的细菌素半纯品，纯度提高了13.52倍；进一步采用阳离子交换树脂层析纯化上述步骤得到的细菌素半纯品，所述分离条件为：以SPSepharose Fast Flow为凝胶填料，上样1mL，以含0-1M NaCl、pH5.5的0.02mol/L醋酸缓冲液线性梯度洗脱，线性梯度洗脱的时间是60min，所述线性梯度洗脱中NaCl的浓度在60min内由0M线性升至1M，流速为0.8mL/min，同时检测洗脱液在280nm处的紫外吸收值，并根据A₂₈₀值图形波峰波谷的情况，将所有峰的洗脱液分别进行合并后进行抑菌活性检测，结果如图2所示。收集保留时间为8-18min(即第19-24管)的蛋白峰为细菌素活性峰，经冷冻干燥浓缩复溶于pH7.0磷酸缓冲液中，作为细菌素纯品，4℃冰箱贮存备用。最终获得2mL，比活力高达1847.31AU/mg的细菌素纯品(表7)。

表7 不同阶段细菌素纯化效果分析表

由表7可以看出，通过以上提取纯化程序(硫酸铵沉淀提取、凝胶过滤柱层析及阳离子交换树脂层析)，每100mL青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL-8CGMCC№.7791发酵液可最终获得2mL，比活力高达1847.31AU/mg的细菌素纯品。

总蛋白：采用BCA蛋白浓度测定试剂盒(购自碧云天生物技术研究所，产品货号：P0012)对各样品中总蛋白质含量进行测定；

总活力的定义为：细菌素样品所具有的总抑菌活力单位数；

比活力的定义为：每毫克细菌素蛋白所具有的抑菌活力单位数；

总活力(AU)＝细菌素样品效价值(AU/mL)×样品总体积(mL)；

比活力(AU/mg)＝细菌素样品总活力(AU)/样品总蛋白含量(mg)；

纯化倍数＝纯化后细菌素样品比活力(AU/mg)/纯化前细菌素样品比活力(AU/mg)；

回收率(％)＝纯化后细菌素样品总活力(AU)/纯化前细菌素样品总活力(AU)×100％。

3、纯化细菌素的分子量确定

为了确定细菌素的纯度及精确地分子量，用MALDI-TOF MS(基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱)对纯化所得细菌素样品进行分析，确定纯化所得样品为单一成分物质，并得到该细菌素的分子量为829.23Da，如图3所示。

实施例4、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL-8CGMCC№.7791所产细菌素的应用特性

1、细菌素的理化特性

(1)热稳定性：准备7管细菌素样品(效价5662.15AU/mL)，1mL/管，分别水浴加热处理50℃、30min；60℃、30min；70℃、30min；80℃、30min；90℃、30min；121℃、20min。以未经热处理的样品为对照，进行抑菌试验，检测细菌素活性变化。结果表明：菌株BL-8所产细菌素经50～80℃，处理30min，能保持92％以上的活性残留；90℃处理其抑菌活性仅损失33％；121℃，20min的高温处理后仍有26％左右的抑菌活性，说明该细菌素具有较强的热稳定性。

(2)酸碱耐受性：选取pH范围2～11处理进行细菌素酸碱耐受性试验。分别取0.5mL的细菌素样品(pH7.0，效价5662.15AU/mL)于10个试管中，用1mol/L HCl和1mol/L NaOH分别调其至所要求pH，37℃温育4h后，将所有试管调pH至中性(7.0左右)，以未调节pH的样品加蒸馏水同比稀释的细菌素样品(pH＝7.0)为对照，进行抑菌试验，检测细菌素活性变化。结果表明：菌株BL-8所产细菌素的抑菌活性在pH2-10范围内基本保持不变，残留效价比均在80％以上；而pH为11时，抑菌活性明显降低，残留效价比最高只有12％。这些结果显示该细菌素具有较宽泛的pH值活性范围，可在多种食品(酸性和中性)中广泛使用。

