CN113355265B - 一种植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
发明公开了一种植物乳杆菌及其应用，植物乳杆菌于2020年11月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61306；植物乳杆菌的应用为将植物乳杆菌用于液体饲料的发酵，包括以下步骤：在饲料原料中加入葡萄糖、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、蛋白酶、果胶酶、α‑淀粉酶和含植物乳杆菌的发酵种子液进行发酵处理，得到经发酵的液体饲料；该植物乳杆菌发酵能够产生乳酸，具有明显的抑菌作用，是性能优异的液体饲料发酵菌种。
Description
技术领域
本发明涉及一种植物乳杆菌及其应用，属于微生物技术领域。
背景技术
在饲料禁抗及养殖减抗的双重背景下，畜禽养殖面临着生长性能下降，疾病多发以及养殖成本提高等问题。因此，探索低成本的替抗方案成为畜禽养殖关注的焦点问题。
研究表明，微生物发酵饲料可以去除多种抗营养因子，还可积累丰富的有益代谢产物及益生菌。例如液体发酵饲料具有极佳的益生功能，发酵处理后饲料中的粗纤维、粗蛋白等大分子营养物质得到分解，饲料营养价值大幅度提高。同时益生菌在饲料中快速繁殖，发酵过程中益生菌产生的风味物质对畜禽具有极佳的诱食效果，而且部分有益代谢产物能够促进畜禽的肠道健康。与养殖场使用固态发酵饲料相比，液态发酵饲料容易自动化控制，发酵时间短，周转快，效率明显提升，饲料粉尘也明显减少。研究表明，饲喂液态发酵饲料能够有效降低动物肠道的pH值，抑制肠道有害菌增殖，增强肠胃消化能力；液态发酵饲料能够缓解断奶应激，提高生长性能，并降低腹泻率；能够明显降低粪便臭味，减少养殖环境中有害菌滋生；此外，液态发酵饲料还具有降低呼吸道疾病发生率，提高猪采食量和增重等功能。
目前市场上的发酵菌种及复合发酵剂对快速降低液体发酵料pH效果不理想，抑菌效果也不明显。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的第一个目的在于提供一种植物乳杆菌，该植物乳杆菌发酵能够产生乳酸，具有明显的抑菌作用，是性能优异的液体饲料发酵菌种。
本发明的第二个目的在于提供一种上述植物乳杆菌的应用，为用于液体饲料的发酵，降低饲料的pH，改善饲料气味，提高畜禽营养物质利用率和吸收率。
实现本发明的第一个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种植物乳杆菌，分类命名为Lactobacillus plantarum，植物乳杆菌于2020年11月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏单位的地址为：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No.61306。
实现本发明的第二个目的可以通过采取如下技术方案达到：一种植物乳杆菌的应用，将植物乳杆菌用于液体饲料的发酵。
进一步地，将植物乳杆菌以发酵种子液的方式用于液体饲料的发酵；发酵种子液通过以下方法制备得到：将植物乳杆菌活化后，接种到液体培养基中培养，得到发酵种子液。
进一步地，液体培养基包括蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、吐温-80、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸三铵、硫酸镁和硫酸锰。
进一步地，液体饲料的发酵方法包括以下步骤：在饲料原料中加入葡萄糖、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、蛋白酶、果胶酶、α-淀粉酶和含植物乳杆菌的发酵种子液进行发酵处理，得到经发酵的液体饲料。
进一步地，饲料原料、葡萄糖、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的质量之比为1000:(5-10):(0.5-5):(0.5-5)；饲料原料的质量和含植物乳杆菌的发酵种子液的体积之比为100g:(10-20)mL；含植物乳杆菌的发酵种子液的活菌浓度为(10-20)×108cfu/mL。
进一步地，发酵处理的温度为30-37℃。
进一步地，蛋白酶的酶单位为10000-50000U，果胶酶的酶单位为5000-10000U，α-淀粉酶的的酶单位为2000-3000U。
进一步地，蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶。
进一步地，中性蛋白酶和酸性蛋白酶的酶活比为1:0.8-1.5。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
1、本发明的植物乳杆菌具有明显的产酸能力，对致病菌具有高效的抑菌作用，是性能优异的液体饲料发酵菌种；
2、本发明将植物乳杆菌用于液体饲料的发酵，植物乳杆菌能发酵产生乳酸，快速降低饲料的pH，并具有高效的抑菌效果，加速代谢产物的累积，改善饲料气味，提高畜禽营养物质利用率和吸收率；
3、本发明液体饲料的发酵可使液体饲料在24h时pH降低到3.9以下，同时发酵上清液对大肠杆菌，沙门氏菌，金黄色葡萄球菌有明显的抑制作用。
附图说明
本发明涉及的植物乳杆菌，分类命名为Lactobacillus plantarum，于2020年11月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61306。
