CN110423698B - 一株嗜热侧孢霉ym-2及其复合菌剂与应用 - Google Patents

一株嗜热侧孢霉ym-2及其复合菌剂与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株嗜热侧孢霉YM‑2及其复合菌剂与应用，该菌株于2019年8月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC 18127。该菌株的菌落呈白色，形态较大，质地疏松、呈絮状，外观干燥，菌丝较细并呈丛枝状；该菌株生长温度和pH较广泛，其适宜温度为42℃~48℃，适宜pH为5.0~7.0。本发明还提供了利用嗜热侧孢霉YM‑2制成的复合菌剂以及该复合菌剂在制备用于肉鸡养殖、有机肥腐熟、黄瓜种植和废渣发酵生产单细胞蛋白的添加剂中的应用，该复合菌剂具有活菌数高、菌种适应能力强、菌株性能稳定、制备方法简单、成本低等特点，且具有广阔的应用前景。

Description

一株嗜热侧孢霉YM-2及其复合菌剂与应用
技术领域
本发明主要涉及微生物技术领域，具体涉及一株嗜热侧孢霉YM-2及其复合菌剂与应用。
背景技术
纤维素是世界上最丰富的可再生资源，但因为其结构的复杂性，又是葡萄糖分子以β-1，4糖苷键结合的直链高分子化合物，因此很难分解，所以目前对纤维素的有效利用还很少。纤维素酶系是降解纤维素的酶的总称，包括3种主要组分，分别是内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。利用微生物生产的纤维素酶可以将纤维素转化为人类需要的各种领域的各种产品，因此这一酶系在食品、洗涤剂、纺织和饲料等行业内具有广泛的应用前景，如在食品工业中，利用纤维素酶将自然界纤维素类物质降解成可发酵糖，进而通过发酵生产酒精、单细胞蛋白有机酸、甘油等化学化工原料；在畜牧养殖中，可以利用纤维素酶加快禽畜废弃物的堆肥，进而将废弃物降解成绿色肥料，施入田中起到改良土壤和增加肥效的作用。
产纤维素酶的微生物主要有细菌、放线菌和丝状真菌，其中丝状真菌产生纤维素酶系统比较复杂，因此能够充分水解纤维素。而利用微生物发酵生产纤维素酶，优良的菌种是关键，并且适宜的培养条件也是发挥优良菌种性能、获得高产酶量的保证。目前我国对纤维素酶生产上多采用常温菌如木霉、曲霉和青霉等。但是，目前纤维素酶的工业化生产由于菌种不抗高温，在许多地方夏季不能生产，而且所产酶活性偏低，从而增加了生产成本，并限制了纤维素酶应用。
因此，从环境中筛选耐高温、适合高温发酵、所产纤维素酶在高温时可以有较好的催化效率、不易变性且能够提高发酵效率的嗜热型微生物极为重要，这对于提高纤维素酶的工业化生产技术具有重要的研究意义，并对于人类社会解决环境污染、食物短缺和能源危机具有重大的现实意义。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的是提供一株嗜热侧孢霉YM-2及其复合菌剂与应用。本发明筛选的嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)YM-2耐高温、具有很好的分解纤维素的能力，并将其制备成复合菌剂，且所述的复合菌剂用途广泛。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
本发明提供了一株嗜热侧孢霉YM-2，其特征在于，其分类名为嗜热侧孢霉Sporotrichum thermophile，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 18127。
进一步的，所述嗜热侧孢霉YM-2的菌落呈白色，形态较大，质地疏松、呈絮状，外观干燥，菌丝较细并呈丛枝状。
进一步的，所述嗜热侧孢霉YM-2适宜生长温度为42℃～48℃，适宜生长pH为5.0～7.0。
本发明还提供了含有所述嗜热侧孢霉YM-2的复合菌剂。
进一步的，所述复合菌剂的菌株包括：菌含量为4×108～8×108CFU/g的嗜热侧孢霉、菌含量为1×108～3×108CFU/g的嗜热芽孢杆菌、菌含量为1×108～3×108CFU/g的嗜热放线菌、菌含量为1×108～2×108CFU/g的产朊假丝酵母和菌含量为1×108～2×108CFU/g植物乳杆菌。
