CN111534453B - 一株可抑制丝状真菌的青春双歧杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株可抑制丝状真菌的青春双歧杆菌及其应用，属于生物技术领域。本发明提供了一株青春双歧杆菌CCFM1108，此菌株可抑制丝状真菌，具体体现在：将此菌株分别与扩展青霉孢子、黑曲霉孢子、娄地青霉孢子或指状青霉孢子共培养后，可在7天内显著抑制扩展青霉、黑曲霉、娄地青霉或指状青霉孢子的萌发率；将此菌株的发酵上清液分别与扩展青霉孢子、黑曲霉孢子、娄地青霉孢子或指状青霉孢子共培养后，可显著抑制扩展青霉孢子、黑曲霉孢子、娄地青霉孢子或指状青霉孢子的萌发且孢子萌发抑制率分别可高达99.88±0.66％、92.23±0.53％、88.83±0.82％、99.25±0.62％。
Description
技术领域
本发明涉及一株可抑制丝状真菌的青春双歧杆菌及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
果蔬腐败会导致果蔬的外观缺陷和营养缺失。在冷藏和运输设施不完善的发展中国家，果蔬腐败的问题尤为突出，其对果蔬行业造成的损失也尤为严重。
扩展青霉、黑曲霉、娄地青霉、指状青霉等丝状真菌均是造成果蔬腐败的元凶之一，它们主要通过侵蚀果蔬的叶片、果实等造成果蔬腐败，进而引起果蔬的贮藏病害，并且，它们会产生毒素(例如，展青霉素和桔霉素)，这些毒素会残留在果蔬中，进而通过食物链进入人体，具有潜在的危害性。因此，抑制扩展青霉、黑曲霉、娄地青霉、指状青霉等丝状真菌对防止果蔬腐败，进而减少果蔬行业的损失来说也十分重要。
目前，丝状真菌导致的果蔬腐败问题主要通过化学杀菌剂来控制，但是，考虑到丝状真菌抗药性的出现以及化学杀菌剂残留量对人体造成的潜在健康威胁，人们趋于开发生态友好的方法来控制水果采后腐烂。
与化学杀菌剂相比，物理防治法和生物防治法均在生态友好方面具有一定优势。其中，物理防治法主要是通过将果蔬进行微波加热和冷藏来抑制丝状真菌感染，但是，由于微波加热和冷藏等物理手段在果蔬表面停留之间很短，物理防治法不具有持续性。
生物防治法则主要是通过拮抗微生物来抑制丝状真菌感染，此方法与物理防治法相比持续性比较好，但是，生物防治法存在效果较差的缺陷，这主要是因为很多拮抗微生物本身也属于真菌，也会导致水果表面真菌性腐败。因此，急需找到一种抑制扩展青霉等丝状真菌能力强的非真菌类拮抗微生物以解决现有生物防治法存在的缺陷。
发明内容
[技术问题]
本发明要解决的技术问题是提供一株可抑制丝状真菌的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)。
[技术方案]
为解决上述技术问题，本发明提供了一株青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentic)CCFM1108，其特征在于，所述青春双歧杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60925，保藏日期为2019年12月09日。
所述青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108来源于广东地区的健康成年人粪便样本，该菌株经测序分析，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)，命名为青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentic)CCFM1108。
所述青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108在mMRS固体培养基上的菌落直径范围0.5～2mm，正面形态圆形，侧面形态呈突起状，边缘整齐，乳白色或淡黄色，不透明，表面湿润光滑，无色素产生。
本发明还提供了一种丝状真菌抑制剂，所述抑制剂的成分包含上述青春双歧杆菌CCFM1108和/或上述青春双歧杆菌CCFM1108的发酵上清液。所述青春双歧杆菌CCFM1108的发酵上清液是通过将青春双歧杆菌CCFM1108接种至培养基中进行发酵获得的。
在本发明的一种实施方式中，所述抑制剂的成分还包含载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为药学上可接受的载体。
在本发明的一种实施方式中，所述载体为填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂和/或矫味剂。
在本发明的一种实施方式中，所述抑制剂的剂型为粉剂、乳剂、颗粒剂或微粒剂。
本发明还提供了一种抑制丝状真菌的方法，所述方法为将上述丝状真菌抑制剂与丝状真菌进行共培养。
在本发明的一种实施方式中，所述抑制丝状真菌包括降低丝状真菌孢子的萌发率、抑制丝状真菌菌丝体的生长、降低丝状真菌产毒素的产量和/或降低丝状真菌LaeA基因的表达量。
本发明还提供了上述青春双歧杆菌或上述丝状真菌抑制剂或上述方法在抑制丝状真菌方面不以疾病的诊断和治疗为目的的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述抑制丝状真菌包括降低丝状真菌孢子的萌发率、抑制丝状真菌菌丝体的生长、降低丝状真菌产毒素的产量和/或降低丝状真菌LaeA基因的表达量。
本发明还提供了上述青春双歧杆菌或上述丝状真菌抑制剂或上述方法在防止果蔬腐败中的应用。
[有益效果]
1、本发明提供了一株青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108，此青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108可抑制丝状真菌，具体体现在：
(1)将此青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108分别与扩展青霉孢子、黑曲霉孢子、娄地青霉孢子或指状青霉孢子共培养后，可在7天内显著抑制扩展青霉、黑曲霉、娄地青霉或指状青霉孢子的萌发率；