图1-3分别为发酵种子液上清液的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为指示菌的抑菌图；
图4为实施例1溶钙圈视图；
图5为革兰氏染色图；
图6为系统发育树
图7-9分别为实施例4发酵种子液上清液的沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌为指示菌的抑菌图。
具体实施方式
下面，结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述：
一种植物乳杆菌，植物乳杆菌于2020年11月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61306；为革兰氏阳性的杆状细菌，不产芽孢；在MRS平板上培养48h，菌落乳白色，圆形，凸起，表面光滑，不透明，边缘整齐。
该植物乳杆菌具有明显的抑菌作用，特别是对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌的抑菌效果。
使用上述特定的植物乳杆菌，配制发酵种子液用于液体饲料的发酵：
将冻存的植物乳杆菌在液体培养基中以温度37℃活化24h，180r/min后，取1mL接种到100mL新的液体培养基中在温度37℃条件下培养至活菌浓度为(10-20)×108cfu/mL，得到发酵种子液；检测发酵种子液的上清液的抑菌性，以沙门氏菌(CGMCC1.2385)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(8099)为指示菌，抑菌图分别如图1-3所示。
液体培养基成分：蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、吐温-80、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸三铵、硫酸镁和硫酸锰。
液体饲料的发酵方法包括以下步骤：
在饲料原料中加入水、葡萄糖、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、10000-50000U蛋白酶、5000-10000U果胶酶、2000-3000Uα-淀粉酶和含植物乳杆菌的发酵种子液在温度为30-37℃的条件下进行发酵处理，得到经发酵的液体饲料；
含植物乳杆菌的发酵种子液配合枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌，可以提升液体发酵饲料的风味，增强诱食性，但降低了乳酸含量及对致病菌的抑菌效果；通过加入蛋白酶、果胶酶和α-淀粉酶，保持了诱食风味的同时，可快速地降低液体发酵饲料pH，24h内pH至3.9以下，提高了乳酸含量及乳酸菌活菌数，有效降解大分子营养物质及降低抗营养因子，更利于禽畜的吸收，同时加强了对沙门氏菌的抑制效果；
其中，饲料原料、葡萄糖、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的质量之比为1000:(5-10):(0.5-5):(0.5-5)；饲料原料的质量和含植物乳杆菌的发酵种子液的体积之比为100g:(1-2)mL；
其中，蛋白酶包括碱性蛋白酶(pH为9-11)、中性蛋白酶(pH为5.5-8.5)和酸性蛋白酶(pH为2.5-3.5)，中性蛋白酶和酸性蛋白酶的酶活比为1:0.8-1.5；该酶活比下可以更好地降解饲料底物中的蛋白质，为益生菌快速提供氮源，进而促进益生菌的快速增殖及有益代谢产物的积累。
具体地，实施例中使用的培养基/液体培养基等如无特殊说明，成分均为：蛋白胨10g、牛肉膏5g、酵母膏4g、葡萄糖20g、吐温-80 1mL、磷酸氢二钾2g、乙酸钠5g、柠檬酸三铵2g、硫酸镁0.2g和硫酸锰0.05g；加水定容至1000mL，在接种前经121℃灭菌20-30min，植物乳杆菌种子培养基的pH为6.2-6.4。
实施例1：
菌种的获得：
用无菌镊子采集畜禽肠道内容物、土壤等样品，装入袋中并做标记。即在无菌条件下用0.8wt％的生理盐水将样品稀释成不同浓度，取10-3mL样品稀释液倾注于培养基上。37℃培养48h后，观察平板培养基上菌落周围的溶钙圈如图4所示，并选取具有明显溶钙圈的菌落划线于培养基上继续纯化，纯化的菌落进行标号记录，革兰氏染色镜检。筛选出革兰氏染色阳性的菌落，初步认定为乳杆菌。最后将分离出的单菌落接种到菌种保藏培养基中，于37℃恒温培养箱中培养24h后，放入冰箱中4℃保藏。
菌种复筛与鉴定：
1)复筛
将筛选得到的菌株接种于培养基，于180r/min、37℃培养24h，活化。
活化后的菌种按1％接种量接种于新的培养基，于180r/min、37℃培养24h，得发酵液。
取发酵液，4℃、10000r/min离心10min。以大肠杆菌(8099)作为指示菌株，接种于LB培养基，37℃、180r/min培养18h。用0.8wt％的生理盐水稀释大肠杆菌菌液，取稀释后的菌液1mL加入到冷却后的100mL固体LB培养基中混匀，倒平板。平板冷却后放牛津杯。吸取待测样品100μL加入到牛津杯中，37℃培养24h，测量抑菌圈直径并记录。挑选抑菌活性最强的菌株进行下一步实验。用游标卡尺量抑菌圈的直径。结果如表格1所示：
表格1抑菌圈的直径
表格1中记录了抑菌圈最大的10株菌的情况，其中RSJ24株的抑菌圈最小；最大的为RSJ13，其抑菌圈值为17.97mm；挑取抑菌圈直径在16.0mm以上的菌落，继续划线纯化并保存。