本发明还提供了所述复合菌剂在制备用于肉鸡养殖的饲料添加剂中的应用。
本发明还提供了所述复合菌剂在制备用于有机肥腐熟的添加剂中的应用。
进一步的，所述有机肥为猪粪、鸡粪、鸭粪、羊粪、牛粪、污泥、食用菌下脚料、谷壳和农作物秸杆中的至少一种。
本发明还提供了所述复合菌剂在制备用于黄瓜种植的添加剂中的应用。
本发明还提供了所述复合菌剂在制备用于废渣发酵生产单细胞蛋白的添加剂中的应用。
进一步的，所述废渣为农业废渣。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和有益效果：
(1)本发明所述的嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)YM-2是一种嗜热型微生物，耐高温、适合高温发酵、所产纤维素酶在高温时可以有较好的催化效率、不易变性，同时可以避免发酵过程中杂菌的污染，提高发酵效率，且该菌性状稳定、培养简单、培养条件不苛刻、适用条件较广以及不会造成环境污染，对纤维素还具有极强的分解能力，且能与其它微生物菌协同作用，因此嗜热侧孢霉有希望成为很好的工业分解纤维素的菌种。
(2)本发明将所述的嗜热侧孢霉制成复合菌剂，该复合菌剂具有多种功能，包括促进肉鸡的生长、加快有机肥腐熟、具有很好的除臭作用、增加黄瓜种植时的成苗率和产量、利用并促进废渣发酵生产单细胞蛋白等。
(3)本发明所述的复合菌剂中的几种菌株可以产生协同作用共同促进纤维素等大分子营养物质分解成小分子营养物质，增加腐熟速度，降低腐熟周期，快速降解畜禽类粪便等有机物料中产生臭味的含硫化合物含氮，还能有效清除发酵物料中的病原微生物、寄生虫卵、杂草种子，清除程度达到100％。而且该复合菌剂具有活菌数高、菌种适应能力强、菌株性能稳定、制备方法简单、成本低等特点，因此具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明分离得到的嗜热侧孢霉YM-2在PDA培养基上的菌落照片。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1：嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)YM-2的筛选与鉴定
1、嗜热侧孢霉YM-2的筛选
以土壤为样品，将1g土壤加入到10mL无菌水中混匀制成10-1稀释液，吸取10-1稀释液1mL加入到9mL无菌水中混匀制成10-2稀释液，以此类推制作10-3、10-4、10-5稀释液，分别取10-3、10-4、10-5稀释液涂布于PDA培养基上，在45℃下培养6d，选取明显的菌落进行多次纯化后得到单菌落，将其命名为YM-2，并置于PDA斜面培养基中保存。所述PDA培养基的配方为：马铃薯汁1000mL，葡萄糖10g，琼脂20g，pH6.8；其中马铃薯汁的制备方法为：取去皮的马铃薯200g，切成小块，加水1000mL并煮沸30min后，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000mL。
所述菌株YM-2在PDA培养基菌落形态如图1所示，菌落呈白色，形态较大，质地疏松、呈絮状，外观干燥，菌丝较细并呈丛枝状。该菌株生长温度范围为10℃～70℃，其适宜温度为42℃～48℃；生长pH值范围为pH 4.0～12.0，其适宜pH为5.0～7.0。
2、嗜热侧孢霉YM-2的ITS序列测定
以所述菌株YM-2的基因组DNA为模板，使用真菌通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS5(5’-GCATATCAATAAGCGGAGGA-3’)进行扩增，获得ITS扩增序列。PCR反应体系(25μL)为：10×buffer(含Mg2+)2.5μL，dNTP 2μL，上下游引物各1μL，Taq酶0.25μL，DNA模板1μL，使用ddH2O补充至25μL。PCR反应程序为：94℃预变性10min；94℃变性50s，54℃退火1min，72℃延伸2min，进行35个循环；最后72℃延伸10min。将扩增序列进行测序，其测序结果如SEQ ID No：1的核苷酸序列所示，再将序列在Genbank上进行Blast比对，结果显示YM-2菌株与嗜热侧孢霉Sporotrichum thermophile的相似性最高(99.58％)，因此判断该菌株为嗜热侧孢霉。