(3)蛋白酶敏感性：将不同蛋白酶(胰蛋白酶、胃蛋白酶、酸性蛋白酶、中性蛋白酶、溶菌酶)配成5mg/mL的溶液，分别取0.1mL置于离心管中，分别加入纯化后的细菌素样品(效价5662.15AU/mL)0.4mL，使酶的终浓度为1mg/mL，并调节pH为各酶的最适pH范围内，同时以0.1mL无菌水加入0.4mL细菌素作为对照，37℃温育4h，检测细菌素活性。结果表明，菌株BL-8所产细菌素对胃蛋白酶和胰蛋白酶敏感，对酸性蛋白酶和中性蛋白酶部分敏感，对溶菌酶完全不敏感。此实验证明双歧杆菌所产细菌可被人体内的部分蛋白酶分解消化，作为生物防腐剂进入人体后安全无残留，在实际应用具有很高的安全性。

2、细菌素的抑菌谱

采用牛津杯双层平板琼脂扩散法制作不同指示菌平板，指示菌细菌终浓度为10⁷cfu/mL，真菌、酵母细胞或孢子浓度为10⁴个/mL，牛津杯中加样品后于指示菌最适条件培养，测定抑菌圈直径。如表8所示：菌株BL-8所产细菌素有较宽的抑菌范围，不仅对李斯特菌、葡萄球菌、芽孢杆菌等革兰氏阳性菌有明显抑制作用，对大肠杆菌等阴性菌也表现出非常强烈的抑菌活性。其中，细菌素对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果最强，抑菌圈直径高达30mm以上。但是细菌素对三株受试真菌(普通青霉菌、白假丝酵母菌和啤酒酵母菌)、假单胞菌、沙门氏菌、猪链球菌及蜡样芽孢杆菌未表现出抑菌活性。

表8 菌株BL-8所产细菌素的抑菌谱

注：NICPBP为卫生部药品生物制品检定，ATCC为美国标准菌种保藏所，CVCC为中国兽医微生物菌种保藏中心，CGMCC为普通微生物菌种保藏管理中心；-表示没有抑制，+表示抑菌圈直径＜13mm，++表示抑菌圈直径为13～20mm，+++表示抑菌圈直径＞20～30mm，++++表示抑菌圈直径＞30mm。

Claims

1.青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)BL-8，其特征在于，所述的青春双歧杆菌BL-8保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为BL-8CGMCC No.7791。

2.一种生产青春双歧杆菌细菌素的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

(1)发酵权利要求1所述的青春双歧杆菌；

(2)从发酵液中提取并纯化所述青春双歧杆菌细菌素；

所述发酵的培养基组成为：乳糖2％、胰蛋白胨2％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、磷酸氢二钾0.2％、柠檬酸二胺0.2％、乙酸钠0.5％、吐温80 0.1％、七水合硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％、玉米浆0.35％、L-半胱氨酸盐酸0.035％，pH6.5，所述百分数均为质量百分比。

3.根据权利要求2所述方法，其特征在于：发酵所述青春双歧杆菌的温度为37℃，培养时间为32h。

4.根据权利要求2或3任一所述的方法，其特征在于，所述的提取并纯化的步骤为：

(1)采用60-80％饱和度硫酸铵从发酵液中盐析提取细菌素粗品；

(2)通过凝胶过滤层析或阳离子交换树脂层析纯化，并经冷冻干燥得到所述青春双歧杆菌细菌素纯品。

5.根据权利要求4所述方法，其特征在于：所述硫酸铵饱和度为80％。

6.根据权利要求4所述方法，其特征在于：所述凝胶过滤层析的方法参数为：以Sephadex G-25为凝胶填料，流速0.5mL/min，收集保留时间为72-80min的蛋白峰，即得所述青春双歧杆菌细菌素溶液。

7.根据权利要求4所述方法，其特征在于：所述阳离子交换树脂层析的方法参数为：以SP Sepharose Fast Flow为凝胶填料，用pH5.5的含0-1M NaCl的0.02M醋酸缓冲液在60min内进行线性梯度洗脱，流速0.8mL/min，收集保留时间为8-18min的蛋白峰，即得所述青春双歧杆菌细菌素溶液。

8.根据权利要求4所述方法，其特征在于：纯化后得到的青春双歧杆菌细菌素分子量为829.23Da。