因此结合抑菌圈大小、革兰氏染色及形态观察，选择RSJ01为候选菌种进行生理生化及16S rRNA分子鉴定。
2)革兰氏染色鉴定
用接种环挑取RSJ01单菌落涂布至载玻片，用生理盐水稀释均匀，火焰固定后进行革兰氏染色，而后根据《伯杰氏细菌学鉴定手册》通过显微镜进行形态学鉴定。结果如表格2和图5所示。
表格2生理生化试验
注：“+”表示为阳性反应，“-”表示为阴性反应
3)菌种16S rDNA测序鉴定
提取目标菌株基因组作为模板，利用通用引物进行PCR扩增后测序。引物序列，引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’(SEQ ID NO.1)，1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’(SEQ ID NO.2)；
PCR反应体系为25μL，其体系为10×Taq Buffer 2.5μL，dNTPs(2.5mM)2μL，ExTaq(5U/μL)0.25μL，27F(10μM)0.5μL，1492R(10μM)0.5μL，ddH2O 16.25μL，3μL DNA模板。
PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火1min，72℃延伸90s，30个循环；72℃终延伸10min。PCR完成后电泳检测为阳性的PCR产物，测序并Blast在线比对。测序结果如SEQ ID No.3。制作系统发育树如图6所示。
实施例2：
具体实施方式的植物乳杆菌配制发酵种子液用于液体饲料的发酵：
液体饲料的发酵方法包括以下步骤：
在饲料原料1kg中加入水3kg混合，再加入葡萄糖7g，含植物乳杆菌的发酵种子液15mL(15×108cfu/mL)在温度为35℃的条件下进行发酵处理，得到经发酵的液体饲料。
实施例3：
具体实施方式的植物乳杆菌配制发酵种子液用于液体饲料的发酵：
液体饲料的发酵方法包括以下步骤：
在饲料原料1kg中加入水3kg混合，再加入葡萄糖7g、枯草芽孢杆菌2g、酿酒酵母菌2g、含植物乳杆菌的发酵种子液15mL(15×108cfu/mL)，在温度为35℃的条件下进行发酵处理，得到经发酵的液体饲料。
实施例4：
具体实施方式的植物乳杆菌配制发酵种子液用于液体饲料的发酵：
液体饲料的发酵方法包括以下步骤：
在饲料原料1kg中加入水3kg混合，再加入葡萄糖7g、枯草芽孢杆菌2g、酿酒酵母菌2g、30000U蛋白酶、8000U果胶酶、2500Uα-淀粉酶、含植物乳杆菌的发酵种子液15mL(15×108cfu/mL)在温度为35℃的条件下进行发酵处理，得到经发酵的液体饲料。检测液体饲料的上清液的抑菌性，以沙门氏菌(CGM CC1.2385)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、大肠杆菌(8099)为指示菌，抑菌图分别如图7-9所示。
对比例1：
在饲料原料1kg中加入水3kg混合，再加入葡萄糖7g、乳酸菌A1g(市购乳酸菌产品，225×108cfu/g)在温度为35℃的条件下进行发酵处理，得到经发酵的液体饲料。
对比例2：
在饲料原料1kg中加入水3kg混合，再加入葡萄糖7g、枯草芽孢杆菌2g、酿酒酵母菌2g、乳酸菌A1g(市购乳酸菌产品，225×108cfu/g)在温度为35℃的条件下进行发酵处理，得到经发酵的液体饲料。
对比例3：
在饲料原料1kg中加入水3kg混合，再加入葡萄糖7g、枯草芽孢杆菌2g、酿酒酵母菌2g、30000U蛋白酶、8000U果胶酶、2500Uα-淀粉酶、乳酸菌A1g(市购乳酸菌产品，225×108cfu/g)在温度为35℃的条件下进行发酵处理，得到经发酵的液体饲料。
实施例2-4和对比例1-3的检测：发酵24h，检测pH，乳杆菌数，发酵上清液乳酸及抑菌性(针对大肠杆菌(8099)、金黄色葡萄球菌(ATCC 6538)、沙门氏菌(CGMCC1.2385)，结果如表格3所示。
表格3实施例和对比例的检测结果
通过表格3可以得知，检测24h的pH、乳酸、乳杆菌数、抑菌性等，结果表明本发明植物乳杆菌可以快速启动发酵，降低发酵饲料的pH，24h发酵液乳杆菌数、乳酸含量明显优于市购乳酸菌，同时实施例与对比例相比，在大肠杆菌、金黄色葡萄球菌及沙门氏菌抑菌性方面也明显好于市购乳酸菌。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 广东温氏大华农生物科技有限公司
<120> 一种植物乳杆菌及其应用
<130> 2021
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 1
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 2
ggttaccttg ttacgactt 19
<210> 3
<211> 1424
<212> DNA
<213> 人工合成(Artificial Sequence)
<400> 3
gttcctaaaa ggttacccca ccgactttgg gtgttacaaa ctctcatggt gtgacgggcg 60
gtgtgtacaa ggcccgggaa cgtattcacc gcggcatgct gatccgcgat tactagcgat 120
tccgacttca tgtaggcgag ttgcagccta caatccgaac tgagaatggc tttaagagat 180
tagcttactc tcgcgagttc gcaactcgtt gtaccatcca ttgtagcacg tgtgtagccc 240