(2)将此青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液分别与扩展青霉孢子、黑曲霉孢子、娄地青霉孢子或指状青霉孢子共培养后，可显著抑制扩展青霉孢子、黑曲霉孢子、娄地青霉孢子或指状青霉孢子的萌发且孢子萌发抑制率分别可高达99.88±0.66％、92.23±0.53％、88.83±0.82％、99.25±0.62％；
(3)将扩展青霉孢子接种至含有此青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentic)CCFM1108发酵上清液的培养基上进行培养后，扩展青霉菌丝体的生长被显著抑制，且当培养基中青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液的浓度达到20％(v/v)时，抑制率可达100％；
(4)将扩展青霉孢子接种至含有此青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentic)CCFM1108发酵上清液的培养基上进行培养后，扩展青霉产展青霉素的产量被显著抑制，且当培养基中青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液的浓度达到20％(v/v)时，抑制率可达83.5％；
(5)将扩展青霉孢子接种至含有此青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentic)CCFM1108发酵上清液的培养基上进行培养后，扩展青霉LaeA基因的相对表达量显著降低，与接种至不含此青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液的培养基上进行培养的扩展青霉相比显著降低，
因此，本发明的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108在抑制扩展青霉、防止果蔬腐败中具有极高的应用前景。
2、本发明提供了一株青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108，此青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108的发酵上清液可抑制扩展青霉，且此青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108的发酵上清液具有良好的酸稳定性、热稳定性和蛋白酶稳定性，具体体现在：
(1)青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液的pH为3.42，此时，其对扩展青霉菌丝体生长的抑制能力较强；
(2)经加热处理后，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉菌丝体生长的抑制能力较未经加热处理的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液略有提高；
(3)经蛋白酶处理后，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉菌丝体生长的抑制能力较未经蛋白酶处理的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液略有提高，
因此，本发明的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108在抑制扩展青霉、防止果蔬腐败中具有极高的应用前景。
生物材料保藏
一株青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108，所述青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108已于2019年12月09日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60925，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
附图说明
图1：不同浓度青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉菌丝体生长的影响。
图2：不同浓度青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对展青霉素合成量的影响。
图3：青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉patA基因表达的影响
图4：经不同方式处理后的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉菌丝体生长的影响。
具体实施方式
下面结合具体实施例和附图对本发明进行进一步的阐述。
下述实施例中涉及的扩展青霉购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，产品编号为CICC 40658；下述实施例中涉及的黑曲霉购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，产品编号为CICC 2089；下述实施例中涉及的娄地青霉购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，产品编号为CICC 40663；下述实施例中涉及的指状青霉购自北纳生物，产品编号为BNCC336887。
下述实施例中涉及的培养基如下：
mMRS固体培养基：在1L蒸馏水中加入10g蛋白胨、10g牛肉膏、20g葡萄糖、5g酵母浸膏、2g无水乙酸钠、0.25g一水硫酸锰、1mL吐温80、2.6g三水合磷酸氢二钾、0.5g七水硫酸镁、2g柠檬酸二铵、1g半胱氨酸盐酸盐、18g琼脂粉，pH 6.2～6.5。