本发明将筛选到的嗜热侧孢霉YM-2进行菌种保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2019年8月27日；嗜热侧孢霉Sporotrichum thermophile的保藏编号为CGMCC 18127。
实施例2：嗜热侧孢霉YM-2复合菌剂的制备
本发明所述的嗜热侧孢霉复合菌剂包括以下组分：菌含量为4×108～8×108CFU/g的嗜热侧孢霉、1×108～3×108CFU/g的嗜热芽孢杆菌、1×108～3×108CFU/g的嗜热放线菌、1×108～2×108CFU/g的产朊假丝酵母和1×108～2×108CFU/g植物乳杆菌，载体为大豆蛋白粉和饼粕；其中要确保复合菌剂的有效活菌数不少于5×108CFU/g。
在本实施例中，除嗜热侧孢霉外，其他菌种均为市售产品。
实施例3：所述复合菌剂在肉鸡养殖中的应用
将实施例2中制备的复合菌剂以0.1％的质量比添加到肉鸡饲料中，压实密封发酵5天后使用。
选100只健康且体重差异不明显的1日龄肉鸡随机分为2个组：菌剂组和对照组，每个组均设置2个重复，每重复组有25只鸡。饲养前对鸡舍、鸡笼及周边环境消毒处理，采用笼养方式饲养，鸡舍具有自动控温加热装置。在饲养过程中，给菌剂组的肉鸡投喂添加复合菌剂并发酵好的饲料，而给对照组的肉鸡投喂不添加任何复合菌剂的饲料；饲养时要保持鸡舍的恒定光照和机械通风，保证肉鸡可以自由采食、自由饮水，共饲养56天。在饲养开始后，每7天定时测量每组肉鸡的空腹重量，并计算肉鸡的日增重。
检测的结果是为：对照组的肉鸡平均日增重为60.23±1.59g，菌剂组的肉鸡平均日增重为73.18±0.87g。通过上述结果可以明显看出，在56天的养殖过程中，菌剂组的肉鸡日增重明显高于对照组，且增长了21.5％，说明了在肉鸡饲料添加了本发明所述的嗜热侧孢霉复合菌剂可以明显促进肉鸡的生长，而这是由于复合菌剂中的菌种可以促进饲料中的纤维素等大分子营养物质分解成有利于肉鸡吸收的小分子营养物质，进而增加肉鸡的吸收率和消化率，并且该复合菌剂还能够帮助饲料脱毒，清除其中的病原微生物、寄生虫卵，从而促进肉鸡的生长。
实施例4：所述复合菌剂在有机肥腐熟中的应用
将猪粪、鸡粪、鸭粪、羊粪、牛粪以及污泥、食用菌下脚料、谷壳、农作物秸杆按照粪便和其他有机物料1∶1的质量比混合后，分成两组，一组为菌剂组，一组为对照组。在菌剂组中加入实施例2中制备的复合菌剂，添加量为有机物料总量的0.1％；对照组不做任何处理，垛型堆制发酵。发酵周期以发酵温度降至室温为止。在发酵过程中，定时观察发酵的物理状态，结果如表1所示。
表1复合菌剂制备有机肥效果
Figure BDA0002195451220000051
由表1可知，菌剂组的有机肥腐熟效果要明显优于对照组，菌剂组制备的有机肥速度快、颜色深、无臭味、C/N比降低，说明添加了本发明所述的嗜热侧孢霉复合菌剂能够快速提高有机肥的发酵温度并明显缩短腐熟周期；而且对有机物料中纤维素降解作用好，进而降低C/N比，有利于有机肥的后续应用；且除臭效果明显，这是由于该复合制剂中所含菌种可以快速降解畜禽类粪便等有机物料中产生臭味的含硫化合物含氮。
实施例5：所述复合菌剂在黄瓜种植中的应用
选择一块种植面积为100m2左右、光照良好的土地，将其平均分成2组，其中一组作为菌剂组，按照20kg/亩在土壤上均匀撒施实施例2中制备的复合菌剂并深翻混匀；另外一组作为对照组，不做任何处理。在处理后7天分别在两组土壤上种植250株黄瓜秧苗，连续跟踪记录成苗数量和产量，同时记录种植地中杂草的情况。结果如表2所示。
表2复合菌剂对黄瓜种植的影响
Figure BDA0002195451220000052
Figure BDA0002195451220000061