aggtcataag gggcatgatg atttgacgtc atccccacct tcctccggtt tgtcaccggc 300
agtctcacca gagtgcccaa cttaatgctg gcaactgata ataagggttg cgctcgttgc 360
gggacttaac ccaacatctc acgacacgag ctgacgacaa ccatgcacca cctgtatcca 420
tgtccccgaa gggaacgtct aatctcttag atttgcatag tatgtcaaga cctggtaagg 480
ttcttcgcgt agcttcgaat taaaccacat gctccaccgc ttgtgcgggc ccccgtcaat 540
tcctttgagt ttcagccttg cggccgtact ccccaggcgg aatgcttaat gcgttagctg 600
cagcactgaa gggcggaaac cctccaacac ttagcattca tcgtttacgg tatggactac 660
cagggtatct aatcctgttt gctacccata ctttcgagcc tcagcgtcag ttacagacca 720
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gagttccact gtcctcttct gcactcaagt ttcccagttt ccgatgcact tcttcggttg 840
agccgaaggc tttcacatca gacttaaaaa accgcctgcg ctcgctttac gcccaataaa 900
tccggacaac gcttgccacc tacgtattac cgcggctgct ggcacgtagt tagccgtggc 960
tttctggtta aataccgtca atacctgaac agttactctc agatatgttc ttctttaaca 1020
acagagtttt acgagccgaa acccttcttc actcacgcgg cgttgctcca tcagactttc 1080
gtccattgtg gaagattccc tactgctgcc tcccgtagga gtttgggccg tgtctcagtc 1140
ccaatgtggc cgattaccct ctcaggtcgg ctacgtatca ttgccatggt gagccgttac 1200
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cccccgcttc tgggcaggtt tcccacgtgt tactcaccag ttcgccactc actcaaatgt 1380
aaatcatgat gcaagcacca atcaatacca gagttcgttc gact 1424
Claims (9)
1.一种植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌于2020年11月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61306。
2.一种植物乳杆菌的应用，其特征在于，将植物乳杆菌用于液体饲料的发酵；所述植物乳杆菌于2020年11月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCCNo.61306。
3.如权利要求2所述的植物乳杆菌的应用，其特征在于，将植物乳杆菌以发酵种子液的方式用于液体饲料的发酵；所述液体饲料的发酵方法包括以下步骤：在饲料原料中加入葡萄糖、枯草芽孢杆菌、酿酒酵母菌、蛋白酶、果胶酶、α-淀粉酶和含植物乳杆菌的发酵种子液进行发酵处理，得到经发酵的液体饲料；所述饲料原料的质量和含植物乳杆菌的发酵种子液的体积之比为100g:(1-2)mL。
4.如权利要求3所述的植物乳杆菌的应用，其特征在于，所述发酵种子液通过以下方法制备得到：将植物乳杆菌活化后，接种到液体培养基中培养，得到发酵种子液；所述液体培养基包括蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、葡萄糖、吐温-80、磷酸氢二钾、乙酸钠、柠檬酸三铵、硫酸镁和硫酸锰。
5.如权利要求3所述的植物乳杆菌的应用，其特征在于，所述饲料原料、葡萄糖、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母菌的质量之比为1000:(5-10):(0.5-5):(0.5-5)；所述含植物乳杆菌的发酵种子液的活菌浓度为(10-20)×108cfu/mL。
6.如权利要求3所述的植物乳杆菌的应用，其特征在于，所述发酵处理的温度为30-37℃。
7.如权利要求3所述的植物乳杆菌的应用，其特征在于，所述蛋白酶的酶单位为10000-50000U，果胶酶的酶单位为5000-10000U，α-淀粉酶的酶单位为2000-3000U。
8.如权利要求3所述的植物乳杆菌的应用，其特征在于，所述蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶。
9.如权利要求8所述的植物乳杆菌的应用，其特征在于，所述中性蛋白酶和酸性蛋白酶的酶活比为1:0.8-1.5。
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