mMRS液体培养基：在1L蒸馏水中加入10g蛋白胨、10g牛肉膏、20g葡萄糖、5g酵母浸膏、2g无水乙酸钠、0.25g一水硫酸锰、1mL吐温80、2.6g三水合磷酸氢二钾、0.5g七水硫酸镁、2g柠檬酸二铵、1g半胱氨酸盐酸盐，pH 6.2～6.5。
PDA培养基：在1L马铃薯汁中加入20g葡萄糖和18g琼脂，自然pH。
实施例1：青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108的筛选、鉴定、培养和观察
1、筛选
取1g来源于无锡地区的健康成年人粪便样本，用生理盐水梯度稀释后涂布于mMRS固体培养基上，置于37℃厌氧环境中培养72h，观察并记录菌落形态；挑取菌落在mMRS固体培养基上划线，于37℃厌氧环境下进行纯化培养，获得纯化后的单菌落；挑取单菌落在mMRS固体培养基上划线，37℃厌氧培养48h，对所得菌落进行革兰氏染色(革兰氏染色方法参考教科书《工业微生物育种学》作者：诸葛健著)，记录菌落形态，并根据教科书《常见细菌系统鉴定手册》(作者：东秀珠)考察菌株的生理生化特性，保留革兰氏阳性、菌落呈光滑圆形、过氧化氢阴性的菌株，此菌株的其余生理生化特性为：能利用D-核糖、L-阿拉伯糖、乳糖、纤维二糖、低聚果糖、山梨醇、淀粉、葡萄糖、甘露糖、木糖、麦芽糖、海藻糖；硝酸盐还原、接触酶、精氨酸水解实验、吲哚实验均为阴性。
2、初步鉴定
挑取步骤1筛选得到的菌株的单菌落接种至mMRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到菌液；将菌液8000rpm离心2min，收集沉淀；将沉淀用含0.05％半胱氨酸盐酸盐(m/m)的磷酸盐缓冲液(pH 6.5、浓度0.05M)洗涤两次后8000rpm离心2min，收集菌体；取0.2mg菌体重悬于200μL含0.05％半胱氨酸盐酸盐(m/m)和0.25％Triton X-100(m/m)的磷酸盐缓冲液(pH 6.5、浓度0.05M)中，得到重悬液；在将重悬液中添加50μL混合液(由浓度为6mg/mL氟化钠和10mg/mL碘乙酸钠混合而得)以及50μL浓度为80mg/mL的果糖-6-磷酸后37℃孵育1h，得到孵育液；在孵育液中添加300μL浓度为0.139g/mL的盐酸羟胺(pH6.5)后室温(25℃)放置10min，得到待测液；在待测液中分别添加200μL浓度为15％(m/m)的三氯乙酸溶液和200μL浓度为4M的HCL溶液，得到反应体系1～2；在反应体系1～2中添加200μL浓度为5％(m/m)的三氯乙酸溶液和200μL浓度为0.1M的HCL溶液，添加后，反应体系1～2迅速变为红色，说明步骤1筛选得到的菌株为F6PPK阳性，初步断定为双歧杆菌。
3、进一步鉴定
挑取步骤1筛选得到的菌株的单菌落接种至mMRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，得到菌液；取1mL于1.5mL离心管中，10000rpm离心2min，收集沉淀；将沉淀用无菌水洗涤一次后10000rpm离心2min，收集菌体；取0.2mg菌体重悬于500μL无菌水中，用于细菌16SrDNA PCR反应；提取步骤1筛选得到的菌株的基因组，将菌株的18S rDNA进行扩增和测序(扩增得到的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)，将获得的序列在GeneBank中进行核酸序列比对，结果显示菌株为青春双歧杆菌，命名为青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentic)CCFM1108；
其中，PCR反应体系：10×Taq buffer，5μL；dNTP，5μL；27F，0.5μL；1492R，0.5μL；Taq酶，0.5μL；模版，0.5μL；ddH2O，38μL；
PCR反应条件：95℃，5min；95℃，10s；55℃，30s；72℃，30s；step2-4，30×；72℃，5min；12℃，2min；
PCR所用引物：F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.2)；R：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.3)。
4、培养和观察
挑取步骤1筛选得到的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108的单菌落接种至mMRS固体培养基上，37℃培养48h，48h后，观察青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108在mMRS固体培养基上的菌落特征。
观察可得，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108在mMRS固体培养基上的菌落直径范围0.5～2mm，正面形态圆形，侧面形态呈突起状，边缘整齐，乳白色或淡黄色，不透明，表面湿润光滑，无色素产生。
挑取步骤1筛选得到的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108的单菌落接种至mMRS液体培养基中，37℃培养48h，48h后，通过电镜观察青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108的菌体特征。
观察可得，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108不形成孢子，不运动，菌体呈杆状，稍弯曲，多数呈V型，少数呈Y型，两端着色深。
挑取步骤1筛选得到的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108的单菌落接种至mMRS液体培养基中，37℃培养，培养过程中，每隔4h检测菌液的OD600，通过OD600绘制青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108的生长曲线。