由表2可知，菌剂组的成苗率较对照组明显增高，且黄瓜产量也获得明显增加，增幅为13.4％，而且菌剂组杂草数量明显少于对照组，说明了添加本发明所述的嗜热侧孢霉复合菌剂可以促进作物秧苗生长，进而有效的增加作物的成苗率，并具有增产和抑制杂草生长的作用，这是由于该复合菌剂可以有效分解土壤中的纤维素类物质，增加速效养分，同时促进作物对养分的吸收，而且该复合菌剂还可以清除土壤中的病原微生物和寄生虫卵、杂草种子等，有效抑制土壤中有害物质对作物的伤害及抑制杂草的生长，减少务农人员的工作量。
实施例6：所述复合菌剂在废渣发酵生产单细胞蛋白中的应用
取一厂的农业废渣，分成两组，一组为菌剂组，一组为对照组。将废渣与其质量比为10∶1的蔗糖、20∶1的磷酸二氢钾、25∶1的磷酸氢二钾及1∶2的水配置成培养液并灭菌。在菌剂组中加入培养液总质量0.1％的本发明所述的复合菌剂，对照组加入等量的尿素，45℃发酵72h。发酵完成，通过离心收集沉淀，所获菌体再通过干燥处理，即可获得单细胞蛋白成品。最终结果发现菌剂组制备的单细胞蛋白量要高于对照组，说明本发明所述的嗜热侧孢霉复合菌剂能够有效的利用废渣生产单细胞蛋白，进而提高废渣的消化率，有利于废渣的分解和充分利用，还可以减少环境污染。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
序列表
<110> 山东庄氏农业科技有限公司
青岛农业大学
<120> 一株嗜热侧孢霉YM-2及其复合菌剂与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 479
<212> DNA
<213> 嗜热侧孢霉(Sporotrichum thermophile)
<400> 1
tctccgttgg tgaaccagcg gagggatcat tacagagttg caaaactcta aaccatcgtg 60
aacgctacct aaaccgttgc ttcggcgggc ggcgccctcg cgcgcccccc tggggcccgc 120
accgcgggcg cccgccggag gtacaccaaa ctcttgatat gttatggcca ctctgagtct 180
cctgtactga ataagtcaaa actttcaaca acggatctct tggttctggc atcgatgaag 240
aacgcagcga aatgcgataa gtaatgtgaa ttgcagaatt cagtgaatca tcgaatcttt 300
gaacgcacat tgcgcccgcc agcatcctgg cgggcatgcc tgttcgagcg tcatttcaac 360
ccatcaagcc cacggcttgt gttggggacc tgcggctgcc cgcaggccct gaaaaccagt 420
ggcgggctcg ctagtcacac cgggcgtagt agcatacgac ctcgctcagg gcgtgctgc 479

Claims (1)

1.含有嗜热侧孢霉YM-2的复合菌剂在制备用于肉鸡养殖的饲料添加剂中的应用；
所述复合菌剂的菌株包括：菌含量为4×108~8×108 CFU/g的嗜热侧孢霉、菌含量为1×108~3×108 CFU/g的嗜热芽孢杆菌、菌含量为1×108~3×108 CFU/g的嗜热放线菌、菌含量为1×108~2×108 CFU/g的产朊假丝酵母和菌含量为1×108~2×108 CFU/g植物乳杆菌；所述复合菌剂的有效活菌数不少于5×108 CFU/g；所述复合菌剂中的载体为大豆蛋白粉和饼粕；
所述嗜热侧孢霉YM-2的分类名为嗜热侧孢霉Sporotrichum thermophile，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC 18127；
所述复合菌剂的使用方法为：将复合菌剂以0.1%的质量比添加到肉鸡饲料中，压实密封发酵5天后使用；
所述复合菌剂明显增加肉鸡日增重，促进肉鸡的生长。
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