由生长曲线可知，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108生长24h时达到对数生长末期。
实施例2：青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108及其发酵上清液对丝状真菌孢子萌发率的影响
1、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108对丝状真菌孢子萌发率的影响(双层平板-生长抑制法)
挑取实施例1筛选得到的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108的单菌落在mMRS固体培养基上划线，厌氧环境下37℃培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于mMRS液体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h进行培养，重复此操作3次，得到培养至第三代的菌液。
用接种环蘸取安瓿管中的扩展青霉菌液接种到PDA培养基上，28℃、200rpm培养7d，得到菌丝体及孢子；挑取孢子接种于PDA斜面上，28℃、200rpm培养7d，重复此操作2次，得到培养至第三代的扩展青霉；在生长有培养至第三代的扩展青霉的PDA培养基中加入5mL无菌水，用接种环刮取孢子，再用4层无菌纱布过滤得到扩展青霉孢子悬液；将扩展青霉孢子悬液用无菌水稀释至浓度为1×104cfu/mL。
用接种环蘸取菌悬液mMRS固体培养基上划两条两厘米的平行线，37℃培养48h后，mMRS固体培养基上添加8mL浓度为1×104cfu/mL的扩展青霉孢子悬液，28℃分别培养2d、7d后，观察抑制区域(即mMRS固体培养基上的划线区域)，以抑制区域的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108菌落及菌落周围无孢子萌发的面积占mMRS固体培养基总面积的百分比作为指标，检测青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108对扩展青霉孢子萌发率的抑制能力，检测结果见表1。
参照同样的方法分别检测青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108对黑曲霉、娄地青霉和指状青霉孢子萌发率的抑制能力，检测结果见表1。
由表1可知，检测青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108对扩展青霉、黑曲霉、娄地青霉和指状青霉孢子萌发率的抑制能力时，抑制区域的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108菌落及菌落周围不小于mMRS固体培养基70％面积的区域均无孢子萌发，可见，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108对扩展青霉、黑曲霉、娄地青霉和指状青霉孢子萌发率的抑制能力较强。
表1青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108对不同丝状真菌孢子萌发率的抑制能力
注：双歧杆菌菌落及菌落周围不小于平板30％面积的区域均无孢子萌发，+++；双歧杆菌菌落区域及菌落周围低于30％平板面积的区域无孢子萌发，++；仅双歧杆菌菌落区域无孢子萌发，+；无孢子萌发抑制区域，-。
2、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对丝状真菌孢子萌发率的影响(96孔板-孢子萌发抑制法)
挑取实施例1筛选得到的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108的单菌落在mMRS固体培养基上划线，厌氧环境下37℃培养48h，得到单菌落；挑取单菌落接种于mMRS液体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h进行培养，得到种子液；将种子液以2％(v/v)的接种量接种至mMRS液体培养基中，厌氧环境下37℃培养48h进行培养，重复此操作2次，获得发酵液；将发酵液8000rpm离心10min后通过0.2μm滤器过滤，获得发酵上清液。
用接种环蘸取安瓿管中的扩展青霉菌液接种到PDA培养基上，28℃、200rpm培养7d，得到菌丝体及孢子；挑取孢子接种于PDA斜面上，28℃、200rpm培养7d，重复此操作2次，得到培养至第三代的扩展青霉；在生长有培养至第三代的扩展青霉的PDA培养基中加入5mL无菌水，用接种环刮取孢子，再用4层无菌纱布过滤得到扩展青霉孢子悬液；将扩展青霉孢子悬液用无菌水稀释至浓度为1×104cfu/mL。
在无菌96孔板中加入190μL发酵上清液以及10μL浓度为1×104cfu/mL的扩展青霉孢子悬液，28℃培养48h，得到培养液；以mMRS液体培养基作为对照，通过测量培养液和mMRS液体培养基的OD580，计算青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉的孢子萌发抑制率，计算结果见表2；其中，孢子萌发抑制率(％)＝(1-(△OD发酵上清液-△ODmMRS)/△ODmMRS)×100％。
参照同样的方法分别检测青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对黑曲霉、娄地青霉和指状青霉的孢子萌发抑制率，检测结果见表2。
由表2可知，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉、黑曲霉、娄地青霉和指状青霉的孢子萌发抑制率分别可高达99.88±0.66％、92.23±0.53％、88.83±0.82％、99.25±0.62％，可见，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉、黑曲霉、娄地青霉和指状青霉孢子萌发率的抑制能力较强。
表2青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108对不同丝状真菌孢子萌发的抑制能力
| 菌株 | 孢子萌发抑制率(％) |
| 扩展青霉 | 99.88±0.66 |
| 黑曲霉 | 92.23±0.53 |
| 娄地青霉 | 88.83±0.82 |
| 指状青霉 | 99.25±0.62 |
实施例3：青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉菌丝体生长的影响
将mMRS液体培养基分别以1:9、1.5:8.5、2:8、2.5:7.5、3:7(mMRS液体培养基：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到mMRS液体培养基浓度分别为10、15、20、25、30％(v/v)的对照组混合液；将实施例2获得的发酵上清液分别以1:9、1.5:8.5、2:8、2.5:7.5、3:7(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度分别为10、15、20、25、30％(v/v)的实验组混合液；将对照组和实验组的混合液分别倾倒平板；在平板中央滴加10μL实施例2获得的扩展青霉孢子悬液，28℃培养6d，培养期间，通过每2d测量每一个平板上的菌丝体直径，检测青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉菌丝体生长的影响，检测结果见图1。
如图1所示，通过测量培养第6d时平板上的菌丝体直径可知，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉菌丝体生长的抑制能力随着发酵上清液的浓度升高而增大，在青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液达到20％时，抑制率可达100％；而mMRS液体培养基的浓度变化对扩展青霉的生长影响不显著。
实施例4：青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉产展青霉素产量的影响
将mMRS液体培养基分别以1:9、1.5:8.5、2:8、2.5:7.5、3:7(mMRS液体培养基：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到mMRS液体培养基浓度分别为10、15、20、25、30％(v/v)的对照组混合液；将实施例2获得的发酵上清液分别以1:9、1.5:8.5、2:8、2.5:7.5、3:7(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度分别为10、15、20、25、30％(v/v)的实验组混合液；将对照组和实验组的混合液分别倾倒平板；在平板中央滴加10μL实施例2获得的扩展青霉孢子悬液，28℃培养6d，6d后，在平板上添加5mL酸化水(pH 4.0)后静置1d，1d后，刮取平板上的扩展青霉孢子及菌丝体；将孢子及菌丝体离心过滤，取上清液，将上清液经0.22μm滤膜过滤后高效液相色谱上样，将结果与商业展青霉素标准品(购自普瑞邦公司)进行比较以定量，通过上清液中展青霉素的含量，检测青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉产展青霉素产量的影响，检测结果见图2；其中，高效液相色谱条件为：色谱柱：Waters 4.6*250mmC18色谱柱；柱温：30℃；流动相：10％乙腈，90％水；流速：1mL/min；进样量：10μL；检测器：UV；检测波长：276nm。
如图2所示，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉产展青霉素产量的抑制能力随着发酵上清液的浓度升高而增大，在青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液达到20％时，抑制率可达83.5％；而mMRS液体培养基浓度的增加反而促进展青霉素产量。
实施例5：青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉LaeA基因表达量的影响
将mMRS液体培养基以1.5:8.5(mMRS液体培养基：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到mMRS液体培养基浓度为15％(v/v)的对照组混合液；将实施例2获得的发酵上清液以1.5:8.5(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度为15％(v/v)的实验组混合液；将对照组和实验组的混合液分别倾倒平板；在平板中央滴加10μL实施例2获得的扩展青霉孢子悬液，28℃培养6d，6d后，刮取平板上的扩展青霉孢子及菌丝体，液氮速冻，保存于-80℃；将扩展青霉孢子及菌丝体液氮研磨后采用Trizol法提取总RNA，并以β-tubulin基因为内参进行qRT-PCR以评价青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉PatA基因(PatA基因为调控扩展青霉合成次级代谢产物展青霉素的基因)相对表达量的影响，检测结果见图3；其中，数据采用2-ΔΔCT法进行定量计算。
如图3所示，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液可显著降低扩展青霉LaeA基因的相对表达量；而mMRS液体培养基无此效果。
实施例6：温度对青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液抑制扩展青霉菌丝体生长的能力的影响
将实施例2获得的发酵上清液以1.5:8.5(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度为15％(v/v)的的对照组混合液；将实施例2获得的发酵上清液121℃加热20min后以1.5:8.5(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度为15％(v/v)的实验组混合液；将对照组和实验组的混合液分别倾倒平板；在平板中央滴加10μL实施例2获得的扩展青霉孢子悬液，28℃培养6d，培养期间，通过每2d测量每一个平板上的菌丝体直径，检测青春双歧杆菌(Bifidobacteriumadolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉菌丝体生长的影响，检测结果见图4。
如图4所示，通过测量培养第6d时平板上的菌丝体直径可知，经加热处理后，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液(菌丝体生长直径为8.8mm)对扩展青霉菌丝体生长的抑制能力较未经加热处理的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液(菌丝体生长直径为9.0mm)略有提高。
实施例7：pH对青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液抑制扩展青霉菌丝体生长的能力的影响
将实施例2获得的发酵上清液(pH为3.42)以1.5:8.5(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度为15％(v/v)的的对照组混合液；将实施例2获得的发酵上清液调节至pH为7后(用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl调节)以1.5:8.5(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度为15％(v/v)的实验组混合液；将对照组和实验组的混合液分别倾倒平板；在平板中央滴加10μL实施例2获得的扩展青霉孢子悬液，28℃培养6d，培养期间，通过每2d测量每一个平板上的菌丝体直径，检测pH对青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液抑制扩展青霉菌丝体生长的能力的影响，检测结果见图4。
如图4所示，通过测量培养第6d时平板上的菌丝体直径可知，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液的pH为3.42，此时，其对扩展青霉菌丝体生长的抑制能力较强(菌丝体生长直径为9.0mm)；pH为7时，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液对扩展青霉菌丝体生长的抑制能力与未经pH调节的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液相比显著降低(菌丝体生长直径为15.6mm)。
实施例8：蛋白酶处理对青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液抑制扩展青霉菌丝体生长的能力的影响
先将实施例2获得的发酵上清液调节至pH为7(用1mol/L的NaOH和1mol/L的HCl调节)，然后在发酵上清液中添加1mg/mL蛋白酶(购自SIGMA公司，产品编号为P3910)，37℃水浴2h，接着将发酵上清液100℃煮沸灭酶3min，得到经蛋白酶处理的发酵上清液；将实施例2获得的发酵上清液以1.5:8.5(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度为15％(v/v)的的对照组混合液；以1.5:8.5(发酵上清液：PDA培养基)的体积比与PDA培养基混合，得到发酵上清液浓度为15％(v/v)的实验组混合液；将对照组和实验组的混合液分别倾倒平板；在平板中央滴加10μL实施例2获得的扩展青霉孢子悬液，28℃培养6d，培养期间，通过每2d测量每一个平板上的菌丝体直径，检测蛋白酶处理对青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液抑制扩展青霉菌丝体生长的能力的影响，检测结果见图4。
如图4所示，通过测量培养第6d时平板上的菌丝体直径可知，经蛋白酶处理后，青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液(菌丝体生长直径为8.6mm)对扩展青霉菌丝体生长的抑制能力较未经蛋白酶处理的青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentic)CCFM1108发酵上清液(菌丝体生长直径为9.0mm)略有提高。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一株可抑制丝状真菌的青春双歧杆菌及其应用
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1392
<212> DNA
<213> 青春双歧杆菌
<400> 1
agaggctccc ccaaaggttg ggccaccggc ttcgggtgct acccactttc atgacttgac 60
gggcggtgtg tacaaggccc gggaacgcat tcaccgcggc gttgctgatc cgcgattact 120
agcgactccg ccttcatgga gtcgggttgc agactccaat ccgaactgag accggtttta 180
agggatccgc tccacctcgc ggtgtcgcat cccgttgtac cggccattgt agcatgcgtg 240
aagccctgga cgtaaggggc atgatgatct gacgtcatcc ccaccttcct ccgagttgac 300
cccggcggtc ccccgtgagt tcccaccacg acgtgctggc aacacagggc gagggttgcg 360
ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacgacc atgcaccacc 420
tgtgaacccg ccccgaaggg agaccgtatc tctacggctg tcgggaacat gtcaagccca 480
ggtaaggttc ttcgcgttgc atcgaattaa tccgcatgct ccgccgcttg tgcgggcccc 540
cgtcaatttc tttgagtttt agccttgcgg ccgtactccc caggcgggat gcttaacgcg 600
ttggctccga cacggagacc gtggaatggt ccccacatcc agcatccacc gtttacggcg 660
tggactacca gggtatctaa tcctgttcgc tccccacgct ttcgctcctc agcgtcagtg 720
acggcccaga gacctgcctt cgccattggt gttcttcccg atatctacac attccaccgt 780
tacaccggga attccagtct cccctaccgc actcaagccc gcccgtaccc ggcgcggatc 840
caccgttaag cgatggactt tcacaccgga cgcgacgaac cgcctacgag ccctttacgc 900
ccaataattc cggataacgc ttgcacccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 960
gccggtgctt attcgaaagg tacactcacc ccgaagggct tgctcccagt caaaagcggt 1020
ttacaacccg aaggccgtca tcccgcacgc ggcgtcgctg catcaggctt gcgcccattg 1080
tgcaatattc cccactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtatctcag tcccaatgtg 1140
gccggtcgcc ctctcaggcc ggctacccgt cgaagccatg gtgggccgtt accccgccat 1200
caagctgata ggacgcgacc ccatcccata ccgcaaaagc tttcccagag gaccatgcgg 1260
tcaactggag catccggcat taccacccgt ttccaggagc tattccggtg tatggggcag 1320
gtcggtcacg cattactcac ccgttcgcca ctctcaccca ggagcaagct cctgggatcc 1380
cgtcgactgc at 1392
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tacggctacc ttgttacgac tt 22
Claims (13)
1.一株青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis），其特征在于，所述青春双歧杆菌保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.60925，保藏日期为2019年12月09日。
2.一种丝状真菌抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的成分包含权利要求1所述的青春双歧杆菌和权利要求1所述青春双歧杆菌的发酵上清液。
3.如权利要求2所述的一种丝状真菌抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的成分还包含载体。
4.如权利要求3所述的一种丝状真菌抑制剂，其特征在于，所述载体为药学上可接受的载体。
5.如权利要求3或4所述的一种丝状真菌抑制剂，其特征在于，所述载体为填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂和/或矫味剂。
6.如权利要求2-4任一所述的一种丝状真菌抑制剂，其特征在于，所述抑制剂的剂型为粉剂、乳剂、颗粒剂或微粒剂。
7.一种抑制丝状真菌的方法，其特征在于，所述方法为丝状真菌抑制剂与丝状真菌在体外进行共培养；所述丝状真菌为扩展青霉、黑曲霉、娄地青霉或指状青霉；
所述丝状真菌抑制剂包含权利要求1所述的青春双歧杆菌和权利要求1所述青春双歧杆菌的发酵上清液。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述抑制剂的成分还包含载体。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述载体为药学上可接受的载体。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述载体为填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂和/或矫味剂。
11.如权利要求7-10任一所述的方法，其特征在于，所述抑制剂的剂型为粉剂、乳剂、颗粒剂或微粒剂。
12.权利要求1所述的青春双歧杆菌或权利要求2-6任一所述的丝状真菌抑制剂在抑制丝状真菌方面的应用；所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的；所述丝状真菌为扩展青霉、黑曲霉、娄地青霉或指状青霉。
13.权利要求1所述的青春双歧杆菌或权利要求2-6任一所述的丝状真菌抑制剂在防止果蔬腐败中的应用。
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